KR20160089082A - Crystal structure of human Mus81-Eme1-DNA complex and preparing method thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 핵산 내부 가수분해효소 활성을 가지는 Mus81(Methyl methane sulphonate and UV Sensitive 81)-Eme1(Essential meiotic endonuclease 1)과 DNA 기질 복합체의 3차원 결정구조 및 이의 결정화방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 Mus81-Eme1과 플랩(flap) DNA 기질이 결합된 복합체의 구조에 관한 것이다. The present invention relates to a three-dimensional crystal structure of Mus81 (Methyl methane sulphonate and UV sensitive 81) -Eme1 (Essential meiotic endonuclease 1) having a nucleic acid internal hydrolase activity and a DNA substrate complex and a crystallization method thereof. More specifically, the present invention relates to a structure of a complex in which Mus81-Eme1 is combined with a flap DNA substrate.
DNA(Deoxyribonucleic acid) 손상의 효율적이고 정확한 수리는 세포의 생존과 유전체의 완전성(genomic integrity)을 유지하는데 매우 필수적이다. 상동 재조합(Homologous recombination; HR)은 이중가닥 DNA의 절단, 손상된 복제분기점(replication forks)과 같은 DNA 손상 복구와 염색체 분열에 주된 과정이다. 상동 재조합은 DNA 이중가닥이 교차 결합한 형태인 십자형 접합(holliday junction; HJ)과 같은 연결된 DNA 구조(joint molecules; JMs)를 형성하며, 이러한 DNA는 기질의 구조에 특이적인 핵산 내부 가수분해효소(structure-selective endonuclease)인 Mus81-Eme1(Mms4), Slx1-Slx4, 또는 Gen1에 의해 정상적인 두 가닥의 이중나선 DNA로 되돌아갈 수 있다. Efficient and accurate repair of DNA (Deoxyribonucleic acid) damage is essential for maintaining cell viability and genomic integrity. Homologous recombination (HR) is a major process for DNA damage repair and chromosomal fragmentation, such as cleavage of double-stranded DNA, impaired replication forks. Homologous recombination forms linked molecules (JMs) such as the holliday junction (HJ), a cross-linked form of DNA double stranded DNA, that is specific for the structure of the nucleic acid internal hydrolytic -selective endonuclease, Mus81-Eme1 (Mms4), Slx1-Slx4, or Gen1.
Mus81(Methyl methane sulphonate and UV Sensitive 81)-Eme1(Essential meiotic endonuclease 1) 복합체는 기질의 구조에 특이적인 핵산 내부 가수분해 효소인 XPF 패밀리의 한 종류로써 촉매부위(catalytic site)에 매우 보존적인 ERKX3D 모티프를 공통적으로 가지고 있다. Mus81-Eme1 복합체는 기질의 구조에 특이적인 핵산 내부 가수분해 효소 활성을 가지고 있어 홈(nick)이 있는 DNA 구조를 절단하는데, 그 예로는 홈이 있는 십자형 접합 (nicked Holliday junction; nicked HJs), 3' 플랩(flap) DNA, 손상된 복제분기점(replication forks)이 있으며 이들 DNA를 효과적으로 절단함으로써 유전적인 안정에 기여한다. 특히 진핵세포에서 정지된 복제포크의 재시작과 감수 분열의 상동 재조합 과정에서 나타나는 중간체 절단에 중요한 역할을 한다. 하지만, Mus81-Eme1 복합체는 holliday junction 을 효과적으로 절단하지 못한다. 그동안 Mus81-Eme1 복합체가 holliday junction 보다 홈(nick)이 있는 holliday junction을 더 잘 자르는 이유로 nick-and-counternick 기작이 제시되었고, ss-ds DNA 접합부위의 5’-말단에서 3-7 번째 염기를 절단하며, ss-ds DNA 접합부위로부터 5개 이상의 염기가 비어 있으면 DNA를 절단하지 못한다고 알려져 있다. 최근 연구에 따르면 Slx1-Slx4가 일차적으로 holliday junction을 절단하여 홈(nick)을 만들면, 2차적으로 Mus81-Eme1가 반대쪽 접합부위(junction)를 절단함으로써 선형의 이중가닥 DNA로 복구시킨다고 알려져 있다. The mutant Escherichia coli (Methyl methane sulphonate and UV Sensitive 81) -Eme1 (Essential meiotic endonuclease 1) complex is a kind of XPF family which is a nucleic acid internal hydrolase specific to the substrate structure. It is a highly conserved ERKX 3 D motifs. The Mus81-Eme1 complex has a nucleic acid internal hydrolase activity specific to the substrate structure, which cleaves the nicked DNA structure, such as nicked Holliday junction (nicked HJs), 3 'Flap DNA, impaired replication forks, and contribute to genetic stability by effectively cleaving these DNAs. In particular, it plays an important role in the resumption of cloned forks suspended in eukaryotic cells and in the cleavage of intermediates in homologous recombination of meiosis. However, the Mus81-Eme1 complex fails to cleave effectively the holliday junction. The nick-and-counternick mechanism has been suggested for the Mus81-Eme1 complex to better nick the holliday junction than the holliday junction, and the 3-7 base at the 5'-end of the ss-ds DNA junction It is known that DNA can not be cleaved if five or more bases are empty from the ss-ds DNA junction. Recent studies have shown that when Slx1-Slx4 first nicks holliday junctions, Mus81-Eme1 secondarily cleaves the opposite junction to restore linear double-stranded DNA.
효모와 후생동물에서 Mus81이나 Mms4/Eme1을 제거했을 때 자외선이나 다양한 DNA 손상 약물 투여에 의해 감수분열이나 유사분열시 염색체의 이상분열을 일으키고, 손상된 DNA의 복구를 위한 상동 재조합 과정이 일어나지 못해서 세포는 정상세포와 달리 사멸한다. 또한 Mus81 또는 Mms4/Eme1의 결핍은 정상세포의 분열 동안 염색체 비정상적인 염색체 재배열을 증가시킨다고 알려져 있다. 따라서 이러한 연구결과들로 미루어 보아 Mus81-Eme1 복합체의 역할이 세포 생존에 중요함을 알 수 있다. When Mus81 or Mms4 / Eme1 is removed from yeast and welfare, ultraviolet rays or various DNA damage drugs cause abnormal division of chromosomes upon meiosis or mitosis, and no homologous recombination process for repairing damaged DNA occurs. Unlike normal cells. It is also known that the deficiency of Mus81 or Mms4 / Eme1 increases abnormal chromosomal rearrangement of chromosomes during normal cell division. Thus, these results suggest that the role of the Mus81-Eme1 complex is important for cell survival.
그러나 Mus81의 상동 단백질인 ApeXP F-DNA 복합체의 구조가 밝혀졌고 DNA가 없는 Mus81-Eme1 복합체의 구조가 밝혀졌으나, MUS/XPF 핵산 내부 가수분해효소(endonuclease) 패밀리가 어떻게 기질을 인식하고 절단하는지 분자적 수준에서 잘 알려져 있지 않다. 기존의 연구결과에 따르면, DNA와 결합하지 않은 Mus81-Eme1 복합체의 3차원 결정구조 분석을 통해 Mus81-Eme1는 Mus81의 핵산가수분해효소 도메인(nuclease domain)과 Eme1의 핵산가수분해효소 유사 도메인(nuclease-like domain), 그리고 Mus81와 Eme1에 2개씩 존재하는 각각의 helix-hairpin-helix 도메인(HhH2) 즉, “MHhH2”, “EHhH2”으로 구성되어 있으며, Mus81-Eme1의 MHhH2와 EHhH2 도메인은 DNA 기질과의 결합에 관여된다고 알려져 있다. 그러나 현재까지 Mus81-Eme1의 nick HJ, 3’flap DNA 기질 인식과 절단 방법, Mus81-Eme1가 5’-말단을 인지하는 이유, 그리고 Mus81-Eme1의 절단부위 인식 방법에 대해 잘 알려져 있지 않다. 현재 알려져 있는 Mus81-Eme1 단백질의 결정구조나 XPF-DNA의 구조를 통해서는 Mus81-Eme1의 DNA 인식 및 절단과정을 이해하기 어렵다. However, the structure of the mutant AseXP F-DNA complex, which is the homologous protein of Mus81, has been clarified and the structure of the Mus81-Eme1 complex without DNA has been revealed. However, how the MUS / XPF nucleic acid endonuclease family recognizes and cleaves the substrate It is not well known at enemy level. According to the results of previous studies, Muslim-Eme1 has been isolated from the nuclease domain of Mus81 and the nuclease domain of Eme1 through the analysis of the three-dimensional crystal structure of the Mus81-Eme1 complex, -like domain), and two helix-hairpin-helix domains (HhH2), ie, "MHhH2" and "EHhH2", which exist in two mutations in Mus81 and Eme1. The MHhH2 and EHhH2 domains of Mus81- And the like. However, to date, it is not well known whether nick HJ, 3'flap DNA substrate recognition and cleavage of Mus81-Eme1, Mus81-Eme1 recognizes the 5'-terminal and how to recognize the cleavage site of Mus81-Eme1. It is difficult to understand the DNA recognition and cleavage process of Mus81-Eme1 through the crystal structure of the currently known Mus81-Eme1 protein or the structure of XPF-DNA.
Mus81-Eme1 복합체의 기질 인식과 절단 기작을 밝히고 그 기작을 조절할 수 있다면 암세포에서 DNA 손상 복구가 일어나지 않도록 하여 결과적으로 암을 죽음에 이르게 하는 암 치료제로 사용할 수 있을 것이다. If the substrate recognition and cleavage mechanism of the Mus81-Eme1 complex is identified and its mechanism can be controlled, DNA damage repair can be prevented from occurring in the cancer cells, resulting in a cancer treatment that leads to cancer death.
본 발명자들은, 상기와 같은 종래의 문제점 해결을 위하여 인간 Mus81-Eme1 단백질 복합체에 플랩(flap) DNA를 결합시켜 Mus81-Eme1-DNA 복합체의 3차원 결정구조를 얻어 Mus81-Eme1 복합체의 기질 DNA와 결합에 의한 구조적 변화, 기질과 절단부위 인식 방법, 및 주요 결합부위 등을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다. In order to solve the above conventional problems, the present inventors have synthesized a three-dimensional crystal structure of a Mus81-Eme1-DNA complex by binding flap DNA to a human Mus81-Eme1 protein complex and then binding it to the substrate DNA of the Mus81-Eme1 complex , The method for recognizing the substrate and the cleavage site, and the main binding site.
이에, 본 발명은 Mus81-Eme1 복합체가 DNA 기질과 결합하고 있는 3차원 결정구조 및 이에 관한 정보를 제공하는데 목적이 있다. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a three-dimensional crystal structure in which the Mus81-Eme1 complex binds to a DNA substrate and information on the three-dimensional crystal structure.
또한, 본 발명은 Mus81-Eme1-DNA 복합체의 결정화 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.The present invention also aims at providing a method for crystallizing Mus81-Eme1-DNA complex.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Mus81(Methyl methane sulphonate and UV Sensitive 81)-Eme1(Essential meiotic endonuclease 1) 복합체가 DNA 기질과 결합하고 있는 3차원 결정구조를 가지며, 상기 Mus81-Eme1는 인간 유래 단백질이며 상기 DNA 기질은 플랩(flap) DNA인 것을 특징으로 하는, Mus81-Eme1-DNA 복합체 구조결정을 제공한다. In order to accomplish the object of the present invention, the present invention has a three-dimensional crystal structure in which Mus 81 (Methyl methane sulphonate and UV-sensitive 81) -Eme 1 (Essential meiotic endonuclease 1) -Eme1 is a human-derived protein, and the DNA substrate is a flap DNA.
