KR20160079060A - 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물 및 그의 용도 - Google Patents

무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

특히 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘의 세공에 함유된 카고 물질, 예컨대 카고 분자 또는 카고 나노입자를 면역계 세포에 전달하는데 사용하기 위한 것으로서, 예를 들어 염증성 장 질환, 및 특히 크론병, 자가면역 질환, 알레르기의 치료와 치료적 백신접종을 위한 치료적 접근으로서의 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물 및, 그의 의학적 용도가 개시된다.

Description

무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물 및 그의 용도{AMORPHOUS MAGNESIUM-SUBSTITUTED CALCIUM PHOSPHATE COMPOSITIONS AND THEIR USES}
본 발명은 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물 및 그의 의학적 용도, 및 더욱 특히 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘의 세공에 함유된 카고(cargo) 물질, 예컨대 카고 분자 또는 카고 나노입자를 면역계 세포에 전달하는데 사용하기 위한 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물에 관한 것이다. 추가의 측면에서, 본 발명은 염증성 장 질환, 특히 크론병, 자가면역 질환, 알레르기의 치료와 치료적 백신접종을 위한 새로운 치료적 접근, 및 진단에 사용하기 위한 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물에 관한 것이다.
인산칼슘은 오르토인산염 (PO4 3-), 메타인산염 또는 피로인산염 (P2O7 4 -)과 함께 칼슘 이온 (Ca2 +) 및 수소 또는 하이드록사이드 이온을 함유하는 광물류에 붙여진 이름이다. 뼈와 치아 에나멜에 존재하는 자연 발생 형태의 인산칼슘 중 하나는 Ca5(PO4)3(OH)의 근사식을 가지며 대개 Ca10(PO4)6(OH)2로 표시되는 생물학적 하이드록시아파타이트 (HA)이다. 생물학적 분야에서, 합성한 결정성 하이드록시아파타이트는 주로 뼈 및 치아를 보수하기 위한 충전재로서 조직 공학에 사용된다. 하이드록시아파타이트의 나노입자가 또한 약물 담체로서 제안되었으며, 영상 기술에 이용되고 있다.
하이드록시아파타이트는 중성 또는 염기성 용액에서 칼슘 및 제2인산염의 침전 반응으로 제조할 수 있고, 그의 최종 생성물로서 결정성 하이드록시아파타이트를 가진다. 그러나, 침전 동안, X-선 회절에 대해 무정형인 구조적 및 화학적으로 상이한 전구체 상이 형성되는데, 무정형 인산칼슘 (ACP)으로서 알려져 있다. 전구체 상의 화학적 분석에 의해 이 비결정성 상은 함수 인산칼슘인 것으로 나타났다. 다른 무정형 물질과 같이, ACP에 대해 예컨대 Ca9(PO4)6과 같이 수 개의 식이 제안되고 있다.
하이드록시아파타이트는 바이오분자용 담체로서, 특히 DNA 트랜스펙션, 약물 전달을 위해서뿐 아니라 정형외과 및 치과에서 사용되고 있다. 일례로서, 쵸드허리(Chowdhury) 등은 DNA를 결정성 하이드록시아파타이트 형태의 인산칼슘으로 침전시켜 배양하에 포유동물 세포로의 DNA 전달을 연구하였다 (Gene, 341: 77-82, 2004; J. Controlled Release, 116(2): e68-e69, 2006 Analytical Biochemistry, 328: 96-97, 2004; US 2007/0077306 참조). 이 실험은 침전된 하이드록시아파타이트 입자의 성장을 억제하기 위한 제제로서 Mg2 + 및 입자 크기의 증가에 따른 트랜스펙션 효율의 손실을 피하기 위해 DNA의 사용을 포함하였다. 그러나, Mg2 +가 DNA와 함께 침전된 아파타이트 입자에 도입되기는 하였지만, 입자는 결정성으로 남아 있다. 다스굽타(Dasgupta) 등은 소 혈청 알부민을 위한 방출 제어 담체로서 Zn- 및 Mg-도핑 하이드록시아파타이트 나노입자의 사용을 보고하였다 (Langmuir, 26(7): 4958-4964, 2010). 그러나, 쵸드허리 등에 의해 보고된 연구에서와 같이, 생성된 도핑 하이드록시아파타이트 물질은 비변형 하이드록시아파타이트와 마찬가지로 유의한 정도의 결정도를 가진다.
합성 동안, ACP는 (물의 존재하에서) 신속히 미소결정성 하이드록시아파타이트로 전환되고, 수용액에서 준안전성 ACP의 수명은 특정 마크로분자 및 간섭 이온의 존재, pH, 점도, 이온 강도 및 온도의 함수인 것으로 보고되었다. 문헌[Boskey & Posner (1973, 1974)]에서는 전환 속도에 대해 연구하고 Mg 이온에 의한 ACP 내 Ca 이온의 치환으로 무정형 상태의 안정성이 더 커져 하이드록시아파타이트와 같은 보다 더 결정성인 상으로 전환되는 경향이 줄어드는 것을 밝혀냈다. 이들은 적어도 1:25 (Mg:Ca)의 비에서, 건조 분말로서 시간이 지나도 안정하게 남아 있는 무정형 마그네슘 인산칼슘 상이 생성됨을 보여주었다.
ACP의 합성이 보고되었지만, 이 물질은 치과 및 조직 공학의 분야에서 뼈 및 치아 보수에 사용하기 위한 구조 물질 및 조직 공학용의 스캐폴드로서 매우 제한적인 적용이 제안되었다. 일례로서, 자오(Zhao) 등 (Chemistry Central Journal, 5: 40-47, 2011)은 치과에서 치아의 재광물화 및 보수를 위한 합성물로서 무정형 인산칼슘의 용도를 기술하였다. 이들은 기타 이온의 존재하 및 생체내 조건에서, ACP가 Mg2 +, F-, 탄산염, 피로인산염, 디포스폰산염 또는 폴리인산화 대사물 또는 뉴클레오티드의 존재하에 동적 안정화 때문에 유의적인 기간동안 지속될 수 있어, 합성 ACP가 하이드록시아파타이트로 변환되는 것을 방지할 수 있다고 보고하였다. 리(Li) 및 웽(Weng) (J. Mater. Sci.: Mater. Med., 18: 23032308, 2007)은 무정형 인산칼슘 (ACP)의 합성을 보고하였고, 저온에서 안정화 첨가제로서 폴리(에틸렌 글리콜)을 사용하였다. 이들은 ACP가 ACP 분말 중 4 w.t.% 폴리(에틸렌 글리콜)로 5℃에서 18시간 이상동안 모액내 폴리(에틸렌 글리콜)에 의해 안정화될 수 있음을 발견하였고, ACP가 조직 공학용 생분해성 스캐폴드로서 사용될 수 있음을 제시하였다.
파이어판(Peyer's patch)은 위장관에서 중요한 면역 감지 및 감시 기능을 수행하는 림프 여포이다. 파이어판 상피 아래 부분은 상피하 돔 (SED)으로 칭해지고, 항원 제시 세포가 풍부하다. 소화관 내강의 전 박테리아 및 유사 크기의 마이크로입자는 위쪽으로 이동하여 수상 돌기를 여포 관련 상피를 통해 확장하는 특정 SED 수지상 세포에 의해 직접 식균작용화될 수 있다. 가용성 분자 및 더 작은 입자의 감시를 위해 상피는 직접 내강을 샘플화하고 샘플화 물질을 기저 면역 세포에 수송하는 것으로 보이는 독특한 미소주름 (M) 세포를 함유한다. 정확히 어떻게 이것이 발생하고 예를 들어, 어떤 항원이 도중에 분해되지 않는지는 알려지지 않았다.
또한, 왜 파이어판 M 세포가 소화관 내강으로부터 ~20-250 nm 직경의 비-생물학적 나노입자를 그렇게 적극적으로 샘플화하는지도 분명하지 않다. 그렇지만, 그것의 발생은 세포 및 동물 모델에서뿐 아니라 또한 가공 식품, 약제 및 치약으로부터의 나노입자에 일상적으로 매일 노출되는 인간에 대해 잘 입증되어 있다.
발명의 개요
대체로, 본 발명은 본원에 기재된 실험으로부터 포유동물 위장관 내강의 가장 풍부한 비-생물학적 입자가 무정형 인산칼슘 나노입자 형태의 인산칼슘이라는 발명자의 통찰에 기반한다. Ca2 + 및 PO4 3- 이온은 모두 원위 장 내강으로 활발히 분비되는데 여기서 인산칼슘은 과포화되어 침전된다. 소화관에 의한 칼슘의 분비는 보통 내생적 손실로서 지칭되지만, 칼슘의 항상성에 거의 기여하지 않고, 그의 배출은 소변을 통해 매개되기 때문에, 왜 이것이 일어나는지는 알려지지 않았다. 본 발명은 또한 위장관에서 칼슘 이온 및 인산염 이온이 침전하고 내강에 존재하는 유기 분자를 포획하는 나노입자 및 작은 마이크로입자를 형성함으로써 상기 유기 분자를 파이어판내 소화관 점막 면역 세포 및 장관막 림프절로 전달할 수 있다는 발명자의 연구결과에 기반한다. 어떤 특정 이론에 구애됨이 없이, 본 발명자들은 이것이 국소 환경에 있는 항원 및 기타 분자의 장 면역 감시에 기여하고 그 기전에 의해 상기 항원 및 기타 분자가 면역계에 제시되거나 그에 의해 나타난다고 판단하였다. 본원에 기재된 연구들은 전문적인 소화관 면역 세포에서 인산칼슘 나노입자의 존재 및 펩티도글리칸의 존재를 함께 검출하기 위해 뮤린 및 인간 장 조직의 분비를 이용한 실험에서 상기 발견이 박테리아성 펩티도글리칸에 대해 자연적으로 발생한다는 것을 입증하였다. 이는 또한 단백질 항원, 즉 오브알부민을 경구 섭취한 마우스에서 이 경로를 따른다는 것을 보임으로써 확인되었다.
마이크로미립자, 즉 마이크로미터 직경 크기 또는 적어도 전형적인 미생물 크기의 인산칼슘이 장관에서 형성되고 기능을 수행할 수 있다는 것이 광범하게 제안되었지만, 본 발명은 더 작은 무정형 입자에 관한 것이다. 본 발명자들은 또한 내인적으로 생산된 인산칼슘 나노입자가 5 nm 정도로 작고 250 nm 정도로 크지만, 전형적으로 75 nm 내지 150 nm 직경의 무정형 인산칼슘 상을 포함하고, 전자현미경법에 의해 대규모 공극을 가지고 있음을 추가로 발견하였다. 공극은 직경이 전형적으로 1-2 nm이고, 부분적으로 또는 전체적으로 전자현미경법에 의해 이미지화할 수 없는 유기 분자의 도입에 기인한다고 제안되었다.
본 발명자들은 위장관에서 면역 세포에 의한 작은 내인성 나노입자의 흡수를 실현하였으며, 이는 내인적으로 생산된 나노입자와 유사한 방식으로 세포에 의해 흡수되도록, 카고 물질, 예컨대 카고 분자 또는 나노입자를 수송할 수 있는 내인성 나노입자의 합성 모방체를 개발할 수 있음을 의미한다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 작은 내인성 무정형 인산칼슘 나노입자의 합성 모방체 및, 특히 치료 및 진단 적용 모두에 사용하기 위한 생물학적 활성 카고 물질, 예컨대 카고 분자 및/또는 나노입자의 포획 및 전달을 위한 그의 용도에 관한 것이다. 따라서, 이러한 양태에서, 본 발명은 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 (AMCP)을 포함하고, 여기서 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘에는 관심 부위로 전달하기 위한 생물학적 활성 카고 물질이 봉입(entrap)되어 있는 조성물에 관한 것이다. 관련 양태에서, 본 발명은 카고 물질의 전달에 사용하기 위한 것으로, 치료에 사용하기 위한 카고 물질이 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘에 봉입된 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물을 제공한다. 관련 양태에서, 본 발명은 카고 물질의 전달에 사용하기 위한 것으로, 카고 물질을 사용한 진단방법 및 관련 방법에 사용하기 위한 카고 물질이 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘에 봉입된 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물을 제공한다.
관련 양태에서, 본 발명은 생물학적 활성 카고 물질을 위장관에 전달함으로써 병태의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 것으로, 생물학적 활성 카고 물질을 봉입하여 상기 카고 물질이 위장관 내 관심 부위로 전달되도록 할 수 있는 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 (AMCP)을 포함하는 조성물을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 생물학적 활성 카고 물질을 위장관에 전달함으로써 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 이 방법은 생물학적 활성 카고 물질을 봉입하여 상기 카고 물질이 위장관 내 관심 부위로 전달되도록 할 수 있는 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 (AMCP)을 포함하는 조성물을 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 생물학적 활성 카고 물질을 위장관에 전달함으로써 염증성 장 질환, 예컨대 크론병 또는 셀리악병(coeliac disease)의 치료 또는 예방의 방법에 사용하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 생물학적 활성 카고 물질을 봉입하여 상기 카고 물질이 위장관 내 관심 부위로 전달되도록 할 수 있는 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 (AMCP)을 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 생물학적 활성 카고 물질을 위장관에 전달함으로써 자가면역 질환의 치료 또는 예방의 방법에 사용하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 생물학적 활성 카고 물질을 봉입하여 상기 카고 물질이 위장관 내 관심 부위로 전달되도록 할 수 있는 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 (AMCP)을 포함한다. 자가면역 질환으로는 다발성 경화증, 셀리악병, 1형 당뇨병 및 전신 홍반성 루푸스 (SLE)를 예로 들 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 생물학적 활성 카고 물질을 위장관에 전달함으로써 알레르기의 치료 또는 예방의 방법에 사용하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 생물학적 활성 카고 물질을 봉입하여 상기 카고 물질이 위장관 내 관심 부위로 전달되도록 할 수 있는 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 (AMCP)을 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 생물학적 활성 카고 물질을 위장관에 전달함으로써 암의 치료 또는 예방의 방법에 사용하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 생물학적 활성 카고 물질을 봉입하여 상기 카고 물질이 위장관 내 관심 부위로 전달되도록 할 수 있는 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 (AMCP)을 포함한다. 암의 치료 또는 예방과 관련된 본 발명의 의학적 용도의 예는 골수성 백혈병, 예컨대 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 림프모구성 백혈병 및 급성 골수성 백혈병 (AML)이다.
추가 양태에서, 본 발명은 생물학적 활성 카고 물질을 세포에 전달하는 방법을 제공하며, 이 방법은 세포를 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 (AMCP)에 봉입된 생물학적 활성 카고 물질을 포함하는 조성물과 접촉시켜 조성물이 분산되어 세포에 의해 흡수될 수 있는 나노입자를 형성함으로써 생물학적 활성 카고 물질을 세포에 전달하는 것을 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은
(a) 칼슘 이온 (Ca2 +), 마그네슘 이온 (Mg2 +)을 포함하는 용액 및 인산염 이온 (PO4 2-)을 포함하는 용액을 제공하는 단계로서, 상기 용액 중 어느 하나 또는 둘 다 하나 이상의 생물학적 활성 카고 물질을 포함하는 단계;
(b) 칼슘 이온 (Ca2 +), 마그네슘 이온 (Mg2 +)을 포함하는 용액과 인산염 이온 (PO4 2-)을 포함하는 용액을 혼합하여 생물학적 활성 카고 물질이 봉입된 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘을 침전시키는 단계;
(c) 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘을 회수하는 단계; 및
(d) 임의로 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘을 세척 및 건조하는 단계
를 포함하는, 봉입된 생물학적 활성 카고 물질을 함유하는 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명자들은 합성 후, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘이 생물학적 활성 카고 분자를 관심 부위로 분산되어 전달할 수 있는 응집 나노입자를 포함하는 것을 발견하였다. 이는 물질이 카고의 전달을 위한 생물학적 환경에서 나노입자를 형성하는 동시에, 합성 후 정제 및 처리가 용이하다는 이점을 가진다. 유리하게, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물은 단백질의 존재하에 수성 환경에서 효율적으로 분산됨으로써 카고 물질이 생체내 환경에서 전달가능하도록 한다.
일부 적용에서, 본 발명자들은 본 발명에 따른 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물이 관심 부위에서 나노입자에 대한 보조 및/또는 직접 전사 반응을 일으키지 않는 침묵(silent) 전달 플랫폼이라는 상당한 이점을 가지는 것을 발견하였다. 예를 들어, 나노입자를 흡수하여 처리된 세포는 생물학적 활성 카고 물질 단독 및/또는 유발되지 않은 대조 세포에 대한 반응과 실질적으로 상이한 반응을 갖지 않는다.
따라서, 일부 경우에, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 나노입자는, 바람직하게는 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 나노입자에 3시간 내 노출로 평가되어, 나노입자로 유발된 세포와 유발되지 않은 대조 세포에게 미치는 직접 전사 반응을 다르게 변조하지 않는다는 의미에서 침묵이다. 이는 도 10에 기초한 실험에서 결정될 수 있으며, 합성 AMCP에 대한 유전자의 직접 전사 반응의 상관성은 정상 세포에 비해 바람직하게는 2배 위 및 2배 아래 조절의 범위에 포함되는 것으로 나타났다.
이러한 특징에 의해 본 발명의 조성물은 전달된 항원에 의해 일어나는 반응 외에 전달제가 형성되는 물질이 보조 반응을 생성하는 선행 기술의 전달 시스템과 차별된다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물은 나노입자를 우선적으로 흡수하는 세포형으로 카고 분자의 전달을 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 예로서, 이는 위장관 내 세포, 예컨대 장 림프 여포의 항원 제시 면역 세포를 포함한다. 나노입자를 우선적으로 흡수하는 세포형은 항원 제시 B 세포를 포함하나, 특히 수지상 세포 및 대식세포, 예컨대 CD11b 및 CD11c 양성 세포이다.
