KR20160115286A - 막걸리로부터 파네졸 및 스쿠알렌의 용매 추출법 - Google Patents

막걸리로부터 파네졸 및 스쿠알렌의 용매 추출법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혼합 용매를 이용해 막걸리에서 스쿠알렌 및 파네졸을 동시에 추출하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 석유 에테르(petroleum ether), 클로로포름(chloroform), 메탄올(methanol), 및 n-부탄올(n-butanol)의 혼합용매를 추출용매로 사용하는 것을 특징으로 하는 막걸리로부터 파네졸(farnesol) 또는 스쿠알렌(squalene)을 추출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 용매 추출법을 사용하여 막걸리에 함유된 파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene)을 효율적으로 동시에 추출할 수 있으며, 특별한 추출 도구를 필요로 하지 않아 저렴한 비용으로 쉽게 높은 회수율로 분석할 수 있다.

Description

막걸리로부터 파네졸 및 스쿠알렌의 용매 추출법{Method for the solvent extraction of farnesol and squalene from makgeolli}
본 발명은 혼합 용매를 이용해 액체 시료에서 스쿠알렌 또는 파네졸을 고회수율로 용매 추출하는 방법에 관한 것이다.
막걸리는 우리나라 전통주의 일종으로 원래 고두밥에 누룩을 빚은 술이다. "막 걸러낸 술"이란 의미로 흰색의 불투명한 색깔을 띠고 있어 탁주라고 하기도 한다. 최근 막걸리는 건강 전통주로 젊은이들로부터 많은 각광을 받고 있으며 일본을 비롯한 아시아 지역에서 한류 열풍과 더불어 수출이 확대되고 있다. 막걸리는 한국을 대표하는 문화 컨텐츠의 일부가 되어가고 있기 때문에, 국가적 브랜드 상품으로 발돋움할 수 있도록 그를 뒷받침해줄 수 있는 과학적인 연구가 필요하다.
막걸리의 성분에 관한 연구는 발효식품 과학자들이나 식품분석과학자들에 의하여 이미 여러 편의 논문이 발표되었다. 막걸리의 조성을 살펴보면 수분이 약 90%이고, 알코올 함량이 6-8%, 나머지 성분은 탄수화물, 단백질 등으로 구성되어 있다.
막걸리는 와인과 맥주처럼, 효모의 발효 과정을 통해 제조되므로 막걸리의 향미성분은 생산 제품의 질을 측정하는 중요한 요소이기도 하다. 막걸리의 향미에 영향을 미치는 24종의 에스테르, 19종의 알코올, 9종의 산, 및 10종의 알데히드 등이 보고되었으나, 막걸리 기능성 성분에 관한 연구는 많지 않은 실정이다. 와인의 경우, 기능성 물질에 대한 연구가 꾸준히 활발하게 이루어지고 있으며, 레스베라트롤(resveratrol), 비-플라보노이드 성분, 쿼세틴(quercetin), 플라보놀(flavonol) 등의 물질이 와인에 함유되어 있어 적절한 양의 와인 섭취는 심혈관계 질환, 당뇨병, 골다공증이나 신경계 질환을 저해시킬 수 있다고 보고되어 있다. 막걸리로부터 기능성 성분을 추출하여 분석하기 위하여 고상 미세 추출(Solid Phase Micro Extraction, SPME), 동적 헤드스페이스 샘플링(Dynamic headspace sampling) 등 다양한 방법이 시도되었으나 아직도 막걸리의 기능성 성분 특성에 관한 연구는 밝혀지지 않은 것이 더욱 많다.
최근 본 발명자들은 막걸리에 파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene)이 포함되어 있다는 것을 발견하고 대한민국 등록특허 제10-1485426호 등을 출원하였다.
파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene)은 여러 암 세포의 저해인자로 밝혀져 있다. 특히 파네졸(farnesol) 및 관련 이소프레노이드(isoprenoids), 페릴릴 알코올(perillyl alcohol) 및 제라니올(geraniol)은 많은 과일 및 아로마 식물에서 발견되는 자연 화합물이라고 보고되어왔다. 특히, 파네졸은 물에는 불용성이나, 오일과는 혼합가능하다. 이소프레노이드 알코올 파네졸은 다양한 암종(carcinoma) 세포 타입의 세포 싸이클 휴지기(cell cycle arrest) 및 세포사멸에 관한 효과적인 유도체이다. 파네졸이 몇몇 동물 모델에서 종양생성을 억제한다는 것이 보고되면서, 인 비보(in vivo) 화학예방요법(chemopreventative) 및 항암제로서 유용할 것이라 예상되고 있다(McAnally, Jung, & Mo, 2003; Lim, & Park, 2006; Ong, Heidor, De Conti, Dagli, & Moreno, 2006; Joo, Liao, Collins, Grissom, & Jetten, 2007; Joo, & Jetten, 2010). 스쿠알렌(squalene)은 심해상어의 간에 많이 함유되어 있는 불포화지방산으로, 체내 면역기능을 강화시켜 암세포 성장을 억제하고 인체에 유해한 활성산소를 제거하며, 체내 중금속과 노폐물 등을 녹여 배출시키는 효능이 있다.
