KR20160072795A - 일체형 유전자 치료 유도만능줄기세포 제작방법 - Google Patents

일체형 유전자 치료 유도만능줄기세포 제작방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20160072795A
KR20160072795A KR1020150177270A KR20150177270A KR20160072795A KR 20160072795 A KR20160072795 A KR 20160072795A KR 1020150177270 A KR1020150177270 A KR 1020150177270A KR 20150177270 A KR20150177270 A KR 20150177270A KR 20160072795 A KR20160072795 A KR 20160072795A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
thr
ala
ipsc
cys
gly
Prior art date
Application number
KR1020150177270A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101796518B1 (ko
Inventor
정선구
권은정
정상균
Original Assignee
한국 한의학 연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국 한의학 연구원 filed Critical 한국 한의학 연구원
Publication of KR20160072795A publication Critical patent/KR20160072795A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101796518B1 publication Critical patent/KR101796518B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/02—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • C12Y204/02008—Hypoxanthine phosphoribosyltransferase (2.4.2.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1307—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from adult fibroblasts

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)

Abstract

본 발명은 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC) 제작 요소 및 유전자 치료 요소를 결합한 원-스텝(one-step) 방법을 통해 환자 유래 체세포주로부터 유전자 치료된 유도만능줄기세포를 제작하는 방법에 관한 것으로, 상기 원-스텝(one-step)에 의해 유전적 변형을 갖는 유도만능줄기세포(induced puripotenet stem cell, iPSC) 제조방법은 성체 체세포의 역분화를 유도하는 리프로그래밍 에피좀 벡터, 및 유전자 교정 또는 돌연변이 유발 전달체를 동시에 숙주세포로 도입하여 유전자 교정된 iPSC 또는 돌연변이 유발된 질환모델 iPSC를 제조할 수 있고, 상기 유전자가 교정되거나, 돌연변이가 유발된 iPSC가 다른 종류의 정상형의 iPSC와 동일한 특징 및 상이한 특징을 나타냄으로써 질환치료용 세포치료제 또는 치료물질의 스크리닝에 사용할 수 있다.

