KR20160057280A - 단일세포 분리장치 및 방법 - Google Patents

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    • G01N2015/1024—
    • G01N2015/1029—

Abstract

본 발명은 미세유체 칩의 구조를 이용하여 채널을 통과하는 단일세포의 개수를 측정하고, 측정결과를 기반으로 단일세포를 분리시켜 유체 방울 속에 인입시켜 외부로 배출시키는 단일세포 분리장치 및 방법에 관한 것으로, 상부 패널과 하부 패널로 구성되고, 상부 패널과 하부 패널 사이에 단일세포를 포함하는 시료를 이송시키기 위한 유로가 형성된 유체 채널; 유체 채널에 일정 간격 이격된 상태로 구비되며, 유체 채널의 유로를 통해 이송되는 시료에 전기적 신호를 인가하는 제 1, 제 2 전극과, 제 1 전극 및 제 2 전극 사이에 구비되며, 유로를 통해 이송되는 시료 내의 단일세포를 감지하는 감지전극으로 이루어져, 유로를 통해 이송되는 시료에 전기적 신호를 인가시키고, 전기적 신호가 인가된 시료의 전기적 신호를 감지하여 시료 내에 단일세포가 존재하는지의 여부를 감지하는 단일세포 측정부; 및 감지전극에 의해 단일세포가 감지되는 경우 단일세포 분리제어신호를 출력하는 단일세포 분리제어장치를 포함한다. 이에 따라 짧은 시간 내에 효과적으로 단일세포를 포함하는 시료로부터 단일세포를 분리해 낼 수 있도록 하는 효과가 있다.

Description

단일세포 분리장치 및 방법{Apparatus and method for separating single cell}
본 발명은 단일세포 분리장치 및 방법에 관한 것으로, 특히 미세유체 칩의 구조를 이용하여 채널을 통과하는 단일세포의 개수를 측정하고, 측정결과를 기반으로 단일세포를 유체 방울 속에 인입시켜 외부로 배출시키는 단일세포 분리장치 및 방법에 관한 것이다.
세포는 다양하고 복잡한 단백질-단백질 상호작용을 통하여 유전자 표현, 세포성장, 세포 주기, 대사, 신호전달 등의 여러 생물학적 기능을 수행함으로써 생명현상을 유지하고 있다.
대부분의 생물학 연구에 사용되는 세포군 대상 연구방법론의 경우 세포군 내의 개별 세포가 균일한 세포반응을 일으킨다는 가정하에 데이터의 분석이 이루어 진다. 하지만, 실제로 개별세포가 균일한 반응을 일으키지 않을 경우, 평균 측정값에 기반을 둔 결과분석은 오류를 초래할 수 있다. 실제 개별세포가 균일한 반응을 일으키는 지의 여부는 여러 기술적인 문제로 인해 실험적으로 증명된 경우가 지극히 미미하여 단일 세포 분석을 위한 기술 개발이 필수적이다.
기존의 단일 세포 분석을 위해 마이크로 어레이를 이용하는 방법에는 세포의 크기와 비슷한 크기의 구멍을 뚫어 그 안에 단일 세포가 들어가도록 하는 방법과 유전체 전기영동(dielectrophoresis)을 이용하여 단일 세포를 특정 위치에 잡아두는 방법이 있었다. 유전체 전기영동의 경우 인가되는 전압을 끊게 되면, 세포가 원하지 않은 다른 위치로 이동하는 문제점이 있다.
또한, 단일 세포의 유전 특성을 측정하기 위하여 전기회전이라는 방법이 있는데, 이는 n 개의 전극에 360/n씩 위상 차이가 있는 회전 교류 신호를 인가하여 회전율을 측정하고 single-shell dielectric model을 기반으로 하는 세포의 회전속도 분광 이론 결과와 비교분석함으로써 세포의 유전 특성을 도출하는 방법이다.
종래 이와 같이 세포의 회전 속도 분광을 측정하기 위해서 바닥기판에crisscross 형태를 이루고 있는 네 개의 전극을 형성하고, 이의 중앙에 측정하고자하는 세포를 위치시킨 후 각 전극에 90의 위상차를 가지는 세포 회전을 위한 ROT 신호를 인가하였다. 이러한 방법은 세포의 회전 속도 분광 측정전에 네개의 전극에 nDEP force를 발생시킴으로써 세포를 전극의 중앙에 위치시켰다.
그러나, 종래 방법은 세포의 회전 속도 분광 측정도중 전극의 중앙인 측정 영역으로 원하지 않는 세포들이 유입됨으로써 세포들간 간섭이 발생할 수 있고, 세포가 회전하는 동안 세포 멤브레인과 바닥 기판과의 마찰이 발생하는 문제가 있었으며, 또한, 전기 회전에 있어서 회전 교류 신호의 주파수를 증가시키면, 세포에 양의 유전영동력, 즉, 전극쪽으로의 힘이 발생하여 전극에 달라붙게 되고, 결과적으로 정확한 회전 속도 분광 측정이 어렵다는 문제점이 있었다.