본 발명자들은 막걸리에서 파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene) 성분을 분리하고자 SBSE(Stir Bar Sorptive Extraction)와 GC-MSD(Gas Chromatography-Mass Selective Detector)을 사용하였다. 막걸리와 같은 액체 식품의 경우 수분 함량이 높아 SPME(Solid-Phase Micro Extraction)나 DHS(Dynamic Headspace Sampling)법으로 향미성분을 추출할 경우 수분에 의한 방해로 인하여 목적하는 향미성분이 충분히 추출되지 않는 경우가 있다. 따라서, 이 경우 목적하는 성분만을 선택적으로 추출하기 위해서는 SBSE방법이 효과적이다. 하지만, SBSE방법은 고가의 장비가 필요하기 때문에 막걸리 업체나 여러 소규모의 연구실에서 경제적으로 부담되는 추출방법이라는 단점이 있다. 업체의 현실을 고려하여 간편한 용매 추출법과 GC-MSD 뿐만 아니라 GC-FID(Gas Chromatography with Flame Ionization Detector)로도 분석할 수 있는 방법이 필요한 현실이다.
대한민국 등록특허 제10-1485426호
이에 본 발명은 액체 시료, 특히 막걸리로부터 파네졸(farnesol) 또는 스쿠알렌(squalene)을 간편한 용매 추출법을 사용하여 추출하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 석유 에테르(petroleum ether), 클로로포름(chloroform), 메탄올(methanol), 및 n-부탄올(n-butanol)의 혼합용매를 추출용매로 사용하는 것을 특징으로 하는 시료로부터 파네졸(farnesol) 또는 스쿠알렌(squalene)을 추출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 시료로부터 파네졸(farnesol) 또는 스쿠알렌(squalene)을 추출하는 방법을 통해 파네졸(farnesol) 또는 스쿠알렌(squalene)을 각각 추출할 수 있으며, 또한 파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene)을 동시에 추출할 수 있다.
본 발명에서 상기 시료는 파네졸(farnesol) 또는 스쿠알렌(squalene)이 포함된 것으로 예상되는 액체 시료를 의미한다. 상기 액체 시료는 액체인 시료라면 어느 것에 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 알코올 음료가 해당되며, 가장 바람직하게는 막걸리가 해당된다.
본 발명에서 상기 막걸리는 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 약 80 내지 90%의 수분 및 약 5 내지 8%의 알코올을 포함하고 있는 것일 수 있다. 막걸리로부터 기능성 성분을 추출할 경우 높은 수분 함량과 알코올 함량으로 인해 추출에 어려움이 있으나, 본 발명의 추출방법을 통해 우수한 효율로 파네졸(farnesol) 또는 스쿠알렌(squalene)을 추출할 수 있다.
본 발명에서 상기 막걸리는 시중에서 시판되어 있는 막걸리를 사용할 수 있으며, 당업계 공지된 막걸리 제조방법에 따라 제조된 막걸리를 사용할 수도 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 다양한 막걸리의 제조방법이 있으나 일반적인 제조방법으로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, i) 고두밥을 만드는 단계 ii) 누룩을 제조하는 단계 iii) 고두밥과 누룩을 혼합하는 단계 iv) 물을 첨가한 후 발효시키는 단계, iv) 술덧을 걸러내는 단계를 포함한다.
상기 고두밥은 지에밥이라고도 하며, 아주 되게 지은 된밥을 의미하며, 주로 식혜나 술을 만들 때 사용한다. 고두밥의 원료로는 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 찹쌀, 멥쌀, 현미, 보리, 밀가루 등의 곡물을 이용하여 제조할 수 있다.
상기 누룩은 술을 만들 때 사용하는 발효제의 용도로 사용되며, 술을 만드는 효소를 갖는 곰팡이를 곡류에 번식시킨 것을 의미한다. 상기 곰팡이는 바람직하게는 누룩곰팡이이고, 빛깔에 따라 황국균, 흑국균, 홍국균 등이 있으며, 막걸리의 제조에 있어서 바람직하게는 황국균이 사용된다. 상기 곡류는 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 밀, 쌀, 녹두, 보리 등이 포함된다.
