KR20160117409A - 분석을 위한 큰 dna 분자를 제시하기 위한 시스템 및 방법 - Google Patents

Abstract

분석을 위해 핵산 분자를 제시하기 위한 시스템 및 방법이 제공된다. 핵산 분자는 나노슬릿 내에 구속되는 중심 부분을 갖는다. 나노슬릿은 이온 완충액을 함유한다. 핵산 분자는 나노슬릿의 나노슬릿 길이보다 큰 펼친 길이를 갖는다. 이온 완충액의 이온 강도 및 나노슬릿 및 핵산 분자의 정전기적 또는 유체역학적 특성은 조합되어 나노슬릿의 가장 작은 물리적 치수 이상인 합계된 디바이 길이를 제공한다.

Description

분석을 위한 큰 DNA 분자를 제시하기 위한 시스템 및 방법{SYSTEM AND METHOD FOR PRESENTING LARGE DNA MOLECULES FOR ANALYSIS}

관련 출원에 대한 전후 참조

본 출원은 2013년 9월 13일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 61/877,570호의 이익을 주장하며, 상기 특허의 개시내용은 이의 전체내용이 기재된 바와 같이 본원에 참조로서 포함된다.

미 연방 후원 연구에 관한 설명

본 발명은 미국 국립보건원에 의해 수여된 HG000225 및 미국 국립과학재단에 의해 수여된 0832760 하의 정부 지원에 의해 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 일정한 권리를 갖는다.

발명의 배경

본 발명의 분야는 핵산 분자 조작이다. 더욱 상세히, 본 발명은 다양한 기술에 의한 검사를 위한 핵산 분자의 부분을 더 낫게 제시하기 위해 핵산 분자를 스트레칭시키는 것에 관한 것이다.

인간 유전체의 많은 부분은 다수의 카피로 존재하는 DNA 서열로 구성되어 있다. 상기 요소는 생물학적 조절 및 진화에 있어서 중요한 역할을 하지만, 이들의 존재는 현재의 DNA 서열분석 접근법을 번거롭게 한다. 따라서, 인간의 서열분석을 완료하고자 하는 경우 심각한 문제가 발생하거나, 현재 주요 서열분석 플랫폼에 의해 사용되는 짧은 분석물 문자로 인해 암 유전체는 종종 과다의 서열 데이터를 제공한다. 독특하게 식별할 수 있는 특징을 갖지 않는 조각으로 직소 퍼즐을 조립하고자 하는 것처럼, 상기 서열 데이터는 전체 유전체의 서열을 조립하는 것을 어렵게 만든다. 더욱이, 돌연변이와 같은 집단 내에서의 유전체 변화를 평가하는 능력, 또는 다형성은 또한 제한적이다. 상기 난제에 대처하기 위해, 전유전체 분석^{1 -3} 시스템은 현재 생물정보학 파이프라인 전체에 걸친 유전체 변화를 나타내기 위해 큰 유전체 DNA 분석물^{3 , 4}을 제시하는 양식을 특징으로 한다. 나노구속(nanoconfinement) 접근법을 이용한 유전체 분석을 위한 실익을 달성하는 것은 대량의 데이터 세트를 처리하기 위해 상승작용적으로 균형이 이루어지는 시스템 구성요소의 통합을 필요로 한다. 상기 구성요소는 데이터 분석을 위한 실험 오차 처리의 통계적 고려사항이 통합된 알고리즘에 의해 보완된, 샘플 제조, 분자 표지, 구속된 DNA 분자의 제시, 및 검출을 포함한다.^5-8

DNA 분자를 구속하는 다수의 접근법이 과거 수년간 시험되고 수행되었으며^5,10-15, 몇몇은 DNA 분자를 이들의 펼친 길이에 가깝게 신장시켰다. 문헌[Kim et al.]⁹에서는, 예를 들어, 폴리(디메틸실록산)(PDMS) 반복된 나노채널(250 nm × 400 nm) 내에서 λ-DNA를 신장시켰고, 초저 이온 강도 조건(0.06 mM)을 이용하여 0.88의 스트레치(stretch)를 달성하였다. 본 발명자가 아는 바로는, 이는 저 이온 강도 완충액을 이용하여 나노채널 내에서 DNA 분자에 대해 보고된 가장 긴 스트레치였다. 다른 연구에서, 문헌[Reisner et al.]¹¹에서는 DNA 분자를 0.83까지 신장시키기 위해 더 높은 이온 강도 조건(~5 mM)을 갖는 50 nm 융합 실리카 나노채널을 이용하였다. 이들 두 접근법을 이용한 스트레치는 0.8보다 높았으나, 둘 모두의 기술은 한계를 나타낸다. 문헌[Reisner et al.]의 접근법은 분자의 펼친 길이에 가깝게 DNA 분자를 신장시키기 위해 분자 지속 길이보다 작은 극도의 나노구속 장치의 제작을 필요로 하여¹⁶, 분자 로딩 과정의 복잡성을 증가시킨다는 점에서 힘들다.

따라서, 상기 언급된 결점을 극복하는 핵산 분자를 스트레칭시키기 위한 접근법이 필요하다.

발명의 개요

본 발명은 핵산 분자를 스트레칭시키는 미세유체 장치 및 방법을 제공함으로써 상기 언급된 결점을 극복한다.

본 발명의 개시에 따르면, 미세유체 장치는 제1 마이크로채널, 제2 마이크로채널, 나노슬릿(nanoslit), 핵산 분자, 및 이온 완충액을 포함할 수 있다. 나노슬릿은 제1 마이크로채널과 제2 마이크로채널 사이에 걸쳐 있을 수 있다. 나노슬릿은 제1 마이크로채널과 제2 마이크로채널 사이에 유체 경로를 제공할 수 있다. 핵산 분자는 제1 말단 부분, 제2 말단 부분, 및 제1 말단 부분과 제2 말단 부분 사이에 위치된 중심 부분을 포함할 수 있다. 이온 완충액은 나노슬릿 및 제1 및 제2 마이크로채널 내에 존재할 수 있다. 제1 마이크로채널은 나노슬릿의 제1 말단에 인접한 제1 클러스터 영역을 포함할 수 있고, 제2 마이크로채널은 나노슬릿의 제2 말단에 인접한 제2 클러스터 영역을 포함할 수 있다. 제1 클러스터 영역은 제1 말단 부분을 함유할 수 있다. 제2 클러스터 영역은 제2 말단 부분을 함유할 수 있다. 나노슬릿은 중심 부분을 함유할 수 있다. 핵산 분자는 나노슬릿의 나노슬릿 길이보다 큰 펼친 길이를 가질 수 있다. 이온 완충액의 이온 강도 및 나노슬릿 및 핵산 분자의 정전기적 또는 유체역학적 특성은 조합하여 나노슬릿 높이 또는 나노슬릿 폭 이상의 합계된 디바이 길이(Debye length)를 제공할 수 있다. 나노슬릿 높이 또는 나노슬릿 폭은 나노슬릿의 가장 작은 물리적 치수일 수 있다.

본 발명의 개시에 따르면, 이온 완충액 중에서 핵산 분자를 스트레칭시키는 방법은 핵산 분자의 중심 부분이 나노슬릿을 차지하고, 핵산 분자의 제1 말단 부분이 나노슬릿의 제1 말단에 인접한 제1 클러스터 영역을 차지하고, 핵산 분자의 제2 말단 부분이 나노슬릿의 제2 말단에 인접한 제2 클러스터 영역을 차지하도록 핵산 분자를 배치하는 것을 포함할 수 있다. 나노슬릿, 제1 클러스터 영역, 및 제2 클러스터 영역은 이온 완충액을 포함할 수 있다. 핵산은 나노슬릿의 길이보다 큰 펼친 길이를 가질 수 있다. 이온 완충액의 이온 강도 및 나노슬릿 및 핵산 분자의 정전기적 또는 유체역학적 특성은 조합하여 나노슬릿 높이 또는 나노슬릿 폭 이상의 합계된 디바이 길이를 제공할 수 있다. 나노슬릿 높이 또는 나노슬릿 폭은 나노슬릿의 가장 작은 물리적 치수일 수 있다.

본 발명의 상기 및 다른 양태는 하기 설명으로부터 제시될 것이다. 설명에서, 설명의 일부를 형성하는 수반하는 도면, 및 예시 목적으로 제시되는 본 발명의 바람직한 구체예가 참조된다. 상기 구체예는 반드시 본 발명의 전체 범위를 나타내는 것이 아니며, 따라서 본 발명의 범위를 해석하기 위해 본원의 청구항이 참조된다.

도 1은 분자 덤벨(molecular dumbbell)의 형성을 뒷받침하는 마이크로채널-나노슬릿 장치를 제시한다. (A) PDMS 장치가 세척된 덮개 유리에 부착되고, DNA 분자의 동전기적 로딩을 위해 완충액에 침지된다(제시되지 않음). (B) 로딩된 T4 DNA 분자(166 kb; 74.5 ㎛, 염료 조정된 펼친 길이)가 나노슬릿 길이(28 ㎛)를 초과하는 경우에 덤벨을 형성하고; 나노슬릿에 접한 분자 말단은 마이크로채널 내에서 이완된 코일(로브(lobe))이 되고, 이에 의해 나노슬릿 내에 사이에 존재하는 세그먼트의 스트레치를 (0.85 ± 0.16, I = 0.51 mM)로 향상시키고; 추적은 분자 백본을 따라 형광 강도 변화를 나타낸다. (C) λ-DNA 분자(48.5 kb, 21.8 ㎛)는 덤벨을 형성하기에 너무 짧고, 따라서 나노슬릿 내에 완전히 구속되고; 더 낮은 스트레치(S/L = 0.62 ± 0.08, I = 0.48 mM)가 균일하지 않은 형광 강도 프로파일에 의해 추가로 제시된다.
도 2는 시뮬레이션된 나노슬릿 기하학적 형태를 제시한다. 덤벨을 형성하는 T4-DNA 분자(166kb, L = 74.5 ㎛)의 속사(snapshot)가 제시된다. 시뮬레이션된 슬릿 길이는 10, 20, 및 30 ㎛였고, 분자 스트레치가 분자량과 독립적이라는 사실로 인해 결과는 동등하였다. 여기서 제시된 결과는 20 ㎛ 길이의 나노슬릿을 이용하여 계산되었다.
도 3은 실험, 시뮬레이션, 및 Odijk 이론 사이에서 우수한 일치를 나타내는 T4 DNA(회색 불릿(bullet)(●); 오차 막대는 평균에 대한 SD를 제시한다, N = 51-101 분자) 덤벨에 대한 이온 강도의 함수로서의 스트레치를 기재한다. 백색 불릿(●)은 도 5로부터의 λ 연쇄동일서열 데이터, 및 내부 표준을 이용한 측정을 제시한다(본문 참조). 1X TE 완충액의 연속 희석은 이온 강도를 변화시켰다: 1.0, 0.74, 0.51, 0.45, 0.23, 및 0.11 mM. 삼각형(Δ)은 유체역학적 상호작용을 고려하지 않은 BD 시뮬레이션으로부터의 결과를 제시한다(FD). 박스(□)는 유체역학적 상호작용을 변동시킨 BD 시뮬레이션으로부터의 결과를 제시한다(HI). 점선은 de Gennes 및 Odijk 스케일링(scaling) 예측에 해당한다. 음영진 영역은 유효 h × h 채널과 3h × h 슬릿 사이의 Odijk 스케일링을 포함한다.
도 4는 I = 0.51 mM에서의 T4 DNA 덤벨에 대한 나노슬릿 축 위치의 함수로서의 나노슬릿 축 및 폭 방향에 따른 스트레치이다. 예측된 스트레치가 HI(실선) 및 FD(점선) 사슬에 대해 제시된다. HI 사슬(상부) 및 FD 사슬(하부)의 속사가 포함된다.
도 5는 크기: BD 시뮬레이션에 비한 실험의 함수로서의 λ-DNA 연쇄동일서열 덤벨의 스트레치이다. 화살표는 그래픽 출력에 대한 실험 및 시뮬레이션 결과와 마이크로그래프의 몽타주를 연결시키며; 오차 막대는 N = 9-93 분자에 대해 평균에 대한 SD(점)를 제시한다. 도면은 나노슬릿의 윤곽을 나타내는 수직선을 제시하고; 수평선은 나노슬릿 경계를 나타낸다. 덤벨 로브는 제공된 슬릿/마이크로채널 기하학적 형태에 대해 분자 크기 증가에 따라 확대되며, 시뮬레이션과 강한 유사성을 나타낸다.
도 6은 T4(백색 불릿(●), N = 105 분자), λ-DNA 연쇄동일서열(흑색 불릿(●), N = 4-21 분자), 및 제한 효소 ApaI으로 분해된 M. 플로룸(M. florum) DNA(회색 불릿(●), N = 11-59 분자)에 대한 분자 크기의 함수로서의 덤벨 이완 시간을 제시한다. 각각의 원은 제공된 분자 크기에 대한 평균 이완 시간(R_t)을 나타낸다(146 kb - 582 kb; x-축 오차 막대는 95% 신뢰 구간을 나타낸다). log-log 플롯에 대한 선형 회귀 적합도는 1.23 ± 0.09 (R² = 0.82)의 지수를 나타낸다. 지수 오차는 각각의 포인트의 평균 및 x-축 오차를 포함하는 일관성 시험으로 결정된다(삽입물). T4 DNA 분자에 대한 덤벨 동역학은 수집된 타임 슬라이스로서 여기서 제시된 영상으로 이미지화된다(화살표는 하나의 슬라이스를 나타낸다; 슬라이스 당 0.440 s).

발명의 상세한 설명

본 발명의 개시에서 인용된 모든 참조된 특허, 출원, 및 비-특허 문헌은 이들의 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다. 참고문헌과 본 발명의 개시가 불일치하는 경우, 본 발명의 개시가 우선한다.

