KR20160057941A - Screening method for therapeutic agent of mitochondria dysfunction using TRAP1 gene - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 TRAP1 유전자를 이용한 미토콘드리아 기능 장애 치료제 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 좀 더 상세하게는 (a) TRAP1을 발현하는 세포를 시험제제와 함께 또는 시험제제 없이 배양하는 단계; 및 (b) 상기 시험제제와 함께 배양된 세포에서 TRAP1의 발현 정도를 측정하고 시험제제 없이 배양된 세포에 대한 발현 정도와 비교하여 상기 시험제제가 TRAP1의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약제의 스크리닝 방법, TRAP1 유전자에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA), siRNA 및 miRNA, TRAP1에 특이적인 항체 및 TRAP1 억제물질(TRAP1 inhibitor)의 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for screening for a therapeutic agent for mitochondrial dysfunction using the TRAP1 gene, and more particularly, to a method for screening a therapeutic agent for mitochondrial dysfunction using the TRAP1 gene, comprising: (a) culturing TRAP1- And (b) measuring the level of expression of TRAP1 in cells incubated with the test agent and comparing the level of expression to the cultured cells without the test agent to determine whether the test agent inhibits the expression of TRAP1 A method for screening a drug for the prevention or treatment of diseases caused by mitochondrial dysfunction, antisense RNA for TRAP1 gene, siRNA and miRNA, antibodies specific for TRAP1 and mitochondrial dysfunction of TRAP1 inhibitor (TRAP1 inhibitor) For the prevention or treatment of diseases caused by cancer.
미토콘드리아는 그동안 단순히 세포에 에너지를 공급하는 세포소기관으로 간주되었으나, 세포사멸과정을 수행하는 중요한 세포신호 조절자라는 사실이 1990년대 들어 밝혀지면서 미토콘드리아의 다양한 생체기능에 대한 연구가 활발히 이루어지게 되었다. 최근 들어 미토콘드리아의 기능 이상이 노화과정 및 노화와 관련된 여러 질환들-암과 당뇨 등의 중요 만성질환, 순환기, 호흡기, 내장 및 내분비계 등의 중요장기의 기능 이상, 그리고 알츠하이머병이나 파킨슨병 등의 퇴행성 신경질환-의 발병과 악화에 밀접한 관련이 있다는 연구결과들이 속속 보고 되고 있다. 인슐린(insulin) 저항성을 나타내는 2형 당뇨 환자의 근육 및 간 조직에서 미토콘드리아 전자 전달계의 기능이 저하되는 것이 보고되었으며 [1], 또한 대표적인 퇴행성 신경질환인 파킨슨병 환자의 병변조직에서 미토콘드리아 전자전달계를 이루는 중요요소인 complex I의 활성이 감소됨이 관찰된 바 있다 [2]. 더욱이 파킨슨병 관련 유전자인 Parkin과 PINK1을 초파리 모델에서 결손시켰을 때, 근육과 도파민 신경세포내의 미토콘드리아가 심각하게 손상되면서 인간환자와 유사한 운동성 상실과 도파민 신경세포 손실이 발생함이 발견되어, 미토콘드리아 기능 이상과 질병발생 및 악화 기전과의 밀접한 관계를 한층 더 뒷받침 한 바 있다 [3,4]. 따라서 위에서 언급한 다양한 미토콘드리아 관련 질병의 예방 및 치료법을 개발하려는 연구 들이 활발히 이루어져, 현재 미토콘드리아를 구성하는 중요한 component 들의 활성을 조절하여 환자 체내에서 저하된 미토콘드리아의 기능을 정상화 시키려는 시도가 국내외에서 수행 중에 있다.
Although mitochondria have been regarded as cell organelles that simply supply energy to cells, they have been actively studied for various biological functions of mitochondria in the 1990s as a key cell signal regulator for cell death. Recently, it has been reported that the dysfunction of mitochondria is responsible for various diseases related to aging process and aging - important chronic diseases such as cancer and diabetes, functional abnormalities of important organs such as circulatory system, respiratory system, internal organs and endocrine system and Alzheimer's disease or Parkinson's disease Have been reported to be closely related to the onset and worsening of neurodegenerative diseases. It has been reported that the function of the mitochondrial electron transport system is reduced in muscle and liver tissues of
PINK1과 Parkin은 결손 시 autosomal recessive juvenile parkinsonism (AR-JP)발병을 유도하는 파킨슨병 관련 유전자로 cloning된 후 [5,6], 그 생체 기능 및 병태 생리적 역할에 대한 활발한 연구가 진행되어 왔다. 초기에는 Parkin이 특정 단백질에 유비퀴틴(ubiquitin)을 결합시키는 유비퀴틴 연결효소(ubiquitin ligase)임에 착안하여, Parkin과 결합하는 단백질을 발굴하여 이들과 파킨슨병과의 연관성을 탐구하는 연구가 많이 수행되었으나, 발굴된 Parkin 결합단백질과 파킨슨병의 병태생리기전과의 상관관계가 명확하지 아니하였다. 그러던 중 미토콘드리아에 위치하는 인산화효소인 PINK1의 유전자를 초파리에서 결손시키자 미토콘드리아 기능이상을 수반하는 파킨슨병 관련증상 (도파민 신경세포 감소, 운동성 저하)이 발생하였고, PINK1 유전자 결손 초파리에 Parkin을 발현시키자 미토콘드리아 기능이상과 파킨슨병 관련 증상이 모두 치유되는 실험 결과가 발표되면서 [4], PINK1과 Parkin의 미토콘드리아에서의 역할을 규명하기 위한 연구가 활발히 진행되어 현재, 기능저하를 일으켜 내막의 membrane potential이 저하된 미토콘드리아에 위치한 PINK1이 특이적으로 활성화되면서 Parkin을 손상된 미토콘드리아로 유도하여, 손상된 미토콘드리아의 remodeling을 촉발시켜 이를 수리하거나 제거하여 세포내 미토콘드리아의 기능을 유지한다는 사실이 규명되었다 [7-9]. 또한 PINK1 유전자를 활용한 다양한 유전학 및 세포생물학 실험에서 PINK1이 Parkin외의 다른 신호전달자를 통해서도 미토콘드리아의 기능을 유지한다는 사실이 규명되고 있으며 [10,11], PINK1이 Parkin 외에 신경세포보호 및 노화방지에 중요한 역할을 하는 유전자 Sir2와 FOXO를 통해 미토콘드리아 기능을 유지하고 도파민 신경세포를 보호한다는 사실이 밝혀진바있다. [12].
PINK1 and Parkin have been cloned into a Parkinson-related gene that induces autosomal recessive juvenile parkinsonism (AR-JP) at the time of deficiency [5, 6], and vigorous studies have been conducted on their biological functions and pathophysiological roles. In the early days, Parkin focused on the ubiquitin ligase, which binds ubiquitin to a specific protein. Much research has been carried out to explore the link between Parkin and Parkinson's disease, And the pathophysiology of Parkinson 's disease was not clear. However, when the gene of PINK1, a phosphorylating enzyme located in mitochondria, was deleted in Drosophila, Parkinsonism-related symptoms (dopaminergic neurons decrease, motility decrease) accompanied with mitochondrial dysfunction occurred, and when Parkin was expressed in PINK1 gene deletion Drosophila, In the present study, the effects of PINK1 and Parkin in the mitochondria were investigated. In the present study, the membrane potential of the inner membrane was decreased. PINK1, which is located in the mitochondria, specifically activates Parkin to the damaged mitochondria, triggering remodeling of the damaged mitochondria and repairing or eliminating them to maintain intracellular mitochondrial function [7-9]. In addition, in a variety of genetic and cellular biology experiments using the PINK1 gene, it has been shown that PINK1 maintains mitochondrial function through other signaling pathways other than Parkin [10,11], suggesting that PINK1 inhibits neuronal cell protection and aging It has been shown that genes Sir2 and FOXO play important roles in maintaining mitochondrial function and protecting dopamine neurons. [12].
TRAP1(TNF receptor-associated protein 1)은 미토콘드리아에 특이적으로 존재하는 heat shock protein (HSP)로써 세포질에 존재하는 90-kDa heat shock protein (HSP90)과 대단히 유사하다 [13]. 기존의 연구에서는 TRAP1이 존재할 때, 다양한 동물 세포주에서 활성산소로부터 세포를 보호하는 역할을 함이 보고되어 왔지만[14], 실질적으로 TRAP1에 의한 세포보호의 구체적인 분자기전은 밝혀지지 아니하였다.
TRAP1 (TNF receptor-associated protein 1) is very similar to the 90-kDa heat shock protein (HSP90) present in the cytoplasm as a heat shock protein (HSP) specifically present in mitochondria [13]. Previous studies have shown that when TRAP1 is present, it protects cells from reactive oxygen species in various animal cell lines [14], but the specific molecular mechanism of cell protection by TRAP1 has not been elucidated.
이에 본 발명자들은 TRAP1의 세포 내 역할 규명 및 분자기전에 대해 연구하던 중, TRAP1의 활성 또는 발현을 억제하면 세포가 활성산소에 대한 저항능력이 향상될 뿐만 아니라 PINK1 결손에 의해 유도된 미토콘드리아의 기능 장애가 회복됨을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
Accordingly, the inventors of the present invention found that inhibiting TRAP1 activity or expression while studying the intracellular role and molecular mechanism of TRAP1 not only improves the resistance of cells to reactive oxygen, but also the function of mitochondrial dysfunction induced by PINK1 deficiency And the present invention was completed.
따라서 본 발명의 목적은 (a) TRAP1(tumor necrosis factor receptor-associated protein 1)을 발현하는 세포를 시험제제와 함께 또는 시험제제 없이 배양하는 단계; 및 (b) 상기 시험제제와 함께 배양된 세포에서 TRAP1의 활성 또는 TRAP1의 발현 정도를 측정하고, 시험제제 없이 배양된 세포에서의 TRAP1의 활성 또는 TRAP1의 발현 정도와 비교하여 상기 시험제제가 TRAP1의 활성 또는 TRAP1의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for producing a tumor necrosis factor receptor-associated protein 1 (TRAP1) comprising: (a) culturing cells expressing tumor necrosis factor receptor-associated protein 1 (TRAP1) And (b) measuring the activity of TRAP1 or the expression level of TRAP1 in the cells incubated with the test agent, and comparing the activity of TRAP1 or the level of expression of TRAP1 in cells cultured without the test agent, Or inhibiting the expression of TRAP1 in a mammal, which comprises administering a therapeutically effective amount of TRAP1 to a subject in need thereof.
본 발명의 다른 목적은 TRAP1 유전자에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA), siRNA 및 miRNA로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
It is another object of the present invention to provide a composition for preventing and treating diseases caused by mitochondrial dysfunction, which comprises as an active ingredient any one selected from the group consisting of antisense RNA, siRNA and miRNA for the TRAP1 gene.
본 발명의 또 다른 목적은 TRAP1에 특이적인 항체를 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
It is still another object of the present invention to provide a composition for preventing and treating diseases caused by mitochondrial dysfunction which comprises an antibody specific for TRAP1 as an active ingredient.
본 발명의 또 다른 목적은 TRAP1 억제물질(TRAP1 inhibitor)을 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
It is still another object of the present invention to provide a composition for preventing and treating a disease caused by a mitochondrial dysfunction which comprises a TRAP1 inhibitor (TRAP1 inhibitor) as an active ingredient.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) TRAP1(tumor necrosis factor receptor-associated protein 1)을 발현하는 세포를 시험제제와 함께 또는 시험제제 없이 배양하는 단계; 및 (b) 상기 시험제제와 함께 배양된 세포에서 TRAP1의 활성 또는 TRAP1의 발현 정도를 측정하고, 시험제제 없이 배양된 세포에서의 TRAP1의 활성 또는 TRAP1의 발현 정도와 비교하여 상기 시험제제가 TRAP1의 활성 또는 TRAP1의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약제의 스크리닝 방법을 제공한다.
(A) culturing cells expressing tumor necrosis factor receptor-associated protein 1 (TRAP1) with or without a test agent; And (b) measuring the activity of TRAP1 or the expression level of TRAP1 in the cells incubated with the test agent, and comparing the activity of TRAP1 or the level of expression of TRAP1 in cells cultured without the test agent, Or inhibiting the expression of TRAP1 in a mammal, which comprises administering an effective amount of TRAP1 to a subject in need thereof.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본발명은 TRAP1 유전자에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA), siRNA 및 miRNA로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
In order to accomplish another object of the present invention, the present invention provides a method for preventing and treating diseases caused by mitochondrial dysfunction, which comprises, as an active ingredient, any one selected from the group consisting of antisense RNA, siRNA and miRNA for the TRAP1 gene ≪ / RTI >
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TRAP1에 특이적인 항체를 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
In order to accomplish still another object of the present invention, the present invention provides a composition for preventing and treating diseases caused by mitochondrial dysfunction comprising an antibody specific for TRAP1 as an active ingredient.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TRAP1 억제물질(TRAP1 inhibitor)을 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
In order to accomplish still another object of the present invention, the present invention provides a composition for preventing and treating diseases caused by mitochondrial dysfunction comprising TRAP1 inhibitor (TRAP1 inhibitor) as an active ingredient.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명자들은 세포 내에서 TRAP1의 활성 또는 발현이 억제될 때, 세포의 활성산소에 대한 저항능력이 향상될 뿐만 아니라 PINK1 결손에 의해 유도된 미토콘드리아의 기능 장애가 회복된다는 사실을 처음으로 규명하였으며, 이는 본 명세서에서 최초로 공개하는 것이다.
The present inventors first discovered that when the activity or expression of TRAP1 is inhibited in a cell, not only the ability of the cell to react with reactive oxygen is enhanced, but also the functional disorder of the mitochondria induced by PINK1 deficiency is recovered. Is disclosed first in the specification.
정의Justice
다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다. 다음의 참고문헌은 본 발명의 명세서에 사용된 여러 용어들의 일반적인 정의를 갖는 기술(skill)의 하나를 제공한다. Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOTY(2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walker ed., 1988); 및 Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY. 또한 다음의 정의는 본 발명의 실시를 위해 독자(reader)에게 도움을 주기 위해 제공된다.
Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art. The following references provide one of the skills with a general definition of the various terms used in the specification of the present invention. Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988); And Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY. The following definitions are also provided to assist the reader in the practice of the present invention.
본 명세서에서 용어 "단백질"은 "폴리펩티드(polypeptide)" 또는 “펩티드(peptide)"와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.
As used herein, the term "protein" is used interchangeably with "polypeptide" or "peptide" and refers to a polymer of amino acid residues as commonly found in natural state proteins.
본 발명에서 "핵산", "DNA 서열" 또는 "폴리뉴클레오티드" 는 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다.
In the present invention, "nucleic acid", "DNA sequence" or "polynucleotide" refers to deoxyribonucleotides or ribonucleotides in the form of single- or double-stranded. Unless otherwise constrained, also includes known analogs of natural nucleotides that hybridize to nucleic acids in a manner similar to naturally occurring nucleotides.
본 발명에서 용어 "상동체(homologues)"는 단백질 및/또는 단백질 서열을 언급하는 경우에는 공통의 조상 단백질(common ancestral protein) 또는 단백질 서열에서 자연적으로 또는 인위적으로 유래된 것을 나타낸다. 유사하게 핵산 및/또는 핵산 서열은 그들이 공통의 조상 핵산 또는 핵산 서열로부터 자연적으로 또는 인위적으로 유래되었을 때 상동하다.
The term "homologues " as used herein refers to those derived from a common ancestral protein or protein sequence naturally or artificially when referring to protein and / or protein sequences. Similarly, nucleic acid and / or nucleic acid sequences are homologous when they are derived naturally or artificially from a common ancestral nucleic acid or nucleic acid sequence.
본 명세서에서 용어 "아날로그(analog)"는 표준 물질(reference molecule)과 구조적으로 유사하지만, 표준 물질의 특이적 치환기가 치환에 의해 대체됨으로써 표적이나 조절 방법이 변형된 물질을 말한다. 표준물질과 비교할 때, 아날로그는 당업자에 의해 예상될 수 있는 바와 같이 동일 또는 유사하거나 향상된 유용성(utility)를 가진다. 향상된 성질(예: 표적 물질에 대한 더 높은 결합 친화력)을 갖는 공지의 화합물 변이체를 규명하기 위한 아날로그의 합성 및 스크리닝은 약리 화학적 분야에 공지된 방법이다.
The term "analog" as used herein refers to a substance that is structurally similar to a reference molecule, but whose target or control method has been modified by substitution of a specific substituent of the reference material. Compared to standard materials, analogs have the same, similar, or improved utility as can be expected by those skilled in the art. Synthesis and screening of analogs for identifying known compound variants with improved properties (e.g., higher binding affinity for the target substance) are methods known in the pharmacochemical field.
본 발명은 The present invention
(a) TRAP1(tumor necrosis factor receptor-associated protein 1)을 발현하는 세포를 시험제제와 함께 또는 시험제제 없이 배양하는 단계; 및 (a) culturing cells expressing tumor necrosis factor receptor-associated protein 1 (TRAP1) with or without a test agent; And
(b) 상기 시험제제와 함께 배양된 세포에서 TRAP1의 발현 정도를 측정하고, 시험제제 없이 배양된 세포에서 TRAP1의 발현 정도와 비교하여 상기 시험제제가 TRAP1의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약제의 스크리닝 방법을 제공한다.
(b) measuring the level of expression of TRAP1 in the cells incubated with the test agent, comparing the expression level of TRAP1 with the cells cultured without the test agent, and confirming whether the test agent inhibits the expression of TRAP1 A method for screening a medicament for preventing or treating a disease caused by mitochondrial dysfunction.
(a) 단계는 TRAP1(tumor necrosis factor receptor-associated protein 1)을 발현하는 세포를 시험제제와 함께 또는 시험제제 없이 배양하는 단계이다.
(a) is a step of culturing cells expressing tumor necrosis factor receptor-associated protein 1 (TRAP1) with or without a test agent.
본 발명의 상기‘TRAP1’은 hsp90와 높은 상동성을 지니며, 타입 1 종양 괴사 인자 수용체에 결합한다(하기 문헌 참조: Song et al., J. Biol. Chem., 270:3574-3581 (1995)). TNFR1의 세포내 도메인을 베이트(bait)로 하여 Gal4/HeLa cDNA library의 yeast 2-hybrid screen 및 5-prime RACE를 수행하여, Song et al. (1995)는 TRAP1을 인코딩(encoding)하는 cDNA 부분을 분리해내었다. 이로부터 추론된(deduced) 661-아미노산 단백질은 HSP90 패밀리 일원과 60% 유사하나, HSP90 단백질에서 발견되는 고도로 하전된 도메인이 결여되어 있다. 예를 들어, 하기 문헌 참조: Felts et al., J Biol Chem. 2000; 275(5):3305-12. 또한 상기 TRAP1은 열-충격 단백질 75-KD(HSP75); 종양 괴사 인자 수용체-연관 단백질 1; TRAP1; 및 TNFR-연관 단백질 1으로도 공지되어 있다.The 'TRAP1' of the present invention has high homology with hsp90 and binds to a
본 발명의 상기‘TRAP1’은 TRAP1으로서 공지된 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 가지는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 서열번호 1(Genbank Accession No. NP_057376.2) 또는 서열번호 3(Genbank Accession No.NP_477439.2)으로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한 본 발명의 TRAP1은 이의 기능적 동등물을 포함한다.
The 'TRAP1' of the present invention is not particularly limited as long as it has an amino acid sequence of a polypeptide known as TRAP1, but preferably a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (Genbank Accession No. NP_057376.2) or SEQ ID NO: 3 (Genbank Accession No. NP_477439. 2). ≪ / RTI > TRAP1 of the present invention also includes functional equivalents thereof.
상기 기능적 동등물이란 TRAP1의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것으로, 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩티드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 상기 기능적 동등물은 TRAP1의 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과 생성될 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 또한 상기 기능적 동등물에는 본 발명의 TRAP1 폴리펩티드의 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 또한 아미노산의 결실은 바람직하게는 TRAP1 폴리펩티드의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 아울러 상기 TRAP1 폴리펩티드의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 또한 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.
The functional equivalent means a polypeptide having at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90% sequence homology (i.e., identity) with the amino acid sequence of TRAP1. For example, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84% Sequence homology to the sequences of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, Quot; refers to a polypeptide having substantially the same physiological activity as the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. The functional equivalents may result in some of the amino acid sequence of TRAP1 being added, substituted or deleted. The substitution of the amino acid is preferably a conservative substitution. Examples of conservative substitutions of amino acids present in nature are as follows: (Gly, Ala, Pro), hydrophobic amino acids (Ile, Leu, Val), aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp), acidic amino acids (Asp, Glu), basic amino acids (His, Lys, Arg, Gln, Asn ) And sulfur-containing amino acids (Cys, Met). Also included in such functional equivalents are variants in which a portion of the amino acid is deleted in the amino acid sequence of the TRAP1 polypeptide of the invention. The deletion or substitution of the amino acid is preferably located in a region that is not directly related to the physiological activity of the polypeptide of the present invention. In addition, deletion of the amino acid is preferably located at a site that is not directly involved in the physiological activity of the TRAP1 polypeptide. Also included are variants in which several amino acids have been added at both ends or sequences of the amino acid sequence of the TRAP1 polypeptide. Also included within the scope of the functional equivalents of the present invention are polypeptide derivatives in which some of the chemical structures of the polypeptides are modified while maintaining the basic skeleton of the polypeptide according to the present invention and its physiological activity. This includes, for example, structural modifications to alter the stability, shelf stability, volatility, or solubility of the polypeptides of the present invention.
본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은 TRAP1의 아미노산 서열(서열번호 1 또는 서열번호 3) 과 후보 서열을 정렬하고 갭(gaps)을 도입한 후 TRAP1의 아미노산 서열에 대한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 또한, TRAP1의 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다. 또한, 상기 서열 동질성은 두 개의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST와 같은 컴퓨터 프로그램은 두 개의 폴리펩티드를 각각의 아미노산이 최적으로 매칭되도록 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디펄트 오프닝 페널티(default opening penalty) 및 디펄트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연계되어 사용될 수 있는 PAM250(표준 스코링 매트릭스; Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp 3, 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다. 일치하는 서열(identical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(matched span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열 내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다.
As used herein, sequence homology and homology refers to the percentage of amino acid residues of the candidate sequence to the amino acid sequence of TRAP1 after aligning the candidate sequence with the amino acid sequence of TRAP1 (SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3) and introducing gaps Is defined. If necessary, conservative substitutions as part of sequence homology are not considered to obtain maximum percent sequence homology. Also, the N-terminus, C-terminus, or internal stretch, deletion, or insertion of the amino acid sequence of TRAP1 is not interpreted as a sequence that affects sequence homology or homology. In addition, such homology can be determined by standard standard methods used to compare similar portions of amino acid sequences of two polypeptides. A computer program, such as BLAST, aligns two polypeptides so that each amino acid is optimally matched (either along the full length sequence of one or two sequences or along the predicted portion of one or two sequences). The program provides a PAM 250 (standard scoring matrix; Dayhoff et al., In Atlas of Protein (R)), which provides a default opening penalty and a default gap penalty and can be used in conjunction with a computer program Sequence and Structure,
본 발명에 따른 단백질(폴리펩티드)는 천연에서 추출하거나 유전공학적 방법에 의해 작제될 수 있다. 예를 들면, 통상적인 방법에 따라 상기 폴리펩티드 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 핵산(예를 들어, 서열번호 2 또는 서열번호 4)을 작제한다. 상기 핵산은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제 할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)을 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 작제된 핵산은 이에 작동가능하게 연결되어 (operatively linked) 핵산의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 핵산이 발현되기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 핵산에 의해 발현된, 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 "실질적으로 순수한 폴리펩티드(substantially pure polypeptide)"라 함은 본 발명에 따른 폴리펩티드가 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Editions; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink(eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.
The proteins (polypeptides) according to the present invention can be extracted naturally or constructed by genetic engineering methods. For example, a nucleic acid encoding the polypeptide or a functional equivalent thereof (e.g., SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4) is constructed according to a conventional method. The nucleic acid can be constructed by PCR amplification using an appropriate primer. Alternatively, DNA sequences may be synthesized by standard methods known in the art, for example, using an automated DNA synthesizer (commercially available from Biosearch or Applied Biosystems). The constructed nucleic acid is inserted into a vector comprising one or more expression control sequences (e.g., promoters, enhancers, etc.) operatively linked to the expression of the nucleic acid, and the recombinant The host cell is transformed with an expression vector. The resulting transformant is cultured under culture medium and conditions suitable for expression of the nucleic acid to recover a substantially pure polypeptide expressed by the nucleic acid from the culture. The recovery can be carried out using methods known in the art (for example, chromatography). By "substantially pure polypeptide" as used herein is meant that the polypeptide according to the invention is substantially free of any other proteins derived from the host cell. Genetic engineering methods for the synthesis of polypeptides of the present invention can be found in Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, Second (1998) and Third (2000) Editions; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif., 1991; And Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 12073-12080,1990.
또한, 본 발명의 폴리펩티드는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989).