본 발명에서 상기 석유 에테르(petroleum ether)는 혼합용매 총 부피에 대하여 30 내지 40 부피%일 수 있으며, 바람직하게는 혼합용매 총 부피에 대하여 32 내지 38 부피%일 수 있고, 더욱 바람직하게는 혼합용매 총 부피에 대하여 35 부피%일 수 있다.
본 발명에서 상기 클로로포름(chloroform)은 혼합용매 총 부피에 대하여 35 내지 45 부피%일 수 있으며, 바람직하게는 혼합용매 총 부피에 대하여 37 내지 43 부피%일 수 있고, 더욱 바람직하게는 혼합용매 총 부피에 대하여 40 부피%일 수 있다.
본 발명에서 상기 메탄올(methanol)은 혼합용매 총 부피에 대하여 15 내지 25 부피%일 수 있으며, 바람직하게는 혼합용매 총 부피에 대하여 17 내지 23 부피%일 수 있고, 더욱 바람직하게는 혼합용매 총 부피에 대하여 20 부피%일 수 있다.
본 발명에서 상기 n-부탄올(n-butanol)은 혼합용매 총 부피에 대하여 1 내지 10 부피%일 수 있으며, 바람직하게는 혼합용매 총 부피에 대하여 3 내지 8 부피%일 수 있고, 더욱 바람직하게는 혼합용매 총 부피에 대하여 5 부피%일 수 있다.
본 발명에서 상기 석유 에테르(petroleum ether), 클로로포름(chloroform), 메탄올(methanol), 및 n-부탄올(n-butanol)은 5 내지 10 : 5 내지 10 : 2 내지 6 : 1 의 부피비로 혼합될 수 있으며, 바람직하게는 6 내지 8 : 7 내지 9 : 3 내지 5 : 1 의 부피비로 혼합될 수 있고, 더욱 바람직하게는 7 : 8 : 4 : 1 의 부피비로 혼합될 수 있다.
본 발명에서 상기 파네졸(farnesol) 또는 스쿠알렌(squalene)은 80 내지 120%의 회수율로 추출될 수 있다. 상기 회수율은 FDA에서 제시한 회수율 기준(1 ㎍/㎖ 경우 75-120%, 0.01 ㎍/㎖ 경우 70-125%)에 적합하다. 회수율은 참값으로부터 평균치의 오차정도로서 정확성을 평가하는 추출 효율로서 기질(식품 matrix)의 영향을 고려해야한다. 120% 이상의 회수율을 보이는 경우는, 막걸리의 분석대상물질(파네졸 또는 스쿠알렌) 이외의 막걸리 중에 존재하는 다른 구성성분에 의해 분석대상물질의 검출을 방해하여 회수율에 영향을 주는 것이라고 볼 수 있다. 이러한 이유로, 식품의 분석에서는 식품 matrix에 대한 특이성이 높은 시험방법이 적용되어야 한다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 시료로부터 파네졸(farnesol) 또는 스쿠알렌(squalene)을 추출하는 방법을 제공한다.
S1) 시료에 석유 에테르(petroleum ether), 클로로포름(chloroform), 메탄올(methanol), 및 n-부탄올(n-butanol)의 혼합용매를 섞는 단계;
S2) 교반하는 단계;
S3) 원심분리하는 단계;
S4) 하등액을 수득하는 단계; 및
S5) 수득된 하등액을 농축하는 단계.
본 발명에서 상기 S1) 단계의 석유 에테르(petroleum ether), 클로로포름(chloroform), 메탄올(methanol), 및 n-부탄올(n-butanol)은 혼합용매 총 부피에 대하여, 석유 에테르(petroleum ether)는 30 내지 40 부피%, 클로로포름(chloroform)은 35 내지 45 부피%, 메탄올(methanol)은 15 내지 25 부피%, 및 n-부탄올(n-butanol)은 1 내지 10 부피%일 수 있다. 바람직하게는 혼합용매 총 부피에 대하여, 석유 에테르(petroleum ether)는 32 내지 38 부피%, 클로로포름(chloroform)은 37 내지 43 부피%, 메탄올(methanol)은 17 내지 23 부피%, 및 n-부탄올(n-butanol)은 3 내지 8 부피%일 수 있다. 더욱 바람직하게는 혼합용매 총 부피에 대하여, 석유 에테르(petroleum ether)는 35 부피%, 클로로포름(chloroform)은 40 부피%, 메탄올(methanol)은 20 부피%, 및 n-부탄올(n-butanol)은 5 부피%일 수 있다.
본 발명에서 상기 S2) 단계의 교반은 20분 내지 40분 지속될 수 있다. 바람직하게는 25분 내지 35분 지속될 수 있다. 더욱 바람직하게는 30분 지속될 수 있다.