대안적으로 또는 추가로, 본 발명자들은 본 발명에 따른 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물이 마그네슘 이온 및/또는 생물학적 활성 카고 물질에 의해 무정형 상으로 안정화된다는 중요한 이점을 가지는 것을 추가로 발견하였다. 이와 관련하여, 무기 화학 분야에서는, ACP 내 Ca2 + 이온의 Mg2 + 이온에 의한 치환이 더 큰 무정형 상태의 안정성으로 이어져 보다 더 결정성인 상으로 전환되는 경향이 줄어든다고 인식하고 있다. 문헌[Boskey & Posner (1973, 1974)]은 적어도 1:25 (Mg:Ca)의 비에서, 무정형 Mg Ca PO4 상이 건조 분말로서 시간이 지나도 안정하게 남아 있음을 보여주었다. 그러나, 본 발명자들은 그의 합성 동안, 마그네슘 이온에 의해 안정화된 무정형 인산칼슘 (AMCP)이 카고 분자, 예컨대 단백질 항원, 생물활성 시토카인, 펩티도글리칸, 저분자량 유기 분자, 및 카고 나노입자, 예컨대 무기 나노입자를 비롯하여 광범위 카고 물질을 포획하는데 특히 유용하다는 것을 최초로 인식하였다. 이것은 결과적으로 본 발명에 따른 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물에 대해 다양한 상이한 적용의 길을 여는 열쇠가 되었다. 카고 분자의 특정 예로는 뮤라밀 디펩티드 (MDP), 리포폴리사카라이드 (LPS), 폴리이노신산:폴리시티딜산 (폴리 I:C) 및 레티노산 (RA)을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명자들은 본 발명의 합성 방법을 이용하여 조성물 관련 카고 분자가 단순히 입자의 표면에 결합되는 것이 아닌 적어도 부분적으로 물질내에 도입된 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물 (Mg, Ca, PO4)을 형성할 수 있음을 발견하였다. 이는 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물이 카고 물질 주위에 어느 정도 템플릿을 만들어 전체적으로 다공성 물질을 형성한 것처럼 보이게 함을 의미한다. 다시 말해서, 다른 카고 물질의 존재하에 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물의 공침전으로 이들 다른 카고 물질의 적어도 일부가 합성 동안 물질 내에 봉입되게 된다. 유리하게, 이로서 카고가 표면에 단순히 흡착된 경우에 비해, 생체내에서 도중에 카고를 표적 세포에 대해 더 잘 보호할 수 있다.
또한, 본 발명은 세포에 의해 흡수될 수 있는 카고 물질을 함유하여 세포 소화시 카고 물질의 방출로 이어지고, 이에 따라 카고 물질에 대한 전형적인 세포 반응을 제공할 수 있는 나노입자를 형성하기 위해 본 발명에 따른 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물이 분산될 수 있음을 입증한다. 예를 들어, 박테리아성 펩티도글리칸이 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물에 의해 포획될 수 있고, 세포에 전달된 경우, 박테리아성 펩티도글리칸의 전형인 시토카인 (IL-10; IL-I; TNFα 등)의 생산을 이끌 것이다. 상술한 바와 같이, 본 발명자들은 놀랍게도, 입자-포매 카고가 카고 단독으로부터 유래한 세포 신호를 충실히 재현하고, 즉 양 방향에서 신호 전달의 감쇠가 존재하지 않음을 발견하였다.
유리하게, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 나노입자는 세포 흡수에 비독성이고 안전하다. 일반적으로 업계에서는 무정형 입자가 결정성 입자보다 세포에 더 안전한 것으로 인정하고 있다. 본 발명의 나노입자에 노출되어 이를 흡수하는 세포는, 예를 들어 인산칼슘 하이드록시아파타이트에 장기간 노출과 달리, 사멸하지 않는다
또한, 본 발명에 따른 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물은 2개 이상의 상이한 카고 물질을 공동 전달하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 실험은 펩티도글리칸 및 항원이 둘 다 존재하는 경우, 펩티도글리칸이 존재하기 때문에 분비되는 IL-10에 의해 그로 인한 항원에 대한 T 세포 반응이 현저히 감소됨을 입증하였다.
추가 양태에서, 본 발명은 내인성 무정형 인산칼슘 나노입자와 소화관 내에서 연관되는 세포가 크론병에서 단백질 예정사 리간드 1 (PD-L1)의 부재 또는 발현 감소를 나타내고, 즉 그렇치 않으면 상응하는 건강한 세포에 존재한다는 연구결과에 기반한다. PD-L1은 질환의 원인이 이들 세포의 PD-L1 발현 실패와 관련될 수 있음을 암시하는 내성-유도 분자이다. 따라서, 이러한 양태에서, 본 발명은 염증성 장 질환, 예컨대 크론병의 치료 방법에 사용하기 위한 약제를 제공하며, 여기서 약제는 (a) PD-L1의 발현 상향 조절; 또는 (b) PD-L1 단백질 활성화; 또는 (c) PD-L1 발현 억압 억제; 또는 (d) 장 림프 여포의 일부 항원 제시 세포 상에서 PD-L1 활성화의 성질을 가진다. 관련 양태에서, 본 발명은 카고 물질로서 본 발명에 따른 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 물질 내에 봉입되어 있는 약제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 장 림프 여포의 항원 제시 면역 세포에서 PD-L1 발현을 향상시킬 수 있는, 크론병의 치료 방법에 사용하기 위한 약제를 제공한다.
이제 본 발명의 실시형태를 첨부한 도면을 참조로 하여 예시적으로 제한없이 설명한다. 그러나 본 발명의 다양한 추가의 양태 및 실시형태가 본 발명의 설명에 비추어 당업자들에게 자명할 것이다.
본원에서 사용된 "및/또는"은 명시된 두 특징 또는 구성성분 각각을 다른 것과 함께 또는 없이 특정 개시한 것으로 간주한다. 예를 들어 "A 및/또는 B"는 각각 본원에서 개별적으로 제시되는 것과 같이, (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B 각각의 특정 개시로서 간주한다.
문맥이 달리 지시하지 않는 한, 상기 명시된 설명 및 특징의 정의는 본 발명의 특정 양태 또는 실시형태에 한정되지 않으며, 기재된 모든 양태 및 실시형태에 동일하게 적용된다.
도 1. 합성 AMCP 나노입자의 STEM 특성화:
a- 합성 AMCP 입자 클러스터 (스케일 바 20 ㎚)의 고각도 환형 암시야 STEM 이미지 및 b- 에너지 분산 X 선 마이크로분석에 의한 실시예 원소 조성. c-e- XY 면을 통해 다수의 오르토슬라이스(orthoslice) 수단에 의해 재구성된 부피 (f)로부터 세부적인 내부 구조 (f-i)를 나타내는 합성 AMCP 입자 (스케일 바 20 nm)의 일련의 오르토슬라이스 및 (g-i) 각각 YZ, XZ 및 XY 배향을 통한 투명도 뷰.
도 2. A. 투과전자현미경법. B. 산화철 나노입자의 존재하에 형성된 AMCP 입자의 3D 토모그라피 재구성 (실시예 8 참조). C-D. 일부가 어떻게 AMCP 내에 포획되었는지를 나타냄. E. 실시예 2 및 3에서 제조된 AMCP 입자중 BSA 및 Pg의 도입%.
도 3. A. 합성 및 조직 배양 배지에서 희석 후 AMCP 입자에 존재하는 Ca 및 P 원소의 ICP-OES 분석. B. 실시예 2 및 4에서 제조되고 (조직 배양 배지에서 재현탁 및 희석 후), 나노사이트(nanosight)를 사용하여 나노택킹 (nanotacking) 분석법 (NTA)으로 분석된 AMCP 입자의 크기 분포.
도 4. A. AMCP/BSA 및 AMCP/BSA/Pg와 3시간 배양 후 유세포분석 이미지화 (n = 4)에 의해 측정된 PBMC 내 이중 칼사인 고 CD107a 고 CD14+ APC의 평균 백분율. B. 유세포분석 이미지화로 측정된 리소좀 표지 CD107a에 의한 내부화 입자 (칼사인+) 및 입자 공동-국소화를 나타내는 CD14+ 세포의 대표적인 이미지 (하나의 건강한 대조군의 PBMC로부터의 데이터가 나타남). B. AMCP/BSA/sPg 대 대조군에 대한 신호 로그비 (SLR)는 y-축 상에 플롯팅하고, sPg 대 대조군에 대한 SLR은 x-축 상에 플롯팅함. 각각의 점은 단일 유전자를 나타낸다. 완전 상관 곡선을 완전 상관선의 각 점에 +1 또는 -1을 더하여 산출된 선형 2-배 상-/하향-조절 (통상 잠재적 '차이'를 나타내는데 필요한 최소 배수 변화)에 상응하는 경계값 및 데이터 상에 오버레이하였다.
도 5: 리포폴리사카라이드 (LPS) 및 T 세포 항원 PPD의 이중 운반은 PPD 항원 특이적 CD4+ T 세포 증식을 억제한다. 왼쪽 상단: CFSE 증식 어세이에서 CD4+CD3+ 분열 세포 (저 CFSE)를 나타내는 플로우 플롯의 예; 생 림프구 게이트 내 세포를 CD4에 대해 게이팅하고, CD3 대 CFSE를 플롯팅하였다. 오른쪽 상단: 5 PPD 반응자로부터 가용성 및 미립자 PPD 항원/항원-LPS 조합 평균 데이터에 대응하는 5일 째 PBMC에서 CD4+CD3+ T 세포의 증식을 나타냄. 자극에 대한 PBMC 집단 내 CD4+CD3+ CFSE 저 세포를 자극 지수로서 나타내었다. 하단: PD-L1 및 IL-10R 차단에 의한 추가 CFSE CD4+CD3+ T 세포 증식 T 세포 어세이. 6개 PPD 반응자로부터의 평균 데이터가 도시됨. 증식 분율이 2% 이상이고 4 이상의 자극 지수를 가지면 PPD 반응의 모든 증식 어세이는 유의적인 것으로 간주하였다.
도 6. pro-IL1β의 유도를 위해 LPS로 3시간 동안 일차 사전-자극되거나 (10 ng/ml, 줄무늬 기둥), 또는 자극되지 않고 (무늬 없는 기둥), 음성 대조군 (즉, 조직 배양 배지), AMCP/BSA (A-B), sPg 및 AMCP/BSA/sPg (C-D)와 추가 배양 (3시간)된 PBMC로부터의 IL-1 β 분비.
도 7. LPS (3시간; 10 ng/ml)의 존재 또는 부재하에 자극된 후 sPg 및 AMCP/BSA/sPg로 3시간 동안 유발된 (n=2) PBMC에서의 IL-1β (A) 및 IL-10 (B) 반응. 상등액을 3시간 유발 후 21시간 추가 추적하여 분석하였다.
도 8. 각각 건강한 대상체 및 크론병 대상체에서 내부화 AMCP (녹색) 및 유도 또는 결핍 PD-L1 (적색)을 나타내는 건강한 대상체 (A; 회색) 및 크론병 대상체 (B; 청색)에서 파이어판 장 세포의 공초점 현미경사진.
도 9. (a) 마그네슘 (Mg) 및 소 혈청 알부민 (BSA) 모두의 부재하, (b) 0.9 mM (Mg; 최종 농도), (c) 1.8 mm Mg, (d) 1.8 mM Mg 및 BSA, (e) 3.6 mM Mg 및 (f) 3.6 mM Mg 및 BSA의 존재하에 제조된 인산칼슘 나노입자의 X-선 회절 패턴.
도 10. 비히클 대조군 처리 (n=7)의 것에 대해 상관관계가 있는 합성 AMCP에 3시간 노출 후 유전자의 평균 log2 발현 값으로, 단백질-부하된 합성 AMCP 나노입자로 유발된 세포가 유발되지 않은 (대조군) 세포의 것과 유사한 전사 '특징'을 나타냄을 입증한다. 완전 상관의 이론적 선을 중앙선에 나타내었으며, 가장자리 선은 2-배 상향- 및 하향-조절의 것에 해당한다.
도 11. A- 상피하 영역에서 분명한 칼사인 염색 (녹색)을 나타내는 맹장 패치로서, 이는 파이어판 외에, 면역-활성 충수 림프 패치도 또한 내인성 나노광물질을 흡수함을 보여준다. 핵은 회색으로 나타난다; 스케일 바 50 ㎛. B- 유의적인 수의 AMCP (녹색) 나노광물질+ 세포를 나타내는 뮤린 장관막 림프절.
상세한 설명
무정형 인산칼슘
무정형 인산칼슘 (ACP)은 모든 인산칼슘 형태 중에서 결정성 인산칼슘의 장거리 주기적 원자 스케일 질서를 갖지 않는 점에서 특이하다. 이는 ACP가 그의 브로드한 확산 X-선 회절 패턴으로부터 25°2 세타에서 최대치를 갖고 잘 결정화된 하이드록시아파타이트에 비해 다른 상이한 특징을 갖지 않는 것으로부터 알아볼 수 있음을 의미한다. 추가로 또는 대안적으로, 무정형 인산칼슘은 XRD에 의한 분석이 약 31°2-세타에서 피크를 이루고 22 내지 36 2-세타에 걸친 전형적인 브로드 밴드를 나타내는 인산칼슘 물질로서 특정될 수 있다 (예컨대, 도 9에서의 디프랙토그램 d-f). 이러한 브로드 밴드는 하이드록시아파타이트 물질에 존재하는 32 2-세타에서 더 샤프한 피크 (예컨대, 도 9에서의 디프랙토그램 a-c)와는 완전히 다르다는 것이 주목된다. 브로드한 XRD 밴드는 또한 도 9에 도시된 바와 같이 본 발명에 따른 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물의 특징이다. 이에 반해, 상기 다스굽타 등 및 쵸우드허 등의 적어도 부분적으로 결정성인 물질에 대한 XRD 회절 패턴은 더 세밀하게는 하이드록시아파타이트의 것에 가깝다. 무정형 인산칼슘 및 결정성 하이드록시아파타이트에 대한 XRD 회절 패턴의 비교를 도 9에 나타내었으며 당업자라면 도 9에 도시된 패턴을 비교함으로써 X-선 회절로 측정시 인산칼슘 형태가 무정형인지 아닌지를 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 전자현미경하에, ACP의 형태학상 형태는 10 나노미터 크기의 작은 구형 입자로서 나타난다. 따라서, 본원에서 사용된 ACP 및 AMCP ("무정형의 마그네슘 치환된 인산칼슘")는 이러한 무정형의 인산칼슘을 가리키며 결정형의 인산칼슘, 예컨대 하이드록시아파타이트를 포함하지 않는다.
일반적으로, 본 발명자들은 본 발명에 따른 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물이 합성되는 경우, 이들은, 예를 들어 여과 및/또는 원심분리, 및 다른 기술, 예컨대 저장 및 사용을 위해 조성물 내 물질의 건조 및 제제화를 이용한 처리에 의해 정제가 용이한 응집 입자 형태로 제조됨을 발견하였다. 당업자라면 건조 또는 다른 제조 공정 동안 응집을 최소화하거나 방지하기 위해 제제에 적절한 부형제가 첨가될 수 있음이 자명할 것이다. 그러나, 본 발명자들은 유리하게도 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물이 임상적으로 존재할 수 있는 수화 환경 또는 생물학적 환경에서 전달되는 경우, 물질이 본원에 기재된 특징을 가지는 나노입자 형태로 재분산됨을 발견하였다. 이는, 예를 들어, 나노입자가 세포 흡수에 적합한 크기임을 의미한다. 따라서, 본원에 사용된, "응집체"는 환경 변화에 대응하여 개별 입자, 예컨대 나노입자로 재분산될 수 있는 비교적 느슨하게 결합된 입자군을 지칭한다.
바람직하게는, 본 발명에 사용된 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물은 다음의 특징들을 가진다. 바람직하게는, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물 내 Mg 대 Ca의 비는 적어도 1:25, 임의로 적어도 1:20, 임의로 적어도 1:10, 임의로 적어도 1:5, 임의로 적어도 1:4 및 대부분 임의로 적어도 1:3이다.
일반적으로, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물이 예를 들어 전달시에 수화 형태인 경우, 이들은 분산되어 나노입자 조성물을 형성한다. 일반적으로, 나노입자는 평균 직경이 5 nm 내지 500 nm 직경의 범위내, 평균 직경이 20 nm 내지 350 nm의 범위, 더 바람직하게는 평균 직경이 20 nm 내지 200 nm의 범위, 더 바람직하게는 평균 직경이 20 nm 내지 150 nm의 범위, 더 바람직하게는 평균 직경이 75 nm 내지 150 nm의 범위이다. 주어진 크기 범위 내에서, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 나노입자의 적어도 75%가 상기 범위의 평균 직경을 갖는 것이 바람직하고, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 나노입자의 적어도 90%가 상기 범위의 평균 직경을 갖는 것이 더 바람직하다. 입자 크기는, 예를 들어 Nanosight NS500 (Nanosight, Amesbury, UK)을 사용하고 NTA2.2 분석 소프트웨어를 사용하여 나노입자 트래킹 분석으로 평가할 수 있다.
이하 설명되는 바와 같이, 본 발명에 따른 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물은 이들이 카고 분자 또는 카고 나노입자와 같은 카고 물질을 봉입하거나, 그 주위에 템플릿화되기 때문에 다공성을 나타낸다. 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물의 공극은 광물 영역 및 비-광물 영역 (세공)인 그의 홀을 보이기 때문에 전자현미경에서 '보이지 않는(blind)', 유기 카고를 부분적으로 또는 완전히 함유하는 세공과 참 세공의 조합을 나타낸다. 이는 TEM, 보다 바람직하게는 STEM 및 최상으로는 STEM 토모그라피로 관찰할 수 있다. BET 또는 수은 침입이 카고에 의해 점유되지 않은 참 세공의 척도를 제공할 수 있다. 전형적으로, 나노입자내 세공의 크기는 10 nm 이하, 더 바람직하게는 5 nm 이하, 및 가장 바람직하게는 약 1 내지 3 nm이다. 일반적으로, 이들이 나노입자 형태인 경우, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 입자는 거의 구형 또는 길쭉한 구형 형상을 가진다.
본 발명에 따른 무정형의 마그네슘-치환된 칼슘 조성물의 안정성은 본 발명의 물질의 주된 이점이며, 이는 부분적으로 물질내에 마그네슘 이온이 존재함으로써 발생한다. 건조 분말로서 시간이 지나도 안정하게 남아 있는 무정형 AMCP (Mg Ca PO4) 상이 생성될 수 있다. 바람직하게는, 이는 25개의 Ca 원자당 적어도 하나의 Mg 원자 및 하나의 Ca 이온당 1개 이하의 Mg 이온을 함유한다. 더 바람직한 Mg:Ca 비는 적어도 1:20이고, 더 바람직하게는 적어도 1:10이고, 더 바람직하게는 적어도 1:5 Mg:Ca 이온이고, 더 바람직하게는 적어도 1:4 Mg:Ca 이온 또는 적어도 1:3 Mg:Ca 이온이다.
마그네슘 치환된 인산칼슘 나노입자의 컴퓨터 모델화
제1 원리 DFT 모델화를 CASTEP (Clark et al: First principles methods using CASTEP. Zeitschrift fuer Kristallographie: 220 (5-6): 567-570, 2005) 평면파 시뮬레이션 코드를 사용하여 행하였다. 입자 핵형성의 초기 단계 전형인 작은 전구체 인산칼슘 클러스터를 구축하고 시뮬레이션하였다.