본 발명의 개시는 미세유체 장치를 제공한다. 미세유체 장치는 제1 마이크로채널, 제2 마이크로채널, 나노슬릿, 핵산 분자, 및 이온 완충액을 포함할 수 있다. 나노슬릿은 제1 마이크로채널과 제2 마이크로채널 사이에 걸쳐 있을 수 있다. 나노슬릿은 제1 마이크로채널과 제2 마이크로채널 사이에 유체 경로를 제공할 수 있다. 핵산 분자는 제1 말단 부분, 제2 말단 부분, 및 제1 말단 부분과 제2 말단 부분 사이에 위치된 중심 부분을 가질 수 있다. 이온 완충액은 나노슬릿 및 제1 및 제2 마이크로채널 내에 존재할 수 있다. 제1 마이크로채널은 나노슬릿의 제1 말단에 인접한 제1 클러스터 영역을 포함할 수 있고, 제2 마이크로채널은 나노슬릿의 제2 말단에 인접한 제2 클러스터 영역을 포함할 수 있다. 제1 클러스터 영역은 제1 말단 부분을 함유할 수 있다. 제2 클러스터 영역은 제2 말단 부분을 함유할 수 있다. 나노슬릿은 중심 부분을 함유할 수 있다. 핵산 분자는 나노슬릿의 나노슬릿 길이보다 큰 펼친 길이를 가질 수 있다. 이온 완충액의 이온 강도 및 나노슬릿 및 핵산 분자의 정전기적 또는 유체역학적 특성은 조합하여 나노슬릿 높이 또는 나노슬릿 폭 이상의 합계된 디바이 길이를 제공할 수 있다. 나노슬릿 높이 또는 나노슬릿 폭은 나노슬릿의 가장 작은 물리적 치수일 수 있다.

본 발명의 개시는 또한 이온 완충액 중에서 핵산 분자를 스트레칭시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 핵산 분자의 중심 부분이 나노슬릿을 차지하고, 핵산 분자의 제1 말단 부분이 나노슬릿의 제1 말단에 인접한 제1 클러스터 영역을 차지하고, 핵산 분자의 제2 말단 부분이 나노슬릿의 제2 말단에 인접한 제2 클러스터 영역을 차지하도록 핵산 분자를 배치하는 것을 포함할 수 있다. 나노슬릿, 제1 클러스터 영역, 및 제2 클러스터 영역은 이온 완충액을 포함할 수 있다. 핵산은 나노슬릿의 길이보다 큰 펼친 길이를 가질 수 있다. 이온 완충액의 이온 강도 및 나노슬릿 및 핵산 분자의 정전기적 또는 유체역학적 특성은 조합하여 나노슬릿 높이 또는 나노슬릿 폭 이상의 합계된 디바이 길이를 제공할 수 있다. 나노슬릿 높이 또는 나노슬릿 폭은 나노슬릿의 가장 작은 물리적 치수일 수 있다.

도 1(A)를 참조하여, 미세유체 장치는 레플리카(replica) 10, 예를 들어, PDMS 레플리카, 예를 들어, 마이크로채널 12 및 나노슬릿 14을 포함할 수 있다. 장치는 기판 16 상에 마운팅될 수 있다. 장치는 전극 18을 가질 수 있다.

도 1(B)를 참조하여, 미세유체 장치는 덤벨 형태의 스트레칭된 핵산 분자 20를 함유할 수 있다. 형광 강도 22는 해당 핵산 분자 20 옆에 제시된다. 핵산 분자 20의 길이에 걸친 형광 강도 22에서의 변화의 결핍은 우수한 스트레칭을 나타낸다.

도 1(C)를 참조하여, 제시된 미세유체 장치는 나노슬릿 길이보다 짧고, 덤벨 형태가 아니고, 완전히 스트레칭되지 않은 핵산 분자 24를 함유한다. 형광 강도 26는 해당 핵산 분자 옆에 제시된다. 핵산 분자 20의 길이에 걸친 형광 강도 26에서의 더 큰 변화는 불량한 스트레칭을 나타낸다.

특정 구체예에서, 제1 클러스터 영역이 핵산 분자의 제1 클러스터화 말단 부분을 보유하고, 제2 클러스터 영역이 핵산 분자의 제2 클러스터화 말단 부분을 보유하는 경우 나노슬릿은 핵산 분자의 중심 부분을 함유하도록 형성될 수 있다. 핵산 분자의 중심 부분은 일반적으로 핵산 분자의 제1 클러스터화 말단과 제2 클러스터화 말단 사이에 위치될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "클러스터화 말단" 또는 "클러스터화 형태"는 스트레칭되지 않고, 핵산 분자의 각각의 말단의 적어도 일부 내에 무작위 코일을 함유하는 핵산 분자의 형태를 나타낸다. 본원에서 사용되는 "클러스터 영역"은 클러스터화 말단에 의해 차지된 마이크로채널 내의 공간을 나타낸다. 클러스터 영역은 본질적으로 동일한 크기이거나, 이의 각각의 마이크로채널보다 작을 것이다.

특정 구체예에서, 나노슬릿은 하기와 같은 물리적 치수를 가질 수 있다. 나노슬릿은 약 1 nm 내지 약 1 ㎛인 가장 작은 물리적 치수를 가질 수 있다. 나노슬릿은 200 nm 내지 10 ㎛의 나노슬릿 폭을 가질 수 있다. 나노슬릿은 1 ㎛ 이하의 나노슬릿 폭을 가질 수 있다. 나노슬릿은 30 ㎛ 이하의 나노슬릿 길이를 가질 수 있다. 나노슬릿은 20 nm 내지 200 nm의 나노슬릿 높이를 가질 수 있다. 나노슬릿은 100 nm 이하의 나노슬릿 높이를 가질 수 있다. 특정 구체예에서, 나노슬릿은 전체 나노슬릿 길이에 걸쳐 실질적으로 균일한 나노슬릿 폭, 실질적으로 균일한 나노슬릿 높이, 또는 둘 모두를 가질 수 있다.

특정 구체예에서, 나노슬릿은 핵산 분자의 펼친 길이 이하 또는 핵산 분자의 펼친 길이의 절반 이하의 길이를 가질 수 있다.

특정 구체예에서, 나노슬릿은 적어도 50 nm의 가장 작은 물리적 치수를 가질 수 있다. 특정 구체예에서, 핵산 분자는 적어도 약 50 nm의 가장 작은 물리적 치수를 갖는 나노슬릿 내에 배치된다. 즉, 장치는 50 nm 미만의 공동이 제작되는 것을 필요로 하지 않을 수 있다. 또한, 핵산 분자가 본 구체예의 나노슬릿 내에 배치되거나, 본 구체예의 나노슬릿을 통해 스레딩(threading)되거나, 본 구체예의 나노슬릿으로 동전기학적으로 유도되는 경우, 조우될 가장 작은 통로는 50 nm의 통로일 수 있다.

특정 구체예에서, 이온 완충액은 나노슬릿 높이 또는 나노슬릿 폭 이상의 합계된 디바이 길이를 제공하기 위해 나노슬릿 및 핵산 분자와 적절하게 조합된 이온 강도를 가질 수 있으며, 나노슬릿 높이 또는 나노슬릿 폭은 나노슬릿의 가장 작은 물리적 치수이다. 특정 구체예에서, 이온 완충액은 나노슬릿 높이 또는 나노슬릿 폭의 적어도 약 25%인 나노슬릿 또는 핵산의 디바이 길이를 제공하는 이온 강도를 가질 수 있으며, 나노슬릿 높이 또는 나노슬릿 폭은 나노슬릿의 가장 작은 물리적 치수이다. 특정 구체예에서, 이온 완충액은 약 0.75 mM 이하의 이온 강도를 가질 수 있다.

특정 구체예에서, 이온 완충액은 Tris-HCl, EDTA, 2-머캅토에탄올, POP6, 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다.

특정 구체예에서, 이온 완충액은 점도 개질제를 포함할 수 있다. 점도 개질제는 수크로스일 수 있다.

특정 구체예에서, 제1 마이크로채널, 제2 마이크로채널, 또는 둘 모두는 하기와 같은 물리적 치수를 가질 수 있다. 마이크로채널은 약 1 ㎛ 내지 약 1 mm인 가장 작은 물리적 치수를 가질 수 있다. 마이크로채널은 1 ㎛ 내지 1 mm의 마이크로채널 폭을 가질 수 있다. 마이크로채널은 약 20 ㎛의 마이크로채널 폭을 가질 수 있다. 마이크로채널은 100 ㎛ 내지 20 cm의 마이크로채널 길이를 가질 수 있다. 마이크로채널은 약 10 mm의 마이크로채널 길이를 가질 수 있다. 마이크로채널은 20 nm 내지 100 ㎛의 마이크로채널 높이를 가질 수 있다. 마이크로채널은 약 1.66 ㎛의 마이크로채널 높이를 가질 수 있다.

특정 구체예에서, 장치는 온도 조정 모듈을 추가로 포함할 수 있다. 온도 조정 모듈은 핵산 분자, 이온 완충액 또는 둘 모두의 온도를 조정하기 위해 이용될 수 있다. 온도 조정 모듈은 핵산 분자의 운동 동역학을 늦추기 위해 온도를 상승시키거나 낮추기 위해 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, 이온 완충액은 20℃ 이하의 온도를 가질 수 있다.

특정 구체예에서, 미세유체 장치는 하나 이상의 전극을 포함할 수 있다. 전극 또는 전극들은 나노슬릿 또는 나노슬릿들과 실질적으로 평행하게 배열될 수 있고, 핵산 분자를 나노슬릿으로 동전기학적으로 유도시키기 위해 이용될 수 있다.

특정 구체예에서, 핵산 분자는 적어도 약 30초의 이완 시간을 가질 수 있다. 특정 구체예에서, 핵산 분자는 나노슬릿의 나노슬릿 길이보다 크거나, 나노슬릿의 나노슬릿 길이보다 적어도 2배 더 큰 펼친 길이를 가질 수 있다.

특정 구체예에서, 핵산 분자는 DNA 분자일 수 있다.

특정 구체예에서, 핵산 분자의 배치는 핵산 분자를 나노슬릿을 통해 스레딩시키거나, 핵산 분자의 중심 부분을 나노슬릿으로 동전기학적으로 유도시키거나, 이의 조합을 포함할 수 있다.

특정 구체예에서, 상기 방법은 핵산 분자의 중심 부분의 적어도 일부를 영상화시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 영상화는 현미경검사, 예를 들어, 형광 현미경검사 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 개시 전체에 걸쳐 논의되는 바와 같이, 큰 DNA 분자가 "덤벨" 형태로 분석을 위해 제공될 수 있다. 기재된 접근법에서, 예를 들어, 이온 완충액 내의 DNA 분자는 미세유체 장치 내의 나노슬릿을 통해 통과하도록 야기된다. 이는 분자의 중심 부분(즉, 나노슬릿 내의 분자의 부분)이 선형 형태를 향해 스트레칭되고, 분자의 반대 말단(즉, 나노슬릿 외부의 분자의 부분)이 클러스터 형태, 즉, "덤벨" 형태를 형성하는 분자의 형태를 발생시킬 수 있다. 본 발명의 개시에 따른 DNA의 상기 제시는 DNA를 스트레칭시키기 위한 엔트로피, 탄성 및 유체역학적 힘의 장점을 취할 수 있으며, 예를 들어, 관련 분자의 스트레칭된 중심 부분(즉, 덤벨의 "막대")에 대한 다양한 분석을 수행하기 위해 이용될 수 있다. 상기 분석을 뒷받침하기 위해, 나노슬릿 내의 DNA 분자의 일부가 "Odijk" 레짐(regime)(즉, 구속된 DNA 분자의 신장에서의 인지된 편평기)에 도달(또는 적어도 접근)하는 것을 보장하고, 요망되는 프로토콜(들)의 수행을 촉진하기 위해 적절히 긴 이완 시간을 나타내는 장치 및 절차를 실행하는 것이 유용할 수 있다.

유의한 모델링 및 실험을 통해, DNA 분자의 스트레치의 정도 및 이완 시간에서의 인지할 만한 개선이 미세유체 장치 형태 및 이온 용액 특징의 조심스럽게 선택된 조합을 이용하여 실행될 수 있음이 결정되었다. 예를 들어, 미세유체 장치 내에서의 적절하게 스케일링된 나노슬릿과 함께 낮은 강도의 이온 환경의 이용은 이전에 가능했던 것보다 해당 DNA 분자의 더욱 완전히 스트레칭된 형태의 달성을 촉진할 수 있다. 상기 환경/스케일링은 관찰된 분자의 형태를 담당하는 정전기적 및 유체역학적 상호작용 사이의 섬세한 균형을 유리하게 다룰 수 있다.

한 예로서, 관련 분자의 펼친 길이의 절반 미만의 나노슬릿 길이를 나타내는 미세유체 장치가 본원에 기재된 덤벨 형태를 이용하지 않는 분자에 비한 현저한 개선인 약 수분의 이완 시간을 전달할 수 있는 것이 결정되었다. 이는 분자의 실험적 관찰을 강하게 돕는다. 따라서, 특정 적용에 대해, 관련 DNA 분자의 펼친 길이의 절반 이하의 길이를 갖는 나노슬릿을 갖는 미세유체 장치를 형성시키는 것이 이로울 수 있다. 특히, 특정 형태 및 조건하에서, 나노슬릿 길이가 참조 분자와 관련하여 적절하게 조정된 후, 임의의 크기의 분자(예를 들어, 참조 분자의 펼친 길이를 초과하는 펼친 길이(L)를 갖는 분자)의 비교적 균일한 제시를 위해 동일한 미세유체 장치가 이용될 수 있다. 예를 들어, 특정 분자(예를 들어, 각각 0.01X 내지 0.1X 범위의 4% (v/v) 2-머캅토에탄올, 0.1% (w/v) POP6(Applied Biosystems) 및 TE 완충액(1X: 10 mM Tri-HCL 및 1 mM EDTA pH 7.9)을 함유하는 용액 중 λ 박테리오파지(New England Biolabs) 48.5 kb (L = 16.5 ㎛/21.8 ㎛), T4 박테리오파지(Wako Chemicals) 166 kb (L = 56.3 ㎛/74.5 ㎛), λ-연쇄동일서열(New England Biolabs, λ 연쇄동일서열 래더, 크기 범위 = 137.4 - 582.0 kb), M. 플로룸(ApaI 분해: 252 kb, L = 85.7 ㎛/113.2 ㎛; 541 kb L = 184.2 ㎛/243.2 ㎛))(상기에서, L은 각각 염색되지 않은/염색된 펼친 길이를 나타냄)와 관련하여, 미세유체 장치는 28 ㎛ 길이의 나노슬릿에 의해 1 ㎛ 폭 x 100 nm 높이를 포함하도록 유리하게 제작될 수 있다. 이러한 식으로, 나노슬릿의 길이는 일반적으로 시험되는 분자의 (염색되거나 염색되지 않은) 펼친 길이의 절반 미만이고, 이에 따라 향상된 이완 시간이 달성될 수 있다.