본 발명에서 상기 S3) 단계의 원심분리는 8000 내지 12000 rpm 에서 5 내지 15분 수행할 수 있으며, 바람직하게는 10000 rpm 에서 10분 수행할 수 있다.
본 발명에서 상기 S5) 단계의 농축은 진공감압농축기를 사용하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 액체 시료로부터 파네졸(farnesol) 또는 스쿠알렌(squalene)을 추출하고 분석하는 방법을 제공한다:
S1) 시료에 석유 에테르(petroleum ether), 클로로포름(chloroform), 메탄올(methanol), 및 n-부탄올(n-butanol)의 혼합용매를 섞는 단계;
S2) 교반하는 단계;
S3) 원심분리하는 단계;
S4) 하등액을 수득하는 단계;
S5) 수득된 하등액을 농축하는 단계; 및
S6) GC-MS(Gas Chromatograph-Mass Spectrometer)로 농축물을 분석하는 단계.
본 발명에서 상기 농축물은 에탄올, 아세톤 또는 에틸아세테이트로 용해하여 분석할 수 있으며, 바람직하게는 에틸아세테이트로 용해하여 분석할 수 있다.
본 발명에서 상기 파네졸(farnesol)은 0.1 내지 50 ㎍/㎖ 의 범위로 분석될 수 있으며, 바람직하게는 0.09 내지 1 ㎍/㎖ 의 범위로 분석될 수 있다.
본 발명에서 상기 스쿠알렌(squalene)은 1 내지 500 ㎍/㎖ 의 범위로 분석될 수 있으며, 바람직하게는 0.85 내지 10 ㎍/㎖ 의 범위로 분석될 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 용매 추출법을 사용하여 시료에 함유된 파네졸(farnesol) 또는 스쿠알렌(squalene)을 효율적으로 추출할 수 있으며, 특별한 추출 도구를 필요로 하지 않아 저렴한 비용으로 쉽게 분석할 수 있다.
도 1은, 메탄올/메틸렌 클로라이드 혼합용매(좌)와 메탄올/클로로포름 혼합용매(우)로 각각 막걸리를 추출한 결과를 나타낸 사진이다.
도 2는, 용매추출을 위한 자동왕복쉐이커(reciprocating shaker)와 석유 에테르/메탄올 혼합용매로 막걸리를 추출한 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은, 석유 에테르/클로로포름/메탄올/n-부탄올 추출법을 사용하여 막걸리의 파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene)을 추출하는 공정을 나타낸 도면이다.
도 4는, 파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene) 표준용액을 GC/MSD(Gas chromatograph/mass selective detector)의 SIM mode로 분석한 TIC(Total Ion Chromatogram)이다.
도 5는, GC/MSD를 사용하여 막걸리 용매 추출액(석유 에테르 50, 디클로로메탄 30, 메탄올 20)을 분석한 TIC(Total Ion Chromatogram)이다.
도 6은, 막걸리 중에 함유되어 있는 파네졸(farnesol) 표준물질을 GC/MSD-SIM mode로 분석한 매스 스펙트럼(mass spectrum)이다.
도 7은, 막걸리 중에 함유되어 있는 스쿠알렌(squalene) 표준물질을 GC/MSD-SIM mode로 분석한 매스 스펙트럼(mass spectrum)이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
[실험방법]
1. 시료 및 물질
12 종의 막걸리 시료는 (서울 장수 생막걸리, 국순당 생막걸리, 톡쏘는 쌀막걸리, 미담, 서울 월매 쌀막걸리, 국산당 쌀막걸리, 장수 홍삼막걸리, 복분자 막걸리 주시락, 배상면주가 유기농 막걸리, 경주 법주 쌀막걸리, 친환경쌀 참살이 생막걸리, 국순당 예담 차례주) 시중마트에서 구입하여 사용하였다.
2. GC -MS (Gas chromatography-mass spectrometry) 분석 조건
막걸리에서 석유 에테르(petroleum ether)/클로로포름(chloroform)/메탄올(methanol)/n-부탄올(n-butanol) 추출법을 사용하여 추출된 파네졸(farnesol)과 스쿠알렌(squalene)은 GC-MS (Agilent 7890A GC, MD 5973 quadruple MS)로 분석되었다. 기능성 성분 정성 및 정량을 위한 GC 분석조건으로 컬럼은 HP-5MS bonded-phase fused-silica capillary column (0.25 ㎛ i.d. × 30 m, 0.25 ㎛ film thickness, Agilent Technologies, Middleburg, OI, USA)를 사용하였다. 인젝터(injector) 온도는 250℃, 오븐(oven) 온도는 50℃에서 3분간 유지한 다음, 분당 10℃/분으로 165℃까지 올린 후 5분간 유지하였다. 그 후, 260℃까지 10℃/분으로 올리고 2분간 유지한 뒤 최종온도인 305℃까지 15℃/분으로 승온 후 6분간 유지하였다. 운반기체는 헬륨을 사용하였고 (1.0 ㎖/분), split mode (5:1)로 1 ㎕ 주입하였다. 그리고 파네졸(farnesol)과 스쿠알렌(squalene)의 질량분석을 위해 SIM (Selected Ion Monitoring) mode를 사용하였으며, 파네졸(farnesol)에 대해 69, 81, 93 m/z, 스쿠알렌(squalene)에 대해 69, 95, 137 m/z 의 이온 질량이 선택되었다.