본 발명의 일 구현예로, 상기 Mus81-Eme1-DNA 복합체는 하기와 같은 X-선 결정 구조를 가지는 것을 특징으로 한다. In one embodiment of the present invention, the Mus81-Eme1-DNA complex has the following X-ray crystal structure.
결정의 분해능 한계: 6.5Å, Resolution limit of crystal: 6.5 A,
결정공간군: C2, Crystal space group: C2,
격자 단위: a=221.8Å, b=135.3Å, c=102.9Å, 및 α=γ=90°, β= 113.3°Lattice units: a = 221.8 占 b = 135.3 占 c = 102.9 占 and? =? = 90 占 and? = 113.3
Rworking (%): 25.5Rworking (%): 25.5
Rfree (%): 30.0 Rfree (%): 30.0
본 발명의 다른 구현예로, 상기 Mus81-Eme1-DNA 복합체는 하기와 같은 X-선 결정 구조를 가지는 것을 특징으로 한다. In another embodiment of the present invention, the Mus81-Eme1-DNA complex is characterized by having an X-ray crystal structure as described below.
결정의 분해능 한계: 6.0 Å, Resolution limit of crystal: 6.0 A,
결정공간군: C2221, Crystalline space group: C222 1 ,
격자 단위: a=92.4Å, b=250.8Å, c=430.2Å, 및 α=β=γ=90°Lattice unit: a = 92.4 A, b = 250.8 A, c = 430.2 A, and? =? =? = 90
Rworking (%): 27.3Rworking (%): 27.3
Rfree (%): 32.4 Rfree (%): 32.4
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 Mus81-Eme1-DNA 복합체는 기질 DNA와 결합에 의해 Mus81과 Eme1의 HhH2 도메인(helix-hairpin-helix2 domain)이 핵산가수분해효소 도메인(nuclease domain)에 대해 회전하면서 열린 구조를 형성하는 것을 특징으로 한다. In another embodiment of the present invention, the Mus81-Eme1-DNA complex has a structure in which the HhH2 domain (helix-hairpin-helix2 domain) of Mus81 and Eme1 binds to the nucleic acid hydrolase domain (nuclease domain) Thereby forming an open structure.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 Mus81-Eme1-DNA 복합체는 Mus81의 핵산가수분해효소 도메인(nuclease domain)과 Eme1의 HhH2 도메인(helix-hairpin-helix2 domain) 사이에 위치한 pre-nick DNA, Eme1의 핵산가수분해효소 유사 도메인(nuclease-like domain)과 Mus81의 HhH2 도메인(helix-hairpin-helix2 domain) 사이에 위치한 post-nick DNA, 5’-말단 포켓, 및 활성부위(active site)를 포함하는 것을 특징으로 한다. In another embodiment of the present invention, the Mus81-Eme1-DNA complex comprises a pre-nick DNA located between the nucleic acid hydrolase domain of Mus81 and the HhH2 domain (helix-hairpin-helix2 domain) of Eme1, Eme1 Including a post-nick DNA, a 5'-terminal pocket, and an active site located between the nuclease-like domain of the mouse Mus81 and the HuhH2 domain of Mus81 (helix-hairpin-helix2 domain) .
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 Mus81-Eme1-DNA 복합체는 Mus81의 소수성 쐐기(wedge)가 pre-nick DNA와 post nick DNA를 분리하는 것을 특징으로 한다. In another embodiment of the present invention, the Mus81-Eme1-DNA complex is characterized in that the hydrophobic wedge of Mus81 separates the pre-nick DNA and the post nick DNA.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 Mus81-Eme1-DNA 복합체는 5’-말단 포켓이 post-nick DNA의 5’nick 말단을 특이적으로 인식하는 것을 특징으로 한다. In another embodiment of the present invention, the Mus81-Eme1-DNA complex is characterized in that the 5'-terminal pocket specifically recognizes the 5'nick end of the post-nick DNA.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 Mus81-Eme1-DNA 복합체는 post-nick DNA의 마이너 그루브(minor groove)가 Mus81의 R483, S486, 및 K489와 Eme1의 K241, 및 R244와 결합하며 Mus81의 R530은 DNA 이중가닥 사이의 깊이 위치하는 것을 특징으로 한다. In another embodiment of the present invention, the Mus81-Eme1-DNA complex is characterized in that the minor groove of post-nick DNA binds to R483, S486, and K489 of Mus81 and K241 and R244 of Eme1, Is located deep between DNA double strands.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 Mus81-Eme1-DNA 복합체는 post-nick DNA가 Mus81-Eme1 복합체의 5’-말단 포켓 내 R350, 및 N390과 Eme1의 K441, 및 K449와 결합하며 Mus81의 I344, I345, T383, 및 A387에 둘러싸여 있는 것을 특징으로 한다. In another embodiment of the present invention, the Mus81-Eme1-DNA complex is characterized in that the post-nick DNA binds R350 in the 5'-terminal pocket of the Mus81-Eme1 complex and K349 and K449 of Eme1 and I344 of Mus81 , I345, T383, and A387.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 Mus81-Eme1-DNA 복합체는 pre-nick DNA의 마이너 그루브(minor groove)가 Mus81의 R348, R355, K302, 및 K465와 Eme1의 R491, S493, R534, 및 T541와 결합하는 것을 특징으로 한다. In another embodiment of the present invention, the Mus81-Eme1-DNA complex is characterized in that the minor groove of the pre-nick DNA is composed of R348, R355, K302 and K465 of Mus81 and R491, S493, R534 and T541 of Eme1 And the like.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 활성부위는 D274, E277, 및 D307인 것을 특징으로 한다. In still another embodiment of the present invention, the active sites are D274, E277, and D307.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, Mus81-Eme1-DNA의 3차원 구조의 결정 제조방법을 제공한다. In addition, the present invention provides a method for producing a crystal of a three-dimensional structure of Mus81-Eme1-DNA, comprising the following steps.
a) 인간 유래의 Mus81 및 Eme1 단백질을 발현, 정제하여 Mus81-Eme1 단백질 복합체를 형성하는 단계;a) expressing and purifying Mus81 and Eme1 proteins derived from human to form a Mus81-Eme1 protein complex;
b) 상기 Mus81-Eme1 단백질 복합체에 기질 DNA를 혼합하여 결합시키는 단계; 및 b) mixing and binding the substrate DNA to the Mus81-Eme1 protein complex; And
c) 상기 결합된 Mus81-Eme1-DNA 복합체를 행잉 드롭 증기 평형법(hanging drop vapor diffusion method)을 이용하여 결정화하는 단계. c) crystallizing the bound Mus81-Eme1-DNA complex using a hanging drop vapor diffusion method.
본 발명의 일 구현예로, 상기 정제는 니켈 친화성 크로마토그래피(Ni2 +-NTA affinity chromatography), 이온 교환 크로마토그래피(cation-exchange chromatography), 및 투석 방법을 통해 수행될 수 있다. In one embodiment of the invention, the purification can be carried out by means of nickel affinity chromatography (Ni 2 + -NTA affinity chromatography), cation-exchange chromatography, and dialysis.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 Mus81-Eme1 단백질 복합체와 DNA 기질의 혼합비율은 1:1 내지 1:3의 중량비인 것을 특징으로 한다. In another embodiment of the present invention, the mixing ratio of the Mus81-Eme1 protein complex to the DNA substrate is 1: 1 to 1: 3.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 결정화는 4 내지 18℃에서 2 내지 10일 동안 수행될 수 있다. In another embodiment of the present invention, the crystallization may be carried out at 4 to 18 캜 for 2 to 10 days.
또한, 본 발명은 Mus81-Eme1-DNA의 3차원 결정구조를 이용하여 Mus81-Eme1 복합체의 핵산 내부 가수분해효소 활성을 저해하는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. In addition, the present invention provides a screening method for a substance that inhibits the activity of nucleic acid internal hydrolase of Mus81-Eme1 complex using the three-dimensional crystal structure of Mus81-Eme1-DNA.
본 발명의 Mus81-Eme1-DNA 복합체의 3차원 결정구조는 Mus81-Eme1의 DNA 기질과의 결합의 의한 구조적 변화, 기질 인식 및 절단 기작, 결합 부위 등의 정보를 제공함으로써 Mus81-Eme1-DNA 복합체 구조를 기반으로 암세포 내 Mus81-Eme1의 핵산 내부 가수분해효소 활성을 억제하여 암 치료제를 개발하는데 유용하게 이용할 수 있다. The three-dimensional crystal structure of the Mus81-Eme1-DNA complex of the present invention provides information on structural changes, substrate recognition and cleavage mechanism, and binding site of Mus81-Eme1 binding to the DNA substrate, The present invention can be used to develop a therapeutic agent for cancer by inhibiting the internal hydrolytic enzyme activity of Mus81-Eme1 in cancer cells.
도 1은, 인간 Mus81-Eme1가 5-nt(nucleotide) 5’flap DNA를 가진 17-bp(base pair)의 이중가닥(double strand; ds)DNA 기질과 결합된 복합체와 3-nt 3’flap을 가진 32-bp의 이중가닥 DNA와 결합한 복합체를 crystal Ⅰ(A)과 crystal Ⅱ(B)의 3차원 결정구조로 나타낸 것이다.
도 2A는, DNA 기질과 결합하지 않은 인간 Mus81-Eme1 복합체의 3차원 결정구조이고, 도 2B는, Mus81-Eme1-DNA 복합체의 3차원 결정구조를 나타낸 것이며, 도 2C 및 도 2D는 상기 각 구조의 Eme1 연결부위(linker)를 확대하여 나타낸 것이다.
도 3A 및 B는, Mus81-Eme1-DNA 복합체 내에서 post-nick DNA가 5’-말단 포켓과 Mus81의 MHhH2, Eme1의 nuclease-like 도메인과의 결합하는 부위를 나타낸 것이며, 도 3C,는 Mus81-Eme1의 다양한 주요 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환시킨 후 Mus81-Eme1의 핵산 내부 가수분해효소 활성을 알아보기 위해 홈이 있는 십자형 접합(nicked holliday junction)을 기질로 하여 nuclease activity assay를 수행한 결과이며, 도 3D는, nuclease activity assay 결과를 정량화하여 나타낸 것이다.
도 4A는, 5’-말단 포켓 부위와 post-nick DNA의 결합을 시뮬레이션으로 보여주는 것이고, 도 4B는, pre-nick DNA가 Mus81의 nuclease 도메인 및 Eme1의 HhH2 도메인과의 결합부위를 보여주며, 도 4C는, Mus81-Eme1의 다양한 주요 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환시킨 후 Mus81-Eme1의 핵산 내부 가수분해효소 활성을 알아보기 위해 3’flap DNA를 기질로 하여 nuclease activity assay를 수행한 결과이며, 도 4D는, nuclease activity assay 결과를 정량화하여 나타낸 것이다.