Description

일체형 유전자 치료 유도만능줄기세포 제작방법{Method for manufacturing gene-corrected induced pluripotent stem cell combining reprogramming and gene-editing}
본 발명은 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC) 제작 요소 및 유전자 조작 요소를 결합하여 원-스텝(one-step)으로 체세포주로부터 유전자 교정 또는 질환모델의 iPSC 제조방법에 관한 것이다.
정밀한 유전자 조작 기술의 발달은 유전자 연구(genetic study)뿐만 아니라, 더욱 효과적으로 의료에의 적용을 촉진하였다. 징크-핑거 뉴클레아제(zinc-finger nucleases, ZFN), 전사 활성화인자-성 작동인자 뉴클레아제(transcription activator-like effector nucleases, TALEN), 및 짧은 회귀성 반복-카스9 뉴클레아제 시스템(short palindromic repeat-cas9 nuclease system)을 규칙적으로 갖는 미생물 무리(microbial cluster)로부터의 RNA-안내 엔도뉴클라제(RNA-guided endonucleases, RGEN)를 포함하는 강력한 분자 가위로서의 유전자 조작 도구(genome editing tool)는 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosome)를 기초로 한 상동 재조합(homologous recombination)을 응용한 방법과 더불어, 표적 유전자를 게놈(genome)으로부터 효과적으로 삽입(insert), 제거(delete) 또는 치환(replace)할 수 있도록 한다.
유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)의 발견은 자가유래의 줄기세포 이식(autologous stem cell transplantation) 및 인간 질병 모델의 새로운 전략을 위한 새로운 길을 열었고, 이는 신경질환, 혈액기형, 척수손상, 심장질환, 당뇨 및 관절염과 같은 다양한 범위의 질환에 적용될 수 있을 것이다. 게다가, 질환 모델로써의 iPSC는 상기 서술한 유전자 조작 도구와 결합할 때 더욱 유용할 것이다. 최근 연구에 의하면 세포 대체치료(cell replacement therapy) 또는 기전 연구를 통한 질병의 발병 매커니즘 연구에 적용하기 위해 유전자 조작 도구를 사용하여 유전자-변형 iPSC가 제조되었으며, 또한 상기 iPSC의 유전자 조작 효율을 증가시키기 위한 방법도 연구되고 있다(Daisy A, et al., Nature, 481: 295-305, 2012).
이와 같이, 유전자 조작 도구를 이용하여 배아줄기세포(embryonic stem cells)와 매우 유사한 인간 iPSC를 제조할 수 있는 이유는 줄기세포가 자기재생(self-renewal)을 유지하면서 끊임없이 분열하는 점 때문이다. 게다가, 무기한으로 자랄 수 있는 다양한 종류의 세포주가 있음에도 iPSC가 다양한 세포로의 분화할 수 있는 능력이 있어, iPCS에 유전자 조작도구를 적용하여 유전자 조작된 iPSC를 제조하기 위해 많은 연구가 진행 중에 있다(Matthias Stadtfeld et al., Science, 322(5903): 945-949, 2008). 그러나, 기존의 유전자 조작 도구를 iPSC에 적용하기 위해서는 일반적으로 유도만능줄기세포를 제작하고, 제작된 유도만능줄기세포에 유전자 조작도구를 도입해야 하는 단계를 거쳐야 하는 단점이 있다. 즉, 노동력, 비용, 시간 투여 등의 번거로운 과정이 필요하다.
진행성 골화성 섬유이형성증(fibrodysplasia ossificans progressiva, FOP)은 선천성 질환으로 ACVR1 유전자에 상염색체 우성 돌연변이(autosomal dominant mutation)에 의해 결합조직(connective tissue) 및 근육조직(muscle tissue)의 이소성골화(heterotopic ossification)를 형성하는 질환이다. ACVR1 유전자는 제 1형 액티빈 A 수용체(activin A type I receptor)를 암호화하고 있고, ALK2라고도 불리는데, 진행성 골화성 섬유이형성증의 대표적인 돌연변이 형태는 ACVR1 p.R206H이며, 이 유전자에서 발현된 수용체 단백질이 활성화되어 이 질환을 유발한다.
FOP 환자로부터 유래된 iPSC의 제조 시에는 환자유래 세포의 ACVR1 p.R206H에 유전적 변이가 나타남으로써 iPSC 생산 단계에서 이례적으로 콜로니(colony)가 확인되었다 하더라도, 이 콜로니는 줄기세포로써 비정형성을 나타내며, 상기 iPSC를 미분화상태(undifferentiated status)로 유지하는 것이 어렵다고 알려져 있다. 따라서, FOP 환자 유래의 iPSC에 유전자 조작 도구를 도입하는 것은 제한이 있고, 이는 연구자들로 하여금 FOP 유래 체세포에 직접적인 유전자 조작을 적용하기 위해 다른 방법을 시도하게 만든다.
이에, 본 발명자들은 iPSC의 제조를 용이하게 할 수 있고, FOP와 같이 환자 유래 iPSC의 제조가 어려운 문제를 해결하고자 실험을 수행하던 중, 성체 체세포의 역분화를 유도하는 리프로그래밍 에피좀 벡터, 및 유전자 교정 또는 돌연변이 유발 전달체를 동시에 성체 체세포로 도입하여 유전자 교정된 iPSC 또는 돌연변이 유발된 질환모델 iPSC를 제조할 수 있고, 상기 유전자가 교정되거나, 돌연변이가 유발된 iPSC가 다른 종류의 정상적인 iPSC와 동일한 특징 또는 상이한 특징을 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC) 제작 요소 및 유전자 치료 요소를 결합한 원-스텝(one-step) 방법을 통해 환자 유래 체세포주로부터 유전자 치료된 유도만능줄기세포, 및 유전자 기능 연구를 위해 체세포로부터 유전자 편집된 유도만능줄기세포를 제작하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기를 포함하는 유전자 교정된 iPSC의 제조방법을 제공한다:
1) 개체에서 분리된 성체 체세포에 리프로그래밍 에피좀 벡터(reprogramming episomal vector) 및 돌연변이 교정 전달체를 동시에 도입하여 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)를 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 제조된 iPSC를 선별하는 단계.
또한, 본 발명은 하기를 포함하는 유전자 교정된 iPSC의 제조방법을 제공한다:
1) FOP 환자에서 분리된 섬유아세포에 리프로그래밍 에피좀 벡터(reprogramming episomal vector), 서열번호 1로 구성되는 sgRNA 및 서열번호 2로 구성되는 ssODN으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 동시에 도입하여 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)를 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 제조된 iPSC를 선별하는 단계.
아울러, 본 발명은 하기를 포함하는 질환모델 iPSC의 제조방법을 제공한다:
1) 분리된 성체 체세포에 리프로그래밍 에피좀 벡터 및 돌연변이 유발 전달체를 동시에 도입하여 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)를 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 제조된 iPSC를 선별하는 단계.
본 발명의 원-스텝(one-step)에 의해 유전적 변형을 갖는 유도만능줄기세포(induced puripotenet stem cell, iPSC) 제조방법은 성체 체세포의 역분화를 유도하는 리프로그래밍 에피좀 벡터, 및 유전자 교정 또는 돌연변이 유발 전달체를 동시에 숙주세포로 도입하여 유전자 교정된 iPSC 또는 돌연변이 유발된 질환모델 iPSC를 제조할 수 있고, 상기 유전자가 교정되거나, 돌연변이가 유발된 iPSC가 다른 종류의 정상형의 iPSC와 동일한 특징 및 상이한 특징을 나타냄으로써 질환치료용 세포치료제 또는 치료물질의 스크리닝에 사용할 수 있다.
도 1a는 히포크산틴-구아닌 포스포리보실전이효소 1(Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase 1, Hprt1)가 녹아웃(knockout)된 유도만능줄기세포(induced puripotenet stem cell, iPSC)를 제조하기 위한 TALEN 및 Hprt1 서열의 쌍을 나타내는 도이다.
도 1b는 TALEN 플라스미드가 형질감염된 섬유아세포주의 게노믹(genomic) DNA를 주형으로 생산된 PCR 산물로 수행한 T7 엔도뉴클레아제 I(T7 endonuclease I, T7EI) 어세이(assay) 결과를 나타내는 도이다.
도 1c는 원-스텝(one-step)으로 Hprt1가 녹아웃된 iPSC 제조방법을 나타내는 도이다.
도 1d는 Hprt1 돌연변이가 유발된 클론의 단일-가닥 구조다형성(single-strand conformation polymorphism, SSCP) 어세이 결과를 나타내는 도이다.
도 1e는 Hprt1 돌연변이가 유발된 클론의 히포크산틴 아미노프테린 티미딘(Hypoxanthine-aminopterin thymidine, HAT) 배지에서의 민감성 및 6-티오구아닌(6-thioguanine, 6-TG)에 저항성을 확인한 도이다.
도 1f는 SSCP 어세이, 또는 HAT 또는 6-TG 처리에 의한 Hprt1 돌연변이가 유발된 클론의 서열을 확인한 도이다.
도 2a는 Hprt1 돌연변이 iPSC의 네거티브 선별(negative selection)을 나타내는 도이다:
i: 인간 섬유아세포;
ii: 네거티브 선별되거나 선별되지 않은 Hprt1 돌연변이 iPSC;
iii: 6-TG 처리 1일 후; 및
iV: 6-TG 처리 5일 후.
도 2b는 생성된 Hprt1 돌연변이 iPSC의 수를 확인한 도이다.
도 2c는 정상형 또는 Hprt1 돌연변이 iPSC로부터 수득된 PCR 산물의 T7EI 어세이 결과를 나타내는 도이다.
도 3a는 AAVS1 유전자를 위한 단일-가이드 RNA(single-guided RNA, sgRNA)를 나타내는 도이다.
도 3b는 sgRNA가 도입된 섬유아세포의 게놈 (genomic) DNA를 주형으로 생산된 PCR 산물로 수행한 T7 엔도뉴클레아제 I(T7 endonuclease I, T7EI) 어세이(assay) 결과를 나타내는 도이다.
도 3c는 원-스텝(one-step)으로 sgRNA가 도입된 iPSC 제조방법을 나타내는 도이다.
도 3d는 정상형 또는 sgRNA가 도입된 iPSC로부터 수득된 PCR 산물의 T7EI 어세이 결과를 나타내는 도이다.
도 3e는 sgRNA에 의해 유전자 결실이 일어난 클론의 서열을 확인한 것이다.
도 4a는 FOP 환자 유래 세포주로부터 기존의 방법으로 iPSC로 분화유도 후 생성된 콜로니를 나타내는 도이다.
도 4b는 기존의 방법으로 제조된 FOP 환자 유래 iPSC의 분화 상태를 나타내는 도이다.
도 4c는 기존의 방법으로 제조된 FOP 환자 유래 iPSC의 전분화능 마커의 발현을 세미-정량(semi-quantitative) RT-PCR로 확인한 도이다.
도 5a는 FOP 환자 유래 iPSC에 GFP 발현 벡터를 도입하고 1일 후, GFP의 발현을 확인한 도이다.
도 5b는 FOP 환자 유래 iPSC에 GFP 발현 벡터를 도입하고 15일 후, GFP의 발현을 확인한 도이다.
도 5c는 도 5b를 확대하여 나타낸 도이다.
도 5d는 도 5c에서 보이는 알칼리 포스파타제(alkine phsphatase)와 GFP 발현 세포주를 나타내는 도이다.
도 5e는 FOP 환자 유래 iPSC에 GFP 발현 벡터를 도입한 후, LDN-193189를 농도별로 처리하여 FOP 환자 유래 iPSC의 GFP 발현 및 알칼리 포스파타제 염색 결과를 나타내는 도이다.
도 6a는 ACVR1 유전자를 위한 단일-가이드 RNA(single-guided RNA, sgRNA)를 나타내는 도이다.
도 6b는 FOP 유래 섬유아세포에 단일-가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(single-strand oligodeoxynucleotide, ssODN) 주형매개의 복구상동인도복구(homology-directed repair, HDR) 효율을 나타내는 도이다.
도 6c는 심층 염기서열 분석을 통해 FOP 유래 섬유아세포에 도입된 sgRNA의 표적 효율을 나타내는 도이다.
도 6d는 심층 염기서열 분석을 통해 FOP 유래 섬유아세포에 도입된 ssODN의 표적 효율을 나타내는 도이다.
도 6e는 FOP 유래 섬유아세포로부터 유전자 교정된 iPSC를 제조하는 방법을 나타내는 도이다.
도 6f는 유전자 교정된 FOP 환자 유래 iPSC의 후보군을 찾기 위한 유전형을 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 6g는 상동인도복구된 FOP 환자 유래 iPSC의 서열 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 7a는 ACVR1 sgRNA에 대한 온-타겟(on-target)과 오프-타겟(off-target) 후보군을 나타내는 도이다.
도 7b는 오프-타겟을 확인하기 위해 ACVR1과 오프-타겟 후보 유전자인 FILIP1L, RIC8A 및 BYSL의 서열과 PCR 증폭을 위한 프라이머 결합 부위를 나타내는도이다.
도 7c는 오프-타겟 후보군들에 대한 T7 엔도뉴클레아제 어세이 방법을 통해 오프-타겟 여부 및 ACVR1 sgRNA의 효율을 나타내는 도이다.
도 8은 FOP 환자 유래 섬유아세포 및 유전자 교정된 iPSC의 서열분석 결과를 나타내는 도이다.
도 9a는 유전자가 교정된 FOP 환자 유래 iPSC에서 알칼리 포스파타제의 발현을 확인한 도이다.
도 9b는 유전자가 교정된 FOP 환자 유래 iPSC에서 다분화능 마커의 발현을 확인한 도이다.
도 9c는 유전자가 교정된 FOP 환자 유래 iPSC의 핵형 분석 결과를 나타내는 도이다.
도 10a는 줄기세포배지에서 배양한 iPSC에 대한 본 코사(von kossa) 염색 결과를 나타내는 도이다.
도 10b는 미네랄 분화 조건에서 배양한 분화세포에 대한 본 코사 염색 결과를 나타내는 도이다.
이하, 본 발명의 용어를 설명한다.
본 명세서에 사용된 용어 '원-스텝(one-step)은 리프로그래밍(reprogramming) 및 유전자 편집(gene-editing)을 동시에 도입하는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 '리프로그래밍 에피좀 벡터(reprogramming episomal vector)'는 염색체에 유입되지 않은 벡터, 즉, 에피좀 벡터에서 역분화를 유도할 수 있는 OCT4, shp53, SOX2, Klf4, Lin28 및 L-myc과 같은 전사조절 유전자가 발현될 수 있도록 제작된 벡터를 의미한다.
예를 들어, OCT4, shp53, SOX2, Klf4, Lin28 및 L-myc로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 전사조절 유전자를 포함하는 벡터를 의미할 수 있다.
상기 벡터는 OCT4-shp53를 포함하는 벡터, Sox2-Klf4를 포함하는 벡터, 및 Lin28-L-myc를 포함하는 벡터를 의미할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 '레쉬니한 신드롬(Lesch-nyhan syndrome)'은 히포크산틴-구아닌 포스포리보실전이효소 1(Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase 1, Hprt1) 유전자의 기능이 상실되어 나타나는 질환이다.
본 명세서에서 사용된 용어 '탈렌(TALEN)'은 DNA 표적 부위를 특이적으로 인지하는 TAL 영향 DNA 결합 도메인(TAL effect DNA binding domain)이 결합되어 있는 제한효소에 의해 DNA 표적 부위를 자르는 시스템을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 '골화성 섬유이형성증(fibrodysplasia ossificans progressiva, FOP)'은 ACVR1 유전자의 돌연변이에 의한 기능성 획득(gain-of function)을 통해 계속적으로 BMP 신호전달이 유도되기 때문에, BMP 신호전달에 의한 뼈 발달이 촉진되어, 근육이나 연결조직들이 골화되는 질환이다.
본 명세서에 사용된 용어 '단일-가이드 RNA(single-guided RNA, sgRNA)'는 표적 DNA 서열에 상보성을 갖는 RNA로 crRNA 및 tracrRNA로 구성되어 있다.
본 명세서에 사용된 용어 '단일-가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(single-strand oligodeoxynucleotide, ssODN)'는 한가닥의 DNA로 구성되어 있고, 비정상 염기(base)를 정상 염기로 교체하기 위하여 정상 유전자의 공여자(donor)로 사용된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