한국 공개특허 제 10-2014-0078189 호 미국 공개특허 제 2014-00231315 호 한국 공개특허 제 10-2012-0041870 호 일본 등록특허 제 4420900 호
이와 같은 문제점을 해소시키기 위해 본 발명은 미세유체 칩의 구조를 이용하여 채널을 통과하는 단일세포의 개수를 측정하고, 측정결과를 기반으로 단일세포를 유체 방울 속에 인입시켜 외부로 배출시키는 단일세포 분리장치 및 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 전기측정부와 분리부 사이에 완충부를 구비시켜 단일세포를 포함하는 시료로부터 단일세포를 분리할 때 이용되는 압력으로 인해 발생한 역류(backflow) 현상이 발생하지 않도록 하는 단일세포 분리장치 및 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 이종세포와 원하는 세포인 단일세포를 분리시켜 배출되도록 하고, 배출된 단일세포는 복수개의 공간으로 이루어진 웰 플레이트의 각 공간에 독립적으로 분리되어 보관되도록 하는 단일세포 분리장치 및 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 실시예에 따른 단일세포 분리장치는 상부 패널과 하부 패널로 구성되고, 상부 패널과 하부 패널 사이에 단일세포를 포함하는 시료를 이송시키기 위한 유로가 형성된 유체 채널; 유체 채널에 일정 간격 이격된 상태로 구비되며, 유체 채널의 유로를 통해 이송되는 시료에 전기적 신호를 인가하는 제 1, 제 2 전극과, 제 1 전극 및 제 2 전극 사이에 구비되며, 상기 유로를 통해 이송되는 시료 내의 단일세포를 감지하는 감지전극으로 이루어져, 유로를 통해 이송되는 시료에 전기적 신호를 인가시키고, 전기적 신호가 인가된 시료의 전기적 신호를 감지하여 시료 내에 단일세포가 존재하는지의 여부를 감지하는 단일세포 측정부; 및 감지전극에 의해 단일세포가 감지되는 경우 단일세포 분리제어신호를 출력하는 단일세포 분리제어장치를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 단일세포 분리장치는 상부 패널과 하부 패널로 구성되고, 상부 패널과 하부 패널 사이에 단일세포를 포함하는 시료를 이송시키기 위한 유로가 형성된 유체 채널; 유체 채널로 광을 방출시키는 광학측정센서로 이루어지며, 광학측정센서가, 단일세포가 포함된 샘플에 의해 반사되는 광을 수신받아 전기적 신호로 변환시켜 단일세포 감지신호로 출력하는 단일세포 측정부; 및 광학측정센서로부터 출력되는 전기적신호를 이용하여 상기 단일세포를 포함하는 시료의 유체 채널 통과속도를 도출하고, 샘플의 통과속도를 기반으로 상기 단일세포 분리제어신호를 출력하는 단일세포 분리제어장치를 포함할 수 있다.
본 발명의 또다른 실시예에 따른 단일세포 분리장치는 상부 패널과 하부 패널로 구성되고, 상부 패널과 하부 패널 사이에 단일세포를 포함하는 시료를 이송시키기 위한 유로가 형성된 유체 채널; 유체 채널로 자기장을 인가시키는 홀센서로 이루어지며, 홀센서가, 상기 자기장에 의해 발생된 전압을 감지하여 출력하는 단일세포 측정부; 및 홀센서에 의해 감지된 전압을 입력받아 단일세포를 포함하는 샘플의 유체 채널 통과속도를 도출하고, 샘플의 통과속도를 기반으로 단일세포 분리제어신호를 출력하는 단일세포 분리제어장치를 포함할 수 있다. 분리장치.
본 발명과 관련된 실시예로서, 제 1 전극 및 제 2 전극이, 유체 채널의 상부 패널 또는 하부 패널 또는 상하부 패널 상에 구비될 수 있다.
본 발명과 관련된 실시예로서, 단일세포 분리제어장치가, 감지전극으로부터 입력되는 전기적 신호를 기반으로 유로를 통과하는 단일세포의 개수를 카운트하여 제공할 수 있다.
본 발명과 관련된 실시예로서, 단일세포 분리제어장치의 세포분리 제어신호에 응하여 유체를 공급하여 세포 배출구로 이송되는 단일세포와 결합시킨 후 단일세포 배출구를 통해 배출시키는 단일세포 분리부를 더 포함할 수 있다.
본 발명과 관련된 실시예로서, 단일세포 분리제어장치의 단일세포 분리제어신호에 의해 작동되어 단일세포 분리부에 의해 분리된 단일세포와 결합되는 유체를 공급하는 유체 공급부를 더 포함할 수 있다.
본 발명과 관련된 실시예로서, 단일세포 분리부가, 단일세포와 결합되는 유체를 에어압을 이용하여 공급할 수 있다.
본 발명과 관련된 실시예로서, 단일세포와 결합되는 유체 공급시 생성되는 에어압에 의한 역류를 감소시키기 위한 완충부를 더 포함할 수 있다.
본 발명과 관련된 실시예로서, 완충부가, 특정 모양의 긴 유로를 가질 수 있다.
본 발명과 관련된 실시예로서, 일측 단부가 유체 채널에 연결되어 있으며, 상기 단일세포 측정부에 의해 유체 채널에 이종세포가 감지되는 경우 이종세포를 외부로 배출시키는 이종세포 배출 채널; 및 일측 단부가 이종세포 배출 채널 내에 마련되며, 다른 일측 단부에 이종세포 배출 채널 내로 공기를 주입하는 공기주입부가 연결되어 있는 밸브 채널을 더 포함할 수 있다.
본 발명과 관련된 실시예로서, 유체 채널과 이종세포 배출 채널의 관 굵기가 서로 상이할 수 있다.
본 발명과 관련된 실시예로서, 이종세포 배출 채널과 밸브 채널 사이에 PDMS 막이 형성되어 있을 수 있다.
본 발명과 관련된 실시예로서, 단일세포 분리제어장치의 단일세포 분리제어신호에 응하여 웰 플레이트를 전진이동 또는 후진이동시키는 웰 플레이트 구동부를 더 포함할 수 있다.