도 5A는, Mus81의 활성부위를 나타내며, 도 5B는, 활성부위의 아미노산 잔기를 알라닌(Alanine)으로 치환시킨 후 홈이 있는 십자형 접합(nicked holliday junction)을 기질로 하여 nuclease activity assay를 수행한 결과이며, 도 5C는, DNA 가닥을 포함하는 Mus81의 활성부위를 나타낸 것이다.
도 6은, 인간 Mus81-Eme1-DNA 복합체와 hFEN1-DNA, ApXPF-DNA, 및 FANCM-FAAP24-DNA의 구조를 비교하여 나타낸 것이다. Figure 1 shows that human Mus81-Eme1 binds to a 17-bp (base pair) double stranded (ds) DNA substrate with a 5-nucleotide 5'flap DNA and a 3-nt 3'flap (A) and crystal II (B), which are bound to a 32-bp double-stranded DNA with a three-dimensional crystal structure.
FIG. 2A shows a three-dimensional crystal structure of a human Mus81-Eme1 complex not bound to a DNA substrate, FIG. 2B shows a three-dimensional crystal structure of a Mus81-Eme1-DNA complex, And the Eme1 linker of FIG.
3A and B show the binding sites of the post-nick DNA in the Mus81-Eme1-DNA complex between the 5'-terminal pocket and MHhH2 of Mus81 and the nuclease-like domain of Eme1, and FIG. After substitution of various major amino acid residues of Eme1 with other amino acid residues, nuclease activity assay was performed using a nicked holliday junction as a substrate to examine the activity of nucleic acid internal hydrolase of Mus81-Eme1 , And FIG. 3D is a graph showing quantification results of the nuclease activity assay.
Figure 4A shows the binding of the 5'-terminal pocket region and post-nick DNA in a simulated manner, Figure 4B shows the binding site of the pre-nick DNA with the nuclease domain of Mus81 and the HhH2 domain of Eme1, 4C is a result of performing nuclease activity assay using 3'flap DNA as a substrate to examine the activity of nucleic acid internal hydrolase of Mus81-Eme1 after substituting various major amino acid residues of Mus81-Eme1 with other amino acid residues, Figure 4D is a quantitative representation of nuclease activity assay results.
FIG. 5A shows the active site of Mus 81, FIG. 5B shows the result of performing nuclease activity assay using a nicked holliday junction as a substrate after replacing the amino acid residue of the active site with alanine And Fig. 5C shows the active site of Mus 81 including the DNA strand.
Fig. 6 shows a comparison of the structures of human Mus81-Eme1-DNA complex with hFEN1-DNA, ApXPF-DNA, and FANCM-FAAP24-DNA.
본 발명은 Mus81-Eme1 복합체가 DNA 기질과 결합하고 있는 3차원 결정구조 및 이에 관한 정보를 제공한다. The present invention provides a three-dimensional crystal structure in which the Mus81-Eme1 complex binds to a DNA substrate and information on the three-dimensional crystal structure.
본 발명의 상기 Mus81-Eme1 복합체는 결정의 분해능 한계 6.5Å, 결정공간군 C2, 격자 단위 a=221.8Å, b=135.3Å, c=102.9Å, 및 α=γ=90°, β= 113.3°, Rworking (%) 25.5, Rfree (%): 30.0, 또는 결정의 분해능 한계 6.0 Å, 결정공간군 C2221, 격자 단위 a=92.4Å, b=250.8Å, c=430.2Å, 및 α=β=γ=90°, Rworking (%) 27.3, Rfree (%) 32.4의 X-선 결정구조를 갖으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The Mus81-Eme1 complex of the present invention has a crystal resolution limit of 6.5 Å, crystal space group C2, lattice unit a = 221.8 Å, b = 135.3 Å, c = 102.9 Å and α = γ = 90 °, β = 113.3 ° , The Rworksing (%) 25.5, the Rfree (%): 30.0, or the resolution limit of the crystal 6.0 Å, the crystal space group C222 1 , the lattice unit a = 92.4 Å, b = 250.8 Å, c = 430.2 Å, ray crystal structure of γ = 90 °, Rworking (%) 27.3, and Rfree (%) 32.4.
본 발명에서는 인간 Mus81-Eme1 복합체와 플랩(flap) DNA 기질을 결합시킨 Mus81-Eme1-DNA 복합체의 3차원 결정구조를 밝히고 구조를 분석하였다. In the present invention, the three-dimensional crystal structure of the Mus81-Eme1-DNA complex, in which the human Mus81-Eme1 complex and the flap DNA substrate are combined, is clarified and analyzed.
본 발명의 일 실시예에서는, Mus81-Eme1가 3’flap DNA와 결합한 구조를 통해 기질 DNA는 Mus81의 핵산가수분해효소 도메인(nuclease domain)과 Eme1의 HhH2 도메인(helix-hairpin-helix2 domain) 사이에 위치한 pre-nick DNA와 Eme1의 핵산가수분해효소 유사 도메인(nuclease-like domain)과 Mus81의 HhH2 도메인 사이에 위치한 post-nick DNA로 나뉠 수 있으며, Pre-nick DNA와 post-nick DNA는 약 100°도 구부러져 있고, 그 사이는 4개의 뉴클레오타이드(nucleotide)로 이뤄진 한 가닥 DNA로 연결되어 있으며 두 DNA 부분은 Mus81의 소수성 쐐기 모양의 helix-turn-helix (HTH)와 loop에 의해 분리되어 있는 것을 확인하였다(실시예 2 참조). In one embodiment of the present invention, the mutation of Mus81-Eme1 with 3'flap DNA allows the substrate DNA to be inserted between the nucleotide hydrolase domain of Mus81 and the HhH2 domain (helix-hairpin-helix2 domain) of Eme1 Nick DNA and post-nick DNA located between the nuclease-like domain of Eme1 and the HhH2 domain of Mus81, and pre-nick DNA and post-nick DNA are located at about 100 ° It was confirmed that the two DNA fragments were separated by the loop of the hydrophilic wedge-shaped helix-turn-helix (HTH) of Mus81, while the DNA fragment was connected to one strand of DNA consisting of four nucleotides (See Example 2).
본 발명의 다른 실시예에서는, DNA 기질이 결합되지 않은 Mus81-Eme1 복합체와 Mus81-Eme1-DNA 복합체 구조를 비교함으로써 기질의 결합시 구조변화를 확인하였다. 그 결과 Mus81의 연결자가 직선으로 뻗고 Eme1의 연결자가 이전에 없던 나선형 구조를 이루면서 nuclease 도메인과 2HhH2 도메인이 멀어지고 2HhH2 도메인이 nuclease 도메인에 대해 40° 회전하여 전체적으로 열린 구조를 형성함을 관찰하였다. 또한 이러한 구조적 변화로 Mus81의 소수성 쐐기 모양의 HTH가 드러나고 5'-말단 포켓이 형성됨을 확인하였다. 상기의 구조적 변화가 5' flap DNA 기질이 붙은 구조에서도 동일하게 관찰됨으로써 이로부터 Mus81-Eme1 복합체가 기질 DNA의 5’-nick 말단을 특이적으로 인식하고 먼저 결합함을 알 수 있었다(실시예 3 참조). In another embodiment of the present invention, structural changes during binding of the substrate were confirmed by comparing the Mus81-Eme1 complex with the Mus81-Eme1-DNA complex without the DNA substrate. As a result, it was observed that the linker of Mus81 stretched in a straight line and the linker of Eme1 had a helical structure that had not existed before, and the 2HhH2 domain was rotated 40 ° to the nuclease domain to form a totally open structure by moving away the nuclease domain and 2HhH2 domain. This structural change also revealed that the hydrophobic wedge shaped HTH of Mus81 was revealed and 5'-terminal pockets were formed. This structural change was also observed in the structure with the 5 'flap DNA substrate, so that it was found that the Mus81-Eme1 complex specifically recognized and bound the 5'-nick end of the substrate DNA first (Example 3 Reference).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, Mus81-Eme1 복합체의 구조적 변화를 야기하는 post-nick DNA의 결합부위를 분석하였다. Mus81-Eme1과 post-nick DNA 사이의 결합은 크게 두 부분으로 나타났으며, 먼저 post-nick DNA의 마이너 그루브(minor groove)가 Mus81의 R483, S486, 및 K489와 Eme1의 K241, 및 R244와 결합하며, Mus81의 R530은 DNA 이중가닥 사이의 깊이 위치하는 것을 확인하였다. 두 번째는 post-nick DNA가 Mus81-Eme1 복합체의 5’-말단 포켓 내 R350, 및 N390과 Eme1의 K441, 및 K449와 결합하며 Mus81의 I344, I345, T383, 및 A387에 둘러싸여 있는 것을 확인하였다. 상기 결합에 관여하는 아미노산 잔기를 다른 것으로 치환한 경우에는 홈이 있는 십자형 접합(nicked holliday junction)과 3’flap DNA 기질에 대한 Mus81-Eme1의 핵산 내부 가수분해효소 활성이 감소하는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).In another embodiment of the present invention, binding sites of post-nick DNA, which cause structural changes in the Mus81-Eme1 complex, were analyzed. The binding between Mus81-Eme1 and post-nick DNA was largely divided into two parts. First, a minor groove of post-nick DNA was bound to R483, S486, and K489 of Mus81 and K241 and R244 of Eme1 , And that the R530 of Mus81 was located deep between the DNA double strands. The second confirms that post-nick DNA is bound to R350 in the 5'-terminal pocket of the Mus81-Eme1 complex, and to K441 and K449 of Nme90 and Eme1 and to I344, I345, T383, and A387 of Mus81. When the amino acid residues involved in this binding were replaced with other ones, it was confirmed that the activity of nucleic acid internal hydrolase of Mus81-Eme1 on the nicked holliday junction and the 3'flap DNA substrate was reduced See Example 4).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, Mus81-Eme1와 pre-nick DNA의 결합 부위를 분석한 결과 pre-nick DNA는 마이너 그루브(minor groove)를 통해 Mus81의 R348, R355, K302, 및 K465와 Eme1의 R491, S493, R534, 및 T541 아미노산 잔기와 결합하는 것을 확인하였으며, 상기 결합에 관여하는 아미노산을 다른 것으로 치환한 경우에는 홈이 있는 십자형 접합(nicked holliday junction)과 3’flap DNA 기질에 대한 Mus81-Eme1의 핵산 내부 가수분해효소 활성이 감소하는 것을 확인하였다(실시예 5 참조).In another embodiment of the present invention, pre-nick DNA was analyzed through the minor groove of Mus81-Eme1 and pre-nick DNA binding sites, and R348, R355, K302, and K465 of Mus81 and Eme1 R491, S493, R534, and T541 amino acid residues. When the amino acids involved in the binding were replaced with other amino acids, it was confirmed that the mutated amino acid residues in the mutated nicked holliday junction and Mus81- It was confirmed that the nucleic acid internal hydrolase activity of Eme1 was decreased (see Example 5).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, Mus81-Eme1-DNA 복합체를 1mM MgCl2를 포함하는 buffer에 담굼으로써 Mus81-Eme1-DNA (5’flap) 결정에 Mg2 + 이온을 넣어주어 Mg2 + 이온이 활성부위에 결합할 수 있도록 함으로써 Mus81 내의 활성부위를 확인하였다. Mg2 + 이온은 D274, E277, D307 아미노산의 carboxyl group과 결합하였으며, 상기 아미노산들을 알라닌으로 치환한 경우 Mus81-Eme1의 nuclease 활성이 사라지는 것을 확인하였다(실시예 6 참조).In another embodiment of the invention, Mus81-Eme1-DNA complex was given to put the Mg 2 + ion in Mus81-Eme1-DNA (5'flap) determined by damgum in buffer containing 1mM MgCl 2 Mg 2 + ions The active sites in Mus 81 were identified by being able to bind to the active site. Mg 2 + ions were combined with D274, E277, D307 carboxyl group of the amino acid, if the substitution of the amino acid with alanine was confirmed that the nuclease activity of the Mus81-Eme1 disappear (see Example 6).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, Mus81-Eme1 복합체와 다른 5’flap DNA를 기질로 하는 핵산 가수분해효소들과의 공통적인 구조적 특징을 분석하였다. 그 결과 Mus81 단백질의 중심에 나선(helix)으로 둘러싸인 여섯 개의 시트(sheet)는 FEN1과 Exo1에서도 관찰됨을 알 수 있었고, Mus81은 FEN1, Exo1과 같은 5' 핵산 가수분해 효소와 기질 인식, DNA 구부러짐, 단백질의 구조적 변화와 같은 특징을 공유하는 것을 관찰하였다. 또한 Mus81의 소수성 쐐기는 5' 핵산 가수분해 효소의 쐐기와 일치하고 Mus81-Eme1의 5'-말단 포켓은 5' 핵산 가수분해 효소의 3' flap 결합 부위와 비슷함을 확인하였다. 상기 결과를 통해 Mus81-Eme1이 5’말단에 홈이 있는 3’flap DNA 기질을 선호하는 이유를 알 수 있었다(실시예 7 참조).In another embodiment of the present invention, structural features common to the nucleic acid hydrolases with the Mus81-Eme1 complex and other 5'flap DNA substrates are analyzed. As a result, it was found that six sheets of helix-surrounded sheets in the center of Mus81 protein were also observed in FEN1 and Exo1, and Mus81 showed 5 'nucleic acid hydrolases such as FEN1 and Exo1, substrate recognition, DNA bending, And structural changes of proteins. In addition, we confirmed that the hydrophobic wedge of Mus81 coincided with the wedge of the 5 'nucleic acid hydrolase and the 5'-terminal pocket of Mus81-Eme1 was similar to the 3' flap binding site of the 5 'nucleic acid hydrolase. The above results indicate that Mus81-Eme1 prefers a 3'flap DNA substrate with a groove at the 5 'end (see Example 7).