포스너(Posner)의 클러스터 (Posner, Acc. Chem. Res., 8: 273-281, 1975), (Ca9(PO4)6)는 결정성 아파타이트의 형성을 위한 전구체인 것으로 간주된다. 이 구조가 출발 모델로서 사용되었으나 실험적으로 측정된 조성, MgCa7(PO4)6을 반영하기 위해 식을 변경하였다. 클러스터의 기하 구조 및 안정성의 분석을 수행하였다. 안정성은 형성 에너지 분석을 사용하여 열역학적으로 평가하였다. 이 분석으로 다음 결과를 얻었다. 상기 실험적으로 측정된 조성에서, 클러스터는 칼슘의 경우보다 마그네슘의 경우가 더 안정하였다. 이는 마그네슘 치환이 선호되지 않는 포스너의 클러스터인 경우에 해당하지 않는다.
결정성 하이드록시아파타이트 (HA)에서 마그네슘 치환을 이루기 위해 에너지가 필요하고, 따라서 치환시 형성 에너지는 양의 값이다. 실험적으로 측정된 조성의 클러스터에서 동일한 치환의 형성 에너지는 음의 값이며, 따라서 더 선호된다. 이는 실험 클러스터내 마그네슘이 무정형 구조를 결정화에 대해 안정화함을 나타낸다. 마그네슘 치환의 가장 선호적인 위치는 클러스터의 중심이다. 이는 마그네슘 이온이 가장 안정한 위치이다.
클러스터의 기하구조는 치환된 포스너의 클러스터 및 무마그네슘 클러스터 둘 다에 비해 훨씬 "더 느슨하다". 치환된 포스너의 클러스터에 비해, Mg-P 거리는 2.5% 더 크고 P-P 거리는 5% 더 크다. 클러스터는 그의 구형 기하구조를 상실하는데, 더 약한 결합을 가져 더 무정형으로 보이는 클러스터를 나타낸다.
포획된 카고 물질
본원에 기재된 실험은 본 발명에 따른 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물내에 하나 이상의 카고 물질을 포획하는 것이 가능함을 보인다.
Figure pct00001
카고 물질로서의 나노입자
나노입자 구조는 직접 그 자체로 또는 그 안의 치료제 운반에 기인한 치료적 유용성을 가질 수 있다. 일반적으로 <20nm, 바람직하게는 <15 nm 및 가장 바람직하게는 <10 nm 직경의 작은 나노입자가 본 발명에 따른 무정형의 마그네슘-치환된 칼슘 조성물에 용이하게 도입될 수 있다. 이는 이들이 아니면 유도되지 않을, 작은 나노입자의 표적화라는 이점을 가질 수 있다. 예를 들어, 범발성 인플루엔자에 대한 간섭 RNA가 작은 핵-표적화 나노입자에 도입될 수 있는데, 이 자체가 무정형의 마그네슘-치환된 칼슘 조성물에 도입되어 흡입기 또는 유사 장치에 의해 초기 상기도에 전달되는 것을 허용하고, 더 작은 입자을 방출하여 더 깊은 상피 세포로 추가 이동 및 전달되기 전에 무정형의 마그네슘-치환된 칼슘 조성물을 폐벽액에 용해되도록 할 수 있다.
제2 예는 치료 철이다. 예를 들어, 위분해를 건너뛰거나 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 이의 일례는 페리틴 코어와 같은 나노미립자 수산화철로서, 소장에 온전하게 전달되어 엔도시토시스를 통해 소장 전체에 흡수된 뒤 Fe 이용을 위해 리소좀내적으로 용해하기를 원하는 경우일 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 무정형의 마그네슘-치환된 칼슘 조성물을 사용하여 금속 나노입자 또는 금속 옥소-하이드록사이드 나노입자, 예컨대 철 또는 구리 나노입자, 또는 양자점의 전달을 가능케 하며, 예를 들어, 입자의 카고를 시험관내 및 생체내 시스템 모두에서 이동시킬 수 있는 실험에 대해 바람직할 수 있다. 따라서 추가 양태에서, 본 발명은 검출가능한 모이어티, 예컨대 라벨을 포함하는 카고 물질이 봉입된 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 (AMCP)을 포함하는, 진단방법에 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 일 실시형태에서, 이는 카고 물질을 위장관에 전달함으로써 카고 물질을 위장관 내 관심 부위로 전달할 수 있고, 검출가능한 모이어티를 검출할 수 있는 기술을 이용하는 것을 포함한다.
관련 양태에서, 본 발명은 대상체에 검출가능한 모이어티를 포함하는 카고 물질이 봉입된 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 (AMCP)을 포함하는 조성물을 투여하고, 카고 물질을 포함하는 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘을 위장관에 전달하고, 검출가능한 모이어티를 검출하는 것을 포함하는 진단방법을 제공한다.
카고 물질로서의 백신
치료제는 a) 특이적 세포형으로의 표적화 및/또는 b) 위장 수송 도중 소화로부터의 보호를 필요로 할 수 있다. 본 발명에 따른 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물은 두 경우 모두에서 이점을 제공할 수 있다. 첫째 APC 및/또는 세망-내피 세포의 표적화는 경구적으로, 직장으로 또는 비경구적으로 이루어진다. 본원에 기재된 이유로, 본 발명에 따른 무정형의 마그네슘-치환된 칼슘 조성물은 카고 물질을 파이어판 및 장관막 림프절 (MLN)에 전달하는데 매우 적합하다. 둘째, 효소로부터의 소화에 대해 일부 보호를 제공한다. 일례는 백신접종일 수 있다. 하나 이상의 카고 분자를 포함하는 백신을 무정형의 마그네슘-치환된 칼슘 조성물에 도입하여 상기 목적중 어느 하나 또는 모두를 달성할 수 있다. 제2 예는 염증성 장 질환, 류마티스성 관절염 또는 다른 염증성 또는 자가면역 장애에서의 치료적 전달이다. 본 발명에 따른 무정형의 마그네슘-치환된 칼슘 조성물 내에 팩키징되고 APC 및 관련 세포에 표적화된다는 점에서 스테로이드, 메토트렉세이트, 아자티오프린 또는 심지어 비-표적화 치료제로서 사용되는 생물제제와 같은 특이적 치료에 유익할 수 있다.
어떤 특정 이론에 구애됨이 없이, 본 발명자들은 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물이 자가면역 증상, 염증성 장 질환, 류마티스성 관절염 또는 다른 염증성 장애와 같은 병태의 기저를 이루는 전신 및/또는 국소 반응을 둔화시키는 경구 면역관용을 유도함으로써 상기 병태의 치료를 위해 사용될 수 있을 것으로 판단한다. 소화되지 않는 경구 소비 물질은 내인적으로 생산된 인산칼슘 나노입자에 의해 포획되어 관련 세포로 운반될 수 있지만, 이 과정은 본 발명에 따른 무정형의 합성 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물에 이미 존재하는 카고 물질에 대한 세포 노출에 비해 상대적으로 비효율적이다.
핵산 카고 분자
무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물은, 예를 들어 세포에서 핵산 서열의 발현, 유전자 녹다운을 위한 짧은 핵산 서열의 전달 등을 얻기 위해 핵산 서열인 카고 물질을 전달하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 핵산은 네이키드(naked) 서열일 수 있거나 또는 발현 벡터에 도입될 수 있다. 핵산은 전적으로 또는 부분적으로 합성될 수 있고, 게놈 DNA, cDNA 또는 RNA를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 핵산이 RNA를 포함하는 경우, 나타낸 서열 참조는 T에 대해 U 치환된 RNA 등가물에 대한 참조로서 이해하여야 한다.
예를 들어 유전자 및/또는 그의 조절 요소의 전부 또는 일부를 암호화하는 핵산 서열은 본원에 포함된 정보 및 참조와 당업계에 공지된 기술을 이용하여 당업자가 용이하게 만들 수 있다 (예를 들어, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989, and Ausubel et al, Short Protocol in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1992 참조). 이들 기술은 (i) 예컨대, 게놈원으로부터의 핵산 샘플을 증폭하기 위한 중합효소 연쇄 반응 (PCR)의 이용, (ii) 화학적 합성, 또는 (iii) 대장균에서의 증폭을 포함한다. 핵산 서열의 변경은, 핵산 발현을 위해 사용되는 숙주 세포에서의 코돈 선호를 감안하여 예컨대, 부위 지정 돌연변이생성을 이용할 수 있다. 핵산 증폭을 위한 PCR 기술은 미국특허 제4,683,195호에 기재되어 있다. PCR 기술에 대한 일반적인 사용에 대한 참조는 문헌[Mullis et al, Cold Spring Harbour Symp. Quant. Biol., 51:263, (1987), Ehrlich (ed.), PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989, Ehrlich et al, Science, 252:1643-1650, (1991), "PCR Protocol; A Guide to Methods and Applications", Eds. Innis et al, Academic Press, New York, (1990)]을 포함한다.
핵산 서열의 발현을 얻기 위해, 이는 그의 발현을 조절하기 위해 핵산에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 가지는 벡터내로 도입될 수 있다. 벡터는 기타 서열, 예컨대 삽입된 핵산의 발현을 유도하기 위해 프로모터 또는 인핸서, 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드가 융합 및/또는 핵산 암호화 분비 신호로서 생성되어 숙주 세포에서 생성된 폴리펩티드가 세포로부터 분비되도록 하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 적합한 벡터는 프로모터 서열, 말단 단편, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 표지 유전자 및 필요에 따라 다른 서열을 비롯해 적절한 조절 서열을 포함하도록 선택되거나 작제될 수 있다. 벡터는 플라스미드 또는 바이러스, 예컨대, 필요에 따라 '파지, 또는 파지미드일 수 있다. 추가의 세부적인 내용은, 예를 들어, [Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press]를 참조한다. 예를 들어 핵산 작제물의 제조, 돌연변이생성, 서열결정, 세포로의 DNA 도입 및 유전자 발현에서의 핵산 조작, 및 단백질 분석을 위한 많은 공지 기술 및 프로토콜은 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992]에 상세히 기술되어 있다. 핵산 또는 발현 벡터는 본 발명에 따른 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물이 사용시 분산되는 나노입자를 사용하여 표적 세포로 트랜스펙션됨으로써 해당 유전자를 암호화하는 핵산이 표적 세포에서 발현되도록 할 수 있다.
폴리펩티드 카고 분자
무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 나노입자는 펩티드 또는 폴리펩티드, 예를 들어 단백질 항원 또는 시토카인인 카고 분자를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 사용된 폴리펩티드는 모노머가 아미노산이고 아미드 결합을 통해 함께 연결되는 폴리머를 포함한다. 폴리펩티드를 형성하는 아미노산은 비천연 아미노산, 예컨대 β-알라닌, 페닐글리신 및 호모아르기닌을 포함할 수 있거나, 또는 핵산으로 암호화되지 않는 아미노산, 및/또는 반응성 그룹, 글리코실화 부위, 폴리머, 치료 모이어티, 바이오분자 등을 포함하도록 변형된 아미노산이 또한 본 발명에 사용될 수 있다. 본 발명에 사용된 모든 아미노산은 D- 또는 L-형일 수 있다. 자연 발생 L-이성체의 사용이 일반적으로 바람직하다.
기재된 방법은 단일 아미노산 및 펩티드로부터의 모든 크기 또는 타입의 폴리펩티드에서 분자량이 100 kDa 이하 또는 초과인 폴리펩티드 및 단백질 및 예외적인 경우로 예컨대 백만 kDa 이하 또는 초과의 페리틴까지 적용가능하다. 따라서, 편의상, 본원의 방법은 일반적으로 "폴리펩티드"를 참조하여 기술되지만, 이는 당업계에서 종종 펩티드로서 칭해지는 더 짧은 서열의 아미노산 (예컨대, 2, 3, 4, 5 또는 10 길이의 아미노산에서 30, 40 또는 50 길이의 아미노산까지) 뿐 아니라 일반적으로 단백질로서 칭해지는 더 큰 폴리펩티드도 포함하도록 취해져야 한다. 이 용어는 또한 일반적으로 단백질로서 칭해지는 이차, 삼차 또는 사차 구조를 가지는 폴리펩티드뿐만 아니라, 다중 도메인 단백질 또는 질환 과정에서 중요한 다른 단백질 및 폴리펩티드를 포함하도록 해석되어야 한다.
적합한 폴리펩티드 부류의 예는, 예를 들어 컨디셔닝 및 세포 재학습을 위한 인터페론, 인터류킨, 케모카인, 림포카인 및 시토카인, 알레르겐 (즉, 경구 또는 전신성), 박테리아성 단백질 및 자가면역 단백질을 포함한다.
카고 분자로서의 미생물-관련 분자 패턴
무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물은 미생물-관련 분자 패턴 (MAMP), 예컨대 펩티도글리칸을 포함하는 카고 분자를 전달하는데 사용될 수 있다. MAMP의 예는 리포폴리사카라이드, 뮤라밀 디펩티드, 리포토케인산 또는 세포 톨-유사 수용체 및/또는 세포내 NOD-유사 수용체 및 관련 패밀리 구성원이 관련될 수 있는 임의의 분자를 포함한다. MAMP는 세포 환경에 따라 그의 염증성 (보조) 또는 항-염증성 (관용원성)을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어 위장관에서 불이행은 관용원성중 하나이다. 주변부에서, 이는 면역 반응중 하나이다. 당업계에는 배양시 세포가 그의 소화관 면역-관용원성 상태를 시도 및 모방하기 위해 컨디셔닝될 수 있음이 알려져 있다. 펩티도글리칸은 본 발명에 따른 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물을 사용하여 적절한 컨디셔닝에 의해 생체내 또는 생체외에서 표적 세포로 전달될 수 있고 이에 의해 관용원성 신호가 관심 세포에서 유도될 수 있다. 예를 들어, IL-10은 분비될 수 있고, PD-L1은 상향-조절될 수 있다. 추가로 입자가 항원을 가지는 경우 제시된 항원에 대한 T 세포 반응은 유용하게 관용원성일 수 있다. 이러한 경로가 작동되지 않을 수 있는 크론병과 같은 병태에서는, 본원의 다른 곳에서 추가 검토된 다른 물질이 고려될 수 있다.
카고 분자로서의 소분자
무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물은 영양소와 같은 소분자의 포획 및 전달을 위해 유의미하게 사용될 수 있다. 이는 여러면에서 유익할 수 있다. 첫째, 영양소는 영양면에서 혜택을 가지는 칼슘, 특히 마그네슘, 규소 및 비타민 D와 상승작용을 한다. 둘째, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물은 영양소가 나노입자에 의해 소화 (본 발명의 조성물이 위에서 용해되어 분산)되는 것으로부터 부분적으로 또는 완전히 보호하여 위산이 조성물내 영양소에 대해 작용하는 시간을 지연시킬 수 있다. 추가의 예는 경구적으로 또는 비경구적으로 투여되는지에 상관없이 AMCP 입자를 특이적으로 소거하는 세포에 소분자, 예컨대 영양소, 아미노산, 핵산 (그의 서열 포함)의 표적화 전달을 포함한다. APC 및 세망-내피 세포는 특히 이러한 방식으로 표적화될 수 있다.
무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 물질의 합성
봉입된 생물학적 활성 카고 물질을 함유하는 본 발명에 따른 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 물질의 합성은 [Boskey and Posner (1973, 1974)]에 기재된 방법으로부터 개조할 수 있는데, 여기에서의 물질은 생물학적 활성 카고 물질을 봉입하지 않고 그 방법에 일부 추가 개선이 있다는 차이가 있다. 개괄적으로, 본 발명의 방법은 무정형 상에서 인산칼슘의 안정화를 위해 마그네슘 이온 (Mg2 +)을 사용한다. 그러나, 본 발명자들은 생물학적 활성 카고 물질이 마그네슘 이온 (Mg2 +)에 의해 제공되는 것을 넘어서는 추가 안정화를 제공할 수 있고, 침전된 물질을 건조하는 단계의 효율성이 무정형 상을 보존하는데 중요한 역할을 한다는 것을 발견하였다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은
(a) 칼슘 이온 (Ca2 +), 마그네슘 이온 (Mg2 +)을 포함하는 용액 및 인산염 이온 (PO4 2-)을 포함하는 용액을 제공하는 단계로서, 상기 용액 중 어느 하나 또는 둘 다 하나 이상의 생물학적 활성 카고 물질을 포함하는 단계;
(b) 칼슘 이온 (Ca2 +), 마그네슘 이온 (Mg2 +)을 포함하는 용액과 인산염 이온 (PO4 2-)을 포함하는 용액을 혼합하여 생물학적 활성 카고 물질이 봉입된 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘을 침전시키는 단계;
(c) 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘을 회수하는 단계; 및
(d) 임의로 카고 물질이 봉입된 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘을 세척 및 건조하는 단계
를 포함하는, 봉입된 생물학적 활성 카고 물질을 함유하는 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물의 제조방법을 제공한다.
편의상, 칼슘 이온 (Ca2 +), 마그네슘 이온 (Mg2 +) 및 생물학적 활성 카고 분자를 포함하는 용액을, 예를 들어 Tris, HEPES, BICINE, TRICINE 또는 시트르산 완충액, 또는 아미노산, 예컨대 리신 또는 글리신을 사용하여 약 pH 7.5 내지 pH 10의 pH, 및 더 바람직하게는 약 8.0의 pH에서 완충시킨다. 이는 50 mM 내지 300 mM 범위의 농도에서 Tris, 예를 들어 약 150 mM Tris 완충액을 사용하여 달성할 수 있다. 일반적으로, 칼슘 이온 (Ca2 +)의 농도는 5 mM 내지 200 mM, 예를 들어 약 17.7 mM이다. 일반적으로, 마그네슘 이온 (Mg2 +) 대 칼슘 이온 (Ca2 +)의 비는 적어도 1:25, 임의로 적어도 1:20, 임의로 적어도 1:10, 임의로 적어도 1:5, 임의로 적어도 1:4 및 임의로 적어도 1:3이다. 생물학적 활성 카고 분자의 농도는 침전된 나노입자에 포획하기를 희망하는 분자의 양에 좌우된다. 예로서, 생물학적 활성 카고 분자가 치료적 활성 분자인 적용에서, 농도는 일반적으로 생물학적 활성 카고 분자가 기능성 식품(nutraceutical) 분자인 적용에 대한 것보다 낮다.
인산염 이온 (PO4 2-) 용액의 농도는 5 mM 내지 200 mM, 예를 들어 약 20 mM이고, 일반적으로 칼슘 이온 (Ca2 +), 마그네슘 이온 (Mg2 +) 및 생물학적 활성 카고 분자를 포함하는 용액과 동일한 완충액 용액에서 완충된다. 칼슘 용액에 인산염 이온 (PO4 2-) 용액을 신속히 첨가하여 무정형 인산칼슘 (ACP) 상이 형성되는 동안 Ca2 + 및 PO4 2-의 비가 일정하게 유지되도록 한다. 안정화제의 부재에서, 이는 보통 더 결정성 상인, 예컨대 하이드록시아파타이트로 신속히 전환될 수 있다. 이러한 전환은 합성시 마그네슘 이온 (Mg2 +)을 첨가함으로써 방지되거나, 또는 적어도 제한될 수 있는데, 인산칼슘 광물에 도입됨으로써 격자가 붕괴되고 표면 재형성이 감소된다 (도 7A, B).