본 발명과 관련된 실시예로서, 웰 플레이트가, 복수개의 공간들로 이루어져 있으며, 첫번째 공간이 이종세포들이 보관하는 공간이고, 그 나머지 복수개의 공간들이 단일세포 1개씩 각각 분리시켜 보관하는 공간일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 단일세포 분리방법은 단일세포 분리장치를 이용하여 단일세포를 분리하는 방법으로서, 세포가 포함된 시료를 시료 주입용 유체 채널의 시료 주입부에 주입하는 단계; 유체 채널의 유로를 통해 이송되는 시료에 전기적 신호를 인가시키는 단계; 전기적 신호가 인가된 시료의 전기적 신호를 감지하여 단일세포의 존재유무를 판단하는 단계; 및 단일세포가 존재하는 경우 단일세포와 결합될 유체를 공급하여, 유체 내부에 단일세포를 위치시킨 후 단일세포 배출구를 통해 배출시키는 단계로 이루어질 수 있다.
본 발명과 관련된 실시예로서, 단일세포가 존재하는 경우 단일세포의 수를 카운트하여 해당 시료를 통해 분리해낸 단일세포의 개수를 제공하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 미세유체 칩의 구조를 이용하여 채널을 통과하는 단일세포의 개수를 측정하고, 측정결과를 기반으로 단일세포를 분리시켜 유체 방울 속에 인입시켜 외부로 배출시킴으로써, 짧은 시간 내에 효과적으로 단위세포를 포함하는 시료로부터 단일세포를 분리해 낼 수 있도록 하는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 전기측정부와 분리부 사이에 완충부를 구비시켜 단일세포를 포함하는 시료로부터 단일세포를 분리할 때 이용되는 압력으로 인해 발생한 역류(backflow) 현상이 발생하지 않도록 함으로써, 전기측정부에서 단일세포를 분리하기 위한 전기적 측정이 이루어질 때 역류현상으로 인해 이상이 발생 되지않도록 하는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 이종세포와 원하는 세포인 단일세포를 분리시켜 배출되도록 하고, 배출된 단일세포는 복수개의 공간으로 이루어진 웰 플레이트의 각 공간에 독립적으로 분리되어 보관되도록 함으로써, 이종의 세포로 인해 순도가 떨어지는 것을 방지할 수 있으며, 추후 유전자 분석을 수행하는 경우 이종세포들의 DNA의 증폭현상으로 인해 결과값이 오류가 나는 현상을 미연에 제거하는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 단일세포 분리장치의 구성을 설명하기 위한 블록도이다.
도 2는 도 1의 단일세포 분리부의 일 실시예를 설명하기 위한 블록도이다.
도 3은 도 1에 적용된 단일세포 분리장치의 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 단일세포 분리장치를 나타낸다.
도 5는 본 발명에서의 단일세포 분리장치에서의 세포 변형성 측정 과정을 설명하기 위한 도면이다.
도 6은 본 발명에 채용된 감지전극으로부터 출력되는 감지신호를 도 1에 채용된 단일세포 분리제어장치에서 수신받아 X 및 Y 축상에 표시하여 제공하는 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 단일세포 분리장치의 제조공정을 설명하기 위한 도면이다.
도 8은 도 1의 단일세포 분리부의 다른 실시예를 설명하기 위한 블록도이다.
도 9는 도 1의 단일세포 분리부의 또다른 실시예를 설명하기 위한 블록도이다.
도 10은 도 2의 실시예에 의한 단일 세포 분리 결과를 나타낸다.
도 11은 도 1에 이종세포 분리채널 및 밸브 채널이 마련된 상태를 설명하기 위한 도면이다.
도 12 및 도 13은 본 발명에 채용된 유체 채널, 이종세포 분리 채널, 밸브 채널의 구조적 특징을 설명하기 위한 도면이다.
도 14는 본 발명에 채용된 PDMS 막을 설명하기 위한 도면이다.
도 15는 본 발명에 채용된 웰 플레이트를 설명하기 위한 도면이다.
본 발명에서 사용되는 기술적 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아님을 유의해야 한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 기술적 용어는 본 발명에서 특별히 다른 의미로 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미로 해석되어야 하며, 과도하게 포괄적인 의미로 해석되거나, 과도하게 축소된 의미로 해석되지 않아야 한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 기술적인 용어가 본 발명의 사상을 정확하게 표현하지 못하는 잘못된 기술적 용어일 때에는, 당업자가 올바르게 이해할 수 있는 기술적 용어로 대체되어 이해되어야 할 것이다. 또한, 본 발명에서 사용되는 일반적인 용어는 사전에 정의되어 있는 바에 따라, 또는 전후 문맥상에 따라 해석되어야 하며, 과도하게 축소된 의미로 해석되지 않아야 한다.
또한, 본 발명에서 사용되는 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함한다. 본 발명에서, "구성된다" 또는 "포함한다" 등의 용어는 발명에 기재된 여러 구성 요소들, 또는 여러 단계를 반드시 모두 포함하는 것으로 해석되지 않아야 하며, 그 중 일부 구성 요소들 또는 일부 단계들은 포함되지 않을 수도 있고, 또는 추가적인 구성 요소 또는 단계들을 더 포함할 수 있는 것으로 해석되어야 한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 바람직한 실시 예를 상세히 설명하되, 도면 부호에 관계없이 동일하거나 유사한 구성 요소는 동일한 참조 번호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다.