Also, the polypeptide of the present invention can be easily prepared by chemical synthesis (Creighton, Proteins, Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., NY, 1983) known in the art. Representative methods include, but are not limited to, liquid or solid phase synthesis, fractional condensation, F-MOC or T-BOC chemistry (see for example Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press , Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Atherton and Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989).
본 발명에서 '프로모터'란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, '작동 가능하게 연결된다(operably linked)'는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있다.
As used herein, the term " promoter " refers to a DNA sequence that regulates the expression of a nucleic acid sequence operatively linked to a particular host cell. The term 'operably linked' means that a nucleic acid fragment is different from other nucleic acid fragments Quot; is meant that the function or expression thereof is influenced by other nucleic acid fragments. In addition, it may further comprise any operator sequence for regulating transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence controlling the termination of transcription and translation. As the promoter, a constitutive promoter that induces expression of a target gene at all times or an inducible promoter that induces expression of a target gene at a specific position and time can be used.
본 발명에서 "숙주세포(host cell)"이라 함은 임의의 수단(예: 전기충격법, 칼슘 포스파타제 침전법, 미세주입법, 형질전환법, 바이러스 감염 등)에 의해 세포 내로 도입된 이종성 DNA를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포를 말한다.
In the present invention, the term "host cell" includes heterologous DNA introduced into cells by any means (for example, electric shock method, calcium phosphatase precipitation method, microinjection method, transformation method, virus infection, etc.) Refers to prokaryotic or eukaryotic cells.
본 발명에서‘TRAP1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드' 는 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산서열, 또는 이와 적어도 70% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산서열을 암호화하는 염기서열을 가질 수 있다. 상기 핵산은 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함한다. 즉, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 갖거나 상기 염기서열에 상보적인 염기서열을 가질 수 있다. 바람직하게는 서열번호 2(Genbank Accession No. NM_016292.2) 또는 서열번호 4(Genbank Accession No. NM_058091.3)로 표시되는 염기서열을 갖는다. 상기 핵산은 천연에서 분리되거나 위에서 기술한 바와 같이 유전공학적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
In the present invention, the 'polynucleotide encoding TRAP1' may have an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, or a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having at least 70% or more sequence homology. The nucleic acid includes both DNA, cDNA, and RNA sequences. That is, the polynucleotide may have a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, or an amino acid sequence having at least 70% or more homology thereto, or may have a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence. Preferably, it has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 (Genbank Accession No. NM_016292.2) or SEQ ID NO: 4 (Genbank Accession No. NM_058091.3). The nucleic acid may be isolated from nature or may be prepared by genetic engineering methods as described above.
본 명세서에서 용어 "발현(expression)"이라 함은 세포에서 단백질 또는 핵산의 생성을 의미하는 것으로, 프로모터에 의해 유발된 특정 뉴클레오티드 서열의 전사와 번역을 모두 포함하는 의미이다. 따라서 본 발명의‘TRAP1 발현’이란, 바람직하게 TRAP1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(예를들어 서열번호 2 또는 서열번호 4)의 전사와 번역 과정을 모두 포함하는 의미이다.
As used herein, the term "expression " refers to the production of a protein or nucleic acid in a cell, and includes both transcription and translation of a specific nucleotide sequence caused by a promoter. Thus, the expression " TRAP1 expression " of the present invention is meant to include both transcription and translation of a nucleotide sequence (for example, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4) encoding a TRAP1 protein.
상기‘TRAP1을 발현하는 세포’는 세포 내에서 TRAP1 유전자의 발현이 일어나는 세포라면 이에 한정되지 않으나, 바람직하게 진핵세포이며, 더욱 바람직하게 미토콘드리아(mitochondria, 사립체)를 세포 소기관으로서 포함하는 세포일 수 있다.
The 'TRAP1-expressing cell' is not limited to the cell in which the TRAP1 gene is expressed in the cell, but it may preferably be a eukaryotic cell, more preferably a mitochondria (mitochondria) .
본 발명에서 ‘제제(agent)’ 또는 ‘시험제제(test agent)’라 함은 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 단백질, 폴리펩티드, 소 유기 물질(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다. 다르게 지정되지 않는 한, 제제, 물질 및 화합물은 호환성 있게(interchangeably) 사용할 수 있다.
In the present invention, the term "agent" or "test agent" refers to any substance, molecule, element, compound, Combinations. But are not limited to, proteins, polypeptides, small organic molecules, polysaccharides, polynucleotides, and the like. It may also be a natural product, a synthetic compound or chemical compound, or a combination of two or more substances. Unless otherwise specified, the agents, substances and compounds may be used interchangeably.
본 발명의 방법으로 스크리닝되거나 동정될 수 있는 시험제제는, 폴리펩티드, 베타-턴 미메틱(beta-turn mimetics), 다당류, 인지질, 호르몬, 프로스타글란딘, 스테로이드, 방향족 화합물, 헤테로사이클릭 화합물, 벤조디아제핀(benzodiazepines), 올리고머릭 N-치환 글리신(oligomeric N-substituted glycines), 올리고카르바메이트(oligocarbamates), 당류(saccharides), 지방산, 퓨린, 피리미딘 또는 이들의 유도체, 구조적 아날로그 또는 조합을 포함한다. 어떤 시험제제는 합성 물질일 수 있으며, 다른 시험제제는 천연물질일 수 있다. 상기 시험제제는 합성 또는 자연 화합물의 라이브러리를 포함하는 광범위하고 다양한 출처로부터 얻어질 수 있다. 조합(combinatorial) 라이브러리는 스텝-바이-스텝 방식으로 합성될 수 있는 여러 종류의 화합물로 생산될 수 있다. 다수의 조합 라이브러리의 화합물들은 ESL(encoded synthetic libraries) 방법(WO 95/12608, WO 93/06121, WO94/08051, WO 95/395503 및 WO 95/30642)에 의해 제조될 수 있다. 박테리아, 곰팡이, 식물 및 동물 추출물 형태의 자연 화합물의 라이브러리는 상업적인 출처로부터 얻거나 또는 필드(field)에서 수집될 수 있다. 공지된 약리학적(pharmacological) 제제가 구조적 아날로그를 제조하기 위하여 아실화, 알킬화, 에스테르화 반응(esterification), 아미드화 반응(amidification)과 같은 지시되거나(direct) 무작위한 화학적 수식에 적용될수 있다. 상기 시험 제제는 자연적으로 생성되는 단백질 또는 그의 단편일 수 있다. 이런 시험 제제는 자연 출처(natural source), 예컨대, 세포 또는 조직 용해물로부터 수득될 수 있다. 폴리펩티드 제제의 라이브러리는 예컨대, 통상적인 방법에 의해 생성되거나 상업적으로 입수할 수 있는 cDNA 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 상기 시험 제제는 펩티드, 예컨대, 약 5-30개, 바람직하게는 약5-20개, 보다 바람직하게는 약7-15개의 아미노산을 가지는 펩티드일 수 있다. 상기 펩티드는 자연적으로 생성되는 단백질, 랜덤 펩티드 또는 "바이어스화(biased)" 랜덤 펩티드의 절단물일 수 있다.Test agents that can be screened or identified by the methods of the invention include but are not limited to polypeptides, beta-turn mimetics, polysaccharides, phospholipids, hormones, prostaglandins, steroids, aromatics, heterocyclic compounds, benzodiazepines Oligomeric N-substituted glycines, oligocarbamates, saccharides, fatty acids, purines, pyrimidines or derivatives, structural analogs or combinations thereof. Some test agents may be synthetic and other test agents may be natural. The test agent can be obtained from a wide variety of sources including libraries of synthetic or natural compounds. A combinatorial library can be produced with a variety of compounds that can be synthesized step-by-step. Compounds of multiple combinatorial libraries can be produced by the encoded synthetic libraries (ESL) method (WO 95/12608, WO 93/06121, WO 94/08051, WO 95/395503 and WO 95/30642). Libraries of natural compounds in the form of bacterial, fungal, plant and animal extracts can be obtained from commercial sources or collected in the field. Known pharmacological agents can be applied to direct or random chemical modifications such as acylation, alkylation, esterification, amidification to produce structural analogs. The test agent may be a naturally occurring protein or a fragment thereof. Such test agents can be obtained from natural sources, such as cell or tissue lysates. Libraries of polypeptide preparations can be obtained, for example, by conventional methods or from commercially available cDNA libraries. The test agent may be a peptide, for example, a peptide having about 5-30 amino acids, preferably about 5-20 amino acids, and more preferably about 7-15 amino acids. The peptide may be a naturally occurring protein, a random peptide or a cleavage of a "biased" random peptide.
또한 상기 시험 제제는 "핵산”일 수 있다. 핵산 시험 제제는 자연적으로 생성되는 핵산, 랜덤 핵산, 또는 "바이어스화” 랜덤 핵산일 수 있다. 예컨대, 원핵 또는 진핵 게놈의 절단물을 위에서 기재한 바와 유사하게 사용될 수 있다.The test agent may also be a "nucleic acid. &Quot; The nucleic acid test agent may be a naturally occurring nucleic acid, a random nucleic acid, or a" biased " random nucleic acid. For example, cuts of prokaryotic or eukaryotic genomes can be used similar to those described above.
또한 상기 시험 제제는 소분자(예: 약 1,000 이하의 분자량을 갖는 분자)일 수 있다. 소분자의 조절 제제를 스크리닝하기 위한 방법에는 바람직하게는 고속 분석 어세이(high throughput assay)가 적용될 수 있다. 위에서 기재한 대로 소분자 시험 제제의 조합 라이브러리가 본 발명의 스크리닝 방법에 용이하게 적용될 수 있다. 많은 어세이가 상기 스크리닝에 유용하다(Shultz, Bioorg. Med. Chem. Lett., 8:2409-2414, 1998; Weller, Mol. Drivers., 3:61-70, 1997; Fernandes, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:597-603, 1998; and Sittampalam, Curr. Opin. Chem. Biol., 1:384-91, 1997).
The test agent may also be a small molecule (e.g., a molecule having a molecular weight of about 1,000 or less). Preferably, a high throughput assay can be applied to the method for screening a control preparation of a small molecule. A combination library of small molecule test preparations as described above can be easily applied to the screening method of the present invention. Many assays are useful in the screening (Shultz, Bioorg. Med. Chem. Lett., 8: 2409-2414, 1998; Weller, Mol. Drivers., 3: 61-70, 1997; Fernandes, Curr. Opin. Chem. Biol., 2: 597-603, 1998; and Sittampalam, Curr. Opin. Chem. Biol., 1: 384-91, 1997).
본 발명의 방법에 스크리닝되는 시험 제제의 라이브러리는 TRAP1 단백질이나 아날로그에 대한 구조 연구를 근거로 제조될 수 있다. 이런 구조 연구는 TRAP1에 결합할 가능성이 있는 시험 제제의 규명을 가능하게 한다. TRAP1의 3차원적 구조는 여러 방법, 예컨대, 결정학 구조 및 분자적 모델링(crystal structure and molecular modeling)으로 연구될 수 있다. X-선 결정학(X-ray crystallography)을 이용하는 단백질 구조 연구 방법이 문헌에 잘 알려져 있다: Physical Bio-Chemistry, Van Holde, K. E.(Prentice-Hall, New Jersey 1971), pp.221-239, and Physical Chemistry with Applications to the Life Sciences, D. Eisengerg & D.Crothers(Benjamin Cummings, Menlo Park 1979). TRAP1의 구조에 대한 컴퓨터 모델링은 스크리닝하기 위해 시험 제제의 디자인을 위한 다른 수단을 제공한다. 분자적 모델링 방법은 문헌에 개시되어 있다: U.S. Pat. No. 612,894 and U.S. Pat. No. 5,583,973. 또한 단백질 구조는 중성자 회절(neutron diffraction) 및 NMR(nuclear magnetic resonance)에 의해 결정될 수 있다: Physical Chemistry, 4th Ed. Moore, W. J.(Prentice-Hall, New Jersey 1972) and NMR of Proteins and Nucleic Acids, K. Wuthrich(Wiley-Interscience, New York 1986).
Libraries of test agents screened in the methods of the present invention can be prepared based on structural studies of TRAP1 proteins or analogs. This structural study enables the identification of test agents potentially binding to TRAP1. The three-dimensional structure of TRAP1 can be studied in a number of ways, such as crystal structure and molecular modeling. Methods of studying protein structures using X-ray crystallography are well known in the literature: Physical Bio-Chemistry, Van Holde, KE (Prentice-Hall, New Jersey 1971), pp. 221-239, and Physical Chemistry with Applications to the Life Sciences, D. Eisengerg & D.Crothers (Benjamin Cummings, Menlo Park 1979). Computer modeling of the structure of TRAP1 provides other means for the design of test agents for screening. Molecular modeling methods are described in the literature: US Pat. No. 612,894 and US Pat. No. 5,583,973. Protein structures can also be determined by neutron diffraction and nuclear magnetic resonance (NMR): Physical Chemistry, 4th Ed. Moore, WJ (Prentice-Hall, New Jersey 1972) and NMR of Proteins and Nucleic Acids, K. Wuthrich (Wiley-Interscience, New York 1986).
본 발명에서 상기‘TRAP1을 발현하는 세포를 시험제제와 함께 배양하는 것’은 TRAP1 자체 및 이의 발현에 영향을 주는 인자와 시험제제의 접촉을 유도하는 과정을 의미하는 것이다. 상기 시험제제의 접촉 방법은 예를 들어, 시험관 내(in vitro)에서 시험제제가 세포막 외부에 처리되어 세포 내로 도입되는 것에 의한 것일 수도 있고, 또는 공지의 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술에 의해 시험제제가 세포 내에서 발현됨에 따른 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
In the present invention, 'culturing cells expressing TRAP1 together with a test agent' means a process of inducing contact between TRAP1 itself and factors affecting its expression and the test agent. The method of contacting the test agent may be, for example, by in vitro administration of the test agent to the outside of the cell membrane to be introduced into the cell, or by a known standard recombinant DNA and molecular cloning technique But the present invention is not limited thereto.
(b) 단계는 상기 (a) 단계의 시험제제와 함께 배양된 세포에서 TRAP1의 발현 정도를 측정하고, 시험제제 없이 배양된 세포에서 TRAP1의 발현 정도와 비교하여 수치의 감소에따라 상기 시험제제가 TRAP1의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 단계이다.
(b) comprises measuring the expression level of TRAP1 in the cells incubated with the test agent of step (a), comparing the expression level of TRAP1 with the level of expression of TRAP1 in the cells cultured without the test agent, TRAP1 < / RTI >
본 발명의 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약제 스크리닝 방법은, TRAP1의 발현 정도를 측정하여 수행될 수 있으며, 이때 상기‘TRAP1의 발현정도 측정’은 TRAP1 유전자의 발현수준 측정을 의미하는 것으로 mRNA 발현수준 측정 및 단백질발현 수준 측정(단백질 양 변화 측정)을 모두 포함하는 의미이다. 상기 'mRNA 발현수준 측정'이란 대상 세포에서 TRAP1 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 상기‘단백질 발현수준 측정’이란 대상세포에서 TRAP1 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는 상기 TRAP1 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
The drug screening method for prevention or treatment of diseases caused by the mitochondrial dysfunction of the present invention can be performed by measuring the expression level of TRAP1, wherein the 'measurement of the expression level of TRAP1' means the measurement of the expression level of the TRAP1 gene Quot; is meant to include both mRNA expression level measurement and protein expression level measurement (protein amount change measurement). The 'measurement of mRNA expression level' refers to measuring the amount of mRNA by measuring the presence and expression level of TRAP1 gene in the target cell. The 'measurement of protein expression level' is a process of confirming the presence and the expression level of a protein expressed from a TRAP1 gene in a target cell, preferably using an antibody that specifically binds to the TRAP1 gene, But is not limited to.
상기한 바와 같이 본 발명의 스크리닝 방법을 TRAP1의 발현을 분석하여 실시하는 경우, TRAP1 유전자의 발현량 변화의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, mRNA 발현수준은 RT-PCR(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블롯팅(Peter B. Kaufma et al., Molecular 및 Cellular Methods in Biology 및 Medicine, 102-108, CRC press), cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), DNA 칩 등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As described above, when the screening method of the present invention is carried out by analyzing the expression of TRAP1, the change in the expression level of the TRAP1 gene can be measured by various methods known in the art. For example, mRNA expression levels can be measured by RT-PCR (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)), competitive RT- Real-time RT-PCR, RNase protection assay (RPA), northern blotting (Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC press) (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed. Cold Spring Harbor Press (2001)) or in situ hybridization reaction (Sambrook et al., Molecular Cloning. ed. Cold Spring Harbor Press (2001)), DNA chips, and the like, but the present invention is not limited thereto.
상기 RT-PCR 프로토콜에 따라 실시하는 경우에는 우선, 시험물질을 처리한 세포에서 총 RNA를 분리한 다음, 올리고dT 프라이머 및 역전사효소를 이용하여 제1쇄 cDNA를 제조한다. 이어, 제1쇄 cDNA를 주형으로 이용하고, TRAP1 유전자-특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 실시한다. 그런 다음, PCR 증폭 산물을 전기영동하고, 형성된 밴드를 분석하여 TRAP1 유전자의 발현량 변화를 측정한다.When the RT-PCR is performed according to the RT-PCR protocol, total RNA is isolated from cells treated with the test substance, and first strand cDNA is prepared using oligo dT primer and reverse transcriptase. Next, the first-strand cDNA is used as a template and a PCR reaction is carried out using a TRAP1 gene-specific primer set. Then, the PCR amplification product is electrophoresed, and the band formed is analyzed to measure the change amount of TRAP1 gene expression.
또한, 단백질발현 수준 측정(즉, TRAP1 단백질의 양의 변화)은 당업계에 공지된 다양한 면역분석 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, TRAP1 단백질의 양의 변화는 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 그리고 샌드위치 분석등을 사용할 수 있고, 이외에도 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 웨스턴 블랏, 단백질 칩(protein chip) 등이 사용될수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
In addition, measurement of protein expression levels (i. E., Changes in the amount of TRAP1 protein) may be performed through a variety of immunoassay methods known in the art. For example, changes in the amount of TRAP1 protein can be measured by radioimmunoassay, radioimmunoprecipitation, immunoprecipitation, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), capture-ELISA, inhibition or competitive assay, and sandwich assay Ouchterlony immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immuno staining, Complement Fixation Assay, Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS), Western blot, protein chip ) May be used, but the present invention is not limited thereto.
본 발명의‘미토콘드리아 기능 장애’는 정상적인 세포에서 나타나는 미토콘드리아의 생물학적 활성이 감소된 상태로서 이에 제한되지 않으나 예를 들어, 미토콘드리아 효소 활성의 감소, 전자전달계(electron transport chain) 활성 감소, 막전위 감소, 활성산소종(reactive oxygen species) 생산의 증가, 미토콘드리아 단편화(mitochondria fragmentaion), 칼슘 조절장애, 및 미토콘드리아 DNA (mtDNA)의 돌연변이 현상을 포함한다.
The 'mitochondrial dysfunction' of the present invention is a state in which the biological activity of mitochondria appearing in normal cells is reduced, but not limited thereto. For example, mitochondrial enzyme activity, electron transport chain activity, Increased production of reactive oxygen species, mitochondrial fragmentation, calcium regulation disorders, and mutation of mitochondrial DNA (mtDNA).
본 발명의‘미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환’은 바람직하게 PINK1 유전자 결손에 의한 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환인 것을 특징으로 한다. The 'disease caused by mitochondrial dysfunction' of the present invention is preferably a disease due to a mitochondrial dysfunction caused by a PINK1 gene deletion.
상기‘결손’은 유전자의 기능이 결실되어있는 것을 의미하는 것으로 본 발명의‘PINK1 유전자 결손’은 PINK1 유전자에 기능 결실형 변이가 생기는 경우 및 PINK1 유전자를 결실시키는 경우를 포함한다. 상기 PINK1유전자의 기능 결실형 변이는 유전자에 부가된 임의의 조작(치환, 역위, 부가, 중복 등의 돌연변이)을 통해 정상적인 PINK1 유전자의 발현이 불능하게 되거나 또는 유전자로부터 발현된 단백질이 본래 PINK1의 생물학적 활성을 가지지 않는 것을 포함하는 의미이다.
The 'deletion' means that the function of the gene is deleted. The 'PINK1 gene deletion' of the present invention includes cases in which a functional deletion type mutation occurs in the PINK1 gene and a case in which the PINK1 gene is deleted. The functional deletion mutation of the PINK1 gene may be caused by a disruption of the normal expression of the PINK1 gene through an arbitrary manipulation (mutation such as substitution, inversion, addition or redundancy) added to the gene, or a protein expressed from the gene is inherently biologically Is meant to include those that do not have activity.
상기 PINK1(PTEN-induced putative kinase 1) 유전자는 바람직하게 서열번호 6(Genbank Accession No.NM_032409.2) 또는 서열번호 8(Genbank Accession No.NM_132112.4)로 표시되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 폴리뉴클레오타이드에 의하여 발현되는 PINK1 단백질은 서열번호 5 (Genbank Accession No.NP_115785.1) 또는 서열번호 7 (Genbank Accession No.NP_572340.2)로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 것 일 수 있다.
The PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1) gene may preferably have a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 (Genbank Accession No. NM_032409.2) or SEQ ID NO: 8 (Genbank Accession No. NM_132112.4) , But is not limited thereto. Also, the PINK1 protein expressed by the polynucleotide may have an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 (Genbank Accession No. NP_115785.1) or SEQ ID NO: 7 (Genbank Accession No. NP_572340.2).
구체적으로 상기‘미토콘드리아 기능 장애에 의한 질환’은 퇴행성 뇌질환, NARP 증후군(Neurogenic muscular weakness-Ataxia-Retinitis pigmentosa syndrome), 다발성 경화증 증후군(Multiple Sclerosis-like Syndrome), 모성 유전 심근증( Maternally Inherited CardioMyopathy), 진행성 외안근 마비(Progressive External Ophthalmoplegia), MERRF 증후군(Myoclonic Epilepsy with Ragged-Red Fibers syndrome), MNGIE 증후군(Myoneurogastrointestinal disorder and encephalopathy), 피어슨 골수 증후군(Pearson Marrow syndrome), 컨스-세이어 증후군(Kearns-Sayre syndrome), 레버씨 시신경 위축증(Leber hereditary optic neuropathy), 아미노글루코시드 연관 난청(Aminoglycoside-associated deafness), 난청을 동반하는 당뇨(Diabetes with deafness), Luft 병(Luft disease), 리증후군(Leigh syndrome), 알퍼스병(Alpers Disease), 중쇄 아실코에이 탈수효소 결핍증 (medium chain acyl-CoA dehydrogenase [MCAD] deficiency), 경쇄 아실 코에이 탈수효소 결핍증(Segmental colitis associated with diverticular [SCAD] disease), 단쇄 수산화 코에이 탈수효소 결핍증(Short chain 3- hydroxyacyl CoA dehydrogenase[SCHAD] deficiency), 초장쇄 아실코에이 탈수효소 결손증(Very long chain acyl-CoA dehydrogenase [VLCAD] deficiency ), 장쇄 수산화 아실코에이 탈수효소 결핍증(long chain 3-hydroxy acyl-CoA dehydrogenase [LCHAD] deficiency), 글루타르산뇨증 II형(Glutaric aciduria II) 및 치사성 유아 심근증(Lethal infantile cardiomyopathy)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 한다.Specifically, the 'diseases caused by mitochondrial dysfunction' include degenerative brain diseases, NARP syndrome, Multiple Sclerosis-like Syndrome, Maternally Inherited Cardio Myopathy, Progressive External Ophthalmoplegia, Myoclonic Epilepsy with Ragged-Red Fibers syndrome, Myoneurogastrointestinal disorder and encephalopathy, Pearson Marrow syndrome, Kearns-Sayre syndrome ), Leber hereditary optic neuropathy, aminoglycoside-associated deafness, diabetes with deafness, Luft disease, Leigh syndrome, Alpers Disease, medium chain acyl-CoA dehydrogenase (MCAD) defici ency), Segmental colitis associated with diverticular (SCAD) disease, Short chain 3-hydroxyacyl CoA dehydrogenase [SCHAD] deficiency, High-chain acyl coacidase (Long chain acyl-CoA dehydrogenase [LCHAD] deficiency), glutaric aciduria II (long chain acyl-CoA dehydrogenase [LCHAD] And lethal infantile cardiomyopathy. ≪ Desc /
상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이며병(Alzheimer's disease), 헌팅턴병(Huntington's Disease) 및 치매(dementia)로 이루어지는 군에서 선택된 하나인 것을 특징으로 한다.
The degenerative brain disease is characterized by being selected from the group consisting of Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Huntington's disease, and dementia.
또한 본 발명의 스크리닝 방법은 전술한 (a) 및 (b) 단계 이후에 Further, the screening method of the present invention can be carried out after the steps (a) and (b)
‘(c) 상기 (b) 단계에서 TRAP1의 발현을 억제하는 것으로 확인된 시험제제를 미토콘드리아 기능장애로 인한 질환을 가지고 있는 동물에 투여하여 치료효과를 나타내는지를 검사하는 단계’를 추가적으로 포함할 수 있다.