마그네슘 이온 (Mg2 +)에 의한 무정형 인산칼슘으로의 안정화는 [Boskey & Posner (1974)]에 의해 최초로 연구되었지만, 본 발명자들은 놀랍게도, 나노입자의 다공성 구조가 다양한 상이한 종류의 생물학적 활성 카고 분자를 도입할 수 있음을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 나노입자의 구조내에 봉입된 카고 물질이 합성 동안 및 후속 건조 및 저장 동안 무정형 상을 추가로 안정화한다는 것도 발견하였다. 이는 본 발명의 방법을, 무정형 인산칼슘 상을 안정화하는데 예를 들어 17.7 mM Ca 당 1.8 mM의 Mg를 필요로 하는 것으로 밝혀진 [Boskey & Posner]에 의한 것보다 더 낮은 마그네슘 이온 (Mg2 +)의 농도에서 사용할 수 있게 허용한다. 그러나, 일반적으로, 제조된 나노입자의 안정성을 향상시키는데 더 높은 마그네슘 이온 (Mg2 +)의 농도가 바람직하다.
편의상, 본 발명에 따른 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물의 회수는 원심분리 또는 여과에 의해 수행할 수 있으며, 이어 조성물을 세척한 다음, 부분적으로 또는 완전히 건조한다. 이러한 조작의 용이성은 합성 동안 나노입자가 적절히 재수화되는 경우 나노 형태로 재분산될 마이크론-크기 응집체의 일시적 집합체로 되기 때문에 가능하다. 유리하게, 세척 및 건조 단계는 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물로부터 물을 제거하는데 도움을 주기 위해 하나 이상의 아세톤 세척제를 사용하여 수행할 수 있다. 본 발명자들은 이를 달성하는 방식이 조성물을 아세톤 (바람직하게는 약 10의 pH)에서 재슬러리한 후, 원심분리를 이용하여 조성물을 건조하는 것임을 발견하였다. 조성물의 최적의 안정화를 위해, 아세톤 세척 단계는 2회 반복되었다 (하기 표 1 참조).
[표 1]
150 mM Tris (pH 8)에서 17.7 mM Ca2 +, 19.7 mM PO4 2-로부터 제조된 물질의 광물 상에 Mg 농도, 단백질 및 아세톤 건조가 미치는 효과. 이들 결과에 기초해, 아세톤 재슬러리화는 물을 제거함으로써 상을 안정화하고, 따라서 1회 아세톤 재슬러리는 물질로부터 충분한 물을 제거하기 위해 제공되는 2회-슬러리화 단계와 등가적인 효과를 가질 수 있다.
Figure pct00002
*NS = 합성되지 않음
표 2는 합성시 및 최종 물질에서 Mg:Ca 비를 측정한 실험 결과를 나타낸다.
[표 2]
스톡 용액 및 AMCP의 합성 후 ICP로 결정된 Mg:Ca 및 P:Ca 비
Figure pct00003
N/A: 해당 없음
* 단백질에서 유래된 [Mg]
본 발명자들은 추가로 카고 분자의 도입이 수성 환경에서 물질의 상 안정성을 증가시킨다는 것을 발견하였으며, 이는 생물의학적 적용에 유용하다. 이것은 조직 배양 배지에서 예시되었으며, 여기서는 단백질 카고 분자, 이 경우 단백질 소 혈청 알부민이 부하된 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 나노입자가 상응하는 비부하 무정형 마그네슘-치환된 인산칼슘보다 하이드록시아파타이트 (HA)로 전환하는데 상당히 더 긴 시간을 필요로 하였다 (표 3).
[표 3]
조직 배양 배지에서 pH 10.0에서 상술된 프로토콜에 따라 제조되고 아세톤으로 2회 세척된 뒤 오븐에서 밤새 건조된 Mg-안정화된 ACP ([Mg]=3.6 mM)의 상 안정성에 미치는 단백질 도입의 효과.
Figure pct00004
원심분리 및 pH 10.0 물로 2회 세척된 샘플
D10 (합성 혼합물과 동일 부피)에 재현탁된 샘플
원심분리 및 pH 10.0 물로 세척된 샘플
원심분리 및 아세톤으로 2회 세척된 샘플
오븐에서 밤새 건조
또한, 본 발명자들은 합성시 pH를 pH 8.0을 초과하여 증가시키면 [Boskey & Posner (1974)]에 의해 사용된 바와 같이 pH 8.0에서 합성된 상응하는 물질에 비해 상 안정성이 개선된 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물을 제공할 있음을 발견하였다. 따라서, 단계 (a) 및/또는 (b) 동안 pH가 7.5 초과, 바람직하게는 적어도 pH 8.0, 더 바람직하게는 적어도 pH 8.5, 및 가장 바람직하게는 적어도 pH 9.0인 것이 바람직하다.
제제 및 용도
본 발명에 따른 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물은 봉입된 카고 물질, 예컨대 카고 분자 또는 카고 나노입자를 전달하기 위한 약제로서의 용도를 위해 제제화될 수 있고, 시험관내 및/또는 생체내에서 카고 분자에 반응하는 병태를 치료 및/또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 다른 곳에서 기술된 바와 같이, 진단 적용에 사용하기 위한 조성물이 또한 개시된다. 따라서, 본 발명의 조성물은 또한 본 발명에 따른 하나 이상의 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물, 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 완충액, 안정화제 또는 당업자에게 주지인 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 비독성이어야 하고, 해당 적용을 위해 고체상 물질의 효능을 크게 방해하지 않아야 한다.
담체 또는 다른 성분의 정확한 특성은 조성물의 투여 방식 또는 경로와 관련될 수 있다. 이들 조성물은 위장 전달, 특히 경구적 및 경비위 전달; 주사를 포함한 비경구적 전달; 또는 이 목적 또는 주로 이러한 혜택을 가지고 다른 목적을 위해 사용될 수 있는 보철을 비롯한 특정 부위에서의 임플란트를 포함하나 이들에 제한되지 않는 다양한 전달 경로에 의해 전달될 수 있다. 특히, 조성물은 유전자 트랜스펙션 또는 핵산 서열의 도입, 백신접종, 치료제 전달, 동일 또는 상이한 수령자로의 재주사를 위한 세포의 생체외 조작 및 영양소 전달에 사용될 수 있다. 특히, 조성물은 백신접종에, 자가면역 질환의 치료 또는 예방에, 암 요법의 일부로서, 식품 알레르기 및/또는 탈감각화를 비롯한 과민증(intolerance)의 치료에, 염증성 장 질환, 가장 특히 크론병의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명은, 주로 위장관에 존재하는 세포, 예컨대 파이어판 및 장관막 림프절에 존재하는 세포, 회장 및 맹장의 맹장 패치, 특히 충수와 같은 장소에서 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물이 광범위 치료 물질을 전달하는데 사용되는 의학적 용도를 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 암의 치료 또는 예방을 위해, 특히 백신 조성물로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 골수성 백혈병의 치료를 위한 백신으로 사용될 수 있다. 이는 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 림프모구성 백혈병 및 급성 골수성 백혈병 (AML)과 같은 골수성 백혈병에서 필라델피아 염색체의 형성으로 인한 BCR-ABL (Breakpoint Cluster Region - Abelson)의 융합 단백질인 카고 분자의 사용을 포함할 수 있다. 그의 부분 또는 합성 유사체를 비롯한 BCR-ABL 융합 단백질은 AMCP 내에 도입될 수 있으며, 이상 암 융합 단백질에 대한 강건한 적응 면역 T 세포 반응을 유도하기 위해, 임의로 면역-자극 (관용성 파괴)제, 예컨대 MAMP와 조합될 수 있다. 치료적 백신접종을 위한 카고 분자로서 사용될 수 있는 다른 암 융합 단백질 표적은 GAG-ONC (라우스 육종 바이러스)이다. 이들 단백질에 대한 상세한 설명은 다음에서 이용할 수 있다:
GAG-ONC:
http://www.nlm.nih.gov/cgi/mesh/2011/MB_cgi?mode=&term=gag-onc+Fusion+Proteins
BCR-ABL:
http://www.nlm.nih.gov/cgi/mesh/2011/MB_cgi?mode=&term=Fusion+Proteins,+bcr-abl&field=entry#TreeD12.776.602.500.500.100
추가 실시형태에서, 본 발명은 치료 백신접종을 사용하여 자가면역 T 세포 및 자가 항체 반응에 대한 내성을 유도함으로써 자가면역 질환의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 다발성 경화증에 대한 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE) 뮤린 모델을 사용한 선행 연구에서 자가면역 신경-항원 표적에 대한 치료 백신접종이 경구 경로를 통해 이뤄질 수 있다 (Song et al., The Peyer's patch is a critical immunoregulatory site for Mucol Tolerance in Experimental autoimmune encephalomylelitis (EAE). J. Autoimmun. 2008 June;30(4):230-7.)
일 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 치료 백신접종에 의해, 예를 들어 하나 이상의 자가면역 중추신경계 신경-항원 단백질을, 임의로 자가면역 표적에 대해 관용원성 T 세포 반응을 유도하기 위해 하나 이상의 관용성 유도제, 예컨대 펩티도글리칸과 함께 AMCP에 도입함으로써 다발성 경화증의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 예로서, 특히 다발성 경화증의 치료에 관련되는 신경-항원 단백질은 미엘린 염기성 단백질 (MBP), 프로테오리피드 단백질 (PLP), 미엘린 희돌기교세포 당단백질 (MOG), 미엘린-관련 당단백질 (MAG), S100β 당단백질 (SB), 희돌기교세포-미엘린 당단백질 (OMGP), 미엘린-관련 희돌기교세포 염기성 단백질 (MOBP), αβ-수정질 (CRAB) 및 2'-3'-사이클릭 뉴클레오티드 3'-p포스포디에스테라제 (CNP)를 포함한다 ([Crawford et al., High prevalence of autoreactive, neuroantigen-specific CD8+ T cells in multiple sclerosis revealed by novel flow cytometric assay. Blood 2004 Jun 1;103(11):4222-31] 참조). 따라서, 이들 단백질, 또는 그의 생물학적 활성 단편의 하나 이상이 카고 분자로서 사용될 수 있다.
추가 실시형태에서, 본 발명은 염증성 장 질환, 예컨대 크론병 및 셀리악병의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 셀리악병과 같은 염증성 장 질환의 치료 또는 예방용 치료 백신접종은 글리아딘, 밀에서 발견되는 프롤라민 (글루텐 단백질), 또는 트리티세아(Triticeae) 종의 작물 (예컨대 보리 및 호밀)에서 발견되는 유사 단백질을 관용성 유도제 (예컨대 펩티도글리칸)의 존재 또는 부재하에 AMCP에 도입하여 자가면역 표적에 대한 관용원성 T 세포 반응을 유도함으로써 수행될 수 있다. [Di Sabatino et al. (The Lancet - 25 April 2009 (Vol. 373, Issue 9673, Pages 1480-1493)] 참조.
추가 실시형태에서, 본 발명은 1형 당뇨병의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 1형 당뇨병의 치료 또는 예방용 치료 백신접종은 글루탐산 데카복실라제 (GAD) 이소형 GAD67 및 GAD65를 관용성 유도제 (예컨대 펩티도글리칸)의 존재 또는 부재하에 AMCP에 도입하여 자가면역 표적에 대한 관용원성 B 세포 반응을 유도함으로써 수행될 수 있다. [Kaufman et al. (Autoimmunity to two forms of glutamate decarboxylase in insulin-dependent diabetes mellitus. J. Clin. Invest., 1992;89(1):283-292.)] 참조.
추가 실시형태에서, 본 발명은 전신 홍반성 루푸스 (SLE)와 같은 자가면역 증상의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다. SLE의 치료 또는 예방용 치료 백신접종은 HMGB1 (High Mobility Group box 1) 및 다른 소핵 리보핵산 단백질 (nRNP, 루푸스 및 다른 자가면역 질환에서 자가항체의 공통 표적)을 관용성 유도제 (예컨대 펩티도글리칸)의 존재 또는 부재하에 AMCP에 도입하여 자가면역 표적에 대한 관용원성 B 세포 반응을 유도함으로써 수행될 수 있다. [Poole et al., Early Targets of nRNP Humoral Autoimmunity in Human Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis Rheum. 2009 March; 60(3): 848-859] 참조.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물은 카고 물질을 이를 우선적으로 흡수하는 세포형 또는 생물학적 위치에 전달하기 위해 사용될 수 있다. 이들은 회장과 같은 위장관의 위치에 존재하는 파이어판 및 장관막 림프절 및 맹장의 맹장 패치, 특히 충수를 포함한다.
경구용 약학 조성물은 정제, 캅셀, 분말, 겔, 액체 형태, 스프링클 또는 적합한 식품으로 하여 투여될 수 있다. 정제는 고체 담체, 예컨대 젤라틴, 또는 보조제를 포함할 수 있다. 캅셀은 장용 코팅과 같은 특수 성질을 가질 수 있다. 액체 약학 조성물은 일반적으로 물, 석유, 동물 또는 식물성 오일, 광유 또는 합성 오일과 같은 액체 담체를 포함한다. 생리 식염수 용액, 덱스트로즈 또는 다른 사카라이드 용액, 또는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜이 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 나노입자가, 예컨대, 물질의 성분 전달을 조절하기 위해 고체 형태로 유지되는 것을 요하는 경우, 제제의 성분들을 선택하는 것이 필요할 수 있으며, 예컨대, 물질의 액체 제제가 제조되는 경우도 그에 따른다. 물질이 식품과 함께 투여되는 경우, 제제 성분들은 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물과 상용성이고 적합한 물리화학적 및 관능적 특성을 제공하도록 선택될 것이다.
정맥내, 피부 또는 피하 주사, 또는 질환 부위로의 주사의 경우, 활성 성분은 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물 내에 있는 것은 예외로 발열물질이 없고 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 가지는 비경구적으로 허용가능한 수용액 또는 현탁물의 형태일 것이다. 관련 업자들은 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 락트산 첨가 링거 주사액과 같은 등장성 비히클을 사용하여 적합한 용액을 용이하게 제조할 수 있을 것이다. 방부제, 안정화제, 완충액, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 필요애 따라 포함될 수 있다.
개체에 투여하기 위한 본 발명에 따라 사용된 물질 및 조성물은 바람직하게는 "예방적 유효량" 또는 "치료적 유효량"으로 투여되며 (경우에 따라 예방이 치료로 간주될 수도 있음), 이는 개체의 임상적 상태에 혜택을 나타내기에 충분한 것이다. 실제 투여량과, 투여 속도 및 시간적 경과는 치료 대상체의 특성 및 중증성에 따라 달라질 것이다. 용량 등의 결정은 일반 의사 및 기타 의학 박사의 책임 범위 내에 있으며, 일반적으로 치료할 질환, 개별 환자의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 의사가 알고 있는 다른 인자들을 고려한다. 상기에 언급된 기술 및 프로토콜의 예는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins]에서 참조할 수 있다. 조성물은 치료할 병태에 따라 단독으로, 또는 다른 치료제와 함께 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물의 사용예는 식이 무기질 보충제 및 강화제; 치료 무기질 보충제 (예컨대, 정맥내 및 경구 경로에 의해 투여); 약물, 영양소 또는 화장품 담체/코-복합체; 인산염 결합제; 기타 결합 또는 격리 적용; 식품 첨가제; 발한억제제; 햇빛차단제; 백신 조성물 보조제; 면역-조절제; 박리제를 포함한 직접 화장품 적용; 뼈 및 치아용 충전물/시멘트; 근접치료를 포함한 임플란트 물질, 및 영상화제 및 조영제의 전달을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물은 영양 또는 의학적 혜택을 위한 보충용 전달 플랫폼으로서 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명은 카고 물질로서 나노입자, 예를 들어 금속-기반 또는 금속 옥소-하이드록사이드 기반 나노입자를 채용한다. 이들은 영상용으로, 예를 들어 본 발명의 조성물이 투여된 대상체에 존재하는 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘을 추적하기 위해 사용될 수 있다. 모든 구성에서, 그러나 가장 특히는 강화제를 위해, 후속 제제는, 예컨대 물질이 그의 의도하는 용도에 맞게 보호 코팅 (예컨대, 리피드)의 추가가 필요할 수 있다. 예를 들어 조성물은 경구 투여용으로 캡슐화될 수 있다.
장 건강 및 질환, 특히 크론병에서 PD-L1의 역할
항원 제시 세포 (APC)는 MHC의 그루브에서 그의 표면상에 폴리펩티드를 처리하여 제시할 수 있는 가용성 및/또는 미립자 단백질 항원을 획득한다. 이어 T 세포는 그의 T 세포 수용체 (TCR)를 통해 MHC와 결부되어 MHC-항원-TCR 복합체를 형성할 수 있다. 정확히 T 세포가 어떻게 반응하는지는 인자들의 수에 좌우되며, 중요한 것은 다른 표면 분자로부터의 공동 자극 신호이다.
위장관에서, 단백질 항원이 접하고 APC에 의해 T 세포에 제시되는 중요한 한 영역은 림프 여포인 것으로 알려져 있으며, 그의 예로는 회장의 파이어판 및 맹장의 맹장 패치, 특히 충수를 들 수 있다. 위장관에서의 일반적인 반응은 소화관이 노출되는 모든 유익한 항원 (예컨대, 환경 및 식품 단백질에 살고있는 우호적인 박테리아)에 대해 활성 면역 반응을 방지하기 위한 면역-관용중 하나인 것이 또한 알려져 있다. 항원 제시 세포 (APC)에서 발현되는 예정사 리간드 1 (PD-L1)은 일반적으로 T 세포에 강한 면역-관용 신호를 제공하는 공동 자극 분자이고, 위장관에서 관용성 유지를 돕기 위한 후보 분자중 하나이다. 본 발명의 일 양태에서, 본 발명자들은 내인성 인산칼슘 나노광물질의 존재로 인해 칼사인으로 염색된 파이어판의 세포가 장 림프 여포의 세포를 수용하는 대표적인 항원이고, 보통 특징적이고 주로 고수준의 PD-L1을 발현하는 것을 발견하였다. 이들 세포는 주로 이러한 소화관 영역에서 수지상 세포 집단의 전형인 CD11b 및 CD11c 양성이고, 소수는 성숙 대식세포의 전형인 CD68 양성이다. 합쳐 생각하면, 이들 관찰결과는 (a) 인산칼슘 나노입자에 의해 항원이 림프 여포 면역 세포로 흡수 및 제시되고, (b) 항원이 관용원성 배경에 제시되도록 보장하는데 PD-L1이 이들 특이적 세포에서 중요한 역할을 한다는 것과 일치한다.