상기 기재된 것과 같은 미세유체 장치는 또한 기재된 나노슬릿의 어느 한 말단에 마이크로채널을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 예를 들어, 상기 기재된 장치에 대한 마이크로채널은 20 ㎛ 폭 x 1.66 ㎛ 높이 x 10 mm 길이의 치수로 제작될 수 있다. 이들 미세유체 장치(및 본 발명의 개시에 의해 고려되는 다른 미세유체 장치)의 제작은 다양한 공지된 기술, 예를 들어, 실리콘 웨이퍼 상에서의 반응성 이온 에칭을 이용할 수 있으며, PDMS 레플리카는 소프트 리소그래피(soft lithography)에 의해 생성되고, O₂ 플라즈마 처리에 의해 친수성이 된다.

상기 기재된 나노슬릿 형태에 더하여 또는 대안으로서, 대상 분자의 스트레치가 또한 감소된 이온 강도 완충액 내에 핵산 분자를 제공함으로써 유리하게 향상될 수 있다. 예를 들어, 다양한 현재의 이론과 대조적으로, Odijk 레짐 스트레칭이 관련 DNA 분자의 지속 길이(특정 구체예에서, 정전기적 고려사항을 고려함)와 동일한(또는 적어도 동등한) 유효 구속을 제공함으로써 획득될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이로 인해, 이온 강도의 감소는 미세유체 장치의 표면의 증가된 디바이 길이(그 자체가 또한 적절히 낮은 이온 강도에 의해 향상됨)에 의해 유도되는 향상된 유효 구속 및 사슬 지속 길이를 유리하게 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 감소된 이온 강도 및 적절히 형성된 나노슬릿은 나노슬릿 높이(예를 들어, 상기 기재된 장치에 대해 ~ 100 nm)와 동등(또는 동일)한 분자의 지속 길이 및/또는 장치의 디바이 길이를 발생시킬 수 있다. 이러한 식으로, 유효 구속이 사슬 지속 길이와 동등(또는 동일)하므로, Odijk 레짐이 달성될 수 있다. 따라서, 적절한 미세유체 장치 형태(예를 들어, 나노슬릿 치수)와 함께 감소된 이온 강도 완충액의 이용은 더 긴 이완 시간을 발생시킬 수 있고, 이에 의해 영상화-기반 유전체 분석 및 다른 연구를 더욱 도울 수 있다. 이와 같이, 미세유체 장치를 설계하고 제작하고(예를 들어, 나노슬릿 치수와 관련하여 설계 및 제작), 유효 DNA 직경에 초점을 두는 것이 아니라(혹은 초점을 두는 것에 더하여) 관련 DNA 분자의 지속 길이를 기초로 하여 완충액 이온 강도를 선택(예를 들어, 증가하는 디바이 길이를 예상하여 선택)하는 것이 적절할 수 있다. 예를 들어, 상기 논의된 예시적인 장치(즉, 28 ㎛ 나노슬릿에 의해 1 ㎛ 폭 x 100 nm 높이를 가짐)와 관련하여, 2-머캅토에탄올에 대해 0.006% 및 POP6에 대해 0.00015%의 최종 농도를 갖는 TE 완충액이 이용될 수 있다.

추가 치수로서, 특정 구체예에서, 낮은 이온 강도 용액(상기 논의된 바와 같음)으로의 수크로스의 첨가 및/또는 적절하게 시간 조절된 온도의 감소가 용액 점도를 증가시킬 수 있고, 이에 의해 이완 시간을 추가로 연장시킬 수 있다.

따라서, 실제로, 대상 DNA는 시간 조절된 전기적 펄스를 통해 미세유체 장치 상의 나노슬릿을 통해 스레딩되어, 상기 기재된 "덤벨" 형태를 발생시킬 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 특정 구체예에서, 나노슬릿은 DNA 분자의 관련된 특징(예를 들어, 분자 펼친 길이 및/또는 지속 길이)을 기초로 하여 형성/제작될 수 있고, 적절히 낮은 이온 강도(예를 들어, 나노슬릿 높이와 동등한 장치 디바이 길이를 제공하는데 필요한 바와 같은 0.11 mM 또는 유사한 강도) 완충액이 이용될 수 있다. 특히, 적절하게 스케일링된 나노슬릿 및 유도된 덤벨 형태에 의해 발생된 탄성력과 조합된 더 낮은 이온 강도 완충액(예를 들어, 0.11 mM)은 심지어 완전히 신장된 제시 지점까지 DNA 신장을 크게 향상시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 개시 전체에 걸쳐 논의된 바와 같이, 이러한 향상은, 예를 들어, DNA 덤벨과 덤벨 로브의 엔트로피 반동력의 유체역학적 상호작용 뿐만 아니라 감소된 이온 강도 조건을 통한 정전기적 상호작용의 향상으로부터 발생할 수 있다. 특정 예에서, 용액 점도를 증가시키고, 이에 의해 이완 시간을 추가로 연장시키기 위해 수크로스가 또한 낮은 이온 용액에 첨가될 수 있고/있거나 온도가 감소(예를 들어, 로딩 후에 전환됨)될 수 있다.

250 nm x 400 nm PDMS 반복 나노채널 및 0.06 mM 이온 강도 완충액을 이용한 과거의 노력은 λ DNA에 대해 0.88의 스트레치를 전달하였다. 이들 조건 하의 디바이 길이는 약 40 nm이다. 따라서, 합계된 디바이 길이(장치 루프, 장치 플로어, 장치 루프를 마주하는 핵산 분자의 표면, 및 장치 플로어를 마주하는 핵산 분자의 표면의 디바이 길이, 즉, 4배의 디바이 길이)는 250 nm의 가장 작은 물리적 치수보다 짧은 약 160 nm이다. 마찬가지로, 50 nm 융합 실리카 나노채널 및 ~5mM 이온 강도 완충액을 이용한 노력은 DNA 분자에 대해 0.83 이하의 스트레치를 전달하였다. 이들 조건 하의 디바이 길이는 약 1.34 nm이다. 따라서, 합계된 디바이 길이는 50 nm의 가장 작은 물리적 치수보다 짧은 약 5.34 nm이다. 대조적으로, 적절하게 스케일링된 나노슬릿 치수(예를 들어, 표적 분자의 관련 양태에 대해 조정됨) 및 적절하게 낮은 이온 강도 완충액(예를 들어, 장치 디바이 길이의 향상된 스케일링을 위해 선택됨)의 개시된 조합의 한 구체예의 이용은 1.06 이상의 스트레치를 유용하게 전달할 수 있다.

매우 큰 DNA 분자의 분석은 긴-범위의 위상 서열 정보를 본질적으로 뒷받침하나, 임의의 유전체 분석 플랫폼의 일부로서 이들의 효과적인 제시를 위한 새로운 접근법을 필요로 한다. 분자 시뮬레이션에 의해 보강된 분자 구속, 이온 환경, 및 DNA 탄성 특성을 집합시킨 다면적인 접근법을 이용하여, 본 발명자는 나노스케일 슬릿 내에 큰 DNA 분자의 제시를 위한 효과적이고 규모 변경 가능한 접근법을 개발하였다. 본 발명의 접근법은 DNA 덤벨의 형성에 의지하며, 여기서 분자의 큰 세그먼트는 이들을 구속시키기 위해 사용된 나노슬릿의 외부에 남아 있는다. 본 발명의 접근법의 다른 특징을 상승작용시키는 낮은 이온 환경은 DNA 분자가 펼친 길이와 동등한 완전히 스트레칭된 형태를 채택하는 것을 가능케 하고, 이에 의해 광학 현미경검사에 의한 분석을 돕는다. 따라서, 나노슬릿 내의 DNA 분자의 형태 및 동역학을 기재하기 위해 분자 모델이 제안되며; 유체역학적 효과가 그린 함수 형식론(Green's function formalism)을 통해 포함되는 중합체 동역학의 랑게빈 서술(Langevin description)이 채택된다. 본 발명의 시뮬레이션은 정전기적 상호작용과 유체역학적 상호작용 사이의 섬세한 균형이 관찰된 분자 형태를 담당하는 것을 나타낸다. 본 발명자는 구속 치수가 분자의 지속 길이와 동일 크기 자릿수인 경우에 "Odijk 레짐"이 확실히 시작하는 것을 입증하고, 추가로 확인하였다. 본 발명자는 또한 덤벨 동역학과 관련한 현재의 이론을 요약한다.

여기서, 나노슬릿으로의 큰 DNA의 동전기학적 로딩이 무작위 코일의 스트레칭 및 분석물 어레이로서의 제시에 대한 새로운 경로를 제공한다. 1 초과의 종횡비를 갖는 나노슬릿 또는 채널은 큰 데이터 세트의 획득을 촉진하는 유전체학적으로 규모 변경 가능한 나노구속 조건을 실현시킨다. 나노슬릿은 또한 전자-빔 제작된 원판으로부터 일회용 장치의 대규모 복제를 통해 저비용의 제작을 가능케 한다. 또한, 낮은 이온 강도 조건은 DNA 분자의 지속 길이를 증가시키고, 이에 의해 실라스틱 물질의 고유한 기하학적 한계와 양립되는 장치 내의 DNA의 나노구속을 발생시킨다.^{5 ,9} 첫번째 세대의 "나노코딩(nanocoding)"에서, 구속된 DNA 분자의 맵핑이 서열-특이적 표지로 수행되었다.⁵ 유전체 분석을 위한 상기 맵핑 데이터의 값은 마커 밀도⁶ 및 분자 스트레치 S/L(여기서, S는 분자의 겉보기 길이이고, L은 이의 펼친 길이임)에 좌우되는 것으로 밝혀졌다.

이전 연구에서 개설된 협력된 실험 및 이론적 접근법을 통해,⁵ 본 발명자는 본 발명의 나노슬릿 내에 DNA "덤벨" 형태를 연동시키는 것이 엔트로피, 탄성 및 유체역학적 힘을 통해 DNA 스트레칭을 크게 향상시킬 것으로 추론하였다. 본 문헌에서, 본 발명자는 DNA 덤벨을 나노슬릿 내에 있는 사이에 존재하는 중합체 세그먼트의 측면에 접한 마이크로채널 내에 2개의 이완된 코일(로브)를 포함하는 것으로 규정한다(도 1). 본 발명의 실험은 분자 덤벨이 나노슬릿 내의 DNA 스트레치를 이전 실험⁵에서와 동일한 이온 강도 및 "넓은(spacious)" 구속 조건(슬릿 치수: 100 nm × 1000 nm)을 이용하여 완전한 분자 펼친 길이까지 증가시키는 것을 확실히 제시한다. 더욱 중요하게는, DNA 덤벨은 0.06 mM 미만의 이온 강도, 또는 심각한 구속(50 nm 미만)을 포함하는 현재의 접근법의 한계를 극복한다. 낮은-이온 강도 조건에 의해 매개되는 로브의 엔트로피 반동력, 유체역학적 상호작용, 및 정전기적 상호작용의 조합은 나노슬릿 내의 DNA 분자 백본 전체에 걸쳐 장력을 발생시키고, 추가로 분자를 신장시킨다. 처음으로, 덤벨 형태는 1.06 ± 0.19까지의 스트레치를 나타내는 나노슬릿 내에서의 DNA 분자의 신장을 가능케 한다. 본 발명의 결과는 유효 DNA 직경이 de Gennes-Odijk 전이에 대한 관련 파라미터임을 암시한 다른 이론¹¹과 명백히 반대로 지속 길이가 유효 구속(정전기적 고려사항을 포함함)과 동일시에 "Odijk 레짐"이 달성되는 것을 나타낸다. 또한, 본 발명자는 분자의 펼친 길이가 나노슬릿 길이의 2배보다 더 긴 경우에, 덤벨의 이완 시간이 약 수분이고, 로브 크기에 따라 증가하는 것을 발견하였다. 스트레치는 분자량과 독립적으로 남아 있는다. 상기 분자 제시는 스트레칭된 분자(즉, 평형을 벗어난 준안정 상태)의 포착을 크게 향상시키고, 이에 의해 이러한 접근법을 유전체 분석 시스템에 대한 실제 구성요소로 만든다.

최근에, 문헌[Yeh et al.]¹⁷에서 또한 문헌[Kim et al.]⁹에 의해 이용된 것과 유사한 조합된 마이크로스케일 및 나노스케일 장치에서 구속된 DNA 분자에 대한 실험을 수행하였다. 이들은 일부 환경하에서 긴 DNA가 덤벨을 형성할 수 있었던 것을 관찰하였다. 이들은 강한 구속 하에서 엔트로피 반동력의 정역학 및 동역학의 연구를 가능케 하는 엔트로피-유도 단일 분자 줄다리기(tug-of-war)(TOW) 반응식을 강조하는 준정적 인수에 의해 이들의 관찰을 설명하였다. 이러한 연구에서, 본 발명자는 마이크로스케일 구속 내의 대칭 로브에 해당하는 상기 준정적 레짐이 사라지는 출현 가능성을 갖는 것을 제시한다. 구속된 분자는 비평형 조건하에 있으며, 로브의 균일하지 않은 크기는 분자 반동을 조절한다. 비평형 조건을 고려하여, 본 발명자는 여러 메커니즘이 분자 동역학 및 덤벨 수명을 조절할 수 있음을 제시한다.