(c) a step of inspecting whether or not a test agent confirmed to inhibit the expression of TRAP1 in step (b) is administered to an animal having a disease caused by mitochondrial dysfunction to show a therapeutic effect ' .
상기 (c) 단계에서 동물은 인간이 아닌 동물(non-human animal)인 것이 바람직하다. 또한 상기 '치료 효과'란 미토콘드리아 기능장애로 인한 질환 및 이의 증상을 완화 또는 개선하는 효과, 미토콘드리아 기능 장애의 진행을 억제하는 효과의 일부 또는 전부를 포함하는 의미이다.
In step (c), the animal is preferably a non-human animal. The term " therapeutic effect " includes a part or all of the effect of alleviating or ameliorating the disease due to the mitochondrial dysfunction and its symptoms, or suppressing the progress of the mitochondrial dysfunction.
또한 본 발명은 (a) TRAP1 또는 상기 TRAP1을 발현하는 세포와 시험제제를 배양하는 단계; 및(A) culturing TRAP1 or a cell expressing said TRAP1 and a test agent; And
(b) 상기 TRAP1의 활성을 측정하여, 상기 시험제제가 TRAP1의 활성을 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약제의 스크리닝 방법을 제공한다. (b) measuring the activity of TRAP1, and confirming whether the test agent inhibits the activity of TRAP1, and screening the agent for the prevention or treatment of diseases caused by mitochondrial dysfunction.
상기 (b) 단계에서 시험제제가 TRAP1의 활성을 억제하는 지 여부는, 시험제제와 함께 배양된 세포에서 TRAP1의 활성 정도를 측정하고 시험제제 없이 배양된 세포에서의 TRAP1 활성 정도와 비교하여 수치의 감소에 따라 판정할 수 있다.
Whether the test agent inhibits the activity of TRAP1 in step (b) can be determined by measuring the activity of TRAP1 in the cells cultured with the test agent and comparing the level of TRAP1 activity with that of cultured cells without the test agent It can be judged according to the decrease.
상기 스크리닝 방법은 전술한 (a) 및 (b) 단계 이후에The screening method may be carried out after the steps (a) and (b)
‘(c) 상기 (b) 단계에서 TRAP1의 활성을 억제하는 것으로 확인된 시험제제를 미토콘드리아 기능장애로 인한 질환을 가지고 있는 동물에 투여하여 치료효과를 나타내는지를 검사하는 단계’를 추가적으로 포함할 수 있다.
(c) a step of inspecting whether the test agent confirmed to inhibit the activity of TRAP1 in step (b) is administered to an animal having a disease caused by mitochondrial dysfunction to show a therapeutic effect ' .
상기 본 발명의 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약제 스크리닝 방법에 있어서, TRAP1 단백질의 활성을 억제하는 약제의 스크리닝 방법은 이에 제한되지 않으나, 예를들어 간접적으로 다른 인자를 통해 TRAP1 단백질의 활성을 억제하거나 또는 TRAP1 단백질에 결합하는 물질을 스크리닝하여 실시할 수 있다. 후자의 경우, TRAP1 단백질로서, 분리된 형태의 TRAP1 또는 세포 내에 포함되어 있는 TRAP1 단백질 등 어떠한 형태의 것도 사용할 수 있다.
In the method for screening drugs for the prevention or treatment of diseases caused by the mitochondrial dysfunction of the present invention, screening methods for agents that inhibit the activity of TRAP1 protein are not limited thereto. For example, Or by screening for a substance that binds to the TRAP1 protein. In the latter case, any type of TRAP1 protein can be used, such as isolated TRAP1 or TRAP1 protein contained in the cells.
본 발명의 스크리닝 방법은 다양한 방식으로 실시할 수 있으며, 특히 당업계에 공지된 다양한 결합 분석(binding assay)에 따라 고성능(high throughput) 방식으로 실시할 수 있다. 본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 시험물질 또는 TRAP1 단백질은 검출가능한 표지(detectable label)로 표지 될 수 있다. 예를 들어, 상기 검출가능한 표지는, 화학적 표지(예컨대, 바이오틴), 효소 표지(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제, β-갈락토시다아제 및 β-글루코시다아제), 방사능 표지(예컨대, 14C, 125I, 32P 및 35S), 형광 표지(예컨대, 쿠마린, 플루오레세인, FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민(rhodamine) 6G, 로다민 B, TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine), Cy-3, Cy-5, Texas Red, Alexa Fluor, DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole), HEX, TET, Dabsyl 및 FAM), 발광 표지, 화학 발광(chemiluminescent) 표지, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 또는 금속 표지(예컨대, 금 및 은)이다.The screening method of the present invention can be carried out in various ways, and can be carried out in a high throughput manner according to various binding assays known in the art. In the screening method of the present invention, the test substance or TRAP1 protein may be labeled with a detectable label. For example, the detectable label may be a chemical label (e.g., biotin), an enzyme label (such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, peroxidase, luciferase,? -Galactosidase, (E.g., 14 C, 125 I, 32 P and 35 S), fluorescent labels (e.g., coumarin, fluorescein, FITC (fluoresein isothiocyanate), rhodamine 6G, rhodamine B , TAMRA (6-carboxy-tetramethyl-rhodamine), Cy-3, Cy-5, Texas Red, Alexa Fluor, DAPI, HEX, TET, Dabsyl and FAM, A chemiluminescent label, a fluorescence resonance energy transfer (FRET) label or a metal label (e.g., gold and silver).
검출가능한 표지가 표지된 TRAP1 단백질 또는 시험물질을 이용하는 경우, TRAP1 단백질과 시험물질 사이의 결합 발생 여부는 표지로부터 나오는 신호를 검출하여 분석할 수 있다. 예를 들어, 표지로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질을 이용하여 시그널을 검출한다. 표지로서 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl 및 pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌과 같은 기질을 이용하여 시그널을 검출한다.When a detectable marker labeled TRAP1 protein or test substance is used, whether or not the binding between the TRAP1 protein and the test substance is detected can be detected by detecting a signal from the label. For example, when alkaline phosphatase is used as a label, it is possible to use bromochloroindoleyl phosphate (BCIP), nitroblue tetrazolium (NBT), naphthol-AS-B1-phosphate and Signals are detected using chromogenic substrates such as enhanced chemifluorescence (ECF). When horseradish peroxidase is used as a label, it is preferable to use chlorinaphthol, aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, D-luciferin, lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate), resorpine benzyl ether, luminol, HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB (tetramethylbenzidine), ABTS (2,2'-Azine-di [3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-phenylenediamine (OPD), and naphthol / pyronin.
택일적으로, 시험물질의 TRAP1 단백질로의 결합 여부는 상호작용물(interactants)의 표지 없이 분석할 수도 있다. 예를 들어, 마이크로피지오미터(microphysiometer)를 이용하여 시험물질이 TRAP1 단백질에 결합하는지 여부를 분석할 수 있다. 마이크로피지오미터는 LAPS(light-addressable potentiometric sensor)를 이용하여 세포가 그의 환경을 산성화하는 속도를 측정하는 분석 도구이다. 산성화 속도의 변화는, 시험물질과 TRAP1 단백질 사이의 결합에 대한 지시자로 이용될 수 있다(McConnell et al., Science 257:19061912(1992)).Alternatively, the binding of the test substance to the TRAP1 protein may be assayed without the labeling of the interactants. For example, a microphysiometer can be used to analyze whether a test substance binds to TRAP1 protein. The microphysiometer is an analytical tool that uses a light-addressable potentiometric sensor (LAPS) to measure the rate at which a cell acidifies its environment. A change in the rate of acidification can be used as an indicator of the binding between the test substance and the TRAP1 protein (McConnell et al., Science 257: 19061912 (1992)).
시험물질의 TRAP1 단백질과의 결합 능력은 실시간 이분자 상호작용 분석(BIA)를 이용하여 분석할 수 있다(Sjolander & Urbaniczky, Anal. Chem.,. 63:2338-2345(1991), 및 Szabo et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705(1995)). BIA는 실시간으로 특이적 상호작용을 분석하는 기술로서, 상호작용물(interactants)의 표지없이 실시할 수 있다(예컨대, BIAcore™). 표면 플라즈몬 공명(SPR)에서의 변화는 분자들 사이의 실시간 반응에대한 지시자(indicator)로 이용될 수 있다.The ability of the test substances to bind to the TRAP1 protein can be analyzed using real-time bimolecular interaction analysis (Sjolander & Urbaniczky, Anal. Chem., 63: 2338-2345 (1991), and Szabo et al. , Curr. Opin. Struct Biol., 5: 699-705 (1995)). BIA is a technique for analyzing specific interactions in real time and can be performed without the labeling of interactants (e.g., BIAcore ™). Changes in surface plasmon resonance (SPR) can be used as indicators for real-time reactions between molecules.
또한, 본 발명의 스크리닝 방법은, 투-하이브리드 분석 또는 쓰리-하이브리드 분석 방법에 따라 실시할 수 있다(U.S. Pat. No. 5,283,317; Zervos et al., Cell 72, 223232, 1993; Madura et al., J. Biol. Chem. 268, 1204612054, 1993; Bartel et al., BioTechniques 14, 920924, 1993; Iwabuchi et al., Oncogene 8, 16931696, 1993; 및 W0 94/10300). 이 경우, TRAP1 단백질을 "베이트(bait)" 단백질로 이용할 수 있다. 이 방법에 따르면, TRAP1 단백질에 결합하는 물질, 특히 단백질을 스크리닝 할 수 있다. 투-하이브리드시스템은 분할 가능한 DNA-결합 및 활성화 도메인으로 구성된 전사인자의 모듈 특성에 기초한다. 간단하게는, 이 분석 방법은 두 가지 DNA 컨스트럭트를 이용한다. 예컨대, 하나의 컨스트럭트에서, TRAP1-코딩 폴리뉴클레오타이드를 공지의 전사 인자(예컨대, GAL4)의 DNA 결합 도메인-코딩 폴리뉴클레오타이드에 융합시킨다. 다른 컨스트럭트에서, 분석 대상의 단백질(“프레이” 또는 “시료(시험제제)”)을 코딩하는 DNA 서열을 상기 공지의 전사인자의 활성화 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 융합시킨다. 만일, 베이트 및 프레이가 생체 내에서 상호작용하여 복합체를 형성하면, 전사인자의 DNA-결합 및 활성화 도메인이 인접하게 되며, 이는 리포터 유전자(예컨대, LacZ)의 전사를 촉발하게 된다. 리포터 유전자의 발현을 검출할 수 있으며, 이는 분석 대상의 단백질이 TRAP1 단백질과 결합할 수 있음을 나타내는 것이며, 결론적으로 세포의 항산화능 증가 및 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 및 치료제로 이용될 수 있음을 나타내는 것이다.The screening method of the present invention can be carried out according to a two-hybrid analysis or a three-hybrid analysis method (US Pat. No. 5,283,317; Zervos et al., Cell 72, 223232, 1993; Madura et al. Bartel et al., BioTechniques 14, 920924, 1993; Iwabuchi et al., Oncogene 8, 16931696, 1993; and WO 94/10300). In this case, the TRAP1 protein can be used as a "bait" protein. According to this method, a substance binding to TRAP1 protein, particularly a protein, can be screened. To-hybrid system is based on the modular nature of the transcription factor consisting of segmentable DNA-binding and activation domains. Briefly, this analysis method uses two DNA constructs. For example, in one construct, a TRAP1-coding polynucleotide is fused to a DNA binding domain-coding polynucleotide of a known transcription factor (e.g., GAL4). In another construct, a DNA sequence encoding a protein of interest ("prey" or "sample (test preparation)") is fused to a polynucleotide encoding the activation domain of the known transcription factor. If the bait and the fray interact in vivo to form a complex, the DNA-binding and activation domains of the transcription factor become adjacent, which triggers the transcription of the reporter gene (e.g., LacZ). The expression of the reporter gene can be detected. This indicates that the protein to be analyzed can bind to the TRAP1 protein. As a result, it can be used as an agent for preventing and treating diseases caused by increased antioxidant ability of cells and mitochondrial dysfunction Lt; / RTI >
이어, 시험물질이 처리된 TRAP1 단백질의 활성을 측정한다. 측정 결과, TRAP1 단백질의 활성이 하향-조절(down-regulation)되는 것이 측정되면, 상기 시험물질은 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 및 치료제로 판정될 수 있다.
Next, the activity of the TRAP1 protein treated with the test substance is measured. As a result of the measurement, when it is measured that the activity of TRAP1 protein is down-regulated, the test substance can be determined as a preventive and therapeutic agent for a disease caused by mitochondrial dysfunction.
상기 본 발명의 스크리닝 방법은 시험 제제가 TRAP1의 활성 또는 TRAP1 의 발현을 저해(또는 억제)하는지 여부를 판정함으로써, 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환에 대하여 예방 및 치료효과를 보이는 물질들을 선별하는 것을 특징으로 한다. 상기와 같은 방법은 TRAP1의 활성 또는 TRAP1 유전자 발현이 억제됨에 따라, 산화스트레스에 대한 저항성이 커지고 PINK1유전자 결손에 의해 유발된 미토콘드리아 기능 장애가 회복되는 원리를 이용하는 것으로서, 이러한 사실은 본 발명에서 처음 공개되는 것이다.
The screening method of the present invention is characterized in that the test agent is selected to inhibit (or inhibit) the expression of TRAP1 or TRAP1, thereby selecting a substance having a preventive and therapeutic effect against a disease caused by mitochondrial dysfunction do. The above method utilizes the principle that TRAP1 activity or TRAP1 gene expression is inhibited, resistance to oxidative stress is increased, and mitochondrial dysfunction caused by PINK1 gene deletion is restored. This fact is disclosed in the present invention will be.
이는 본 발명의 명세서 실시예에 잘 나타나 있다.
This is well illustrated in the specification of the present invention.
본 발명의 일실시예에서는 TRAP1 유전자가 결손된 초파리 모델을 제작하고, TRAP1 결손 초파리에 산화스트레스 작용제로 알려진 파라콰트(paraquat) 및 로테논(rotenone)을 처리하고 초파리의 생존률을 측정하였다. 그 결과 정상 초파리에 비해서 TRAP1이 결손된 초파리의 생존률이 높은 것으로나타났다. 또한 TRAP1 mRNA 발현을 저해시킨 초파리에서도 상기와 같은 결과가 나타났다. 이로서 TRAP1 유전자를 억제하면 산화 스트레스에 대한 저항성이 높아지는 것을 확인하였다.
In one embodiment of the present invention, a Drosophila model lacking TRAP1 gene was prepared, and paraquat and rotenone, known as oxidative stress agents, were treated with TRAP1 deficient Drosophila and the survival rate of Drosophila was measured. As a result, the survival rate of TRAP1 deficient Drosophila was higher than that of normal Drosophila. The same results were obtained in the Drosophila that inhibited TRAP1 mRNA expression. Thus, it was confirmed that the resistance to oxidative stress is increased by inhibiting the TRAP1 gene.
본 발명의 다른 일실시예에서는 PINK1 유전자가 결손되어 미토콘드리아 기능장애를 나타내는 초파리에서, TRAP1 유전자를 결손시켰을때 산화 스트레스에 대한 저항성 및 미토콘드리아 기능 장애의 회복 정도를 평가하였다. 그 결과 PINK1 유전자 결손에 의한 rotenone 저항성 감소를 TRAP1 유전자 결손이 정상화 시킴을 확인하였고, 가슴근육 사멸 및 미토콘드리아 외형이상, 가슴근육 내 미토콘드리아 양 및 ATP level 감소, 운동성 감소 및 도파민성 신경세포 사멸 등의 PINK1 mutant phenotype들이 TRAP1 유전자 결손 시 모두 정상화됨을 확인하였다.
In another embodiment of the present invention, resistance to oxidative stress and recovery of mitochondrial dysfunction were evaluated in the absence of TRAP1 gene in Drosophila expressing mitochondrial dysfunction due to deletion of PINK1 gene. As a result, we confirmed that the TRAP1 gene deletion normalizes the loss of rotenone resistance due to the PINK1 gene deletion, and the PINK1 gene deletion such as chest muscle apoptosis and mitochondrial dysplasia, mitochondrial amount and ATP level in the chest muscle, decreased motility and dopaminergic neuronal cell death mutant phenotypes were normalized when the TRAP1 gene was deleted.
본 발명의 다른 일실시예에서는 TRAP1 specific inhibiter로 알려진 gammitrinib-TPP(G-TPP)를 초파리에 투여하고 PINK1 결손에 의한 미토콘드리아 기능이상을 정상화 시킬 수 있는지 확인하였다. 그 결과G-TPP 용액을 투여한 PINK1 유전자 결손 초파리의 운동성이 통계적으로 유의미하게 회복되었고 , G-TPP 용액을 30일간 투여하면 PINK1 결손에 의한 도파민성 신경세포의 사멸이 억제됨을 확인하였다 . 또한 PINK1 결손 세포주는 정상 세포주와는 달리 carbon source를 gulcose에서 galactose로 교체하면 미토콘드리아 막전위가 감소하게 되는데 , G-TPP를 처리할 경우 감소된 막전위가 증가하였다.
In another embodiment of the present invention, gammitrinib-TPP (G-TPP), which is known as a TRAP1 specific inhibitor, is administered to Drosophila to determine whether mitochondrial dysfunction caused by PINK1 deficiency can be normalized. As a result, the mobility of the PINK1 gene-deficient Drosophila melanogaster treated with the G-TPP solution was statistically significantly restored, and that the administration of the G-TPP solution for 30 days inhibited the death of dopaminergic neurons by the PINK1 deficiency. In contrast, in the PINK1-deficient cell line, the mitochondrial membrane potential decreased when the carbon source was changed from gulcose to galactose. G-TPP treatment decreased the membrane potential.
전술한 바와 같이, TRAP1 유전자의 발현 억제제 또는 TRAP1 단백질의 활성 억제제는 미토콘드리아의 기능장애, 특히 PINK1 유전자 결손에 의한 미토콘드리아 기능장애 및 이에 의한 질환을 예방 및 치료하며 세포의 항산화력을 상승시킨다.
As described above, the inhibitor of TRAP1 gene expression or the activity of TRAP1 protein prevents and treats dysfunction of mitochondria, particularly mitochondrial dysfunction caused by PINK1 gene deletion and diseases thereof, and elevates antioxidant power of cells.
따라서 본발명은 TRAP1 유전자(TRAP1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드)에 대해 특이적인 안티센스 RNA(antisense RNA), siRNA 및 miRNA로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 상기 “특이적인”은 세포내에서 다른 유전자에 영향을 미치지 않고 타겟 유전자만 억제하는 능력을 의미한다.
Accordingly, the present invention provides a method for preventing and / or preventing diseases caused by mitochondrial dysfunction, which comprises, as an active ingredient, any one selected from the group consisting of antisense RNAs, siRNAs and miRNAs specific for the TRAP1 gene (polynucleotide encoding TRAP1) Thereby providing a therapeutic composition. The " specific " means the ability to suppress only the target gene without affecting other genes in the cell.
상기‘안티센스 RNA'란 표적 유전자의 제1전사체 또는 mRNA 전체 또는 일부에 상보성이고, 제1전사체 또는 mRNA의 프로세싱, 수송 및(또는) 번역을 방해함으로써 표적 유전자의 발현을 차단하는 RNA 전사체를 말한다. 안티센스 RNA는 5' 비코딩 서열, 3' 비코딩 서열, 인트론 또는 코딩 서열에서 특정 유전자 전사체의 일부와 상보성일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용된 안티센스 RNA는 유전자 발현을 차단하는 안티센스 RNA의 효능성을 증가시키는, 리보자임 서열 영역을 포함할 수 있다.‘리보자임’이란 촉매 RNA를 말하고, 서열 특이적 엔도리보뉴클레아제를 포함한다. 상기‘표적 유전자’는 본 발명의 목적상 TRAP1이다.The "antisense RNA" refers to an RNA transcript that is complementary to all or a portion of a first transcript of a target gene and that blocks the expression of the target gene by interfering with the processing, transport and / or translation of the first transcript or mRNA . The antisense RNA may be complementary to a portion of a particular gene transcript in a 5 'noncoding sequence, a 3' noncoding sequence, an intron, or a coding sequence. The term " ribozyme " as used herein refers to a catalytic RNA, and refers to a sequence specific endoribonucleic acid Lt; / RTI > The 'target gene' is TRAP1 for the purpose of the present invention.
상기‘RNA 전사체’란 DNA 서열의 RNA 폴리머라제에 의해 촉매된 전사에 기인한 생성물을 말한다. RNA 전사체가 DNA 서열의 완전한 상보성 카피인 경우, 제1 전사체로서 또는 제1 전사체의 전사 후 프로세싱으로부터 유래된 RNA 서열일 수 있다. "전령 RNA(mRNA)"란 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있는 RNA를 말한다.
The 'RNA transcript' refers to a product resulting from transcription catalyzed by an RNA polymerase of the DNA sequence. When the RNA transcript is a complete complementary copy of the DNA sequence, it may be an RNA sequence derived from the first transcript or from post-transcription processing of the first transcript. "Messenger RNA (mRNA)" refers to RNA that can be translated into a protein by a cell.
상기 “siRNA”는 표적 유전자의 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNA 간섭 (RNAi: RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 이중사슬 RNA를 의미하고, 표적유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법 또는 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. siRNA 말단 구조는 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하고 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 또한, siRNA는 표적유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.The term " siRNA " means a double-stranded RNA capable of inducing RNA interference (RNA interference) through cleavage of mRNA of a target gene, and includes a sense RNA strand having a sequence homologous to the mRNA of the target gene And antisense RNA strands having complementary sequences. siRNA is provided as an efficient gene knockdown method or gene therapy method because it can inhibit the expression of a target gene. The siRNA is not limited to a complete pair of double-stranded RNA portions that are paired with each other, but is paired by a mismatch (the corresponding base is not complementary), a bulge (no base corresponding to one chain) May be included. The siRNA termini are both blunt or cohesive termini. The adhesive end structure can be a structure having a 3-terminal protruding structure and a 5-terminal protruding structure, and the number of protruding bases is not limited. In addition, the siRNA can be added to a protruding portion of one end in a range where the effect of suppressing the expression of the target gene can be maintained, for example, a small RNA (for example, a natural RNA molecule such as tRNA, rRNA, ). The siRNA terminal structure does not need to have a cleavage structure on both sides, and a stem loop structure in which one terminal region of double-stranded RNA is connected by linker RNA may be used. The length of the linker is not particularly limited as long as it does not interfere with the pairing of the stem portions.
본 발명에서 사용되는 siRNA는 그 자체로 폴리뉴클레오타이드 페어링을 갖는 완전한 형태, 즉 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 두 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태이거나, 생체 내에 투여된 후 이러한 형태를 갖도록 하나의 단일쇄 올리고뉴클레오타이드 단편과 이의 역방향(reverse) 상보물이 스페이서에 의해 분리된 단일쇄 폴리뉴클레오타이드로부터 유도될 수 있는 형태, 예를 들어 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유도된 siRNA 발현 카세트를 형질전환 또는 감염(infection) 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태일 수 있다. siRNA를 제조하고 세포 또는 동물로 도입하는 방법의 결정은 목적 및 표적 유전자 산물의 세포 생물학적 기능에 따라 달라질 수 있다.
The siRNA used in the present invention may be a complete form having polynucleotide pairing itself, that is, a form in which siRNA is directly synthesized in a test tube and introduced into a cell through two transformation processes, Single chain oligonucleotide fragments and their reverse-phase trefoil can be derived from single-stranded polynucleotides separated by a spacer, for example, a form of siRNA expression vector or PCR-derived siRNA prepared so that the siRNA is expressed in a cell The expression cassette may be introduced into the cell through a transformation or infection process. The determination of how to prepare siRNAs and introduce them into cells or animals may depend on the objective and the cellular biological function of the target gene product.
본 발명에서 "miRNA(마이크로 RNA)"는 유전자 발현의 전사후 조절자로서 작용하는, 내인성 유전자에서 유래된 짧은 비코딩 RNA를 의미한다. miRNA는 표적 유전자의 mRNA와 염기쌍을 이룸으로써 유전자 발현의 전사 후 조절자로서 작용한다. 본 발명의 miRNA는 TRAP1유전자의 발현을 억제하는 활성이 있는 한 그 염기 서열 및 길이는 특별히 제한되지 않는다.
In the present invention, "miRNA (microRNA)" means a short non-coding RNA derived from an endogenous gene, which functions as a post-transcriptional regulator of gene expression. miRNAs serve as post-transcriptional regulators of gene expression by forming base pairs with the mRNA of the target gene. As long as the miRNA of the present invention has an activity of inhibiting the expression of the TRAP1 gene, its nucleotide sequence and its length are not particularly limited.