또한, 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
또한, 첨부된 도면은 본 발명의 사상을 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위한 것일 뿐, 첨부된 도면에 의해 본 발명의 사상이 제한되는 것으로 해석되어서는 아니 됨을 유의해야 한다.
도 1은 본 발명에 따른 단일세포 분리장치의 구성을 설명하기 위한 블록도이다. 도 2는 도 1의 단일세포 분리부의 일 실시예를 설명하기 위한 블록도이다. 도 3은 도 1에 적용된 단일세포 분리장치의 모식도이다. 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 단일세포 분리장치를 나타낸다. 도 5는 본 발명에서의 단일세포 분리장치에서의 세포 변형성 측정 과정을 설명하기 위한 도면이다. 도 6은 본 발명에 채용된 감지전극으로부터 출력되는 감지신호를 도 1에 채용된 단일세포 분리제어장치에서 수신받아 X 및 Y 축상에 표시하여 제공하는 그래프이다. 도 7은 본 발명에 따른 단일세포 분리장치의 제조공정을 설명하기 위한 도면이다.
(전극 채용 방식)
도 1에 도시된 바와 같이 단일세포 분리장치는 단일세포 분리장치(100)와, 단일세포 분리제어장치(200)로 이루어진다.
단일세포 분리장치(100)는 시료유입구(110)를 통해 유입되는 단일세포를 포함하는 시료를 유체채널(160)의 유로를 통해 이송시키기 위해 주사기 펌프에 의한 유체흐름을 생성시키고, 유체채널(160)의 유로를 통해 이송되는 시료의 전기적 신호를 감지하여 감지신호로 출력하며, 감지신호에 응하여 입력된 단일세포 분리제어신호에 응하여 유체채널(160)의 유로를 통해 이송되고 있는 시료로부터 시료에 포함된 세포를 분리시키고, 분리된 세포를 유체방울에 인입시켜 세포배출구를 통해 배출시킨다.
단일세포 분리제어장치(200)는 감지신호를 입력받아 유체채널을 통해 세포가 이송되고 있음을 인지하고, 인지 결과를 기반으로 단일세포 분리제어신호를 생성시켜 단일세포 분리장치(100)로 출력한다.즉 단일세포 분리제어장치(200)는 도 6에 도시된 바와 같이 감지전극(123)으로부터 출력되는 감지신호를 수신받아 X 및 Y 축상에 표시하여 화면상으로 제공한다. 이에 단일세포 분리제어장치(200)는 세포의 크기와 개수의 측정이 가능해진다.
도 2에 도시된 바와 같이 단일세포 분리장치(100)는 외부로부터 가해지는 물리적인 힘에 의해 단일세포를 포함하는 시료가 유입되는 시료유입구(110)와, 시료유입구(110) 및 유체채널(160)을 통해 단일세포를 포함하는 시료가 유입되면, 유체채널(160)의 유로를 통해 이송되고 있는 시료에 인가된 전기적 신호를 감지하여 세포분리 제어장치(200)로 출력하는 단일세포 측정부(120)와, 단일세포 분리제어신호에 응하여 유체채널(160)을 통해 이송되는 단일세포를 유체 방울에 인입시킨 후 단일세포 배출구(150)를 통해 외부로 배출시키는 단일세포 분리부(140)로 이루어진다.
이때 시료가 유체채널을 통해 이송될 수 있는 이유는 주사기 펌프에 의한 유체 흐름이 있기 때문이다.
특히 단일세포 분리장치(100)는 단일세포 측정부(120)와 단일세포 분리부(140) 사이에 완충부를 더 구비하고 있으며, 완충부(130)는 단일세포 분리부(140)에 의해 세포를 분리시켜 유체 방울을 인입시킬 때 발생되는 노이즈를 완화시킨다.이때 완충부(130)는 도 3에 도시된 바와 같이 "U"자 형으로 형성되어 긴 유로를 가지게 되며, "U"자뿐만 아니라 지그재그 형상 등과 같이 긴 유로를 가질 수 있는 형상이면 어떠한 형상이든 무관한다. 완충부(130) 내부에는 미량의 공기로 채워져 있다.
그리고 단일세포 분리장치(100)는 단일세포 분리제어장치(200)의 단일세포 분리제어신호에 의해 작동되어 단일세포 분리부(140)에 의해 분리된 세포와 결합되는 유체를 공급하는 유체 공급부(170)를 더 포함한다.
단일세포 측정부(120)는 도 2 및 도 3에 도시된 바와 같이 일정간격으로 이격된 상태로 위치되어, 외부로부터 공급되어지는 전원에 의해 유체채널(160)의 유로에 전기적 신호를 인가시키는 제 1, 제 2 전극(121)(122)과, 제 1, 제 2 전극(121)(122) 사이에 구비되며, 유체채널(160)의 유로를 통해 이송되는 시료의 전기적 신호를 감지하여 출력하는 감지전극(123)으로 이루어진다. 즉, 제 1, 제 2 전극(121)(122)에 의해 인가되는 전기적 신호를 유체채널(160)의 유로를 통해 시료가 용이하게 이송될 수 있도록 하며, 감지전극(123)은 유체채널(160)의 유로를 통해 이송되는 시료의 전기적 신호를 감지하여 세포분리 제어장치(200)로 출력하고, 단일세포 분리제어장치(200)는 감지전극(123)에서 입력되는 전기적 신호 중 미리 설정된 한계값보다 큰 전기적 신호에 대해서만 단일세포로 인식하고, 인식된 단일세포를 분리시키기 위한 단일세포 분리제어신호를 생성시켜 출력하게 된다. 즉, 단일세포 분리제어장치(200)는 감지전극(123)을 통해 전기적 신호를 입력받아 미리 설정된 한계치 이상의 값이 입력되는 경우 유체채널(160)의 유로를 통해 세포가 이송되는 것을 인지하고 단일세포 분리부(140)로 단일세포 분리제어신호를 출력한다.