3. 메탄올/메틸렌 클로라이드, 메탄올/클로로포름 추출법을 통한 막걸리로부터 파네졸( farnesol ) 및 스쿠알렌( squalene ) 추출
용매를 사용하여 막걸리로부터 기능성 성분을 추출할 경우 높은 수분함량과 알코올 함량으로 인하여 추출에 어려움이 있다. 막걸리의 함유된 90%의 수분과 6%정도의 알코올 함량 때문에 기능성 성분과 향미성분을 추출하기 위하여 중간극성의 용매인 메틸렌 클로라이드(methylene chloride) 또는 클로로포름(chloroform)과 극성이 높은 메탄올(methanol)을 혼합하여 기능성물질을 추출하였다(도 1).
메탄올/메틸렌 클로라이드 혼합용매와 메탄올/클로로포름 혼합용매로 각각 막걸리를 추출한 결과, 메틸렌 클로라이드와 클로로포름은 물이나 메탄올보다 비중이 크기 때문에 분액 깔데기에서 아래층으로 분리되지만, 층 분리가 쉽게 되지 않았다(도 1). 유기용매 층과 시료 간 분리를 위하여 12시간 이상이 소요되었기 때문에, 막걸리로부터 파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene) 성분을 추출하는데 효율성이 매우 낮은 것으로 판단된다.
4. 메탄올/석유 에테르 추출법을 통한 막걸리로부터 파네졸 ( farnesol ) 및 스쿠알렌( squalene ) 추출
석유 에테르(petroleum ether)는 비극성 용매로, 휘발성이 매우 강하고 시료용기를 녹이는 성질이 강하므로 이를 고려하여 밀폐가 잘되는 시료 추출용기를 선정하여 막걸리로부터 파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene)을 추출하였다 (도 2). 막걸리 50 ㎖을 250 ㎖의 원심분리용 셀에 취하고 혼합 용매 90 ㎖ (석유 에테르 50 ㎖, 메탄올 40 ㎖)을 가하였다. 30% NaCl 용액을 각 셀에 30 ㎖ 첨가하였다. 쉐이커(shaker)를 사용하여 30분간 추출한 후, 원심 분리 (10,000 rpm, 10분) 하여 상등액을 취하였다. 이 추출 과정은 세 번 반복되었고, 모아진 추출액은 무수 황산나트륨(anhydrous sodium sulfate)으로 탈수되었다. 추출액은 진공감압농축기를 사용하여 농축되고, 전체부피를 에탄올(ethanol)을 사용하여 1.5 ㎖ 로 맞추었다. 회수율 실험은 막걸리 샘플에 0.2, 1, 10 ㎍/㎖의 두 가지 표준물질을 첨가하여 측정되었다. 위와 같은 추출방법을 수행 하에, 0.2, 1 ㎍/㎖의 파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene)에 대해 에틸아세테이트(ethylacetate)로 전체부피를 맞춰 회수율 실험이 함께 진행되었다. 추출물의 두 가지 기능성 성분인 파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene)은 GC-MSD로 분석하였다.