상기 본 발명의 TRAP1 유전자에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA), siRNA 및 miRNA는 공지의 방법을 통해 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어 상기 본 발명의 TRAP1 유전자에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA), siRNA 및 miRNA는 벡터에 포함되어 개체에 제공될 수 있다. 즉, 프로모터; 및 이와 작동 가능하게 연결된 상기 TRAP1 유전자에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA), siRNA 및 miRNA로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터의 형태로 세포 또는 개체에 제공될 수 있다. The antisense RNA, siRNA and miRNA for the TRAP1 gene of the present invention can be introduced into cells through a known method. For example, the antisense RNA, siRNA and miRNA for the TRAP1 gene of the present invention may be contained in a vector and provided to an individual. A promoter; And a polynucleotide encoding any one selected from the group consisting of antisense RNAs, siRNAs and miRNAs against the TRAP1 gene operably linked thereto, in the form of a recombinant expression vector .
상기 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 등을 포함할 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.The expression vector includes, but is not limited to, a plasmid vector, a cosmid vector, a bacteriophage vector, and a viral vector. Suitable expression vectors may include promoter, operator, initiation codon, termination codon, expression modulating elements such as polyadenylation signal and enhancer, and the like, and may be prepared variously according to the purpose.
상기 제조합 벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 숙주 세포에 도입할 수 있다. 숙주 세포로의 도입방법은 바람직하게는 염화칼슘법, 미세사출법(microprojectile bombardment), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method) 등 공지의 방법을 이용할 수 있다.The first combination vector may be introduced into a host cell using methods known in the art. Methods for introduction into host cells are preferably selected from the group consisting of calcium chloride method, microprojectile bombardment, electroporation, PEG-mediated fusion, microinjection, liposome mediated method liposome-mediated method) can be used.
숙주세포로는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포, 진균(예를 들어, 아스퍼질러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피키아 패스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) 등과 같은 하등 진핵세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있으나 이에 제한되지는 않으며, 바람직하게는 인간 세포일 수 있다.Examples of host cells include prokaryotic cells such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces, Pseudomonas, Proteus mirabilis or Staphylococcus. A host cell, a fungus (e.g., Aspergillus), a yeast (e.g., Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces ), Neurospora crassa and the like, eukaryotic cells such as insect cells, plant cells, mammals and the like can be used as a host cell, but not limited thereto, and preferably May be a human cell.
한편, 본 발명에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 다음 문헌에 기재되어 있다(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989); by Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984); and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience (1987)).
Meanwhile, the standard recombinant DNA and molecular cloning techniques used in the present invention are well known in the art and are described in Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1984), 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989); by Silhavy, TJ, Bennan, ML and Enquist, LW, Experiments with Gene Fusions, ; and by Ausubel, FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience (1987)).
상기‘미토콘드리아 기능 장애’및‘미토콘드리아 기능 장애에 의한 질환’에 대한 설명은, 상기 스크리닝 방법에서 전술한 바와 같다.
The 'mitochondrial dysfunction' and 'diseases caused by mitochondrial dysfunction' are as described above in the screening method.
본 발명은 TRAP1에 특이적인 항체를 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
The present invention provides a composition for preventing and treating diseases caused by mitochondrial dysfunction, which comprises an antibody specific for TRAP1 as an active ingredient.
상기 항체에서“특이적” 또는 “특이적인”이란 세포내에서 항체가 오직 하나의 항원에만 결합할 수 있는 특이성을 의미하며, 또한 항원 결합 도메인이 어떤 항원 중에 포함되는 복수의 에피토프 중 특정 에피토프에 대해 특이적인 경우에도 사용된다. 본 발명에서 상기 항원은 TRAP1 이다.
The term " specific " or " specific " as used herein refers to the specificity of an antibody capable of binding to only one antigen within a cell, and also refers to a specific epitope among a plurality of epitopes, It is also used in specific cases. In the present invention, the antigen is TRAP1.
상기‘항체’란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 TRAP1을 특이적으로 인지하는 항체를 의미하며, 다클론 항체 및 단클론 항체를 모두 포함한다.The term " antibody " refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site. For purposes of the present invention, an antibody refers to an antibody that specifically recognizes TRAP1, including both polyclonal and monoclonal antibodies.
TRAP1 단백질의 서열 및 구조는 이미 해당분야에 규명되어있으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.Since the sequence and structure of the TRAP1 protein have already been identified in the field, the production of the antibody using the TRAP1 protein can be easily made using techniques well known in the art.
다클론 항체는 상기한 TRAP1 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.Polyclonal antibodies can be produced by methods well known in the art for obtaining sera containing antibodies by injection of the above-mentioned TRAP1 protein antigen into an animal and blood sampling from the animal. Such polyclonal antibodies can be prepared from any animal species host, such as goats, rabbits, sheep, monkeys, horses, pigs, small dogs, and the like.
단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 융합 방법(fusion method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 재조합 DNA 방법(미국특허 제4,816,567호) 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.Monoclonal antibodies can be prepared by methods known in the art such as the fusion method (see Kohler and Milstein (1976) European Jounal of Immunology 6: 511-519), the recombinant DNA method (US Patent No. 4,816,567) or the phage antibody library et al., Nature, 352: 624-628, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597, 1991).
본 발명의 TRAP1 억제를 통한 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 및 치료에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다. Antibodies used in the prevention and treatment of diseases due to mitochondrial dysfunction through TRAP1 inhibition of the present invention include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms having two full-length light chains and two full-length heavy chains . A functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least an antigen-binding function, and includes, for example, Fab, F (ab ') 2, F (ab') 2 and Fv.
상기 항체는 기존의 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 치료제와 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)시킬 수 있다. 상기 커플링 될수 있는 치료제는 미토콘드리아의 기능 장애를 회복시키는 활성이 있는 한 그 종류가 제한되지 않으나, 예를 들어 젤다나마이신(Geldanamycin) 등 일 수 있다.
The antibody may be indirectly coupled (e.g., covalently linked) to a therapeutic agent for a disease caused by existing mitochondrial dysfunction, either directly or through a linker. The type of the therapeutic agent that can be coupled is not limited as long as it has an activity of restoring mitochondrial dysfunction, for example, Geldanamycin and the like.
항체는 그 자체 또는 항체를 포함하는 조성물로 투여될 수 있다. 치료용 조성물의 경우 투여 방식에 따라 허용 가능한 담체를 포함하여 적절한 제제로 제조된다. 투여 방식에 적합한 제제는 공지되어 있고, 전형적으로 막을 통과한 이동을 용이하게 하는 계면활성제를 포함한다. 이러한 계면활성제는 스테로이드에서 유도된 것이거나 N-[1-(2,3-디올레오일)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTMA) 등의 양이온성 지질, 또는 콜레스테롤 헤미숙시네이트, 포스파티딜 글리세롤 등의 각종 화합물 등이 있다.
The antibody may be administered by itself or in a composition comprising the antibody. In the case of a therapeutic composition, an appropriate preparation is prepared, including an acceptable carrier depending on the mode of administration. Formulations suitable for the mode of administration are well known and typically comprise a surfactant which facilitates migration through the membrane. Such surfactants are those derived from steroids or cationic lipids such as N- [1- (2,3-dioloyl) propyl-N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTMA), or cholesterol hemi- , Phosphatidylglycerol, and the like.
본 발명의 항체를 포함하는 조성물은 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환을 치료하기 위하여 약학적으로 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 약학 조성물은 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 항체를 포함하는 조성물은 비경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내, 및 국부적 면역억제치료를 위해 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의해 투여된다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하투여가 포함된다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 제제의 pH는 항체 안정성(화학적 및 물리적 안정성)의 균형을 맞추고 투여되는 환자에게 적절하도록 하는데 일반적으로, pH 4와 pH 8 범위이다. 그 외에도 경피 투여 및 경구 투여 등의 투여를 위한 다른 기술들을 적절하게 변형시켜 이용하여, 적당한 제제를 고안할 수 있다. 전형적인 투여량 수준은 표준 임상적 기술을 사용하여 최적화할 수 있다.The composition comprising the antibody of the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount to treat diseases caused by mitochondrial dysfunction. The pharmaceutical composition may be administered singly or multiply. Compositions comprising the antibody are administered by any suitable method including, but not limited to, parenteral, subcutaneous, intraperitoneal, intrapulmonary, and intranasal, and, if necessary, for localized immunosuppressive therapy. Parenteral infusions include intramuscular, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, or subcutaneous administration. The preferred modes of administration and formulations are intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular, and drip injections. The pH of the formulation is generally in the range of pH 4 and pH 8, in order to balance antibody stability (chemical and physical stability) and make it suitable for the patient being administered. In addition, other techniques for administration such as transdermal administration and oral administration may be suitably modified and used to devise a suitable preparation. Typical dosage levels can be optimized using standard clinical techniques.
또한, 본 발명의 항체는 항체를 암호화하는 핵산의 형태로 투여되어 세포내에서 항체가 생성되도록 할 수 있다(WO 96/07321).
In addition, the antibody of the present invention may be administered in the form of a nucleic acid encoding an antibody to produce an antibody in the cell (WO 96/07321).
상기‘미토콘드리아 기능 장애’및‘미토콘드리아 기능 장애에 의한 질환’에 대한 설명은, 상기 스크리닝 방법에서 전술한 바와 같다.
The 'mitochondrial dysfunction' and 'diseases caused by mitochondrial dysfunction' are as described above in the screening method.
본 발명은 TRAP1 억제물질(TRAP1 inhibitor)을 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
The present invention provides a composition for preventing and treating a disease caused by a mitochondrial dysfunction which comprises a TRAP1 inhibitor (TRAP1 inhibitor) as an active ingredient.
본 발명에서 상기 TRAP1 억제 물질은 미토콘드리아에서 TRAP1의 활성을 일부 감소시키거나 완전히(실질적으로 완전히) 저해하는 물질을 의미한다. 따라서 상기 TRAP1 억제물질은 TRAP1의 발현을 억제하는 물질 또는 발현된 TRAP1의 활성 억제제를 모두 포함하는 의미이다. 또한, 상기 TRAP1은 Hsp90과 높은 상동성을 가지고 있는 것으로 알려져 있어 Hsp90과 결합하여 이의 활성을 억제하는 물질은 TRAP1과도 결합하여 이의 활성을 억제할 가능성이 높기 때문에, 본 발명에서 상기 TRAP1 억제물질은 미토콘드리아 관통 가능한 Hsp90 활성 억제물질을 포함할 수 있다.
In the present invention, the TRAP1 inhibitory substance means a substance that partially or completely (completely) inhibits the activity of TRAP1 in mitochondria. Therefore, the TRAP1 inhibitor is meant to include both a substance that inhibits the expression of TRAP1 or an inhibitor of the activity of TRAP1 expressed. Since the TRAP1 is known to have high homology with Hsp90, a substance that binds to Hsp90 and inhibits its activity is highly likely to bind to TRAP1 and inhibit its activity. Therefore, the TRAP1 inhibitory substance in the present invention is mitochondria Penetrable Hsp90 activity inhibiting material.
상기 발현의 억제는 전사 단계에서의 조절 또는 전사후 단계에서의 조절을 통해 억제될 수 있다. 전사 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 유전자의 발현을 억제하기 위한 방법, 예를 들면 프로모터 또는 유전자 부위의 돌연변이를 유도하여 프로모터 활성 또는 단백질의 기능을 저해하는 방법일 수 있고,전술한 바와 같이 안티센스(antisense) 유전자를 발현시키는 방법, iRNA(iRNA는 siRNA, shRNA 등 당업계에 공지된 다양한 형태 또는 명칭의 간섭 RNA를 포함하는 의미) 또는 마이크로RNA(microRNA) 방법 등에 의해 수행될 수 있다.
The inhibition of the expression can be inhibited through regulation in the transcription stage or in the post transcription stage. Modulation in the transcription step may be a method for inhibiting the expression of a gene known to a person skilled in the art, for example, a method of inducing a mutation of a promoter or a gene site to inhibit the promoter activity or the function of the protein, a method of expressing an antisense gene, an iRNA (iRNA means an interfering RNA having various forms or titles known in the art such as an siRNA, a shRNA, etc.) or a microRNA (microRNA) method.
전사 후 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 단백질 발현을 저해시키기 위한 방법, 예를 들면 서열번호 1 또는 3으로 표시되는 TRAP1 단백질 또는 이들에 대한 기능적 동등물을 암호화하는 유전자(예를 들어, 서열번호 2 또는 서열번호 4)를 주형으로 전사된 mRNA의 안정성을 저해하는 방법, 단백질 또는 폴리펩티드의 안정성을 저해하는 방법에 의해 수행될 수 있다.
Modulation in the post-transcriptional step may be carried out by a method known to those skilled in the art for inhibiting protein expression, for example, a gene encoding the TRAP1 protein represented by SEQ ID NO: 1 or 3, or a functional equivalent thereto (for example, 2 or SEQ ID NO: 4) of the present invention may be carried out by a method of inhibiting the stability of the mRNA transcribed with the template, or a method of inhibiting the stability of the protein or polypeptide.
Hsp90 또는 TRAP1을 특이적으로 저해하는 물질이 당업계에 공지되어있으며, Hsp90 또는 TRAP1 억제물질의 종류에 관하여는 WO 2009/036092를 참고 문헌으로 할수 있다. Substances which specifically inhibit Hsp90 or TRAP1 are known in the art, and WO 2009/036092 can be referred to regarding the types of Hsp90 or TRAP1 inhibitory substances.
바람직하게 본 발명의 TRAP1 억제물질은 가미트리닙(gamitrinib), 안테나페디아 세포 관통성 서열(ANT)과 컨쥬게이션된 젤다나마이신 및 쉬페르딘(Shepherdin)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이다.
Preferably, the TRAP1 inhibitory substance of the present invention is any one selected from the group consisting of gamitrinib, geldanamycin and Shepherdin conjugated with an antigen-pediatric cell-penetrating sequence (ANT).
가미트리닙은 미토콘드리아로 약물을 전달하는 부위(운반체)와 목적 단백질을 저해하는 부위(젤다나마이신) 및 이들을 연결하는 링커(linker)로 이루어져 있으며, 상기 약물전달부위의 구조에 따라 가미트리닙 G1, G2, G3, G4 또는 TPP로 구분된다. 모든 가미트리닙들은 미토콘드리아로 운반되어 Hsp90/TRAP1을 저해하는 공통된 작용기전을 가지고 있으나 운반체에 따라서 운반효능 및 약물 반응 속도에서 약간의 차이를 보인다.The gamitriinib is composed of a site (carrier) for transporting the drug to the mitochondria, a site (geldanamycin) for inhibiting the target protein, and a linker for linking the sites. The gamitriinib G1 , G2, G3, G4 or TPP. All gamitri nips are transported to the mitochondria and have a common mechanism of action that inhibits Hsp90 / TRAP1, but there is a slight difference in transport efficiency and drug reaction rate depending on the carrier.
본 발명에서‘가미트리닙(Gamitrinib)’은 링커를 통해 C17 위치에서 미토콘드리아 관통 모이어티(예를들어, 테트라구아니디늄(G4), 트리구아니디늄(G3), 디구아니디늄(G2), 모노구아니디늄(G1), 또는 트리페닐포스포늄(TPP) 모이어티)에 컨주게이션된 젤다나마이신 유사체(예를 들어, 17-AAG)를 지칭한다. 이러한 적용을 통해, 특정 가미트리닙의 일부가 되는 미토콘드리아 관통 모이어티가 때때로 지시된다. 예를 들어, 가미트리닙-G4는 테트라구아니디늄 모이어티가 존재하는 가미트리닙을 지칭한다. 예를 들어, 가미트리닙-TPP는 트리페닐포스포늄 모이어티가 존재하는 가미트리닙을 지칭한다. In the present invention, 'gamitrinib' binds to mitochondrial through-going moieties (for example, tetraguanidinium (G4), trianguidinium (G3), diguanidinium (G2) Refers to a geldanamycin analog (e. G., 17-AAG) conjugated to a monoguanidinium (Mono guanidinium (G1), or triphenylphosphonium (TPP) moiety). Through this application, the mitochondrial through-going moiety, which is part of a particular gmitrinib, is sometimes indicated. For example, gamitriinib-G4 refers to gamitriinib in which the tetraguanidinium moiety is present. For example, Kamitri nip-TPP refers to kamitriinib in which a triphenylphosphonium moiety is present.
바람직하게 본 발명의 가미트리닙은 가미트리닙-G1, 가미트리닙-G2, 가미트리닙-G3, 가미트리닙-G4 및 가미트리닙-TPP로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게 가미트리닙-G4 또는 가미트리닙-TPP일 수 있다.
Preferably, the paramitriin of the present invention may be at least one selected from the group consisting of kamitriinib-G1, kamitriinib-G2, kamitriinib-G3, kamitriinib-G4 and kamitriinib-TPP, Preferably gammitriin-G4 or gametrienib-TPP.
상기 가미트리닙-G1은 바람직하게 하기 화학식 1의 구조를 가지며, 천연으로부터 분리 정제하거나, 상업적으로 구입하여 사용하거나 또는 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있다.Gamitirinib-G1 preferably has a structure of the following formula (1), and may be isolated or purified from nature, commercially purchased, or produced by a chemical synthesis method known in the art.
<화학식 1>≪
상기 가미트리닙-G2는 바람직하게 하기 화학식 2의 구조를 가지며, 천연으로부터 분리 정제하거나, 상업적으로 구입하여 사용하거나 또는 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있다.
Gamitirinib-G2 preferably has a structure of the following formula (2), and may be isolated from natural sources, commercially purchased, or produced by a chemical synthesis method known in the art.
<화학식 2>(2)
상기 가미트리닙-G3은 바람직하게 하기 화학식 3의 구조를 가지며, 천연으로부터 분리 정제하거나, 상업적으로 구입하여 사용하거나 또는 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있다.Gamitirinib-G3 preferably has a structure of the following formula (3), and may be isolated from natural sources, commercially purchased, or produced by a chemical synthesis method known in the art.
<화학식 3>(3)
상기 가미트리닙-G4는 바람직하게 하기 화학식 4의 구조를 가지며, 천연으로부터 분리 정제하거나, 상업적으로 구입하여 사용하거나 또는 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있다.Gamitirinib-G4 preferably has a structure of the following formula (4), and may be isolated and purified from nature, commercially obtained, or produced by a chemical synthesis method known in the art.
<화학식 4>≪ Formula 4 >
상기 가미트리닙-TPP는 바람직하게 하기 화학식 5의 구조를 가지며, 천연으로부터 분리 정제하거나, 상업적으로 구입하여 사용하거나 또는 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있다.The germitriin-TPP preferably has a structure of the following formula (5), and may be isolated from natural sources, commercially obtained, or produced by a chemical synthesis method known in the art.
<화학식 5>≪
본 발명의 일실시예에서 사용된 가미트리닙-TPP는 다른 가미트리닙과 비교하여 우수한 약물 반응 속도 및 경제적인 합성이 가능한 화합물이다. 상기 가미트리닙의 유기합성 과정은 문헌[J. Clin. Invest., 2009, Mar, 119(3):454-64; US 2009/0099080]에 상세히 설명되어 있다. 본 발명은 가미트리닙-TPP를 이용하여 수행되었으나, 본 기술분야의 숙련자라면 다른 가미트리닙도 동일한 작용 기전을 가지므로 상기 가미트리닙 TPP 대신에 다른 가미트리닙을 사용하여도 동일한 효과를 얻을 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 가미트리닙 G1, G2, G3 및 G4를 사용하는 약학 조성물도 본 발명의 범주에 포함된다.
The gamitirinib-TPP used in one embodiment of the present invention is a compound capable of an excellent drug reaction rate and economical synthesis as compared to other gamitirinib. The organic synthesis of the gamitirinib can be carried out as described in J. Med. Clin. Invest., 2009, Mar. 119 (3): 454-64; US 2009/0099080. Although the present invention has been carried out using gamitirinib-TPP, one skilled in the art will have the same effect even if another gamitirinib is used instead of gamitirib TPP because the other gamitirinib also has the same mechanism of action As will be appreciated by those skilled in the art. Therefore, pharmaceutical compositions using gamitriibs G1, G2, G3 and G4 are also included in the scope of the present invention.
본 발명에서‘안테나페디아 세포 관통성 서열(ANT)’은 이에 제한되지 않으나, 바람직하게 서열번호 11로 표시되는 펩타이드 서열일 수 있다.
In the present invention, the 'ANT' is not limited to the ANT, but may preferably be the peptide sequence shown in SEQ ID NO: 11.
상기 안테나페디아 세포 관통성 서열(ANT)과 컨주게이션(conjugation)된 젤다나마이신(ANT-GA 으로 표기)은 바람직하게 하기 화학식 6의 구조를 가진다(도 12 참조).The geldanamycin (denoted by ANT-GA) conjugated with the ANT and the ANP preferably has the following structure (see FIG. 12).
<화학식 6>(6)
상기 쉬페르딘(Shepherdin)은 안테나페디아 세포 관통성 서열 및 수비빈(survivin) 유래 Hsp90(또는 TRAP1) 억제 펩타이드 서열이 포함된 펩타이드를 의미한다. 상기 수비빈 유래 Hsp90(또는 TRAP1) 억제 펩타이드 서열에 관하여서는 WO 2009/036092를 참고문헌으로 할 수 있으며 이에 제한되지 않으나, 바람직하게 수비빈 유래 Hsp90(또는 TRAP1) 억제 펩타이드는 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열일 수 있다.
The Shepherdin refers to a peptide comprising an Hsp90 (or TRAP1) inhibitory peptide sequence derived from an Antennapedia cell penetration sequence and survivin. For the HSP90 (or TRAP1) inhibition peptide sequence derived from the male vivin, WO 2009/036092 can be referred to, but not limited thereto, preferably the Hsp90 (or TRAP1) Amino acid sequence.
또한 상기 쉬페르딘 서열은 이에 제한되지 않으나, 바람직하게 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열일 수 있다.
The shaperdine sequence is not limited thereto, but may preferably be the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13.
상기‘미토콘드리아 기능 장애’및‘미토콘드리아 기능 장애에 의한 질환’에 대한 설명은, 상기 스크리닝 방법에서 전술한 바와 같다.
The 'mitochondrial dysfunction' and 'diseases caused by mitochondrial dysfunction' are as described above in the screening method.
본 발명의 용어‘조성물’은 약학적 조성물과 식품 조성물 및 화장료 조성물을 모두 포함할 수 있으나, 바람직하게 약학적 조성물을 의미한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 TRAP1 억제 활성 성분들을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는" 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. The term 'composition' of the present invention may include both a pharmaceutical composition and a food composition and a cosmetic composition, but preferably means a pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition according to the present invention may contain the TRAP1 inhibitory active ingredients of the present invention alone or in combination with one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents. The term "pharmaceutically acceptable" as used herein means a non-toxic composition which is physiologically acceptable and which, when administered to humans, does not inhibit the action of the active ingredient and does not normally cause an allergic reaction such as gastrointestinal disorder, dizziness, .
상기‘TRAP1 억제 활성 성분’이란 TRAP1 유전자에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA), siRNA 및 miRNA로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나, TRAP1 에 특이적인 항체, 가미트리닙, ANT-GA 및 쉬페르딘 등을 포함하는 TRAP1 억제 물질을 포함하며, 이제 제한되지 않는다.
The 'TRAP1 inhibitory active ingredient' includes any one selected from the group consisting of antisense RNA, antisense RNA, siRNA and miRNA for the TRAP1 gene, an antibody specific for TRAP1, gamitriinib, ANT-GA, Lt; RTI ID = 0.0 > TRAP1 < / RTI > inhibitors.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
The pharmaceutically acceptable carrier may further include, for example, a carrier for oral administration or a carrier for parenteral administration. Carriers for oral administration may include lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid, and the like. In addition, it may contain various drug delivery materials used for oral administration to peptide preparations. In addition, the carrier for parenteral administration may contain water, a suitable oil, a saline solution, an aqueous glucose and a glycol, and may further contain a stabilizer and a preservative. Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid. Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol. The pharmaceutical composition of the present invention may further contain a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, etc. in addition to the above components. Other pharmaceutically acceptable carriers and preparations can be found in Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1995).
본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
The composition of the present invention can be administered to mammals including humans by any method. For example, it can be administered orally or parenterally. Parenteral administration methods include, but are not limited to, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, enteral, topical, sublingual or rectal administration Lt; / RTI >
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be formulated into oral preparations or parenteral administration preparations according to the administration route as described above.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈,메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.In the case of a preparation for oral administration, the composition of the present invention may be formulated into a powder, a granule, a tablet, a pill, a sugar, a tablet, a liquid, a gel, a syrup, a slurry, . For example, an oral preparation can be obtained by combining the active ingredient with a solid excipient, then milling it, adding suitable auxiliaries, and then processing the mixture into a granular mixture. Examples of suitable excipients include sugars including lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol and maltitol, and starches including corn starch, wheat starch, rice starch and potato starch, Cellulose such as methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and hydroxypropylmethyl-cellulose and the like, fillers such as gelatin, polyvinylpyrrolidone and the like. In addition, crosslinked polyvinylpyrrolidone, agar, alginic acid, or sodium alginate may optionally be added as a disintegrant. Further, the pharmaceutical composition of the present invention may further comprise an anti-coagulant, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent and an antiseptic agent.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995)에 기재되어 있다.
In the case of a preparation for parenteral administration, it can be formulated by a method known in the art in the form of injection, cream, lotion, external ointment, oil, moisturizer, gel, aerosol and nasal aspirate. These formulations are described in Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1995, which is a commonly known formulary for all pharmaceutical chemistries.