제 1, 제 2 전극(121)(122) 및 감지전극(123)은 도 4에 도시된 바와 같이 유체 채널(160)을 형성하는 하부 패널(10)에 형성된다. 한편, 제 1, 제 2 전극(121)(122) 및 감지전극(123)은 도 4의 하부 패널(10)에 형성되는 것과는 달리 상부 패널에 형성될 수도 있으며, 또는 하부 패널 및 상부 패널에 각각 별도로 형성될 수도 있다.
즉, 단일세포 분리장치(100)는 도 7에 도시된 바와 같이 칩 형태를 이루며, 이 칩은 크게 전기적 감지를 위한 전극부분과 유체 채널을 형성하기 위한 PDMS(polydimethylsiloxane)부분으로 구분된다. 즉, 단일세포 분리를 위한 칩은 도 7에 도시된 바와 같이 리소그래피 공정으로 제작된다. 도 7을 참조하여 좀 더 상세히 기술하면 즉 유리기판 상부에 Cr과 Au층을 순차적으로 적층시킨 후 유리기판 상부에 원하는 전극패턴을 가질 수 있도록 디자인된 마스크 및 UV 빔을 이용하여 패터닝화하고, 1차적으로 Au를 에칭시킨 후 Cr을 에칭시키고 유리기판에 홀을 형성시켜 세포 배출구를 형성시킨다.
이후, 상부 유리 기판에 SU-8을 이용하여 유체 채널 패턴이 형성된 PDMS를 위에서 간단히 설명한 리소그래피 방식으로 제조된 칩에 산소 플라즈마(O2 Plasma) 처리를 이용하여 기판과 PDMS를 접합시킴으로써 단일세포 분리장치를 도 4와 같이 최종 완성할 수 있다.
위에서 기술된 전극부분 형성 및 PDMS부분 형성 공정은 이미 공지된 기술로 여기서는 그 상세한 설명을 생략하기로 한다.
상기와 같이 구성된 단일세포 분리장치의 작용에 대해서 설명하면 다음과 같다.
도 1 내지 도 5에 도시된 바와 같이 단일세포 분리장치(100)에 단일세포 분리제어장치(200)를 연결한 후 시료유입구(110)를 통해 단일세포가 포함된 시료를 주입시킨 후 전극(121)(122)에 전원을 인가시키면, 단일세포가 포함된 시료는 유체 채널(160)의 유로를 통해 원할하게 이송하게 된다. 즉 주사기 펌프를 이용하여 유체가 일정 속도로 흐르도록 하면, 단일세포가 포함된 샘플은 유체가 일정하게 흐르는 유체 채널(160)을 통해 원할하게 이송되기 시작하는 것이다.
이렇게 유체 채널(160)을 통해 이송된 단일세포가 포함된 시료가 도 5에 도시된 바와 같이 제 1 전극(121)을 통과한 위치의 유체 채널(160)까지 이송되면, 감지전극(123)에 의해 감지된 전압이 단일세포 분리제어장치(200)로 출력되고, 단일세포 분리제어장치(200)에서는 단일세포 분리장치(100)의 감지전극(123)으로부터 입력된 전압을 화면상에 출력시키면 도 5에 도시된 바와 같이 사인(sine) 신호가 형성된다. 이때 세포분리 제어장치는 도 7과 같은 세포가 인식되면 X,Y 축 상에 이를 표시하여 크기 및 개수를 카운트하여 제공할 수 있게 된다.
그러면 단일세포 분리제어장치(200)는 이렇게 측정된 사인 신호의 피크(peak)인 미리 설정된 한계치(threshold) 이상의 값만을 인지하여 단일 세포를 인지하게 된다. 이렇게 단일세포가 인지되면 단일세포 분리제어장치(200)는 단일세포 분리제어신호를 발생시켜 단일세포 분리부(140)와 연결되어 있는 유체 공급부(170)로 출력한다.
그러면 유체 공급부(170)는 단일세포 분리제어신호에 응하여 작동하게 되고 미리 채워져 있던 PBS가 소량 배출되게 되며, 소량 배출된 PBS(Phosphate buffer saline; 인산 완충 식염수)에 세포가 인입되어 단일세포 배출구(150)를 통해 외부로 배출된다. 즉 유체 공급부(170)는 단일세포 분리제어신호에 응하여 소량의 유체를 압력으로 단일세포 분리부(140)로 밀어내고, 단일세포 분리부(140)는 밀려들어온 유체 방울 내에 단일세포가 있도록 한 후 단일세포 배출구(150)를 통해 단일세포 분리장치(100)인 칩 외부로 배출시킨다. 이때 완충부(130)는 유체 공급부(170)에 의해 발생되는 압력에 의하여 발생한 역류(backflow)에 의하여 단일세포 측정부(120)의 측정상태에 이상이 생기지 않도록 완충해준다. 완충부(130) 내부에는 미량의 공기로 채워져 있기 때문에 유체 공급부(170)에 의해 발생된 압력을 완화시켜 준다.