또한, 본 발명은 인간 유래의 Mus81 및 Eme1 단백질을 발현, 정제하여 Mus81-Eme1 단백질 복합체를 형성하는 단계; 상기 Mus81-Eme1 단백질 복합체에 기질 DNA를 혼합하여 결합시키는 단계; 및 상기 결합된 Mus81-Eme1-DNA 복합체를 행잉 드롭 증기 평형법(hanging drop vapor diffusion method)을 이용하여 결정화하는 단계를 포함하는 Mus81-Eme1-DNA의 3차원 구조의 결정 제조방법을 제공한다. In addition, the present invention provides a method for producing a protein comprising the steps of: expressing and purifying Mus81 and Eme1 proteins derived from human to form a Mus81-Eme1 protein complex; Mixing the Muslim-Eme1 protein complex with the substrate DNA; And a step of crystallizing the bound Mus81-Eme1-DNA complex using a hanging drop vapor diffusion method. The present invention also provides a method for producing a three-dimensional structure of Mus81-Eme1-DNA.
본 발명에서 상기 정제는 니켈 친화성 크로마토그래피(Ni2 +-NTA affinity chromatography), 이온 교환 크로마토그래피(cation-exchange chromatography), 및 투석 방법을 통해 수행될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the purification can be carried out through nickel affinity chromatography (Ni 2 + -NTA affinity chromatography), cation-exchange chromatography, and dialysis, but is not limited thereto.
본 발명에서 상기 Mus81-Eme1 단백질 복합체와 DNA 기질의 혼합비율은 1:1 내지 1:3의 중량비일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the mixing ratio of the Mus81-Eme1 protein complex and the DNA substrate may be 1: 1 to 1: 3, but is not limited thereto.
본 발명에서 상기 결정화는 4 내지 18℃에서 2 내지 10일 동안 수행되나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the crystallization is carried out at 4 to 18 DEG C for 2 to 10 days, but is not limited thereto.
또한, 본 발명은 Mus81-Eme1-DNA의 3차원 결정구조를 이용하여 Mus81-Eme1 복합체의 핵산 내부 가수분해효소 활성을 저해하는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. In addition, the present invention provides a screening method for a substance that inhibits the activity of nucleic acid internal hydrolase of Mus81-Eme1 complex using the three-dimensional crystal structure of Mus81-Eme1-DNA.
본 발명에서 사용되는 용어, “단백질”은 수많은 아미노산의 연결체로 20가지의 서로 다른 아미노산들이 펩타이드 결합이라고 하는 화학 결합으로 길게 연결된 폴리펩타이드의 복합체를 말한다. 폴리펩티드 및 단백질은 자연적으로 발생하거나 비-재조합 세포에 의해 생성될 수 있거나, 폴리펩티드 및 단백질은 유전적으로 조작된 세포 또는 재조합 세포에 의해 생성될 수 있다. 폴리펩티드 및 단백질은 나이브 단백질의 아미노산 서열을 갖는 분자 또는 나이브 서열의 한 이상의 아미노산으로부터의 결실, 이에 대한 첨가 및/또는 이의 치환을 갖는 분자를 포함할 수 있다. As used herein, the term " protein " refers to a complex of polypeptides that are linked by chemical bonds, in which 20 different amino acids are peptide bonds, connecting a number of amino acids. Polypeptides and proteins may be naturally occurring or produced by non-recombinant cells, or the polypeptides and proteins may be produced by genetically engineered cells or recombinant cells. Polypeptides and proteins may include molecules having amino acid sequences of a Naive protein or molecules having deletions, additions thereto and / or substitutions thereon from one or more amino acids of a Naive sequence.
본 발명에서 사용되는 용어,“단백질 결정”은 3차원의 결정격자로 이루어진 물질의 고체 상태의 한 가지 유형을 말한다. As used herein, the term " protein crystals " refers to one type of solid state of matter consisting of a three dimensional crystal lattice.
본 발명에서 사용되는 용어, “기질”은 효소와 작용하여 화학 반응을 일으키는 물질로써, 본 발명에서는 핵산 내부 가수분해효소 활성을 가진 Mus81/Eme1에 결합하여 절단되는 DNA 기질, 바람직하게는 홈이 있는 십자형 접합(nick holliday junction), 3’flap DNA 일 수 있다. As used herein, the term " substrate " refers to a substance that reacts with an enzyme to cause a chemical reaction. In the present invention, a DNA substrate that binds to and cleaves Mus81 / Eme1 having a nucleic acid internal hydrolase activity, Nick holliday junction, 3 'flap DNA.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.
[[ 실시예Example ]]
실시예Example 1. 실험 준비 1. Experimental preparation
1-1. 1-1. Mus81Mus81 과 and Eme1Eme1 단백질의 발현 및 정제 Protein expression and purification
인간 Mus81과 Eme1 단백질(hMus1, hEme1)을 발현하기 위한 방법으로, hMus1(246-551)과 hEme1(178-570)의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 통하여 증폭시킨 후 대장균 발현벡터에 각각 삽입하여 대장균에서 Mus1과 Eme1 단백질을 발현시켰다. A gene encoding the amino acid sequence of hMus1 (246-551) and hEme1 (178-570) was amplified by polymerase chain reaction (PCR) to express human Mus81 and Eme1 protein (hMus1, hEme1) And then inserted into Escherichia coli expression vector to express Mus1 and Eme1 protein in Escherichia coli.
PCR을 통해 Mus1과 Eme1의 유전자를 증폭시키기 위하여 각각 유전자의 5’-말단과 3’-말단에 상응하는 PCR용 프라이머를 합성하였다. 합성한 상기 프라이머들은 유전자를 대장균 발현 벡터로 삽입할 수 있도록 제한효소 인지 부위를 갖고 있으며, 추가적으로 3’-말단에 상응하는 프라이머는 종결코돈을 포함하도록 만들어 단백질 합성이 인위적으로 종료될 수 있도록 하고 5’-말단에 대응하는 프라이머는 N-말단의 아미노산을 제거하도록 합성하였다. 즉, Mus81의 프라이머는 유전자의 코돈을 토대로 세린(Serine)-알라닌(Alanine)-글루타메이트(Glutamate)로 시작하고, Eme1의 프라이머는 유전자의 코돈을 토대로 프롤린(Proline)-글라이신(Glycine)-글루타민(Glutamine)으로 시작하도록 프라이머를 제조하였다. 상기 합성된 프라이머와 사람의 cDNA를 주형으로 중합효소 연쇄 반응을 진행하여 Mus81과 Eme1의 유전자를 증폭시키고, 증폭된 각각의 유전자를 제한효소로 절단한 후 Mus81은 pCDF-duet 벡터에, Eme1은 pET-duet 벡터에 삽입하였다. transformation(형질전환) 과정을 통해 유전자를 삽입한 상기 벡터들을 대장균(E.coli(DE3))에 도입한 후 재조합 벡터가 잘 도입된 대장균을 선별하기 위해 재조합 벡터의 선별 마커에 해당되는 항생제가 함유된 LB배지에서 진탕 배양하고 대장균이 일정농도에 다다르면 IPTG(isopropyl-D-galactopyranoside)를 첨가하였다. To amplify the genes of Mus1 and Eme1 through PCR, primers for PCR corresponding to the 5'-terminal and 3'-terminal of each gene were synthesized. The primers thus synthesized have a restriction enzyme recognition site so that the gene can be inserted into an E. coli expression vector. In addition, the primer corresponding to the 3'-end includes the termination codon so that the protein synthesis can be artificially terminated. '-Terminal was synthesized to remove the N-terminal amino acid. That is, the primer of Mus81 starts with Serine-Alanine-Glutamate based on the codon of the gene, and the primer of Eme1 is derived from Proline-Glycine-Glutamine Glutamine). The amplified genes of Mus81 and Eme1 were amplified by polymerase chain reaction using the synthesized primers and human cDNA as templates, and the amplified genes were digested with restriction enzymes. Then, Mus81 was inserted into the pCDF-duet vector and Eme1 was inserted into the pET -duet vector. After introducing the vectors into E. coli (DE3) through a transformation process, antibiotics corresponding to selection markers of the recombinant vector are contained in order to select E. coli to which the recombinant vector is well introduced And then IPTG (isopropyl-D-galactopyranoside) was added when Escherichia coli reached a certain concentration.
단백질의 발현 여부는 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동방법으로 확인하였다. 단백질이 충분히 발현되도록 일정 시간 대장균을 진탕 배양한 뒤, 배양액을 원심분리하여 대장균 세포를 침전시키고 대장균을 적당한 완충 용액에 용해시켰다. 상기 대장균을 파쇄하고 원심분리로 단백질이 녹아있는 상층액을 분리한 후 니켈 친화성 크로마토그래피(Ni2 + -NTA affinity chromatography), 이온 교환 크로마토그래피(cation-exchange chromatography), 20mM Bis-Tris-propane-HCl (BTP-HCl) pH7.0, 0.2M NaCl, 및 5mM DTT가 포함된 buffer를 이용한 투석 등을 통하여 Mus81-Eme1 단백질을 분리 및 정제하였다.