놀랍게도, 본 발명자들은 이제 크론병에서, 이들 세포가 거의 항상 PD-L1에 대해 음성이거나, 또는 매우 낮은 수준을 발현함을 발견하였다. 이는 이들 영역, 즉 장 림프 여포에서 PD-L1 신호전달의 장애가 크론병 원인병론에서 환자에게 치료적 유용성을 제공하기 위해 교정될 수 있는 기본적 이상임을 제시한다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 소화관에 존재하는 항원-제시 면역 세포에서 PD-L1의 발현을 증가시킬 수 있는, 크론병의 치료 방법에 사용하기 위한 약제를 제공한다. 일부 실시형태에서, 약제는 본원에 기재된 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 나노입자를 사용하여 세포에 전달됨으로써 이들 세포에 의한 그의 선택적인 흡수의 이점을 취할 수 있다.
설명으로서, 예정 세포사 리간드 1 ('PD-L1')은 290개의 아미노산 단백질을 암호화하는 유전자를 가진다. CD274로도 지칭되는 주요 PD-L1은 B7:CD28 공-수용체 분자의 상과에 속하며, 그의 수용체 PD-1에 결합한 경우 시토카인 생산 및 TCR 신호전달을 감소시킴으로써 T 세포 기능 억제제로서 작용한다.
PD-L1 (유전자명 CD274; 동의어 B7H1, PDCD1L1, PDCD1LG1, PDL1 및 때로 PD-1 리간드 1으로도 지칭됨)에 대한 HUGO 유전자 부호 보고는 PD-L1 핵산 및 아미노산 서열에 대한 연결이 제공되었을 뿐만 아니라 뮤린 및 래트 상동체가 언급된 http://www.genenames.org/data/hgnc_data.php?hgnc_id=17635에서 확인할 수 있다. 전장 인간 PD-L1의 아미노산 서열이 UniProt Knowledgebase 내 서열 번호 1 (식별자 Q9NZQ7-1)에 나타나 있으며, 선택적 스플라싱에 의해 생산된, 다음과 같은 표준 서열과 상이한 2개의 다른 이소형도 기재되어 있다: 이소형 2에는 아미노산 19-132이 누락되었고 (식별자: Q9NZQ7-2), 이소형 3에는 178번 위치에 아미노산 교환 (178-178: K D)이 일어났으며 아미노산 179-290이 누락되었다 (식별자: Q9NZQ7-3).
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따라서, 일 양태에서, 본 발명은 PD-L1의 발현을 상향 조절하기 위해 장 림프 여포의 이들 항원 제시 세포를 처리하는 것이 크론병의 치료 또는 예방에 상당한 치료적 유용성을 가질 수 있다는 새로운 발견에 기반한다. 따라서 생체내 나노광물질을 모방하는 본 발명에 따른 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 물질은 봉입된 카고 물질로서 PD-L1 발현을 상향 조절할 수 있는 약제를 전달하기 위해 사용될 수 있으며, 치료를 필요로 하는 바로 그 장 림프 여포 세포를 표적화하는 이점을 가진다. 이러한 치료는 제안된 '펩티도글리칸 차단'이 일반적으로 크론병, 또는 실제 염증성 장 질환에서 PD-L1 발현 장애의 근본적인 역학적 이유로 증명되면 그것을 건너뛰는 것이 필요할 수 있다.
일부 예로서, PD-L1을 유도할 수 있는 약제는 당업계에 공지되었다. PD-L1은 인간 세포에서 1형 인터페론, 예컨대 IFN 감마에 의해 유도된다 (Seung-Jin Lee et al 2006, Dong et al 2002). 이 경로는 인간 담관 상피 세포에서 마이크로RNA-513을 사용하여 PD-L1 발현을 유도 또는 억제하는데 성공적으로 조작되었다: miRNA-513에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드로 담관 상피 세포의 트랜스펙션으로 PD-L1 발현이 유도되었다 (Gong et al 2009).
바이러스 dsRNA, 폴리이노신-폴리사이티딜산 (폴리 IC)의 유사체는 상피 세포내 핵 인자 κB(NF-κB)의 활성화를 통해 B7-H1의 발현을 상향 조절한다 (Keiko Kan-o et al 2013). 유사하게, HIV와 같은 바이러스 감염은 APC 상에 PD-L1의 바이러스적으로 유도된 상향 조절과 연관된다 (Trabattoni et al 2003, Seyerl et al 2010).
또한, 미코박테리아 감염은 APC에서 PD-L1 발현을 유도한다 (Sakai et al 2010). 이는 무엇보다 특히 PPD가 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 형태로 존재하는 경우, 심지어 미코박테리아 단백질 산물, 예컨대 튜베르쿨린 (PPD)의 단백질 정제된 유도체로 자극하여 APC 상의 PD-L1을 상향 조절함으로써 행해질 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 다음 중 하나 이상이 가능할 수 있는 약제에 관한 것이다:
(a) PD-L1의 발현 상향 조절; 또는
(b) PD-L1 단백질의 활성화; 또는
(c) PD-L1의 억압 억제; 또는
(d) 일반적으로 크론병, 또는 염증성 장 질환의 치료 방법에 사용하기 위한, 장 림프 여포의 항원 제시 세포 상에서 PD-L1의 활성화.
관련 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 물질 내에 카고 물질로서 봉입된 상기 약제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
첫 번째 접근법에서, 본원에 기재된 치료는 표적 세포에서 PD-L1 발현을 유도하기 위해 유전자 요법: 본원의 다른 곳에서 상세히 기술된 유전자 요법을 이용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이것은 PD-L1을 저수준으로 발현하거나 발현하지 않는 표적 세포로의 전달을 위해 본 발명의 합성한 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물에 도입된 PD-L1을 암호화하는 핵산을 포함하는 카고 물질을 수반할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 이러한 양태에 따른 유전자 요법의 방법은 야생형 PD-L1에 의해 제공되는 효과를 제공하고 크론병을 치료하거나 또는 이러한 병태의 새로운 발병을 억제하기 위해서, 활성 폴리펩티드를 합성할 수 없거나 이를 정상 수준으로 합성할 수 없는 환자를 치료하기 위해 생물학적 활성 PD-L1 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 사용할 것이다.
유전자를 각종 상이한 표적 세포로 도입하기 위해 종래 기술에서는 바이러스 벡터와 같은 벡터가 사용되었다. 전형적으로 벡터는 트랜스펙션이 목적하는 폴리펩티드의 발현으로부터 유용한 치료 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 비율의 세포에서 일어날 수 있도록 표적 세포에 노출된다. 트랜스펙션된 핵산은 각각의 표적화된 세포의 게놈에 영구 도입되어 오래 지속되는 효과를 제공할 수 있거나, 또는 대안적으로 처리가 주기적으로 반복되어야 할 수도 있다.
모두 바이러스 벡터 및 플라스미드 벡터인 다양한 벡터가 당업계에 공지되었으며, 미국 특허 제5,252,479호 및 WO93/07282호를 참조할 수 있다. 특히, 파포바바이러스, 예컨대 SV40, 우두 바이러스, HSV 및 EBV를 포함한 헤르페스바이러스, 및 레트로바이러스를 비롯한 다수의 바이러스가 유전자 도입 벡터로서 사용되고 있다. 종래 기술에서의 많은 유전자 요법 프로토콜은 무능화 뮤린 레트로바이러스를 사용하고 있다.
바이러스 벡터의 사용에 대한 대안으로, 핵산을 세포로 도입하는 공지된 다른 방법은 전기천공법, 인산칼슘 공-침전, 마이크로인젝션, 리포좀에 의해 매개되는 이입 및 직접 DNA 흡수 등의 기계적 기술, 및 수용체-매개 DNA 이입을 포함한다. 또한, 본 발명은 본원에 기재된 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물을 사용하여 PD-L1 핵산 서열을 표적 세포에 전달하는 추가의 수단을 제공한다.
상기 언급한 바와 같이, PD-L1 폴리펩티드, 또는 그의 활성 부분을 암호화하는 핵산을 사용하는 유전자 요법의 목적은 야생형 PD-L1 폴리펩티드의 양이 존재하지 않거나 단지 저하된 수준으로 존재하는 세포에서 핵산의 발현 산물의 양을 증가시키는 것이다.
두 번째 접근법에서, 요법은 PD-L1 유전자의 프로모터 영역을 활성화하여 이를 단백질로서 발현하는 약제일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이는 본 발명의 합성한 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물에 도입된 카고 물질로서 사용되는 약제를 포함할 수 있다. PD-L1 발현 활성화 인자는 본원에 기재된 스크리닝 방법을 이용하여 찾을 수 있다.
세 번째 접근법에서, 처리는 PD-L1을 유도하는 것으로 알려져 있기 때문에 MAMP를 포함할 수 있다. MAMP의 예는 본원의 다른 곳에 제시되었다. 펩티도글리칸, 및 펩티도글리칸 단편은 상술한 이유로 유용한 MAMP일 수도 아닐 수도 있다. 일부 실시형태에서, 이는 본 발명의 합성한 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물에 도입된 카고 물질로서 사용되는 MAMP를 포함할 수 있다.
네 번째 접근법에서, 처리는 폴리 IC 및 인터페론 또는 다른 시토카인, 특히 I형 인터페론과 같이 PD-L1 발현을 유도하는 가용성, 콜로이드성, 나노미립자 또는 마이크로미립자 형태의 화합물 또는 화합물의 혼합물을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이는 본 발명의 합성한 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물에 도입된 카고 물질로서 사용되는 화합물을 포함할 수 있다.
다섯 번째 접근법에서, 처리는 PD-L1을 유도하는 생물학적 제제, 예컨대 바이러스 또는 박테리아, 또는 그의 약독화 형태, PPD와 같은 생물학적 제제의 혼합물 및/또는 균질물 또는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이는 본 발명의 합성한 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물에 도입된 카고 물질로서 사용되는 생물학적 제제를 포함할 수 있다.
여섯 번째 접근법에서, 처리는 크론병에서 PD-L1 발현의 억압을 억제하기 위한 처리를 포함할 수 있으며, 여기서 처리는 임의로 합성 마그네슘-치환된 인산칼슘의 카고이다. 일부 실시형태에서, 이는 본 발명의 합성한 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물에 도입된 카고 물질로서 사용되는 PD-L1 발현의 억압을 억제할 수 있는 약제를 포함할 수 있다.
당업자들에게는 이들의 방법이 단독으로 또는 임의의 조합으로 사용될 수 있다는 것이 자명할 것이다. PD-L1의 활성화를 추가 접근법은 하나 이상의 케모카인 또는 시토카인 (예컨대, 인터페론), 마이크로RNA (예컨대, miR-513), 펩티드, 단백질 또는 당단백질, 항체, 효소, 올리고뉴클레오티드 및/또는 siRNAs 또는 RNAi의 사용을 포함할 수 있다.
PD-L1 활성화 인자의 스크리닝 방법
본 발명은 크론병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 PD-L1의 발현을 증가시킬 수 있는 약제의 스크리닝 방법을 포함한다. 본원에서 설명한 바와 같이, PD-L1이 항원 제시 세포, 예컨대 수지상 세포 상에 존재하는 경우, 이는 그 세포에 의해 제시되는 항원에 관용성이 되도록 T-세포를 지시하는 표지로서 작용한다. 어떤 특정 이론에 구애됨이 없이, 본 출원에서의 결과는 PD-L1의 발현 수준 감소 또는 무발현은 이러한 관용성을 유도할 수 없고 따라서 크론병의 핵심인 염증을 일으킴을 나타낸다. 본 발명자들은 PD-L1의 발현 감소가 내강 항원을 수용하는 항원 제시 세포에서 PL-D1의 발현을 유도함으로써 크론병을 치료 또는 예방하는데 치료 표적인 것으로 판단한다. 일 실시형태에서, 이 접근법은 PD-L1 기능 또는 발현을 복원할 수 있는 약제를 전달하기 위해 소화관에서 이러한 세포를 표적화하는데 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 나노입자의 성질을 이용할 수 있다.
당업자에게 치료제가 장 림프 여포에서 실제로 공동 자극 분자 발현, 예컨대 PD-L1 발현을 증가시키는지를 평가하기 위해 다수의 방법을 취할 수 있다는 것은 주지이다. 한가지 접근법은 처리후 림프 응집물을 절제 또는 생검하고, 예컨대 절편들의 면역염색법에 의해, 또는 취한 조직의 영역 또는 추출 세포의 ELISA 또는 유전자 발현 분석에 의해 PD-L1 또는 다른 발현을 비교하는 것을 포함할 것이다. 결과를 샴(sham) 처리 또는 위약 처리된 경우 또는 베이스라인에서 취한 샘플과 비교할 수 있다. 인간의 경우에는, 내시경 검사로 생검할 장 림프 응집물이 더 잘 식별되도록 전문적인 염료가 사용될 수 있다. 명백히, 이 기술은 크론병을 가진 환자에게 적용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 예컨대, 염증성 장 질환, 및 특히 크론병용 약제로서 차후 사용 또는 개발하기 위해 PD-L1 발현 또는 단백질 활성을 활성화할 수 있는 후보 약제를 확인하기 위해 PD-L1 활성화 인자를 찾을 목적으로 후보 화합물을 스크리닝하는 방법을 포함한다. 편의상, 이는 어세이 성분들의 상호작용을 돕기 위해 어세이 완충액에서, 그리고 복수 후보 약제들을 시험하기 위해 다중 웰 포맷으로 수행될 수 있다. 이어 주어진 후보가 PD-L1 발현 또는 PD-L1 단백질 수준 또는 활성을 증가시키는지의 여부를 결정하기 위해 PD-L1의 활성을 하나 이상의 후보 화합물의 존재 및 부재하에 결정할 수 있다.
PD-L1을 상향 조절하는 전달된 카고에 의해 어느 수용체가 표적 세포와 결부되어 발현되었는지를 이해하기 위해, 기술은 면역염색법 및 유전자 발현의 측정을 비롯한 수용체 발현의 조사를 이용할 수 있다. 그 후, 추가의 스크리닝 연구를 통해 수용체와 결부되어 PD-L1 발현을 이끌 적합한 카고에 도달할 수 있다.
일례로서, 본 발명의 이러한 양태에 사용하기 위한 적합한 카고 분자는 PD-L1의 공지 활성화 인자 또는 새로이 규명된 것일 수 있다. 조합 라이브러리 기술은 PD-L1과 같은 표적 단백질의 활성을 조절하는 능력에 대해 잠재적으로 방대한 수의 상이한 물질들을 시험하는데 하나의 효율적인 방식을 제공한다. 이러한 라이브러리 및 그의 사용은 당업계에 주지이다. 추가 연구를 위한 후보 약제의 확인 후, 해당 약제를 정상 세포에 치명적인지 아닌지, 또는 치료적 용도에 적합한지를 결정하기 위해 시험할 수 있다. 이러한 연구 및 생체내 요법에 대한 그의 선택을 확인하는 기타 연구 후, 약제를 제조할 수 있고/있거나, 의약, 약학 조성물 또는 복용형을 제조하는데 사용할 수 있다.
일부 실시형태에서, D-L1 활성화 인자에 대한 스크리닝 방법은 PD-L1을 발현할 수 있는 세포를 하나 이상의 후보 약제와 접촉시키고, 단백질 활성의 PD-L1 발현이 후보 약제에 대한 반응을 증가시키는지를 결정하는 단계를 포함하는 세포-기반 어세이를 사용할 수 있다. 방법은 PD-L1 발현 또는 단백질 활성을 증가시키는 후보 약제를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 적용은 이러한 스크리닝 방법에 사용하기 위한 적합한 세포형 및 표현형을 찾을 것이다. 당업계에서는 소화관 내 상피층 및 다른 부위로부터 국소 항원 제시 세포 (APC)가 이들 자체가 신호인 경우 관용 유도 표현형을 가지고 있는 것으로 여겨지는 신호가 유도된다는 것은 주지이다 (Iliev, 2009, 2009;, Rimoldi, 2005; Maheshwari, 2011). 이러한 과정을 모방할 수 있는 시험관내 조건은 공지되었다. 따라서, 혈구를 채취하고 약품 칵테일, 또는 상피 세포 배양물로부터의 실제 배지 (소위 상피 세포 조정 배지)로 사용할 수 있고, APC의 관용 촉진 표현형을 유도할 수 있다 (Mann et al., 2012; den Hartog et al., 2013; Zeuthen et al., 2008; Steinbrink, 1997). 마찬가지로 APC의 관용 촉진 과정을 파괴하는 것도 가능하다. 예를 들어, TNF 알파를 부가하여 크론병 과정을 모방할 수 있다 (Bkamias, 2013).
제1 접근법으로, PD-L1을 상향 조절할 수 있는 후보 약제는 종래 기술로부터 확인할 수 있다. 이들 약제를 단독으로 또는 본 발명의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물 내 카고 물질로서 조건화 APC와 접촉시킬 수 있다. 조건화 세포는 TNF알파 및/또는 다른 관용 파괴제의 존재 또는 부재하에 있을 것이다. PD-L1 조절은, 예를 들어 정량적 RT-PCR에 의해 유전자 상향 조절에 대해, 유세포 분석법과 함께 항체 염색법에 의해 단백질에 대해 평가될 것이다. 바람직하게는, PD-L1 발현을 향상시킬 수 있는 것으로 확인된 후보 약제는 APC의 관용 촉진 과정을 파괴하기 위해 TNFα와 같은 약제를 사용함에도 불구하고 상기 발현을 향상시킬 수 있다.
제2 접근법으로, 유사하지만, APC가 정상 또는 크론병 상피 세포 배양으로부터의 배지로 조건화된 방법이 수행될 수 있는데, 상기 상피 세포는 내시경에 의한 생검으로 또는 수술시에 유래된 것이다. 바람직하게는, PD-L1 발현을 향상시킬 수 있는 것으로 확인된 후보 약제는 크론병 상피 세포에 의해 조건화된 배지를 사용함에도 불구하고 상기 발현을 향상시킬 것이다.
제3 접근법으로, 크론병에 대한 다수의 동물 모델이 존재한다. 예를 들어, 그중 한가지가 [Adolph et al. 2013]에 의해 기술되었다. 파이어판 절편을 칼사인 및 PD-L1에 대해 염색함으로써 상이한 모델이 스크리닝될 것이다. 후보 약제를 치료제로서의 적합성에 대해 시험하기 위해 칼사인 양성 파이어판 APC에서 크론병에서 관찰된 것과 유사한 낮은 PD-L1 발현을 가지는 모델을 사용할 것이다. 이들은 본 발명의 합성한 마그네슘 치환된 인산칼슘 조성물 내에서 또는 밖에서 적용될 수 있고, 장용 코팅되어 또는 그 코팅없이 경구적으로, 또는 관류 또는 묶은 루프 실험 또는 유사한 외과적 실험에 적용될 수 있으며, 이때 잠재적 치료제는 파이어판과 1시간 이상 접촉된다. 이어 잠재적 치료 적용 후 파이어판을 특정 시기에 절개하고, 염색을 통해 단백질에 대해 및/또는 동소 하이브리드화를 통해 유전자 상향 조절로 PD-L1 발현의 변화를 평가할 수 있다. 임의로, 패치 영역 또는 심지어 절개한 단세포가 상술된 바와 같은 유세포 분석법 및/또는 유전자 분석 기술에 의해 평가될 수 있다.