회수율 실험은 막걸리 샘플에 0.2, 1, 10 ㎍/㎖의 두 가지 표준물질을 첨가하여 측정되었는데, 각각 첨가된 농도에 대해 파네졸(farnesol)은 161.9±10.9%, 77.9±18.1%, 및 35.8±0.8%를 나타내었고, 스쿠알렌(squalene)은 33.6±13.2%, 47.4±15.7%, 및 72.6±1.4%를 나타내었다. 낮은 농도의 스쿠알렌(squalene) 표준물질 첨가하는 경우, 낮은 회수율을 보여 용매추출방법으로의 변경이 필요하였다. 두 기능성 성분을 추출하는 용매의 변경뿐만 아니라, 스쿠알렌(squalene)이 비극성이기 때문에 전체부피를 맞추는 용매를 에탄올(ethanol)에서 에틸아세테이트(ethylacetate)로 변경하는 필요하다고 판단되었다. 2 ㎍/㎖과 100 ㎍/㎖ 범위에서 파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene)의 linear range는 각각 0.9995와 0.9998로 좋은 직선성을 보였다. 또한, 파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene)의 LOD(limit of detection)와 LOQ(limit of quntification)는 각각 0.58 ㎍/㎖, 1.76 ㎍/㎖와 0.38 ㎍/㎖, 1.15 ㎍/㎖를 보였다. 위와 같은 추출방법 하에, 0.2, 1 ㎍/㎖의 파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene)에 대해 에틸아세테이트(ethylacetate)로 전체부피를 맞춰 회수율 실험 결과, 파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene)에 대한 회수율은 각각 68.7±17.6%, 219±10.9%와 217±38.8%, 219±10.9%로 나타나, 에탄올로 전체부피를 맞춰 실험된 결과보다 회수율은 높아졌으나, 국제규격(CODEX) 범위에 허용되는 수치(80-120%)가 아니기 때문에 추출용매 변경을 다시 수행하는 것이 필요한 것으로 판단되었다.
5. 석유 에테르/디클로로메탄/메탄올 추출법을 통한 막걸리로부터 파네졸( farnesol ) 및 스쿠알렌( squalene ) 추출
막걸리 50 ㎖을 250 ㎖의 원심분리용 셀에 취하고 혼합 용매 100 ㎖ (석유 에테르 50 ㎖, 디클로로메탄 30 ㎖, 메탄올 20 ㎖)을 가하였다. 30% NaCl 용액을 각 셀에 30 ㎖ 첨가하였다. 쉐이커(shaker)를 사용하여 30분간 추출한 후, 원심 분리 (10,000 rpm, 10분) 하여 상등액을 취하였다. 이 추출 과정은 세 번 반복되었고, 모아진 추출액은 무수 황산나트륨(anhydrous sodium sulfate)으로 탈수되었다. 추출액은 진공감압농축기를 사용하여 농축되고, 전체부피를 에틸아세테이트(ethylacetate)를 사용하여 1.5 ㎖로 맞추었다. 추출물의 두 가지 기능성 성분인 파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene)은 GC-MSD로 분석하였다.
분석 결과, 회수율 실험은 막걸리 샘플에 0.2 ㎍/㎖의 파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene) 표준물질을 첨가하여 측정되었는데, 각각 첨가된 농도에 대해 파네졸(farnesol)은 63.7±17.6%, 217.3±38.9%로 나타났다.
6. 석유 에테르/클로로포름/메탄올/n- 부탄올 추출법을 통한 막걸리로부터 파네졸( farnesol ) 및 스쿠알렌( squalene ) 추출
막걸리의 두 가지 기능성 성분을 추출하기 위해서, 석유 에테르, 클로로포름, 메탄올의 혼합용매에 n-부탄올을 혼합하거나 혼합하지 않은 용매로 비교 실험하였다. 막걸리 50 ㎖을 250 ㎖의 원심분리용 셀에 취하고 혼합 용매 100 ㎖ (석유 에테르 35 ㎖, 클로로포름 40 ㎖, 메탄올 20 ㎖, n-부탄올 5 ㎖)과 95 ㎖(석유 에테르 35 ㎖, 클로로포름 40 ㎖, 메탄올 20 ㎖)을 각각 가하였다. 30% NaCl 용액을 각 셀에 30 ㎖ 첨가하였다. 쉐이커(shaker)를 사용하여 30분간 진탕하면서 추출한 후, 원심 분리 (10,000 rpm, 10분) 하여 하등액을 취하였다. 이 추출 과정은 세 번 반복되었고, 모아진 추출액은 무수 황산나트륨(anhydrous sodium sulfate)으로 탈수되었다. 추출액은 진공감압농축기를 사용하여 농축되고, 전체부피를 에틸아세테이트(ethylacetate)를 사용하여 1.5 ㎖로 맞추었다(도 3).
추출 혼합용매에 n-부탄올 양을 늘려서(10 ㎖) 파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene) 두 기능성 물질의 회수율도 비교하였다. 막걸리 50 ㎖을 250 ㎖의 원심분리용 셀에 취하고 혼합 용매 100 ㎖(석유 에테르 30 ㎖, 클로로포름 40 ㎖, 메탄올 20 ㎖, n-부탄올 10 ㎖)로 위와 같은 방법으로 두 가지 물질을 추출하였다. 추출물의 두 가지 기능성 성분 파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene)은 GC-MS로 분석하였다.