Protein expression was confirmed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Escherichia coli was shake-cultured for a certain period of time so that the protein was sufficiently expressed, and the culture solution was centrifuged to precipitate E. coli cells, and E. coli was dissolved in an appropriate buffer solution. The E. coli was disrupted and centrifuged to separate the supernatant from the protein solution, followed by nickel affinity chromatography (Ni 2 + -NTA affinity chromatography), ion exchange chromatography (20 mM Bis-Tris-propane The protein was isolated and purified by dialysis with a buffer containing HCl (BTP-HCl) pH 7.0, 0.2 M NaCl, and 5 mM DTT.
1-2. 기질 1-2. temperament DNADNA
본 발명의 실시예에서 사용한 기질 DNA(PAGE-purified DNA)은 Bioneer Co. (Daejeon, Korea)에서 구입하였다. 결정화(crystallization) 단계를 위해, 구입한 DNA는 추가로 정제한 후 annealing 과정을 수행하였다. 하기 실시예 2의 첫 번째 결정화 구조(crystal Ⅰ)과 두 번째 결정화 구조(crystal Ⅱ) 및 세 번째 결정화 구조(crystal Ⅲ)의 서열은 하기 표 1에 나타내었다. The substrate DNA (PAGE-purified DNA) used in the examples of the present invention was obtained from Bioneer Co. (Daejeon, Korea). For the crystallization step, the purchased DNA was further purified and then annealed. The sequences of the first crystallization structure (crystal I), the second crystallization structure (crystal II) and the third crystallization structure (crystal III) in Example 2 are shown in Table 1 below.
하기 실시예 4 내지 6의 nuclease assay F60의 nHJ(nicked Holliday Junction) DNA 기질 또한 하기 표 1에 나타내었다. 5’-말단에 32P가 표지된 DNA(5’-32P-labeled DNA)는 Poly nucleotide kinase(Roche Applied Science, Rockford, IL, USA),γ-32P-dATP(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)와 함께 준비하였다. DNA 기질들의 annealing은 150 mM NaCl, 15mM sodium citrate buffer가 포함된 buffer하에 95℃에서 5분 동안 끓인 후 식히는 과정으로 수행되었다. 3’flap DNA 기질은 5’-32P-labeled R60, nHJL, and nHJS을 annealing함으로써 얻었다. The nHJ (nicked Holliday Junction) DNA substrates of the nuclease assay F60 of Examples 4 to 6 below are also shown in Table 1 below. With a 32 P labeled the 5'-end DNA (5'- 32 P-labeled DNA ) has Poly nucleotide kinase (Roche Applied Science, Rockford, IL, USA), γ- 32 P-dATP (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). Annealing of the DNA substrates was performed by boiling for 5 minutes at 95 ° C in a buffer containing 150 mM NaCl and 15 mM sodium citrate buffer. The 3'flap DNA substrate was obtained by annealing 5'- 32 P-labeled R60, nHJL, and nHJS.
[표 1][Table 1]
1-3. 기질 결합 및 결합 단백질 결정화(1-3. Substrate Bonding and Binding Protein Crystallization CrystallizationCrystallization ))
상기 실시예 1-1에서 발현 및 정제한 Mus81(246-551)-Eme1(178-570)단백과 DNA기질을 결합시키기 위해 정제된 단백질(Mus81-Eme1)과 단백질의 1-3배의 중량비의 DNA를 1~5℃에서 1시간 동안 수용액 상태에서 혼합하였다. 상기 과정에 의해 DNA와 Mus81-Eme1 복합체가 형성되었으며, 상기 결합은 비 공유결합으로써 바람직하게는 수소결합이다.The protein (Mus81-Eme1) purified to bind the protein with the Mus81 (246-551) -Eme1 (178-570) protein expressed and purified in Example 1-1 and the protein at a weight ratio of 1-3 The DNA was mixed at 1 to 5 ° C for 1 hour in an aqueous solution. By this process, DNA and Mus81-Eme1 complex were formed, and the bond is a non-covalent bond, preferably a hydrogen bond.
상기 Mus81-Eme1-DNA 복합체를 결정화하기 위해 4℃에서 행잉 드롭 증기 평형법(hanging drop vapor diffusion method)을 수행하였다. 단백질 용액을 보존용액과 섞은 시료를 보존용액과 증기 평형 상태를 이루도록 용기 상단에 부착시켰다. 용기 내에서 시료는 보존용액보다 그 함량이 낮아 증기 평형 상태를 이루기 위해서 시료 내 수분이 낮아지고 평형 상태에 도달하면서 단백질 결정이 생기게 된다. 단백질 결정화를 위해 사용하는 보존용액에 첨가되는 침전제는 기질 종류에 따라 달라질 수 있으며, 에탄올 (ethanol), 메틸펜탄디올 (methyl pentanediol), 부탄디올(butanediol) 일 수 있다. 전체 보존용액 내에서의 침전제의 농도는 사용되는 침전제의 종류에 따라서 달라지는데, 상기 에탄올은 전체 보존용액에 대하여 1~10%(v/v)일 수 있고 메틸펜탄디올과 부탄디올은 10~30%(v/v)일 수 있다. 보존용액은 상기 침전제 외에도 통상적으로 사용 가능한 염, 완충액 및 세정제 등을 포함할 수 있다. 상기 단백질 결정화 조건에서 pH 또한 기질 종류에 따라 달라질 수 있으며 pH 5.0~7.0에서 수행될 수 있다. 본 실시예에서는 17-bp 5’flap DNA 기질이 결합된 첫 번째 결정화 구조(crystal Ⅰ)는 5% ethanol, 0.1 M Tris-HCl, pH 7.0, 및 5mM DTT가 포함된 결정화 buffer를 사용하였고, 32-bp 3’flap DNA 기질이 결합된 두 번째 결정화 구조(crystal Ⅱ)는 16% methyl pentanediol(MPD), 0.1M sodium acetate, pH 5.0, 20mM hexamminecobalt chloride, 및 5mM DTT가 포함된 buffer, 24-bp 3’flap DNA 기질이 결합된 세 번째 결정화 구조(crystal Ⅲ)는 13% butanediol, 0.1M sodium acetate, pH 5.0, 및 5 mM DTT buffer를 사용하였다. 단백질 결정을 형성하기 위한 반응은 4℃ 또는 18℃에서 2~10일 동안 수행되었다.
A hanging drop vapor diffusion method was performed at 4 캜 to crystallize the Mus81-Eme1-DNA complex. The protein solution was mixed with the preservative solution and attached to the top of the vessel in equilibrium with the preservative solution. In the container, the content of the sample is lower than that of the preservative solution, so that the water content in the sample is lowered to reach the equilibrium state in order to achieve the steam equilibrium state, and protein crystals are formed. The precipitant to be added to the preservative solution used for protein crystallization may vary depending on the kind of substrate and may be ethanol, methyl pentanediol, butanediol. The concentration of the precipitant in the total preservation solution depends on the type of precipitant used, which may be 1-10% (v / v) for the total preservative solution, 10-30% for methylpentanediol and butanediol v / v). The preservative solution may contain salts, buffers and detergents conventionally usable in addition to the above precipitants. In the protein crystallization condition, the pH may also be varied depending on the kind of the substrate and may be performed at pH 5.0 to 7.0. In this example, the first crystallization structure (crystal I) to which the 17-bp 5'flap DNA substrate was bound was a crystallization buffer containing 5% ethanol, 0.1 M Tris-HCl, pH 7.0 and 5 mM DTT, -bp The second crystallization structure (crystal Ⅱ) with 3'flap DNA substrate bound was a buffer containing 16% methyl pentanediol (MPD), 0.1M sodium acetate, pH 5.0, 20 mM hexamminecobalt chloride, and 5 mM DTT, 24-bp The third crystallization structure (crystal Ⅲ) with 3'flap DNA substrate was 13% butanediol, 0.1M sodium acetate, pH 5.0, and 5 mM DTT buffer. The reaction to form protein crystals was carried out at 4 캜 or 18 캜 for 2 to 10 days.
1-4. 1-4. nucleasenuclease activityactivity assayassay (핵산가수분해효소 활성 분석)(Analysis of nucleic acid hydrolase activity)
반응 buffer(25mM Tris-HCl, pH8.0, 5mM β-mercaptoethanol, 100μg/ml BSA(Sigma-Aldrich, USA), 5% 글리세롤(glycerol), and 10mM MgCl2)에 32P가 표지된 홈이 있는 십자형 접합( 32P-labeled nHJ) DNA와 3’flap DNA 기질이 포함된 절단 반응 용액(cleavage reaction mixture)을 37℃에서 다양한 시간(2-60분) 동안 반응시켰다. 이후 1X stop buffer(0.3% SDS, 5mM EDTA, pH 8.0, and 0.1mg/ml proteinase K(Sigma-Aldrich, USA))를 37℃에서 30분 동안 처리함으로써 반응을 종결시켰다. 반응물은 1× TBE (Tris-borate-EDTA)에서 10% 폴리아크릴아마이드에 녹인 후 13/Vcm에서 90분 동안 분리시켰다. 절단되지 않은 기질들은 MultiGauge version 3.0 (Fujifilm)을 이용하여 phosphorimager 분석을 통하여 정량화하였다.
Reaction buffer (25mM Tris-HCl, pH8.0 , 5mM β-mercaptoethanol, 100μg / ml BSA (Sigma-Aldrich, USA), 5% glycerol (glycerol), and 10mM MgCl 2 ) in which the groove is 32 P labeled A cleavage reaction mixture containing cross-linked ( 32 P-labeled nHJ) DNA and a 3 'flap DNA substrate was reacted at 37 ° C for various times (2-60 minutes). The reaction was then terminated by treatment with 1X stop buffer (0.3% SDS, 5 mM EDTA, pH 8.0, and 0.1 mg / ml proteinase K (Sigma-Aldrich, USA) at 37 ° C for 30 minutes. The reaction was dissolved in 10% polyacrylamide in 1 × TBE (Tris-borate-EDTA) and then separated at 13 / Vcm for 90 minutes. Uncleaved substrates were quantitated by phosphorimager analysis using MultiGauge version 3.0 (Fujifilm).
실시예Example 2. 결정 구조 확인 2. Determination of crystal structure
Mus81-Eme1의 기질 구조에 대한 특이성과 절단 메커니즘에 대한 이해를 돕기 위해 인간 Mus81(ΔN245)-Eme1(ΔN177) 단백질에 3가지 다른 DNA 기질이 결합한 구조를 결정화하여 분석하였다. 상기 N말단이 잘린 Mus81-Eme1 복합체는 잘리지 않은 복합체와 동일한 활성을 가진다. 기질은 비활성 기질인 5’flap DNA와 길이가 다른 활성 기질인 3’flap DNA를 사용하였다. 대표적으로 각각의 기질 즉, 5-nt(nucleotide) 5’flap DNA를 가진 17-bp(base pair) double strand(ds)DNA와 결합된 복합체(crystal Ⅰ)와 3-nt 3’flap을 가진 32-bp dsDNA와 결합한 복합체(crystal Ⅱ), 및 3-nt 3’flap을 가진 24-bp dsDNA와 결합한 복합체(crystal Ⅲ)의 결정구조를 분석하였으며, crystal Ⅰ과 crystal Ⅱ의 결정구조를 도 1에 나타내었다. To aid understanding of the specificity and cleavage mechanism of the substrate structure of Mus81-Eme1, we have crystallized and analyzed the structure of human Mus81 (ΔN245) -Eme1 (ΔN177) protein bound to three different DNA substrates. The N-terminal truncated Mus81-Eme1 complex has the same activity as the non-truncated complex. The substrate used was 5'flap DNA, an inactive substrate, and 3'flap DNA, an active substrate with a different length. Representatively, a complex (crystal Ⅰ) coupled with a 17-bp (base pair) double strand (ds) DNA with 5-nt (nucleotide) 5'flap DNA and a complex with 3-nt 3'flap The crystal structure of the complex (crystal Ⅱ) bound to -bp dsDNA and the complex (crystal Ⅲ) bound to 24-bp dsDNA having 3-nt 3'flap was analyzed and the crystal structure of crystal Ⅰ and crystal Ⅱ was shown in Fig. Respectively.