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 500mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
The total effective amount of the composition of the present invention may be administered to a patient in a single dose and may be administered by a fractionated treatment protocol administered over a prolonged period of time in multiple doses. In the pharmaceutical composition of the present invention, the content of the active ingredient may be varied depending on the degree of the disease. Preferably, the total preferred dose of the pharmaceutical composition of the present invention may be from about 0.01 μg to about 10,000 mg, and most preferably from about 0.1 μg to 500 mg, per kilogram of patient body weight per day. However, the dosage of the pharmaceutical composition may be determined depending on various factors such as the formulation method, administration route and frequency of treatment, as well as the patient's age, body weight, health condition, sex, severity of disease, diet and excretion rate, It will be possible to determine the appropriate effective dose of the composition of the present invention by those of ordinary skill in the art in view of this point. The pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited to its formulation, administration route and administration method as long as the effect of the present invention is exhibited.
본 발명의 스크리닝 방법은 미토콘드리아 기능 장애에 의한 질환의 예방 및 치료 기능을 갖는 물질들을 효과적으로 스크리닝 할 수 있다. 또한 본 발명에서 TRAP1 및 이의 유전자에 대한 억제 기능을 갖는 조성물들은 산화 스트레스에 대한 저항성을 높이고 미토콘드리아 기능 장애를 정상 상태로 회복시키는 효과가 있다.
The screening method of the present invention can effectively screen for substances having the function of preventing and treating diseases caused by mitochondrial dysfunction. In the present invention, compositions having an inhibitory function against TRAP1 and its gene have an effect of increasing resistance to oxidative stress and restoring mitochondrial dysfunction to a normal state.
도 1은 각각 TRAP1 P 초파리(a) 및 TRAP1 D6 초파리(b)에서, TRAP1 유전자 및 주변 유전자들의 상대적 위치와 조작 상태를 나타낸 모식도이다. 구체적으로 (a)는 TRAP1 P 초파리에서 p-element 삽입 위치 및 TRAP1 유전자를 중심으로한 주변 유전자들의 위치를 나타내고, (b)는 TRAP1 D6 초파리에서 TRAP1의 C-terminal coding sequence가 손실된 위치를 나타낸다.
도 2의 B는 TRAP1 recombinant protein을 이용하여 제작한 초파리 TRAP1 antibody를 사용하여, TRAP1 P 및 TRAP1 D6 초파리 체내에 TRAP1 단백질 발현 여부를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다(ACT: β-actin (loading control), TRAP1: TRAP1 단백질, RV: 정상초파리, TRAP1 P : TRAP1의 exon에 p-element가 삽입되어 있는 초파리, TRAP1 D6 : TRAP1의 C-terminal coding sequence가 손실된 초파리, hs>TRAP1 : TRAP1 과발현 초파리로서 hs-GAL4와 UAS-TRAP1으로 초파리 몸 전체에서 TRAP1을 발현시킴).
도 2의 C는 TRAP1 P 및 TRAP1 D6 초파리에서 TRAP1 mRNA 발현 정도를 RT-PCR 기법을 통해 확인한 결과를 나타낸다( RV: 정상초파리, TRAP1 P : TRAP1의 exon에 p-element가 삽입되어 있는 초파리, TRAP1 D6 : TRAP1의 C-terminal coding sequence가 손실된 초파리).
도 3의 D는 TRAP1 P 및 TRAP1 D6 초파리에서, TRAP1 발현 유전자의 바로 옆 유전자인 Vha 16-1의 mRNA 발현 정도를 RT-PCR기법을 통해 확인한 결과를 나타낸다(RV: 정상초파리, TRAP1 P : TRAP1의 exon에 p-element가 삽입되어 있는 초파리, TRAP1 D6 : TRAP1의 C-terminal coding sequence가 손실된 초파리).
도 3의 E에서 윗줄은 초파리 S2 세포주에 TRAP1WT(야생형 초파리 TRAP1 단백질)의 cDNA를 발현시켰을때 TRAP1 단백질이 모두 미토콘드리아로 특이적으로 이동한 모습을 나타내며, 아랫줄은 초파리 S2 세포주에 TRAP1△N (TRAPWT에서 N-terminal의 미토콘드리아 이동신호 펩티드를 제거한 TRAP1 단백질)의 cDNA를 발현시켰을때 TRAP1 단백질이 세포기질에만 존재하는 모습을 나타낸다(HA : hamagglutinin, mito: 미토콘드리아, merge : 이미지 통합).
도 4의 A는 정상(RV) 초파리와 TRAP1 mutant (TRAP1D6)의 수명을 조사한 결과를 나타낸다.
도 5의 B는 각각의 초파리군에 산화 스트레스 작용제인 파라콰트(paraquat)를 처리한 후, 각 초파리군별 생존률을 나타낸다 (RV: 정상 초파리).
도 5의 C는 각각의 초파리군에 산화 스트레스 작용제인 로테논(rotenone)을 처리한 후, 각 초파리군별 생존률을 나타낸다 (RV: 정상 초파리).
도 6의 D는 서열번호 10으로 표시되는 TRAP1 특이적 RNAi를 몸 전체에 발현시켜 TRAP1 mRNA 발현을 저해시킨 초파리에서 oxidative stress에 대한 저항성정도를 측정한 것이다(da/+♂: 수컷 control로서 da-GAL4만 가짐, da/+♀: 암컷 control로서 da-GAL4만 가짐, da>TRAP1i♂: TRAP1 RNAi를 발현시킨 수컷 실험군으로서 da-GAL4와 UAS-TRAP1 RNAi를 활용하여 몸 전체에서 TRAP1 RNAi를 발현시킴, da>TRAP1i♀: TRAP1 RNAi를 발현시킨 암컷 실험군으로서 da-GAL4와 UAS-TRAP1 RNAi를 활용하여 몸 전체에서 TRAP1 RNAi를 발현시킴 ).
도 7의 A는 야생형 초파리(WT), PINK1 유전자 결손 초파리(B9), PINK1 및 TRAP1 유전자 동시 결손 초파리('B9,TRAP1D6' 및 'B9,TRAP1P')군에서, 산화 스트레스 작용제인 로테논(rotenone)을 처리한 후 각 초파리군별 생존률을 나타낸다.
도 8의 B는 각각의 초파리군에서 날개(wing) 및 가슴(thorax)근육에 대한 결손 표현형(defective phenotype)을 가진 개체들의 비율을 조사한 결과이다.
도 8의 C에서 윗줄은 각각의 초파리군에서 초파리 가슴근육 조직내 미토콘드리아 외형을 toluidine blue 염색으로 확인한 모습을 나타내며, 아랫줄은 각각의 초파리군에서 초파리 가슴 근육세포의 사멸정도를 TUNEL assay로 확인한 결과를 나타낸다.
도 9의 D는 각각의 초파리군에서 운동성 테스트를 수행한 결과를 나타낸다.
도 10의 E는 각각의 초파리군에서 가슴근육 내 미토콘드리아 양(미토콘드리아 DNA의 양)을 측정한 결과를 나타낸 것이다(coxⅠ: cytochrome c oxidase subunit I, coxⅢ: cytochrome oxidase III gene , cyt B: cytochrome B).
도 10의 F는 각각의 초파리군에서 가슴근육 내 ATP level을 측정한 결과를 나타낸다.
도 11의 G는 각각의 초파리군에서, 뇌조직의 도파민성 신경세포를 anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody staining으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 11의 H는 각각의 초파리군에서, 뇌의 Dorso-lateral (DL) region에 위치한 도파민성 신경세포의 개수를 나타낸 것이다.
도 12는 TRAP1 inhibitor 물질들의 구조를 개략적으로 나타낸 것이다 (Kang BH, BMB Rep. 45, 1-6).
도 13의 A는 각각의 초파리군 별로 갓 우화한 adult 초파리에 G-TPP를 3일간 투여했을 때, G-TPP 투여 농도에 따른 초파리의 운동성 테스트 결과이다(WT: wilde type 초파리, B6: PINK1 유전자 결손 초파리).
도 14의 B는 각각의 초파리군 별로 G-TPP를 30일간 투여했을 때, G-TPP 투여 농도에 따른 도파민성 신경세포의 상태를 anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody staining으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 14의 C는 각각의 초파리군 별로 G-TPP를 30일간 투여했을 때, G-TPP 투여 농도에 따른 도파민성 신경세포의 개수를 나타낸 것이다.
도 15의 D는 각각의 세포주에서, 탄소원(글루코오스 또는 갈락토오스), G-TPP, 17-AAG 처리 조건별 미토콘드리아 막전위를 나타낸 결과이다(PINK1+/+ : 정상 세포주, PINK1-/- : PINK1 유전자 결손 세포주).
도 16의 A는 각각의 초파리군에 대하여 운동성 테스트를 수행한 결과를 나타낸다.
도 16의 B는 각각의 초파리군에 대하여 가슴근육 내 ATP level을 측정한 결과를 나타낸다.
도 16의 C는 각각의 초파리군에 대하여 가슴근육 내 미토콘드리아 양 (미토콘드리아 DNA의 양)을 측정한 결과를 나타낸 것이다(coxⅠ: cytochrome c oxidase subunit I, coxⅢ: cytochrome oxidase III gene , cyt B: cytochrome B).FIG. 1 is a schematic diagram showing the relative positions and manipulation states of TRAP1 gene and peripheral genes in TRAP1 P Drosophila (a) and TRAP1 D6 Drosophila (b), respectively. Specifically, (a) represents the positions of p-element insertion sites and peripheral genes centered on the TRAP1 gene in TRAP1 P Drosophila, and (b) indicates the position where the C-terminal coding sequence of TRAP1 is lost in TRAP1 D6 Drosophila .
Be B of Figure 2 using the fruit fly TRAP1 antibody produced by using a TRAP1 recombinant protein, The results confirm whether TRAP1 protein expression by Western blot to TRAP1 P and TRAP1 D6 Drosophila body (ACT: β-actin (loading control) , TRAP1: TRAP1 protein, RV: normal Drosophila, TRAP1 P : Drosophila with p-element inserted into exon of TRAP1 , TRAP1 D6 : Drosophila with loss of C-terminal coding sequence of TRAP1, hs> TRAP1: TRAP1 overexpressing Drosophila hs-GAL4 and UAS-TRAP1 express TRAP1 throughout the fruit fly).
FIG. 2C shows the results of RT-PCR analysis of TRAP1 mRNA expression in TRAP1 P and TRAP1 D6 Drosophila (RV: normal Drosophila, TRAP1 P : Drosophila with p-element inserted into exon of TRAP1 , TRAP1 D6 : Drosophila in which the C-terminal coding sequence of TRAP1 is lost).
FIG. 3D shows the results of RT-PCR analysis of the mRNA expression level of Vha 16-1, a gene adjacent to the TRAP1 expression gene, in TRAP1 P and TRAP1 D6 Drosophila (RV: normal Drosophila, TRAP1 P : TRAP1 TRAP1 D6 : Drosophila in which the C-terminal coding sequence of TRAP1 is lost).
The upper line is a Drosophila S2 cell line in Fig. 3 E TRAP1 WT when sikyeoteul expressing the cDNA of the (wild-type Drosophila TRAP1 protein) shows a state that both the TRAP1 protein specific to go to the mitochondria, the bottom line is a Drosophila S2 cell line TRAP1 △ N (TRAP1 protein, TRAP1 protein with the N-terminal mitochondrial transport signal peptide removed in TRAP WT ) is present in the cell matrix (HA: hamagglutinin, mito: mitochondria, merge: image integration).
FIG. 4A shows the results of examining the lifespan of the normal (RV) fruit fly and the TRAP1 mutant (TRAP1 D6 ).
FIG. 5B shows the survival rate (RV: normal fruit flora) of each fruit floss group after treatment with paraquat which is an oxidative stress agonist.
FIG. 5C shows survival rates (RV: normal fruit flies) of each Drosophila group after treatment with the oxidative stress agonist rotenone.
FIG. 6D shows the degree of resistance to oxidative stress in Drosophila in which TRAP1-specific RNAi expressed in SEQ ID NO: 10 was expressed in the whole body and inhibited TRAP1 mRNA expression (da / +: male: da- GAL4 alone, da / + ♀: da-GAL4 only as a female control, da> TRAP1i♂: Male TRAIL1 RNAi expressing strain expressing TRAP1 RNAi in whole body using da-GAL4 and UAS-TRAP1 RNAi , da> TRAP1i♀: a female experimental group expressing TRAP1 RNAi, using da-GAL4 and UAS-TRAP1 RNAi to express TRAP1 RNAi throughout the body).
FIG. 7A shows the effect of the oxidative stress agonist rrotenone, which is an oxidative stress agonist, in the wild type Drosophila (WT), PINK1 gene deficient Drosophila (B9), PINK1 and TRAP1 gene simultaneous deficient Drosophila ('B9, TRAP1 D6 ' and B9, TRAP1 P ' (rotenone), respectively.
FIG. 8B shows the results of examining the proportion of individuals having a defective phenotype for the wing and thorax muscles in each of the fruit fly groups.
The upper line in FIG. 8C shows the morphology of the mitochondria in the Drosophila chest muscle tissues by the toluidine blue staining in each of the Drosophila group and the lower line shows the degree of death of the Drosophila chest muscle cells in the Drosophila group by the TUNEL assay .
FIG. 9D shows the result of performing a motility test on each of the Drosophila groups.
FIG. 10E shows the result of measurement of mitochondrial amount (mitochondrial DNA amount) in the chest muscle in each of the Drosophila group (cox I: cytochrome c oxidase subunit I, coxIII: cytochrome oxidase III gene, cyt B: cytochrome B) .
Fig. 10F shows the result of measuring the ATP level in the chest muscle in each of the Drosophila groups.
FIG. 11G shows the result of confirming the dopaminergic neurons of the brain tissue by anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody staining in each of the Drosophila group.
H in FIG. 11 shows the number of dopaminergic neurons located in the dorsal-lateral (DL) region of the brain in each of the Drosophila group.
Figure 12 schematically illustrates the structure of TRAP1 inhibitor materials (Kang BH, BMB Rep. 45, 1-6).
FIG. 13A shows the result of a test for the movement of fruit flies according to the concentration of G-TPP when G-TPP was administered for 3 days to freshly grown adult flies by each flock group (WT: wilde type Drosophila, B6: PINK1 gene Deficient fruit flies).
FIG. 14B shows the results of confirming the state of dopaminergic neurons according to the concentration of G-TPP administration by anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody staining when G-TPP was administered for 30 days for each of the fruit flies.
FIG. 14C shows the number of dopaminergic neurons according to the concentration of G-TPP when G-TPP was administered for 30 days in each Drosophila group.
In Figure 15, each cell line D is a carbon source (glucose or galactose), G-TPP, 17- AAG is a result showing the processing condition by the mitochondrial membrane potential (PINK1 + / +: the normal cell line, PINK1 - / -: PINK1 gene-deficient Cell line).
FIG. 16A shows the result of performing a mobility test on each of the Drosophila groups.
FIG. 16B shows the result of measuring the ATP level in the chest muscle for each of the fruit flies.
FIG. 16C shows the result of measurement of mitochondrial amount (mitochondrial DNA amount) in the chest muscle for each of the fruit flies group (cox I: cytochrome c oxidase subunit I, cox III: cytochrome oxidase III gene, cyt B: cytochrome B ).
이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.
<실시예 1> ≪ Example 1 >
TRAP1 유전자 조작 모델 제작Production of TRAP1 gene manipulation model
<1-1> TRAP1 결손 초파리 모델 및 초파리 사육<1-1> TRAP1 deficient Drosophila model and Drosophila breeding
TRAP1의 생체기능을 규명하고자 TRAP1의 exon에 초파리의 transposon인 p-element가 삽입되어 있는 초파리(TRAP1 P )를 블루밍턴 스탁 센터[Bloomington Drosophila Stock Center(BDSC) Indiana, USA]로부터 입수하였다 (도 1의 (a)). 이 초파리를 p-element의 excision을 유도하는 transposase를 발현하는 초파리와 교배함으로써 p-element의 imprecise excision을 통한 TRAP1 유전자의 결손을 시도하여, p-element 삽입부위 주위가 1kb 가량 결손되어 TRAP1의 C-terminal coding sequence가 손실된 초파리 (TRAP1 D6 )를 제작하였다 (도 1의 (b)).To identify the biological function of TRAP1, Drosophila ( TRAP1 P ), in which a p-element, a transposon of Drosophila, was inserted into the exon of TRAP1 was obtained from Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) Indiana, USA (a)). This cross-breeding of the Drosophila with the transgenic Drosophila expressing p-element excision induces impaired excision of the TRAP1 gene through the imprecise excision of the p-element, resulting in a 1 kb deletion of the p-element insertion site, ( TRAP1 D6 ) in which the terminal coding sequence was lost (Fig. 1 (b)).
별도의 언급이 없는 한, 모든 실험에 있어서 초파리는 25℃, 60% 습도를 유지한 상태에서 표준 콘밀 배지(Standard Conmeal media)(7% 슈크로즈(sucrose),5% 효모, 2.5% 아가(agar))를 이용하여 사육된 것이다.
Unless otherwise noted, in all experiments, Drosophila was grown on standard Conmeal media (7% sucrose, 5% yeast, 2.5% agar )).
<1-2> TRAP1 결손 초파리 모델에서 TRAP1 단백질 발현여부 확인<1-2> Identification of TRAP1 protein expression in TRAP1-deficient Drosophila model
TRAP1 P 와 상기 실시예<1-1>에서 제작된 초파리 mutant TRAP1 D6 에서 TRAP1 유전자의 발현 여부를 확인하기 위하여, 초파리 TRAP1 재조합 단백질(서열번호 9)을 뉴질랜드흰토끼(New Zealand white rabbit)에 투여하여 수득한 초파리 TRAP1 antibody로 웨스턴 블롯을 수행하였으며, 또한 qRT-PCR을 수행하였다.To confirm the expression of the TRAP1 gene in the TRAP1 P and the Drosophila mutant TRAP1 D6 prepared in the above Example <1-1>, the Drosophila TRAP1 recombinant protein (SEQ ID NO: 9) was administered to New Zealand white rabbit Western blotting was performed with the Drosophila TRAP1 antibody obtained by the above-described method, and qRT-PCR was also performed.
대조군으로서 정상 초파리(RV) 및 hs>TRAP1을 사용하였으며, 상기 hs>TRAP1는 TRAP1 과발현 초파리주로서 하기와 같은 방법으로 제작되었다. 간략하게, TRAP1 발현 핵산(서열번호 4, NM_058091.3)을 pUAST 벡터(Drosophila genome resource center, DGRC, Indiana, USA)에 삽입하여 UAS-TRAP1 발현 벡터를 제조하였다. 공지의 방법인 P-인자 매개 생식세포 형질전환(P-element-mediated germ line transformation)법으로서 UAS-TRAP1 발현벡터를 w-초파리(BDSC로부터 수득)에 미세주입하여 UAS-TRAP1 발현벡터로 형질전환된 초파리를 제작하였다. UAS/Gal4 system(A.H. Brand and N. Perrimon., Development 1993 118, 401-15)을 이용하여, 상기 UAS-TRAP1 발현벡터로 형질전환된 초파리를 hs-GAL4 초파리(BDSC로부터 수득)와의 교미를 통해 차세대에서 TRAP1을 초파리 몸 전체에 발현시킨 hs>TRAP1 초파리를 수득하였다.
As a control, normal flora (RV) and hs > TRAP1 were used, and hs > TRAP1 was produced by TRAP1 overexpressing Drosophila. Briefly, a UAS-TRAP1 expression vector was prepared by inserting the TRAP1-expressing nucleic acid (SEQ ID NO: 4, NM_058091.3) into a pUAST vector (Drosophila genome resource center, DGRC, Indiana, USA). The UAS-TRAP1 expression vector was microinjected into a w-Drosophila (obtained from BDSC) as a known P-element-mediated germ line transformation method and transformed into a UAS-TRAP1 expression vector Were prepared. Using the UAS / Gal4 system (AH Brand and N. Perrimon., Development 1993 118, 401-15), the Drosophila transformed with the UAS-TRAP1 expression vector was mated with hs-GAL4 Drosophila (obtained from BDSC) In the next generation, hs > TRAP1 Drosophila in which TRAP1 was expressed throughout the fruit fly body was obtained.
상기 웨스턴 블롯은 다음과 같은 방법으로 수행되었다. 간략하게, 상기 각각의 실험군 초파리로부터 수득한 protein sample을 SDS-PAGE 후 nitrocellulose membrane에 electro-blotting한다. Membrane을 2% BSA TBS-T (Tris-buffered saline with 0.1% TWEEN20)에 30분간 blocking 한 다음, blocking solution에 1:1000 비율로 상기 초파리 TRAP1 antibody를 희석한 용액에 membrane을 넣고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 incubation 시킨다. 이후 Anti-rabbit IgG HRP 2nd antibody (Rockland) 를 1:5000으로 희석한 TBS-T에 membrane을 상온에서 1시간 incubation한 다음 ECL kit (Amersham)로 형광 반응을 시킨 후 LAS-4000 (GE health care)으로 관찰하였다.
The Western blot was performed in the following manner. Briefly, the protein samples obtained from each of the experimental flies were SDS-PAGE and electro-blotted on a nitrocellulose membrane. Membrane was blocked with 2% BSA TBS-T (Tris-buffered saline with 0.1% TWEEN20) for 30 min. Then, membrane was added to the solution of the Drosophila TRAP1 antibody diluted 1: 1000 in blocking solution. Lt; / RTI > After incubation for 1 hour at room temperature with TBS-T diluted 1: 5000 with
또한 상기 qRT-PCR(Quantitative RT-PCR)은 간략하게 하기의 방법으로 수행되었다. 상기 각각의 실험군에서 3day old 수컷 초파리 5마리로부터 Total RNA를 Easy-Blue kit (Intron)를 이용하여 분리한 다음, random hexamer (Promega) 와 MMLV reverse transcriptase (Promega)로 cDNA를 합성하였다. SYBR Premix Ex Taq (Takara) kit와 Prism 7000 Real-Time PCR system (ABI)을 이용하여 섭씨 94도에서 30초, 55도에서 30초, 72도에서 30초의 조건으로 Quantitative real-time PCR을 수행하였다. 본 실험에서 사용된 TRAP1 특이적 프라이머 서열은 하기 [표 1]과 같다.
In addition, qRT-PCR (Quantitative RT-PCR) was performed briefly as follows. Total RNA was isolated from five adult 3 day old Drosophila melanogaster using the Easy-Blue kit (Intron) and cDNA was synthesized with random hexamer (Promega) and MMLV reverse transcriptase (Promega). Quantitative real-time PCR was performed using SYBR Premix Ex Taq (Takara) kit and Prism 7000 real-time PCR system (ABI) at 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds . The TRAP1-specific primer sequences used in this experiment are shown in Table 1 below.
상기 웨스턴 블롯 및 qRT-PCR 결과 TRAP1 P 및 TRAP1 D6 모두 체내에서 TRAP1 단백질 및 mRNA 발현이 성공적으로 억제된 것을 확인하였다(도2의 B 및 C).
As a result of Western blot and qRT-PCR, it was confirmed that TRAP1 protein and mRNA expression were successfully inhibited in both TRAP1 P and TRAP1 D6 (Fig. 2B and Fig. 2C).
<1-3> TRAP1 결손 초파리 모델에서, TRAP1 주변 유전자에대한 영향 평가<1-3> Evaluation of effect on TRAP1 peripheral gene in TRAP1 deficient Drosophila model
TRAP1 P 와 상기 실시예<1-1>에서 제작된 초파리 mutant TRAP1 D6 에서, TRAP1 옆의 유전자인 Vha-16의 mRNA 발현 정도를 qRT-PCR기법으로 조사하였다. qRT-PCR은 상기 실시예 <1-2>에 기재된 것과 같은 방법으로 수행되었으며, 이때 사용된 Vha-16 특이적 프라이머는 하기 [표 2]의 서열을 가진다. In the TRAP1 P and the Drosophila mutant TRAP1 D6 prepared in Example <1-1>, the degree of mRNA expression of Vha-16 gene next to TRAP1 was examined by qRT-PCR technique. The qRT-PCR was carried out in the same manner as described in the above Example < 1-2 >. The Vha-16 specific primers used herein have the sequence shown in Table 2 below.
실험결과, 제작된 초파리 mutant TRAP1 D6 의 체내에서 Vha-16의 발현은 별다른 영향을 받지 않은 것을 확인하였다(도 3의 D). 즉 초파리 mutant TRAP1 D6 는 TRAP1 유전자만 결손되고, TRAP1 주변의 다른 유전자들의 기능은 정상적임을 확인하였다.
As a result, it was confirmed that the expression of Vha-16 was not significantly affected in the body of the produced Drosophila mutant TRAP1 D6 (FIG. 3 D). In other words, TRAP1 D6, a fruit fly mutant, was found to be deficient in TRAP1 gene, and the functions of other genes around TRAP1 were normal.