재료 및 실험 방법

장치 제작 및 구성. 마이크로채널-나노슬릿 장치 원판은 JEOL JBX-5DII 시스템(CNTech, UW-Madison)을 이용하여 전자 빔 리소그래피에 의해 제작되었다. 나노슬릿(1 ㎛ 폭 × 100 nm 높이 × 28 ㎛ 길이)은 CF4 반응성 이온 에칭에 의해 실리콘 웨이퍼로 에칭되었고, 변형된 SU8 마이크로채널(20 ㎛ 폭 × 1.66 ㎛ 높이 × 10 mm 길이)이 위에 덮여졌다(도 1 참조). PDMS 레플리카가 소프트 리소그래피에 의해 생성되었고, O₂ 플라즈마 처리에 의해 친수성이 되었고, 24시간 동안 증류수에 저장된 후, 장치가 2개월 동안 이용되었다. 나노슬릿 장치가 산-세척된 음성으로 하전된 유리 표면 상에 마운트되었다.¹ 백금 전극(선, 0.013" 직경)이 완충액 챔버 내에서 나노슬릿에 거의 평행하게 대각성 배향으로 배치되었고, 유리 표면이 Plexiglas 홀더의 바닥에 붙여지고, Kepco (모델 BOP 100-1M) 양극성 작업 전원 장치에 부착되었다. DNA 용액이 모세관 작용을 이용하여 마이크로채널로 로딩되었고, 장치는 20분 동안 완충액[2-머캅토에탄올(0.006%) 및 POP6(0.00015%; Applied Biosystems)의 최종 농도를 갖는 TE] 중에 침지되어, 측정 전에 완충액 평형화시켰다. 장치가 침지된 후, DNA 분자가 동전기학적으로 나노슬릿으로 유도되었고, 이들이 완전히 나가기 전에 시간이 조정되어, 이들은 덤벨로서 포착되었다.

DNA 샘플 및 스트레칭. YOYO-1 (1,1-[1,3-프로판디일비스[(디메틸이미니오)-3,1-프로판디일]]비스[4-[(3-메틸-2(3H) 벤족사졸릴리덴)메틸]-퀴놀리늄 아이오다이드)⁵(Molecular Probes)로 염색된 DNA 샘플은 [(염색되지 않은/염색된 펼친 길이), L; 1 염료/4 bp의 삽입 속도로 추정함] λ-박테리오파지(New England Biolabs) 48.5 kb(L = 16.5 ㎛/21.8 ㎛), T4 박테리오파지(Wako Chemicals) 166 kb(L = 56.3 ㎛/74.5 ㎛), λ-연쇄동일서열(New England Biolabs, λ 연쇄동일서열 래더, 크기 범위 = 137.4 - 582.0 kb), 메소플라스마 플로룸(Mesoplasma florum)(ApaI 분해: 252 kb, L = 85.7 ㎛/113.2 ㎛; 541 kb, L = 184.2 ㎛/243.2 ㎛)을 포함하였다. DNA 용액은 또한 4% (v/v) 2-머캅토에탄올, 0.1% (w/v) POP6(Applied Biosystems) 및 0.01X 내지 0.1X 범위의 TE 완충액(1X: 10 mM Tris-HCl 및 1 mM EDTA pH 7.9)을 함유하였고; 이온 강도는 NaCl 표준을 이용한 전도율에 의해 결정되었다.⁹

이미지 포착 및 분석. YOYO-1-염색된 분자가 스트레치 및 이완 시간 실험을 위해 아르곤 이온 레이저(488 nm; 전환기(nosepiece)에서 측정된 8 μW 내지 200 μW)에 의해 조명되는 Zeiss 135 M 에피형광 현미경(63x Zeiss Plan-Neofluar 오일 침지 대물렌즈)에 커플링된 Hamamatsu CCD 카메라(Orca-ER)를 이용하여 영상화(Manual Collect 소프트웨어⁵)되었다. T4 덤벨 분자의 이완 동역학을 영상화시키기 위해 더욱 민감한 카메라(Andor iXon-888 EMCCD)가 사용되었다. 이미지는 백그라운드로부터 분자를 역치화시키고, 분자 형광 강도 및 길이를 측정함으로써 "롤링 볼(rolling ball)" 알고리즘¹⁹ 세그먼트를 이용하여 백그라운드를 공제시키기 위해 ImageJ¹⁸을 이용하여 분석되었다.

메소플라스마 플로룸 제조. M . 플로룸 ²⁰은 30℃에서 ATCC 1161에서 성장된 후, 펠렛화되었다. 세포는 10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 및 1 M NaCl의 용액으로 세척된 후, 펠렛화되고, 재현탁되었다. 37℃의 가온된 세포가 1% 저 융해 온도 아가로스와 1:1(v/v)로 혼합되고, 삽입 트레이 내에 분배되었다. 삽입물^{21 , 22}이 50 mL 코니컬 튜브에서 풀링되었고, 37℃에서 밤새 6 mM Tris-HCl pH 7.6, 1M NaCl, 100 mM EDTA, 1% N-라우로일사르코신, 및 20 ㎍/mL RNase에서 인큐베이션되었다. 이후, 삽입물이 1 mg/mL 프로테이나제 K와 함께 0.50M EDTA pH 8.0, 1% N-라우로일사르코신으로 옮겨지고, 50℃에서 밤새 인큐베이션된 후, 0.1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드 및 이후 0.50 M EDTA, pH 9.5로 10회 투석되었다. 삽입물은 1X TE에 대해 2회 투석된 후, 전기용출을 위해 0.1X TE에서 투석되었다.

표면 전하 밀도의 결정. 표면 전하 밀도가 2개의 포트를 갖는 나노슬릿 장치에서의 전기삼투 흐름 측정을 이용하여 평가되었다. 전기삼투 흐름이 문헌[Huang et al.]²³에 의해 기재된 것과 유사한 구성으로 측정되었다. 포트가 표준 면도날을 이용하여 산소 플라즈마 처리된 나노슬릿 장치로 절단되었다. 20 mm 간격을 둔 백금 전극이 포트 내에 배치되고, 제2 저장소와 지면 사이에 195 Ω 저항기를 갖는 EC-105 전원 장치(EC Apparatus Corporation)에 연결되었다. 외부 전위가 적용됨에 따른 전위 강하를 측정하기 위해 멀티미터(multimeter)가 저항기 전체에 걸쳐 직접 연결되었다. 20 밀리몰의 포스페이트 완충액, pH 7.0이 로드에 첨가되었고, 시스템이 플러싱(flushing)된 후, 10 mM 포스페이트 완충액 pH 7.0이 첨가된 후, ~100 V(3분)가 적용되며; 전압 극성이 이후 추가 3분 동안 역전되었다. 선형 적합으로 각각의 세트의 실험에 대한 정방향 바이어스와 역방향 바이어스 사이의 절편(시간, t)을 확인하였다. 전기삼투 이동(μ_EOF)이 하기에 의해 계산되었다:

상기 식에서, L_C는 마이크로채널 길이이고, E는 전기장이고, t는 시간이다.

전기삼투 이동으로부터, 표면 상의 전하 밀도(σ_e)는 다음과 같다:

상기 식에서, ξ는 제타 전위이고, κ^-1은 디바이 길이이고, r_w는 표면으로부터의 정규 거리이고, ε은 상대 유전율이고, ε₀는 진공의 유전율이다. 따라서, 장치 내부의 표면 밀도는 1.1 내지 1.3 e/nm²인 것으로 밝혀졌다.

나노구속 하에서의 비드 확산. 나노슬릿 내의 각각 0.20 mM 및 10 mM NaCl, κ^-1 = 22 및 3 nm 중 YG 카르복실 말단화 비드(24 nm; Molecular Probes)가 Zeiss TIRF 100X 1.46 NA 대물렌즈 및 135TV 도립현미경을 이용한 전체 내부 반영 형광 현미경(Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy)(TIRF) 현미경검사를 이용하여 영상화되었다. 광열은 488 nm 조명(아르곤-이온 레이저, Coherent); ¼ 파장판; 갈릴레이식 망원경(40 mm 및 200 mm 초점 거리 렌즈(Edmund Industrial Optics)); 광대역 필터 485/20(Semrock); 및 525/50 여기 필터(Chroma)를 포함하였고; 빔은 이후 125 mm 필드 길이 볼록렌즈에 의해 대물렌즈로 맵핑되었다. TIRF 여기는 ~70 nm(나노슬릿 깊이 미만; 100 nm)의 침투 깊이를 발생시켰고; 이미지는 525/50 방사 필터(Chroma)를 통해 Andor SOLIS 소프트웨어로 작동되는 Andor iXon-888 카메라로 통과되었고, 이는 이후 쉐이딩 보정을 위해 "롤링 볼" 알고리즘으로 백그라운드 공제되었고;¹⁹ 이미지 노이즈를 감소시키기 위해 칼만 스택 알고리즘(Kalman stack algorithm)이 수행되었다. 비드 형광 강도 변동의 주기성이 최대 피크를 식별하기 위해 고속 푸레이 변환(FFT)을 이용하여 분석되었다.

DNA 모델 및 시뮬레이션 접근법

나노슬릿 내의 DNA 덤벨 형태를 시뮬레이션하기 위해 브라운 동역학(BD) 시뮬레이션이 수행되었다. 그린 함수 형식론 전체에 걸쳐 긴-범위 유체역학 상호작용이 포함되었고, O(N) 일반 기하학적 이왈드-유사 방법(General Geometry Ewald-like Method)(GGEM)으로 계산되었다.^{24 - 31} 덤벨 형태에 대한 구속 효과의 조합이 존재한다. 슬릿 내의 분자는 마이크로채널 내, 및 나노슬릿 폭 내에서 de Gennes의 레짐(구속 크기 ~ R_g)³²을 겪고, 나노슬릿 높이에서 Odijk 레짐(구속 크기 ~ l _p)^{16 ,33,34}을 겪는다. 이러한 레짐의 조합은 본 연구에서 고려되는 슬릿을 기재하기 위해 이용되는 모델에 다수의 제한을 둔다(도 2 참조).

DNA의 이용 가능한 설명은 상세한 원자론적 모델³⁵로부터 뉴클레오티드를 규정하기 위해 다중 부위를 이용하는 메조스케일 모델^{36 -39} 및 개별적 비드(및 스프링)에 의해 다중 뉴클레오티드를 기재하는 크게 나누어진 모델(coarse grained model)^40-42까지 이른다. 주목할 만한 예는 연속 벌레형 사슬(continuous worm-like chain)(WLC) 모델과 함께 크래트키-포로드 모델(Kratky-Porod model), 마르코 및 시기아 보간법을 이용하는 비드-스프링 모델,^{43 -47} 및 비선형 탄성 스프링(FENE)-기반 모델^26,27,48을 포함한다. 적절한 모델은 지속 길이의 유한 이산형화(finite discretization) 없이 나노구속의 길이 스케일을 분해시켜야 하는데, 이는 세그먼트 확산에 대한 특징적인 시간이 특징적인 사슬-확산 시간보다 여러 자릿수 작기 때문이다. 크래트키-포로드 또는 더 고급의 분해 모델이 계산의 결과로서 요구된다(비드와 사슬 확산 시간 사이에 8 자릿수의 시간 스케일 분리가 존재한다). 스펙트럼의 다른 말단에서, 단일 스프링에 의해 10-20 지속 길이를 기재하는 연속 WLC 모델은 나노슬릿 구속을 기재하는데 필요한 해상도를 갖지 않는다.

문헌[Yeh et al.]¹⁷에서는 DNA 덤벨에 대한 이들의 실험을 기재하기 위해 스프링에 의해 연결된 비드-스프링 사슬의 시뮬레이션을 수행하였다. 그러나, 스프링의 WLC 표시로부터 시작하여, 이들은 모델과 실험 사이에 합치가 관찰될 때까지 규칙을 변형시켰다. 그러나, 상기 접근법이 광범위한 조건에 걸쳐 큰 DNA 분자를 기재할 수 있는지 그리고 이것이 정말로 예측적인지의 여부는 불명확하다. 우수한 절충물이며, 본 발명의 연구에서 본 발명자가 채택한 접근법이 언더힐-도일(Underhill-Doyle)(UD) 모델에 의해 제공된다.^{49 - 51} UD 모델은 본래 θ-용매에 대해 개발되었고; 본 연구에서, 본 발명자는 우수한-용매 조건을 기재하고, 짐 스케일링(Zimm scaling)을 발생시키기 위해 배제된 체적력 및 유체역학적 상호작용을 포함시켰다. 점성의 용매에 용해된 중합체 분자는 N_s = N_b - 1 스프링을 통해 연결된 N_b 비드로 구성된 비드-스프링 사슬에 의해 표현된다. 본 발명의 구속된 시스템의 조건은 레이놀즈 수가 0이 되고, 관성이 무시되는 조건이다. 각각의 비드에 대한 힘 평형은 하기를 필요로 한다:

비드 l에 대해,

는 유체역학적 힘이고,

는 비드-대-비드의 배제된 체적력이고,

는 비드-벽의 배제된 체적력이고,

는 브라운 힘이고,

는 UD 스프링 힘이다.

일정한 스트레치의 기계적 총체를 이용하여 개발된 상기 모델은 인접한 분자 비드 사이의 연결도에 대해 사용된다. 이러한 모델은 하기와 같이 규정된다:^49-51

상기 식에서,

이고, 여기서

는 최대 스프링 신장이고, r은

이다.

상기 다항식 전개의 계수는 하기에 의해 규정된다:

상기 식에서,

이고,

는 스프링 당 지속 길이의 수이다.

상기 모델의 개발에서, 언더힐 및 도일⁴⁹은

의 함수로서 스프링 규칙의 오차 평가를 수행하였고, 이는

에 대해 1%의 최대 오차로 DNA 거동을 재현하는 것을 발견하였다. 본 발명자는

에 의해 제공된 UD 모델의 최대 길이 분해를 선택하였다.