상기목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기를 포함하는 유전자 교정된 iPSC의 제조방법을 제공한다:
1) 개체에서 분리된 성체 체세포에 리프로그래밍 에피좀 벡터(reprogramming episomal vector) 및 돌연변이 교정 전달체를 동시에 도입하여 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)를 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 제조된 iPSC를 선별하는 단계.
상기 개체는 돌연변이가 발생하거나 발생할 가능성이 있는 인간을 포함하는 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간을 포함하며, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 1)의 개체는 골화성 섬유이형성증(fibrodysplasia ossificans progressiva, FOP) 또는 판코니 빈혈(fanconi anemia) 환자인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않으며, 유전자의 돌연변이에 의해 발생할 수 있는 질환의 환자이면 모두 적용가능하다.
상기 단계 1)의 성체 체세포는 인간 유래 섬유아세포인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않으며, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등 모든 동물 유래 체세포를 모두 사용할 수 있다. 또한, 상기 iPSC의 배양은 당업계에서 일반적으로 사용되는 배아줄기세포 배양조건으로 배양되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 1)의 리프로그래밍 에피좀 벡터는 Oct4, shp53, Sox2, Klf4, Lin28 및 L-myc으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 1)의 돌연변이 교정 전달체는 유전자 가위를 포함하는 것이 바람직하고, 상기 유전자 가위는 ZFN(zinc-finger nuclease), TALEN(transcription activator-like effector nuclease) 및 RGEN(RNA-guided DNA endonuclease)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 것이 바람직하나, 본 발명의 실시예에 의하면 RGEN을 이용하여 수행하였다. 또한, 상기 RGEN 유전자 가위를 이용하는 돌연변이 교정 전달체는 단일-가이드 RNA(single-guided RNA, sgRNA) 또는 단일-가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(single-strand oligodeoxynucleotide, ssODN)를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 sgRNA는 서열번호 27로 구성되거나, ACVR1 p.R206H 돌연변이를 표적으로 하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 ssODN은 서열번호 28으로 구성되거나, ACVR1 c.617G>A 돌연변이를 복구하기 위한 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 방법으로 제조된 유전자 교정된 iPSC는 배양 후 3 내지 4주일 때 1차적인 iPSC 콜로니들을 분리하여 마트리겔(matrigel)이 코팅된 플레이트로 옮겨 배양을 지속하는 것을 특징으로 하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 상기 iPSC는 섬유아세포 배지에 48시간 동안 배양한 후, 줄기세포 배지로 교체하여 배양을 지속하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
또한, 상기 방법으로 제조된 유전자 교정된 iPSC는 대립 유전자 중에 적어도 하나는 공여체 DNA가 표적에 삽입되어 있고, 동시에 다른 대립유전자 위치에 알젠에 의한 삽입-결실(indel) 돌연변이가 생성되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 1)에서 제조된 iPSC를 선별하는 상기 단계 2)는 당업계에서 공지된 유전자 교정 여부를 확인하는 방법으로 선별할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명자들은 원-스텝(one-step) 전략을 이용하여 골화성 섬유이형성증(fibrodysplasia ossificans progressiva, FOP) 환자 유래 세포주로부터 iPSC를 제조하기 위하여, ACVR1 p.R206H 돌연변이를 표적으로 하는 단일-가이드 RNA(single-guided RNA, sgRNA) 또는 단일-가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(single-strand oligodeoxynucleotide, ssODN) 주형을 리프로그래밍 에피좀 벡터와 함께 전기천공법으로 FOP 환자 유래 섬유아세포에 도입한 뒤, 이를 확인한 결과 292 bp 길이의 PCR 앰플리콘으로부터 각각 191 bp 및 101 bp 길이로 잘린 두 개의 밴드가 확인되었으며, 공여체 DNA 제작시 고려사항인 유전형질 분석을 통한 스크리닝의 편의를 위해 의도적으로 유발한 숨은 돌연변이를 통해 공여체 DNA의 표적 효율성이 약 6.5%임을 확인하였다(도 6b 참조).
또한, 상기 방법으로 제조된 유전자 교정된 FOP 환자 유래 iPSC의 유전형을 분석한 결과, 유전형을 확인한 88개의 클론 중 8개의 클론은 대립 유전자 중에 적어도 하나는 공여체 DNA가 표적에 삽입되어 있었고, 표적 빈도(targeting frequency)는 약 9%로 확인되었고(도 6g 참조), 서열분석 결과, FOP 환자에서 돌연변이된 잔기가 야생형의 공여자 DNA로 치환된 것을 확인하였다(도 8 참조).
또한, 본 발명의 유전자 교정된 FOP 환자 유래 iPSC의 알칼리 포스파타제의 발현을 확인한 결과, 유전자가 교정된 FOP 환자 유래 iPSC에서 강한 알칼리 포스파타제의 발현이 관찰되었다(도 9a 참조). 다분화능 마커의 발현을 확인한 결과 SOX2 및 DNMT3B의 발현이 FOP 환자 유래 iPSC에서는 감소하였으나, 유전자가 교정된 FOP 환자 유래 iPSC에서는 정상형과 유사한 정도로 강하게 발현하였으며(도 9b 참조), 핵형을 분석한 결과, 유전자 교정된 FOP 환자 유래 iPSC가 일반적인 핵형을 가지고 있음을 확인하였다(도 9c).
또한, 본 발명의 유전자 교정된 FOP 환자 유래 iPSC의 유전자 교정 효과를 확인한 결과, FOP 환자 유래 세포주로부터 원스텝(one-step) 방법을 통해 유전자 교정된 줄기세포는 야생형 iPSC와 유사한 형태를 보이는 반면, FOP 환자 유래 세포로부터 제작된 줄기세포의 경우 다량의 미네랄을 함유하여 검은 부분이 강하게 나타나는 것을 확인하였다(도 10a 및 10b 참조).
결론적으로, 본 발명의 iPSC 제조방법은 기존에 제작이 어려웠던 FOP 환자 유래 섬유아세포로부터 효과적으로 iPSC를 제조하였고, 이를 FOP 치료에 사용할 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 하기를 포함하는 유전자 교정된 iPSC의 제조방법을 제공한다:
1) FOP 환자에서 분리된 섬유아세포에 리프로그래밍 에피좀 벡터(reprogramming episomal vector), 서열번호 27로 구성되는 sgRNA 및 서열번호 28으로 구성되는 ssODN으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 동시에 도입하여 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)를 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 제조된 iPSC를 선별하는 단계.
아울러, 본 발명은 하기를 포함하는 질환모델 iPSC의 제조방법을 제공한다:
1) 분리된 성체 체세포에 리프로그래밍 에피좀 벡터 및 돌연변이 유발 전달체를 동시에 도입하여 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)를 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 제조된 iPSC를 선별하는 단계.
상기 단계 1)의 성체 체세포는 인간 유래 섬유아세포인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않으며, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등 모든 동물 유래 체세포를 모두 사용할 수 있다. 또한, 상기 iPSC의 배양은 배아줄기세포 배양조건으로 배양되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 1)의 리프로그래밍 에피좀 벡터는 Oct4, shp53, Sox2, Klf4, Lin28 및 L-myc으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 발현하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 1)의 돌연변이 유발 전달체는 유전자 가위를 포함하는 것이 바람직하고, 상기 유전자 가위는 ZFN(zinc-finger nuclease), TALEN(transcription activator-like effector nuclease) 및 RGEN(RNA-guided DNA endonuclease)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 것이 바람직하나, 본 발명의 실시예에 의하면 TALEN을 선택하여 사용하였다. 또한, 상기 TALEN을 포함하는 돌연변이 유발 전달체는 히포크산틴-구아닌 포스포리보실전이효소 1(Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase 1, Hprt1)을 녹아웃시키는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않으며, Hprt1을 녹아웃시키기 위해 TALEN에 인식되는 유전자 서열은 서열번호 29 또는 서열번호 30로 구성된 서열을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 Hprt1은 서열번호 31으로 구성된 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 질환은 레쉬니한 증후군(Lesch-Nyhan syndrome)인 것이 가장 바람직하나, 특정 유전자의 돌연변이에 의해 발생하는 질환으로 대사질환, 암 질환, 뇌질환, 심혈관 질환, 혈액질환, 골질환 등을 모두 포함하는 모든 유전질환에 적용가능하다.
상기 방법으로 제조된 유전자 교정된 iPSC는 배양 후 3 내지 4주일 때 1차적인 iPSC 콜로니들을 분리하여 마트리겔(matrigel)이 코팅된 플레이트로 옮겨 배양을 지속하는 것을 특징으로 하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 상기 iPSC는 섬유아세포 배지에 48시간 동안 배양한 후, 줄기세포 배지로 교체하여 배양을 지속하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명자들은 원-스텝(one-step) 전략을 이용한 레쉬니한 증후군(Lesch-Nyhan syndrome)의 특징을 갖는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)를 제조하기 위하여, 히포크산틴-구아닌 포스포리보실전이효소 1(Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase 1, Hprt1) 녹아웃 벡터 및 리프로그래밍 에피좀 벡터(reprogramming episomal vector)를 동시에 전기천공법으로 정상형의 섬유아세포에 도입하였고, 그 결과 약 10%의 효율로 유전자 조작이 일어난 것을 확인하였고(도 1b 참조), 알칼리 포스파타제 염색 결과 상기 방법으로 제조된 일부 클론에서 리프로그래밍과 동시에 유전자 조작이 동시에 수행되었고, 그 효율은 대조군과 비교하여 36%로 나타났다(도 1c 및 도 2a 참조).
또한, 상기 방법으로 생성된 세포로부터 유전자 조작된 iPSC를 선별하여 돌연변이 부근의 서열을 분석하여 이를 확인한 결과, Hprt1이 제거되어 6-TG에 저항성을 나타내는 클론들의 일부가 정상형에서 다른 형태의 단일-가닥 구조다형성을 나타낼 뿐만 아니라(도 1d 참조), 히포크산틴 아미노프테린 티미딘(Hypoxanthine-aminopterin thymidine) 배지에서 성장이 가능하고(도 1e 참조), 서열분석 결과 TALEN의 왼쪽 및 오른쪽 팔에서 염기들의 삽입 또는 결실을 확인하였다(도 1f 참조).
아울러, T7 엔도뉴클레아제 I(T7 endonuclease I, T7E1) 어세이(assay)를 통한 유전자 조작된 iPSC를 확인한 결과, 재생된 DNA 혼합생산물(mixture product)이 모두 T7E1에 의해 잘림으로써(도 2c 참조), 모든 분리된 클론들이 TALEN에 의해 돌연변이가 일어났음을 확인하였다.
결론적으로, 본원발명의 질환모델 iPSC의 제조방법은 정상형의 성체 체세포로부터 단시간에 경제적으로 질환모델 iPSC를 제조할 수 있으므로, 상기 질환모델 iPSC를 이용한 특정 질환의 약물 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 원-스텝(one-step) 전략을 이용한 레쉬니한 증후군( Lesch - Nyhan syndrome)의 특징을 갖는 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell, iPSC )의 제조
<1-1> 히포크산틴 -구아닌 포스포리보실전이효소 1의 녹아웃 및 리프로그래밍에피좀 벡터의 도입
X-염색체와 연결된 히포크산틴-구아닌 포스포리보실전이효소 1(Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase 1, Hprt1)의 결핍에 의해 발생하는 레쉬니한 증후군의 유전적 특징을 갖는 세포주를 다음과 같은 방법으로 제조하였고, 상기 세포주를 제조하기 위해 리프로그래밍 에피좀 벡터(reprogramming episomal vector, Addgene, 미국)를 사용하였는데, 이는 일본의 신야 야마나카에 의해 제조된 것으로 앱스테인-B-바이러스(Ebstein-B-virus)의 바이러스 유전자인 EBNA-1이 도입된 pCXLE라는 벡터인데, 바이러스처럼 에피좀의 성격을 나타내는 특징이 있다. 이 빈 벡터에 OCT4-shp53, Sox2-Klf4, Lin28-L-myc이 각각 짝을 이루어 존재하고, 특히 OCT4-shp53의 경우 OCT4는 CAG 프로모터에 의해, shp53은 U6 프로모터에 의해 발현되며 그 외 나머지 유전자들은 모두 CAG 프로모터의 조절을 받는다.
구체적으로, 1 x 106 개의 섬유아 세포주를 150 ㎕의 R-버터에서 희석한 후, 2 ㎍의 X-염색체 연결된 히포크산틴-구아닌 포스포리보실전이효소 1을 녹아웃(knock out) 시키기 위한 TALEN 벡터(vector)(도 1a), 및 1.5 ㎍의 세포의 리프로그래밍(reprogramming)을 위한 리프로그래밍 에피좀 벡터(reprogramming episomal vector)를 첨가하여 Neon 전기천공기를 사용하여 1,200 V, 30 ms, 2x pulses의 조건으로 전기천공법을 이용하여 상기 섬유아 세포주에 동시에 도입하였다. 도입 후, 48시간 동안 섬유아세포 배지(10% FBS가 포함된 DMEM 배지)에 배양하였고, 도 1b에 나타난 바와 같이 유전자 조작 효율은 약 10%인 것으로 확인되었다(도 1b). 상기 제조된 세포를 섬유아세포 배지에 배양한 48시간 후, 줄기세포 배지(mTesR1)로 교체하여 세포를 배양하였다. 줄기세포 배지에서 배양 2주 후, 미성숙한 iPSC가 형성되면 1x 6-티오구아닌(6-thioguanine)을 줄기세포 배지에 첨가하여 배양을 지속하고, 배지는 5일 동안 매일 교체였다.
그 결과, 형질감염 20일 후, 상기 방법으로 제조된 클론에서 TALEN 매개의 Hprt1 유전자의 제거에 의해 6-티오구아닌(6-thioguanine, 6-TG)에 저항성을 나타내는 일부 전-iPSC(pre-iPSC) 클론을 선별하였고, 줄기세포에 특이적으로 염색되는 알칼리 포스파타제의 활성을 통해 그 효율을 쉽게 검증할 수 있었다(도 1c 및 도 2a). 이들 중 일부는 리프로그래밍과 동시에 유전자 조작이 동시에 수행되었고, 그 효율은 대조군과 비교하여 36%로 나타났다.
<1-2> 생성된 세포로부터 유전자 조작된 iPSC의 선별 및 확인
상기 실시예 <1-1>의 과정에서 제조된 클론으로부터 전-iPSC를 단일-가닥 구조다형성(single-strand conformational pattern) 방법에 따라 선별하였다.
