KR20160093247A - Method for production of water-soluble polysaccharide cross-linked with chitosan - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a method for producing water-soluble polysaccharides cross-linked with chitosan. The water-soluble polysaccharides which are cross-linked with chitosan and are produced by the production method of the present invention, exhibit outstanding effects in terms of protein dispersion stability within pH 4.2-4.8 close to the isoelectric point of the protein, thereby preventing protein precipitation. Accordingly, the water-soluble polysaccharides produced by the present invention can be used in foods or beverages containing protein.

Description

키토산 가교 수용성 다당류의 제조방법 {Method for production of water-soluble polysaccharide cross-linked with chitosan}[0001] The present invention relates to a method for producing a water-soluble polysaccharide cross-linked with chitosan,

본 발명은 키토산 가교 수용성 다당류의 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로 단백질 등전점 부근인 pH 4.2~4.8 영역에서 단백질을 안정화시킬 수 있는 키토산 가교 수용성 다당류의 제조방법에 관한 것이다.
More particularly, the present invention relates to a method for producing a chitosan-crosslinking water-soluble polysaccharide capable of stabilizing a protein in a pH range of 4.2 to 4.8 near a protein isoelectric point.

종래의 산성 음료에서, 분산 안정제로는 펙틴(pectin) 또는 카복시메틸셀룰로스(carboxymethyl cellulose, CMC)가 사용되었다. 하지만, 이들은 음료의 점도를 높이는 문제점을 야기하였다. 이에 최근에는 상기의 문제점인 점도를 낮추기 위해, 다당류를 이용하여 산성 하에서 점도를 높이지 않는 분산 안정제를 개발하여 사용하고 있다. In conventional acidic drinks, pectin or carboxymethyl cellulose (CMC) was used as a dispersion stabilizer. However, they caused problems of increasing the viscosity of the beverage. Recently, in order to lower the viscosity, which is the above-mentioned problem, a dispersion stabilizer which does not increase viscosity under acidic conditions by using a polysaccharide has been developed and used.

다당류는 식물섬유소로 이용되는 동시에 식품기능제로서의 성질을 가지고 있어 여러 식품의 기능소재로 널리 이용되고 있는데, 그 예로 단백질 음료, 미반류, 면류 등이 있다. 또한, 다당류의 우수한 분산성은 미네랄의 분산에도 이용이 가능하여, 그림 도구나 도료 등의 안료, 시멘트의 분산제로서도 이용되고 있다. Polysaccharides are used as plant fiber and at the same time, they are widely used as functional materials of various foods because they have properties as food functional agents. Examples of such polysaccharides are protein beverages, unrefrigerated and noodles. In addition, the excellent dispersibility of the polysaccharide can be used for dispersing minerals, and is also used as a dispersant for pigments such as painting tools, paints, and cements.

한편, 산성 발효유 분야에서 분산 안정제로서의 다당류 사용은 저점도와 높은 안정화로 인해 독자적인 시장을 구축하고 있다. 아시아, 특히 한국과 중국에서 산성 발효유 시장은 크게 신장하고 있는데, 이에 맞춰 분산 안정제로 쓰일 수 있는 다당류 개발도 더욱 중요한 관심사가 되고 있다. On the other hand, the use of polysaccharides as a dispersion stabilizer in the field of acidic fermented milk has established its own market due to its low viscosity and high stabilization. In Asia, especially in Korea and China, the acidic fermented milk market is expanding rapidly, and development of polysaccharides that can be used as dispersion stabilizers is becoming more important.

다당류는 자신이 가진 음전하에 의해 단백질 표면에 이온적 또는 소수적으로 결합하는데, 전기적 반발이나 입체 장해에 의해 단백질의 응집 또는 침전을 억제시킨다. Polysaccharides bind ionic or hydrophobic to the protein surface by their negative charge, which inhibits protein aggregation or precipitation by electrical repulsion or steric hindrance.

하지만, 기존의 다당류는 단백질 등전점 영역인 pH 4.2~4.8에서 충분한 분산 안정성을 나타내지 못하고 있다. However, existing polysaccharides do not show sufficient dispersion stability at pH 4.2 ~ 4.8 which is the protein isoelectric point.

따라서, 단백질 등전점 영역인 pH 4.2~4.8에서도 안정적인 분산 안정제를 개발하고자 하는 노력이 필요한 실정이다.
Therefore, there is a need to develop a stable dispersion stabilizer even in the pH is 4.2 ~ 4.8 which is the protein isoelectric point region.

대한민국 등록특허 제10-1056794호(발명의 명칭: 수용성 대두 식이섬유 제조 방법, 이에 의한 다당류 및 이들을 첨가한 식품)에는, 수용성 식이섬유 제조방법에 있어서, 두부제조 과정에서 발생하는 비지에서 효소로 비지 잔사를 마련하는 단계; 상기 비지 잔사를 물에 분산 용해시키고 수산화나트륨으로 pH 11~13으로 조정하고 50~65℃에서 1~3시간 동안 연화하는 단계; 상기 연화된 액에 염산을 첨가하여 pH 4~6으로 조정하여 110~130℃에서 1~3시간 동안 추출하는 단계; 상기 추출한 액을 수득하여 한외여과를 실시하여 단당류, 저분자 단백질, 색소성분 및 무기염류를 제거하는 단계;를 포함하는 수용성 대두 식이섬유의 제조방법에 대해 기재되어 있다.Korean Patent No. 10-1056794 (titled invention: a method for producing a water soluble soybean fiber and a polysaccharide and a food added with the same) is characterized in that in the method for producing a water-soluble dietary fiber, Providing a residue; Dispersing and dissolving the residue in water, adjusting the pH to 11 to 13 with sodium hydroxide and softening at 50 to 65 ° C for 1 to 3 hours; Adjusting the pH to 4 to 6 by adding hydrochloric acid to the softened solution, and extracting at 110 to 130 ° C for 1 to 3 hours; Extracting the extracted liquid to perform ultrafiltration to remove the monosaccharide, low molecular protein, coloring matter component and inorganic salts, and thereby producing a water-soluble soybean fiber. 대한민국 등록특허 제10-0226245호(발명의 명칭: 수용성 다당류 및 그의 제조방법)에는, 람노스, 푸코스, 아라비노스, 크실로스, 갈락토스, 글루코스 및 우론산으로 구성되고, 우로산의 에스테르화도가 50%이하인 수용성 다당류 및 그의 제조방법에 대해 기재되어 있다.Korean Patent No. 10-0226245 entitled " Water-soluble polysaccharide and method for producing the same ", which is composed of rhamnose, fucose, arabinose, xylose, galactose, glucose and uronic acid, Soluble polysaccharides having a water content of not more than 50% and a process for producing the same.