한정되지 않은 비드-비드 상호작용에 대해, 본 발명자는 가우스 배제 체적 전위를 이용한다. 우수한 용매 조건하에서의 선형 중합체의 희석 용액에 대한 중성자 산란 데이터는 사슬을 따라 작은 거리에서 이상적인 사슬 거동 및 긴 거리에서 우수한 용매 거동을 나타낸다.^{52 - 57} 본 발명자는 2개의 하위분자(submolecule)(또는 분자 블랍(molecular blob))의 중첩으로 인해 에너지의 증가를 고려한다. 각각의 하위분자는 제2 모멘트

와 함께 가우스 확률 분포를 갖는 것으로 간주되며, 상기 식에서

는 스프링 당 지속 길이의 수이다. 2개의 가우스 코일의 중첩으로 인한 에너지 손실을 고려하여, 사슬의 2개의 비드 사이의 배제 체적 전위에 대해 하기 식에 도달하였다:^53,55

상기 식에서,

이고,

는 DNA 유효 직경에 관한 배제 체적 파라미터이고,^{54 ,55} k_B는 볼츠만 상수이고, T는 온도이다.

비드-벽 배제 체적 상호작용을 기재하기 위해 반발 레너드-존스 포텐셜^{58 , 59}이 이용되며, 유클리디안 거리가 벽 정상 방향에 의해 대체된다.

비드-스프링 DNA 분자의 동역학은 형태 분포 함수를 도출함으로써 기재된다. 상기 함수에 대한 확산 등식은 포커-플랑크 식(Fokker-Planck equation)의 형태를 가지며; 상기 기재된 힘 평형은 비드의 위치에 대한 운동의 확률 미분 방정식의 하기 시스템에 해당한다:^55,60,61

상기 식에서, R은 중합체 사슬을 구성하는 비드의 3N_b 좌표를 함유하는 벡터이며, x _i는 비드 l의 데카르트 좌표를 나타낸다.

길이 3N _b의 벡터 U ₀는 교란되지 않은 속도장, 즉, 임의의 중합체 분자의 부재하에서의 속도장이다. 벡터 F는 길이 3N _b를 가지며, f _l 는 비드 l에 대해 작용하는 전체 비-브라운, 비유체역학적 힘을 나타낸다. 최종적으로, d W의 3N _b 독립적 성분은 제로 평균 및 분산 dt와 함께 실제-평가된 가우스 분포로부터 획득된다. 사슬의 비드의 운동은 전체 흐름장을 교란시키며, 이는 차례로 다른 비드의 운동에 영향을 준다. 이들 유체역학적 상호작용(HI)은 3N _b × 3N _b 확산 텐서, D = k _B T M (M은 움직임 텐서임)의 3 × 3 블록 구성요소(D _lμ )를 통해 중합체 사슬 동역학에 기입되며, 이는 비드 스토크스 저항 및 유체역학 상호작용 텐서, Ω _lμ 로 분리될 수 있다:

상기 식에서, δ는 3 × 3 항등 행렬이고, δ _lμ 는 크로네커 델타이고, ξ는 비드 마찰 계수이다. 브라운 섭동은 변동-소실 정리 D = B·B ^T를 통해 유체역학적 상호작용에 커플링된다. 시스템을 설명하는 특징적인 길이, 시간, 및 힘 척도는 각각 비드 유체역학 반경 α, 비드 확산 시간 ξα ²/k _B T, 및 k _B T/α에 의해 설정된다. 비드 마찰 계수 ξ는 스토크스 법칙, 즉, ξ = 6πηa를 통한 용매 점도 η 및 α와 관련된다.

통상적인 그린 함수-기반 방법에서, M은 명백히 계산되며, 생성된 유속을 결정하기 위한 행렬-벡터 연산은 O(N ²) 연산을 필요로 한다. 또한, 비주기적 변역에 대해, 속도를 정확히 계산하기 위해 적절한 경계 조건, 예를 들어, 비-슬립 경계에 대해 u(x) = 0이 포함되어야 한다. 문헌[Jendrejack et al.]^{2 ,57,62-64}에서는 유한요소법(finite element method)(FEM)을 이용한 해법으로 경계 조건을 시행하였으며, 여기서 2차 스케일링이 분석을 작은 시스템으로 제한한다. 문헌[Hernandez-Ortiz et al.]⁶⁵에서는 O(N ^1.66 log N)로 스케일링되나, 슬릿 기하 구조로 제한되는 문헌[Mucha et al.]⁶⁶에 의해 개발된 방법을 일반화시켰다. 주기적 변역에서의 O(NlogN) 계산에 의한 M·F의 계산을 가능케 하는 다른 접근법이 존재한다. 예를 들어, 포인트 힘의 주기적 배열에 의해 유도된 스토크스 유동에 대한 문헌[Hasimoto]⁶⁷의 해법을 기초로 하는 이왈드 합계(Ewald sum) 및 입자-메쉬 이왈드(particle-mesh Ewald)(PME) 방법이 있다. 이러한 연구에서, 유속(M·F)은 문헌[Hernandez-Ortiz et al.]^25-31,68에 의해 도입된 O(N) GGEM을 이용하여 계산된다. GGEM은 M의 명백한 해석 없이 M·F를 발생시키며, B·dW에 대한 문헌[Fixman]^{69 ,70}의 중간점 통합 알고리즘 및 문헌[Fixman]⁷¹의 체비쉐프 다항식 근사법(Chebyshev polynomial approximation)과 조합하는 경우, 이는 본 발명자가 유효 O(N) 행렬- 비 함유 식을 통해 때에 맞춰 사슬을 도출하는 것을 가능케 한다.^{26 - 29} 이러한 방법의 세부사항 및 이의 수행은 하기에 기재된다.

이온 강도는 DNA 포스페이트 백본 상의 전하 사이의 정전기적 상호작용 및 나노슬릿 벽과의 상호작용을 통해 DNA 형태에 영향을 미친다. 이들 상호작용은 κ² = 2N_Ae² I/ε₀εk _B T(여기서, N_A는 아보가드로수이고, e는 전자 전하이고, I은 이온 강도이고, ε₀은 자유 공간의 유전율이고, ε은 물의 유전 상수임)에 의해 규정된 디바이 길이(κ^-1) 전체에 걸쳐 스크리닝된다. 이온 강도에서의 감소(1.0으로부터 0.11 mM)로 인해 디바이 길이가 증가(10으로부터 30 nm)함에 따라, 백본 유사-전하 반발, 및 채널의 유효 높이에서의 감소로 인해(차례로, 표면-DNA 전하 반발로 인해) 분자의 지속 길이가 증가한다. 문헌[Odijk]³⁴ 및 문헌[Skolnick and Fixman]⁷²(OSF)에서는 벌레형 중합전해질 코일의 지속 길이(l _p)가 짧은 범위의 정전 전위에 의해 영향을 받는 방식을 이론적으로 추정하였다. 문헌[Baumann et al.]에서는 큰 DNA 분자에 대한 실험을 통해 이들의 이론적 예측을 입증하였고,⁷³ 하기 식의 표현으로 정량적 예측을 달성하였다:

상기 식에서, l _p,0는 완전히 스크리닝된 정전기적 분포에 해당하는 고유의 지속 길이(l _p,0 = 50 nm)이다.

본 발명의 실험에서, 덤벨 분자의 지속 길이는 82.4 내지 358 nm 범위이다. OSF 이론의 예측이 우려를 발생시켰으나,⁷⁴ OSF는 이온 강도와 관련하여 지속 길이에 대한 정확한 스케일링을 제공하는 것으로 공지되어 있다.^{73 , 75} 이전에 언급된 바와 같이, 이온 환경은 또한 구속에서 중요한 역할을 하는데, 이는 장치의 표면이 이의 자신의 디바이 길이와 함께 1.1 내지 1.3 e/nm²의 전하 밀도를 갖기 때문이다. 본 발명의 BD 시뮬레이션은 벽과의 정전기적 상호작용을 직접 포함하지 않으며, 대신, 상기 모델은 지속 길이에서의 변화를 설명하기 위해 파라미터화되었고, 디바이 길이에 따라 벽-배제된 체적이 변형되었다. 본 발명자는 현재 이들 효과를 더욱 정확히 설명하기 위해 완전한 HI-정전기적 DNA 모델을 수행하고 있음이 주목되어야 하며, 결과는 장차 제시될 것이다. 모델 파라미터화가 벌크 내의 λ-DNA에 대한 실험 데이터를 이용하여 수행되었고, 본 발명자는 23℃에서 43.3 cP 용매 중에서 L = 21 ㎛, R_g = 0.7 ㎛, <S> = 1.5 ㎛, I = 10.798 mM에서 l _p = 53 nm, 및 D _Z = 0.0115 ㎛²/s의 Zimm 확산 계수(HI 사슬)를 이용한다⁴⁷(실제 속도(η_s)는 훨씬 낮음을 주의하라).

이후, 다양한 이온 강도에서 모델 파라미터를 찾기 위해 축척 인수(scaling argument)가 이용되었다:

상기 식에서, ω ~ κ^-1 + κ^-1 log(V _effκ^{- 1})는 DNA의 유효 직경이고,^{76 ,77} V _eff는 유효 DNA 선전하이다^{78 , 79}. 이온 강도 및 지속 길이에 의해 지시된 필요 스케일링을 생성시키기 위해 UD 모델이 이후 파라미터화되었고, 따라서 식 13에 제공된 스케일링을 따르기 위해 비드-비드 배제 체적의 범위가

로 변형된 한편, 벽 디바이 길이를 설명하기 위해 비드-벽 배제 체적 범위가 증가되었다.

나노구속된 DNA 덤벨의 이론적 고려사항

나노구속된 DNA 분자의 동적 거동에 대한 해석을 제공하기 위해 분석 이론이 이용된다.

로브의 자유 에너지. 본 발명자가 잠시 나노슬릿의 개방을 무시하는 경우, 본 발명자는 덤벨의 한 로브 내의 DNA 사슬을 단단하고 평탄한 벽에 의해 제한된 펼친 길이 s의 긴 가요성 코일로서 관찰할 수 있다. 고정된 2개의 말단을 갖는 코일의 분배 함수는 이미지 전하에 의해 유도된 반사된 형태를 제한 자유 공간에서의 가우스 함수에 의해 제공되는 것으로 공지되어 있다^{80 - 82}(사슬이 이상적인 경우). 이는 이의 값이 벽에서 0으로 감소되어야 하기 때문이다. 한 말단 포인트의 형태 상에 통합시키는 경우, 하나는 분배 함수 G(z;s)를 유도하며, 여기서 z는 로브의 다른 말단에서 벽까지의 거리이고, 로브는 길이 A = 2l _p의 s/A Kuhn 세그먼트로 구성된다. G는 z << s^1/2A^1/2에 대해 하기 식으로 감소되는 경우에만 실제 z/s^1/2A^1/2의 함수이다:

나노슬릿의 개방 영역은 D × h (h << D)이다. 식 14는 z > h인 경우 정밀히 유효하다. 여기서, h = O(l _p)이고, 따라서 나노슬릿 내의 DNA(0 또는 소수의 역 배수)가 DNA의 짧은 사이에 존재하는 섹션에 의해 z > ~h로 로브에 연결되며, 이의 설명은 난제이다. 후자의 자유 에너지는 무시될 수 있으나, 로브의 자유 에너지는 하기와 같이 표현된다:

전체 펼친 길이 L의 DNA가 나노슬릿 대신 나노포어를 통해 전위되는 경우, 식 15는 문헌[Sung and Park.]⁸³에 의해 논의된 바와 같이 전체 자유 에너지를 발생시킨다:

로브가 비대칭인 경우, DNA를 나노포어의 외부로 유도하는 DNA에 대한 힘이 존재한다:

DNA가 편향 레짐에서 나노슬릿을 통해 번역되는 경우 2개의 로브가 존재한다는 조건으로 유사한 힘이 우세한 역할을 할 것이다. 배제된 체적의 효과는 다소 약하며, 이는 단지 식 15에서 수계수를 변경시킨다.⁸¹

대칭 덤벨. 대칭 덤벨의 평형을 연구하는 것은 흥미롭다. 본 발명자가 나노슬릿이 긴 것으로 가정하고, 정전기를 무시하는 경우, 본 발명자는 식 15로부터 DNA의 전체 자유 에너지를 하기와 같이 기재할 수 있다:

본 발명자는 길이 l _s (

>> gL)의 나노슬릿에 걸쳐 있는 스트레칭된 DNA에 대한 이상적인 사슬 항을 추가하였다. 긴 사슬은 채널을 따라 후방 및 전방으로 활주하며, 전체 지속 길이 g << l _s를 갖는다. 따라서, DNA에 대한 힘인 하기 식 19는 결코 0과 동등하지 않으며, 평형에서 정확히 대칭 덤벨 형태가 존재할 수 없다:

2개의 로브는 나노슬릿으로 수축되어야 한다. 단일 로브의 자유 에너지의 반직관적 특성은 문헌[Farkas et al.]⁸⁴에 의해 이전에 강조되었다. 분리된 사슬은 벽으로부터 떨어진 변형력(deflection force)을 경험한다(s는 상수이나, z는 식 14에서 더 커진다). 그러나, 나노슬릿 내의 DNA의 섹션에 부착된 로브에 대해, z =h는 고정된 채로 유지되고, s는 가변적이다. 본 발명자는 식 19에서 로브로부터 발생하는 에트로피 힘이 일반적으로 매우 약함을 인지한다.

배제-체적 효과 및 비드레이닝 한계(Nondraining Limit). 도 6에서 사용된 DNA 샘플의 물리적 특성이 점근 레짐(asymptotic regime)에 얼마나 잘 부합하는가? 배제 체적 파라미터 z _el은 2개의 Kuhn 세그먼트 사이의 배제-체적 효과의 척도이다⁸⁵:

상기 식에서, DNA 유효 직경은 I = 0.51 mM에서 ω = 74.9 nm이다.