구체적으로, 6-TG에 저항성을 나타내는 21개의 Hprt1 돌연변이 클론을 팁(tip)을 사용하여 손으로 분리한 뒤, PCR 증폭하여 생성된 PCR 산물을 단일-가닥으로 변성(denaturation)하여 단일-가닥 구조다형성 젤(gel)에 전기영동하여 이를 확인하였다. 또한, TALEN에 의해 유발된 돌연변이 부근의 서열을 상기와 같은 방법으로 PCR하여 수득된 PCR 앰플리콘(amplicon)을 pTOP TA V2라는 벡터에 클로닝한 후, T 벡터에 존재하는 M13 유니버샬(universal) 프라이머를 이용하여 오토매틱 서열 분석기를 사용하여 서열 분석을 수행한 뒤, 결과 분석은 원래 야생형 서열과 비교하였으며 한쌍의 TALEN에 의해 잘린 스페이서(spacer) 부근에서 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실을 확인하였다.
그 결과, 도 1d에 나타난 바와 같이, Hprt1이 제거되어 6-TG에 저항성을 나타내는 클론들의 일부가 정상형에서 다른 형태의 단일-가닥 구조다형성을 나타낼 뿐만 아니라(도 1d), 히포크산틴 아미노프테린 티미딘(Hypoxanthine-aminopterin thymidine) 배지에서 성장이 가능함을 확인하였다(도 1e).
또한, 서열분석 결과, TALEN의 왼쪽 및 오른쪽 팔(arm) 사이의 공간에서 염기들의 삽입 또는 결실을 확인하였다(도 1f).
<1-3> T7 엔도뉴클레아제 I(T7 endonuclease I, T7E1 ) 어세이(assay)를 통한 유전자 조작된 iPSC의 확인
상기 실시예 <1-2>에서 선별된 유전자 조작된 iPSC를 사용하여 T7 엔도뉴클레아제 어세이를 수행하여 선별된 클론에 돌연변이가 생성되었는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, 돌연변이 클론 후보 및 야생형 세포주로부터 게노믹(genomic) DNA를 분리한 후, 돌연변이 예상 부위를 PCR을 수행하여 증폭하였다. 상기 증폭된 PCR 산물들로부터 야생형 세포주 유래 산물을 각각의 돌연변이 클론 후보 유래 산물들과 섞어준 뒤, 최초 95 ℃에서부터 25 ℃까지 초당 2씩 낮춰 2형이중가닥(heteroduplex) 모양을 형성시키고, 형성된 2형이중가닥에 T7E1 2 유닛(unit)을 20분간 처리한 뒤 2% 아가로스 겔(agarose gel)에 전기영동하여 이를 확인하였다.
그 결과, 재생된 DNA 혼합생산물(mixture product)이 모두 T7E1에 의해 잘린것을 확인하였고(도 2c), 이는 상기 모든 분리된 클론들이 TALEN에 의해 돌연변이가 일어났음을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 레쉬니한 증후군 모델 세포주 제조방법은 체세포로부터 iPSC를 제조하면서 동시에 질환 특이적 유전자 변형을 유발시킴으로써 효율적인 유전자 조작된 iPSC를 3 내지 4주의 단시간에 제조할 수 있다.
< 실시예 2> 원-스텝(one-step) 전략을 이용한 인간 포피 섬유아세포(human foreskin fibroblasts, hFFn ) 로부터 iPSC의 제조
<2-1> AAVS1 safe-harbor locus를 표적으로 하는 단일-가이드 RNA(single-guided RNA, sgRNA )의 도입
리프로그래밍과 유전자 조작 단계를 포함하는 상기 원-스텝 전략의 효율성을 측정하기 위해, AAVS1 safe-harbor locus 를 표적으로 하는 단일-가이드 RNA(single-guided RNA, sgRNA)를 제작하였다(도 3a). 역분화줄기세포 제작을 위해 사용되는 벡터로는 OCT4-shp53, Sox2-Klf4, Lin28-L-myc이 각각 짝을 이루어 존재하는 에피좀 벡터(Addgene, 미국)를 사용하였다. 상기 AAVS1 safe-harbor locus 를 표적으로 하는 sgRNA는 툴젠(대한민국)에 의뢰하여 제작하였다. 상기 sgRNA는 sgRNA 서열에 팸(protospacer adjacent motif, PAM) 서열(서열번호 32: CTCCCTCCCAGGATCCTCTCTGG)을 포함하도록 제작하였다.
tracrRNA와 crRNA로 구성된 sgRNA의 발현을 위해 sgRNA 플라스미드에 존재하는 U6 프로모터를 사용하였다. CAG 프로모터는 Cas9-엔도뉴클리아제를 인코딩하는 원래의 플라스미드에 존재하는 CMV 프로모터로 대체하였다. sgRNA가 도입된 iPSCs를 제조하는 방법은 다음과 같다.
구체적으로, 인간 포피 섬유아세포(human foreskin fibroblasts, hFFn)에 0.05% % TrypLETM express (Invitrogen)를 처리하여 트립신화 한 후, DPBS를 사용하여 세척하였다. 1 × 106 개의 상기 인간 포피 섬유아세포(human foreskin fibroblasts, hFFn)를 150 ㎕의 R-버터에서 희석한 후, 1.5 μg의 각각의 상기 에피좀 벡터, 1.5 μg Cas9-encoding 플라스미드, 및 1.5 μg AAVS1-sgRNA를 첨가하였다. 10 또는 100 μl 팁과 함께 Neon 전기천공기를 사용하여 1,200 V, 30 ms, 2x pulses의 조건으로 전기천공법을 이용하여 상기 첨가물을 인간 포피 섬유아세포에 도입하였다. 도입 후, 48시간 동안 섬유아세포 배지(10% FBS가 포함된 DMEM 배지)에 배양하였다.
그 결과, 도 3b에 나타난 바와 같이 유전자 조작 효율은 약 34%인 것으로 확인되었다(도 3b).
<2-2> T7 엔도뉴클레아제 I(T7 endonuclease I, T7E1 ) 어세이(assay)를 통한 유전자 조작된 iPSC의 확인
상기 실시예 2-1에 따라 제조된 세포를 섬유아세포 배지에 배양한지 48시간 후, 줄기세포 배지(mTesR1)로 교체하여 세포를 배양하였으며, 상기 배지는 매일 교체하였다. 줄기세포배지에서 배양한지 3주 후, 분화를 위해 1차 iPSC 콜로니를 각각 96-웰 플레이트에 옮겼다. 콜로니가 각 웰의 80% 를 채울때까지 이를 배양하였다(도 3c). 상기 배양된 1차 iPSC에서 50개의 iPSC 클론을 선별하여 상기 실시예 1-3에 따라 T7 엔도뉴클레아제 어세이를 수행하여, 선별된 클론에 돌연변이가 생성되었는지 여부를 확인하였다.
그 결과, 돌연변이 효율이 82%임을 확인하였고(도 3d), 이는 대부분의 분리된 클론들이 상기 sgRNA에 의해 AAVS1 safe-harbor locus 에서 돌연변이가 일어났음을 나타낸다.
<2-3> 서열분석
염기서열 분석 결과, 팸 근처에서 indel(삽입 또는 결실) 돌연변이가 일어났음을 확인하였다(도 3e).
< 비교예 1> 공지된 방법으로 진행성 골화성 섬유이형성증 ( fibrodysplasia ossificans progressiva , FOP) 환자 유래 세포주로부터 iPSC의 제조
<1-1> FOP 환자 유래 세포주로부터 iPSC로의 분화 유도
ACVR1 p.R206H에 유전적 변이를 갖는 FOP 환자로부터 분리한 체세포를 이용하여 iPSC를 제조하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 1 x 106개의 FOP 환자에서 유래한 섬유아세포주를 전기 천공법을 위해 R-버퍼 150 ㎕로 희석한 뒤, 3 종류의 리프로그래밍 에피좀 벡터인 hOCT4-shp53, hSox2-hKLF4 및 hL-myc-hLin28를 각각 1.5 ㎍씩 섞은 것을 희석하여 상기 FOP 환자 유래 섬유아세포주에 첨가하였다. 그런 다음, 상기 세포주를 Neon 전기천공기에서 1,200 V, 30 ms 및 2x pulses 조건으로 48시간 동안 섬유아세포 배지(10% FBS가 포함되어 있는 DMEM 배지)에 배양한 후에, 줄기세포 형성 전용배지인 mTesR1에서 3 내지 4주간 지속적으로 배양하여 줄기세포를 형성하였다.
그 결과, 도 4a에 나타난 바와 같이 리프로그래밍이 진행된 이후 선택할 수 있는 적절한 크기의 콜로니(colony)가 형성된 것을 확인하였다(도 4a). 대부분의 상기 콜로니들은 일반적이지 않은 형태 및 약한 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase) 활성을 나타내고 있음에도 불구하고 이들 콜로니로부터 12개를 무작위적으로 선택하여 계대배양을 지속하였다.
<1-2> FOP 환자 유래 세포주로부터 제작된 iPSC에 배양 보조세포의 공급
상기 비교예 <1-1>에서 유도된 FOP 환자 유래 iPSC 세포의 비정형적인 미분화 상태가 개선될 수 있도록, 일반적으로 사용되고 있는 MEF-배양보조세포(MEF-feeder cell)를 함께 공배양(coculture)한 뒤, FOP 환자 유래 iPSC 세포의 분화를 알칼리 포스파타제 염색으로 확인하였다.
구체적으로, 6-웰 조직배양 플레이트에 0.1% 젤라틴으로 37 ℃ 인큐베이터에서 코팅한 후 웰 당 1 x 104개의 마이토마이신(mitomycine)이 처리된 CF-1 배양보조세포를 붙여주고, 24시간 후 D-PBS로 웰에 붙어있는 배양보조세포를 세척한 후 1 x 103개의 iPSC를 그 위에서 배양하였다. 배양 7일 후, 상기 배양된 iPSC를 10% 포름알데히드로 1분간 고정하고, 0.1% TBS로 2 내지 3회 세척하여 상기 포름알데히드를 제거하였다.
한편, 제조사의 프로토콜대로 알칼리 포스파타제 염색 키트(시그마, 미국)를 제조하였다. 구체적으로, 1 ㎖ 질산나트륨(sodium nitrate)를 1 ㎖ FRV-알칼리 용액에 넣고 부드럽게 섞어 다이아조늄염(diazonium salt)을 제조한다. 상기 다이아조늄염 용액을 제조하고 2분 후, 상기 다이아조늄염 용액 및 1 ㎖의 나프톨(naphthol) AS-BI 알칼리 용액을 45 ㎖의 증류수에 순차적으로 첨가하였다. 상기 제조된 용액을 고정된 iPSC에 처리하여 상온(25 ℃)에서 15분간 방치한 뒤 수돗물로 세척하고, 이를 광학현미경 및 디지털카메라로 관찰하였다.
그 결과, 도 4b에 나타난 바와 같이 FOP 환자 유래 iPSC 세포주가 MEF-배양보조세포에 의해 적절히 부착되었으나, FOP 환자 유래 iPSC 세포주는 MEF-배양보조세포에 의해 여전히 도움을 받지 못하고 있음을 일부분만 염색된 알칼리 포스파타제 염색 결과로 확인할 수 있었다. 이는 공지된 방법으로 제조된 FOP 환자 유래 iPSC 세포주는 가장 이상적인 미분화조건인 MEF-배양보조세포와의 공배양 상태에서조차 줄기세포로서 회복이 되지 않음을 나타낸다(도 4b 오른쪽).
<1-3> FOP 환자 유래 세포주로부터 제작된 iPSC의 전분화능 유전자 발현 확인
상기 실시예 <1-1>에서 유도된 FOP 환자 유래 iPSC 세포의 전분화능을 야생형 iPSC 세포와 비교하기 위하여, 전분화능 유전자의 발현을 세미-정량(semi-quantitative) RT-PCR으로 확인하였다.
구체적으로, 세미-정량 RT-PCR을 수행하기 위하여 각각의 세포주를 트리졸(trizol, 인비트로젠, 미국)로 처리하여 전체 RNA를 추출하고, RNAeasy 미니키트(퀴아젠, 미국)를 사용하여 제조사의 프로토콜대로 RNA를 정제하였다. 상기 정제된 RNA 2 ㎍을 주형으로 iScrpit™ cDNA 합성키트(바이오래드, 미국)를 사용하여 제조사의 프로토콜대로 cDNA를 합성하였고, 이때 수행 온도는 42였다. 그리고나서, 생성된 PCR 산물을 사용하여 정량을 수행하였으며, 최초 반응에 사용한 RNA의 양을 환산하여 10 ng의 cDNA가 각각의 정량 PCR에 사용되었다. 정량분석에 사용된 PCR 조건은 95 ℃ 1분, 58 ℃ 1분, 72 ℃ 1분으로 하여 20 내지 40회로 이를 반복하였으며, 각각의 유전자에 대한 지수기(exponential phase)를 결정하였다. 대조군인 GAPDH의 경우 21회를 반복하였고, 다른 유전자에 대해서는 36회를 반복하였으며, 그 결과 생성된 PCR 앰플리콘의 10 ㎕를 2%의 아가로스 겔에 로딩하여 EtBr 염색으로 확인하였다. 각각의 유전자 정량을 위해 사용된 프라이머는 하기와 같다.
유전자 서열(5'3') 방향 서열번호
OCT4 AAGCTCCTGAAGCAGAAGAGGA 정방향 1
ATGGTCGTTTGGCTGAATACCT 역방향 2
SOX2 TGGACTTCTTTTTGGGGGACTA 정방향 3
GCAAAGCTCCTACCGTACCACT 역방향 4
LIN28A AAAGGAAAGAGCATGCAGAAGC 정방향 5
AAGTAGGTTGGCTTTCCCTGTG 역방향 6
ESG1 TCGTGGTTTACGGCTCCTATTT 정방향 7
TCACTTCATCCAAGGGCCTAGT 역방향 8
GDF3 TGTACTTCGCTTTCTCCCAGAC 정방향 9
TTCCCTTTCTTTGATGGCAGAC 역방향 10
DNMT3B TCTCACGGTTCCTGGAGTGTAA 정방향 11
GTAGGTTGCCCCAGAAGTATCG 역방향 12
GAPDH CCTCAACGACCACTTTGTCAAG 정방향 13
TCTTCCTCTTGTGCTCTTGCTG 역방향 14
그 결과, 도 4c에 나타난 바와 같이 야생형의 iPSC 세포와 비교하여 SOX2 및 DNMT3B의 발현이 낮은 것으로 나타났다(도 4c).
<1-4> FOP 환자 유래 세포주로 제작된 iPSC에서 유전자 도입시 미분화 유지능력 확인
FOP 환자 유래 세포주로 제작된 iPSC 세포를 바탕으로 유전자 교정을 시행하고자 하였다. 상기 iPSC에서 유전자 교정을 시도하기 전 전기천공법을 이용하여 유전자 조작 도구를 도입해야하는데, 그 효율을 GFP 발현 벡터를 이용해 점검하였다. FOP 환자 유래 iPSC에 GFP 발현벡터를 도입하기 위해서는 많은 양(적어도 1 x 105개의 세포들)의 미분화상태의 세포들이 필요하나, 상기 결과에서 나타난 바와 같이 FOP 환자 유래 iPSC가 미분화 상태를 유지하는 것이 어려워 1 x 106개의 FOP 환자 유래 iPSC 세포에 GFP 발현 벡터를 도입하였다.
구체적으로, FOP 환자 유래 iPSC 세포에 GFP를 비교예 <1-1>에 기재된 바와 같이 전기천공법을 사용하여 도입하였다.
그 결과, 도 5e에 나타난 바와 같이 FOP 환자 유래 세포주로 제작된 iPSC 세포주의 경우, 형질감염 1일 후 야생형 iPSC와 비슷한 양의 GFP가 발현되고 있었으나, 도입 15일째에는 야생형 iPSC가 줄기세포 콜로니(총 48개)를 더 잘 형성함을 확인하였다. 또한, 야생형 iPSC의 경우 형성된 콜로니에서 GFP 발현(총 12개)도 잘 되는 반면, FOP 환자 유래 세포주로 제작된 iPSC 세포주의 경우 1 내지 2개의 줄기세포 콜로니가 형성된 것을 확인하였다(도 5b 내지 도 5d).
또한, FOP의 원인은 ACVR1의 돌연변이 단백질인 Alk2의 지속적인 활성에 의해 나타나는데, GFP 발현 벡터를 도입한 뒤, ALk2 억제제인 LDN-193189를 처리하였음에도 불구하고, 여전히 GFP 발현되는 줄기세포 콜로니를 형성하기 어려운 것을 확인하였다(도 5e). 이는 공지된 방법에 의해 FOP 환자 유래 세포주로부터 제작한 iPSC를 바탕으로 유전자 치료를 위한 유전자 조작도구를 세포 내로 도입하는 것이 어렵다는 점을 나타낸다.
< 실시예 3> 원-스텝(one-step) 전략을 이용한 골화성 섬유이형성증 ( fibrodysplasia ossificans progressiva , FOP) 환자 유래 세포주로부터 iPSC의 제조
<3-1> ACVR1 p. R206H 돌연변이를 표적으로 하는 단일-가이드 RNA(single-guided RNA, sgRNA )의 제작
상기 <실시예 1>의 레쉬니한 증후군의 특징을 갖는 iPSC 제작 방법을 적용하여 FOP 환자 유래의 세포주로부터 iPSC를 유도하기 위해 ACVR1 유전자의 6번째 엑손의 돌연변이 잔기를 표적으로 하는 단일-가이드 RNA를 제작하였다.
구체적으로, 상기 sgRNA는 ACVR1 돌연변이를 유전자 치료하기 위해 치료부위를 표적으로 하는 sgRNA 서열에 팸(protospacer adjacent motif, PAM) 서열(서열번호 15: CACACTCCAACAGTGTAATCTGG)을 포함하도록 툴젠(대한민국)에 의뢰하여 제작한 뒤, 이를 이용하여 상기 실시예 <1-3>의 방법으로 T7E1 어세이를 수행하였다.
그 결과, 상기의 방법으로 제작된 단일-가이드 RNA는 HEK293 세포에서 sgRNA-cas9 엔도뉴클레아제에 의한 표적을 절단하였고, 또한 FOP 환자의 섬유아세포에서도 위치 특이적으로 표적 유전자를 절단하는 것을 확인하였다.
<3-2> 단일-가닥 올리고데옥시뉴클레오티드 (single-strand oligodeoxynucleotide , ssODN) 주형의 제작
상동인도복구(homology-directed repair, HDR)를 위한 공여체 DNA로서 단일-가닥 올리고데옥시뉴클레오티드 주형을 제작하였다.
구체적으로, 공여체 DNA는 총 90개의 잔기로 이루어진 ssODN으로 Integrated DNA technology(IDT) 회사로부터 주문 및 제작되었고, 상기 제작된 공여체 DNA의 위치는 ACVR1 c.617G>A 돌연변이의 교정을 목적으로 하기 때문에 돌연변이 위치와 알젠(RGEN)에 의해 잘릴것으로 예상되는 잔기를 중심으로 양쪽으로 총 90개 잔기를 갖는 공여체 DNA의 서열을 정하였다.