본 발명에서는 비지 및 키토산을 이용하여, 단백질 등전점 부근인 pH 4.2~4.8 영역에서 단백질을 안정화시킬 수 있는 수용성 다당류를 제조할 수 있는 방법을 개발하여 제공하고자 한다. In the present invention, a method for preparing a water-soluble polysaccharide capable of stabilizing a protein in a pH range of 4.2 to 4.8 near protein isoelectric point using beijing and chitosan is developed and provided.

또한, 본 발명은 비지로부터 중성당(neutral sugar) 함량을 극대화시킬 수 있는 추출조건을 확립하여 제공하고자 한다.
In addition, the present invention aims to establish and provide an extraction condition capable of maximizing the neutral sugar content from the beage.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비지(bean curd refuse)로부터 추출된 수용성 다당류에 가교제로서 키토산을 첨가하고, pH 10~14의 알칼리 조건하에서 가열하는 단계 (a); 상기 가열 후, 냉각하고 pH를 3~5로 조정한 후, 가교 반응에 참여하지 않은 여분의 키토산을 원심분리를 통해 제거하는 단계 (b); 상기 원심분리 후, 상층액의 pH를 6~8로 조정한 후, 에탄올수용액을 첨가하여 에탄올 침전을 수행하는 단계 (c); 및 상기 에탄올 침전 후, 원심분리하여 침전물을 수득하는 단계 (d);를 포함하는 것을 특징으로 하는 키토산으로 가교된 수용성 다당류의 제조방법을 제공한다. In order to accomplish the above object, the present invention provides a method for preparing chitosan, comprising: (a) adding chitosan as a crosslinking agent to a water-soluble polysaccharide extracted from bean curd refuse and heating under alkaline conditions of pH 10-14; (B) removing the excess chitosan not participating in the cross-linking reaction by centrifugation after cooling by heating to adjust the pH to 3 to 5; (C) a step of adjusting the pH of the supernatant after the centrifugation to 6 to 8, followed by ethanol precipitation by adding an aqueous ethanol solution; And (d) a step (d) of centrifuging the precipitate after ethanol precipitation to obtain a water-soluble polysaccharide crosslinked with chitosan.

본 발명의 키토산 가교 수용성 다당류의 제조방법에 의해 제조된 수용성 다당류는 기존의 비지 유래 다당류와 달리 단백질 등전점 부근인 pH 4.2~4.8 영역에서도 단백질의 분산 안정에 매우 우수한 효과를 발휘함이 본 발명을 통해 확인되었다. The water-soluble polysaccharide prepared by the process for producing a chitosan crosslinked water-soluble polysaccharide of the present invention exerts a very excellent effect on the stability of protein dispersion even in the pH 4.2 to 4.8 region near the protein isoelectric point, unlike the conventional polysaccharide .

이하에서는 본 발명의 키토산으로 가교된 수용성 다당류의 제조방법에 대해 더욱 자세히 설명하고자 한다.
Hereinafter, a method of preparing a water-soluble polysaccharide crosslinked with chitosan of the present invention will be described in more detail.

<단계 (a): 수용성 다당류에 키토산 첨가 후, 가열> &Lt; Step (a): heating after adding chitosan to water-soluble polysaccharide >

본 단계 (a)는 비지(bean curd refuse)로부터 추출된 수용성 다당류에 가교제로서 키토산을 첨가하고, pH 10~14의 알칼리 조건하에서 가열하는 단계이다. 본 발명에서는 가교제로서 키토산을 사용하는데, 상기 조건을 통해 수용성 다당류와 키토산 사이의 가교결합이 유도된다. 이때, 본 단계 (a)의 가열은 바람직하게 70~90℃로 30~120분 동안 수행하는 것이 좋은데, 이 조건에서 가교결합이 극대화될 수 있기 때문이다. 또한, 본 단계 (a)는 필요 시 물을 더 첨가할 수도 있다. This step (a) is a step of adding chitosan as a crosslinking agent to the water-soluble polysaccharide extracted from bean curd refuse and heating under alkaline conditions of pH 10 to 14. In the present invention, chitosan is used as a crosslinking agent. Through the above conditions, cross-linking between the water-soluble polysaccharide and chitosan is induced. At this time, it is preferable to carry out heating in this step (a) preferably at 70 to 90 ° C for 30 to 120 minutes, since crosslinking can be maximized under this condition. In this step (a), water may be further added if necessary.

한편, 본 단계 (a)의 비지로부터 추출된 수용성 다당류는, 바람직하게 비지에 무게비로 5~6배수의 물을 가하고, pH를 2~3으로 조정한 후, 가열하는 단계 (가); 상기 가열 후, 냉각하고 원심분리하여 침전물을 제거하고 상등액을 수득하는 단계 (나); 상기 상등액의 pH를 4~6으로 조정하고, 원심분리하여 침전물을 수득하는 단계 (다); 상기 침전물을 건조하여 건조물을 수득한 후, 정제수에 용해시키는 단계 (라); 및 상기 용해 후, 에탄올 수용액을 첨가하여 에탄올 침전을 수행하고 원심분리하는 단계 (마); 를 포함하는 과정으로부터 수득된 것을 사용하는 것이 좋다. 이와 같은 과정을 통해 수득된 수용성 다당류는 중성당 함량이 높아, 가교제와의 가교결합시 분산 안정력이 증가된다. 이하, 각 단계에 대해 하기에서 더욱 상세히 설명하고자 한다.
On the other hand, the water-soluble polysaccharide extracted from the beverage of the present step (a) preferably has a pH of 2 to 3 and then is heated by adding water to the beverage in a ratio of 5 to 6 times by weight. After the heating, the mixture is cooled and centrifuged to remove the precipitate and a supernatant is obtained (step b); Adjusting the pH of the supernatant to 4 to 6 and centrifuging to obtain a precipitate (c); Drying the precipitate to obtain a dried material, and then dissolving the dried material in purified water; And after the dissolution, an aqueous ethanol solution is added to perform ethanol precipitation and centrifugation (Step e); And the like. The water-soluble polysaccharide obtained through such a process has a high neutral sugar content, so that the dispersion stabilizing force when cross-linking with the crosslinking agent is increased. Each step will be described in more detail below.