회수율 실험은 막걸리 샘플에 0.1 ㎍/㎖과 1 ㎍/㎖의 두 가지 표준물질을 첨가하여 측정되었다. n-부탄올을 혼합한 용매로 추출된 파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene)의 회수율 결과는 각각 85.8±9.8%, 120.8±18.3%와 89.8±11.6%, 113.9±7.8%로 추출율의 정확도가 높았다. 이 회수율 결과는 0.1 ㎍/㎖과 1 ㎍/㎖ 농도에 대해 CODEX에서 지정한 범위(80-120%)에 인정된다.
n-부탄올을 혼합하지 않은 용매로 추출된 파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene)의 회수율 결과는 각각 38.4±3.6%, 64.1±4.5%와 95.2±8.5%, 134±7.10%로 나타났다.
이와 같이, n-부탄올을 혼합하여 사용하는 것이 파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene)의 동시분석에 적합한 것으로 판단된다.
그러나 추출 혼합용매에 n-부탄올 양을 늘려서 두 기능성 물질을 추출한 결과(10 ㎖), 0.1 ㎍/㎖의 파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene) 회수율은 101.2±13.5%, 71.7±15.8%으로 스쿠알렌(squalene)의 회수율이 줄어들어 추출 혼합용매는 석유 에테르 35, 클로로포름 40, 메탄올 20, n-부탄올 5 부피비가 적합한 것으로 확인되었다.
첨가 농도
(㎍/㎖)		 회수율 (%)
B C D
부피를 맞추기 위한 용매 에탄올 에틸
아세테이트		 에틸
아세테이트		 에틸 아세테이트
첨가
부탄올 (%)		 0 5 10
파네졸 0.2 161.9±10.9 68.7±17.6 63.7±17.6 38.4±3.6 85.8±9.8 101.2±13.5
1 77.9±18.1 219±10.9 64.1±4.5 111.1±4.3
10 35.8±0.8
스쿠알렌 0.2 33.6±13.2 217±38.8 217.3±38.9 95.2±8.5 89.8±11.6 71.7±15.8
1 47.4±15.7 219±10.9 134±7.1 113.9±7.8
10 72.6±1.4
7. 막걸리 시료로부터 파네졸 ( farnesol ) 및 스쿠알렌( squalene ) 추출 결과
도 4는 파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene) 표준용액을 GC/MSD(Gas chromatograph/mass selective detector)의 SIM mode로 분석한 TIC(Total Ion Chromatogram)이다. GC-MSD를 사용하여 막걸리 추출액을 분석한 TIC (도 5)에 나타낸 것처럼, 파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene)이 분리 및 확인되었다.
도 6, 7은 막걸리 중에 함유되어있는 파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene) 표준물질을 GC/MSD-SIM mode로 분석한 mass spectrum이다. 이 표준 물질들의 mass spectrum과 막걸리에 함유된 파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene)의 mass spectrum이 비교되어 정성, 정량 분석되었다
막걸리 중의 파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene) 함량은 하기 표 2과 같다. 막걸리의 파네졸(farnesol) 함량은 0.03-0.22 ㎍/㎖의 범위 내에서 분석되었다. 그리고, 막걸리의 스쿠알렌(squalene) 함량은 0.61-8.95 ㎍/㎖의 범위 내에서 분석되었다.
샘플 번호 파네졸(㎍/㎖) 스쿠알렌(㎍/㎖)
1 0.14±0.015 1.44±0.158
2 0.12±0.009 3.73±0.151
3 0.09±0.018 4.56±0.529
4 0.04±0.003 1.26±0.154
5 0.15±0.005 2.80±0.015
6 0.10±0.007 1.88±0.125
7 0.22±0.012 3.54±0.145
8 0.07±0.005 3.64±0.267
9 0.11±0.007 8.95±0.566
10 0.12±0.009 0.61±0.044
11 0.04±0.003 2.01±0.138
12 0.03±0.002 7.20±0.200
막걸리에 함유된 파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene)을 추출하기 위한 석유 에테르 35, 클로로포름 40, 메탄올 20, n-부탄올 5 부피비로 혼합된 용매 추출법은 GC-MS를 이용하여 측정되었다. 우선, 측정된 높은 회수율 결과를 통하여 파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene)을 효율적으로 동시 추출할 수 있는 방법인 것으로 확인되었다(표 1). 이 추출방법은 두 물질의 동시 추출을 위한 SBSE, SPME, SPE와 같은 특별한 추출 도구를 필요로 하지 않는 간단한 용매추출로 이뤄진 방법이다. 그러므로, 막걸리 업체 현실을 고려한 일반적인 랩에서도 쉽게 분석할 수 있는 장점을 갖는다.