그 결과, 도 6a에 나타난 바와 같이 ACVR1 c.617G>A 돌연변이를 복구하기 위하여, 제작된 ssODN은 크게 세 가지 부분을 고려하였다. 첫째, c.617 돌연변이된 알라닌(alanine) 부위를 야생형의 구아닌(guanine)으로 치환해야 하기 때문에 야생형 잔기를 포함하고 있고, 둘째, 유전자 교정이 되었다 하더라도 ACVR1의 알젠이 계속해서 작용할 경우 교정에 제공된 공여체 DNA에 또 다른 돌연변이가 발생할 수 있기 때문에 일단 교정된 공여체가 알젠에 의해 영향을 받지 않도록 팸 서열에 숨은 돌연변이(silent mutation)을 의도적으로 유발하였으며, 셋째, 최종적으로 교정된 클론을 유전형질 분석(genotyping)을 이용한 스크리닝을 위해 제한효소인 Hpy188I가 인식할 수 있도록 두 번째 고려사항을 포함하여 숨은 돌연변이를 같은 잔기에 유발하였다.
<3-3> sgRNA 및 ssODN의 FOP 환자의 섬유아세포로의 도입
FOP 환자로부터 분리한 섬유아세포에 상기 실시예 <1-1>에서 제조한 리프로그래밍 에피좀 벡터, 및 상기 실시예 <3-1> 및 <3-2>에서 제작된 sgRNA 및 ssODN을 상기 실시예 <1-1>에 기재된 바와 같이 전기 천공법을 이용하여 동시에 도입한 뒤 유전자가 교정된 iPSC의 일부를 수득하여 공여체 DNA의 표적 효율을 확인하기 위해 게놈 DNA를 추출하여 교정부위를 중심으로 PCR 앰플리콘을 합성하였다.
그 결과, PCR 앰플리콘에 제한효소인 Hpy188I를 처리한 결과, 도 6b에 나타난 바와 같이 아가로스 겔에서 292 bp 길이의 PCR 앰플리콘으로부터 각각 191 bp 및 101 bp 길이로 잘린 두 개의 밴드가 확인되었다(도 6b).
이는 상기 설명한 바와 같이 공여체 DNA 제작시 고려사항인 유전형질 분석을 통한 스크리닝의 편의를 위해 의도적으로 유발한 숨은 돌연변이에 Hpy188I 인식 잔기가 있기 때문에 효율적으로 공여체 DNA의 표적 효율성이 약 6.5%임을 확인하였다. 효율성은 이미지 J 소프트웨어(Image J software)에서 잘린 밴드의 강도(intensity)를 측정하여 결정하였다.
<3-4> 심층 염기서열(Deep sequencing) 분석
상기 <3-3>에 따라 제조된 sgRNA, 및 ssODN이 도입된 iPSC의 sgRNA의 표적 효율을 확인하기 위해 심층 염기서열(deep sequencing) 분석을 실시하였다.
구체적으로, hot-start Taq polymerase, SolgTM h-Taq DNA polymerase (SolGent, 대한민국)를 사용하여 앰플리콘을 포함하는 on-target과 3개의 off-target을 PCR 증폭하였다. 각 앰플리콘의 증폭을 위해 사용되는 PCR 프라이머는 하기 표 2와 같다. 상기 앰플리콘을 5'-말단 kination을 통한 서열반응, adaptor ligation, 및 PCR 반응에 필요한 Illumina Miseq platform인 바코드화된 서열 모듈로 조작하였다. Miseq platform을 사용하여 다중 병렬 시퀀싱에 의해 얻어진 paired -end 판독은 BLAST 프로그램을 사용하여 각각의 앰플리콘에 대한 야생형에 대비하여 확인하였다. 팸으로부터 20개 이내의 염기에서 결실부분이 나타나는 것을 돌연변이가 일어난 것으로 판단하였고, Perl 스크립트를 사용하여 그 수를 확인하였다.
유전자 서열(5'3') 방향 서열번호
ACVR1/ALK2 ATCAGGAAGTGGCTCTGGTCTT 정방향 16
TGCATATTACCCACAAAGAAAGGA 역방향 17
FILIP1L TCCAAAAAGAGAAGAAGAAAACG 정방향 18
GGTACCGTGCAGGTGTTGAT 역방향 19
RIC8A CTCCCTGCCCACAGAGACT 정방향 20
GGACAGGATTCGGACACTCT 역방향 21
BYSL TCTCATCCTGGGCTCACAGT 정방향 22
CTTCCCGGAGGGTACAAGTG 역방향 23
그 결과, 다른 프라이머를 사용한 것과 달리, ALK2 프라이머를 사용한 경우에 한해 결실 부분이 나타남을 확인하였으며, mALK2-hDF에서 indel 빈도는 약 8%(2.1% ssODN-매개 homology-directed target 제외)로 나타났다(도 6c). 또한, ssODN-매개 HDT의 효율은 2.1%로 나타났다(도 6d).
<3-5> 세포의 배양
상기 실시예 <3-3>의 방법으로 생산된 세포주로부터 iPSC를 선별하기 위하여 세포를 배양하였다.
구체적으로, 공-형질감염(co-transfection) 후, 3 내지 4주일 때 1차적인 iPSC 콜로니들을 팁(tip)을 사용하여 손으로 분리한 뒤, 마트리겔이 코팅되어 있는 96-웰 플레이트에 옮겼다. 상기 방법으로 옮긴 세포는 100 ㎕의 줄기세포 배지인 mTesR1을 매일 갈아주면서 콜로니가 웰의 80%를 채울 때까지 이를 배양하였다(도 6e).
< 실시예 4> FOP 환자 유래 세포로부터 제조된 iPSC의 확인
<4-1> 유전형 분석( genotyping )
상기 <실시예 3>의 방법으로 제조 및 분화된 iPSC 세포주의 유전형을 분석하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <3-5>에서 배양된 세포를 각 웰의 절반을 사용하여 게놈의 DNA를 추출하였고, 상기 추출된 DNA를 주형으로 PCR 앰플리콘을 증폭하였다. PCR은 95 ℃ 5분; 5회 반복(95 ℃ 1분, 62 ℃ 1분, 72 ℃ 1분); 5회 반복(95 ℃ 1분, 60 ℃ 1분, 72 ℃ 1분); 25회 반복(95 ℃ 1분, 58 ℃ 1분, 72 ℃ 1분); 72 ℃ 5분의 조건으로 수행되었으며, 이때 사용한 프라이머 서열은 공여체 DNA의 측면 부위를 인식하는 것으로 서열번호 24으로 기재되는 프라이머(5'-TTTCCCCTTGTCTTAAACCAC-3') 및 서열번호 25로 기재되는 프라이머(5'-CAAGTTCAGGTGCTCCAACATT-3')로 PCR을 수행하여 수득된 PCR 앰플리콘의 공여체 DNA에 의한 유전자 교정여부를 확인하기 위하여 총 88개 클론에 대하여 Hpy188I를 처리하였다.
그 결과, 도 6f에 나타난 바와 같이, 292 bp 길이의 PCR 앰플리콘으로부터 각각 191 bp 및 101 bp 길이로 잘린 두 개의 밴드를 갖는 클론들이 확인되었다(도 6f).
또한, 도 6g에 나타난 바와 같이, 유전형을 확인한 88개의 클론 중 8개의 클론은 대립 유전자 중에 적어도 하나는 공여체 DNA가 표적에 삽입되어 있었고, 표적 빈도(targeting frequency)는 약 9%로 확인되었다. 상기 8개의 HDR 클론 중 6개는 하나의 대립유전자가 공여체 DNA의 대립유전자로 치환되었고, 동시에 다른 대립유전자 위치에 알젠에 의한 삽입-결실(indel) 돌연변이가 생성되었다. 그러나, 상기 공여체가 들어간 8개 클론 중 나머지 2개인 #13 및 #81 클론은 양쪽 대립유전자에 모두 야생형의 서열을 갖고 있었다. 알젠이 야생형 대립유전자에 영향을 주지 않고, 돌연변이 대립유전자에만 작용하며, 그에 따라 공여체 DNA 매개의 HDR이 돌연변이 대립유전자 위치에 정확하게 발생하였다(도 6g).
<4-2> 서열분석
FOP 환자 유래의 iPSC 세포주에서 유전자 교정여부는 서열분석을 통해 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <4-1>에서 생성된 클론의 두 대립유전자 서열을 확인하기 위하여 PCR 앰플리콘을 정제하여 pTOP TA V2(엔지노믹스, 대한민국) 벡터에 삽입하였고, 상기 PCR 앰플리콘이 삽입된 pTOP TA V2 벡터에 존재하는 M13에 대한 공지된 프라이머를 사용하여 서열을 분석하였다(도 6g). 상기 실시예 <4-1>에서 유전자가 교정된 것으로 확인된 클론의 유전자 교정 여부를 확인하기 위해서는 PCR 앰플리콘을 정제하여 서열번호 26으로 기재되는 프라이머(5'-AAAAGCAGATTTTCCAAGTTCCA-3')를 사용하여 서열 분석을 의뢰하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 FOP 환자에서 돌연변이된 잔기가 야생형의 공여자 DNA로 치환된 것을 확인하였다(도 8).
또한, iPSC 세포주가 성장하는 동안 그 모습을 현미경으로 관찰한 결과, 유전자 교정된 FOP 환자 유래 iPSC가 야생형 iPSC와 비슷한 형태를 나타내는 것을 확인하였고, 배양에 어떠한 제한도 없이 배양되는 것을 확인하였다.
<4-3> 알칼리 포스파타제의 발현 확인
상기 <실시예 3>의 방법으로 유도된 유전자 교정된 FOP 환자 유래 iPSC에서 알칼리 포스파타제 발현여부를 확인하기 위하여 상기 비교예 <1-2>에 기재된 바와 같이 알칼리 포스파타제 염색을 수행하였다.
그 결과, 도 9a에 나타난 바와 같이 유전자가 교정된 FOP 환자 유래 iPSC에서 강한 알칼리 포스파타제의 발현을 확인한 반면, 유전자 교정을 수행하지 않은 FOP 환자 유래 iPSC에서는 알칼리 포스파타제의 발현이 약하게 나타나는 것을 확인하였다(도 9a).
<4-4> 다분화능 마커의 발현 확인
상기 <실시예 3>의 방법으로 유도된 유전자 교정된 FOP 환자 유래 iPSC에서 전형적인 다분화능 마커로 알려진 OCT4, SOX2, LIN28A, ESG1, GDF3, DNMT3B 유전자의 발현을 상기 비교예 <1-3>에 기재된 바와 같이 세미-정량 RT-PCR을 수행하여 이를 확인하였다.
그 결과, 도 9b에 나타난 바와 같이 SOX2 및 DNMT3B의 발현이 FOP 환자 유래 iPSC에서는 감소하였으나, 유전자가 교정된 FOP 환자 유래 iPSC에서는 강하게 발현하였고, 이는 야생형의 iPSC와 비슷한 수준이었다(도 9b).
<4-5> 핵형( karyotype ) 분석
상기 <실시예 3>의 방법으로 유도한 유전자 교정된 FOP 환자 유래 iPSC를 20회 이상 계대 배양하여 T-25 조직 배양 플레이트의 85%가 가득 차게 배양한 뒤 이를 젠딕스(대한민국)에 핵형 분석을 의뢰하였다.
그 결과, 도 9c에 나타난 바와 같이 유전자 교정된 FOP 환자 유래 iPSC가 일반적인 핵형을 가지고 있음을 확인하였다(도 9c).
<4-6> FOP 환자 유래 세포주로부터 제작된 유전자 치료된 줄기세포의 유전자 교정 효과 확인
FOP 는 근육이나 결합조직 등을 구성하는 가장 기본 단위인 세포 내에 미네랄을 포함하면서 골화되는 경향을 보여 나타나는 질환이다. FOP 환자 유래 체세포에서 제작된 유전자 치료된 줄기세포의 유전자 교정효과가 FOP 환자 유래 치료안된 줄기세포와 비교하여 어느 정도 차이를 나타내는지 본코사(von Kossa) 염색방법을 통해 확인하였다.
구체적으로, 각각의 줄기세포 5 x 104개를 마트리겔(matrigel)이 코팅된 24-웰 조직배양 플레이트에서 배양하였다. 배양 24시간 후, 미네랄 분화배지[4 μM 덱사메타손(dexamethasone, 시그마, 미국), 50 ㎍/㎖ L-아스코르브산 2-포스페이트 세스퀴마그네슘 솔트 하이드레이트(L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate, 시그마, 미국), 50 ㎍/㎖ β-글리세롤포스페이트 디소듐 솔트 하이드레이트(β-glycerophosphate disodium salt hydrat, 시그마, 미국), 및 20% FBS가 첨가된 DMEM]에서 각각 7일 또는 14일간 분화를 유도하였다. 날짜별 수득한 샘플을 10% 포름알데하이드에 5분간 고정한 뒤, 수돗물로 2 내지 3회 세척 후, 5% 질산은(silver nitrate)으로 30분간 염색하고, 다시 수돗물로 2 내지 3회 세척하였다. 그리고나서, 5% 탄산나트륨(sodium carbonate) 및 10% 포름알데하이드 용액에 2분간 반응시킨 뒤, 상기 반응에 의해 검게 변한 것을 확인하고 디지털 카메라로 이미지를 촬영하였다.
그 결과, 도 10a 및 10b에 나타난 바와 같이 FOP 환자 유래 세포주로부터 원스텝(one-step) 방법을 통해 유전자 교정된 줄기세포는 야생형 iPSC와 유사한 형태를 보이는 반면, FOP 환자 유래 세포로부터 제작된 줄기세포의 경우 다량의 미네랄을 함유하여 검은 부분이 강하게 나타났다(도 10a. 및 10b).
결론적으로, 본 발명의 iPSC 제조방법은 기존에 제작이 어려웠던 FOP 환자 유래 섬유아세포로부터 효과적으로 iPSC를 제조하였고, 이를 이용하여 FOP 치료에 사용할 수 있음을 확인하였다. 뿐만 아니라, 유도만능줄기세포 환자 맞춤형의 목적으로 제작되는 만큼, 난치성 유전질환에 의한 유전자 치료를 통한 세포 치료제 개발에 있어서 상기 기술방법을 적용하면 비용, 시간, 노동력 등을 획기적으로 줄일 수 있는 효율적이고 보편적인 맞춤형 치료를 수행할 수 있을 것이다. 한편, 유전자의 기능상실(loss of function)이나, 기능획득(gain of function)을 연구하는데 있어서 상기 사례로 제시한 Hprt1에 대한 레쉬니한 증후군의 경우처럼 본 방법을 적용하면 효율적으로 돌연변이 클론을 확보할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Korea Institute of Oriental Medicine <120> Method for manufacturing gene-corrected induced pluripotent stem cell combining reprogramming and gene-editing <130> KPA151238-KR-P1 <150> KR 10-2014-0179767 <151> 2014-12-12 <160> 31 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCT4 forward primer <400> 1 aagctcctga agcagaagag ga 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCT4 reverse primer <400> 2 atggtcgttt ggctgaatac ct 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2 forward primer <400> 3 tggacttctt tttgggggac ta 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2 reverse primer <400> 4 gcaaagctcc taccgtacca ct 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LIN28A forward primer <400> 5 aaaggaaaga gcatgcagaa gc 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LIN28A reverse primer <400> 6 aagtaggttg gctttccctg tg 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESG1 forward primer <400> 7 tcgtggttta cggctcctat tt 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESG1 reverse primer <400> 8 tcacttcatc caagggccta gt 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GDF3 forward primer <400> 9 tgtacttcgc tttctcccag ac 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GDF3 reverse primer <400> 10 ttccctttct ttgatggcag ac 22 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNMT3B forward primer <400> 11 tctcacggtt cctggagtgt aa 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNMT3B reverse primer <400> 12 gtaggttgcc ccagaagtat cg 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 13 cctcaacgac cactttgtca ag 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 14 tcttcctctt gtgctcttgc tg 22 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> protospacer adjacent motif sequence <400> 15 cacactccaa cagtgtaatc tgg 23 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACVR1/ALK2 forward primer <400> 16 atcaggaagt ggctctggtc tt 22 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACVR1/ALK2 reverse primer <400> 17 tgcatattac ccacaaagaa agga 24 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FILIP1L forward primer <400> 18 tccaaaaaga gaagaagaaa acg 23 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FILIP1L reverse primer <400> 19 ggtaccgtgc aggtgttgat 20 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RIC8A forward primer <400> 20 ctccctgccc acagagact 19 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RIC8A