Crystal I은 결정의 분해능 한계 2.8Å, 결정공간군 P212121, 격자 단위 a=85.0Å, b=226.5Å, c=52.5Å 및 α=β=γ=90°, Rworking (%) 22.1, 및 Rfree (%) 24.1의 X-선 결정구조를 갖는 것으로 분석되었다. crystal Ⅱ는 결정의 분해능 한계 6.5Å, 결정공간군 C2, 격자 단위 a=221.8Å, b=135.3Å, c=102.9Å 및 α=γ=90°, β= 113.3°, Rworking (%) 25.5, 및 Rfree (%) 30.0의 X-선 결정 구조를 나타내었으며, Crystal Ⅲ는 결정의 분해능 한계 6.0Å, 결정공간군 C2221, 격자 단위 a=92.4Å, b=250.8Å, c=430.2Å 및 α=β=γ=90°, Rworking (%) 27.3, 및 Rfree (%) 32.4의 X-선 결정구조를 갖는 것을 확인하였다. Crystal I has a resolution limit of 2.8 Å, crystal space group P2 1 2 1 2 1 , lattice unit a = 85.0 Å, b = 226.5 Å, c = 52.5 Å and α = β = γ = 90 °, Rworking (%) 22.1, and Rfree (%) 24.1. crystal Ⅱ has a crystal resolution limit of 6.5 Å and crystal space group C2 and lattice units a = 221.8 Å, b = 135.3 Å, c = 102.9 Å and α = γ = 90 °, β = 113.3 °, Rworking (%) 25.5, And Rfree (%) 30.0. Crystal III showed crystal resolution limit of 6.0 Å, crystal space group C222 1 , lattice unit a = 92.4 Å, b = 250.8 Å, c = 430.2 Å, and α = β = γ = 90 °, Rworking (%) 27.3, and Rfree (%) 32.4.
또한, 도 1A 내지 도 1B에 나타낸 바와 같이, Mus81-Eme1의 구조는 크게 Mus81의 nuclease 도메인과 Eme1의 nuclease-like 도메인이 이루는 nuclease 도메인, Mus81의 HhH2 도메인과 Eme1의 HhH2 도메인이 이루는 2HhH2 도메인으로 나누어져 있다. 3' flap DNA가 결합한 구조(crystal Ⅱ)를 기준으로 기질 DNA 또한 Mus81의 nuclease 도메인(왼쪽 위 파랑)과 Eme1의 HhH2 도메인(왼쪽 아래 핑크) 사이에 위치한 pre-nick DNA와 Eme1의 nuclease-like 도메인(오른쪽 위 핑크)과 Mus81의 HhH2 도메인(오른쪽 아래 파랑) 사이에 위치한 post-nick DNA로 나뉠 수 있으며 5' flap DNA는 post-nick DNA 부분에 해당한다. As shown in Figs. 1A and 1B, the structure of Mus81-Eme1 is divided into the nuclease domain consisting of the nuclease domain of Mus81 and the nuclease-like domain of Eme1, and the 2HhH2 domain composed of the HhH2 domain of Mus81 and the HhH2 domain of Eme1 It is. Based on the structure of the 3 'flap DNA (crystal Ⅱ), the substrate DNA also contains pre-nick DNA located between the nuclease domain of Mus81 (upper left blue) and the HhH2 domain of Eme1 (lower left pink) and the nuclease-like domain of Eme1 (DNA in the upper right) and post-nick DNA located between the Mus81's HhH2 domain (lower right) and the 5 'flap DNA corresponds to the post-nick DNA portion.
도 1B에 나타낸 바와 같이, crystal Ⅱ의 구조에서 Pre-nick DNA와 post-nick DNA는 약 100° 정도 구부러져 있으며 그 사이는 4개의 뉴클레오타이드로 이뤄진 한 가닥 DNA로 연결되어 있고 두 DNA 부분은 Mus81의 소수성 쐐기 모양의 helix-turn-helix (HTH, α2-α3)와 loop β6-α4에 의해 분리되는 것을 관찰할 수 있다. 상기 쐐기의 오른쪽에는 Mus81의 nuclease 도메인과 Eme1의 연결자 (α7)로 이뤄진 5'-말단 포켓이 있고 왼쪽에는 Mus81의 α1, α2, loop β3-β4로 이뤄진 단백질의 활성부위가 위치하고 있는 것을 확인하였다.
As shown in FIG. 1B, in the structure of crystal II, the pre-nick DNA and the post-nick DNA are bent by about 100 °, and there is connected with one strand DNA consisting of four nucleotides. It is observed that the wedge-shaped helix-turn-helix (HTH, α2-α3) and loop β6-α4 are separated. On the right side of the wedge, there is a 5'-terminal pocket made up of the nuclease domain of Mus81 and a linker (E7) of Eme1. On the left side, the active site of the protein consisting of α1, α2 and loop β3-β4 of Mus81 is located.
실시예Example 3. 기질에 의한 3. Substrate-mediated Mus81Mus81 -- Eme1Eme1 의 구조적 변화 분석 Analysis of structural change
기존에 DNA 기질이 결합하지 않은 zfMus81-Eme1구조가 본 실시예의 인간 hMus81-Eme1보다 고해상도로 검증되었지만 두 복합체의 구조가 매우 유사하므로 인간의 DNA가 결합한 경우, 결합하지 않은 경우의 결정 구조를 분석하고자 하였다. Although the zfMus81-Eme1 structure without the DNA substrate binding has been verified at a higher resolution than the human hMus81-Eme1 of the present embodiment, the structure of the two complexes is very similar. Therefore, when human DNA is bound, Respectively.
그 결과, 도 2A 내지 도 2B에 나타낸 바와 같이, 기질이 없는 구조와 비교하였을 때, 기질이 붙은 구조(crystal Ⅰ)인 도 2B 및 확대된 도 2D에서 Mus81의 연결자(464-470)가 직선으로 뻗고 Eme1의 연결자(445-472)가 이전에 없던 나선형 구조 (α7)를 이루면서 nuclease 도메인과 2HhH2 도메인이 멀어지고 2HhH2 도메인이 nuclease 도메인에 대해 40° 회전하여 전체적으로 열린 구조를 형성함을 관찰하였다. 특히, Eme1의 연결자(445-472)가 나선형 구조 (α7)을 이루는데 그 중에서 K441, K449는 기질의 5'-말단과 상호작용하기 때문에 이 상호작용이 구조적 변화를 일으키는 시발점이라 생각되며 Mus81-Eme1의 기질 특이성을 설명한다. 또한 이러한 구조적 변화로 Mus81의 소수성 쐐기 모양의 HTH가 드러나고 5'-말단 포켓이 형성됨을 확인하였다. 상기의 구조적 변화가 5' flap DNA 기질이 붙은 구조에서도 동일하게 관찰되므로 이로부터 기질의 post-nick 부분이 먼저 단백질에 결합함을 할 수 있다.
As a result, as shown in FIGS. 2A and 2B, when the substrate (crystal I) in FIG. 2B and the enlarged view of FIG. 2D are shown in FIG. 2D, the connectors 464-470 of the Mus 81 are arranged in a straight line And that the 2HhH2 domain rotates 40 ° to the nuclease domain to form a totally open structure, as the linkers 445-472 of Eme1 form an unprecedented helical structure ([alpha] 7). In particular, the linkers (445-472) of Eme1 form a helical structure (α7), of which K441 and K449 interact with the 5'-end of the substrate, which is thought to be the starting point for this structural change. The substrate specificity of Eme1 is described. This structural change also revealed that the hydrophobic wedge shaped HTH of Mus81 was revealed and 5'-terminal pockets were formed. The above structural changes are also observed in the structure with the 5 'flap DNA substrate, so that the post-nick portion of the substrate can bind to the protein first.
실시예Example 4. 4. Mus81Mus81 -- Eme1Eme1 와 Wow postpost -- nicknick DNADNA 결합부위 확인 Confirm binding site
4-1. 4-1. MHhH2MHhH2 와 Wow DNADNA 의 of minorminor groovegroove 와의 결합Combination with
도 1A, 도 2B 및 도 2D에서 관찰한 바와 같이, crystal Ⅰ의 구조에서처럼 post-nick DNA의 결합은 Mus81-Eme1에서 구조적 변화를 유도하였으므로, 이는 기질의 post-nick 부분이 먼저 nuclease 도메인과 상호작용할 수 있음을 보여준다.As observed in Figures 1A, 2B, and 2D, binding of post-nick DNA induced structural changes in Mus81-Eme1, as in the crystal I structure, so that the post-nick portion of the substrate first interacts with the nuclease domain .
Mus81-Eme1과 post-nick DNA 사이의 결합은 크게 두 부분으로 설명될 수 있는데, 첫 번째는 도 3B에 나타낸 바와 같이, Eme1의 helix α1과 MHhH2의 연결자(α7-α8) 및 연결자(β10-β11)에 의해 DNA의 minor groove와 post-nick DNA의 중앙부 근처에 결합하는 것이다. Mus81의 R483, S486, K489와 Eme1의 K241, R244 아미노산 잔기가 post-nick DNA의 minor groove에 결합하며 특히 Mus81의 R530은 DNA 이중가닥 사이를 깊게 파고 들어가 있다. 상기 MHhH2와 minor groove사이 결합의 중요성을 알아보기 위해 상기 나열된 아미노산 중 R530, R483, K489를 알라닌으로 치환하였다. 그 결과 도 3C 내지 도 3D에 나타낸 바와 같이, MHhH2상의 R530A and R483A/K489A/R530A 변이의 경우, 8분의 반응 후에 cleaved nHJ 기질의 양이 정상 대조군(WT)과 비교하여 각각 50%와 5%로 nicked HJ에 대한 nuclease 활성이 감소하였다. 3’flap DNA 기질의 경우에는 도 4C 및 도 4D에 나타낸 바와 같이, DNA 절단이 정상 대조군에 비교하여 각각 16%와 5%로 nuclease 활성이 감소함을 확인하였다. 따라서 MHhH2의 상기 잔기들이 DNA 기질을 인식하고 절단하는데 매우 중요함을 확인하였다.