<단계 (가): 비지에 물 첨가 및 가열> &Lt; Step (A): Addition and heating of water to the beverage >

본 단계 (가)는 비지에 무게비로 5~6배수의 물을 가하고, pH를 2.5~4.5으로 조정한 후, 가열하는 단계이다. 이와 같은 조건을 통해 가열함으로써 하기 과정을 통해 수득되는 수용성 다당류 내 중성당의 함량을 증대시킬 수 있다. 중성당 함량이 높아지면 가교결합시 분산 안정력이 증대될 수 있다. In this step (a), 5 to 6 times water is added to the bean by weight, the pH is adjusted to 2.5 to 4.5, and then the bean is heated. By heating through such conditions, the content of neutral sugars in the water-soluble polysaccharide obtained through the following process can be increased. The higher the neutral sugar content, the greater the dispersion stability during crosslinking.

이때, 상기 비지로부터 수용성 다당류의 수득과정에서 상기 단계 (가)의 pH 조정은 바람직하게 시트르산(citric acid)을 첨가하여 수행하는 것이 좋다. 본 발명에서 실험한 바에 의하면 염산 등의 강산을 사용하는 경우보다 유기산인 시트르산을 사용하는 경우, 중성당을 비롯한 저분자 다당류의 함량이 더 늘어남을 확인할 수 있었다.At this time, pH adjustment of the step (a) in the step of obtaining the water-soluble polysaccharide from the beverage is preferably performed by adding citric acid. According to the experiment of the present invention, when citric acid, which is an organic acid, is used, the content of low molecular weight polysaccharide including neutral sugars is more increased than when using strong acid such as hydrochloric acid.

또한, 상기 단계 (가)의 가열은, 바람직하게 100~120℃ 온도로 150~450분 동안 수행하는 것이 좋다. 이와 같은 조건에서 수용성 다당류 내 중성당 함량이 극대화될 수 있기 때문이다.
The heating in step (a) is preferably carried out at a temperature of 100 to 120 DEG C for 150 to 450 minutes. This is because the neutral sugar content in the water-soluble polysaccharide can be maximized under these conditions.

<단계 (나): 상등액 수득> <Step (B): Acquisition of supernatant>

본 단계 (나)는 상기 가열 후, 냉각하고 원심분리하여 침전물을 제거하고, 상등액을 수득하는 단계이다. 본 단계를 통해 수용성 물질이 아닌 불필요 고형분이 제거된다. 이때, 원심분리는 바람직하게 6,000~10,000 rpm으로 20~30분 정도 수행하는 것이 좋다. 또한, 필요 시 필터 여과과정을 더 거칠 수도 있다.
In this step (B), after heating, the mixture is cooled and centrifuged to remove the precipitate, and a supernatant is obtained. Through this step, unwanted solids which are not water soluble substances are removed. In this case, centrifugation is preferably performed at 6,000 to 10,000 rpm for 20 to 30 minutes. In addition, a filter filtration process may be further required if necessary.

<단계 (다): 침전물 수득>&Lt; Step (C): Obtaining a precipitate >

본 단계 (다)는 상기 상등액 수득 후, 상등액의 pH를 4~6으로 조정하고, 원심분리하여 침전물을 수득하는 단계이다. pH를 조정함으로써 다당류만 침전시켜 수득하고, 단당류 등은 상등액을 통해 제거할수 있다.
In this step (c), after obtaining the supernatant, the pH of the supernatant is adjusted to 4 to 6 and centrifuged to obtain a precipitate. By adjusting the pH, only the polysaccharide can be obtained by precipitation, and the monosaccharides and the like can be removed through the supernatant.

<단계 (라): 건조 및 정제수 용해><Step (d): Drying and Purified Water Dissolution>

본 단계 (라)는 상기 침전물 수득 후, 침전물을 건조하여 건조물을 수득한 후, 정제수에 용해시키는 단계이다. 정제수는 수득된 건조물에 대해 무게비로 3~5배 정도 첨가되는 것이 좋다.
In this step (D), after the precipitate is obtained, the precipitate is dried to obtain a dried product and then dissolved in purified water. The purified water is preferably added in a weight ratio of 3 to 5 times to the obtained dried product.

<단계 (마): 에탄올 침전 및 원심분리><Step (e): Ethanol precipitation and centrifugation>

본 단계 (마)는 상기 용해 후, 에탄올 수용액을 첨가하여 에탄올 침전을 수행하고 원심분리하는 단계이다. 본 단계를 통해 본 발명의 수용성 다당류가 회수될 수 있다. 이때, 에탄올 수용액은 바람직하게 에탄올 함량이 90~99%인 것을 사용하는 것이 좋고, 상기 단계 (라)에서 정제수를 첨가하여 제조한 용액의 부피 대비 1.5~2.5배 정도의 양만큼 첨가하는 것이 좋다. 또한, 원심분리는 바람직하게 6,000~10,000 rpm으로 20~30분 정도 수행하는 것이 좋다.
The step (e) is a step of adding ethanol aqueous solution after the above-mentioned dissolution, followed by ethanol precipitation and centrifugation. Through this step, the water-soluble polysaccharide of the present invention can be recovered. The ethanol aqueous solution preferably has an ethanol content of 90 to 99%, and may be added in an amount of about 1.5 to 2.5 times the volume of the solution prepared by adding purified water in the step (d). The centrifugation is preferably performed at 6,000 to 10,000 rpm for about 20 to 30 minutes.

<단계 (바): 침전물의 건조>&Lt; Step (F): Drying of precipitate >

본 발명의 비지로부터 추출된 수용성 다당류의 수득과정은, 상기 단계 (가)~(마) 외에 본 단계 (바)를 더 포함할 수 있는데, 본 단계 (바)는 상기 단계 (마)의 원심분리 후, 건조하는 단계이다. 본 단계의 건조를 통해 수용성 다당류가 분말 형태로 회수될 수 있다.
The process for obtaining the water-soluble polysaccharide extracted from the beverage of the present invention may further comprise this step (f) in addition to the above-mentioned steps (a) to (e), wherein this step (b) Followed by drying. Through drying in this step, the water-soluble polysaccharide can be recovered in powder form.