<1-4> 세포내 TRAP1 단백질의 존재 위치 확인<1-4> Identification of the presence of TRAP1 protein in cells
초파리 TRAP1 단백질이 미토콘드리아 단백질임을 확인하기 위하여 초파리 세포주 Drosophila Schneider 2 (S2) cell에 각각 TRAP1WT(야생형 초파리 TRAP1 단백질)의 cDNA 및 TRAP1△N (TRAPWT에서 N-terminal의 미토콘드리아 이동신호 펩티드를 제거한 TRAP1 단백질)의 cDNA를 발현시켜, 세포 내 존재 위치를 확인하였다. 구체적인 실험방법은 다음과 같다. pUAST vector에 C-terminal hamagglutinin (HA) tagging 된 TRAP1 full length cDNA (TRAP1WT)와 N-terminal deletion mutant (TRAP1△N) cDNA를 cloning하고, 이 plasmid들을 pMT-GAL4 plasmid 와 함께 DDAB 법 (Han K, Nucleic Acids Res., 1996)으로 S2 세포주에 transfection 하였다. Transfection 후 48시간 뒤에 0.5mM CuSO4를 세포에 처리하여 pMT-GAL4의 metallothionein promoter를 활성화시켜 GAL4가 발현되게 함으로써 TRAP1 단백질을 발현시키고, 24시간 후에 5 mg/mL MitoTracker Red CMXRos (Molecular Probes)을 1시간 처리하여 mitochondria를 염색하였다. 이후 4% paraformaldehyde를 함유한 PBS로 세포를 고정시킨 다음, 3% BSA PBS-T (0.3% Triton X-100 in PBS)로 상온에서 1시간 blocking한 다음 1:200 Anti-HA monoclonal antibody를 포함한 blocking solution을 세포에 처리하여 섭씨 4도에서 하룻밤 incubation 하였다. 이후 1:200 anti-mouse FITC antibody를 함유한 PBS-T에 세포를 2시간 incubation 한 다음, LSM 700 공초점 형광현미경 (Carl Zeiss)로 세포 내 TRAP1 단백질의 위치를 조사하였다.
Drosophila TRAP1 protein is a Drosophila cell line to confirm that the mitochondrial protein Drosophila Schneider 2 (S2), respectively in the cell TRAP1 WT (wild-type Drosophila TRAP1 protein) of the cDNA and TRAP1 △ N (TRAP1 removing the mitochondrial movement signal peptide of the N-terminal in the TRAP WT Protein) was expressed to confirm the presence in the cell. Specific experimental methods are as follows. the pUAST vector C-terminal hamagglutinin (HA) tagging the TRAP1 full length cDNA (TRAP1 WT) and N-terminal deletion mutant (TRAP1 △ N) cloning the cDNA, and Han (DDAB method with these plasmid and pMT-GAL4 plasmid K , Nucleic Acids Res., 1996). After 48 hours from transfection, 0.5 mM CuSO 4 was added to the cells to activate the metallothionein promoter of pMT-GAL4 to express GAL4, thereby expressing TRAP1 protein. After 24 hours, 5 mg / mL MitoTracker Red CMXRos (Molecular Probes) And treated with time to stain mitochondria. Then, the cells were fixed with PBS containing 4% paraformaldehyde and then blocked with 3% BSA PBS-T (0.3% Triton X-100 in PBS) for 1 hour at room temperature. Then, the cells were blocked with 1: 200 anti- HA monoclonal antibody solution was incubated overnight at 4 ° C. The cells were then incubated in PBS-T containing 1: 200 anti-mouse FITC antibody for 2 hours, and then the intracellular TRAP1 protein was localized using an LSM 700 confocal fluorescence microscope (Carl Zeiss).
그 결과, 야생형 초파리 TRAP1 cDNA를 입수하여 초파리 세포주 Drosophila Schneider 2 (S2) cell에 발현 시키자 TRAP1 단백질이 모두 미토콘드리아로 특이적으로 이동하였으며, N-terminal의 미토콘드리아 이동신호 펩티드를 제거하자 cytosol에만 존재하여, 초파리 TRAP1 또한 미토콘드리아 단백질임을 확인하였다 (도 3의 E).
As a result, when wild-type Drosophila TRAP1 cDNA was obtained and expressed in Drosophila Schneider 2 (S2) cell of Drosophila cell line, all of TRAP1 protein migrated specifically to mitochondria. When N-terminal mitochondrial transfer signal peptide was removed, Drosophila TRAP1 was also confirmed to be a mitochondrial protein (Fig. 3E).
<실시예 2> ≪ Example 2 >
TRAP1 유전자 결손에 의한 산화 스트레스(oxidative stress) 저항성 Oxidative stress resistance due to TRAP1 gene deletion
<2-1> TRAP1 결손 돌연변이체에서의 산화스트레스 저항성<2-1> Resistance to Oxidative Stress in TRAP1 Deficient Mutants
TRAP1 유전자의 생체기능을 조사하기 위하여 정상 초파리(RV)와 TRAP1 mutant TRAP1D6의 수명 및 산화 스트레스 저항성을 조사하였다. 상기 정상 초파리(RV)는 TRAP1P초파리에서 p-element를 주변의 DNA에 아무런 손상을 주지 않고 정확하게 뽑아내어 TRAP1 유전자의 기능을 정상화 시킨 초파리이다.To investigate the biological functions of the TRAP1 gene, we investigated the lifespan and oxidative stress resistance of normal flora (RV) and TRAP1 mutant TRAP1 D6 . The normal Drosophila (RV) has a p-element in the TRAP1 P Drosophila It is a fruit fly that normalizes the function of the TRAP1 gene by accurately extracting the surrounding DNA without damaging it.
상기 수명 조사 방법은 구체적으로, RV 및 TRAP1D6 각각의 실험군 genotype당 초파리 120 마리를 30마리씩 나누어 초파리 배양배지 10ml이 들어있는 vial에 넣고 3-4일 간격으로 초파리를 새 vial로 옮겨주며 동시에 살아있는 초파리와 죽은 초파리의 마리 수를 check한다. Test가 완료되면 Kaplan-Meier estimator와 log-rank test를 통해 genotype 간 생존률이 통계적으로 의미있게 차이가 나는지 검증하였다.Specifically, 120 rabbits per each experimental group genotype of RV and TRAP1 D6 were divided into 30 rabbits. The rabbits were transferred into vials containing 10 ml of Drosophila culture medium. The rabbits were transferred to new vials every 3-4 days, And the number of dead flies. When the test was completed, the Kaplan-Meier estimator and the log-rank test were used to verify the statistically significant difference in survival rates between genotypes.
또한 상기 산화 스트레스 저항성을 측정하기 위하여, 상기 RV, TRAP1p 및 TRAP1D6 각각의 실험군 genotype당 120마리의 초파리 (3 day old)를 각 30마리씩의 4개 그룹으로 나누어 6시간 동안 starvation 시키고, 5% sucrose, 1% agar, 20mM paraquat (또는 5mM rotenone) 함유 PBS gel 3ml이 담긴 oxidative agent vial에 초파리를 30마리씩 넣어 일정 시간마다 생존율을 측정한다. 상기 oxidative agent vial은 하루에 한번씩 새것으로 교체한다. Test가 완료되면 Kaplan-Meier estimator와 log-rank test를 통해 genotype 간 생존률이 통계적으로 의미있게 차이가 나는지 검증하였다.
To measure the resistance to oxidative stress, 120 rabbits (3 day old) per genotype of RV, TRAP1 p and TRAP1 D6 were divided into 4 groups of 30 rats each, starvation was carried out for 6 hours, and 5% Survival rate is measured every 30 hours by placing 30 fruit flies in oxidative agent vial containing 3 ml of PBS gel containing sucrose, 1% agar and 20 mM paraquat (or 5 mM rotenone). The oxidative agent vials are replaced with new ones once a day. When the test was completed, the Kaplan-Meier estimator and the log-rank test were used to verify the statistically significant difference in survival rates between genotypes.
실험 결과, 수명에 있어서는 상기 정상 초파리(RV))와 TRAP1 mutant TRAP1D6간에 별다른 차이가 없었다 (도4의 A). 그러나 놀랍게도 paraquat (도5의 B), rotenone (도5의 C)등의 oxidative stress agent들을 초파리에 처리하여 본 결과 기존에 알려진 사실과는 달리 TRAP1 유전자 결손이 oxidative stress에 대한 저항성을 항진 시킨다는 결과를 얻었다.
As a result, there was no significant difference in the lifespan between the normal flora (RV) and the TRAP1 mutant TRAP1 D6 (Fig. 4A). However, surprisingly, oxidative stress agents such as paraquat (B in Fig. 5) and rotenone (C in Fig. 5) were treated with Drosophila to show that TRAP1 gene deletion enhances resistance to oxidative stress .
<2-2> TRAP1 넉다운(knock-down) 초파리에서의 산화스트레스에 대한 저항성<2-2> Resistance to oxidative stress in TRAP1 knock-down fruit flies
BDSC로 부터 수득한 암·수 da-GAL4 초파리주(da/+로 표시)에, TRAP1 특이적 RNAi(서열번호 10)를 몸 전체에 발현시켜, TRAP1 mRNA 발현을 저해시킨 초파리 da>TRAP1를 제작하였다. 간략하게, UAS promoter가 붙어있는 TRAP1 특이적 RNAi(서열번호 10)가 염색체에 삽입된 형질전환 초파리를 Vienna Drosophila Resource Center (VDRC) (Vienna, Austria)에서 수득한 후, 상기 da-GAL4 초파리와 교미를 통해 차세대에서 온몸에서 TRAP1 mRNA의 발현이 억제된 da>TRAP1 초파리를 제작하였다. 대조군인 암·수 da-GAL4 초파리주(da/+)와 실험군 암수 da>TRAP1 초파리에 산화물질로서 로테논(rotenone)을 사용하여 상기 실시예 2-1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 산화 스트레스 저항성을 측정하였다.
TRAP1-specific RNAi (SEQ ID NO: 10) was expressed in the whole body in a cancer-male da-GAL4 Drosophila strain (denoted by da / +) obtained from BDSC to inhibit the expression of TRAP1 mRNA Respectively. Briefly, a transgenic Drosophila in which the TRAP1 specific RNAi (SEQ ID NO: 10) with the UAS promoter attached was inserted into the chromosome was obtained from the Vienna Drosophila Resource Center (VDRC) (Vienna, Austria) , We constructed da> TRAP1 Drosophila in which the expression of TRAP1 mRNA was suppressed in whole body in the next generation. Using the same method as described in Example 2-1 above using the male / female da-GAL4 Drosophila (da / +) as the control group and rotenone as the oxidizing substance in the female and female da> TRAP1 Drosophila, oxidative stress resistance Were measured.
도 6에서 보는 바와 같이, TRAP1 특이적 RNAi(서열번호 10)를 몸 전체에 발현시켜 TRAP1 mRNA 발현을 저해시킨 초파리를 이용한 실험에서도 TRAP1 유전자 결손이 oxidative stress에 대한 저항성을 항진시킴이 확인되었다 (도6의 D).
As shown in FIG. 6, TRAP1 gene deletion was found to enhance resistance to oxidative stress even in experiments using Drosophila in which TRAP1-specific RNAi (SEQ ID NO: 10) was expressed throughout the body and TRAP1 mRNA expression was inhibited 6, D).
<실시예 3> ≪ Example 3 >
PINK1 유전자 결손 초파리 모델에서, TRAP1 유전자 결손에 의한 oxidative stress 저항성 및 미토콘드리아 기능 항진In the PINK1 gene-deficient Drosophila model, resistance to oxidative stress by TRAP1 gene deletion and hyperactivity of mitochondrial function
PINK1 유전자 결손시 oxidaive stress에 대한 저항성이 감소한다는 사실이 보고된 바 있어(Clark et al., (2006) Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature 441: 1162-6), PINK1 및 TRAP1 유전자가 동시 결손된 초파리를 제작하여 하기와 같은 실험을 하였다.
It has been reported that PINK1 gene deletion decreases resistance to oxidaive stress (Clark et al., (2006) Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature 441: 1162-6), PINK1 and TRAP1 gene was simultaneously produced and the following experiment was carried out.
<3-1> 초파리 주(line) 및 PINK1 결손 세포주(cell line)<3-1> Drosophila line and PINK1 deficient cell line (cell line)
PINK1 유전자 결손 초파리(B9)는 서울대학교 정종경 교수로부터 제공 받았다. 제공받은 PINK1 유전자 결손 초파리를 상기 실시예<1-1>의 TRAP1D6 및 TRAP1p 과 각각 교배하여 PINK1 및 TRAP1 유전자 동시 결손 초파리 'B9,TRAP1D6' 및‘B9,TRAP1p’를 제작하였다. TRAP1 과량발현 초파리는 상기 실시예<1-2>에서 제작한 cDNA를 이용하여 KAIST 초파리 연구지원실에 의뢰하여 제작하였다(하기 실시예<3-8> 참조). The PINK1 gene-deficient Drosophila (B9) was obtained from Professor Jong-Kyung Chung of Seoul National University. The PINK1 and TRAP1 gene simultaneous deletion fruit fly 'B9, TRAP1 D6 ', and B9 and TRAP1 p 'were prepared by crossing the provided PINK1 gene deletion fruit fly with each of TRAP1 D6 and TRAP1 p of the above Example <1-1>. TRAP1-overexpressed Drosophila was produced using the cDNA prepared in Example <1-2>, and was submitted to the KAIST Drosophila Research Support Office (see Example <3-8 below).
시카고 의대의 Xiaoxi Zhuang 교수 연구실에서 제작된 PINK1 유전자 결손 생쥐로부터 얻은 mouse embryonic fibroblast (MEF) [Xiong et al., J Clin Invest., 2009]를 입수하여 섭씨 37도, 5% CO2 incubator에서 10% FBS를 함유한 DMEM으로 배양하여 실험에 사용하였다 .
Obtained from the PINK1 gene-deficient mice produced in Xiaoxi Zhuang Professor Laboratory of Chicago Medical School mouse embryonic fibroblast (MEF) [Xiong et al., J Clin Invest., 2009] to get to 37 ° C, 10% at 5% CO 2 incubator The cells were cultured in DMEM containing FBS and used for experiments.
<3-2> PINK1 및 TRAP1 유전자가 동시 결손된 초파리에서, 산화스트레스 작용제(rotenone)에 대한 저항성 평가<3-2> Evaluation of Resistance to Oxidative Stress Agents (rotenone) in Drosophila with Simultaneous Loss of PINK1 and TRAP1 Gene
정상 초파리‘WT’, 상기 실시예<3-1>의 PINK1 유전자 결손 초파리‘B9', PINK1 및 TRAP1 유전자가 동시 결손된 초파리 'B9,TRAP1D6' 및‘B9,TRAP1p’각각을 이용하여, 로테논(rotenone)에대한 산화스트레스 저항성을 평가하였다. 산화스트레스 저항성은 상기 실시예<2-1>에 기재된 방법과 동일하게 수행되었다.
B9, TRAP1 D6 ', and B9 and TRAP1 p ', which are the normal fruit flies 'WT', the PINK1 gene deletion fruit fly 'B9', the PINK1 and TRAP1 genes of Example <3-1> Oxidative stress resistance to rotenone was evaluated. The oxidative stress resistance was performed in the same manner as described in the above Example <2-1>.
그 결과 PINK1 유전자 결손에 의한 rotenone 저항성 감소를 TRAP1 유전자 결손이 정상화시킴을 확인하였다 (도7의 A).
As a result, it was confirmed that the loss of rotenone resistance due to the PINK1 gene deletion normalizes the TRAP1 gene deletion (Fig. 7A).
<3-3> 결손 표현형(defective phenotype)의 회복<3-3> Recovery of defective phenotype
정상 초파리‘WT’, 상기 실시예<3-1>의 PINK1 유전자 결손 초파리‘B9', PINK1 및 TRAP1 유전자가 동시 결손된 초파리 'B9,TRAP1D6' 및‘B9,TRAP1p’각각의 실험군에서, 초파리 200마리의 날개와 가슴을 관찰하여 날개가 처진 초파리와 가슴이 우그러든 초파리의 비율을 각각 %로 환산하여 결손 표현형 비율을 산출하였다.
B9, TRAP1 D6 ', and B9 and TRAP1 p in which the normal Drosophila' WT ', the PINK1 gene deletion Drosophila' B9 ', the PINK1 and TRAP1 genes of Example <3-1> The ratio of the phenotype of Drosophila and Drosophila melanogaster was calculated by calculating the percentage of deficient phenotype.
PINK1 유전자가 결손된 초파리들은 가슴근육이 결손됨에 따라 날개가 처지고 가슴부위가 우그러드는 표현형을 보이는 데, TRAP1 유전자 결손에 의해서 PINK1 유전자 결손 초파리의 처진 날개와 우그러든 가슴이 정상으로 회복됨을 확인하였다(도8의 B 참조).
Drosophila deficient in PINK1 gene showed that the wings were sagging and the chest area worsened as the chest muscles were lost. The TRAP1 gene deletion confirmed the wings of the PINK1 gene-deficient Drosophila and the wormy chest recovered to normal (See Fig. 8B).
<3-4> 근육 조직 내 세포사멸 정도 측정 및 미토콘드리아 외형 관찰<3-4> Measurement of the degree of apoptosis in muscle tissue and observation of mitochondrial appearance
근육 조직 내 미토콘드리아 기능이상이 근육세포 사멸을 초래함이 보고되어, 다음과 같은 방법으로 근육세포의 세포사멸 정도를 조사하였다. 정상 초파리‘WT’, 상기 실시예<3-1>의 PINK1 유전자 결손 초파리‘B9', PINK1 및 TRAP1 유전자가 동시 결손된 초파리 'B9,TRAP1D6' 및‘B9,TRAP1p’각각의 실험군에서, 초파리의 가슴 부위를 절개하여 근육조직을 분리한 다음, 4% formaldehyde로 고정시킨 후 TUNEL assay를 실시하여 가슴 근육에서의 세포사멸 정도를 조사하였다. 또한 근육 내 미토콘드리아 외형을 확인하기 위하여, 초파리 가슴 부위를 분리하여 Spurr's resin에 넣고 응고 시킨 후 rotary microtome을 이용하여 10 미크론 두께로 절편을 제작한 후 toluidine blue 염색제로 염색하여 광학현미경으로 근육조직 내 미토콘드리아 외형을 관찰 하였다.
It has been reported that mitochondrial dysfunction in muscle tissue causes muscle cell death, and the degree of apoptosis of muscle cells was examined by the following method. B9, TRAP1 D6 ', and B9 and TRAP1 p in which the normal Drosophila' WT ', the PINK1 gene deletion Drosophila' B9 ', the PINK1 and TRAP1 genes of Example <3-1> The muscle tissue was dissected from the chest area of Drosophila, fixed with 4% formaldehyde, and then subjected to TUNEL assay to investigate the degree of apoptosis in the chest muscle. In order to identify the intramuscular mitochondrial outline, the Drosophila chest was separated, placed in Spurr's resin, and coagulated. A 10-micron thick slice was prepared using a rotary microtome, stained with toluidine blue stain, The outline was observed.
실험 결과 PINK1 유전자 결손에 의한 가슴근육 사멸 (도8의 C에서 아랫줄) 및 미토콘드리아 외형이상 (도8의 C에서 윗줄) 의 PINK1 mutant phenotype들이 TRAP1 유전자 결손 시 모두 정상화되었다.
As a result, PINK1 mutant phenotypes of PINK1 gene deletion (bottom line in C in FIG. 8) and mitochondrial dysplasia (in C line in FIG. 8) were all normalized at the time of TRAP1 gene deletion.
<3-5> 모델동물 운동성 test<3-5> Model animal motility test
정상 초파리‘WT’, 상기 실시예<3-1>의 PINK1 유전자 결손 초파리‘B9', PINK1 및 TRAP1 유전자가 동시 결손된 초파리 'B9,TRAP1D6' 및‘B9,TRAP1p’각각의 실험군에서, 초파리의 운동성을 측정하기위해 climbing assay를 수행하였다, 초파리는 중력을 감지하여 중력의 반대방향으로 움직이는 특성이 있어, 이를 이용하여 초파리의 운동성을 측정하는 실험기법을 climbing assay라 부른다. 일단 초파리를 온도가 일정히 유지되는 암실에 1시간 동안 보관하여 안정화시킨 다음, 초파리가 들어있는 vial을 두드려 초파리를 vial 바닥에 위치시킨 후 10초 동안 15cm이상을 올라오는 초파리의 수를 세어 전체 초파리 중 이러한 기준을 충족시키는 운동성을 보이는 초파리의 비율을 구하고, 이를 5회 반복하여 평균값을 구하였다.
B9, TRAP1 D6 ', and B9 and TRAP1 p in which the normal Drosophila' WT ', the PINK1 gene deletion Drosophila' B9 ', the PINK1 and TRAP1 genes of Example <3-1> A climbing assay was performed to measure the motility of Drosophila. The Drosophila has the property of moving in the opposite direction of gravity by sensing gravity. An experimental technique for measuring the motility of Drosophila is called climbing assay. Once the flies were kept in a dark room for one hour to stabilize them, the flies were placed on the vial floor by tapping the vials containing the flies, counting the number of flies rising above 15 cm for 10 seconds, The percentage of fruit flies exhibiting motility satisfying these criteria was obtained, and the average value was obtained by repeating this five times.
실험 결과 PINK1 유전자 결손에 의한 운동성 감소 (도9의 D)의 PINK1 mutant phenotype이 TRAP1 유전자 결손 시 모두 정상화되었다.
As a result, the PINK1 mutant phenotype of the reduced motility due to the PINK1 gene deletion (FIG. 9D) was normalized when the TRAP1 gene was deleted.
<3-6> 근육 조직 내 mitochondria 양 측정 및 ATP 농도 측정<3-6> Measurement of mitochondria amount and ATP concentration in muscle tissue
정상 초파리‘WT’, 상기 실시예<3-1>의 PINK1 유전자 결손 초파리‘B9', PINK1 및 TRAP1 유전자가 동시 결손된 초파리 'B9,TRAP1D6' 및‘B9,TRAP1p’각각의 실험군에서, 조직 내 미토콘드리아 양 및 기능을 측정하였다. 구체적으로 quantitative real-time PCR 기법을 사용하여 조직 내 미토콘드리아 DNA (mtDNA)의 양을 측정하여 미토콘드리아의 양을 측정 하였다. 또한 미토콘드리아의 기능을 조사하기 위하여 미토콘드리아가 생산하는 에너지 전달물질인 ATP의 양을 측정하였다. mtDNA 양 측정은 실험군별로 초파리 5마리의 가슴을 분리하여 모은 다음, qiagen 사의 DNeasy Blood & tissue kit (#69506)을 이용하여 근육조직 내 total DNA 만을 분리하였다. mtDNA에 존재하는 3가지 미토콘드리아 단백질 유전자 coxⅠ, coxⅢ, cyt B 에 대한 프라이머를 각각 제작한 후(표 3 참조), SYBR Premix Ex Taq (Takara) kit와 Prism 7000 Real-Time PCR system (ABI)을 이용하여 섭씨 94도에서 30초, 55도에서 30초, 72도에서 30초의 조건으로 Quantitative real-time PCR을 수행하여 mtDNA양을 구하였다. 또한 nuclear DNA (nDNA)에 위치한 유전자인 rp49에 대한 프라이머(표 3 참조)를 이용하여 상기와 같은 방법으로 nDNA양을 구한 후, normalization하여 mtDNA 양을 정확하게 확인하였다. B9, TRAP1 D6 ', and B9 and TRAP1 p in which the normal Drosophila' WT ', the PINK1 gene deletion Drosophila' B9 ', the PINK1 and TRAP1 genes of Example <3-1> The amount and function of mitochondria in tissues were measured. Specifically, quantitative real-time PCR was used to measure the amount of mitochondrial DNA (mtDNA) in the tissues to determine the amount of mitochondria. In addition, the amount of ATP, an energy transfer material produced by mitochondria, was measured to examine the function of mitochondria. The amount of mtDNA was determined by collecting 5 chick flies from each experimental group and then isolating total DNA in muscle tissue using qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit (# 69506). The primers for the three mitochondrial protein genes cox I, cox III and cyt B in mtDNA were prepared (see Table 3), then the SYBR Premix Ex Taq (Takara) kit and the Prism 7000 Real-Time PCR system Quantitative real-time PCR was performed at 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds to determine the amount of mtDNA. In addition, the amount of nDNA was determined using primers (see Table 3) for rp49 gene located in the nuclear DNA (nDNA), and the amount of mtDNA was accurately confirmed by normalization.
또한, 근육 조직내 ATP 양을 구하기 위하여 실험군별로 초파리 5마리의 가슴 근육을 0.1ml extraction buffer (6M guanidine-HCl, 10mM Tris, 4mM EDTA, pH 7.8)에 넣고 homogenize 한 후, 액체질소로 급속 냉동시키고 3분간 끓인 다음 원심분리하여 상층액을 모아 추출액을 제조하였다. 상기 추출액에 Enlighten Kit (Promega)를 사용하여 추출액의 ATP 농도를 구하고, BCA assay를 통해 얻은 추출액 내의 단백질 농도로 normalization하여 근육 내 ATP level을 확인 하였다.