전체 지속 길이는 식 12로부터 113.5 nm와 동등하다. 그러므로, z _el은 도 6에서 DNA 샘플에 대해 2.5 내지 5.0 범위이다(분자 크기는 146 내지 582 kb 범위이다). 배제된 체적 효과는 점근에 가까운 것으로 간주될 수 있다(z _el >> 1).

DNA 분자가 유체역학적 직경 d

2 nm을 갖는 벌레형 사슬로 간주되는 경우, 드레이닝 특성은 파라미터 L/2l _p 및 d/2l _p

0.01에 좌우된다. 문헌[Yamakawa and Fujii]에서는 이들의 고전적 연구에서 병진 마찰 계수에 대한 이론을 개발하였다.⁸⁶ 여기서, DNA 코일은 이들의 유체역학이 비드레이닝 한계 내에 효과적으로 존재하기에 충분히 긴 것으로 판명되었다.

나노구속-매개 배출. 하나의 로브만 존재하는 경우, DNA는 나노슬릿으로부터 배출되는데, 이는 나노구속된 DNA와 나머지 로브 내의 이의 동등물 사이에 상당한 자유 에너지 차이가 존재하기 때문이다.^{87 - 89} 문헌[Burkhardt]에서는 나노슬릿 내의 DNA 사슬의 자유 에너지에 대한 표현에서 계수 C₁을 수치적으로 계산하였다.⁹⁰

상기 식에서, C₁ = 1.1036이고, x = L - s이다. 이는 명백히 종종 로브로부터의 기여를 압도하며(식 15), 사슬에 대한 힘

는 일정하다.

DNA는 나노슬릿의 외부로 유도되고, 힘

는 DNA 상의 유체역학적 마찰을 극복해야 하며, 본원에서 부과된 이온 조건하에서 일직선의 막대로서 효과적으로 관찰될 수 있다. 세로 치수 내의 마찰 계수는 하기와 같이 기재될 수 있다⁵³:

이는 D와 독립적인데, 이는 유체역학 내의 상위 컷오프가 자체가 d보다 훨씬 큰 가장 작은 스케일 h이기 때문이다. 따라서, 첫번째 접근으로서, 활주 DNA의 운동의 식이 하기와 같이 표현될 수 있다:

DNA가 배출됨에 따라 로브 크기가 증가하나, 이에 대한 마찰력은 식 23에서 무시될 수 있다. 이전 섹션으로부터, 본 발명자는 이의 크기 R(s) 스케일을 s^3/5로 알고 있어, 본 발명자는 dR/dt = -3/5(R(t)/s(t)) dx(t)/dt로 하였다. 또한, 비드레이닝 한계에서, 확장 로브에 대한 마찰계수는 ηR(t)이고, 로브 마찰은 고차항이다. 또 다른 문제는 벌크 유체역학이 슬릿 내에 얼마나 잘 적용되는지의 여부이다. 모든 타이트한 실리카 나노슬릿에 대한 상기 가정의 가능한 파괴에 대한 증거가 존재한다(h은 약 20 nm와 동등함).^{91 , 92} 본 발명의 경우, 덜 타이트한 PDMS 나노슬릿이 또한 더 평탄한 것으로 예상되나, 본 발명자는 마찰의 정도의 충분한 연구가 이후에 보장되는 것으로 생각한다.

식 23은 용이하게 해설되며, 이전에 제시된 바와 같이 포물선 방정식을 발생시켰다^{87 -89}:

DNA가 t = 0에서 전체 나노슬릿을 채우는 것으로 추정되었다. 본 발명자가 h = 0.1 ㎛, D = 1 ㎛, l _p = 0.1135 ㎛, L = 28 ㎛, η_s = 1 cP, 및 d = 2 nm로 설정하는 경우, 본 발명자는 힘

로 계산하며, 배출 시간은 τ_s = 12 s이다. 후자는 T4 DNA 분자가 실험에서 나노슬릿으로부터 배출되는 시간과 충분히 일치한다. 임시 결론은 벌크 유체역학이 나노슬릿 내에 확실히 적용된다는 것이다. 대조적으로, 문헌[Mannion et al.]⁸⁹의 정사각형 실리카 나노채널에서의 DNA에 대한 실험 마찰이 식 22와 유사한 표현에 의해 예측된 것보다 5배 더 높은 것으로 밝혀졌다. 이러한 불일치는 설명되지 않는다.

로브 전위. 최근에 개관된 바와 같이,⁹³ 나노포어를 통한 가요성 중합체 사슬의 전위에 대해 다수의 평가 및 분석 연구가 전념되었다. 본 발명의 실험에서, DNA 스트레치는 나노슬릿 내에서 매우 높으며, 따라서 본 발명자는 DNA 로브의 전위 동역학이 나노포어 장치에서의 전위 동역학과 매우 유사해야 할 것이라고 생각한다. 이후에 이를 입증하기 위한 모든 사슬 변동의 완전한 분석이 필요할 것이다.

종종, 시간 τ_l 사슬은 하기와 같이 세그먼트의 수 N에 의해 거듭제곱 법칙으로서 나노포어 스케일을 통해 전위하는 것을 필요로 한다:

주요 목적은 β를 정밀하게 계산하는 것이었으나, 이는 많은 논쟁을 발생시켰다.⁹³ 이는 본 발명의 연구 범위를 넘어서나, 본 발명자는 표 1에서 β에 대한 여러 대표적 예측을 요약하였다.

표 1. 세그먼트 N ^a 의 수의 함수로서의 로브 전위 시간 τ _l ~ N ^β 의 지수 β

편향되지 않은 전위의 경우, 문헌[Chuang et al.]⁹⁴에서는 중합체 사슬이 식 15에 의해 제공된 엔트로피 장벽을 가로질러 확산하는 단일 입자로서 관찰될 수 없다고 논의되어 있다. 나노포어를 통한 확산은 집합적이며, 거리 R ~ s^v, 로브의 크기 전체에 걸쳐 Rouse-유사하다. 전위 시간 τ_l은 이후 NR ²(N) ~ N ^{1+ 2v} 로 스케일링될 것이다(표 1의 기재 참조). 유체역학 상호작용과 함께, N에 비례적인 마찰 인수는 N^v ~ R로 감소한다.

최근에, 상기 간단한 계획안이 수정되어야 하는 것이 제안되었다.⁹⁵ 나노포어(또는 나노슬릿)의 존재는 전위의 동역학이 매우 균일하지 않음을 의미한다. 포어를 가로지르는 세그먼트의 확산은 2개의 로브 사이의 장력에서의 불균형을 야기시킨다. 이들 메모리 효과에 의해 영향을 받은 전위 시간은 효과적으로 더 길어진다(표 1 참조).

로브에 대한 연장 힘

가 충분히 큰 경우(

R(s) > k _B T), 전위가 강제되며, τ_l은

에 역비례한다. 본 발명자는 이전의 평가와 불일치함으로 인해 메모리 효과가 없는 경우에 대해 표 1의 기재를 확증하였다.⁹⁶ 본 발명의 논쟁은 소실률 dF/dt를 기초로 한다. 한편, 이는 나노포어의 개방시 사슬의 속도 V _i × 로브를 끌어당기는 힘 f와 동일하다. 로브의 반지름이 R ~ s^υ이라는 사실에 비추어, 본 발명자는 V _i = -ds/dt = -(s/νR) dR/dt임을 알고 있다. 다른 한편으로, 수축 로브 내의 Rouse 한계에서의 소실률은 N

₀(dR/dt)에 의해 제공되며, 여기서

₀ = ξ₀(dR/dt)는 ξ₀의 마찰 계수를 갖는 세그먼트에 대한 통상적인 힘이다. 세그먼트의 통상 속도는 dR/dt이다. 2개의 비율은 동일해야 하며, 따라서 표 1의 기재를 발생시킨다. 메모리 효과는 표 1에 또한 제시된 상당한 지수를 발생시킨다⁹⁷.

결과 및 논의

덤벨 형성은 DNA 분자를 완전히 스트레칭시키고, 유체역학적 고려사항을 필요로 한다. 실험 및 시뮬레이션 접근법을 이용하여, 본 발명자는 단지 나노구속으로부터의 기여에 더하여 코일 자체(덤벨 로브)로부터 발생하는 DNA 스트레치에 대한 탄성 및 유체역학적 기여가 DNA 신장을 크게 향상시킨다는 생각을 조사하였다. 본 발명자는 조심스럽게 시간 조정된 전기 펄스를 이용하여 나노슬릿을 통해 DNA 분자를 전략적으로 스레딩(threading)시킴으로써 도 1에 제시된 본 발명의 나노슬릿 장치 내에서 DNA 덤벨을 생성시켰다. DNA 말단이 나노슬릿 입구와 경계를 접한 2개의 마이크로채널을 차지하도록 하여 무작위 코일을 포함하는 덤벨 로브를 생성시키도록 조건이 조정되었다. 장치의 나노슬릿 부분 내의 DNA 스트레치는 동일 분자의 마이크로채널 부분에 대해 나노슬릿을 비교하는 형광 강도 측정 S/L = l _s

_m/S _m

_s에 의해 평가되며; 여기서

_m은 전체 분자의 통합된 형광 강도이고,

_s 및 l _s는 슬릿 내의 분자 부분의 형광 강도 및 길이이고, S _m은 분자의 공지된 길이이다(㎛; 교정된 염료).

본 발명자는 이온 강도가 지속 길이에 대한 정전기적 기여, 또는 중합체 강직, 및 장치에 의해 제공된 정전기적 환경에 의해 DNA 스트레치에 영향을 미치는 것으로 예상한다.⁵ 따라서, 본 발명자는 샘플 및 장치 둘 모두를 둘러싸는 완충액 이온 강도를 변화시킴으로써 DNA 스트레치에 대한 상기 집합적 효과를 평가하였다. 도 3은 실험으로부터의 이온 강도, I ∈ [0.11, 1.0] mM 및 BD 시뮬레이션(I ∈ [0.5, 10] mM; 재료 및 실험 방법 참조)으로부터의 함수로서 T4 및 λ-박테리오파지 DNA를 이용한 DNA 스트레치를 제시한다. 이온 강도가 감소함에 따라, 문헌[Jo et al.]⁵에 의해 이전에 보고된 바와 같이 나노슬릿 내의 DNA 스트레치는 증가한다. 그러나, 여기서, 덤벨 탄성력의 추가 커플링은 덤벨이 없는 분자 나노구속(S/L = 0.62 ± 0.08; I = 0.47 mM)에 비해 DNA 스트레치를 실질적으로 37%까지 크게 향상(S/L = 0.85 ± 0.16; I = 0.51 mM)시킨다. 이온 강도의 추가 감소는 완전히 스트레칭된(S/L = 1.06 ± 0.19; I = 0.11 mM) DNA 분자의 제시를 가능케 한다. 본 발명자는 T4 DNA에 대해 이전에 밝혀진 값(0.85 ± 0.16; I = 0.51 mM)과 유사한 λ-연쇄동일서열 DNA 덤벨(구속된 부분)의 통합된 형광 강도(0.87 ± 0.14, N = 231; I = 0.48 mM)를 표준화시키기 위해 슬릿 내에서의 공지된 크기의 내부 형광 표준으로서 λ-DNA를 이용하여 상기 스트레치 평가를 추가로 확인하였다. T4 및 λ 실험에 대해 밝혀진 스트레치 값은 일치하였고(도 3), 이는 스트레치 측정 접근법의 일관성 및 재현성을 나타낸다.

도 3은 또한 실험에 비한 BD 시뮬레이션에 의한 본 발명의 이론적 예측의 결과를 제시한다. 완전을 위해, 결과는 변동하는 유체역학적 상호작용을 포함하는 계산(HI), 및 상기 상호작용이 무시되는 계산(자유-드레이닝 모델, FD)에 대해 제시된다. 사슬의 일부가 나노슬릿 내에 존재하고, 여기서 HI가 스크리닝되고, 작은 역할을 할 것으로 예상되는 것을 주목하라. 그러나, 도 3의 결과를 표시함에 따라, HI는 덤벨 동역학에 유의하게 기여하고, 분자 스트레치에 크게 영향을 미친다. 이는 마이크로채널 내의 로브(슬릿 외부)의 Zimm 동역학이 사이에 존재하는 나노슬릿 내의 사슬 세그먼트의 동역학에 영향을 미친다는 사실에 의해 설명될 수 있다. 시뮬레이션 결과에서 2개의 경향이 식별가능하며, I > 1.0 mM에 대해, 스트레치는 거의 일정하고, I ≤ 0.74 mM에 대해, 갑작스러운 증가가 관찰된다. 상기 후자의 범위 내에서, 사슬의 지속 길이는 나노슬릿 높이(~ 100 nm)와 동등한 값에 도달하며, 이에 의해 구속의 수준을 Odijk 레짐 내에 둔다. 이들 이온 강도 조건에서의 구속 크기는 벽이 이들 자체의 이온 구름을 가지므로 100 nm보다 작은 것을 주목하라. 지금, 기초 물리학은 사슬과 연관된 이온 구름과 벽 사이의 상호작용으로 인해 복잡해지고 있다. 그러나, 하나의 주요한 효과는 유효 구속 크기의 감소이며, 즉, 사슬 지속 길이는 증가하고, 벽 사이의 "자유로운" 이용가능한 공간이 감소한다. 스트레치의 본 발명의 시뮬레이션은 실험적으로 관찰된 경향을 따르나, 실험 데이터를 약간 과소예측한다(≤5%). 본 발명자는 불일치가 완전한 정전기적 상호작용이 본 발명의 모델에 포함되지 않는다는 사실로 인한 것으로 생각한다. 또한, 지속 길이가 구속보다 높음으로 인해(l _p > 100 nm) 실험에서 고려된 2개의 가장 낮은 이온 강도 조건에 대해 현재의 모델을 사용하는 것이 가능하지 않음을 주목하라. 이들 포인트는 제쳐놓고, 시뮬레이션은 덤벨-매개 스트레치 배후의 기초 물리 현상, 및 가장 중요하게는 로브에서 작용하는 HI와 DNA 분자를 구속하고 신장시키는 것을 돕는 정전기적 상호작용 사이의 중요한 상호작용을 나타낸다.