<단계 (b): 미반응 키토산의 제거>&Lt; Step (b): Removal of Unreacted Chitosan >

본 단계 (b)는 상기 단계 (a)의 가열 후, 냉각하고 pH를 3~5로 조정한 후, 가교 반응에 참여하지 않은 여분의 키토산을 원심분리를 통해 제거하는 단계이다. 본 단계를 통해 반응에 참여하지 않은 키토산이 제거된다. 이때, 본 단계 (b)의 pH 조정은 바람직하게 시트르산으로 수행하는 것이 좋다. 시트르산을 사용함으로써 pH 변화의 충격을 최소화하여 반응액에 안정성을 부여할 수 있기 때문이다.
The step (b) is a step of cooling after the heating of step (a), adjusting the pH to 3 to 5, and then removing the extra chitosan not participating in the crosslinking reaction through centrifugation. This step removes chitosan that has not participated in the reaction. At this time, the pH adjustment in the step (b) is preferably carried out with citric acid. By using citric acid, the impact of the pH change can be minimized and stability can be imparted to the reaction solution.

<단계 (c): 에탄올 침전><Step (c): Ethanol precipitation>

본 단계 (c)는 상기 단계 (b)의 원심분리 후, 상층액의 pH를 6~8로 조절한 후, 에탄올수용액을 첨가하여 에탄올 침전을 수행하는 단계이다. 이를 통해 키토산으로 가교결합된 수용성 다당류가 침전된다. 이때, 에탄올 수용액은 바람직하게 에탄올 순도 90~99%의 것을 사용하는 것이 좋고, 상층액에 대해 부피비로 6~7배 정도 첨가되는 것이 좋다.
The step (c) is a step of adjusting the pH of the supernatant to 6 to 8 after centrifugation in the step (b), followed by ethanol precipitation by adding an aqueous ethanol solution. Whereby water-soluble polysaccharides crosslinked to chitosan are precipitated. At this time, the aqueous ethanol solution preferably has an ethanol purity of 90 to 99%, preferably 6 to 7 times by volume in the supernatant.

<단계 (d): 침전물의 수득>&Lt; Step (d): Obtaining a precipitate >

본 단계 (d)는 상기 단계 (c)의 에탄올 침전 후, 원심분리하여 침전물을 수득하는 단계이다. 원심분리를 통해 침전된 키토산 가교 수용성 다당류를 회수할 수 있다. 원심분리는 바람직하게 6,000~10,000 rpm으로 20~30분 정도 수행하는 것이 좋다.
The step (d) is a step of precipitating ethanol after the step (c) and centrifuging to obtain a precipitate. The chitosan crosslinked water-soluble polysaccharide precipitated through centrifugation can be recovered. The centrifugation is preferably performed at 6,000 to 10,000 rpm for about 20 to 30 minutes.

<단계 (e): 침전물의 세척>&Lt; Step (e): washing of precipitate >

본 발명은 상기 단계 (a)~(d)외에 바람직하게 본 단계 (e)를 더 포함할 수 있는데, 본 단계 (e)는 상기 단계 (d)의 침전물 수득 후, 단계 (d)로부터 수득된 침전물에 에탄올 수용액을 첨가하여 세척하는 단계이다. 이를 통해 본 발명 키토산 가교 수용성 다당류의 순도를 높일 수 있다. 이때, 에탄올 수용액은 바람직하게 에탄올 순도 50~70%의 것을 사용하는 것이 좋다.
The present invention may further comprise this step (e) in addition to the above steps (a) to (d), wherein step (e) comprises, after obtaining the precipitate of step (d) And adding an aqueous solution of ethanol to the precipitate to wash the precipitate. Thus, the purity of the chitosan-crosslinked water-soluble polysaccharide of the present invention can be increased. At this time, the aqueous ethanol solution preferably has an ethanol purity of 50 to 70%.

<단계 (f): 침전물의 재수득>&Lt; Step (f): Re-acquisition of precipitate >

본 발명은 상기 단계 (e) 후, 바람직하게 본 단계 (f)를 더 포함할 수 있는데, 본 단계 (f)는 상기 단계 (e)의 세척 후, 원심분리하여 침전물을 수득하는 단계이다. 원심분리는 바람직하게 6,000~10,000 rpm으로 20~30분 정도 수행하는 것이 좋다.
The present invention may further comprise the step (f), preferably after step (e), wherein step (f) is a step of centrifuging the precipitate after washing in step (e). The centrifugation is preferably performed at 6,000 to 10,000 rpm for about 20 to 30 minutes.

<단계 (g): 침전물의 건조>&Lt; Step (g): Drying of the precipitate &

본 발명은 상기 단계 (f) 후, 바람직하게 본 단계 (g)를 더 포함할 수 있는데, 본 단계 (g)는 상기 (f)의 침전물 수득 후, 상기 침전물을 건조시키는 단계이다. 본 단계를 통해 본 발명의 키토산 가교 수용성 다당류는 수분이 제거된 분말 형태로 제조된다. 건조는 바람직하게 50~70℃ 온도로 10~20분 정도 수행되는 것이 좋다.
The present invention may further include this step (g) preferably after step (f), wherein step (g) is a step of drying the precipitate after obtaining the precipitate of step (f). Through this step, the chitosan-crosslinking water-soluble polysaccharide of the present invention is prepared in the form of a powder in which moisture is removed. The drying is preferably performed at a temperature of 50 to 70 DEG C for about 10 to 20 minutes.

본 발명의 제조방법에 의해 제조된 키토산으로 가교결합된 수용성 다당류는 단백질 등전점 부근인 pH 4.2~4.8 영역에서 단백질의 분산 안정에 매우 우수한 효과를 발휘하여 단백질 침전을 억제할 수 있다. The water-soluble polysaccharide crosslinked with the chitosan produced by the production method of the present invention exerts a very excellent effect on the stability of protein dispersion in the pH 4.2 ~ 4.8 region near the protein isoelectric point, and can suppress protein precipitation.