(광학측정센서 채용방식)
본 발명의 다른 실시예로서, 단일세포 분리장치가, 도 8에 도시된 바와 같이 상부 패널과 하부 패널로 구성되고, 상부 패널과 하부 패널 사이에 단일세포를 포함하는 시료를 이송시키기 위한 유로가 형성된 유체 채널(160)과, 단일세포 측정부로서 유체 채널(160)로 광을 방출시키고, 단일세포가 포함된 샘플에 의해 반사되는 광을 수신받아 전기적 신호로 변환시켜 단일세포 감지신호로 단일세포 분리제어장치(200)로 출력하는 광학측정센서(121a)로 이루어진다.
그러면 단일세포 분리제어장치(200)가 광학측정센서(121a)로부터 출력되는 전기적신호를 이용하여 단일세포를 포함하는 시료의 유체 채널 통과속도를 도출하고, 샘플의 통과속도를 기반으로 단일세포 분리제어신호를 출력한다.
다시 말해, 단일세포에 부착된 형광비드가 광학측정센서(121a)에서 조사되는 광에 의해 발광하게 되고, 이를 광학측정센서(121a)가 수광하여 전기적 신호로 변환시켜 출력할 수 있다. 즉, 시료의 단일세포에는 형광 비드(bead)가 부착되어 있으므로 형광 비드에 의해 반사되는 광을 광학측정센서(121a)가 수광하는 것이다. 시료에 형광 비드를 부착시키는 방식은 기존의 항원 항체 반응을 통해서 이루어지므로, 그 상세한 설명은 생략하기로 한다.
이에, 단일세포 분리제어장치(200)는 광학측정센서(121a)로부터 출력되는 전기적신호를 이용하여 단일세포를 포함하는 샘플의 유체 채널 통과속도를 도출하고, 샘플의 통과속도를 기반으로 단일세포 분리제어신호를 생성시켜 단일세포 분리부(140)로 출력할 수 있다.
여기에서는 전극 채용방식과 다른 부분에 대해서만 기술하고, 동일한 부분에 대해서는 생략하기로 한다.
( 홀센서 채용방식)
본 발명의 또다른 실시예로서, 단일세포 분리장치가, 도 9에 도시된 바와 같이 상부 패널과 하부 패널로 구성되고, 상부 패널과 하부 패널 사이에 단일세포를 포함하는 시료를 이송시키기 위한 유로가 형성된 유체 채널(160)과, 단일세포 측정부로서 유체 채널(160)로 자기장을 인가시키고, 자기장에 의해 발생된 전압을 감지하여 출력하는 홀센서(121b)와, 홀센서(121b)에 의해 감지된 전압을 입력받아 단일세포를 포함하는 샘플의 유체 채널 통과속도를 도출하고, 샘플의 통과속도를 기반으로 단일세포 분리제어신호를 출력하는 단일세포 분리제어장치(200)로 이루어진다.
다시 말해, 단일세포 측정부(120)의 홀센서(121b)는 유체 채널(160)로 자기장을 인가시키고, 자기장에 의해 발생된 전압을 감지하여 단일세포 분리제어장치(200)로 출력하고, 단일세포 분리제어장치(200)는 홀센서(121b)에 의해 감지된 전압을 입력받아 단일세포를 포함하는 시료의 유체 채널 통과속도를 도출하고, 시료의 통과속도를 기반으로 단일세포 분리제어신호를 생성시켜 단일세포 분리부(140)로 출력할 수 있다. 즉, 시료에 포함되어 있는 단일세포에는 자기성질을 가진 파티클(particle)이 부착되어 있으므로, 자기성질을 가지는 파티클과 홀센서(121b)에서 유체 채널로 인가시키는 자기장이 반응하게 되고, 이 결과로 발생된 전압을 홀센서(121b)가 감지하여 단일세포 분리제어장치(200)로 출력하는 것이다. 시료의 단일세포에 자기성질을 가진 파티클을 부착시키는 방식은 기존의 항원 항체 반응을 통해서 이루어지므로, 그 상세한 설명은 생략하기로 한다.
여기에서는 전극 채용방식과 다른 부분에 대해서만 기술하고, 동일한 부분에 대해서는 생략하기로 한다.
도 10은 기본적인 전기적 신호를 이용하여 생성된 유체 드롭(drop)을 96well에 떨어뜨려 측정을 한 결과를 나타낸다. 도 10에 나타낸 바와 같이 하나의 well에 하나의 cell이 있음을 알 수 있다.
도 11은 도 1에 이종세포 분리채널 및 밸브 채널이 마련된 상태를 설명하기 위한 도면이다. 도 12 및 도 13은 본 발명에 채용된 유체 채널, 이종세포 분리 채널, 밸브 채널의 구조적 특징을 설명하기 위한 도면이다. 도 14는 본 발명에 채용된 PDMS 막을 설명하기 위한 도면이다. 도 15는 본 발명에 채용된 웰 플레이트를 설명하기 위한 도면이다.
(이종세포 분리기능 채용)
본 발명에 따른 단일세포 분리장치는 이종세포(백혈구, 적혈구 또는 찌꺼기 등을 포함)와 단일세포(암세포)를 각각 분리 배출 가능하도록 하는 구조적 특징을 채용하고 있다.
이종세포와 단일세포 분리 배출 구조적 특징은 도 11 내지 도 13에 도시된 바와 같이 일측 단부가 유체 채널(160)에 연결되어 있으며, 단일세포 측정부(120)에 의해 유체 채널(160)을 통해 이동하는 이종세포가 감지되는 경우 이종세포를 외부로 배출시키는 이종세포 배출 채널(180)과, 일측 단부가 이종세포 배출 채널(180) 내에 마련되며, 다른 일측 단부에 이종세포 배출 채널(180) 내로 공기를 주입하는 공기주입장치(300)가 연결되어 있는 밸브 채널(190)로 이루어진다.