The binding between Mus81-Eme1 and post-nick DNA can be largely explained in two parts. First, as shown in FIG. 3B, the helix α1 and MHhH2 linkers (α7-α8) of Eme1 and the linkers (β10- ) To bind near the center of the DNA and the minor groove of the post-nick DNA. The amino acid residues of R483, S486 and K489 of Mus81 and K241 and R244 of Eme1 bind to the minor groove of post-nick DNA, and particularly Mus81's R530 penetrates deeply between DNA double strands. In order to investigate the importance of binding between MHhH2 and the minor groove, R530, R483 and K489 among the amino acids listed above were substituted with alanine. As a result, as shown in Figs. 3C to 3D, in the case of the R530A and R483A / K489A / R530A mutations on MHhH2, the amount of cleaved nHJ substrate after 8 minutes of reaction was 50% and 5% The activity of nuclease against nicked HJ was decreased. In the case of the 3'flap DNA substrate, as shown in FIGS. 4C and 4D, the DNA cleavage was reduced to 16% and 5%, respectively, as compared with the normal control, and nuclease activity was decreased. Therefore, it was confirmed that the above-mentioned residues of MHhH2 are very important for recognizing and cleaving the DNA substrate.
4-2. 5'-말단 포켓과 기질 사이의 결합4-2. The bond between the 5'-terminal pocket and the substrate
두 번째는 5'-말단 포켓에서 일어나는 결합으로서, 도 3A와 도 4A에 나타낸 것처럼 5' flap DNA의 5' 말단 마지막 뉴클레오티드인 “G1”다음의 두 개의 뉴클레오티드는 5'-말단 포켓에 들어맞게 결합되어 있고, 그들 중 “A3”은 쌍을 이루고 있지 않았다. 상기 포켓에서 아데닌(Ade2) 염기의 인산기 산소원자는 Mus81의 R350과 Eme1의 K449와 결합하고, 아데닌(Ade2) 염기와 당은 Eme1의 helix α1과 Mus81에서 helix α4 및 연결자 α4-β7 (I344, I345, T383, A387)에 둘러싸여 있음을 도 3A에서 확인하였다. The second is a linkage occurring in the 5'-terminal pocket. As shown in FIGS. 3A and 4A, the two nucleotides following the "G1", which is the last nucleotide at the 5 'end of the 5' flap DNA, And "A3" among them were not paired. In this pocket, the phosphate oxygen atom of the adenine base binds to R350 of Mus81 and K449 of Eme1, and adenine (Ade2) base and sugar bind helix α1 of Eme1 and helix α4 and connective α4-β7 (I344, I345 , T383, A387) in Fig. 3A.
도 3A 및 도 4A를 통해 상기 포켓에 5’flap DNA의 long 5’flap이 아닌 3’flap DNA의 5’nicked end만 결합할 수 있기 때문에 5'-말단 포켓에서의 결합이 복합체의 기질 특이성에 매우 중요할 것으로 생각하여 이를 확인하기 위해 두 개의 변이 단백질을 만들었다. 5'-말단 포켓의 부피가 큰 아미노산 잔기들이 포켓을 막아 nuclease 활성에 부정적인 영향을 미칠 것으로 판단하여 T383과 A387을 아르기닌으로 치환하였다. 3A and 4A, only the 5'-nicked end of the 3'flap DNA, not the 5'flap of 5'flap DNA, can bind to the pocket, so that the binding at the 5'-terminal pocket is dependent on the substrate specificity of the complex I thought it was very important and made two mutated proteins to confirm this. T383 and A387 were replaced with arginine because the bulky amino acid residues in the 5'-terminal pocket blocked the pockets and were thought to have a negative effect on nuclease activity.
그 결과, 도 3C, 3D 및 도 4C, 4D에 나타낸 바와 같이, 아미노산이 치환된 T383R/A387R의 5'-말단 포켓은 정상대조군과 비교하여 nHJ와 3’flap DNA 기질을 각각 10%와 0.5%만큼 절단하였다. 또한 Mus81의 I344와 I345를 각각 알라닌으로 치환 한 경우 즉, I344A/I345A 경우에는 nHJ와 3’flap DNA를 각각 33%, 14% 절단하였다. 상기 결과들을 통해 아미노산 치환에 의한 분석은 돌연변이에 의한 효과가 DNA 결합에 의한 것인지 촉매의 화학적 단계의 차이에 의한 것인지 구별할 수 없었다. 그러나 Mus81-Eme1와 관련된 초과량의 기질 DNA를 사용함으로써 DNA-결합 친화력이 상기 돌연변이에 의한 효과에 중요하게 작용함을 알 수 있었다. 따라서 이러한 결과들을 통해 기질 인식과 nuclease 활성에서 5'-말단 포켓과 그 쐐기의 중요성을 확인하였다.
As a result, as shown in FIGS. 3C, 3D and 4C and 4D, the 5'-terminal pockets of amino acid-substituted T383R / A387R showed 10% and 0.5% of nHJ and 3'flap DNA substrates, respectively, . In the case of replacing I344 and I345 of Mus81 with alanine, respectively, in the case of I344A / I345A, nHJ and 3'flap DNA were cleaved 33% and 14%, respectively. From the above results, it was not possible to discriminate whether the mutagenic effect was due to the DNA binding or the chemical step of the catalyst. However, by using excess amounts of substrate DNA associated with Mus81-Eme1, it was found that the DNA-binding affinity plays an important role in the mutagenic effect. These results therefore confirmed the importance of 5'-terminal pockets and their wedges in substrate recognition and nuclease activity.
실시예Example 5. 5. Mus81Mus81 -- Eme1Eme1 와 Wow prepre -- nicknick DNADNA 결합부위 확인 Confirm binding site
Mus81-Eme1와 pre-nick DNA의 결합은 도 1B와 도 4B를 통해 Eme1 HhH2 도메인(EHhH2)이 pre-nick DNA와 결합함을 확인하였다. EHhH2의 연결자 α9-α10과 α12-α13은 pre-nick DNA의 minor groove와 상호작용하며, R491(α9-α10)와 R534(α12-α13)는 pre-nick DNA를 인식하는데 관여한다. 상기 결합의 중요성을 확인하기 위해 아미노산 치환을 통한 분석을 수행하였다. The binding of Mus81-Eme1 to pre-nick DNA was confirmed by binding of Eme1 HhH2 domain (EHhH2) to pre-nick DNA through FIG. 1B and FIG. 4B. The linkers α9-α10 and α12-α13 of EHhH2 interact with the minor groove of pre-nick DNA, and R491 (α9-α10) and R534 (α12-α13) are involved in recognition of pre-nick DNA. Analysis via amino acid substitution was performed to confirm the significance of the binding.
그 결과, 도 3C, 3D 및 도 4C, 4D에 나타낸 바와 같이, EHhH2 도메인의 R534와 T541를 각각 글루탐산과 티로신으로 돌연변이 시킨 R534E/T541Y의 경우 nHJ 기질과 3’flap DNA 기질을 대략 25%의 효율로 절단하였다. 반면에 R491과 S493을 각각 글루탐산과 트립토판으로 돌연변이 시킨 R491E/S493W의 경우 정상대조군과 비교하여 nHJ 기질을 약 4% 절단한 것으로 나타났다. 반대쪽으로는, 도 4B를 통해 Mus81 nuclease domain이 helix α3, loops β3-β4, α6-α7, 및 β2-α1을 통해 DNA의 minor groove와 결합하는 것으로 관찰되었다.
As a result, as shown in Figs. 3C, 3D and Figs. 4C and 4D, in the case of R534E / T541Y in which R534 and T541 of the EHhH2 domain were mutated to glutamic acid and tyrosine, respectively, the nHJ substrate and the 3'flap DNA substrate were approximately 25% . On the other hand, R491E / S493W, which mutated R491 and S493 into glutamic acid and tryptophan, respectively, showed about 4% cleavage of the nHJ substrate compared to the normal control. On the other hand, through the FIG. 4B, it was observed that the Mus81 nuclease domain binds to the minor groove of DNA through helix α3, loops β3-β4, α6-α7, and β2-α1.
실시예Example 6. 활성화 부위( 6. Activated site ( activeactive sitesite )의 분석) Analysis
DXnERKX3D 아미노산 서열은 MUS/XPF family 단백질들 사이에서 활성부위의 signature 모티프라고 보고된 바 있으며, 이전 연구에서는 Mus81에서 D307, E333, R334이 DXnER에 해당되며 이 아미노산 잔기들이 Mg2 + 이온과 결합한다고 제시하였다. 따라서 본 실시예에서는 Mus81 내의 활성화부위를 확인하기 위해 Mus81-Eme1-DNA 복합체를 1mM MgCl2를 포함하는 buffer에 담굼으로써 Mus81-Eme1-DNA (5’flap) 결정에 Mg2 + 이온을 넣어주어 Mg2 + 이온이 활성부위에 결합할 수 있도록 하였다. DX n ERKX 3 D amino acid sequence is reported that signature motif in the active site between the MUS / XPF family protein bars, previous study in Mus81 D307, E333, and R334 corresponding to DXnER the amino acid residues are Mg 2 + ions . Therefore, to confirm the active site in Mus81, the Mus81-Eme1-DNA complex was immersed in a buffer containing 1 mM MgCl 2 to add Mg 2 + ions to the Mus81-Eme1-DNA (5 'flap) 2 + ion can bind to the active site.
그 결과, 도 5A에 나타낸 바와 같이, Mg2 + 이온이 D274, E277, D307 아미노산의 carboxyl group과 결합하는 것을 확인하였다. 더욱이 D274, E277, D307을 각각 알라닌으로 치환한 경우에는 nicked HJ 기질에 대한 Mus81-Eme1의 nuclease 활성이 사라지는 것을 확인하였으며, 결과를 도 5B에 나타내었다. As a result, as shown in Figure 5A, Mg + 2 ions was confirmed that the combination and D274, E277, D307 carboxyl group of the amino acid. Furthermore, when D274, E277, and D307 were replaced with alanine, respectively, the nuclease activity of Mus81-Eme1 on the nicked HJ substrate disappeared, and the results are shown in FIG. 5B.
반면, 5' flap DNA는 Mus81-Eme1의 적절한 기질이 아니기 때문에 두 번째 Mg2+ 이온은 확인하지 못하였지만 D307, E333 부근에 위치할 것이라 예상된다. 또한 이 구조를 3' flap DNA가 결합한 구조와 비교하였을 때, 도 5C에 나타낸 바와 같이, DNA의 뼈대가 Mg2 +과 4Å 떨어져 있어 이 부분이 단백질의 활성부위임을 확인하였다.
On the other hand, since the 5 'flap DNA is not a suitable substrate for Mus81-Eme1, the second Mg 2+ ion is not identified but is expected to be located near D307 and E333. When this structure was compared with the structure in which 3 'flap DNA was combined, as shown in FIG. 5C, it was confirmed that the skeleton of the DNA was 4 Å apart from Mg 2 +, and this portion was the active site of the protein.
실시예Example 7. 7. Mus81Mus81 -- Eme1Eme1 과 5’And 5 ' flapflap nucleasenuclease 의 공통적인 구조적 특징 분석Common structural features of
인간의 Mus81은 낮은 아미노산 서열 유사성에도 불구하고 FEN1, Exo1과 같은 5’flap을 기질로 하는 핵산 가수분해효소(nuclease)와 상당히 공통적인 특징을 가진다고 알려져 있다. 도 6A를 통해 Mus81 단백질의 중심에 helix로 둘러싸인 여섯 개의 sheet는 FEN1과 Exo1에서도 관찰됨을 알 수 있다. 또한 도 6A 내지 도 6B에 나타낸 바와 같이, Mus81은 FEN1, Exo1과 같은 5' 핵산 가수분해 효소와 기질 인식, DNA 구부러짐, 단백질의 구조적 변화와 같은 특징을 공유하는 것을 관찰하였다. Mus81의 소수성 쐐기는 5' 핵산 가수분해 효소의 쐐기와 일치하고 Mus81-Eme1의 5'-말단 포켓은 5' 핵산 가수분해 효소의 3' flap 결합 부위와 비슷함을 알 수 있다. 이러한 두드러지는 유사성은 5' 핵산 가수분해 효소의 구조적 보존이 Mus81-Eme1에도 적용될 수 있음을 보여준다. 상기 결과를 통해 Mus81-Eme1이 5’말단에 홈이 있는 3’flap DNA 기질을 선호하는 이유를 알 수 있었다.