따라서, 본 발명에서 제조된 키토산 가교 수용성 다당류는 단백질 함유 음료 또는 식품에 사용될 수 있다.
Thus, the chitosan cross-linking water-soluble polysaccharides prepared in the present invention can be used in protein-containing beverages or foods.

도 1은 수용성 다당류의 추출시, pH 조건에 따른 저분자 다당류의 함량을 나타낸 것이다.
도 2는 수용성 다당류의 추출시, 추출시간에 따른 다당류의 함량을 나타낸 것이다.
도 3은 수용성 다당류의 추출과정을 나타낸 것이다.
도 4는 수용성 다당류에 키토산을 첨가하여 키토산이 가교된 수용성 다당류를 제조하는 과정을 나타낸 것이다.
도 5는 단백질 발효유를 제조하는 과정을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에서 제조한 키토산 가교 수용성 다당류의 단백질 분산 안정 효과를 보여주는 사진이다. Fig. 1 shows the content of low molecular weight polysaccharides according to pH conditions in the extraction of water-soluble polysaccharides.
Fig. 2 shows the content of polysaccharides according to the extraction time during the extraction of the water-soluble polysaccharides.
Fig. 3 shows the extraction process of the water-soluble polysaccharide.
FIG. 4 shows a process for preparing a water-soluble polysaccharide crosslinked with chitosan by adding chitosan to the water-soluble polysaccharide.
5 shows a process for producing protein fermented milk.
FIG. 6 is a photograph showing stability of protein dispersion of the chitosan-crosslinking water-soluble polysaccharide prepared in the present invention.

이하, 본 발명의 구성을 하기 실시예를 통해 구체적으로 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
Hereinafter, the structure of the present invention will be described in detail with reference to the following examples. However, the scope of the present invention is not limited to the following embodiments, and includes modifications of equivalent technical ideas.

[[ 실험예Experimental Example 1: 중성당 함량을 극대화시키는 수용성 다당류의 추출조건 탐색] 1: Extraction conditions of water-soluble polysaccharides to maximize neutral sugar content]

본 실험예에서는 표면반응법(response surface method, RSM)을 사용하여 추출 용매(증류수)의 양과 추출 시간에 따라 비지로부터 추출되는 중성당(neutral sugar) 함량을 정량 분석하고자 하였다. In this experiment, quantitative analysis of the neutral sugar content extracted from beans according to the amount of extraction solvent (distilled water) and extraction time using the surface reaction method (RSM) was performed.

이때, 비지는 50 g 사용하였으며, 각 용매의 양과 추출 시간에 따라 측정된 총 중성당(neutral sugar)의 농도는 하기 표 1에 나타내었다. At this time, 50 g of beage was used, and the concentration of total neutral sugar measured according to the amount of each solvent and extraction time is shown in Table 1 below.

RunRun 증류수 (g)Distilled water (g) 추출시간 (min)Extraction time (min) 총 중성당 (ppm)Total neutral sugar (ppm) 1One 250.000250,000 720.000720,000 2268.080002268.08000 22 187.500187.500 435.000435,000 1546.880001546.88000 33 187.500187.500 435.000435,000 2366.570002366.57000 44 125.000125,000 150.000150,000 1454.080001454.08000 55 187.500187.500 435.000435,000 2298.570002298.57000 66 275.888275.888 435.000435,000 2610.070002610.07000 77 187.500187.500 435.000435,000 2538.250002538.25000 88 187.500187.500 435.000435,000 1914.020001914.02000 99 125.000125,000 720.000720,000 1492.950001492.95000 1010 250.000250,000 150.000150,000 978.88300978.88300 1111 187.500187.500 31.94931.949 810.10900810.10900 1212 99.11299.112 435.000435,000 1262.200001262.20000 1313 187.500187.500 838.051838.051 1561.930001561.93000

실험결과, 비지에 무게비로 5.5배의 증류수를 가하고, 480분 동안 추출을 수행하였을 경우, 추출되는 중성당 함량이 가장 높은 것으로 나타났다.
As a result of the experiment, when extracted water was added at a ratio of 5.5 times by weight to the bean sprouts and extracted for 480 minutes, the extracted neutral sugar content was the highest.

[[ 실시예Example 1: 시트르산( 1: Citric acid ( citric acid)을citric acid) 사용한 수용성 다당류의 추출] Extraction of used water-soluble polysaccharides]

본 실시예에서는 시트르산(citric acid)을 사용하여 수용성 다당류를 추출하고자 하였다. In this example, citric acid was used to extract the water-soluble polysaccharide.

비지(bean curd refuse)에 무게비로 5.5배수의 물을 가하고, 시트르산(citric acid)을 첨가하여 각각 pH가 각각 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5가 되게 하였다. 이후, 이와 같이 다양한 산성조건을 갖는 각기 다른 6개의 샘플을 105℃ 온도로, 480분 동안 가열하여 수용성 다당류를 추출하였다.
Water was added to the bean curd refuse at a weight ratio of 5.5 and citric acid was added to adjust the pH to 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, and 5, respectively. Then, six different samples having various acidic conditions were heated at 105 DEG C for 480 minutes to extract the water-soluble polysaccharides.

[[ 비교예Comparative Example 1: 염산( 1: hydrochloric acid ( HClHCl )을 사용한 수용성 다당류의 추출]) &Lt; / RTI &gt;

본 비교예에서는 염산(HCl)을 사용하여 수용성 다당류를 추출하고자 하였다. In this Comparative Example, a water-soluble polysaccharide was extracted using hydrochloric acid (HCl) .

비지(bean curd refuse)에 무게비로 5.5배수의 물을 가하고, 염산(HCl)을 첨가하여 pH를 각각 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5가 되게 하였다. 이후, 이와 같이 다양한 산성조건을 갖는 각기 다른 6개의 샘플을 105℃ 온도로, 480분 동안 가열하여 수용성 다당류를 추출하였다.
Water was added to bean curd refuse at a weight ratio of 5.5 and the pH was adjusted to 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, and 5 by adding hydrochloric acid (HCl). Then, six different samples having various acidic conditions were heated at 105 DEG C for 480 minutes to extract the water-soluble polysaccharides.