제4 접근법으로, 크론병 환자에서, 임의로 합성 마그네슘-치환된 나노광물질 내에 도입되었거나 도입되지 않은 잠재적 치료제가 회장 및/또는 대장에서의 방출을 위해 필요에 따라 적절한 장용 코팅을 이용하여 경구적으로 또는 직장으로 적용될 수 있다. 처리는 1일, 바람직하게는 3일 및 가장 바람직하게는 1주 또는 그 이상으로 적용될 수 있고, 처리 전과 후에 장 림프 응집물을 생검하여 PD-L1 발현을 상술한 바와 같이 평가할 수 있다.
당업자에게는 크론병 환자의 장 림프 여포의 APC에서 PD-L1을 적절히 유도할 최적의 치료를 찾아내기 위해 상기의 전부 또는 일부가 사용될 수 있음은 자명할 것이다.
실험
파트 I: AMCP 나노입자의 내인성 조립체 발견 및 파이어판에서 장관강의 내인성 나노광물질의 역할
회장루 조성술 환자로부터 회수한 원위 소장 내용물을 주사 전자현미경법 (SEM)을 위해 플라스틱-코팅된 스터브 상에서 공기 건조하였다. 방대한 수의 마이크론 미만 크기 입자를 식별해 내고 그의 인산칼슘이 풍부한 원소 조성을 X-선 마이크로분석법 (XRMA)으로 확인하였다. 고배율 SEM은 입자들이 일반적으로 더 작은 나노미립자 구조체의 응집물임을 나타냈다.
동소 분산을 더 잘 모방하기 위해, 뮤린의 원위 소장이 매립된 비-수성 수지의 전체 단면을 조사하였는데, 해상도를 더 높이기 위해 투과 EM (TEM)을 사용하였다. 상대적으로 전자 밀도가 높은 고밀도 나노입자가 보였고, 이들은 또다시 칼슘 및 인이 풍부한 것으로 분석되었다. 고출력 TEM 이미지화는 이들 입자가 다공성임을 보여주었고, 선택된 영역의 전자 회절은 이들이 보다 전형적으로 생물학적 시스템과 연관이 있는 생물학적 아파타이트 또는 오인산팔칼슘에 비해 결정성이 아님을 증명하였다.
파이어판 M-세포는 내인성 나노광물질을 수송한다
이들 내인적으로 형성된 소화관 내강의 나노광물질들이 파이어판 상피의 M-세포에 의해 수송되었는지를 결정하기 위해, 뮤린-유래 박편의 TEM 분석을 수행하였다. 비-수성 수지를 동소 입자 구조를 보존하는데 사용하였으며, M-세포는 인접한 장세포들에 비해 표면 미세융모가 없거나 그의 크기가 왜소하게 잘 형성되어 있는 것으로 확인되었다. 이러한 전략에 따라, M-세포 내 많은 분산된 나노광물질 구조들은 소화관 내강에서 특정된 크기, 모양, 무정형 구조 및 X-선 원소 조성과 일치하였다. 드물게, M 세포-장세포 계면에서 1 또는 2개의 입자가 관찰되었으나, 이들 미립자가 규칙적인 장세포 내에 있다는 증거는 관찰되지 않았다: 대신 이들은 전형적인 M-세포 특징을 가지는 세포에 제한적이고 그 안에 풍부한 것으로 나타났다.
파이어판의 항원 제시 세포내 내인성 광물
M-세포는 항원 처리능을 거의 갖지 않으며 관강내 분자를 통과시켜 하부 면역 세포로 전달하는 것으로 나타났다. 내인성 나노광물질이 TEM에 의해 M-세포 내에서 분산된 형태로 존재하는 것으로 입증되었지만, APC의 소낭 (즉, 리소좀) 실에 축적되는 경우 나노미립자 클러스터를 광학현미경으로 확인할 수 있다. 따라서, 인간 및 뮤린 파이어판 모두의 냉동 절편을 조사하였고, 광물화된 인산염에 대한 변형된 폰코사(Von Kossa) 염색은 더 깊은 상피하 돔 내에 상당수의 양성 세포를 나타내었다. 광물화된 칼슘에 대한 형광 칼사인 염색으로 이들 관찰결과가 확인되었다. SEM에 장착된 후방 산란 전자들에 대한 검출기에 의해 동일한 상피하 돔 영역 에서 전자 조밀 영역이 확인가능하였으며, X-선 마이크로분석에 의해 칼슘 및 인이 풍부하였다. 인간 및 뮤린 조직 샘플 둘 다 이들 특징에 유사한 양성을 나타내었다.
일반 항체-기반 형광 표지를 뮤린 및 인간 파이어판에서 이들 광물-양성 세포의 APC 표현형을 확인하는데 사용하였다. 아마도 세포내 광물질에 대한 염색 흡수를 통해 인공 세포 항원 염색이 이들 세포에 일어날 수 있기 때문에, 표현형에 대해, 모든 염색이 예상 항원 위치에 전형적인 세포 분포를 나타내고 단순히 광물질이 풍부한 세포 영역과 우연의 일치를 이루지 않도록 주의를 기울여야 한다. 핵 염색 외에, 이중 염색, 즉 광물질뿐 아니라 하나의 표현형 표지에 대한 칼사인을 일시에 사용하였다. 대부분의 인간 및 뮤린 칼사인+ 세포는 CD11b, CD11c 및 HLA-DR에 대해 강한 양성을 나타내었으며 CD68hi는 상이한 아-집단을 이루었다. (말단) 단핵구 표지, CD14는 존재하지 않았는데, 이것과 상술한 양성 항원은 모두 이들 표지를 발현하는 세포를 함유하는 특이적 양성-대조군 조직에서 확인되었다 (방법 참조). 따라서, 종합적으로, 파이어판 상피하 돔의 광물질-양성 세포 표현형은 그 구역에 존재하는 단핵 APC와 일치하였다.
칼사인+ 광물질을 함유하는 개별 세포내 소낭을 상피하 돔 APC 내에서 식별할 수 있었다. 이 영역에서, 박편이 매립된 비-수성 수지의 TEM 이미지화는 개별 나노광물질의 형태가 관강내 및 상피 M-세포 입자와 일치함을 입증하였다. 이미지화에 의한 유사성은 파이어판 및 관강내 내용물의 유사 박편으로부터 X-선 마이크로분석 스펙트럼의 덜 원소적인 표준 정량화를 이용하여 Ca, Mg 및 P 함량에 대해 분석적으로 확인되었다.
동소 주사 TEM (STEM) 특성화 및 3D 나노토모그라피
나노미립자 광물화된 칼슘의 클러스터가 상피하 돔 APC에서 빈번히 관찰되었는데, 이는 아마도 세포 리소좀내 나노광물질에 대해 잘 알려진 내부 소포막에 대한 부착으로 설명될 것이다. 이 클러스터로부터의 영역을 비염색 비-수성-수지-매립 표본과 충분한 대비가 되도록 고각도 환형 암시야 (HAADF) STEM을 사용하여 이미지화하였다. HAADF-STEM 틸트 시리즈(tilt series)를 기록하고 3-D 모델을 재구성하는데 이용하였다.
내인성 나노광물질 포획 및 관강내 박테리아성 단편 및 식사성 항원의 수송
풍부한 다공성 관강내 인산칼슘 나노광물질의 균일한 형성 및 M-세포를 통한 파이어판 APC로의 그의 현저한 수송으로 기능에 대한 의문이 제기되었다. 인산칼슘은 유기 분자 포획에 뛰어나며, 특정 상황하에서 그의 결합된 물질과 함께 세포로 유입된다. 따라서, 이때, 내인성 나노광물질의 구성적인 "카고 배" 기능은 가용성 관강내 유기 마크로분자를 포획할 수 있고, 이어 소화관 APC로 수송할 수 있는 것으로 판단되었다. 경구적으로 전달된 식이 단백질 항원이 내인적으로 형성된 나노광물질과 연관된 파이어판 상피를 통해 가로지를 수 있는지를 시험하기 위해, BALB/c 마우스에 텍사스 레드(Texas Red®)-라벨의 오브알부민을 급이하였다. 파이어판에서 검출된 단백질은 거의 전적으로 상피하 돔의 나노광물질-양성 세포로 구분화되었다. 오브알부민 및 형광색소가 소화동안 분해될 가능성이 남아 있기 때문에, 후자만이 나노광물질과 관련되고, 오브알부민에 대한 파이어판 절편이 또한 직접 염색되었다. 공초점 현미경으로의 분할을 극대화하기 위해, 호이겐스 최대 최소 예상 데콘볼루션 알고리즘(Huygens maximum least expected deconvolution algorithm)을 사용하여 명확한 공동-국소화를 또다시 관찰하였다. 추가로, 밀접하지만 분리된 세포내 칼사인 및 단백질 신호가 있었으며, 나노광물질이 내리소좀적으로 용해되는 경우 예상되는 바와 같이, 처음에 비차폐, 이어 그의 카고 방출이 이어진다.
MAMP, 예컨대 펩티도글리칸은 공생 박테리아 플로라의 재편성으로 인해 회장을 포함한 원위 위장관의 강내 도처에 존재한다. 펩티도글리칸은 전박테리아에 존재하지는 않는 분해/유리 펩티도글리칸만을 인식하는 항체 2E9에 의해 소화관 점막의 인간 및 뮤린 정점면에서 동정되었다. 2E9 항체 실험을 이용한 실험은 또 비분리성 형광 신호 및 분리되었지만 근접한 신호 측면에서 식이 유래 오브알부민과 유사하게, 펩티도글리칸이 APC의 나노광물질로 구분화된 것으로 나타났다. 본 발명자들은 파이어판과 마찬가지로, AMCP 나노광물질이 또한 맹장 패치 상피하 면역 세포에서 관찰되었음을 확인하였다. 종합적으로 이들 데이터는 내인성 장 AMCP 나노광물질이 관강내에서 형성되고, 주로 상피 M 세포를 통해 장 면역-유도 부위, 즉 맹장 및 파이어판의 APC로 유입됨을 제시한다 (도 11A 참조). 경구적으로-전달된 단백질에 대한 장 면역 반응은 파이어판과 장관막 림프절 사이의 협력을 포함한다. 특히, APC의 장관막 림프절로의 이동은 기능 활성 (즉, 항원 제시)을 내포하고, 본 발명자들은 마우스에서 장관막 림프절이 상당한 수의 AMCP 나노광물질+ 세포를 가짐을 확인하였다 (도 11B).
검토
인간 위장관 내강내 내인성 나노광물질 입자의 계수가 현재의 분석 능력을 벗어나는 것이긴 하지만, 인간 및 뮤린 소장 내용물에서의 이들 관찰결과는 이들이 막대한 수로 일어남을 제시한다. 예를 들어, 평균, 50% 보이드 부피 (공극)를 가지는 100 nm 직경의 구형 무정형 입자 (P 팩킹 밀도는 인산팔칼슘에서의 것과 유사)를 형성하기 위해 인간 회장의 1L/24h 장액 (장의 액), 및 평균 6:10 몰비 (P:(Ca+Mg) - Mg가 Ca를 치환하기 때문에)의 제3의 침전물에서 중간 [Ca] 및 [P]가 각각 4.2 mM 및 10 mM인 경우, 약 2.1014개의 입자가 존재할 것으로 추정된다. 이 나노광물질은 입자가 작고 분석 처리 기술이 수성 분해가 일어나지 않도록 주의깊게 제어되어야 하기 때문에 종래 관찰/특정화되지 않았을 확률이 크다.
이 나노광물질에는 다수의 주목할만하고 특이한 특징이 있다. 첫째, 이는 분리된 (분산된), 자기조립 나노입자이다. 내인성 나노광물질의 형성은 주지이며 (예컨대, 페리틴 분자 코어내 페리하이라이트, 또는 뼈의 주 결정자 구조로서 생물학적 아파타이트), 이들은 유기 물질에 의해 템플릿화된다. 그에 반해, 이소성 자기조립 광물화는 보통 입자의 제어되지 않는 침전 및 응집을 수반한다. 둘째, 더 결정성인 인산칼슘보다 우선하여 무정형 인산칼슘을 형성하는데 필요한 최소 이온 활성 산물은 일반적으로 생체내에서 너무 높아서 생물학적 무정형 인산칼슘은 희박하다. 예를 들어, 기질 소포 생체광물화의 개시에 일시적 역할을 할 수 있더라도, 인간에게서 뼈내 무정형 인산칼슘의 발생 증거는 미약하다. 그래도, 무정형 인산칼슘은 적어도 안정한 인산칼슘 상이며, 인산팔칼슘으로 신속히 전환되고 아파타이트형 구조로 이어진다. 그러나, 소화관에서 인산칼슘 나노광물질은 관강으로부터 점막 면역 세포로 곧바로 전달되어 무정형으로 안정한 것으로 보이며, 아마도 비교적 높은 Mg 함량 및 실질적인 유기 카고에 의해 안정화될 것이다. 중요하게, 가장 용이한 가용성 인산칼슘의 형태로서, 리소좀 상태는 내인성 나노광물질의 신속한 용해와 장관강으로부터 유래되는 유기 카고의 방출을 허용할 수 있다. 실제로, 이들 내인적으로 형성된 나노광물질의 세 번째 특징적인 특성은 그의 대규모 공극과, 관강내 분자를 포획하여 이를 M-세포 입구를 통해 파이어판 APC로 전달하는 그의 뚜렷한 기능적 능력이다.
이들 실험은 무정형 인산칼슘 나노입자에 의한 포획 및 면역 세포-전달을 위한 두 표적으로서 펩티도글리칸 및 식이 단백질 항원을 규명하였고, 기타 분자들이 카고 분자로서 유사하게 사용될 수 있으며, 예를 들어 파이어판 APC에 대해 샤프롱된다. 위장 면역계는 관강내 물질을 샘플링하고 적절한 (불이행으로서 관용원성) 면역 반응을 발생하기 위한 분명한 기전 집합체이다. 이러한 작업은 관강내 항원 및 미생물-관련 분자 패턴 (MAMP)과 같은 카고 분자를 M-세포를 통해 상피하 APC로 전달하는 무정형 인산칼슘 나노입자가 소화관의 면역 감시 및 관용 네트워크에 중요한 역할을 할 수 있음을 나타낸다. 실제로, 브러시 보더 효소 네트워크 (brush border enzyme network)는 유리 또는 입자-흡착된 MAMP 및 항원을 파괴할 수 있으며 이에 따라 나노광물질이 도입된 유기 분자만이 안전하게 파이어판 정점 점막을 가로질러 하부 면역 세포에 이를 수 있다.
종합하면, 본 발명의 이들 양태는 자기조립 내인성 나노입자에 의해 매개되는 영양, 소화관 생리학 및 점막 면역계 사이에 새로운 통찰을 제공한다. 특히 이들은 (a) 왜 파이어판이 ~20-250 nm 범위 비-생물학적 나노입자의 흡수에 탁월한 능력을 가지는지, (b) 구성적 상태하에서, 관강내 항원 및 MAMP가 어떻게 사전 효소 분해없이 더 깊은 APC, 상피하 돔에 이를 수 있는지, 또는 (c) 장관강에 왜 '절대적인' 내인성 칼슘 손실이 있는 상피 반응에 연루되는지에 대한 답을 제시한다.
파트 II: ACP 나노입자의 합성 모방체 개발, 그의 특성화 및 카고의 담체로서 용도
위장관에서, 칼슘 이온 및 인산염 이온이 침전하고, 관강에 존재하는 유기 분자를 포획하여 소화관 점막 면역 세포로 전달하는 나노입자를 형성한다는 상기 파트 I에서의 발견에 기초하여, 본 발명자들은 내인성 장 인산칼슘 나노입자의 합성 모방물을 생성하고 이들이 안정하고 카고 분자의 담체로서 작용할 수 있는지를 결정하기 위해 실험을 수행하였다.
실시예 1: 무정형 인산칼슘 ( AMCP ) 입자의 합성
합성 무정형 인산칼슘 ("ACP") 입자를 보스키 및 포스너에 의한 (Boskey and Posner, 1974)의 변형된 프로토콜을 이용하여 제조하였다. 변형시킨 것은 마그네슘 (Mg2+)을 첨가하고/거나 상 안정성 증대를 위해 AMCP 입자 내에 포획될 수 있는 다양한 분자의 존재하에 합성을 수행하는 것이다. 부하 및 비부하 AMCP 입자의 합성 방법은 모두 알칼리성 pH (전형적으로 pH 8 또는 9 및 Tris 완충)에서 완충된 칼슘 용액에 인산염 (PO4) 용액을 신속히 첨가하는 것에 기초한다. 먼저, 더 결정성인 상으로 전환되는 경향이 있는 무정형 인산칼슘 (ACP) 상이 형성된다. 상기 전환 과정은, Mg2+ 이온을 첨가하고/거나 AMCP 입자 내에 포획될 수 있는 광범위 분자의 존재하에 합성을 수행함으로써 방지될 수 있거나, 또는 적어도 억제될 수 있다.
예로서, 18.1 g의 트리즈마-기반 C4H11NO3을 1L 초순수에 용해하여 TRIS 완충액의 0.15M 용액을 만들었다. 염산 (TRIS-HCl)을 적가하여 pH를 pH 8로 조절하였다. 2.6 g의 CaCl2.2H2O를 0.73 g의 MgCl2.2H2O를 함유하는 500 ml TRIS-HCl 완충액에 첨가하고 pH를 pH 8로 조절하여 용액 A를 제조하였다. 2.6 g의 (NH4)2HPO4를 500 ml TRIS-HCl 완충액에 첨가하고 pH를 pH 8로 조절하여 용액 B를 제조하였다. 동일량의 용액 A 및 B (v/v)를 함께 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 회전시켰다. 1시간 후, 생성된 입자를 pH 10 물에서 2회, 아세톤에서 1회 세척하였다. 이어 입자를 밤새 50℃에서 건조시키고, 칭량하였다. 입자 제제 ml당 평균 2.19 mg ± 0.14 (n = 4)의 건조 AMCP 분말을 회수하였다.
실시예 2: 단백질 함유 무정형 인산칼슘 ( AMCP ) 입자의 합성
ACP 입자를, 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 아비딘으로 예시된 단백질을 용액 A에 1 mg/ml이 되도록 첨가하여 변형한 것을 제외하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 동일량의 용액 A 및 B (v/v)를 함께 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 회전시켰다. 1시간 후, 생성된 입자를 pH 10 물에서 2회 세척하고, 생성된 입자 펠렛을 시트르산 완충액 (10 mM, pH 3)에 용해시켰다. 입자에 도입된 단백질 수준을 브래드포드(Bradford) 단백질 어세이에 의해 측정하였다. 가끔, 입자를 또한 50℃에서 밤새 건조시키고, 분말을 칭량하였다 (n = 4, 아세톤에서 2회 세척 후). 평균 242.9 ㎍ ± 47.77 (n = 8) BSA 또는 157.76 ㎍ 아비딘 (n = 1)이 2.39 mg ± 0.14 ACP 분말 (n = 4)에 존재하였다.