To determine the amount of ATP in the muscle tissue, 5 mouse flies of the chest muscles were homogenized in 0.1 ml extraction buffer (6M guanidine-HCl, 10 mM Tris, 4 mM EDTA, pH 7.8) and rapidly frozen with liquid nitrogen After boiling for 3 minutes, the supernatant was collected by centrifugation to prepare an extract. The concentration of ATP in the extract was determined by using Enlighten Kit (Promega) in the extract, and normalized to the protein concentration in the extract obtained through BCA assay to confirm intramuscular ATP levels.
실험 결과 PINK1 유전자 결손에 의한 가슴근육 내 미토콘드리아 양 (도10의 E) 및 ATP level 감소 (도10의 F)의 PINK1 mutant phenotype들이 TRAP1 유전자 결손 시 모두 정상화되었다.
As a result, PINK1 mutant phenotypes in the chest muscle due to PINK1 gene deletion (E in FIG. 10) and ATP level decrease (FIG. 10 F) were normalized at all TRAP1 gene deletion.
<3-7> 초파리 도파민 신경세포 사멸 정도 측정<3-7> Measurement of Drosophila Dopamine Nerve Cell Death Level
정상 초파리‘WT’, 상기 실시예<3-1>의 PINK1 유전자 결손 초파리‘B9', PINK1 및 TRAP1 유전자가 동시 결손된 초파리 'B9,TRAP1D6' 및‘B9,TRAP1p’각각의 실험군에서, 우화 후 30일 지난 초파리의 뇌를 분리하여 4% paraformaldehyde 용액에 고정 시킨 후 Pel-freez 회사의 anti-tyrosine hydroxylase (TH) 항체로 염색한 다음, Dorso-lateral (DL) region 에 위치한 도파민 신경세포의 개수를 측정하였다 (n=40) (Koh H, Kim H, Kim MJ, Park J, Chung J (2012) Sir2 and FOXO Complement Mitochondrial Dysfunction and Dopaminergic Neuron Loss in Drosophila PINK1 Mutants. J Biol Chem 287: 12750-12758).
B9, TRAP1 D6 ', and B9 and TRAP1 p in which the normal Drosophila' WT ', the PINK1 gene deletion Drosophila' B9 ', the PINK1 and TRAP1 genes of Example <3-1> After 30 days of fermentation, the brain of the Drosophila melanogaster was isolated, fixed in 4% paraformaldehyde solution, stained with anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody from Pel-freez, (N = 40) (Koh H, Kim H, Kim JJ, Park J, Chung J (2012) Sir2 and FOXO Complement Mitochondrial Dysfunction and Dopaminergic Neuron Loss in Drosophila PINK1 Mutants J Biol Chem 287: 12750-12758 ).
실험 결과 PINK1 유전자 결손에 의한 도파민성 신경세포 사멸 (도11의 G 및 H) 의 PINK1 mutant phenotype들이 TRAP1 유전자 결손 시 모두 정상화되었다.
As a result, PINK1 mutant phenotypes of dopaminergic neuronal apoptosis (G and H in FIG. 11) due to PINK1 gene deletion were normalized when TRAP1 gene was deleted.
<3-8> TRAP1 유전자의 조직 특이적 과량발현 및 이의 효과<3-8> Tissue-specific overexpression of TRAP1 gene and its effect
BDSC로 부터 수득한 da-GAL4 초파리(da로 표시), 상기 실시예<3-1>의 PINK1 유전자 결손 초파리(B9)와 da-GAL4 초파리의 교미를 통해 수득한‘B9, da’초파리 및 상기‘B9, da’초파리와 상기 실시예 <1-2>에서 제작한 UAS-TRAP1 발현벡터로 형질전환된 초파리의 교미를 통해 차세대에서 TRAP1 유전자가 과량발현된 PINK1 유전자 결손 초파리‘B9, da TRAP1’를 대상으로 운동성평가, 근육 조직 내 mitochondria 양 측정 및 ATP 농도 측정을 수행하였다.
B9, da 'fruit flies obtained through the mating of da-GAL4 fruit flies (denoted by da) obtained from BDSC, the PINK1 gene-deficient Drosophila (B9) of Example <3-1> above and da-GAL4 Drosophila, 'B9, da TRAP1', which is overexpressed in TRAP1 gene in the next generation through mating of 'B9, da' Drosophila and the UAS-TRAP1 expression vector prepared in Example <1-2> Were evaluated for mobility, mitochondria in muscle tissue and ATP concentration.
또한 운동성 평가는 상기 실시예<3-5>에 기재된 방법으로, 근육 조직 내 mitochondria 양 측정 및 ATP 농도 측정은 상기 실시예 <3-6>에 기재된 방법으로 수행되었다.
In addition, the mobility was evaluated by the method described in Example <3-5>, and the amount of mitochondria in muscle tissue and the ATP concentration were measured by the method described in Example <3-6> above.
그 결과 PINK1 mutant (B9, da) 에서 관찰되는 운동성 저하 (도 16의 A), 근육 내 ATP 농도 감소 (도 16의 B), 근육내 mitochondria content 감소 (도 16의 C)가 TRAP1을 과량발현 중인 PINK1 결손 mutant (B9, da TRAP1)에서 전혀 정상화 되지 않는 것을 확인하였다. 즉, TRAP1 유전자 과량 발현은 PINK1 결손 mutant phenotype에 별다른 영향을 주지 못하였다.
16A), decrease in intracellular ATP concentration (Fig. 16B) and decrease in intramuscular mitochondria content (Fig. 16C) observed in the PINK1 mutant (B9, da) It was confirmed that it was not normalized at all in the PINK1 deficient mutant (B9, da TRAP1). In other words, overexpression of TRAP1 gene did not affect the PINK1 deletion mutant phenotype.
이러한 상기 실시예 <3-1> 내지 <3-8>의 결과로부터, TRAP1 유전자 결손이 oxidative stress에 대한 저항성을 증가시키고, PINK1 유전자 결손에 의한 mitochondrial dysfunction을 정상화 시킨다는 사실을 발견하였다.
The results of Examples 3-1 to 3-8 found that TRAP1 gene deletion increases resistance to oxidative stress and normalizes mitochondrial dysfunction due to PINK1 gene deletion.
<실시예 4> <Example 4>
TRAP1 specific inhibitor에 의한 미토콘드리아 기능이상 정상화Normalization of mitochondrial dysfunction by TRAP1 specific inhibitor
미토콘드리아에 특이적으로 위치한 TRAP1을 억제하기 위하여 HSP90 inhibitor인 geldanamycin (17-AAG)및 이에 mitochondria targeting group들을 결합시킨 TRAP1 inhibitor 중 gammitrinib (G-TPP) (도12 참조)을 초파리에 투여하고 PINK1 결손에 의한 미토콘드리아 기능이상을 정상화 시킬 수 있는지 확인하였다.
In order to inhibit TRAP1 specifically located in mitochondria, geldanamycin (17-AAG), an HSP90 inhibitor, and gammitrinib (G-TPP) (see FIG. 12), a TRAP1 inhibitor combined with mitochondria targeting groups, To normalize mitochondrial dysfunction.
<4-1> TRAP1 specific inhibitor 처리 및 운동성 테스트<4-1> TRAP1 specific inhibitor treatment and mobility test
정상초파리(WT) 및 PINK1 결손초파리 모델(B9)을 이용하여, 갓 우화한 adult 초파리에 G-TPP를 3일간 투여한 후 운동성을 조사하였다. Using the normal Drosophila (WT) and the PINK1-deficient Drosophila model (B9), G-TPP was administered to freshly grown adult flies for 3 days before mobility.
G-TPP 투여는 하기와 같은 방법으로 수행되었다. 초파리 배양배지 5ml이 담긴 vial을 만들고 18G 주사바늘로 배지에 구멍을 50개 이상 뚫은 다음, 1mM 또는 5mM 농도의 G-TPP를 함유한 증류수 0.2ml을 넣고 하룻밤 상온에 놓아두어 G-TPP 용액을 배지에 흡수 시킨다. 상기 완성된 G-TPP 함유 vial에 초파리를 30마리씩 넣고 3일간 배양한 다음 실험에 사용하였다. 운동성 테스트 방법은 실시예 <3-5>에 기재된 방법과 동일하게 climbing assay가 수행되었다.
G-TPP administration was carried out in the following manner. A vial containing 5 ml of Drosophila culture medium was prepared, and 50 or more holes were drilled in the medium with 18 G needle. Then, 0.2 ml of distilled water containing 1 mM or 5 mM concentration of G-TPP was added and the mixture was allowed to stand at room temperature overnight. . 30 vials of Drosophila melanogaster were added to the completed vial containing G-TPP and cultured for 3 days. The mobility test method was performed in the same manner as described in Example <3-5>.
그 결과 5mM G-TPP 용액을 투여한 PINK1 유전자 결손 초파리의 운동성이 통계적으로 유의미하게 회복되었다 (도13의 A).
As a result, the mobility of the PINK1 gene-deficient Drosophila melanogaster treated with the 5 mM G-TPP solution was statistically recovered (Fig. 13A).
<4-2> TRAP1 specific inhibitor 처리 및 도파민성 신경세포 사멸 억제<4-2> Treatment of TRAP1 specific inhibitor and inhibition of dopaminergic neuronal cell death
상기 실시예<4-1>에 기재된 방법으로 제작된 G-TPP 함유 vial을 3-4일 마다 새것으로 교환하여, 정상초파리(WT) 및 PINK1 결손초파리(B9)에 G-TPP 용액을 30일간 투여하였고, 이의 도파민성 신경세포 사멸에 대한 영향을 상기 실시예 <3-7>에 기재된 방법으로 평가하였다.
The G-TPP-containing vials prepared by the method described in Example <4-1> were replaced with fresh vials every 3-4 days, and the G-TPP solution was added to the normal Drosophila WT and PINK1-deficient Drosophila B9 for 30 days , And its effect on dopaminergic neuronal cell death was evaluated by the method described in the above Example <3-7>.
G-TPP 용액을 30일간 투여하면 PINK1 결손에 의한 도파민성 신경세포의 사멸이 억제됨을 확인하였다 (도14의 B 및 C).
It was confirmed that administration of G-TPP solution for 30 days inhibited the death of dopaminergic neurons due to PINK1 deficiency (Fig. 14B and Fig. 14C).
<4-3> TRAP1 specific inhibitor 처리 및 미토콘드리아 막전위 측정<4-3> Treatment of TRAP1 specific inhibitor and measurement of mitochondrial membrane potential
정상(PINK1+/+) 및 PINK1 유전자 결손 MEF cell(PINK1-/-)에 도 15에 기재된 조건으로 glucose (4.5g/L) 함유 DMEM, Galactose (4.5g/L) 함유 DMEM, G-TPP, 17-AAG, DMSO를 각실험군 별로 처리하고 16시간 동안 배양하였다. 그리고나서, trypsin을 처리하여 세포를 분리하고, 1 mg/mL JC-1을 함유한 DMEM에 섭씨 37도에서 20분간 incubation 하였다. 이후 red 및 green fluorescence를 EPICS XL cytometer (Beckman Coulter)로 측정한 다음 red fluorescence intensity를 green fluorescence intensity로 나누어 미토콘드리아 막 전위를 측정하였다.
Normal (PINK1 + / +) and PINK1 gene-deficient MEF cell (PINK1 - / -) in the conditions described in Figure 15 on glucose (4.5g / L) containing DMEM, Galactose (4.5g / L) containing DMEM, G-TPP, 17-AAG and DMSO were treated for each test group and cultured for 16 hours. Cells were then treated with trypsin and incubated in DMEM containing 1 mg / mL JC-1 for 20 min at 37 ° C. The red and green fluorescence were measured with an EPICS XL cytometer (Beckman Coulter), and the red fluorescence intensity was divided by the green fluorescence intensity to determine the mitochondrial membrane potential.
그 결과 도 15에서 보는 바와 같이, PINK1 결손 MEF 세포주는 정상 세포주와는 달리 carbon source를 gulcose에서 galactose로 교체하면 미토콘드리아 막전위가 감소하게 되는데, G-TPP를 처리할 경우 감소된 막전위가 증가하였다(도15의 D). 반면에 17-AAG를 처리하였을 경우 감소된 막전위에 별다른 변화가 없었다 (도15의 D).
As shown in FIG. 15, the PINK1-deficient MEF cell line showed a decrease in mitochondrial membrane potential when the carbon source was changed from gulcose to galactose, unlike the normal cell line. G-TPP treatment increased the decreased membrane potential 15 D). On the other hand, when treated with 17-AAG, there was no significant change in reduced membrane potential (Fig. 15D).
상기 실시예<4-1> 내지 <4-3>의 실험결과를 통해 TRAP1 유전자 결손으로 얻어진 실험결과들을 약리학적인 실험기법으로 다시 한 번 확인할 수 있었으며, 파킨슨병과 같은 미토콘드리아 기능이상관련 질환 치료제로 TRAP1 inhibitor를 활용할 수 있는 가능성을 확인하였다.
Experimental results of the examples <4-1> to <4-3> above confirmed the results of the TRAP1 gene deletion by a pharmacological experimental technique, and TRAP1 as a treatment for mitochondrial dysfunction related diseases such as Parkinson's disease inhibitor was used in the study.
본 발명의 스크리닝 방법은 미토콘드리아 기능 장애에 의한 질환의 예방 및 치료 기능을 갖는 물질들을 효과적으로 스크리닝 할 수 있다. 또한 본 발명에서 TRAP1 및 이의 유전자에 대한 억제 기능을 갖는 조성물들은 산화 스트레스에 대한 저항성을 높이고 미토콘드리아 기능 장애를 정상 상태로 회복시키는 효과가 있어 산업상 이용 가능성이 크다.
The screening method of the present invention can effectively screen for substances having the function of preventing and treating diseases caused by mitochondrial dysfunction. In the present invention, compositions having an inhibitory function against TRAP1 and its gene are highly industrially applicable because they increase resistance to oxidative stress and restore mitochondrial dysfunction to a normal state.
<110> Dong-A University Research Foundation For Industry-Academy Cooperation <120> Screening method for therapeutic agent of mitochondria dysfunction using TRAP1 gene <130> NP13-0046 <160> 25 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 704 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human TRAP1 amino acid sequece(NP_057376.2) <400> 1 Met Ala Arg Glu Leu Arg Ala Leu Leu Leu Trp Gly Arg Arg Leu Arg 1 5 10 15 Pro Leu Leu Arg Ala Pro Ala Leu Ala Ala Val Pro Gly Gly Lys Pro 20 25 30 Ile Leu Cys Pro Arg Arg Thr Thr Ala Gln Leu Gly Pro Arg Arg Asn 35 40 45 Pro Ala Trp Ser Leu Gln Ala Gly Arg Leu Phe Ser Thr Gln Thr Ala 50 55 60 Glu Asp Lys Glu Glu Pro Leu His Ser Ile Ile Ser Ser Thr Glu Ser 65 70 75 80 Val Gln Gly Ser Thr Ser Lys His Glu Phe Gln Ala Glu Thr Lys Lys 85 90 95 Leu Leu Asp Ile Val Ala Arg Ser Leu Tyr Ser Glu Lys Glu Val Phe 100 105 110 Ile Arg Glu Leu Ile Ser Asn Ala Ser Asp Ala Leu Glu Lys Leu Arg 115 120 125 His Lys Leu Val Ser Asp Gly Gln Ala Leu Pro Glu Met Glu Ile His 130 135 140 Leu Gln Thr Asn Ala Glu Lys Gly Thr Ile Thr Ile Gln Asp Thr Gly 145 150 155 160 Ile Gly Met Thr Gln Glu Glu Leu Val Ser Asn Leu Gly Thr Ile Ala 165 170 175 Arg Ser Gly Ser Lys Ala Phe Leu Asp Ala Leu Gln Asn Gln Ala Glu 180 185 190 Ala Ser Ser Lys Ile Ile Gly Gln Phe Gly Val Gly Phe Tyr Ser Ala 195 200 205 Phe Met Val Ala Asp Arg Val Glu Val Tyr Ser Arg Ser Ala Ala Pro 210 215 220 Gly Ser Leu Gly Tyr Gln Trp Leu Ser Asp Gly Ser Gly Val Phe Glu 225 230 235 240 Ile Ala Glu Ala Ser Gly Val Arg Thr Gly Thr Lys Ile Ile Ile His 245 250 255 Leu Lys Ser Asp Cys Lys Glu Phe Ser Ser Glu Ala Arg Val Arg Asp 260 265 270 Val Val Thr Lys Tyr Ser Asn Phe Val Ser Phe Pro Leu Tyr Leu Asn 275 280 285 Gly Arg Arg Met Asn Thr Leu Gln Ala Ile Trp Met Met Asp Pro Lys 290 295 300 Asp Val Arg Glu Trp Gln His Glu Glu Phe Tyr Arg Tyr Val Ala Gln 305 310 315 320 Ala His Asp Lys Pro Arg Tyr Thr Leu His Tyr Lys Thr Asp Ala Pro 325 330 335 Leu Asn Ile Arg Ser Ile Phe Tyr Val Pro Asp Met Lys Pro Ser Met 340 345 350 Phe Asp Val Ser Arg Glu Leu Gly Ser Ser Val Ala Leu Tyr Ser Arg 355 360 365 Lys Val Leu Ile Gln Thr Lys Ala Thr Asp Ile Leu Pro Lys Trp Leu 370 375 380 Arg Phe Ile Arg Gly Val Val Asp Ser Glu Asp Ile Pro Leu Asn Leu 385 390 395 400 Ser Arg Glu Leu Leu Gln Glu Ser Ala Leu Ile Arg Lys Leu Arg Asp 405 410 415 Val Leu Gln Gln Arg Leu Ile Lys Phe Phe Ile Asp Gln Ser Lys Lys 420 425 430 Asp Ala Glu Lys Tyr Ala Lys Phe Phe Glu Asp Tyr Gly Leu Phe Met 435 440 445 Arg Glu Gly Ile Val Thr Ala Thr Glu Gln Glu Val Lys Glu Asp Ile 450 455 460 Ala Lys Leu Leu Arg Tyr Glu Ser Ser Ala Leu Pro Ser Gly Gln Leu 465 470 475 480 Thr Ser Leu Ser Glu Tyr Ala Ser Arg Met Arg Ala Gly Thr Arg Asn 485 490 495 Ile Tyr Tyr Leu Cys Ala Pro Asn Arg His Leu Ala Glu His Ser Pro 500 505 510 Tyr Tyr Glu Ala Met Lys Lys Lys Asp Thr Glu Val Leu Phe Cys Phe 515 520 525 Glu Gln Phe Asp Glu Leu Thr Leu Leu His Leu Arg Glu Phe Asp Lys 530 535 540 Lys Lys Leu Ile Ser Val Glu Thr Asp Ile Val Val Asp His Tyr Lys 545 550 555 560 Glu Glu Lys Phe Glu Asp Arg Ser Pro Ala Ala Glu Cys Leu Ser Glu 565 570 575 Lys Glu Thr Glu Glu Leu Met Ala Trp Met Arg Asn Val Leu Gly Ser 580 585 590 Arg Val Thr Asn Val Lys Val Thr Leu Arg Leu Asp Thr His Pro Ala 595 600 605 Met Val Thr Val Leu Glu Met Gly Ala Ala Arg His Phe Leu Arg Met 610 615 620 Gln Gln Leu Ala Lys Thr Gln Glu Glu Arg Ala Gln Leu Leu Gln Pro 625 630 635 640 Thr Leu Glu Ile Asn Pro Arg His Ala Leu Ile Lys Lys Leu Asn Gln 645 650 655 Leu Arg Ala Ser Glu Pro Gly Leu Ala Gln Leu Leu Val Asp Gln Ile 660 665 670 Tyr Glu Asn Ala Met Ile Ala Ala Gly Leu Val Asp Asp Pro Arg Ala 675 680 685 Met Val Gly Arg Leu Asn Glu Leu Leu Val Lys Ala Leu Glu Arg His 690 695 700 <210> 2 <211> 2310 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human TRAP1 cDNA (NM_016292.2) <400> 2 gaggaagccc cgccccgcgc agccccgtcc cgccccttcc catcgtgtac ggtcccgcgt 60 ggctgcgcgc ggcgctctgg gagtacgaca tggcgcgcga gctgcgggcg ctgctgctgt 120 ggggccgccg cctgcggcct ttgctgcggg cgccggcgct ggcggccgtg ccgggaggaa 180 aaccaattct gtgtcctcgg aggaccacag cccagttggg ccccaggcga aacccagcct 240 ggagcttgca ggcaggacga ctgttcagca cgcagaccgc cgaggacaag gaggaacccc 300 tgcactcgat tatcagcagc acagagagcg tgcagggttc cacttccaaa catgagttcc 360 aggccgagac aaagaagctt ttggacattg ttgcccggtc cctgtactca gaaaaagagg 420 tgtttatacg ggagctgatc tccaatgcca gcgatgcctt ggaaaaactg cgtcacaaac 480 tggtgtctga cggccaagca ctgccagaaa tggagattca cttgcagacc aatgccgaga 540 aaggcaccat caccatccag gatactggta tcgggatgac acaggaagag ctggtgtcca 600 acctggggac gattgccaga tcggggtcaa aggccttcct ggatgctctg cagaaccagg 660 ctgaggccag cagcaagatc atcggccagt ttggagtggg tttctactca gctttcatgg 720 tggctgacag agtggaggtc tattcccgct cggcagcccc ggggagcctg ggttaccagt 780 ggctttcaga tggttctgga gtgtttgaaa tcgccgaagc ttcgggagtt agaaccggga 840 caaaaatcat catccacctg aaatccgact gcaaggagtt ttccagcgag gcccgggtgc 900 gagatgtggt aacgaagtac agcaacttcg tcagcttccc cttgtacttg aatggaaggc 960 ggatgaacac cttgcaggcc atctggatga tggaccccaa ggatgtccgt gagtggcaac 1020 atgaggagtt 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cgcacatttt ccgtgacaaa tgaaaagatc cagctgacca 180 gcgattatct aacgaccaaa tcgaatcgaa acgaaacgtt gaagtaggcg cattacatta 240 aaaattggct gccagcccac acagatatcg aaaaaggcga tatatctttg gataatcatt 300 gcaaaaataa accctttcga ttcgacgatt tcgccttgta gttctgccac caccgccccc 360 acacttcgcc ccgcagctgc accacaacca ccaccaccca caaacagaaa atttatttgc 420 gacgcaaaaa caaaacaatc gaatcgaaac gaaccgaacc gaaacgaaac gacagcagct 480 gtttggttat aaatcggcgc tatcgatcgc acacatgagc aaaattggcg gagaagaaga 540 ggaagcagca gcaagagtta agcaccacaa atcttaaaga ataggcacta ggagccgagg 600 tctttgcggg ccgaaagatg tctgtgagac tgctgaccgt gcgactgatc aaacatggtc 660 gctacatttt gcgcagctat tgtaaacgtg atatacacgc caacattttg gaccagaatc 720 aattgaagac aagaagcaag cgaggctttc ccctaccctc caccgctgcc aatgtgctgc 780 ggacaacgcc ccagcaggcg gccaaatcgg tggtcaatgt agtgccccgc accatcaact 840 ccccgtcggg atcaccgttt aatggcagcg gcagtagccc caccagcagc agtggaatct 900 tccgagtggg ccagcatgcg cgcaaattgt tcatcgacaa catcctcagc cgggtgacca 960 ccacctactc ggaggatctg cgccagcgcg 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ggttaccagt 780 ggctttcaga tggttctgga gtgtttgaaa tcgccgaagc ttcgggagtt agaaccggga 840 caaaaatcat catccacctg aaatccgact gcaaggagtt ttccagcgag gcccgggtgc 900 gagatgtggt aacgaagtac agcaacttcg tcagcttccc cttgtacttg aatggaaggc 960 ggatgaacac cttgcaggcc atctggatga tggaccccaa ggatgtccgt gagtggcaac 1020 gccccgctac ataagacgga cgcaccgctc aacatccgca gcatcttcta cgtgcccgac atgaaaccgt 1140 ccatgtttga tgtgagccgg gagctgggct ccagcgttgc actgtacagc cgcaaagtcc 1200 tcatccagac caaggccacg gacatcctgc ccaagtggct gcgcttcatc cgaggtgtgg 1260 tggacagtga ggacattccc ctgaacctca gccgggagct gctgcaggag agcgcactca 1320 tcaggaaact ccgggacgtt ttacagcaga ggctgatcaa attcttcatt gaccagagta 1380 aaaaagatgc tgagaagtat gcaaagtttt ttgaagatta cggcctgttc atgcgggagg 1440 gcattgtgac cgccaccgag caggaggtca aggaggacat agcaaagctg ctgcgctacg 1500 agtcctcggc gctgccctcc gggcagctaa ccagcctctc agaatacgcc agccgcatgc 1560 gggccggcac ccgcaacatc tactacctgt gcgcccccaa ccgtcacctg gcagagcact 1620 caccctacta tgaggccatg aagaagaaag acacagaggt tctcttctgc tttgagcagt 1680 ttgatgagct caccctgctg caccttcgtg agtttgacaa gaagaagctg atctctgtgg 1740 agacggacat agtcgtggat cactacaagg aggagaagtt tgaggacagg tccccagccg 1800 ccgagtgcct atcagagaag gagacggagg agctcatggc ctggatgaga aatgtgctgg 1860 ggtcgcgtgt caccaacgtg aaggtgaccc tccgactgga cacccaccct gccatggtca 1920 ccgtgctgga gatgggggct gcccgccact tcctgcgcat gcagcagctg gccaagaccc 1980 aggaggagcg cgcacagctc ctgcagccca cgctggagat caaccccagg cacgcgctca 2040 tcaagaagct gaatcagctg cgcgcaagcg agcctggcct ggctcagctg ctggtggatc 2100 agatatacga gaacgccatg attgctgctg gacttgttga cgaccctagg gccatggtgg 2160 gccgcttgaa tgagctgctt gtcaaggccc tggagcgaca ctgacagcca gggggccaga 2220 aggactgaca ccacagatga cagccccacc tccttgagct ttatttacct aaatttaaag 