Human Mus81 is known to have a very common feature with nucleic acid hydrolase (nuclease) based on 5 'flap, such as FEN1, Exo1, despite low amino acid sequence similarity. 6A, six sheets surrounded by helix at the center of the Mus 81 protein are also observed in FEN1 and Exo1. As shown in FIGS. 6A and 6B, Mus81 also shares features such as substrate recognition, DNA bending, and structural changes of proteins with 5 'nucleic acid hydrolases such as FEN1 and Exo1. The hydrophobic wedge of Mus81 coincides with the wedge of 5 'nucleic acid hydrolase and the 5'-terminal pocket of Mus81-Eme1 is similar to the 3' flap binding site of 5 'nucleic acid hydrolase. These prominent similarities show that the structural conservation of 5 'nucleic acid hydrolases can also be applied to Mus81-Eme1. These results suggest that Mus81-Eme1 prefers a 3'flap DNA substrate with a groove at the 5 'end.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the present invention without departing from the spirit or scope of the invention. There will be. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive.
Claims (16)
상기 Mus81-Eme1는 인간 유래 단백질이며 상기 DNA 기질은 플랩(flap) DNA인 것을 특징으로 하는, Mus81-Eme1-DNA 복합체 구조결정.
It has a three-dimensional crystal structure in which Mus81 (Methyl methane sulphonate and UV Sensitive 81) -Eme1 (Essential meiotic endonuclease 1) complex binds to DNA substrate,
Wherein the Mus81-Eme1 is a human-derived protein and the DNA substrate is a flap DNA.
상기 Mus81-Eme1-DNA 복합체는 하기와 같은 X-선 결정구조를 가지는 것을 특징으로 하는, 복합체 구조결정:
결정의 분해능 한계: 6.5Å,
결정공간군: C2,
격자 단위: a=221.8Å, b=135.3Å, c=102.9Å, 및 α=γ=90°, β= 113.3°
Rworking (%): 25.5
Rfree (%): 30.0
The method according to claim 1,
The Mus81-Eme1-DNA complex has the following X-ray crystal structure:
Resolution limit of crystal: 6.5 A,
Crystal space group: C2,
Lattice units: a = 221.8 占 b = 135.3 占 c = 102.9 占 and? =? = 90 占 and? = 113.3
Rworking (%): 25.5
Rfree (%): 30.0
상기 Mus81-Eme1-DNA 복합체는 하기와 같은 X-선 결정구조를 가지는 것을 특징으로 하는, 복합체 구조결정:
결정의 분해능 한계: 6.0 Å,
결정공간군: C2221,
격자 단위: a=92.4Å, b=250.8Å, c=430.2Å, 및 α=β=γ=90°
Rworking (%): 27.3
Rfree (%): 32.4
The method according to claim 1,
The Mus81-Eme1-DNA complex has the following X-ray crystal structure:
Resolution limit of crystal: 6.0 A,
Crystalline space group: C222 1 ,
Lattice unit: a = 92.4 A, b = 250.8 A, c = 430.2 A, and? =? =? = 90
Rworking (%): 27.3
Rfree (%): 32.4
상기 Mus81-Eme1-DNA 복합체는 기질 DNA와 결합에 의해 Mus81과 Eme1의 HhH2 도메인(helix-hairpin-helix2 domain)이 핵산가수분해효소 도메인(nuclease domain)에 대해 회전하면서 열린 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는, Mus81-Eme1-DNA 복합체 구조결정.
The method according to claim 1,
The Mus81-Eme1-DNA complex is characterized in that the HhH2 domain (helix-hairpin-helix2 domain) of Mus81 and Eme1 binds to the substrate DNA and forms an open structure by rotating against the nucleic acid hydrolase domain (nuclease domain) Determination of the Mus81-Eme1-DNA complex structure.
상기 Mus81-Eme1-DNA 복합체는 Mus81의 핵산가수분해효소 도메인(nuclease domain)과 Eme1의 HhH2 도메인(helix-hairpin-helix2 domain) 사이에 위치한 pre-nick DNA, Eme1의 핵산가수분해효소 유사 도메인(nuclease-like domain)과 Mus81의 HhH2 도메인(helix-hairpin-helix2 domain) 사이에 위치한 post-nick DNA, 5’-말단 포켓, 및 활성부위(active site)를 포함하는 것을 특징으로 하는, Mus81-Eme1-DNA 복합체 구조결정.
The method according to claim 1,
The Mus81-Eme1-DNA complex comprises a pre-nick DNA located between the nuclease domain of Mus81 and the HhH2 domain (helix-hairpin-helix2 domain) of Eme1, the nucleotide sequence of the nuclease of Eme1 Eme1-Eme1-Eme1- < / RTI > domain, which comprises post-nick DNA, 5'-terminal pockets, and an active site located between the Hindlll-like domain and the HhH2 domain (helix-hairpin- Determination of DNA complex structure.
상기 Mus81-Eme1-DNA 복합체는 Mus81의 소수성 쐐기(wedge)가 pre-nick DNA와 post nick DNA를 분리하는 것을 특징으로 하는, Mus81-Eme1-DNA 복합체 구조결정.
The method according to claim 1,
The Mus81-Eme1-DNA complex is characterized in that the hydrophobic wedge of Mus81 separates pre-nick DNA and post nick DNA.
상기 Mus81-Eme1-DNA 복합체는 5’-말단 포켓이 post-nick DNA의 5’nick 말단을 특이적으로 인식하는 것을 특징으로 하는, Mus81-Eme1-DNA 복합체 구조결정.
The method according to claim 1,
The Mus81-Eme1-DNA complex is characterized in that the 5'-terminal pocket specifically recognizes the 5'nick end of the post-nick DNA.
상기 Mus81-Eme1-DNA 복합체는 post-nick DNA의 마이너 그루브(minor groove)가 Mus81의 R483, S486, 및 K489와 Eme1의 K241, 및 R244와 결합하며 Mus81의 R530은 DNA 이중가닥 사이의 깊이 위치하는 것을 특징으로 하는, Mus81-Eme1-DNA 복합체 구조결정.
The method according to claim 1,
In the Mus81-Eme1-DNA complex, a minor groove of post-nick DNA binds to R483, S486, and K489 of Mus81 and K241 and R244 of Eme1, and R530 of Mus81 is located deep between DNA double strands ≪ RTI ID = 0.0 > Mus81-Eme1-DNA < / RTI > complex structure.
상기 Mus81-Eme1-DNA 복합체는 post-nick DNA가 Mus81-Eme1 복합체의 5’-말단 포켓 내 R350, 및 N390과 Eme1의 K441, 및 K449와 결합하며 Mus81의 I344, I345, T383, 및 A387에 둘러싸여 있는 것을 특징으로 하는, Mus81-Eme1-DNA 복합체 구조결정.
The method according to claim 1,
The Mus81-Eme1-DNA complex is characterized in that the post-nick DNA binds R350 in the 5'-terminal pocket of the Mus81-Eme1 complex and K441 and K449 of Nme90 and Eme1 and is surrounded by I344, I345, T383, and A387 of Mus81 ≪ RTI ID = 0.0 > Mus81-Eme1-DNA < / RTI > complex structure.
상기 Mus81-Eme1-DNA 복합체는 pre-nick DNA의 마이너 그루브(minor groove)가 Mus81의 R348, R355, K302, 및 K465와 Eme1의 R491, S493, R534, 및 T541와 결합하는 것을 특징으로 하는, Mus81-Eme1-DNA 복합체 구조결정.
The method according to claim 1,
The Mus81-Eme1-DNA complex is characterized in that the minor groove of the pre-nick DNA binds to R348, R355, K302 and K465 of Mus81 and R491, S493, R534 and T541 of Eme1. -Eme1-DNA complex structure determination.
상기 활성부위는 D274, E277, 및 D307인 것을 특징으로 하는, Mus81-Eme1-DNA 복합체 구조결정.
6. The method of claim 5,
Wherein the active sites are D274, E277, and D307.
a) 인간 유래의 Mus81 및 Eme1 단백질을 발현, 정제하여 Mus81-Eme1 단백질 복합체를 형성하는 단계;
b) 상기 Mus81-Eme1 단백질 복합체에 기질 DNA를 혼합하여 결합시키는 단계; 및
c) 상기 결합된 Mus81-Eme1-DNA 복합체를 행잉 드롭 증기 평형법(hanging drop vapor diffusion method)을 이용하여 결정화하는 단계.
A method for producing a crystal of a three-dimensional structure of Mus81-Eme1-DNA, comprising the steps of:
a) expressing and purifying Mus81 and Eme1 proteins derived from human to form a Mus81-Eme1 protein complex;
b) mixing and binding the substrate DNA to the Mus81-Eme1 protein complex; And
c) crystallizing the bound Mus81-Eme1-DNA complex using a hanging drop vapor diffusion method.
상기 a) 단계의 정제는 니켈 친화성 크로마토그래피(Ni2 +-NTA affinity chromatography), 이온 교환 크로마토그래피(cation-exchange chromatography), 및 투석 방법을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
13. The method of claim 12,
Characterized in that the purification of step a) is carried out by means of nickel affinity chromatography (Ni 2 + -NTA affinity chromatography), cation-exchange chromatography, and dialysis.
상기 b) 단계에서 Mus81-Eme1 단백질 복합체와 DNA 기질의 혼합비율은 1:1 내지 1:3의 중량비인 것을 특징으로 하는, 방법.
13. The method of claim 12,
Wherein the mixing ratio of the Mus81-Eme1 protein complex to the DNA substrate in the step b) is 1: 1 to 1: 3.
상기 c) 단계의 결정화는 4 내지 18℃에서 2 내지 10일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
13. The method of claim 12,
Wherein the crystallization in step c) is carried out at 4 to 18 캜 for 2 to 10 days.
A method for screening a substance that inhibits the activity of nucleic acid internal hydrolase of the Mus81-Eme1 complex using the three-dimensional crystal structure of Mus81-Eme1-DNA of claim 1.
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| KR1020150008537A KR101806601B1 (en) | 2015-01-19 | 2015-01-19 | Crystal structure of human Mus81-Eme1-DNA complex and preparing method thereof |
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO2021241965A1 (en) * | 2020-05-25 | 2021-12-02 | 주식회사 에즈큐리스 | Novel fusion protein for crystallizing il-33, and crystallizing method using same |
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2015
- 2015-01-19 KR KR1020150008537A patent/KR101806601B1/en active IP Right Grant
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| WO2021241965A1 (en) * | 2020-05-25 | 2021-12-02 | 주식회사 에즈큐리스 | Novel fusion protein for crystallizing il-33, and crystallizing method using same |
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