실시예 3: 단백질 및 조 박테리아 모티브 함유 무정형 인산칼슘 ( AMCP ) 입자의 합성
AMCP 입자를, BSA 및 염색된 (레마졸 브릴리언트 블루; Zhou et al, 1988) 에스. 아우레우스 유래 조 펩티도글리칸을 용액 A에 각각 1 mg/ml 및 100 ㎍/ml이 되도록 첨가하여 변형한 것을 제외하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 동일량의 용액 A 및 B (v/v)를 함께 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 회전시켰다. 1시간 후, 생성된 입자를 pH 10 물에서 2회 세척하였다. 생성된 입자 펠렛을 정량 목적으로 시트르산 완충액에 용해시키고, 입자에 도입된 단백질 수준을 브래드포드 단백질 어세이에 의해 측정하고, 염색된 펩티도글리칸의 양은 595 nm에서 판독하였다. 평균 270.5 ㎍ ± 13.95 (n =3) BSA 및 45.20 ± 0.99 ㎍ (n = 4)의 조 Pg가 1.98 mg ACP 분말 (n = 1)에 존재하였다.
실시예 4: 단백질 및 가용성 박테리아 모티브 함유 무정형 인산칼슘 ( AMCP ) 입자의 합성
AMCP 입자를, BSA 및 이. 콜라이 유래 가용성 펩티도글리칸을 용액 A에 각각 1 mg/ml 및 100 ㎍/ml이 되도록 첨가하여 변형한 것을 제외하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 동일량의 용액 A 및 B (v/v)를 함께 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 회전시켰다. 1시간 후, 생성된 입자를 pH 10에서 2회 세척하였다. 생성된 입자 펠렛을 정량 목적으로 시트르산 완충액에 용해시키고, 입자에 도입된 단백질 수준을 브래드포드 단백질 어세이에 의해 측정하고 가용성 펩티도글리칸의 양은 개조된 과요오드산 쉬프(Periodic Schiff) 어세이 (Jugdaohsingh R, 1999)로 평가하였다. 평균 232.9 ㎍ ± 14.62 (n = 5) BSA 및 29.47 ± 12.83 ㎍ (n = 9) 가용성 Pg가 AMCP 입자에 존재하였다.
실시예 5: 단백질 및 가용성 복합체 폴리사카라이드 함유 무정형 인산칼슘 (AMCP) 입자의 합성
AMCP 입자를, BSA 및 가용성 전분을 용액 A에 각각 1 mg/ml 및 100 ㎍/ml이 되도록 첨가하여 변형한 것을 제외하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 동일량의 용액 A 및 B (v/v)를 함께 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 회전시켰다. 1시간 후, 생성된 입자를 pH 10에서 2회 세척하였다. 생성된 입자 펠렛을 정량 목적으로 시트르산 완충액에 용해시키고, 입자에 도입된 가용성 전분의 양을 개조된 과요오드산 쉬프 어세이 (Jugdaohsingh R, 1999)로 평가하였는 바 45.99 ㎍ (n = 1)인 것으로 확인되었다.
실시예 6: 단백질 및 면역원 함유 무정형 인산칼슘 ( AMCP ) 입자의 합성
AMCP 입자를, BSA를 용액 A에 1 mg/ml이 되도록 첨가하고 단백질 정제된 유도체 (M. Tuberculosis 유래 PPD)를 용액 B에 200 ㎍/ml이 되도록 첨가하여 변형한 것을 제외하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 동일량의 용액 A 및 B (v/v)를 함께 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 회전시켰다. 1시간 후, 생성된 입자를 pH 10에서 2회 세척하였다. 생성된 입자 펠렛을 정량 목적으로 시트르산 완충액에 용해시키켰다. 입자에 도입된 단백질 수준을 브래드포드 단백질 어세이 및 PAS 어세이에 의해 측정하였다. 평균 188.9 ㎍ ± 24.54 (n = 4) BSA 및 51.61 ± 20.07 ㎍ (n = 3) PPD가 ACP 입자에 존재하였다.
실시예 7: 단백질 및 시토카인 함유 무정형 인산칼슘 ( AMCP ) 입자의 합성
AMCP 입자를, BSA를 용액 A에 1 mg/ml이 되도록 첨가하고 흉선 스트로믹 림포포이에틴 (Thymic Stromic Lymphopoietin) (TSLP)을 용액 B에 100 또는 1 ng/ml이 되도록 첨가하여 변형한 것을 제외하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 동일량의 용액 A 및 B (v/v)를 함께 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 회전시켰다. 1시간 후, 생성된 입자를 pH 10 물에서 2회 세척하였다. 생성된 입자 펠렛을 정량 목적으로 시트르산 완충액에 용해시키고, 입자에 도입된 TSLP의 수준을 TSLP에 특이적인 ELISA로 측정하여 각각 1.38 ng (n = 1) 및 25.73 pg (n = 1)임을 확인하였다.
실시예 8: 산화철-함유 입자 및 단백질 또는 " AMCP /BSA/Fe"를 함유하는 무정형 인산칼슘 ( AMCP ) 입자의 합성
AMCP 입자를, Ca2 +/Mg2 +/BSA 용액을 100 ㎍/ml의 산화철 용액과 추가 혼합하여 변형한 것을 제외하고 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조하였다. 이어 생성된 용액을 동일 부피의 PO4 용액과 혼합하여 입자를 침전시켰다.
합성 인산칼슘 입자의 구조 특성화
작은 산화철 나노입자의 부재 (즉, AMCP/BSA) 또는 존재 (즉, AMCP/BSA/Fe) 하에 제조된 합성 인산칼슘 입자를 비-수성 수지 'Quetol 651'에 고정하고, 70 nm 두께로 절단하였다. 주사 투과전자현미경법 (STEM) 모드의 고각도 환형 암시야 (HAADF) 이미지화에 기초한 토모그라피 실험을 FEI Tecnai F20 전자현미경 상에서 Fischione 2020 초고 틸트 토모그라피 홀더를 사용해서 샘플을 단일 축에 대해 -42°에서 2°간격으로 +70°까지 기울여 200kV 하에 수행하였다. 틸트 시리즈를 정렬하고, Inspect3D 소프트웨어 및 AMIRA 소프트웨어를 사용해 가시화되도록 재구성하였다.
합성 인산칼슘 입자 내에 함유된 유기 분획의 정량화
합성 후, BSA 또는 sPg와 같은 카고 분자를 (단독 또는 조합하여) 함유하는 입자를 1,500 rpm에서 (5분 동안) 원심분리하고, 상등액을 수집하였다. 이어, 입자를 pH 10 물에서 2회 세척하였다. 그 다음에, 정량 목적으로, 입자를 100 mM 시트르산 완충액 (pH 3)에 용해시켜 유기 물질을 방출시켰다. 총 단백질 함량을 브래드포드 단백질 어세이를 수행하고 (제조업자의 프로토콜에 따름, Bio-Rad Laboratories, UK), Pg 물질은 변형된 과요오드산 쉬프 어세이 (PAS; Jugdaohsingh R et al, 1999)를 이용하여 정량하였다. 이 어세이는 자주색 복합체의 형성에 기초하며, 그의 흡광도는 용액내 폴리사카라이드의 양에 비례한다. 샘플 및 표준 (100 ㎕)을 먼저 0.5 M 황산중 92 mM 과요오드산나트륨과 (10 ㎕/웰, 37℃에서 가끔 진탕하면서 30분) 인큐베이션한 후, 0.68 M HCl 중 2.7% 아비산나트륨 (20 ㎕/웰)과 플레이트 진탕기 상에서 실온하에 (40분) 인큐베이션하였다. 시프 시약 (50 ㎕/웰; Merck KGaA, Germany)을 첨가하고, 37℃에서 30분 추가 인큐베이션한 다음, 플레이트를 540 nm에서 판독하였다. 폴리사카라이드의 농도를 표준 곡선 가용성 Pg (0-250 ㎍/ml)에 대해 결정하고, 샘플 매트릭스에 대한 기록을 위해 AMCP/BSA 입자의 용해물에서 작성하였다.
크기 측정
나노입자 추적 분석을 Nanosight NS500 (Nanosight, Amesbury, UK) 상에서 NTA2.2 분석 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 각 실험에 대해 샘플을 기술적으로 3중으로 (각각 90초) 측정하고, 결과를 평균내었다. 데이터는 세 독립 실험의 평균으로서 표시된다.
원소 조성의 결정
합성 인산칼슘 입자를 ICP-OES 분석 전에 5% HNO3 (Sigma-Aldrich Company Ltd., Dorset, UK)에 용해시켰다. 샘플을 JY2000 ICP-OES (Horiba Jobin Yvon Ltd., Stanmore, UK)를 사용하여 분석하고, Ca 및 P를 각각 396.847 nm 및 177.440 nm에서 검출하였다. 외부 표준 (보정 표준 용액 1000 ppm, Fisher Scientific UK Ltd, Leicestershire, UK; 0.5-50 ppm)을 사용하여 정량 수행을 하였다. 총 Ca 및 P를 합성 후 또는 TCM에서 희석한 후 수집한 입자 현탁물로부터 얻고, 가용성 Ca 및 P 분획의 측정을 위해 입자 현탁물 분취액을 한외여과 (MWCO 3 kDa, 10분, 12.000 rpm)하였다. 입자 현탁물과 동일하게 처리된 D10 (즉, TCM)으로부터 얻은 Ca 및 P 값을 사용하여 백그라운드 보정을 수행하였다. 원소 미립자 분율을 총 원소 조성과 가용성 원소 조성의 차이로 계산하였다.
세포 단리
백혈구 콘 (n=7)을 National Blood Service (영국 캠브리지)에서 구입하고, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 분리 매질로서 Lymphoprep (Axis Shield Diagnostics Ltd, Dundee, Scotland)를 사용하여 밀도 원심분리에 의해 단리하였다. 요약하면, 혈액을 HBSS (Sigma-Aldrich)로 희석하고, 희석한 혈액 25 ml를 10 ml Lymphoprep에 주의하여 층상화하였다. 20분의 원심분리 (800 x g, 중단없이) 후, 생성된 단핵 세포층을 수집하여 HBSS에서 3회 세척하고, 단핵구를 더 풍부하게 하기 위해 10% 열 불활성화된 우태혈청 (PAA Laboratories Ltd., Dorset, UK), 100 U/ml 페니실린, 100 ug/ml 스트렙토마이신, 및 2 mM L-글루타민 (모두 Sigma-Aldrich 제품)을 첨가한 R10 (RPMI-1640 배지 (Sigma-Aldrich)에 5.106 세포/ml의 농도로 재현탁하였다.
이를 위해, 이차 밀도 원심분리를 마르티네즈(Martinez)에 의해 기술된 바와 같이 수행하였다. 요약하면, 9.25 부의 Percoll을 0.75 부의 10x DPBS (칼슘 및 마그네슘 존재; Sigma-Aldrich)와 혼합한 후, R10에서 46% (v/v)로 희석하여 밀도 매질 Percoll (Sigma-Aldrich)을 285 mOsm으로 삼투처리하였다. PBMC 현탁물을 동일 부피의 285 mOsm Percoll 46% 용액 상에 층상화하였다. 30분의 원심분리 (400 x g, 중단없이) 후, 생성된 단핵구가 풍부화된 PBMC 층을 수집하고, HBSS에서 3회 세척한 다음, 마지막으로 R10에서 1.106 세포/ml로 재현탁하였다. 단핵구-풍부화된 PBMC는 통상 트립판 블루 (Sigma-Aldrich) 배제법에 의해 측정되어 95% 이상의 생존율을 나타낸다 (그리고 유세포 분석법으로 측정된 경우 57.29%의 CD14+ 단핵구로 이루어졌다).
세포 자극
단핵구-풍부화된 PBMC의 배양 및 자극을 멸균 15 ml 팔콘 튜브 (Starlab UK Ltd, Milton Keynes, UK)에서 1.106 세포/ml로 37℃/ 5% CO2 하에 수행하였다. 새로이 단리한 단핵구-풍부화된 PBMC를 밤새 정치시키고 10% 열 불활성화된 우태혈청, 100 U/ml 페니실린, 100 ug/ml 스트렙토마이신, 및 2 mM L-글루타민을 첨가한 신선한 조직 배양 배지 (즉 D10: DMEM (sigma-Aldrich)를 보충하였다. 5.106 세포를 음성 대조군으로서 비히클 D10 또는 4.4 ㎍/ml 가용성 펩티도글리칸 (대장균 유래; Source BioScience plc, Nottingham, UK) (가용성 (sPg) 또는 미립자 (AMCP/BSA/sPg) 형태)으로 3시간 동안 자극하였다. 이는 D10에서 40 ㎍/ml sPg를 제조하거나, 또는 50 ㎍/ml sPg (입자 세척중에 sPg 손실 보상을 위해)와 함께 AMCP/BSA/sPg 입자를 합성하고 세포 현탁물 ml당 125 ㎕의 자극제를 첨가하여 달성하였다. 3시간 후 자극제를 제거하고, 세포를 HBSS에서 2회 세척한 후, 핵산 정제 용액 (Life Technologies Ltd, Paisley, UK)으로 용해하고, 세포 용해물을 RNA 분리 전에 -80℃에서 저장하였다.
RNA 추출
전체 RNA를, Abi Prism 6100 Nucleic Acid PrepStation (Applied Biosystems, UK)을 제조업자의 지침에 따라 사용하여 정제하였는데, AbsoluteRNA 세척 용액 (Applied Biosystems)을 제조업자의 지침에 따라 사용하여 세척하는 단계를 포함한다. 용출된 RNA의 농도 및 순도를 NanoDrop ND-1000 분광광도계 (Labtech International Ltd, UK) 상에서 측정하였다. 때로 뉴클레오티드 농도를 증가시키기 위해, RNeasy MinEluteTM Cleanup Kit (Qiagen Ltd, Manchester, UK)를 제조업자의 지침에 따라 사용하여 제2 정제 과정을 수행하였다. 샘플을 추가 마이크로어레이 처리 때까지 -80℃에서 저장하였다.
마이크로어레이 처리
전체 RNA (100 ng)를 Ambion WT 발현 키트 (Life Technologies, Bleiswijk, Netherlands)를 사용해 표지화하고, 19.732 유전자 암호화 인간 전 게놈 유전자칩 인간 유전자 1.1 ST 어레이 (Affymetrix, Santa Clara, CA)에 하이브리드화하였다. 샘플 표지화, 칩에의 하이브리드화 및 이미지 스캐닝은 제조업자의 지침에 따랐다.
마이크로어레이 데이터 분석
마이크로어레이 분석은 마이크로어레이 데이터의 통계적 분석을 위한 MADMAX 파이프라인을 사용해 수행하였다. 추가 분석을 위해 커스텀 애노테이션(custom annotation)을 유전자에 대한 모든 개별 프로브를 조합한 재편성된 올리고뉴클레오티드 프로브에 기초해 사용하였다. 어레이 상에 적어도 5개의 프로브가 존재하는 유전자만이 고려되었다. 변위치 정규화(quantile normalisation)를 포함한 로버스트 멀티칩 평균 (RMA) 법을 사용하여 발현 값을 계산하였다. 마이크로어레이 데이터를 필터링하고, 4 초과 어레이에 대해 발현 값이 20을 넘는 프로브 세트를 발현된 것으로 간주하고, 추가의 통계 분석을 위해 선택하였다. 또한, 0.25의 사분위범위 (IQR) 컷오프를 이용하여 상태 변동이 거의 없는 유전자를 필터링하였다. 대응 강도-기반 조절 T-통계(paired Intensity-Based Moderated T-statistic) (IBMT [5])를 이용하여 발현 유의차를 평가하였다. p 값이 <0.01인 경우 유전자가 유의적으로 변경되었다고 정의하였다.
가용성 및 미립자 형태의 펩티도글리칸에서 유전자 조절 유사성을 평가하기 위해, 두 처리중 적어도 하나에 의해 유의적으로 변경된 유전자만을 고려하였다. 그를 위해, 각 자극제의 평균 신호 로그비 (SLR; 대수적 배수 변화)를 대조군 처리와 비교하여 계산하고, 상관 플롯으로 시각화하였다 [각 점은 단일 유전자를 나타냄]. [완전 상관선을 완전 상관선의 각 점에 +1 또는 -1을 더하여 산출된 2-배 상-/하향-조절에 상응하는 경계값 및 데이터 상에 오버레이하였다].
결과
합성 모방체는 다공성 무정형 인산칼슘 나노입자를 생성한다
보스키(Boskey)로부터의 프로토콜 변형을 이용하여 합성된 인산칼슘은 그의 생체내 장 대응물과 동일한 크기 범위의 균질한 나노입자를 제공하고 (도 1A), 주로 칼슘, 인 및 마그네슘을 포함하였다 (도 1B). 종래 생체내 연구결과와 마찬가지로, 고각도 환형 암시야 주사 투과전자현미경법에 의한 분석 (HAADF-STEM; 도 1C-E), 및 단백질-부하 합성 AMCP 클러스터의 3D-재구성 (도 1F-I)은 입자의 다공성 특징을 입증하였다 (공극 평균 크기: 1-3 nm).
합성 모방체는 무기 및 유기 성분 주위를 템플릿화한다
결과에 따르면 공극은 부분적으로 모액에 존재하는 무기 및 유기 성분 (예컨대, 산화철 나노입자, 단백질 및/또는 박테리아성 성분) 주위를 템플릿화하는 입자 때문으로 나타났다. 실제로, 합성 모방체가 산화철 나노입자의 존재하에 제조된 경우, TEM은 작은 나노-철 입자가 도처에 도입된 합성 무정형 인산칼슘 나노입자를 나타내었다 (도 2A). 합성 무정형 인산칼슘 나노-철 입자의 주사 투과 전자현미경 (STEM) 단층촬영 재구성에 따라 더 작은 나노-철 입자의 균일한 내부 및 외부 분포가 추가로 확인되었다 (도 2B-D). 종합하면, 합성 모방체는 50-70%의 첨가 유기 물질이 도입된 것으로 증명되었다 (도 2E).
추가 실험에서, 뮤라밀 디펩티드 (MDP), 리포폴리사카라이드 (LPS), 폴리 I:C 및 레티노산 (RA)을 포함한 카고 분자가 본 발명에 따른 합성 AMCP 나노입자에 도입된 것으로 나타났다.