reverse primer <400> 21 ggacaggatt cggacactct 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BYSL forward primer <400> 22 tctcatcctg ggctcacagt 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BYSL reverse primer <400> 23 cttcccggag ggtacaagtg 20 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODN forward primer <400> 24 tttccccttg tcttaaacca c 21 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODN reverse primer <400> 25 caagttcagg tgctccaaca tt 22 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for sequencing <400> 26 aaaagcagat tttccaagtt cca 23 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACVR1 sgRNA <400> 27 cacactccaa cagtgtaatc 20 <210> 28 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODN <400> 28 ctggtcttcc ttttctggta caaagaacag tggctcgtca gattacactg ttggagtgtg 60 tcggtaattc ttttttttcc tttctttgtg 90 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence recognized by TALEN <400> 29 ttatgacctt gatttatttt 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence recognized by TALEN <400> 30 attatgctga ggatttggaa 20 <210> 31 <211> 1435 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Cys Cys Thr Gly Cys Thr Thr Cys Thr 1 5 10 15 Cys Cys Thr Cys Ala Gly Cys Thr Thr Cys Ala Gly Gly Cys Gly Gly 20 25 30 Cys Thr Gly Cys Gly Ala Cys Gly Ala Gly Cys Cys Cys Thr Cys Ala 35 40 45 Gly Gly Cys Gly Ala Ala Cys Cys Thr Cys Thr Cys Gly Gly Cys Thr 50 55 60 Thr Thr Cys Cys Cys Gly Cys Gly Cys Gly Gly Cys Gly Cys Cys Gly 65 70 75 80 Cys Cys Thr Cys Thr Thr Gly Cys Thr Gly Cys Gly Cys Cys Thr Cys 85 90 95 Cys Gly Cys Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys Thr Cys Thr Gly Cys Thr 100 105 110 Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys Gly Gly Cys Thr Thr Cys Cys Thr 115 120 125 Cys Cys Thr Cys Cys Thr Gly Ala Gly Cys Ala Gly Thr Cys Ala Gly 130 135 140 Cys Cys Cys Gly Cys Gly Cys Gly Cys Cys Gly Gly Cys Cys Gly Gly 145 150 155 160 Cys Thr Cys Cys Gly Thr Thr Ala Thr Gly Gly Cys Gly Ala Cys Cys 165 170 175 Cys Gly Cys Ala Gly Cys Cys Cys Thr Gly Gly Cys Gly Thr Cys Gly 180 185 190 Thr Gly Ala Thr Thr Ala Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala 195 200 205 Ala Cys Cys Ala Gly Gly Thr Thr Ala Thr Gly Ala Cys Cys Thr Thr 210 215 220 Gly Ala Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr Thr Gly Cys Ala Thr Ala Cys 225 230 235 240 Cys Thr Ala Ala Thr Cys Ala Thr Thr Ala Thr Gly Cys Thr Gly Ala 245 250 255 Gly Gly Ala Thr Thr Thr Gly Gly Ala Ala Ala Gly Gly Gly Thr Gly 260 265 270 Thr Thr Thr Ala Thr Thr Cys Cys Thr Cys Ala Thr Gly Gly Ala Cys 275 280 285 Thr Ala Ala Thr Thr Ala Thr Gly Gly Ala Cys Ala Gly Gly Ala Cys 290 295 300 Thr Gly Ala Ala Cys Gly Thr Cys Thr Thr Gly Cys Thr Cys Gly Ala 305 310 315 320 Gly Ala Thr Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala 325 330 335 Thr Gly Gly Gly Ala Gly Gly Cys Cys Ala Thr Cys Ala Cys Ala Thr 340 345 350 Thr Gly Thr Ala Gly Cys Cys Cys Thr Cys Thr Gly Thr Gly Thr Gly 355 360 365 Cys Thr Cys Ala Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cys Thr Ala Thr Ala 370 375 380 Ala Ala Thr Thr Cys Thr Thr Thr Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Thr 385 390 395 400 Gly Cys Thr Gly Gly Ala Thr Thr Ala Cys Ala Thr Cys Ala Ala Ala 405 410 415 Gly Cys Ala Cys Thr Gly Ala Ala Thr Ala Gly Ala Ala Ala Thr Ala 420 425 430 Gly Thr Gly Ala Thr Ala Gly Ala Thr Cys Cys Ala Thr Thr Cys Cys 435 440 445 Thr Ala Thr Gly Ala Cys Thr Gly Thr Ala Gly Ala Thr Thr Thr Thr 450 455 460 Ala Thr Cys Ala Gly Ala Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Gly Cys Thr 465 470 475 480 Ala Thr Thr Gly Thr Ala Ala Thr Gly Ala Cys Cys Ala Gly Thr Cys 485 490 495 Ala Ala Cys Ala Gly Gly Gly Gly Ala Cys Ala Thr Ala Ala Ala Ala 500 505 510 Gly Thr Ala Ala Thr Thr Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Ala Thr Gly 515 520 525 Ala Thr Cys Thr Cys Thr Cys Ala Ala Cys Thr Thr Thr Ala Ala Cys 530 535 540 Thr Gly Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Gly Thr Cys Thr Thr Gly 545 550 555 560 Ala Thr Thr Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Ala Thr Ala Thr Ala Ala 565 570 575 Thr Thr Gly Ala Cys Ala Cys Thr Gly Gly Cys Ala Ala Ala Ala Cys 580 585 590 Ala Ala Thr Gly Cys Ala Gly Ala Cys Thr Thr Thr Gly Cys Thr Thr 595 600 605 Thr Cys Cys Thr Thr Gly Gly Thr Cys Ala Gly Gly Cys Ala Gly Thr 610 615 620 Ala Thr Ala Ala Thr Cys Cys Ala Ala Ala Gly Ala Thr Gly Gly Thr 625 630 635 640 Cys Ala Ala Gly Gly Thr Cys Gly Cys Ala Ala Gly Cys Thr Thr Gly 645 650 655 Cys Thr Gly Gly Thr Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Cys Cys Cys 660 665 670 Cys Ala Cys Gly Ala Ala Gly Thr Gly Thr Thr Gly Gly Ala Thr Ala 675 680 685 Thr Ala Ala Gly Cys Cys Ala Gly Ala Cys Thr Thr Thr Gly Thr Thr 690 695 700 Gly Gly Ala Thr Thr Thr Gly Ala Ala Ala Thr Thr Cys Cys Ala Gly 705 710 715 720 Ala Cys Ala Ala Gly Thr Thr Thr Gly Thr Thr Gly Thr Ala Gly Gly 725 730 735 Ala Thr Ala Thr Gly Cys Cys Cys Thr Thr Gly Ala Cys Thr Ala Thr 740 745 750 Ala Ala Thr Gly Ala Ala Thr Ala Cys Thr Thr Cys Ala Gly Gly Gly 755 760 765 Ala Thr Thr Thr Gly Ala Ala Thr Cys Ala Thr Gly Thr Thr Thr Gly 770 775 780 Thr Gly Thr Cys Ala Thr Thr Ala Gly Thr Gly Ala Ala Ala Cys Thr 785 790 795 800 Gly Gly Ala Ala Ala Ala Gly Cys Ala Ala Ala Ala Thr Ala Cys Ala 805 810 815 Ala Ala Gly Cys Cys Thr Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ala Gly Ala Gly 820 825 830 Thr Thr Cys Ala Ala Gly Thr Thr Gly Ala Gly Thr Thr Thr Gly Gly 835 840 845 Ala Ala Ala Cys Ala Thr Cys Thr Gly Gly Ala Gly Thr Cys Cys Thr 850 855 860 Ala Thr Thr Gly Ala Cys Ala Thr Cys Gly Cys Cys Ala Gly Thr Ala 865 870 875 880 Ala Ala Ala Thr Thr Ala Thr Cys Ala Ala Thr Gly Thr Thr Cys Thr 885 890 895 Ala Gly Thr Thr Cys Thr Gly Thr Gly Gly Cys Cys Ala Thr Cys Thr 900 905 910 Gly Cys Thr Thr Ala Gly Thr Ala Gly Ala Gly Cys Thr Thr Thr Thr 915 920 925 Thr Gly Cys Ala Thr Gly Thr Ala Thr Cys Thr Thr Cys Thr Ala Ala 930 935 940 Gly Ala Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Cys Thr Gly Thr Thr Thr Thr 945 950 955 960 Gly Thr Ala Cys Thr Thr Thr Ala Gly Ala Ala Ala Thr Gly Thr Cys 965 970 975 Ala Gly Thr Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala Thr Thr Cys Cys Thr Ala 980 985 990 Ala Ala Cys Thr Gly Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr Gly Cys Ala Cys 995 1000 1005 Thr Ala Thr Gly Ala Gly Cys Cys Thr Ala Thr Ala Gly Ala Cys Thr 1010 1015 1020 Ala Thr Cys Ala Gly Thr Thr Cys Cys Cys Thr Thr Thr Gly Gly Gly 1025 1030 1035 1040 Cys Gly Gly Ala Thr Thr Gly Thr Thr Gly Thr Thr Thr Ala Ala Cys 1045 1050 1055 Thr Thr Gly Thr Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr 1060 1065 1070 Thr Cys Thr Cys Thr Thr Ala Ala Ala Cys Cys Ala Cys Ala Gly Cys 1075 1080 1085 Ala Cys Thr Ala Thr Thr Gly Ala Gly Thr Gly Ala Ala Ala Cys Ala 1090 1095 1100 Thr Thr Gly Ala Ala Cys Thr Cys Ala Thr Ala Thr Cys Thr Gly Thr 1105 1110 1115 1120 Ala Ala Gly Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala Gly 1125 1130 1135 Ala Thr Ala Thr Ala Thr Thr Ala Gly Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ala 1140 1145 1150 Ala Thr Thr Gly Gly Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ala Ala Thr Thr Thr 1155 1160 1165 Thr Thr Ala Thr Ala Thr Ala Thr Gly Cys Ala Gly Gly Ala Ala Ala 1170 1175 1180 Gly Ala Ala Thr Ala Gly Ala Ala Gly Thr Gly Ala Thr Thr Gly Ala 1185 1190 1195 1200 Ala Thr Ala Thr Thr Gly Thr Thr Ala Ala Thr Thr Ala Thr Ala Cys 1205 1210 1215 Cys Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr Gly Thr Thr Ala Gly Ala Ala Ala 1220 1225 1230 Ala Gly Thr Ala Ala Gly Ala Ala Gly Cys Ala Gly Thr Cys Ala Ala 1235 1240 1245 Thr Thr Thr Thr Cys Ala Cys Ala Thr Cys Ala Ala Ala Gly Ala Cys 1250 1255 1260 Ala Gly Cys Ala Thr Cys Thr Ala Ala Gly Ala Ala Gly Thr Thr Thr 1265 1270 1275 1280 Thr Gly Thr Thr Cys Thr Gly Thr Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr 1285 1290 1295 Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ala Gly Thr Ala Gly Thr Gly Thr Thr Thr 1300 1305 1310 Cys Ala Gly Thr Ala Ala Thr Gly Thr Thr Gly Ala Cys Thr Gly Thr 1315 1320 1325 Ala Thr Thr Thr Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Thr Gly Thr Thr Cys 1330 1335 1340 Ala Ala Ala Thr Thr Ala Thr Thr Ala Cys Cys Ala Gly Thr Gly Ala 1345 1350 1355 1360 Ala Thr Cys Thr Thr Thr Gly Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Thr 1365 1370 1375 Cys Cys Cys Thr Thr Thr Thr Ala Ala Ala Thr Gly Cys Ala Ala Ala 1380 1385 1390 Thr Cys Ala Ala Thr Ala Ala Ala Thr Thr Cys Cys Cys Ala Ala Ala 1395 1400 1405 Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 1410 1415 1420 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 1425 1430 1435