[[ 실험예Experimental Example 2: pH에 따른 수용성 다당류의 함량 분석] 2: Analysis of content of water-soluble polysaccharide according to pH]

본 실험예에서는 상기 실시예 1과 비교예 1에 대해 수용성 다당류 내 저분자 다당류의 함량을 고속액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 사용하여 분석하고자 하였다.In this Experimental Example, the content of the low-molecular polysaccharide in the water-soluble polysaccharide was analyzed using high performance liquid chromatography (HPLC) in Example 1 and Comparative Example 1.

실험결과, pH 5를 제외하고는 pH가 낮아질수록 저분자 다당류의 함량이 높아지는 것으로 나타났다. 또한, 염산을 사용한 경우보다, 시트르산을 사용한 경우 저분자 다당류의 함량이 월등히 높은 것을 확인할 수 있었다 (도 1). 도 1은 추출조건 중 pH 조건에 따른 저분자 다당류의 함량을 나타낸 그래프이다. As a result, the content of low molecular weight polysaccharide was increased with decreasing pH except pH 5. In addition, it was confirmed that the content of the low molecular weight polysaccharide was much higher when citric acid was used than in the case of using hydrochloric acid (Fig. 1). FIG. 1 is a graph showing the content of low molecular weight polysaccharides according to pH conditions in extraction conditions. FIG.

따라서, 하기 실시예에서는 수용성 다당류의 효과적인 추출을 위해 시트르산을 사용하였다.
Thus, in the following examples, citric acid was used for effective extraction of water-soluble polysaccharides.

[실험예 3: 추출시간에 따른 수용성 다당류의 함량 분석][Experimental Example 3: Analysis of content of water-soluble polysaccharide according to extraction time]

본 실험예에서는 상기 실시예 1에 대해 추출시간에 따른 다당류의 함량을 분석하고자 하였다. In this Experimental Example, the content of polysaccharide according to the extraction time was analyzed in Example 1 above.

실험결과, 추출시간이 경과함에 따라 총다당류의 함량이 증가함에도 불구하고, 저분자 다당류 (MW 107~6.1kDa)의 함량은 200분 이후 크게 변함 없음을 알 수 있고, 고분자 다당류 (MW 2,350~107kDa)의 함량은 증가함을 알 수 있었다 (도 2). 도 2는 수용성 다당류의 추출시, 추출시간에 따른 다당류의 함량을 나타낸 것이다.
As a result, the content of low molecular polysaccharide (MW 107 ~ 6.1kDa) did not change much after 200 min, and the content of high molecular polysaccharide (MW 2,350 ~ 107kDa) (Fig. 2). &Lt; tb &gt;&lt; TABLE &gt; Fig. 2 shows the content of polysaccharides according to the extraction time during the extraction of the water-soluble polysaccharides.

[[ 실시예Example 2: 키토산으로  2: as chitosan 가교된Bridged 수용성 다당류의 제조] Preparation of water-soluble polysaccharide]

본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 확인된 조건 (시트르산 사용 및 낮은 pH)을 사용하여, 중성당 함량이 높고, 분산 안정성이 높은 수용성 다당류를 추출하고, 여기에 가교제로서 키토산을 첨가하여, 키토산으로 가교된 수용성 다당류를 최종 제조하고자 하였다. In this Example, water-soluble polysaccharides having high neutral sugar content and high dispersion stability were extracted using the conditions (using citric acid and low pH) as confirmed in Example 1, chitosan was added thereto as a crosslinking agent, and chitosan The crosslinked water-soluble polysaccharides were finally prepared.

먼저, 비지(bean curd refuse) 50 g에 무게비로 5.5배수의 물을 가하고, 시트르산(citric acid)을 첨가하여 pH가 2.5가 되게 하였다. 이러한 산성조건 하에서 105℃ 온도로, 480분 동안 가열하여 수용성 다당류를 추출하였다. 그 후, 추출물을 냉각하였다. 냉각 후, 8000 rpm에서 25분 동안 원심분리하고, 0.6 ㎛의 필터로 고형분을 제거하였다. 이후, 고형분이 제거된 추출물을 20% NaOH를 사용하여, pH 5의 산성으로 조절한 후, 건조하였다. 건조된 추출물을 물에 용해시킨 후, 96% 에탄올로 침전하였다. 이후, 8000 rpm에서 25분 동안 원심분리하고, 고형분을 획득하였다. 획득된 고형분을 60℃에서 24시간 건조시킨 후, 분쇄하여 본 발명의 수용성 다당류를 수득하였다 (도 3 참조). 도 3은 수용성 다당류의 추출과정을 나타낸 것이다. First, 5.5 times water was added to 50 g of bean curd refuse at a weight ratio, and citric acid was added to adjust the pH to 2.5. The water-soluble polysaccharides were extracted by heating at 105 DEG C under these acidic conditions for 480 minutes. The extract was then cooled. After cooling, the mixture was centrifuged at 8000 rpm for 25 minutes, and the solid matter was removed with a filter of 0.6 mu m. Then, the extract with the solid content removed was adjusted to an acidic pH of 5 using 20% NaOH, and then dried. The dried extract was dissolved in water and then precipitated with 96% ethanol. Thereafter, it was centrifuged at 8000 rpm for 25 minutes, and solid content was obtained. The obtained solid was dried at 60 DEG C for 24 hours and pulverized to obtain the water-soluble polysaccharide of the present invention (see FIG. 3). Fig. 3 shows the extraction process of the water-soluble polysaccharide.

한편, 상기 수득한 수용성 다당류 10 g에 정제수를무게비로 8배수의 정제수를 가하여 혼합한 후, 가교제로 키토산을 0.135 g 첨가하였다. 첨가 후, 20%의 NaOH를 사용하여 pH 12로 맞춘 후, 80℃에서 60분 동안 가열하여 반응시켰다. On the other hand, 8 g of purified water was added to 10 g of the obtained water-soluble polysaccharide by weight, and 0.135 g of chitosan was added thereto as a cross-linking agent. After the addition, the mixture was adjusted to pH 12 with 20% NaOH, and reacted by heating at 80 DEG C for 60 minutes.

반응 후, 반응물을 냉각하고, 30%의 시트르산(citric acid)을 사용하여 pH를 4.5로 조절하였다. pH 조절 후, 가교 반응에 참여하지 않은 여분의 키토산은 8000 rpm에서 25분 동안 원심분리하여 제거하였다. After the reaction, the reaction was cooled and the pH was adjusted to 4.5 using 30% citric acid. After adjusting the pH, the excess chitosan not participating in the crosslinking reaction was removed by centrifugation at 8000 rpm for 25 minutes.