도 4는 HI의 존재 및 부재 둘 모두에서 다양한 방향의 분자 스트레치의 비교를 제공한다. 나노슬릿 외부에서, 모든 방향의 스트레치 S ₁ (축), S ₂ (수직) 및 S ₃ (구속)는 30-32% 범위 내이다(여기서, 사슬 i의 i번째 방향에 대해 S_i = |max(x _i) - min(x _i)|_i). 따라서, S _i는 각각의 방향에서 가장 긴 분리를 갖는 사슬의 2개의 세그먼트 사이의 거리이다. 대조적으로, 나노슬릿 내부의 세그먼트는 HI가 포함되는 경우 3개의 방향에서 명백한 차이를 나타낸다. 첫째로, 축 방향의 스트레치 S ₁은 HI가 없는 것(FD 사슬)보다 HI를 갖는 경우에 항상 더 높다. HI S ₁ 스트레치는 항상 전체 스트레치 아래인 약 5-7%이며, 이는 이러한 HI S ₁ 스트레치가 전체 스트레치에 대한 주요 기여자임을 나타낸다. 다른 한편으로, FD S ₁ 스트레치는 55-60% 범위 내의 이온 강도로 일정하게 남아 있는다. 수직 방향의 나노슬릿 내의 S ₂ 스트레치는 HI 없이(FD 사슬) 20-25% 범위내이며, 이는 나노슬릿 외부에서 관찰된 것과 유사하다. 나노슬릿 내부의 HI S ₂ 스트레치는 10-15%이다. 수직 스트레치에서의 이러한 변화는 나노슬릿 내에서의 HI와 FD 분자 형태 사이의 명백한 차이를 나타낸다. FD 사슬은 덤벨 로브를 "감지"하지 않으며, 이에 의해 사슬이 나노슬릿 폭 방향으로 슈도랜덤 워크(pseudorandom walk)를 수행하는 것을 가능케 하며(도 4의 하부 사슬); 대조적으로, HI 덤벨은 축 방향으로 스트레치를 증가시키고, 사슬이 나노슬릿 폭 방향으로 자유롭게 움직이는 것을 방해하는 "집합적" 거동을 나타내고; 순수 결과는 "견고한" 덤벨의 생성이다(도 4의 상부 사슬). 요약하면, 덤벨 형태는 슈도나노채널 내에서 DNA 분자의 신장을 발생시킨다. 본 발명의 낮은 이온 강도 조건에 의해 향상된 정전기적 상호작용은 DNA 분자의 구속을 강화시킨다. 디바이 길이가 11 mM에서의 3 nm로부터 0.11 mM에서의 30 nm 범위인 것을 주목하라. 중요하게는, 낮은 이온 강도에서, 디바이 길이는 나노슬릿 높이와 동등하며, 이는 무시할 수 없는 효과이다.⁹⁸ 집합적 HI 및 나노구속과 상승작용적으로 조합된 이러한 정전기적 효과는 DNA 스트레치를 크게 향상시킨다.

디바이 길이 고려사항. DNA 스트레치에 대한 장치 벽에 의한 정전기적 기여를 강조하는 상기 시뮬레이션 결과를 가정하여, 본 발명자는 TIRF 현미경검사(재료 및 실험 방법 참조)를 이용하여 나노슬릿 내에서 음성으로 하전된 라텍스 비드(24 nm)의 확산 동역학을 연구함으로서 디바이 길이가 나노구속에 영향을 미치는 방식을 실험적으로 연구하였다.⁹⁹ 상기 생각은 장치(22 nm, I = 0.20 mM; 3 nm, I = 10 mM) 및 비드(24 nm)의 발생된 디바이 길이로 인해 이온 강도의 함수로서 비드 확산율이 측정가능하게 섭동될 것이라는 점이다. 평균 주기성은 0.1997 mM 및 9.987 mM NaCl에 대해 각각 8 ± 3 s 및 12 ± 4 s로 측정 가능하게 상이하였고(N = 16 beads), 이에 의해 디바이 길이가 나노슬릿의 높이를 효과적으로 제한함을 의미한다(즉, 비드 확산은 더 낮은 이온 강도에서 더욱 구속된다). 이들 관찰은 이온 강도 감소시 구속된 방향에서의 사슬 운동성의 갑작스러운 감소를 입증한다. 구속된 방향에서의 시뮬레이션된 DNA 운동성(확산)은 더 높은 이온 강도 조건에서 ~90 nm였고, 이는 더 낮은 이온 강도 조건에서 매우 작은 1-5 nm로 변화되었다.

DNA 크기가 덤벨 스트레칭 및 이완 시간에 영향을 미치는 방식. 도 5는 일련의 λ 연쇄동일서열을 이용한 분자 크기(97 kb -582 kb; I = 0.51 mM)의 함수로서의 DNA 스트레치를 제시한다. 확실한 덤벨 형성을 보장하기 위해 분자 펼친 길이가 나노슬릿 길이 2배를 초과하는 경우 임의의 크기의 분자의 균일한 제시를 위해 동일한 장치가 이용될 수 있음을 주목하라. 도면에서, 실험 및 시뮬레이션된 결과가 포함된다. 덤벨 형태에 대해, 본 발명자는 나노슬릿 내의 사슬 세그먼트의 축 위치의 평균 제곱 편차를 계산하였다. 중요하게는, 이러한 운동성은 얼마나 확실한 표지된 DNA 특징의 광학 측정이 나노슬릿의 내부에 존재하는지 나타내며; 시뮬레이션 결과는 I = 11 mM에 대해 150 ± 20 bp 및 I = 0.51 mM에 대해 100 ± 20 bp의 운동성을 나타낸다. 본 발명자는 덤벨이 대칭적인 경우에도 궁극적으로 덤벨의 2개의 로브가 형태를 안정화시키지 않는 것을 인지한다(이론적 고려사항 섹션 참조).

덤벨 분자의 유효 이완 시간은 스트레칭 실험에서와 동일한 방식으로 분자를 로딩함으로써 분석되었다. 그러나, 동적 실험에서, 일부 분자는 덤벨을 파괴할 광분해(photocleavage)를 방지하기 위해 약화된 조명을 이용한 7시간 경과에 걸쳐 영상화되어야 한다. 밝은 덤벨 로브는 이들의 분석을 위한 이미지 데이터에서 역치화되어, 나노슬릿 내에 연결 DNA 백본을 보이지 않게 남겨 둔다. 분자가 관찰된 마지막 시점은 슬릿 내의 덤벨의 이완 시간을 결정하였고; 본 발명자는 이후 상대 로브 크기와 상관 없이 제공된 분자 크기에 대한 모든 이완 시간의 평균을 내었다. 측정 완료 후에 남아 있는 분자는 전기장을 적용시킴으로써 가짜 표면-부착에 대해 확인되었고; 부착된 분자는 본 발명의 데이터 세트에 포함되지 않는다. 또한, ≤100 kb인 분자는 배제되었는데, 이는 이들이 신속하게 이완되는 작은 로브를 형성하였기 때문이다. 이완 시간은 단일 DNA 로브의 전위 시간 + 나노슬릿 외부로의 DNA 사슬의 배출 시간이다. 후자의 시간은 통상적으로 약 10 s로 매우 짧은 것으로 판명되었다. 이는 엔트로피 배출을 기초로 한 12 s의 본 발명의 이론적 평가와 매우 일치하며; 나노슬릿 내부의 수성 용매의 점도는 벌크의 것과 가까운 것을 나타낼 것이다. 배출 시간은 본 발명자가 이완 시간으로부터 공제한 간단한 작은 교정이다. 생성된 전위 시간은 λ 연쇄동일서열(흑색), T4(백색), 및 M. 플로룸(회색) DNA 분자에 대해 도 6에 작도되어 있다. 종속 변수는 DNA 분자의 실제 분자 질량이 아니라, 덤벨(Ml)의 2개의 로브의 분자 질량인데, 이는 본 발명자가 이로부터 나노슬릿 내부의 DNA 질량을 공제하였기 때문이다. 이러한 교정은 더 낮은 질량에 대해서 유의하다. 도 6에서, 본 발명자는 로브 전위 시간을 거듭제곱 법칙 τ ~ MI^1.23에 적합화시켰다(본 발명자가 본래의 이완 시간을 작도한 경우, 지수는 1.71이 될 것이다). 덤벨 로브 형광 강도는 1개의 로브가 나노슬릿으로 미끄러져 들어갈 때까지 시간 경과에 걸쳐 변동하며(화살표 b), 이후 분자는 나노슬릿을 하부 마이크로채널로 통과시키고, 마이크로채널로 나간다(화살표 c). 본 출원의 목적을 위한 도 6의 삽입물의 세부사항은 삽입물이 상기 기재된 운동의 시간 경과임을 이해하는 것보다 덜 중요하다.

본 발명의 지수 1.23은 편향되지 않은 전위를 제외한다(본 발명자가 또한 DNA 사슬이 효과적으로 비드레이닝되고, 배제된 체적 효과가 매우 충분히 발휘되는 것을 나타내는, 표 1 참조). 이는 나노포어 경우에서 유체역학적 상호작용과 함께 강제된 전위에 대해 예측된 지수 1.13과 동등하다.⁹⁷ 그러나, 현재, 메모리 효과 없이 전위의 이론을 제외하는 것은 어렵다. 벌크에서, 긴 DNA 사슬의 마찰 특성은 비드레이닝될 수 있다. 그러나, 중합체 형태는 나노슬릿 또는 나노포어에 부착된 로브에 대해 매우 불균일하다. 사슬의 일부가 Rouse 동역학을 따르고, 이에 예측 지수가 0.8 내지 1.2 사이의 어딘가일 것이 논의될 수 있다(표 1). 본 발명의 지수 1.23은 또한 실리콘-옥사이드 나노포어를 통해 전위하는 DNA에 대해 문헌[Storm et al.]^100-102에 의해 측정된 값 1.27과 일치하는 것을 나타낸다. 그러나, 이들의 이온 강도는 높았고(I = 1 M), 따라서 배제된 체적은 약했고, 이들의 사슬은 이상적인 것에 가까웠다(표 1에서 ν = 1/2). 본 발명 자체(공개되지 않음) 분석은 도 6의 상부 로브가 확실히 외부 힘 하에서 나노슬릿으로 전위되고, 이는 일정한 것으로 나타냄을 제시한다. 이러한 힘의 기원은 현재 공지되어 있지 않으며; 이는 이론적 고려사항에서 논의된 바와 같이 엔트로피 기원이 아닐 수 있는데, 이는 이러한 힘이 너무 약하기 때문이다. 이들 약한 힘은 긴 전위 및 이완 시간을 발생시킨다.

de Gennes와 Odijk 구속 레짐 사이의 전이에 관하여 문헌^{11 ,103-105}에서 일부 논쟁 또는 혼동이 존재한다. 본원에 제시된 실험 세트는 상기 논쟁에서 하나의 이슈를 해명하는 것을 돕는데, 이는 이들이 매우 낮은 염 농도에서 수행되었기 때문이다. 이온 강도의 감소는 2개의 주요 결과를 갖는다: 사슬 지속 길이의 증가, 및 장치의 표면의 디바이 길이에 의해 유도된 향상된 유효 구속. 본 발명의 실험적 관찰은 유효 구속이 사슬 지속 길이와 동일해진 경우, Odijk 레짐이 달성되는 것을 나타낸다. 이러한 특징은 유효 DNA 직경 ω가 de Gennes-Odijk 전이에 대해 주요한 영향을 미치는 것을 암시한 다른 결론¹¹과 명백히 반대된다. 그러나, 이러한 반대는 명백한 것인데, 이는 참고문헌¹¹의 이온 강도가 본원에서 사용된 것보다 훨씬 높기 때문이다. 문헌[Wang et al.]¹⁰⁶에서는 참고문헌¹¹의 결과가 중간 레짐과 어떻게 적합되는지 나타내는 것을 시도하였다. 도 3은 D = 1 ㎛ × h = 100 nm 나노슬릿에 대한 de Gennes 이론(S/L ~ (ωl _p)^1/3(Dh)-^1/3) 및 Odijk 이론(S/L ~ 1 - [(D/l _p)^2/3 + (h/l _p)^2/3])의 스트레치 예측을 포함한다. 먼저, 실험이 임의의 스케일링 레짐을 따르지 않음이 도면으로부터 추론할 수 있으나; 덤벨 형태가 나노채널 구속과 경쟁한다는 것을 상기해야 한다. 즉, DNA 덤벨은 효과적인 더 낮은 채널 폭을 "감지"한다. 이러한 효과가 포함되는 경우, 실험은 쉐도우 영역(shadow region)이 포함하는 Odijk 예측(도 3), 즉, 3h × h 나노슬릿 및 h × h 채널에 대한 Odijk 예측을 따른다. 문헌[T. Odijk]^{16 ,33,34}에 의해 지적된 바와 같이, 이의 이론은 강한 정전기적 상호작용을 포함하지 않으며, 따라서 이의 방법은 본원에서 고려되는 더 낮은 이온 강도 조건에서 스트레치를 약간 과소 예측할 것이다. 본 발명자는 완전한 정전기적 상호작용을 설명하기 위한 개선된 분자 모델을 현재 개발중이다.²⁵ 덤벨이 형성되고, 분자가 완전히 스트레칭된 방식으로 제시되는 경우, 자연적인 문제는 나노슬릿 내부에서의 사슬의 운동성 및 덤벨의 이완 시간을 시험하는 것이다. 그러나, 본원에서 보고된 덤벨 동역학은 시종일관 스트레칭된 DNA 분자를 필요로 하는 영상화를 이용한 유전체 분석 계획을 뒷받침할 이완 시간을 제시한다. 낮은 이온 강도 용액으로의 수크로스의 첨가 및 온도의 감소(즉, 로딩 후에 변화됨)는 용액 점도를 증가시킬 것이며, 덤벨 분자의 이완 시간을 연장시킬 것이다.