합성 모방체는 세포 배양 조건하에 안정하게 남아 있다
장 내인성 나노광물질에 대한 모방체를 성공적으로 생성하고, 생체내 그의 관련성/기능을 알아보기 위해, 먼저 무정형 인산칼슘 나노입자가 세포 배양 조건에서 시험시 그의 구조 및 화학적 특성을 유지하는지를 확인하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 모방 인산칼슘은 그의 카고 존재하에 그의 Ca 대 P 비 및 70 nm의 그의 평균 크기를 유지하였다.
합성 모방체는 침묵 항원 전달 플랫폼이다
이어 이들 입자가 일차 면역 세포에 의해 잘 흡수되는지, 그리고 그의 흡수가 그 안에 보유한 카고에 대한 면역 반응을 조절할 수 있는지를 조사하기 위한 연구를 수행하였다. 합성 모방체와의 인큐베이션은 세포사가 발생하지 않았기 때문에 안전성이 제공되었다. 둘째로 도 4에 도시된 바와 같이, 이들 나노입자 (도 4B, 칼사인)는 단핵구에 의해 효율적으로 흡수되고 (도 4B, CD14), 리소좀실로 수송되었다 (도 4B, CD107 및 오버레이). 또한, 흥미롭게도 박테리아 성분 (즉, Pg)을 함유하는 입자의 흡수가 더 큰 것으로 보이고 (도 4A), 입자 자체는 동일한 용량의 펩티도글리칸이 단독으로 전달된 경우 얻은 유전자 발현 프로파일을 변경하지 않았다 (도 4C). 도 10은 비히클 대조군 처리 (n=7)의 것에 대해 상관관계가 있는 합성 AMCP에 3시간 노출 후 유전자의 평균 log2 발현 값을 나타낸다. 이는 단백질-부하된 합성 AMCP 나노입자로 유발된 세포가 유발되지 않은 (대조군) 세포의 것과 유사한 전사 '특징'을 나타냄을 입증한다. 완전 상관의 이론적 선을 검게 나타내었으며, 2-배 상향- 및 하향-조절의 것에 해당하는 가장자리 선은 붉게 나타내었다. 요약하면, 내인성 장 인산칼슘 나노광물질의 합성 모방체는 항원 전달을 위해 안전하고 적합한 플랫폼이고 다른 인산칼슘과 달리 그의 카고를 침묵/비활성 방식으로 전달하는 것으로 입증되었다.
파트 III: 무정형 인산칼슘 나노입자의 세포학적 성질
장의 무정형 인산칼슘 나노입자 모방체에 의해 공동전달된 항원- 리포폴리사카라 이드에 대한 항원 특이적 CD4 T-세포 반응 감소
이 데이터는 MAMP의 미립자 운반에 의한 항원 특이적 T 반응의 억제가 펩티도글리칸의 것에 한정되지 않고 본 발명에 따른 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 물질에 의해 T 세포 항원과 공동-전달된 리포폴리사카라이드를 추가로 포함함을 입증한다 (도 5).
AMCP 및 인플라마솜
2-4 대상체로부터의 PBMC를 3시간 동안 LPS로 (10 ng/ml, 줄무늬 기둥), 또는 그 없이 (무늬 없는 기둥) 일차 사전-자극하여 프로-IL1β를 유도하고 음성 대조군 (즉, 조직 배양 배지) 또는 ACP/BSA와 (3시간 동안) 추가 인큐베이션하였다. 도 6A 및 B에 도시된 바와 같이, ACP/BSA는 조사한 모든 시점에서 음성 대조군에 대해 관찰된 것과 상이한 어떤 IL-1β 반응도 유도하지 않았다. 이는 또한 추가의 펩티도글리칸 (sPg) 성분을 그의 카고에 도입한 입자에도 해당되었다 (도 6C-D).
ACP/BSA 입자는 IL-1β 수준에서 Pg에 대한 반응을 유의적으로 조절하지 않는 것처럼 보이지만 (도 7A), 항-염증성 IL-10의 분비는 증가시키는 것처럼 보인다 (도 7B).
종합하면, 데이터에 따르면 내인성 인산칼슘 나노광물질의 합성 모방체는 인플라마솜 플랫폼을 활성화하지 않고, 그의 카고를 세포로 전달할 수 있으며, Pg에 대한 IL-1β 반응을 변조하지 않고 그 보다는 항-염증성 신호를 증가시킬 수 있는 것으로 나타났다. 이는 본 발명에 따른 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 (AMCP) 나노입자가 나노입자를 흡수하는 세포에 대한 카고 분자의 항원 제시를 차폐 또는 변경하지 않는 성질을 가짐을 의미한다. 이것은 실질적으로 AMCP 나노입자 자체로 야기되는 보조 효과를 초래하지 않아 AMCP 나노입자가 카고 분자에 대한 전달제로서 사용될 수 있음을 의미한다.
파트 IV: 크론병에서 PD-L1 발현의 역할
방법
급속 냉동시킨 파이어판을 가지는 인간 회장 조직 절편을 조직 은행 (Tissue Solutions, UK)으로부터 그곳의 적절한 윤리의식에 따라 입수하였다. 대조군 샘플은 종양 또는 궤양성 대장염을 가지는 환자의 절제단으로부터 얻었다 (회장 카시노이드 종양을 가지는 것 3개, 결장의 선암을 가지는 것 2개, 소장의 악성 흑색종을 가지는 것 1개 및 궤양성 대장염을 가지는 것 2개). 크론병 샘플은 상이한 크론병 해부학적 위치 (회장에서 3곳, 회맹부에서 1곳, 회장 및 대장을 모두 수반한 2곳 및 결장 1곳)를 가지는 환자로부터 유래하였다. 절편 염색 및 공초점 이미지화를 한 쌍씩 (또는 그의 복수)으로 행하여 하나의 크론 절편이 항상 하나의 비크론 절편을 동반하도록 하였는데, 이들은 둘 다 동일하게 처리되었다. 따라서, 모든 샘플은 동일하게 절편화되고 공-염색되었다.
파이어판은 14 ㎛로 동결-절편화 (Leica CM30505)하여 SuperFrost® 슬라이드 상 (Thermo Scientific, USA)에 수집하였고 실온에서 30분 간 공기 건조하였다.
4% 포름알데히드에서 고정화 후 (4℃, 15분), 인간 절편을 Tris 완충 염수 (pH 8.0)로 세척하고, 마우스 항-인간 PD-L1 [(M1H1) eBioscience (14-15983)] 일차 항체와 4℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. Tris 완충 염수 (pH 8.0)에서 추가 세척 후, 슬라이드를 Alexa Fluor® 568 염소 항-마우스 [IgG (H+L), Invitrogen Life Technologies (A11004)] 이차 항체와 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 나노-광물화된 인산칼슘의 검출을 위해, 절편을 Tris 완충 염수 (pH 8.0)로 3회 변경하여 각각 5분 간 세척한 후, 칼사인 Tris-HCl 용액과 4℃에서 1.5시간 동안 어둠 속에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 절편을 Tris 완충 염수 (pH 8.0)로 3회 변경하여 각각 5분 간 주의하여 세척하고, 마지막으로 핵 염료 To-Pro-3 (Invitrogen Life Technologies, 1 ㎛)으로 대비염색하였다. 1분 동안 Tris 완충 염수 (pH 8.0)의 3회 변경 후, 절편을 ProLong® Gold 광퇴색방지 시약 (Invitrogen, UK)을 사용하여 영구히 마운팅하였다.
절편을 x63, 1.2 NA 물 대물 렌즈를 사용하고 다이오드 Ar/ArKr 및 HeNe 레이저를 갖춘 Leica DMIRE2 현미경 (Leica Microsystems, Germany)으로 488, 568 또는 633 nm에서 이미지화하였다. 데이터를 Leica 공초점 소프트웨어 (v2.61)를 사용하여 기록하고, 공개 소스 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리하였다. 동일한 이미지화 및 데이터 수집 과정을 크론병 및 비-크론병 절편에 적용하였다.
결과 및 결론
일관적으로, 이미지화는 크론 및 비-크론 양 조직 샘플로부터 유래한 파이어판 림프 여포의 상피하 돔에서 유사한 수의 칼사인 양성 세포를 나타내었다. 그러나, 칼사인 양성 세포는 또한 비-크론병 대상체로부터 유래한 조직 샘플에서 PD-L1의 고발현을 나타내었으며, 따라서 다시 일관적으로 이들은 크론병 샘플에서 대개 PD-L1 음성이거나, 또는 기껏해야 PD-L1 저 수준이다. 이미지화된 샘플에서 종양 또는 염증의 존재 또는 부재는 이러한 관찰결과들을 설명할 수 없다. 마찬가지로, 질환 부위 (즉, 회장이든, 결장이든, 또는 둘 다이든)도 이러한 관찰결과들을 설명하지 못했다. 연령과도 관계가 없다. 이 연구의 결론은 장 림프 여포내 관강내 항원은 관용원성 상황에 제시되지 않을 것이기 때문에 상기 항원을 수용하거나 제시하는 세포 상에서 PD-L1을 적절히 발현하지 못하는 것이 크론병 원인의 기저가 된다는 것이다. 어떤 특정 이론에 구애됨이 없이, 본 발명자들은 이들 세포가 크론병에서 PD-L1이 그렇게 전반적으로 낮은 이유는 이들 세포에서 관강내 나노광물질에 의해 유사하게 전달되는 펩티도글리칸에 반응하여 PD-L1을 상향 조절하지 못하는 그의 고유성 때문이라고 확신한다.
참조문헌:
다음 참조문헌은 명백히 그 전체가 모든 목적을 위해 참고로 인용된다.
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Figure pct00007

Claims (59)

  1. 생물학적 활성 카고 물질을 위장관에 전달하는 방법에 사용하기 위한 조성물로서, 생물학적 활성 카고 물질을 봉입(entrap)하여 상기 카고 물질이 위장관 내 관심 부위로 전달되도록 할 수 있는 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 (AMCP)을 포함하는 조성물.
  2. 생물학적 활성 카고 물질을 위장관에 전달함으로써 병태를 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 조성물로서, 생물학적 활성 카고 물질을 봉입하여 상기 카고 물질이 위장관 내 관심 부위로 전달되도록 할 수 있는 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 (AMCP)을 포함하는 조성물.
  3. 생물학적 활성 카고 물질을 위장관에 전달하는 방법으로서, 생물학적 활성 카고 물질을 봉입하여 상기 카고 물질이 위장관 내 관심 부위로 전달되도록 할 수 있는 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 (AMCP)을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  4. 생물학적 활성 카고 물질을 위장관에 전달함으로써 병태를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 생물학적 활성 카고 물질을 봉입하여 상기 카고 물질이 위장관 내 관심 부위로 전달되도록 할 수 있는 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 (AMCP)을 포함하는 조성물을 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 마그네슘-치환된 인산칼슘이 X-선 회절로 측정시 무정형인 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘이 25°2 세타에서 최대치를 갖고 브로드하고 확산된 X-선 회절 패턴을 갖는 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘의 X-선 회절 패턴은 결정성 하이드록시아파타이트의 X-선 회절 패턴과 관련된 하나 이상의 피크가 결여된 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘이 분산되어 위장관내 세포에 의해 흡수가능한 나노입자를 형성할 수 있는 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 소화관 점막 면역 세포에 의해 흡수가능한 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 위장관내 세포가 소화관에 존재하는 항원-제시 면역 세포인 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 생물학적 활성 카고 물질을 파이어판 또는 장관막 림프절 (MLN)에 전달하는 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 경구 투여, 경비위 투여 또는 직장 투여용인 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  13. 제12항에 있어서, 조성물이 경구 투여용으로 캡슐화된 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘이 분산되어 CD11b 양성 세포 및/또는 CD11c 양성 세포에 의해 흡수가능한 나노입자를 형성할 수 있는 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘이 분산되어 수지상 세포 및/또는 대식세포에 의해 흡수가능한 나노입자를 형성할 수 있는 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘이 자가면역 질환, 암, 식품 알레르기 및/또는 과민증(intolerance)의 치료 방법에 사용하기 위한 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘이 염증성 장 질환의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘이 크론병 또는 셀리악병(coeliac disease)의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘이 대상체의 백신접종 방법에 사용하기 위한 것이고, 생물학적 활성 카고 분자가 치료 백신 조성물인 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  20. 제19항에 있어서, 치료 백신 조성물이 암의 치료 또는 예방을 위한 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  21. 제20항에 있어서, 암이 골수성 백혈병인 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  22. 제19항에 있어서, 치료 백신 조성물이 자가면역 질환을 치료 또는 예방하기 위한 것이고, 상기 백신 조성물은 자가면역 T 세포 및 자가 항체 반응에 대해 관용성을 유도할 수 있는 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  23. 제22항에 있어서, 자가면역 병태가 다발성 경화증인 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  24. 제19항에 있어서, 치료 백신 조성물이 염증성 장 질환을 치료 또는 예방하기 위한 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  25. 제24항에 있어서, 염증성 장 질환이 크론병 또는 셀리악병인 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  26. 제19항에 있어서, 치료 백신 조성물이 1형 당뇨병을 치료 또는 예방하기 위한 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  27. 제19항에 있어서, 치료 백신 조성물이 전신 홍반성 루푸스 (SLE)를 치료 또는 예방하기 위한 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 카고 물질이 카고 분자 또는 카고 나노입자인 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘이 분산되어 생물학적 활성 카고 분자를 관심 부위로 전달가능한 응집 나노입자를 포함하는 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  30. 제29항에 있어서, 나노입자가 금속-기반 나노입자 또는 금속 옥소-하이드록사이드 기반 나노입자인 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘이, 관심 부위에서 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘에 대해, 생물학적 활성 카고 물질 단독에 대한 반응과 실질적으로 상이한, 보조(adjuvant) 반응을 일으키지 않는 침묵(silent) 전달 플랫폼인 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘이 관심 부위에서 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘에 대해 직접 전사 반응을 일으키지 않는 침묵 전달 플랫폼인 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘이 마그네슘 이온 및/또는 생물학적 활성 카고 분자에 의해 안정화된 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘내 Mg:Ca의 비가 적어도 1:25, 더 바람직하게는 적어도 1:20, 더 바람직하게는 적어도 1:10, 더 바람직하게는 적어도 1:5, 더 바람직하게는 적어도 1:4, 가장 바람직하게는 1:3인 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물이 다수의 카고 분자를 포함하는 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  36. 제35항에 있어서, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물이 2개 이상의 상이한 카고 분자를 포함하는 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물이 3개 이상의 상이한 카고 분자를 포함하는 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물이 치료 백신 성분 및 면역자극제 또는 관용성 유도제를 포함하는 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 활성 카고 물질이 치료 카고 분자인 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 활성 카고 물질이 기능성 식품(nutraceutical) 카고 분자인 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 카고 물질이 단백질 항원, 생물활성 시토카인, 펩티도글리칸, 저분자량 유기 분자 및 나노입자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 카고 물질이 펩티도글리칸, 뮤라밀 디펩티드를 포함하는 펩티도글리칸 서브유닛, 자기항원, 백신 조성물, 핵산 서열, 표적 세포에 대한 PD-L1 발현을 회복시키기 위한 분자, 조직 또는 세포 균질물/현탁물/상등액, 영양소, 영양보조식품, 단백질, 펩티드 서열을 포함하는 단백질 항원 및 알레르겐으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 카고 물질이 영양소, 나노입자, 치료 분자, 백신, 핵산 분자, 예컨대 DNA 또는 RNA인 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 카고 분자를 생체외 세포로 전달하는데 사용되고, 전달된 카고 분자를 포함하는 생체외 세포는 수령자에게 재도입되고/되거나, 카고로 트랜스펙션된 생체외 세포에 의해 영향을 받은 세포가 수령자에게 재도입되는 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물이 카고 분자를 봉입하기 위해 다공성인 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 나노입자가 20 nm 내지 350 nm의 평균 직경을 가지는 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  47. 제46항에 있어서, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 나노입자의 적어도 75%가 상기 범위의 평균 직경을 가지는 것인, 치료 방법에 사용하기 위한 조성물 또는 치료 방법.
  48. 장 림프 여포의 항원 제시 면역 세포에서 PD-L1 발현을 촉진할 수 있는, 크론병의 치료 방법에 사용하기 위한 약제.
  49. 진단 또는 영상화 방법에 사용하기 위한 조성물로서, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 (AMCP)을 포함하고, 상기 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘에는 검출가능한 모이어티가 봉입된 것인 조성물.
  50. 제48항에 있어서, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물이 카고 물질을위장관내 관심 부위로 전달할 수 있는 것인, 진단 또는 영상화 방법에 사용하기 위한 조성물.
  51. 제48항에 있어서, 검출가능한 모이어티가 나노입자, 예컨대 금속-기반 나노입자 또는 금속 옥소-하이드록사이드 나노입자를 포함하는 것인, 진단 또는 영상화 방법에 사용하기 위한 조성물.
  52. (a) 칼슘 이온 (Ca2 +), 마그네슘 이온 (Mg2 +)을 포함하는 용액 및 인산염 이온 (PO4 2-)을 포함하는 용액을 제공하는 단계로서, 상기 용액 중 어느 하나 또는 둘 다 하나 이상의 생물학적 활성 카고 물질을 포함하는 단계;
    (b) 칼슘 이온 (Ca2 +), 마그네슘 이온 (Mg2 +)을 포함하는 용액과 인산염 이온 (PO4 2-)을 포함하는 용액을 혼합하여 생물학적 활성 카고 물질이 봉입된 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘을 침전시키는 단계;
    (c) 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘을 회수하는 단계; 및
    (d) 임의로 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘을 세척 및 건조하는 단계;
    를 포함하는, 봉입된 생물학적 활성 카고 물질을 함유하는 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘 조성물을 제조하는 방법.
  53. 제50항에 있어서, 칼슘 이온 (Ca2 +), 마그네슘 이온 (Mg2 +) 및 생물학적 활성 카고 분자를 포함하는 용액이 적어도 8.0의 pH에서 완충된 것인, 방법.
  54. 제50항 또는 제51항에 있어서, 생물학적 활성 카고 물질이, 봉입된 카고 물질을 포함하지 않는 상응하는 조성물에 비해, 결정상의 인산칼슘으로 전환되는 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘의 안정성을 증가시키는 것인, 방법.
  55. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 세척 및 건조 단계가 조성물을 아세톤에서 재슬러리화하고, 세척된 조성물을 원심분리를 이용하여 건조시키는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  56. 제53항에 있어서, 세척 및 건조 단계가 2회 반복되는 것인, 방법.
  57. 제50항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 및/또는 (b) 동안 pH가 8.0을 초과하는 것인, 방법.
  58. 제50항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 완충액이 Tris, HEPES, BICINE, TRICINE 또는 시트르산 완충액, 또는 리신 또는 글리신과 같은 아미노산인 것인, 방법.
  59. 제50항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 무정형의 마그네슘-치환된 인산칼슘을 약학 조성물로서 제제화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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