유체 채널(160)과 이종세포 배출 채널(180)의 관 굵기가 서로 상이하도록 구성하여, 평상시에는 저항이 작은 방향으로 흘러가도록 한다.
그리고 밸브 채널(190)의 관내에는 공기로 차 있게 된다. 즉 밸브 채널(190)의 일측 단부에는 공기주입장치(300)가 연결되어 있어, 필요에 따라 밸브 채널(190) 내로 공기를 주입시키게 된다. 즉, 단일세포 분리장치의 단일세포 측정부(140)에 의해 원하는 단일세포가 감지되면, 단일세포 감지신호를 단일세포 분리제어장치(200)로 출력하고, 단일세포 분리제어장치(200)가 공기주입장치(300)를 제어하여 밸브 채널(190) 관내로 공기를 주입시게 되면, 밸브 채널(190)과 이종세포 배출 채널(180) 사이에 구비되어 있는 PDMS 막(195)이 도 14의 (b)에 도시된 바와 같이 부풀게 되어 이종세포 배출 채널(180)로 흐르는 유체를 막아 유체의 방향을 바꾸게 된다.
(단일세포와 이종세포 별도로 분리 보관용 웰플레이트 )
마지막으로, 본 발명에 따른 단일세포 분리장치는 단일세포 분리장치에 의해 분리된 이종세포 및 단일세포를 보관하는 웹 플레이트를 더 포함하고 있으며, 웹 플레이트(400)는 도 15에 도시된 바와 같이 복수개의 공간들로 이루어져 있으며, 첫번째 공간(410)이 이종세포들이 보관하는 공간이고, 그 나머지 복수개의 공간들(420)이 단일세포 1개씩 각각 분리시켜 보관하는 공간이다.
초기 동작시 웰 플레이트(400)는 세포 배출부위가 첫번째 공간에 위치되도록 이동된 상태로 정지된다(도 15의 (a) 참조). 그리고 단일세포 측정부(140)가 유체 채널(160)로 이종세포가 유입된 것으로 인지하게 되면, 밸브 채널(190)은 유체 채널(160)과 이종세포 배출 채널(180)이 연결되도록 하며, 이렇게 이종세포 배출 채널(180)을 통해 이동하는 이종세포는 단일세포 분리제어장치(200)의 제어에 응하여 웰 플레이트 구동부(200)가 웰 플레이트(400)의 첫번째 칸이 단일세포 분리장치(100)의 이종세포 배출구 하부에 위치되도록 웹 플레이트(400)를 위치시킨 상태에서 그대로 유지한 상태에서 이종세포를 웰 플레이트(400)의 첫번째 공간에 배출시킨다(도 15의 (a)참조).
만약에 단일세포 측정부(140)가 유체 채널(160)로 단일세포가 유입된 것으로 인지하게 되면 공기주입장치(300)를 제어하여 밸브 채널(190) 내로 공기를 주입시켜 PDMS 막(195)이 부풀어 올라 이종세포 배출채널(180)을 막아, 단일세포가 유체채널(160)을 통해 단일세포 배출구(150)로 배출되도록 한다. 이때 단일세포 분리제어장치(200)가 웰 플레이트 구동부(430)를 제어하여 두번째 공간으로 단일세포를 배출시켜 보관되도록 한다. 그리고 웰 플레이트 구동부(430)는 단일세포 분리제어장치(400)의 이종세포 배출채널(180) 하부에 첫번째 공간이 위치되도록 단일세포 분리제어장치(200)의 제어하에 웰 플레이트(400)를 이동시키게 된다(도 15의 (b) 참조). 즉 웰 플레이트(400)는 단일세포가 해당 공간에 배출되어 보관이 이루어지면, 다시 첫번째 공간이 이종세포 배출 밸브(180) 하부에 위치된다(도 15의 (c) 참조).
이렇게 웰 플레이트 구동부(430)는 단일세포 분리제어장치(300)의 제어에 응하여 전진이동 또는 후진이동을 하면서 첫번째 공간에는 이종세포만 분리되도록 하고, 그 나머지 공간들에는 단일세포가 배출되는 순서대로 두번째 공간, 세번째 공간 등등에 배출되어 보관되도록 한다(도 15의 (d) 내지 (f) 참조).
전술한 내용은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
100 : 단일세포 분리장치
110 : 시료유입구 120 : 단일세포 감지부
130 : 완충부 140 : 단일세포 측정부
150 : 단일세포 배출구 160 : 유체 채널
170 : 유체 공급부
180 : 이종세포 배출 채널 190 : 밸브 채널
195 : PDMS 막
200 : 단일세포 분리제어장치
300 : 공기주입장치
400 : 웰 플레이트 430 : 웰 플레이트 구동부

Claims (17)

  1. 상부 패널과 하부 패널로 구성되고, 상기 상부 패널과 하부 패널 사이에 단일세포를 포함하는 시료를 이송시키기 위한 유로가 형성된 유체 채널;
    유체 채널에 일정 간격 이격된 상태로 구비되며, 상기 유체 채널의 유로를 통해 이송되는 시료에 전기적 신호를 인가하는 제 1, 제 2 전극과, 상기 제 1 전극 및 제 2 전극 사이에 구비되며, 상기 유로를 통해 이송되는 시료 내의 단일세포를 감지하는 감지전극으로 이루어져, 상기 유로를 통해 이송되는 시료에 전기적 신호를 인가시키고, 전기적 신호가 인가된 시료의 전기적 신호를 감지하여 시료 내에 단일세포가 존재하는지의 여부를 감지하는 단일세포 측정부; 및
    상기 감지전극에 의해 단일세포가 감지되는 경우 단일세포 분리제어신호를 출력하는 단일세포 분리제어장치;
    를 포함하는 단일세포 분리장치.