현대의 유전체 분석은 큰 DNA 분자에 의해 독특하게 제시되는 긴-범위의 서열 정보를 요구한다. 이와 같이, 타이트하게 커플링된 실험 및 시뮬레이션 접근법을 이용하여 본원에서 제시된 발견은 더 새로운 유전체 분석 시스템의 설계 및 수행을 위한 실험적 및 이론적 기반을 제공하였다. 이들 진전은 유전체 구조의 우리의 이해를 크게 향상시킬 방식으로 매우 긴 DNA 분자에 의해 본질적으로 제공된 정보적 이점을 충분히 레버리징(leveraging)하기 위한 수단을 제공할 수 있다.

부록

일반 기하학적 이왈드 -유사 방법 및 O(N) 알고리즘 ^{25 - 31} 유속 M·F는 문헌[Hernandez-Ortiz et al.]²⁸에 의해 도입된 O(N) GGEM을 이용하여 계산된다. GGEM의 간단한 설명은 Nb 포인트 힘의 분포에 의해 유도된 유동에 대한 식의 스토크스 시스템을 고려하여 시작한다:

상기 식에서, η은 유체 점도이고, 힘 밀도는 하기와 같다:

상기 식에서, f _l 은 포인트 x _l 에서 유체에 대해 발휘된 힘이다.

27의 용액은 Stokeslet^{28 ,107} 식으로 기재될 수 있고, M·F 결과에 조합될 수 있다. 명백히 계산된 경우, 이러한 결과는 O(N ²) 계산을 필요로 하는 행렬-벡터 연산이다. GGEM은 행렬-벡터 조작을 수행함이 없이 임의의 기하학(적절한 경계 조건을 가짐)에 대해 결과를 함축적으로 결정한다. 이는 통상적인 입자-메쉬 이왈드 방법^108-110과 유사한 평활 함수 g(x)를 이용하여 식 27에서의 힘-밀도 식 ρ(x) = ρ_l(x) + ρ_g(x)의 재언급으로 시작한다. 이러한 스크리닝 함수는 하기를 만족시킨다:

스토크스 식의 선형성에 의해, 유속은 각각의 힘-밀도에 대한 별개의 해법으로 2개 부분의 합계로 기재된다. 하기 "국부 밀도"는 한정되지 않은 변역을 추정하여 계산되는 국부 속도 u_l(x)를 유도한다:

상기 식에서, G_l(x)는 평활 함수 g(x)에 의해 변형된 강제항을 갖는 스토크스 식의 해법으로부터 획득된 평활화된 Stokeslet이 공제된 자유-공간 그린 함수, 또는 Stokeslet으로 구성된다.

스토크스 식에 대해, 본 발명자는 하기에 의해 규정된 변형된 가우스 평활 함수가 G₁(x)에 대한 간단한 식을 발생시키는 것을 발견하였다:

G_l(x)는 길이 스케일 α-1에 대해 지수적으로 감소하므로, 실제 국부 속도는 각각의 입자 l에 대한 가까운 이웃(near-neighbors)만을 고려하여 통상적인 이왈드 방법에서와 같이 계산될 수 있다.^58,111

본 발명의 연구에 대해, 포인트-입자 어림셈은 요망되지 않으며; 상세하게는, 사슬 크기가 증가함에 따라, 물리적이지 않은 속도를 갖는 입자가 중첩될 가능성이 증가한다. 이러한 문제를 피하기 위해, 비-단독 속도를 제공하는 새로운 평활화-힘 밀도를 규정하기 위해 비드 유체역학 반지름 α가 이용될 수 있다. 이는 ξ ~ α^-1과 함께 α가 ξ에 의해 대체된 동일한 변형 가우스를 이용하여 규칙화된 Stokeslet에 의해 Stokeslet를 대체하여 하기를 생성시킴으로써 달성된다:

상기 식에서, 윗첨자 R은 규칙화된 힘 밀도를 나타낸다. ξ^-1 = 3α/(π)^1/2에 대해, 최대 유속은 반지름 a를 갖는 입자의 것과 동일하며, 쌍 이동은 양의 정부호로 남아 있는다.^28,112

전체 속도 u _g(x)는 하기에 의해 제공되는 힘 분포 ρ_g(x)로 인한 것이다:

전체 변역에 대해, 본 발명자는 스토크스 식에 대한 해법을 수치적으로 발견하였고, 이는 u_l(x) + u_g(x)가 적절한 경계 조건을 만족시키는 것을 필요로 한다. 비-슬립 경계에 대해, 본 발명자는 u_g(x) = -u_l(x)를 필요로 한다. 주기적 경계 조건을 이용한 문제에 대해, 전체 속도 u_g(x)의 주기성을 보장하기 위해 푸리에 기법이 이용될 수 있다. 국부 속도 u_l(x)에 대한 주기성은 최소상 규약을 이용하여 획득된다.

본 발명의 경우, 전체 분포는 FEM 포뮬레이션으로 해결되고, 여기서 속도에 대해 8개의 절점을 갖는 직육면체 요소^{27 ,113}가 이용되며, 상응하는 전체 압력에 대해 일정 요소가 이용된다. 선형 시스템의 해법은 희소 행렬에 대한 신속 LU 분할 해석기 SUPER-LU를 통해 수행된다.^{114 , 115} 행렬의 LU 분할은 시뮬레이션의 시작시에만 수행되고; 시간 진행 동안, 유일한 필요한 계산은 GGEM 알고리즘을 매우 효율적으로 만드는 후진 대입(back-substitution)이다(~ O(N), 행렬의 희소 지표를 제공함). GGEM 해법이 α와 독립적이라는 사실을 가정하면, 상기 파라미터의 적절한 선택은 계산 시간의 최적화를 기초로 한다. 전체 계산에서, 정확한 해법에 도달하기 위해, 메쉬 크기는 α^-1인 평활 함수의 스케일보다 작아야 한다. 따라서, 메쉬 해결은 M ~ α³로 스케일링되며; 각각의 후진 대입의 비용은 M²로 스케일링되어, α⁶로 스케일링되는 총 전체 비용을 발생시킨다. 국부 계산에서, 국부 그린 함수의 감소에 의해 결정된 이웃 목록 내에 놓인 모든 쌍의 분포가 계산되어야 한다. 국부 그린 함수는 거리 α^-1에 걸쳐 감소하고, 따라서 각각의 입자에 대한 이웃의 수는 Nα^{- 3}로 스케일링된다. 계산은 입자의 수 × 입자 당 이웃의 수인 모든 쌍에 걸쳐 수행되어야 하며, 이는 N²α^{- 3}로 스케일링되는 국부 계산 비용을 발생시킨다. α에 관해 총(국부 및 전체) 계산 비용을 최소화시키는 것은 α_opt ~ N^2/9로 스케일링되는 최적 α 및 O(N ^4/3)로 스케일링되는 전체 비용을 제공한다. 본 발명자가 해법을 위해 다양한 선형 방법(GMRES, 바이-컨쥬게이트(Bi-conjugate) 방법¹¹⁶)을 선택한 경우, 전체 비용은 α³로 스케일링될 것이며, 이는 α_opt ~ N^1/3의 최적 값 및 O(N)으로 스케일링되는 전체 계산 비용을 발생시킬 것이다.

GGEM은 M의 명확한 구성 없이 M·F를 발생시키므로, 이러한 결과를 필요로 하지 않고 식 10을 시간-적분하는 것, 즉, "행렬 비함유" 포뮬레이션이 요망된다. 문헌[Fixman]^69,70에서는

/

R·D를 평가할 필요 없이 상기 시스템을 시간-적분하는 방법을 제안하였다:

유일한 남아 있는 단계는 행렬을 포함하지 않는 방식으로 B^-1·dW를 평가하는 것이다. 또한 문헌[Fixman]⁷¹에 의해 기재된 바와 같이, 이는 행렬 자체가 아닌 행렬-벡터 결과만을 필요로 하는 체비쉐프 다항식 근사 방법(Chebyshev polynomial approximation method)에 의해 수행될 수 있다. 이러한 접근법은 이미 한정되지 않거나 주기적 변역^{26 -28,30,62,64,117, 118}으로 수행되었으며; GGEM과 함께 이는 임의의 변역으로 직접 일반화될 수 있다.

본 발명은 하나 이상의 바람직한 구체예에 의해 기재되었으며, 명백히 언급된 것과 더불어 많은 등가물, 대안, 변화, 및 변형이 가능하며, 이들은 본 발명의 범위 내이다.

참고문헌

Claims (21)

1. 제1 마이크로채널;
   제2 마이크로채널;
   제1 마이크로채널과 제2 마이크로채널 사이에 걸쳐 있는 나노슬릿(nanoslit)으로서, 제1 마이크로채널과 제2 마이크로채널 사이에 유체 경로를 제공하는, 나노슬릿;
   제1 말단 부분, 제2 말단 부분, 및 제1 말단 부분과 제2 말단 부분 사이에 위치된 중심 부분을 갖는 핵산 분자; 및
   나노슬릿 및 제1 마이크로채널 및 제2 마이크로채널 내의 이온 완충액을 포함하는 미세유체 장치로서,
   제1 마이크로채널이 나노슬릿의 제1 말단에 인접한 제1 클러스터 영역을 포함하고, 제2 마이크로채널이 나노슬릿의 제2 말단에 인접한 제2 클러스터 영역을 포함하고, 제1 클러스터 영역이 제1 말단 부분을 함유하고, 제2 클러스터 영역이 제2 말단 부분을 함유하고, 나노슬릿이 중심 부분을 함유하며,
   핵산 분자가 나노슬릿의 나노슬릿 길이보다 긴 펼친 길이(contour length)를 갖고,
   이온 완충액의 이온 강도 및 나노슬릿 및 핵산 분자의 정전기적 또는 유체역학적 특성이 조합되어 나노슬릿 높이 또는 나노슬릿 폭 이상인 합계된 디바이 길이(Debye length)를 제공하고, 나노슬릿 높이 또는 나노슬릿 폭이 나노슬릿의 가장 작은 물리적 치수인,
   미세유체 장치.
2. 제 1항에 있어서, 나노슬릿이 1 ㎛ 이하의 나노슬릿 폭 또는 100 nm 이하의 나노슬릿 높이를 갖는 미세유체 장치.
3. 제 1항에 있어서, 나노슬릿 길이가 핵산 분자의 펼친 길이의 절반 이하인 미세유체 장치.
4. 제 1항에 있어서, 마이크로채널 중 적어도 하나가 약 20 ㎛의 마이크로채널 폭, 약 10 mm의 마이크로채널 길이, 및 약 1.66 ㎛의 마이크로채널 높이 중 하나 이상을 갖는 미세유체 장치.
5. 제 1항에 있어서, 장치가 온도 조정 모듈을 추가로 포함하는 미세유체 장치.
6. 제 1항에 있어서, 이온 완충액이 20℃ 이하의 온도를 갖는 미세유체 장치.
7. 제 1항에 있어서, 이온 완충액이 점도 개질제를 추가로 포함하는 미세유체 장치.
8. 제 1항에 있어서, 핵산 분자가 적어도 약 30초의 이완 시간을 갖는 미세유체 장치.
9. 제 1항에 있어서, 핵산 분자가 DNA 분자인 미세유체 장치.
10. 제 1항에 있어서, 핵산 분자가 나노슬릿의 나노슬릿 길이보다 적어도 2배 더 큰 펼친 길이를 갖는 미세유체 장치.
11. 핵산 분자의 중심 부분이 나노슬릿을 차지하고, 핵산 분자의 제1 말단 부분이 나노슬릿의 제1 말단에 인접한 제1 클러스터 영역을 차지하고, 핵산 분자의 제2 말단 부분이 나노슬릿의 제2 말단에 인접한 제2 클러스터 영역을 차지하도록 핵산 분자를 배치하는 것을 포함하는, 이온 완충액 중에서 핵산 분자를 스트레칭시키는 방법으로서,
    나노슬릿, 제1 클러스터 영역, 및 제2 클러스터 영역이 이온 완충액을 포함하고,
    핵산 분자가 나노슬릿의 길이보다 큰 펼친 길이를 갖고,
    이온 완충액의 이온 강도 및 나노슬릿 및 핵산 분자의 정전기적 또는 유체역학적 특성을 조합시켜 나노슬릿 높이 또는 나노슬릿 폭 이상의 합계된 디바이 길이를 제공하고, 나노슬릿 높이 또는 나노슬릿 폭이 나노슬릿의 가장 작은 물리적 치수인, 방법.
12. 제 11항에 있어서, 핵산 분자를 배치하는 것이 나노슬릿을 통해 핵산 분자를 스레딩(threading)시키는 것을 포함하는 방법.
13. 제 11항에 있어서, 핵산 분자를 배치하는 것이 핵산 분자의 중심 부분을 나노슬릿으로 동전기학적으로 유도하는 것을 포함하는 방법.
14. 제 11항에 있어서, 나노슬릿이 1 ㎛ 이하의 나노슬릿 폭 또는 100 nm 이하의 나노슬릿 높이를 갖는 방법.
15. 제 11항에 있어서, 나노슬릿 길이가 핵산 분자의 펼친 길이의 절반 이하인 방법.
16. 제 11항에 있어서, 마이크로채널 중 적어도 하나가 약 20 ㎛의 마이크로채널 폭, 약 10 mm의 마이크로채널 길이, 및 약 1.66 ㎛의 마이크로채널 높이 중 하나 이상을 갖는 방법.
17. 제 11항에 있어서, 이온 완충액이 20℃ 이하의 온도를 갖는 방법.
18. 제 11항에 있어서, 이온 완충액이 점도 개질제를 추가로 포함하는 방법.
19. 제 11항에 있어서, 핵산 분자가 적어도 약 30초의 이완 시간을 갖는 방법.
20. 제 11항에 있어서, 핵산 분자가 DNA 분자인 방법.
21. 제 11항에 있어서, 중심 부분의 적어도 일부를 영상화시키는 것을 추가로 포함하는 방법.

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