2280 gtatttctta acccgaaaaa aaaaaaaaaa 2310 <210> 3 <211> 691 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Drosophila TRAP1 amino acid sequence (NP_477439.2) <400> 3 Met Ser Val Arg Ala Met Gly Val Leu Gly Gln Ala Cys Arg Leu Gly 1 5 10 15 Arg Cys Ala Gln Val Leu Arg Gln Ser 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gctccagaac agcagcctga ttcgcaaact gtccagtgtg atttccaccc 1500 gcgttatccg tttcctgcaa gagcggtcca agaagcagcc agaagagtac gaggccttct 1560 accgggacta tgggcttttc ctgaaggaag gaattgtaac ctccagcgac gcctccgaga 1620 aagaagaaat agctaaactt ctgcgttttg aatcctccaa gtcggagacc gccagtgggc 1680 gcatgtcgct ggaggagtac tacaacgccg ttcccgcaga acagcagaat atttactact 1740 tggcagcacc caaccgcgtt cttgccgagt cctcgcccta ctacgagagt ctgaagaagc 1800 gcaacgagct ggtgctcttc tgctacgaac cctatgatga gctggtgctc atgcagctgg 1860 gcaagttcaa aagcaaaaaa ctcgtttccg tggagaagga gatgcgcgaa gagtccaagg 1920 agacaacagc gaccaccgac tttggcgagg gcagtctgct gcgctcagag ctcgacactt 1980 tgattccctg gctggaggag gagctcaggg ggcaggttat taaagtaaaa gccaccactc 2040 gtctagacac ccatccctgt gtaatcaccg tagaggaaat ggctgccgct cgccacttca 2100 ttcgcaccca gagtcaccag gtgccagaac agaatcgatt tgccctgctt caaccagaac 2160 tggagatcaa cccaaagcac cccatcatca agaagcttaa caagctccgt gagagcgaca 2220 aggatctggc ccaacttatc gccaagcagc tctttgcaaa cgcaatggtg ggcgccggtt 2280 tggctgagga 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gaggccagca agagaccatc tgcccgagta gccgcaaatg tgcttcatct 1620 aagcctctgg ggtgaacata ttctagccct gaagaatctg aagttagaca agatggttgg 1680 ctggctcctc caacaatcgg ccgccacttt gttggccaac aggctcacag agaagtgttg 1740 tgtggaaaca aaaatgaaga tgctctttct ggctaacctg gagtgtgaaa cgctctgcca 1800 ggcagccctc ctcctctgct catggagggc agccctgtga tgtccctgca tggagctggt 1860 gaattactaa aagaacatgg catcctctgt gtcgtgatgg tctgtgaatg gtgagggtgg 1920 gagtcaggag acaagacagc gcagagaggg ctggttagcc ggaaaaggcc tcgggcttgg 1980 caaatggaag aacttgagtg agagttcagt ctgcagtcct ctgctcacag acatctgaaa 2040 agtgaatggc caagctggtc tagtagatga ggctggactg aggaggggta ggcctgcatc 2100 cacagagagg atccaggcca aggcactggc tgtcagtggc agagtttggc tgtgaccttt 2160 gcccctaaca cgaggaactc gtttgaaggg ggcagcgtag catgtctgat ttgccacctg 2220 gatgaaggca gacatcaaca tgggtcagca cgttcagtta cgggagtggg aaattacatg 2280 aggcctgggc ctctgcgttc ccaagctgtg cgttctggac cagctactga attattaatc 2340 tcacttagcg aaagtgacgg atgagcagta agtaagtaag tgtggggatt taaacttgag 2400 ggtttccctc ctgactagcc tctcttacag gaattgtgaa atattaaatg caaatttaca 2460 actgcagatg acgtatgtgc cttgaactga atatttggct ttaagaatga ttcttatact 2520 ctgaaggtga gaatattttg tgggcaggta tcaacattgg ggaagagatt tcatgtctaa 2580 ctaactaact ttatacatga tttttaggaa gctattgcct aaatcagcgt caacatgcag 2640 taaaggttgt cttcaactga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2680 <210> 7 <211> 721 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Drosophila PINK1 amino acid sequence (NP_572340.2) <400> 7 Met Ser Val Arg Leu Leu Thr Val Arg Leu Ile Lys His Gly Arg Tyr 1 5 10 15 Ile Leu Arg Ser Tyr Cys Lys Arg Asp Ile His Ala Asn Ile Leu Asp 20 25 30 Gln Asn Gln Leu Lys Thr Arg Ser Lys Arg Gly Phe Pro Leu Pro Ser 35 40 45 Thr Ala Asn Val Leu Arg Thr Thr Pro Gln Gln Ala Ala Lys Ser 50 55 60 Val Val Asn Val Val Pro Arg Thr Ile Asn Ser Pro Ser Gly Ser Pro 65 70 75 80 Phe Asn Gly Ser Gly Ser Ser Pro Thr Ser Ser Gly Ile Phe Arg 85 90 95 Val Gly Gln His Ala Arg Lys Leu Phe Ile Asp Asn Ile Leu Ser Arg 100 105 110 Val Thr Thr Thyr Ser Glu Asp Leu Arg Gln 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Gly Pro Phe Ala 530 535 540 Val Leu Asn Tyr Gly Lys Ala Asp Leu Trp Ala Cys Gly Ala Leu Ala 545 550 555 560 Tyr Glu Ile Phe Gly Asn Arg Asn Pro Phe Tyr Ser Ser Ser Gly Gly 565 570 575 Met Ala Arg Glu Arg Gly Glu Met Thr Leu Ser Leu Arg Asn Ser Asp 580 585 590 Tyr Arg Gln Asp Gln Leu Pro Pro Met Ser Asp Ala Cys Pro Pro Leu 595 600 605 Leu Gln Gln Leu Val Tyr Asn Ile Leu Asn Pro Asn Pro Ser Lys Arg 610 615 620 Val Ser Pro Asp Ile Ala Ala Asn Val Val Gln Leu Phe Leu Trp Ala 625 630 635 640 Pro Ser Asn Trp Leu Lys Ala Gly Gly Met Pro Asn Ser Pro Glu Ile 645 650 655 Leu Gln Trp Leu Leu Ser Leu Thr Thr Lys Ile Met Cys Glu Gly Arg 660 665 670 Pro Gln Met Gly Ala Gly Leu Met Pro Val Ala Ser Cys Gly Asn Arg 675 680 685 Arg Ala Tyr Val Glu Tyr Leu Leu Ile Cys Ser Phe Leu Ala Arg Ala 690 695 700 Arg Leu Arg Arg Ile Arg Gly Ala Leu Asn Trp Ile Gln Asn Val Val 705 710 715 720 Ala <210> 8 <211> 2884 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Drosophila PINK1 cDNA (NM_132112.4) <400> 8 tataccgtaa gtgtggtcac actaacgcct tgctgtttct aaattattcc gttgttttta 60 tcgtaaattc ttgcacactt agctattatt ttatagcgaa atataagcaa agcaagcttt 120 taaacaagtg tttattgcgg cgcacatttt ccgtgacaaa tgaaaagatc cagctgacca 180 gcgattatct aacgaccaaa tcgaatcgaa acgaaacgtt gaagtaggcg cattacatta 240 aaaattggct gccagcccac acagatatcg aaaaaggcga tatatctttg gataatcatt 300 gcaaaaataa accctttcga ttcgacgatt tcgccttgta gttctgccac caccgccccc 360 acacttcgcc ccgcagctgc accacaacca ccaccaccca caaacagaaa atttatttgc 420 gacgcaaaaa caaaacaatc gaatcgaaac gaaccgaacc gaaacgaaac gacagcagct 480 gtttggttat aaatcggcgc tatcgatcgc acacatgagc aaaattggcg gagaagaaga 540 ggaagcagca gcaagagtta agcaccacaa atcttaaaga ataggcacta ggagccgagg 600 tctttgcggg ccgaaagatg tctgtgagac tgctgaccgt gcgactgatc aaacatggtc 660 gctacatttt gcgcagctat tgtaaacgtg atatacacgc caacattttg gaccagaatc 720 aattagagac aagaagcaag cgaggctttc ccctaccctc caccgctgcc aatgtgctgc 780 ggacaacgcc ccagcaggcg gccaaatcgg tggtcaatgt agtgccccgc accatcaact 840 ccccgtcggg atcaccgttt aatggcagcg gcagtagccc caccagcagc agtggaatct 900 tccgagtggg ccagcatgcg cgcaaattgt tcatcgacaa catcctcagc cgggtgacca 960 ccacctactc ggaggatctg cgccagcgcg ctacccgcaa gctattcttt ggcgattcag 1020 cgcccttctt cgccctgatt ggcgttagtc tggcctccgg atcgggtgtg ctcagcaagg 1080 aggatgaact ggagggcgtg tgctgggaga ttcgggaggc agctagccgg ctgcagaacg 1140 cctggaatca cgacgagatc tccgatacgc tagacagcaa gttcaccatc gatgacttgg 1200 aaatcggtcc gcccatagcc aaaggttgtg ccgctgtcgt ctatgcagcg gatttcaaga 1260 aagatgttgc ctcggatggt gcatccctgc ataccgatgc gcagccgcag gcaacgccag 1320 cctttgcgcc gaatagctgg agtacccacg agatgatgtc gccgctgcag aacatgtcgc 1380 gctttgttca caactttggc ggctctgtgg acaacgtctt ccactacagc cagccatctg 1440 cggccagtga tttcgtgggc gcccagtcga gggaacagga ccagcggcac cacgagcaac 1500 agcagcatca gaatcaggaa caagagcagc atcagaacca ggagcccagc agcagtgcct 1560 tcaatgtgac ttctccagcg aattcaaaca tcaacagctc tgtggacagt tatccactgg 1620 cactcaaaat gatgttcaac tacgacatcc agagcaacgc tctgtccata ctgcgtgcca 1680 tgtacaagga gacggtaccg gcacgccagc gcggcatgaa tgaggccgcc gatgagtggg 1740 aacgtttgct gcagaatcaa actgttcacc tgccgcggca tccgaacatt gtctgtatgt 1800 ttggcttctt ttgcgacgag gtgcgcaact ttcccgatgg ccatctcctg tatccggtgg 1860 cgcagccgca acgcatcaat ccacagggct atggccgcaa tatgtcgctg tatctgctga 1920 tgaaacgcta cgatcacagt cttcgcggcc tgctcgatag ccaggatctg agcacgcgca 1980 atcgcatcct gctgctggct caaatgctcg aggctgtcaa ccatttgagc cgtcacggcg 2040 ttgcccatcg tgacctaaag tctgataatg tgctaatcga gctgcaggac gatgcggcgc 2100 cggtgctagt gctctccgac tttggctgtt gtctggcgga caaggtgcat ggcctgcgcc 2160 tgccgtacgt ttcgcacgac gtcgacaagg gcggcaatgc ggcgttgatg gcgccagaga 2220 tcttcaatac gatgcccggt ccgtttgccg tactcaatta tggcaaggcc gatctgtggg 2280 cttgcggtgc cctggcttac gaaatctttg gcaaccgcaa tccgttctat tcgagcagcg 2340 gtgggatggc gcgcgaacgc ggtgagatga cgctttcgct gaggaacagc gattaccgac 2400 aggaccaatt gccgccaatg agcgatgctt gcccgccgct gctgcaacag ctggtctaca 2460 acatcctcaa tcccaacccg tccaagcggg tcagtccgga tattgcggca aatgtggtgc 2520 agctgttcct ctgggcccca tccaattggc ttaaggcggg cggcatgccc aacagtccgg 2580 agatcctaca gtggctcctt tcgctgacca ctaagattat gtgcgagggt cgtccacaga 2640 tgggcgccgg attgatgcca gtggccagct gtggcaatag gcgcgcctat gtggagtacc 2700 tgctcatatg cagctttctg gcacgcgccc ggctgcgtcg cattcgcggc gccctcaact 2760 ggatccagaa tgtggtggcg taggagaaaa gccttctact tgttactctg agaaaatcaa 2820 atggaaaagc gtgtgatacc tatattttac atatgtattt ataaatgaaa tcaaaattaa 2880 cgcc 2884 <210> 9 <211> 699 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAP1 recombinant protein amino acid sequence <400> 9 Met Ser Val Arg Ala Met Gly Val Leu Gly Gln Ala Cys Arg Leu Gly 1 5 10 15 Arg Cys Ala Gln Val Leu Arg Gln Ser His Arg Ser Ala Pro Ala Ala 20 25 30 Phe Asn Ile Thr Ile Gly Ser Gln His Ser Pro Gly Ala Leu Ser Leu 35 40 45 Arg Arg Tyr Ser Thr Glu Thr Lys Gln Ala Ser Gly Ser Val Val Asp 50 55 60 Lys His Glu Phe Gln Ala Glu Thr Arg Gln Leu Leu Asp Ile Val Ala 65 70 75 80 Arg Ser Leu Tyr Ser Asp His Glu Val Phe Val Arg Glu Leu Ile Ser 85 90 95 Asn Ala Ser Asp Ala Leu Glu Lys Phe Arg Tyr Thr Ser Leu Ser Ala 100 105 110 Gly Gly Glu Asn Leu Ala Gly Lys Asp Arg Pro Leu Glu Ile Arg Ile 115 120 125 Thr Thr Asp Lys Pro Leu Met Gln Leu Ile Ile Gln Asp Thr Gly Ile 130 135 140 Gly Met Thr Lys Glu Glu Leu Val Ser Asn Leu Gly Thr Ile Ala Arg 145 150 155 160 Ser Gly Ser Lys Lys Phe Leu Glu Gln Met Lys Gly Thr Gln Gln Gly 165 170 175 Ala Ser Ser Glu Ala Ser Ser Asn Ile Ile Gly Gln Phe Gly Val Gly 180 185 190 Phe Tyr Ser Ser Phe Ile Val Ala Asn Lys Val Glu Val Phe Thr Arg 195 200 205 Ala Ala Val Pro Asn Ala Pro Gly Leu Arg Trp Ser Thr Asp Gly Ser 210 215 220 Gly Thr Tyr Glu Ile Glu Glu Val Pro Asp Val Glu Leu Gly Thr Arg 225 230 235 240 Ile Val Leu His Leu Lys Thr Asp Cys Arg Glu Tyr Ala Asp Glu Glu 245 250 255 Arg Ile Lys Ala Val Ile Lys Lys Tyr Ser Asn Phe Val Gly Ser Pro 260 265 270 Ile Leu Leu Asn Gly Lys Gln Ala Asn Glu Ile Lys Pro Leu Trp Leu 275 280 285 Leu Glu Pro Gln Ser Ile Ser Lys Glu Gln His His Asp Phe Tyr Arg 290 295 300 Phe Ile Ser Asn Ser Phe Asp Val Pro Arg Phe Thr Leu His Tyr Asn 305 310 315 320 Ala Asp Val Pro Leu Ser Ile His Ala Leu Leu Tyr Phe Pro Glu Gly 325 330 335 Lys Pro Gly Leu Phe Glu Met Ser Arg Asp Gly Asn Thr Gly Val Ala 340 345 350 Leu Tyr Thr Arg Lys Val Leu Ile Gln Ser Lys Thr Glu His Leu Leu 355 360 365 Pro Lys Trp Leu Arg Phe Val Lys Gly Val Val Asp Ser Glu Asp Ile 370 375 380 Pro Leu Asn Leu Ser Arg Glu Leu Leu Gln Asn Ser Ser Leu Ile Arg 385 390 395 400 Lys Leu Ser Ser Val Ile Ser Thr Arg Val Ile Arg Phe Leu Gln Glu 405 410 415 Arg Ser Lys Gln Pro Glu Glu Tyr Glu Ala Phe Tyr Arg Asp Tyr 420 425 430 Gly Leu Phe Leu Lys Glu Gly Ile Val Thr Ser Ser Asp Ala Ser Glu 435 440 445 Lys Glu Glu Ile Ala Lys Leu Leu Arg Phe Glu Ser Ser Lys Ser Glu 450 455 460 Thr Ala Ser Gly Arg Met Ser Leu Glu Glu Tyr Tyr Asn Ala Val Pro 465 470 475 480 Ala Glu Gln Gln Asn Ile Tyr Tyr Leu Ala Ala Pro Asn Arg Val Leu 485 490 495 Ala Glu Ser Ser Pro Tyr Tyr Glu Ser Leu Lys Lys Arg Asn Glu Leu 500 505 510 Val Leu Phe Cys Tyr Glu Pro Tyr Asp Glu Leu Val Leu Met Gln Leu 515 520 525 Gly Lys Phe Lys Ser Lys Lys Leu Val Ser Val Glu Lys Glu Met Arg 530 535 540 Glu Glu Ser Lys Glu Thr Thr Ala Thr Thr Asp Phe Gly Glu Gly Ser 545 550 555 560 Leu Leu Arg Ser Glu Leu Asp Thr Leu Ile Pro Trp Leu Glu Glu Glu 565 570 575 Leu Arg Gly Gln Val Ile Lys Val Lys Ala Thr Thr Arg Leu Asp Thr 580 585 590 His Pro Cys Val Ile Thr Val Glu Glu Met Ala Ala Ala Arg His Phe 595 600 605 Ile Arg Thr Gln Ser His Gln Val Pro Glu Gln Asn Arg Phe Ala Leu 610 615 620 Leu Gln Pro Glu Leu Glu Ile Asn Pro Lys His Pro Ile Ile Lys Lys 625 630 635 640 Leu Asn Lys Leu Arg Glu Ser Asp Lys Asp Leu Ala Gln Leu Ile Ala 645 650 655 Lys Gln Leu Phe Ala Asn Ala Met Val Gly Ala Gly Leu Ala Glu Asp 660 665 670 Pro Arg Met Leu Leu Thr Asn Met Asn Thr Leu Leu Ser Arg Ala Leu 675 680 685 Glu Lys Tyr Leu Gly His His His His His 690 695 <210> 10 <211> 346 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence for expressing TRAP1 specific RNAi <400> 10 ccgacttgga ggattcaaaa cgcagaagtt tagctatttc ttctttctcg gaggcgtcgc 60 tggaggttac aattccttcc ttcaggaaaa gcccatagtc ccggtagaag gcctcgtact 120 cttctggctg cttcttggac cgctcttgca ggaaacggat aacgcgggtg gaaatcacac 180 tggacagttt gcgaatcagg ctgctgttct ggagcagctc gcgactcagg ttgagtggaa 240 tgtcctcaga gtcgacaaca ccctttacaa aacgcagcca cttgggcagc agatgctcag 300 tcttggactg aataagcacc ttgcgggtgt aaagagccac accggt 346 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antennapedia (ANT0) <400> 11 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> survivin-derived peptide inhibiting activity of Hsp90 (or TRAP1) <400> 12 Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu 1 5 <210> 13 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Shepherdin amino acid sequence <400> 13 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu 20 25 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAP1-Forward primer <400> 14 gcagcgttca atatcaccat tg 22 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAP1-Reverse primer <400> 15 gacctcgtgg tcggagtcta agg 23 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vha16-1-Forward primer <400> 16 gtcttctgaa gtgagcagcg ac 22 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vha16-1-Reverse primer <400> 17 catcactgac atggcagcaa tacc 24 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX I-Forward primer <400> 18 gtgcctttaa tattaggtgc tc 22 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX I-Reverse primer <400> 19 gtaatagctc ctgctagtac tg 22 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX III-Forward primer <400> 20 cgagatgtat cacgagaagg 20 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX III-Reverse primer <400> 21 gaattccgtg gaatcctgtt g 21 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CytB-Forward primer <400> 22 cgaactttac atgctaacgg tg 22 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CytB-Reverse primer <400> 23 ccgataggat tattagatcc tg 22 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rp49-Forward primer <400> 24 gcttcaagat gaccatccgc cc 22 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rp49-Reverse primer <400> 25 ggtgcgcttg ttcgatccgt aac 23
Claims (12)
(b) 상기 시험제제와 함께 배양된 세포에서 TRAP1의 발현 정도를 측정하고, 시험제제 없이 배양된 세포에서 TRAP1의 발현 정도와 비교하여 상기 시험제제가 TRAP1의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약제의 스크리닝 방법.
(a) culturing cells expressing tumor necrosis factor receptor-associated protein 1 (TRAP1) with or without a test agent; And
(b) measuring the level of expression of TRAP1 in the cells incubated with the test agent, comparing the expression level of TRAP1 with the cells cultured without the test agent, and confirming whether the test agent inhibits the expression of TRAP1 A method for screening a medicament for preventing or treating a disease caused by mitochondrial dysfunction.
(c) 상기 (b) 단계에서 TRAP1의 발현을 억제하는 것으로 확인된 시험제제를 미토콘드리아 기능장애로 인한 질환을 가지고 있는 동물에 투여하여 치료효과를 나타내는지를 검사하는 단계를 추가적으로 포함하는 스크리닝 방법.
The method according to claim 1, wherein after step (b)
(c) inspecting whether the test agent confirmed to inhibit the expression of TRAP1 in step (b) is administered to an animal having a disease caused by mitochondrial dysfunction to show a therapeutic effect.
3. The screening method according to claim 1 or 2, wherein the disease caused by the mitochondrial dysfunction is a disease due to a mitochondrial dysfunction caused by a PINK1 gene deletion.
3. The method of claim 1 or 2, wherein the mitochondrial dysfunction is selected from the group consisting of mitochondrial enzyme activity reduction, electron transport chain activity reduction, membrane potential reduction, increase of reactive oxygen species production, mitochondrial fragmentation fragmentation, calcium regulation disorder, and mutation of mitochondrial DNA < RTI ID = 0.0 > (mtDNA). < / RTI >
The method according to claim 1 or 2, wherein the disease caused by the mitochondrial dysfunction is selected from the group consisting of degenerative brain diseases, NARP syndrome, Multiple Sclerosis-like Syndrome, Maternally Inherited CardioMyopathy, Progressive External Ophthalmoplegia, Myoclonic Epilepsy with Ragged-Red Fibers Syndrome, Myoneurogastrointestinal disorder and encephalopathy, Pearson Marrow syndrome, Kearns-Sayre syndrome, Leber hereditary optic neuropathy, aminoglycoside-associated deafness, diabetes with deafness, Luft disease, Syndrome (Leigh syndrome), Alpers Disease, medium chain acyl-CoA dehydrogenase (SCAD) deficiency, short chain 3-hydroxyacyl CoA dehydrogenase (SCHAD) deficiency, and short-chain acylase deficiency (VLCAD) deficiency, long chain 3-hydroxy acyl-CoA dehydrogenase (LCHAD) deficiency, glutaric aciduria type II Glutaric aciduria II), and lethal infantile cardiomyopathy.
6. The screening method according to claim 5, wherein the degenerative brain disease is one selected from the group consisting of Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Huntington's disease, and dementia. .
A composition for preventing and treating diseases caused by mitochondrial dysfunction, which comprises as an active ingredient any one selected from the group consisting of antisense RNA, siRNA and miRNA against the TRAP1 gene.
A composition for preventing and treating diseases caused by mitochondrial dysfunction comprising an antibody specific for TRAP1 as an active ingredient.
A composition for preventing and treating diseases caused by mitochondrial dysfunction comprising TRAP1 inhibitor (TRAP1 inhibitor) as an active ingredient.
10. The method according to claim 9, wherein the TRAP1 inhibitory substance is geldanamycin conjugated with gamitrinib or an antigen-pediatric cell-penetrating sequence (ANT), for the prevention and treatment of diseases caused by mitochondrial dysfunction Composition.
The composition for preventing and treating diseases caused by mitochondrial dysfunction according to claim 9, wherein the TRAP1 inhibitor is Shepherdin (SEQ ID NO: 13).
(b) 상기 TRAP1의 활성을 측정하여, 상기 시험제제가 TRAP1의 활성을 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 미토콘드리아 기능 장애로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약제의 스크리닝 방법.(a) culturing TRAP1 or a cell expressing said TRAP1 and a test agent; And
(b) measuring the activity of said TRAP1, and confirming whether said test agent inhibits the activity of TRAP1; and screening for a drug for preventing or treating diseases caused by mitochondrial dysfunction.
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