Claims (17)

  1. 석유 에테르(petroleum ether), 클로로포름(chloroform), 메탄올(methanol), 및 n-부탄올(n-butanol)의 혼합용매를 추출용매로 사용하는 것을 특징으로 하는 액체 시료로부터 파네졸(farnesol) 또는 스쿠알렌(squalene)을 추출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 액체 시료는 막걸리인 것을 특징으로 하는 액체 시료로부터 파네졸(farnesol) 또는 스쿠알렌(squalene)을 추출하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 석유 에테르(petroleum ether)는 혼합용매 총 부피에 대하여 30 내지 40 부피%인 것을 특징으로 하는 액체 시료로부터 파네졸(farnesol) 또는 스쿠알렌(squalene)을 추출하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 클로로포름(chloroform)은 혼합용매 총 부피에 대하여 35 내지 45 부피%인 것을 특징으로 하는 액체 시료로부터 파네졸(farnesol) 또는 스쿠알렌(squalene)을 추출하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 메탄올(methanol)은 혼합용매 총 부피에 대하여 15 내지 25 부피%인 것을 특징으로 하는 액체 시료로부터 파네졸(farnesol) 또는 스쿠알렌(squalene)을 추출하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 n-부탄올(n-butanol)은 혼합용매 총 부피에 대하여 1 내지 10 부피%인 것을 특징으로 하는 액체 시료로부터 파네졸(farnesol) 또는 스쿠알렌(squalene)을 추출하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 파네졸(farnesol) 및 스쿠알렌(squalene)이 동시에 추출되는 것을 특징으로 하는 액체 시료로부터 파네졸(farnesol) 또는 스쿠알렌(squalene)을 추출하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 석유 에테르(petroleum ether), 클로로포름(chloroform), 메탄올(methanol), 및 n-부탄올(n-butanol)은 5 내지 10 : 5 내지 10 : 2 내지 6 : 1 의 부피비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 액체 시료로부터 파네졸(farnesol) 또는 스쿠알렌(squalene)을 추출하는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 파네졸(farnesol) 또는 스쿠알렌(squalene)은 80 내지 120%의 회수율로 추출되는 것을 특징으로 하는 액체 시료로부터 파네졸(farnesol) 또는 스쿠알렌(squalene)을 추출하는 방법.
  10. 하기 단계를 포함하는 액체 시료로부터 파네졸(farnesol) 또는 스쿠알렌(squalene)을 추출하는 방법:
    S1) 시료에 석유 에테르(petroleum ether), 클로로포름(chloroform), 메탄올(methanol), 및 n-부탄올(n-butanol)의 혼합용매를 섞는 단계;
    S2) 교반하는 단계;
    S3) 원심분리하는 단계;
    S4) 하등액을 수득하는 단계; 및
    S5) 수득된 하등액을 농축하는 단계.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 S1) 단계의 석유 에테르(petroleum ether), 클로로포름(chloroform), 메탄올(methanol), 및 n-부탄올(n-butanol)은 혼합용매 총 부피에 대하여, 석유 에테르(petroleum ether)는 30 내지 40 부피%, 클로로포름(chloroform)은 35 내지 45 부피%, 메탄올(methanol)은 15 내지 25 부피%, 및 n-부탄올(n-butanol)은 1 내지 10 부피%인 것을 특징으로 하는 액체 시료로부터 파네졸(farnesol) 또는 스쿠알렌(squalene)을 추출하는 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 S2) 단계의 교반은 20분 내지 40분 지속되는 것을 특징으로 하는 액체 시료로부터 파네졸(farnesol) 또는 스쿠알렌(squalene)을 추출하는 방법.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 S5) 단계의 농축은 진공감압농축기를 사용하는 것을 특징으로 하는 액체 시료로부터 파네졸(farnesol) 또는 스쿠알렌(squalene)을 추출하는 방법.
  14. 하기 단계를 포함하는 액체 시료로부터 파네졸(farnesol) 또는 스쿠알렌(squalene)을 추출하고 분석하는 방법:
    S1) 시료에 석유 에테르(petroleum ether), 클로로포름(chloroform), 메탄올(methanol), 및 n-부탄올(n-butanol)의 혼합용매를 섞는 단계;
    S2) 교반하는 단계;
    S3) 원심분리하는 단계;
    S4) 하등액을 수득하는 단계;
    S5) 수득된 하등액을 농축하는 단계; 및
    S6) GC-MS(Gas Chromatograph-Mass Spectrometer)로 농축물을 분석하는 단계.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 농축물은 에틸아세테이트로 용해하여 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 파네졸(farnesol)은 0.09 내지 1 ㎍/㎖ 의 범위로 분석되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 스쿠알렌(squalene)은 0.85 내지 10 ㎍/㎖ 의 범위로 분석되는 것을 특징으로 하는 방법.
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