그 후, 상층액의 pH를 7로 조절한 후, 순도 96%의 에탄올을 무게비로 수용성 다당류의 6배수만큼 첨가하여 침전시키고, 8000 rpm에서 25분 동안 원심분리하여 가교결합된 수용성 다당류를 회수하였다. Thereafter, the pH of the supernatant was adjusted to 7, and ethanol of 96% purity was added by 6 times the weight of the water-soluble polysaccharide to precipitate and centrifuged at 8000 rpm for 25 minutes to recover cross-linked water-soluble polysaccharides .

가교결합된 다당류의 회수 후, 순도 60%의 에탄올로 수용성 다당류를 세척하고, 8000 rpm에서 25분 동안 원심분리하여 고형분을 수득하였다. 이후, 0.3 ㎛ 필터로 고형분을 걸러내고, 60℃에서 15시간 동안 건조 및 분쇄하여 키토산으로 가교된 수용성 다당류를 최종 제조하였다 (도 4 참조). 도 4는 키토산으로 가교된 수용성 다당류를 제조하는 과정을 나타낸 것이다.
After recovery of the cross-linked polysaccharides, the water-soluble polysaccharides were washed with 60% pure ethanol and centrifuged at 8000 rpm for 25 minutes to obtain solids. Thereafter, the solids were filtered with a 0.3 탆 filter, and dried and pulverized at 60 캜 for 15 hours to finally prepare a water-soluble polysaccharide crosslinked with chitosan (see FIG. 4). 4 shows a process for preparing a water-soluble polysaccharide crosslinked with chitosan.

[[ 비교예Comparative Example 2:  2: 트리폴리인산염(tripolyphosphate, TPP)이Tripolyphosphate (TPP) 가교된Bridged 수용성 다당류의 제조] Preparation of water-soluble polysaccharide]

본 비교예에서는 상기 실시예 2에서 가교제로 키토산 대신 트리폴리인산염(TPP)을 사용하여 수용성 다당류를 제조하였다. In this Comparative Example, a water-soluble polysaccharide was prepared by using tripolyphosphate (TPP) instead of chitosan as a crosslinking agent in Example 2 above.

[[ 실험예Experimental Example 4: 키토산으로  4: as chitosan 가교된Bridged 수용성 다당류의 분산 효과 평가] Evaluation of dispersing effect of water-soluble polysaccharide]

본 실험예에서는 상기 실시예 2에서 제조된 '키토산으로 가교된 수용성 다당류'를 단백질이 함유된 음료에 첨가하여 단백질 분산 효과를 평가하고자 하였다. In this experimental example, the 'water-soluble polysaccharide crosslinked with chitosan' prepared in Example 2 was added to a beverage containing protein to evaluate the protein dispersing effect.

실험을 위해 먼저 단백질이 함유된 발효유를 제조하였다. 탈지분유 21 g에 물 79 g을 혼합하여 95℃의 온도에서 15분 동안 가열하였다. 가열 후, 40℃ 온도에서 냉각하고, 시판되는 발효유 80 g을 첨가한 후, 37℃에서 12시간 동안 발효하여 pH 4 상태의 발효유를 제조하였다 (도 5 참조). 도 5는 단백질 발효유를 제조하는 과정을 나타낸 것이다. For the experiment, fermented milk containing protein was first prepared. 21 g of skim milk powder was mixed with 79 g of water and heated at a temperature of 95 캜 for 15 minutes. After heating, the mixture was cooled at a temperature of 40 DEG C, 80 g of commercially available fermented milk was added, and fermented at 37 DEG C for 12 hours to produce fermented milk having pH 4 (see Fig. 5). 5 shows a process for producing protein fermented milk.

한편, 상기에서 제조된 발효유에 물, 그래뉼당 및 본 발명의 '키토산으로 가교된 수용성 다당류'를 하기 표 2의 비율대로 첨가하였다. 이후, 3500 rpm에서 2분 동안 교반하고, 10% 시트르산(citric acid)으로 pH를 4.55로 조정하였다. 그 후, 3500 rpm에서 5분 동안 교반하고, 냉장보관 상태로 13일 동안 단백질을 침전시켜 그 결과를 관찰하였다. Meanwhile, water, granules, and water-soluble polysaccharide crosslinked with chitosan of the present invention were added to the fermented milk prepared above in the proportions shown in Table 2 below. It was then stirred at 3500 rpm for 2 minutes and the pH was adjusted to 4.55 with 10% citric acid. Thereafter, the mixture was stirred at 3500 rpm for 5 minutes, and protein was precipitated for 13 days in a refrigerated state, and the result was observed.

성분ingredient 함량content 1One 2% 키토산 가교 수용성 다당류 용액2% chitosan crosslinked water-soluble polysaccharide solution 20중량%20 wt% 22 물 water 52중량%52 wt% 33 50% 그래뉼당 용액  50% solution in granules 14중량%14 wt% 44 21% 발효유  21% fermented milk 14중량%14 wt% 총계sum 100100

이때, 대조군으로는 대두다당류를 첨가한 발효유 (대조군 1) 및 상기 비교예 2에서 제조한 'TPP 가교 수용성 다당류'를 첨가한 발효유 (대조군 2)를 사용하였다. As a control, fermented milk (control group 1) to which soybean polysaccharide was added and fermented milk (control group 2) to which TPP crosslinked water-soluble polysaccharide prepared in Comparative Example 2 was added were used.

실험결과, 13일차에서, 대두다당류가 단순 첨가된 대조군 1은 많은 양의 단백질 침전이 일어났다. 'TPP 가교 수용된 다당류'가 첨가된 대조군 2는 약 1.2 cm의 침전물 생성이 관찰되었다. As a result of the experiment, on the 13th day, a large amount of protein precipitated in the control group 1 in which the soy polysaccharide was simply added. The control group 2 with added 'TPP crosslinked polysaccharide' showed a precipitate formation of about 1.2 cm.

하지만, 본 발명의 키토산으로 가교된 수용성 다당류(실시예 2)를 첨가한 경우, 단백질 침전이 거의 나타나지 않는 것으로 관찰되었다 (도 6). 도 6은 본 발명의 키토산으로 가교된 수용성 다당류의 분산 안정 효과를 보여주는 사진이다. However, when the water-soluble polysaccharide crosslinked with chitosan of the present invention (Example 2) was added, it was observed that protein precipitation hardly appeared (FIG. 6). 6 is a photograph showing the dispersion stabilizing effect of the water-soluble polysaccharide crosslinked with chitosan of the present invention.