  2. 상부 패널과 하부 패널로 구성되고, 상기 상부 패널과 하부 패널 사이에 단일세포를 포함하는 시료를 이송시키기 위한 유로가 형성된 유체 채널;
    상기 유체 채널로 광을 방출시키는 광학측정센서로 이루어지며, 상기 광학측정센서가, 상기 단일세포가 포함된 샘플에 의해 반사되는 광을 수신받아 전기적 신호로 변환시켜 단일세포 감지신호로 출력하는 단일세포 측정부; 및
    상기 광학측정센서로부터 출력되는 전기적신호를 이용하여 상기 단일세포를 포함하는 시료의 유체 채널 통과속도를 도출하고, 상기 샘플의 통과속도를 기반으로 상기 단일세포 분리제어신호를 출력하는 단일세포 분리제어장치;
    를 포함하는 단일세포 분리장치.
  3. 상부 패널과 하부 패널로 구성되고, 상기 상부 패널과 하부 패널 사이에 단일세포를 포함하는 시료를 이송시키기 위한 유로가 형성된 유체 채널;
    상기 유체 채널로 자기장을 인가시키는 홀센서로 이루어지며, 상기 홀센서가, 상기 자기장에 의해 발생된 전압을 감지하여 출력하는 단일세포 측정부; 및
    상기 홀센서에 의해 감지된 전압을 입력받아 상기 단일세포를 포함하는 샘플의 유체 채널 통과속도를 도출하고, 상기 샘플의 통과속도를 기반으로 상기 단일세포 분리제어신호를 출력하는 단일세포 분리제어장치;
    를 포함하는 단일세포 분리장치.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 1 전극 및 제 2 전극이, 상기 유체 채널의 상부 패널 또는 하부 패널 또는 상하부 패널 상에 구비되는 것을 특징으로 하는 단일세포 분리장치.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 단일세포 분리제어장치가, 상기 감지전극으로부터 입력되는 전기적 신호를 기반으로 유로를 통과하는 단일세포의 개수를 카운트하여 제공하는 것을 특징으로 하는 단일세포 분리장치.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 단일세포 분리제어장치의 세포분리 제어신호에 응하여 유체를 공급하여 세포 배출구로 이송되는 단일세포와 결합시킨 후 상기 단일세포 배출구를 통해 배출시키는 단일세포 분리부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단일세포 분리장치.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 단일세포 분리제어장치의 단일세포 분리제어신호에 의해 작동되어 상기 단일세포 분리부에 의해 분리된 단일세포와 결합되는 유체를 공급하는 유체 공급부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단일세포 분리장치.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 단일세포 분리부가, 상기 단일세포와 결합되는 유체를 에어압을 이용하여 공급하는 것을 특징으로 하는 단일세포 분리장치.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 단일세포와 결합되는 유체 공급시 생성되는 에어압에 의한 역류를 감소시키기 위한 완충부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단일세포 분리장치.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 완충부가, 특정 모양의 긴 유로를 가지는 것을 특징으로 하는 단일세포 분리장치.
  11. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    일측 단부가 상기 유체 채널에 연결되어 있으며, 상기 단일세포 측정부에 의해 상기 유체 채널에 이종세포가 감지되는 경우 상기 이종세포를 외부로 배출시키는 이종세포 배출 채널; 및
    일측 단부가 상기 이종세포 배출 채널 내에 마련되며, 다른 일측 단부에 상기 이종세포 배출 채널 내로 공기를 주입하는 공기주입부가 연결되어 있는 밸브 채널;
    을 더 포함하는 단일세포 분리장치.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 유체 채널과 상기 이종세포 배출 채널의 관 굵기가 서로 상이한 것을 특징으로 하는 단일세포 분리장치.
  13. 제 11 항에 있어서,
    상기 이종세포 배출 채널과 상기 밸브 채널 사이에 PDMS 막이 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 단일세포 분리장치.
  14. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단일세포 분리제어장치의 단일세포 분리제어신호에 응하여 웰 플레이트를 전진이동 또는 후진이동시키는 웰 플레이트 구동부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단일세포 분리장치.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 웰 플레이트가, 복수개의 공간들로 이루어져 있으며,
    첫번째 공간이 이종세포들이 보관하는 공간이고, 그 나머지 복수개의 공간들이 단일세포 1개씩 각각 분리시켜 보관하는 공간인 것을 특징으로 하는 단일세포 분리장치.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 하나의 단일세포 분리장치를 이용하여 단일세포를 분리하는 방법으로서, 단일세포가 포함된 시료를 시료 주입용 유체 채널의 시료 주입부에 주입하는 단계;
    상기 유체 채널의 유로를 통해 이송되는 시료에 전기적 신호를 인가시키는 단계;
    상기 전기적 신호가 인가된 시료의 전기적 신호를 감지하여 단일세포의 존재유무를 판단하는 단계; 및
    단일세포가 존재하는 경우 단일세포와 결합될 유체를 공급하여, 유체 내부에 단일세포를 위치시킨 후 단일세포 배출구를 통해 배출시키는 단계로 이루어지는 단일세포 분리방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    단일세포가 존재하는 경우 단일세포의 수를 카운트하여 해당 시료를 통해 분리해 낸 단일세포의 개수를 제공하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단일세포 분리방법.
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