Claims (16)

1) 개체에서 분리된 성체 체세포에 리프로그래밍 에피좀 벡터(reprogramming episomal vector) 및 돌연변이 교정 전달체를 동시에 도입하여 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)를 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 제조된 iPSC를 선별하는 단계를 포함하는 유전자 교정된 iPSC의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 1)의 개체는 골화성 섬유이형성증(fibrodysplasia ossificans progressiva, FOP) 환자 또는 판코니 빈혈(fanconi anemia) 환자인 것을 특징으로 하는 유전자 교정된 iPSC의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 1)의 성체 체세포는 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 유전자 교정된 iPSC의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 1)의 리프로그래밍 에피좀 벡터는 Oct4, shp53, Sox2, Klf4, Lin28 및 L-myc으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 교정된 iPSC의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 1)의 돌연변이 교정 전달체는 단일-가이드 RNA(single-guided RNA, sgRNA) 및 단일-가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(single-strand oligodeoxynucleotide, ssODN)를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 교정된 iPSC의 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 sgRNA는 서열번호 27로 구성되는 것을 특징으로 하는 유전자 교정된 iPSC의 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 sgRNA는 ACVR1 p.R206H 돌연변이를 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 유전자 교정된 iPSC 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 ssODN은 서열번호 28으로 구성되는 것을 특징으로 하는 유전자 교정된 iPSC의 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 ssODN은 ACVR1 c.617G>A 돌연변이를 복구하기 위한 것을 특징으로 하는 유전자 교정된 iPSC 제조방법.
1) FOP 환자에서 분리된 섬유아세포에 리프로그래밍 에피좀 벡터(reprogramming episomal vector), 및 서열번호 27로 구성되는 sgRNA 또는 서열번호 28으로 구성되는 ssODN 중 어느 하나를 동시에 도입하여 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)를 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 제조된 iPSC를 선별하는 단계를 포함하는 유전자 교정된 iPSC의 제조방법.
1) 분리된 성체 체세포에 리프로그래밍 에피좀 벡터 및 돌연변이 유발 전달체를 동시에 도입하여 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)를 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 제조된 iPSC를 선별하는 단계를 포함하는 질환모델 iPSC의 제조방법.
제11항에 있어서, 상기 단계 1)의 성체 체세포는 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 질환모델 iPSC의 제조방법.
제11항에 있어서, 상기 단계 1)의 리프로그래밍 에피좀 벡터는 Oct4, shp53, Sox2, Klf4, Lin28 및 L-myc으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 발현하는 것을 특징으로 하는 질환모델 iPSC의 제조방법.
제11항에 있어서, 상기 단계 1)의 돌연변이 유발 전달체는 히포크산틴-구아닌 포스포리보실전이효소 1(Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase 1, Hprt1)을 녹아웃시키는 것을 특징으로 하는 질환모델 iPSC의 제조방법.
제14항에 있어서, 상기 Hprt1은 서열번호 31으로 구성된 것을 특징으로 하는 질환모델 iPSC의 제조방법.
제11항에 있어서, 상기 질환은 레쉬니한 증후군(Lesch-Nyhan syndrome)인 것을 특징으로 하는 질환모델 iPSC의 제조방법.
KR1020150177270A 2014-12-12 2015-12-11 일체형 유전자 치료 유도만능줄기세포 제작방법 KR101796518B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20140179767 2014-12-12
KR1020140179767 2014-12-12