상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 키토산 가교 수용성 다당류는 단백질의 등전점인 pH 4.2~4.8에서 단백질을 안정적으로 분산시키는 것으로 확인할 수 있었다. From the above results, it was confirmed that the chitosan crosslinked water-soluble polysaccharide of the present invention stably disperses the protein at pH 4.2 to 4.8, which is the isoelectric point of the protein.

Claims (9)

비지(bean curd refuse)로부터 추출된 수용성 다당류에 가교제로서 키토산을 첨가하고, pH 10~14의 알칼리 조건하에서 가열하는 단계 (a);
상기 가열 후, 냉각하고 pH를 3~5로 조정한 후, 가교 반응에 참여하지 않은 여분의 키토산을 원심분리를 통해 제거하는 단계 (b);
상기 원심분리 후, 상층액의 pH를 6~8로 조정한 후, 에탄올수용액을 첨가하여 에탄올 침전을 수행하는 단계 (c); 및
상기 에탄올 침전 후, 원심분리하여 침전물을 수득하는 단계 (d);를 포함하는 것을 특징으로 하는 키토산으로 가교된 수용성 다당류의 제조방법.
(A) adding chitosan as a crosslinking agent to the water-soluble polysaccharide extracted from bean curd refuse and heating under alkaline conditions of pH 10 to 14;
(B) removing the excess chitosan not participating in the cross-linking reaction by centrifugation after cooling by heating to adjust the pH to 3 to 5;
(C) a step of adjusting the pH of the supernatant after the centrifugation to 6 to 8, followed by ethanol precipitation by adding an aqueous ethanol solution; And
(D) a step (d) of precipitating ethanol after centrifugation to obtain a precipitate; and (c) drying the chitosan-crosslinked water-soluble polysaccharide.
제1항에 있어서,
상기 단계 (d)의 침전물 수득 후,
단계 (d)로부터 수득된 침전물에 에탄올 수용액을 첨가하여 세척하는 단계 (e); 및
상기 세척 후, 원심분리하여 침전물을 수득하는 단계 (f); 를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키토산으로 가교된 수용성 다당류의 제조방법.
The method according to claim 1,
After obtaining the precipitate of step (d)
Adding (e) an aqueous solution of ethanol to the precipitate obtained from step (d) and washing; And
After said washing, centrifuging to obtain a precipitate (f); &Lt; / RTI &gt; wherein the chitosan is further cross-linked with the chitosan.
제2항에 있어서,
상기 단계 (f)의 침전물 수득 후,
상기 침전물을 건조시키는 단계 (g)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키토산으로 가교된 수용성 다당류의 제조방법.
3. The method of claim 2,
After obtaining the precipitate of step (f)
(G) drying the precipitate. &Lt; RTI ID = 0.0 &gt; 11. &lt; / RTI &gt;
제1항에 있어서,
상기 단계 (a)의 가열은,
70~90℃로 30~120분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 키토산으로 가교된 수용성 다당류의 제조방법.
The method according to claim 1,
The heating of step (a)
Wherein the water-soluble polysaccharide is crosslinked at 70 to 90 DEG C for 30 to 120 minutes.
제1항에 있어서,
단계 (b)의 pH 조정은,
시트르산(citric acid)으로 수행하는 것을 특징으로 하는 키토산으로 가교된 수용성 다당류의 제조방법.
The method according to claim 1,
The pH adjustment of step (b)
Wherein the water-soluble polysaccharide is crosslinked with chitosan.
제1항에 있어서,
상기 비지로부터 추출된 수용성 다당류는,
비지에 무게비로 5~6배수의 물을 가하고, pH를 2.5~4.5으로 조정한 후, 가열하는 단계 (가);
상기 가열 후, 냉각하고 원심분리하여 침전물을 제거하고 상등액을 수득하는 단계 (나);
상기 상등액의 pH를 4~6으로 조정하고, 원심분리하여 침전물을 수득하는 단계 (다);
상기 침전물을 건조하여 건조물을 수득한 후, 정제수에 용해시키는 단계 (라); 및
상기 용해 후, 에탄올수용액을 첨가하여 에탄올 침전을 수행하고 원심분리하는 단계 (마); 를 포함하는 과정으로부터 수득된 것을 특징으로 하는 키토산으로 가교된 수용성 다당류의 제조방법.
The method according to claim 1,
The water-soluble polysaccharide extracted from the above-
(A) adding 5 to 6 times water by weight to the bean, adjusting the pH to 2.5 to 4.5, and then heating;
After the heating, the mixture is cooled and centrifuged to remove the precipitate and a supernatant is obtained (step b);
Adjusting the pH of the supernatant to 4 to 6 and centrifuging to obtain a precipitate (c);
Drying the precipitate to obtain a dried material, and then dissolving the dried material in purified water; And
Adding ethanol aqueous solution to ethanol precipitation and centrifugation (e); &Lt; / RTI &gt; wherein the water-soluble polysaccharide is obtained from a process comprising the steps of:
제6항에 있어서,
상기 단계 (마)의 원심분리 후,
건조하는 단계 (바);를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키토산으로 가교된 수용성 다당류의 제조방법.
The method according to claim 6,
After centrifugation of the step (e)
&Lt; RTI ID = 0.0 &gt; (bar). &Lt; / RTI &gt;
제6항에 있어서,
상기 단계 (가)의 pH 조정은,
시트르산(citric acid)을 첨가하여 수행하는 것을 특징으로 하는 키토산으로 가교된 수용성 다당류의 제조방법.
The method according to claim 6,
The pH adjustment in the step (A)
Wherein the water-soluble polysaccharide is crosslinked with chitosan by adding citric acid thereto.
제6항에 있어서,
상기 단계 (가)의 가열은,
100~120℃ 온도로 150~450분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 키토산으로 가교된 수용성 다당류의 제조방법.The method according to claim 6,
The heating in the step (A)
Wherein the water-soluble polysaccharide is crosslinked at a temperature of 100 to 120 DEG C for 150 to 450 minutes.
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