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160072795A true KR20160072795A (ko) 2016-06-23
KR101796518B1 KR101796518B1 (ko) 2017-11-14

Family

ID=56108334

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150177270A KR101796518B1 (ko) 2014-12-12 2015-12-11 일체형 유전자 치료 유도만능줄기세포 제작방법

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101796518B1 (ko)
WO (1) WO2016093668A2 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110331162B (zh) * 2019-06-12 2021-02-19 温州医科大学 一种主动脉夹层特异性诱导多能干细胞及疾病模型应用
EP4349967A1 (en) * 2021-06-02 2024-04-10 Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Novel pluripotent cells

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PE20150336A1 (es) * 2012-05-25 2015-03-25 Univ California Metodos y composiciones para la modificacion de adn objetivo dirigida por arn y para la modulacion de la transcripcion dirigida por arn

Also Published As

Publication number Publication date
WO2016093668A3 (ko) 2016-08-04
WO2016093668A2 (ko) 2016-06-16
KR101796518B1 (ko) 2017-11-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Xie et al. Seamless gene correction of β-thalassemia mutations in patient-specific iPSCs using CRISPR/Cas9 and piggyBac
Park et al. Functional correction of large factor VIII gene chromosomal inversions in hemophilia A patient-derived iPSCs using CRISPR-Cas9
JP7197363B2 (ja) ヌクレアーゼを使用するヒト神経幹細胞のゲノム編集
EP3498843B1 (en) Endonuclease targeting blood coagulation factor viii gene and composition for treating hemophilia comprising same
Chang et al. Modeling human severe combined immunodeficiency and correction by CRISPR/Cas9-enhanced gene targeting
Li et al. Precise correction of the dystrophin gene in duchenne muscular dystrophy patient induced pluripotent stem cells by TALEN and CRISPR-Cas9
An et al. Genetic correction of Huntington's disease phenotypes in induced pluripotent stem cells
CN110300803B (zh) 提高细胞基因组中同源定向修复(hdr)效率的方法
Jang et al. Gene correction in patient-specific iPSCs for therapy development and disease modeling
Park et al. Universal correction of blood coagulation factor VIII in patient-derived induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9
EP4036228A1 (en) Methods for the treatment of corneal dystrophies
Young et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a platform for disease modeling
Wu et al. Generation and validation of PAX7 reporter lines from human iPS cells using CRISPR/Cas9 technology
US20210169054A1 (en) Humanized heart muscle
WO2021216622A1 (en) Gene editing of gba1 in stem cells and method of use of cells differentiated therefrom
KR101796518B1 (ko) 일체형 유전자 치료 유도만능줄기세포 제작방법
Xiong et al. Efficient gene correction of an aberrant splice site in β‐thalassaemia iPSCs by CRISPR/Cas9 and single‐strand oligodeoxynucleotides
US20240060047A1 (en) Cells with sustained transgene expression
WO2020184403A1 (ja) 培養細胞の生産方法
WO2004063356A2 (en) Persistent expression of candidate molecule in proliferating stem and progenitor cells for delivery of therapeutic products
M’Barek et al. Use of human pluripotent stem cells to study and treat retinopathies
WO2016171625A1 (en) Targeting telomerase for cell therapy
Sato et al. Engineering of systematic elimination of a targeted chromosome in human cells
Yamada et al. From cloned frogs to patient matched stem cells: induced pluripotency or somatic cell nuclear transfer?
US20200149041A1 (en) Gene Therapy Drug for Granular Corneal Degeneration

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant