KR20160057223A

KR20160057223A - 생리 활성 조절을 위한 rna 분자 및 이를 이용한 유전자 발현 조절 방법

Info

Publication number: KR20160057223A
Application number: KR1020140158213A
Authority: KR
Inventors: 노정혜; 김혜미
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2014-11-13
Filing date: 2014-11-13
Publication date: 2016-05-23
Also published as: KR101814240B1

Abstract

본 발명은 생리 활성 조절을 위한 RNA 분자 및 이를 이용한 유전자 발현 조절 방법에 관한 것으로, 형질전환 방법을 통하여 세포 내로 도입되었을 때 안정적인 구조를 형성하여 유전자 조절을 수행할 수 있다. 본 발명에 따른 RNA 분자는 이에 결합되는 서열을 변경하여 원하는 유전자의 전사후 조절에 사용될 수 있다. 본 발명의 RNA 분자에 결합된 안티센스 서열과 상보적 결합을 하는 mRNA는 분해가 촉진되어진다. 이로써 유전자의 조절이 빠르게 일어나게 된다. 특히 종래에 용이하지 않았던 방선균류에 적용이 가능하다.

Description

생리 활성 조절을 위한 RNA 분자 및 이를 이용한 유전자 발현 조절 방법{RNA molecule for controlling biological activity and methods of control of biological activity by using thereof}

본 발명은 방선균의 생리 활성을 조절하기 위한 RNA 분자 및 이를 이용한 생리 활성 조절 방법에 관한 것이다.

슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase; SOD)는 널리 분포하고 있는 효소 이고, 이 효소는 슈퍼옥사이드를 과산화수소와 분자 산소로 전환하며, 이 효소는 여러 가지 물질을 보조 인자로 사용한다. 많은 액티노박테리아는 두 개의 Ni-포함(sodN) 및 Fe-포함(sodF) 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제 유전자를 가지고 있다. Streptomyces coelicolor에서는 sodF와 sodN 유전자의 발현이 Fur-패밀리 조절자인, 니켈-특이적인 Nur에 의해 역비례로 조절되고 있다. 니켈이 충분하면, Nur는 sodF의 전사를 억제하고, sodN을 간접적으로 유도한다. 생물정보학적 탐색은 sodN의 업스트림에 보존된 19 염기의 스트레치가 sodF의 다운스트림의 서열과 완벽하게 매치되는 것을 보였다. sodF 유전자는 90 nt의 안정한 작은 크기의 RNA 종들(s-SodF)를 생산한다. 이들 작은 크기의 RNA 종들은 항-sodN 서열을 가지고 있고, 이 항-sodN 서열은 5' 끝에서 리보솜 결합 부위까지 sodN에 상보적이다. 근처의 프로모터가 없고, 5'-인산 특이적인 엑소뉴클리아제에 분해된다는 것은 s-SodF RNA가 sodF mRNA의 가공 산물일 것이라는 것을 나타낸다.

3’ UTR(untranslated region)은 전사후 조절에 관여를 한다. Lijuan Fu 등은 Molecular Brain 2014, 7:71에서 여러 마이크로 RNA가 FOXP2 유전자의 3’ UTR을 이용하여 FOXP2 유전자를 조절한다는 것을 밝혔다. Minlee Kim 등은 Cell Cycle Vol. 13, Issue 6, 2014, pp 1030-1040에서 폐 및 난소암 사례에서 KRAS 유전의 3’UTR에 많은 변이가 있는 것을 확인하였고, 3’ UTR이 miRNA와 컴플리먼터리 결합을 하지 못하여 암을 일으킬 것으로 보고 하였다. 최근에는 miRNA가 결합하는 3’ UTR에 의한 생리 활성 조절에 관한 많은 보고가 뒤따르고 있다.

본 발명자들은 방선균에서 sodF의 3’UTR의 가공산물인 s-SodF RNA가 슈퍼옥사이드 디스뮤타제의 발현을 조절하는 것을 발견하고 이를 이용하여 방선균에서 생리활성이 조절될 수 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 생리활성을 조절할 수 있는 RNA 분자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 RNA 분자를 이용한 생리활성 조절 방법에 관한 것이다.

상기한 목적을 위하여 본 발명은 서열번호 1의 RNA 서열을 가진 RNA 분자를 제공한다.

본 발명의 또 다른 형태는 상기 서열번호 1의 RNA 서열을 암호화 하는 서열번호 2의 DNA 분자를 제공한다.

본 발명의 제3의 형태는 상기 DNA 분자를 포함하는 재조합벡터를 제공한다. 본 발명에서 사용되는 벡터라는 용어는 또다른 핵산을 그것에 결합시켜 이송시킬 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 발현벡터란 용어는 상기 벡터에 의해 운반되는 각 재조합형 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 합성시킬 수 있는 플라스미드, 코스미드 또는 파아지를 포함한다. 바람직한 벡터는 그것이 결합된 핵산을 자기 복제 및 발현시킬 수 있는 벡터이다.

본 발명의 제4의 형태는 상기 재조합벡터로 형질전환된 세포를 제공한다. 본 발명에서 사용되는 '형질전환'이란 용어는 외래 DNA 또는 RNA가 세포에 흡수되어 세포의 유전형이 변화되는 것을 말한다.

상기 세포는 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 원핵세포이고, 보다 더 바람직하게는 방선균이다.

본 발명의 제 5 의 형태는 서열번호 1의 RNA 분자를 이용한 세포의 생리활성 조절 방법을 제공한다. 상기 생리활성 조절은 생리활성을 증가시키거나 감소시키는 것을 모두 포함한다. 생리활성은 이에 제한되는 것은 아니나, 유전자의 전사후 조절에 의한 생리 활성이다. 보다 더 구체적으로는 유전자의 전사후 번역을 조절하거나, mRNA의 안정성을 변화시켜서 조절하는 것이다. 본 발명에 따른 세포는 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 원핵세포이다. 보다 더 바람직하게는 방선균이다.

구체적으로는 서열번호 1의 RNA 분자와 생리 활성 조절에 관계하는 목적 RNA와 결합하는 단계; 상기 결합된 RNA 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및 상기 재조합된 벡터를 숙주 세포로 형질전환시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포의 생리 활성 조절 방법이다.

본 발명의 제 6 의 형태는 서열번호 1의 RNA 분자와 임의의 안티센스 타입의 목적 RNA와 결합하는 단계; 상기 결합된 RNA 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및 상기 재조합된 벡터를 숙주 세포로 형질전환시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포의 목적 RNA의 기능 분석 방법이다.

본 발명에 따른 RNA 분자는 세포내에서 안정적인 구조를 형성할 수 있다.이와 같은 안정적인 구조는 세포내에서 잘 분해되지 않아서 유전자의 조절에 용이하게 이용될 수 있다. 조절하고자 하는 유전자와 상보적 결합할 수 있는 유전자를 본 발명의 RNA 분자와 결합시키면 안정적인 이차구조를 형성하여 전사후 조절을 할 수 있다. 본 발명의 RNA 분자에 결합된 안티센스 서열과 상보적 결합을 하는 mRNA는 분해가 촉진되어진다. 이로써 유전자의 조절이 빠르게 일어나게 된다. 특히 본 발명에 따른 RNA 분자는 종래에 용이하지 않았던 세균에 쉽게 사용될 수 있다. 종래에는 유전자의 조절이 쉽지 않았던 방선균에서 분리된 RNA 구조로서, 방선균류의 유전자 기능 연구에 많은 기여를 할 것이다.

도 1은 sodF와 sodN 유전자의 센스 가닥 사이의 컴플리멘터리티를 보인다. sodF와 sodN 유전자 주변의 유전자 구조를 도식적으로 보였다. sodF 및 sodN의 각각의 다운스트림 및 업스트림의 동일한 19bp의 DNA 서열을 빨간 사각형으로 보였다. 프로모터의 위치(sodFp 및 sodNp) 및 Nur-결합 사이트 (Nur-박스)를 표시하였다. sodF 및 sodN 전사체의 3’ 및 5’UTR의 컴플리먼터리 서열 각각을 중간에 보였다. sodN mRNA의 5’-말단 및 리보솜 결합 위치를 점 및 사각형 박스로 각각 나타내었다. sodF RNA의 S1 맵핑 및 노던 분석을 위한 프로브를 sodF ORF의 종결 코돈의 말단으로부터의 상대적인 거리와 함께 라디오 레이블된 위치(백설표)로 나타냈다. S1 프로브의 웨이브된 조각은 관련이 없는 벡터 서열을 나타낸다.
도 2는 19 nt sodN 컴플리먼터리(항-sodN) 서열을 포함하는 작은 크기의 sodF RNA가 Nur-의존적 방식으로 생산되었다. (A) sodF ORF의 종결 코돈에 상대적인 +60 위치에서의 5’-말단 레이블된 DNA 프로브로의 sodF RNA의 S1 맵핑을 보인다. RNA를 50μM NiSO ₄ 의 존재 및 부존재하에서 성장한 야생형(M145) 및 Δnur 돌연변이체에서 준비하였다. 화살표는 프로브를 완전히 보호하는(sodF) 및 부분적으로 보호하는(s-SodF) sodF RNA의 존재를 가르킨다. FP는 결합된 플라스미드 벡터 서열과의 자유 프로브를 나타낸다. (B) sodF RNA의 노던 블랏 분석을 보인다. RNA는 50μM NiSO₄의 존재 및 부존재하에서 자란 야생형(M145), ΔsodF, ΔsodF2 및 Δnur 세포로부터 준비하였다. RNA는 12.5% PAGE에서 작은-크기의 RNA를 구별하기 위해서 전개되었고, ³²P로 5’말단에서 레이블된 22 nt 단일-가닥 DNA 프로브(sodF 종결 코든에서 상대적으로 +18 에서 +39 nt)로 교잡되었다. 아가로스 젤에서 전기영동된 5S rRNA 밴드를 RNA 샘플의 양과 질을 보이기 위해서 평행하게 보였다.
도 3은 s-SodF RNA의 5’말단을 결정하는 것을 보인다. (A) 고-해상도 S1 분석에 의한 5’-말단의 결정. sodF ORF의 종결코돈에 상대적으로 +78 뉴클레오타이드 위치에 레이블된 DNA 프로브 5’-말단으로 sodF RNA의 S1 맵핑. RNA들을 NiSO₄의 존재 또는 부존재 상태에서 생장한 야생형(M145) 및 Δnur 돌연변이로부터 준비하였다. 전사체의 5’-말단의 위치를 밑줄로 나타내었다. 서열결정 래더를 sodF 올리고 뉴클레오타이드 프라이머(5’-CCT CGC GGG GGC CTT CCT CA-3’) 및 주형 pGEM-sodF346으로 얻었다. (B) sodF (SCO2633) 및 SCO2634 유전자간 지역의 서열 정보. s-SodF의 5’-말단을 19 nt 항-sodN 서열(붉은색), 15 nt의 인버티드 리피트(inverted repeat; 수평형의 화살표) 및 잠재적인 sodF 및 s-SodF RNA의 3’-말단과 함께 밑줄친 굵은 이탤릭체로 나타내었다. (C) 예상되는 s-SodF RNA의 이차적구조. 안정성 뿐만 아니라 90nt 길이의 s-SodF RNA(+11 에서 +100; (B)에서와 같이)의 이차구조를 엠폴드(mfold) 프로그램으로 예상하였다. 5’근처의 스템-루프는 항-sodN 서열을 포함하였다.
도 4는 5’모노포스페이트-의존 엑소뉴클리아제에 대한 sodN mRNA의 안정성에 대한 s-SodF의 효과를 보인다. s-SodF RNA의 인산화 정도를 5-모노포스페이트-의존성 엑소뉴클리아제(5’-Exo)로 처리하여 모니터 하였다. 야생형(M145) 및 Δnur 세포로부터 분리된 전체 RNA를 5’Exo로 다이제스쳔 시켰고, 젤 전기영동으로 분석하였고(아래 패널) s-SodF 특이적인 방사선 레이블된 프로브로 노던 블랏팅하였다(위쪽 패널). RNA 샘플을 5’-Exo 처리전에 5’-삼인산화된 RNA 를 5’-단일인산화된 것으로 전환시키는 TAP의 존재 또는 부존재에서 처리하였다. 각 시료에서의 안정적인 RNA의 상태를 아래쪽 패널에 보였다.
도 5는 sodN mRNA의 안정성에 대한 s-SodF의 영향을 보인다. (A)는 리팜피신의 처리후에 sodF 및 sodN RNA의 S1 맵핑을 보인다. 염색체내에서 ermE^* 프로모터로부터 s-SodF를 발현하는 pSET-기초 재조합 플라스미드가 있거나 없는 야생형(M-145) 및 ΔsodF 세포를 YEME 배지에서 OD600 0.8까지 성장시키고 리팜피신(300μg/ml)로 처리하였다. 리팜피신(300 mg/ml) 처리 후 5, 10, 15 및 20분에 세포를 수확하고 메탄올로 고정하였다. RNA 시료를 5-말단-레이블된 프로브로 S1 맵핑 분석하였다. 대표적인 결과를 보였다. (B) RNA 종의 상대적인 양을 반감기를 측정하기 위하여 그래프화 하였다.
도 6은 sodN 발현을 억제하는데 s-SodF의 서열 특이성을 보인다. (A) s-SodF 여러 변형체를 항- sodN 지역의 서열을 바꾸어 만들었다. V1은 항- sodN 서열에서 예상되는 루프 지역에 상응하는 7개의 서열 변화를 가지고 있다. V2는 그 다음의 연속하는 7개의 뉴클레오타이드의 변화를 가지고 있다. (B) s-SodF 유전자의 sodN mRNA 수준에의 영향을 보인다. 돌연변이화된 s-SodF 유전자를 ermE^* 프로모터를 가진 pSET152-기초 벡터 pSET162로 클론하였고, 도 5에서 사용된 야생형의 s-SodF 컨스트럭트에 수행한 바와 같이 파아지 부착 위치를 통하여 ΔsodF 균주의 염색체내로 통합시켰다. 원천의 벡터 대조구(C), 야생형(WT) 및 s-SodF 유전자의 변형체들(V1, V2)을 가진 상기 ΔsodF 세포를 YEME에서 0.8의 OD가 되도록 배양하였다. RNA 시료를 리팜피신 추적 없이, 도 5에서와 같이 세포를 수확하였다. 세개의 독립적인 실험으로부터의 대표적인 젤을 보였고, sodN mRNA에 대한 평균 ± 표준편차의 정량적인 값을 표시했다.
도 7은 성장 동안에 sodN mRNA의 안정성과 sodF/sodN 비율 사이의 관계를 보인다. (A) 야생형에서 각기 다른 성장 시기에서 sodF 및 sodN mRNA 안정성의 측정. S. coelicolar 세포를 YEME 배지에서 0D₆₀₀의 0.2에서 1.0까지 배양하고, 특정의 0D₆₀₀에서 리팜피신(300μg/ml)로 처리하였다. 리팜피신 처리 후 5, 10, 15 및 20분에 세포를 수확하였고, 메탄올로 고정하였다. 이들의 RNA를 S1 맵핑으로 분석하였고, 비처리 시료에 상대적인 값으로 나타내었다. 0D₆₀₀ 0.24, 0.54 및 0.87 까지 배양한 세포로부터의 대표적인 결과를 보였다. (B) 지수 성장기 동안에서의 sodF 및 sodN mRNA(sodF/sodN)의 상대적 양에서의 변화를 회분 배양이 진행하면서 sodN mRNA의 반감기의 변화와 함께 그래프화하였다. sodF/sodN의 비율을 (A)에서 나타낸 바와 같이 특정한 성장기의 비처리 시료에서 각각의 mRNA-특이적인 밴드의 정량적인 양으로부터 얻었다.
도 8은 Nur-의존 sodF 및 sodN 의 역방향 조절에 대한 모델을 보인다. 이 모델은, 니켈-특이적인 Nur를 통하여 sodF 및 sodN 유전자의 길항적 조절을 가능하게 하는, 작은 가공된 sodF mRNA가 sodN mRNA의 전사 및 안정성을 음성적으로 조절하는 것을 설명한다. 니켈이 제한된 조건에서는, 니켈이 없는 Nur가 sodF 프로모터에 결합하는 능력을 잃어버린다. sodF 유전자의 전사 유도는 전장의 sodF mRNA를 만들도록 하고, 여기에서 19 nt의 항-sodN 서열을 포함하는 90 nt 길이의 3’UTR 조각이 절단되어 안정적인 작은 조절기능의 RNA(s-SodF)을 만든다. s-SodF RNA는 18 bp 까지 sodN mRNA의 5’-말단 조각과 완벽하게 베이스 페어링을 형성할 수 있다. 상기 베이스 페어링은 리보솜 결합을 배제시켜 전사를 억제할 수 있고, sodN mRNA의 분해를 촉진시킬 수 있어서, Ni-SOD의 생산을 빠르게 감소시킨다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정이 되는 것은 아니다.

균주 및 성장 조건

Streptomyces coelicolor A3 M145 균주 및 이의 유도체를 표준적인 절차에 따라 성장 및 유지시켰다(Kieser,T. (2000) Practical Streptomyces Genetics. John Innes Foundation, Norwich). 액체 배양을 위해서, YEME 배지(0.3% 이스트 익스트렉트, 0.3% 몰트 익스트렉트, 0.5% 펩톤, 1% 포도당, 10 또는 34% 수크로스, 5mM MgCl₂독립적으로 멸균됨)를 이용했다. 니켈 처리를 위해서 50μM NiSO₄를 시드 배양 접종시에 배지에 넣었다. Δnur, ΔsodF 및 ΔsodF2 균주는 이전에 제조되었다(Ahn,B.E., Cha,J., Lee,E.J., Han,A.R., Thompson,C.J. and Roe,J.H. (2006) Nur, a nickel-responsive regulator of the Fur family, regulates superoxide dismutases and nickel transport in Streptomyces coelicolor. Mol. Microbiol., 59, 1848?1858; Han,A.-R. (2007), MS thesis. Graduate School, Seoul National University, Seoul; Chung,H.J., Kim,E.J., Suh,B., Choi,J.H. and Roe,J.H. (1999)Duplicate genes for Fe-containing superoxide dismutase in Streptomyces coelicolor A3(2). Gene, 231, 87?93.).

s-SodF 대량생산 균주의 제조

sodF 다운스트림 분절(sodF 종결 코돈의 끝으로부터 +10 에서 +142nt)를 표 1의 프라이머쌍을 가지고 PCR를 이용하여 M145 염색체 DNA로부터 생산하였다. PCR 생산물을 오버랩핑 PCR로 강력한 ermE 프로모터를 포함하는 다른 240bp PCR 생산에 융합시켰다. 399bp의 최종 PCR 생산물을 EcoRI/XbaI 제한 효소로 자르고 티오스트렙톤(thiostrepton) 마커를 포함하는 삽입 벡터인 pSET162에 클론하였다. 재조합 플라스미드를 염기 서열 분석으로 확인하였고, ΔsodF 균주로 형질전환하였다. 음성 대조구로 모(母)벡터 pSET162를 ΔsodF에 도입하였다.

프라이머/ 프로브 명칭	서열 (5' - 3')	설명
ermE^*p-EcoR1_F	GTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCAGCCCGACCCGAGCA(서열번호 3)	forward primer for ermE^* promoter fragment
sodF-ermE^*p_R	GAAGACGATCACGAGGCGGGACGACGTCAGATCCTCCCCGCACCTCTCGC (서열번호 4)	sodF-ermE^* fused primer for overlapping PCR
ermE-sodF* STOP+10_F	GCGAGAGGTGCGGGGAGGATCTGACGTCGTCCCGCCTCGTGATCGTCTTC (서열번호 5)	ermE^-sodF* fused primer for overlapping PCR
sodF STOP+142-XbaI_R	TCTACGAGATCAAGCGGACCCTCTAGAAGGGCCCGGACTTCAGCAACCTG (서열번호 6)	reverse primer for s-SodF overlapping PCR
sodN S1_F	CTCGGTCTCCTGCGACAGTTGCTC (서열번호 7)	forward primer for sodN S1 probe
sodN S1_R	CATCTTCTCCTGGACGGCCTTCAC (서열번호 8)	reverse primer for sodN S1 probe
sodF STOP-140_F	AGCACGCCTTCTACCTGC (서열번호 9)	forward primer for construction of pGEM-sodF200
sodF STOP+60_R	CATTCCGCCCGCCCGGTGAAGG (서열번호 10)	reverse primer for construction of pGEM-sodF200 and S1 probe to detect sodF and s-sodF
sodF STOP-205_F	GATCTACGACCACCAGGGCAAC (서열번호 11)	forward primer for construction of pGEM-sodF346
sodF STOP+78_R	CCTCGCGGGGGCCTTCCTCA (서열번호 12)	reverse primer for construction of pGEM-sodF346 and 5' end mapping of s-SodF
sodF 5' RACE	GTTGATCGAGCCCCACGTCT (서열번호 13)	sodF gene specific primer for 5' RACE
sodN 5' RACE	CTGCTCCTTGATGACCGTGG (서열번호 14)	sodN gene specific primer for 5' RACE
5' RACE Outer Primer	GCTGATGGCGATGAATGAACACTG (서열번호 15)	adaptor specific primer for 5' RACE outer PCR
5' RACE Inner Primer	CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG (서열번호 16)	adaptor specific primer for 5' RACE inner PCR
s-SodF_22nt	GTTGAGAAGACGATCACGAGGC (서열번호 17)	Northern probe to detect s-sodF
anti-sodN_V1_F	CCCGCCTCGTGATCGTACCACACACCTTCACCGGGCGGG (서열번호 18)	forward primer for V1 variant
anti-sodN_V1_R	CCCGCCCGGTGAAGGTGTGTGGTACGATCACGAGGCGGG (서열번호 19)	reverse primer for V1 variant
anti-sodN_V2_F	TCGTCCCGCCTCGCTCCATCCTTCTCAACCTTC (서열번호 20)	forward primer for V2 variant
anti-sodN_V2_R	GAAGGTTGAGAAGGATGGAGCGAGGCGGGACGA (서열번호 21)	reverse primer for V2 variant

S1 맵핑 및 노던 분석

RNA를 야생 균주(M145)로부터 분리하였고, 여러 돌연변이 세포를 YEME에서 0.2에서 1.5 OD₆₀₀으로 길렀다. 수확된 세포를 20%의 최대 증폭(600W, 20kHz)에서 마이크로팁으로 초음파처리기를 사용하여 변형된 Kirby 혼합물에서 분쇄하였다. 페놀/클로로포름으로 추출을 한 후, 상층액을 이소프로판올로 침강시켰다. 상기 RNA 펠렛을 다이에틸파이로카보네이트-처리 증류수로 용해하고, 260nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. rRNA를 시각화하고 게놈 DNA에 의한 오염을 확인하기 위해서, RNA 시료를(각 10μg) 3-(N-모르포리노)프로판설포닉산 완충용액에서 1.3% 아가로스 젤에서 전기영동시켰다. S1 맵핑을 위해서, sodN 및 sodF 전사체를 위한 DNA 프로브를 M145 염색체 DNA를 주형으로 사용한 PCR를 수행하여 제조하였다. PCR에 의해 생성된 sodN 프로브는 sodN 코딩 지역의 개시코돈에 관련된 -175에서 +127nt까지 해당되었다. sodF RNA를 위한 S1 프로브를 제조하기 위해서, PCR 생성 sodF 분절(sodF 종결 코돈의 끝과 관련된 -140 에서 +60 nt까지 및 -205에서 +141nt까지)을 pGEM-T이지 벡터(Promega)에 각각 클론하여 pGEM-sodF200 및 pGEM-sodF346를 제조하였다. pGEM-sodF200으로부터, 프로브 DNA를 T7 포워드 프라이머 및 sodF(+60) 리버스 프라이머를 이용한 이차 PCR로 제조하여, 78bp의 벡터 서열에 연결된 sodF 유전자(-140에서 +60까지)를 포함하는 278-bp의 DNA 분절을 만들었다(도 1). pGEM-sodF346으로부터, 프로브 DNA를 SP6 포워드 프라이머 및 sodF(+78) 리버스 프라이머(표 1)을 이용한 PCR로 제조하여, 100bp의 벡터 서열에 연결된 sodF 유전자(-205에서 +78)을 포함하는 383 bp DNA 분절을 만들었다. 이들 DNA 프로브들을 T4 폴리뉴클레오타이드 카이네이즈로 [γ-³²P]-ATP로 5’-말단을 라디오 레이블링 하였다. 각각의 RNA 시료(25μg), 프로브 DNA를 하이브리다이즈 하고, 표준적인 절차에 따라서 S1 뉴클리아제로 다이제스트 시켰다. sodF RNA의 3’-맵핑을 위해서, 상기 프로브를 T7 및 SP6 프라이머를 이용한, 주형으로 pGEM-sodF346으로부터 PCR로 생산하였다. sodF 유전자(+21 에서 +141까지) 및 78 bp의 벡터 서열을 포함하는 BssSI-절단 PCR 산물(199bp)을 [γ-³²P]-dATP로 레이블링 하였다. 보호되는 분절을 7M 우리아를 포함하는 6% 폴리아크릴아마이드 겔에서 분석하였다. 높은 해상도의 S1 맵핑을 위해서, 서열 래더를[α-³⁵S]-dATP를 가지는 레이블링 믹스내의 sodF(+78) 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 pGEM-sodF346 DNA 주형을 사용하여 제조자에 의해 추천되는 것처럼 세쿠에나아제 버전 2.0(USB corporation)을 이용하여 제조하였다. sodF RNA의 노던 분석을 위하여, 22-nt 사일-사슬 DNA 프로브(sodF 종결 코돈의 끝에 관련된 +18 에서 +39 nt)을 합성하였고, T4 폴리뉴클레오타이드 카이네이즈로 [γ-³²P]-ATP로 레이블링 하였다. 각각 시료의 70μg 전체 RNA를 7M 우리아를 포함하는 12.5% 폴리아크릴아마이드 젤에서 분석하였고, Zetaprobe-GT-막(Bio-Rad)로 옮겨졌다. 방사 활성 신호를 포스포어 스크린 및 이미지 분석기(FLA-2000, Fuji)로 관찰 및 정량하였다.

5’-RACE

cDNA 말단의5’-고속 증폭(rapid amplification of cDNA ends; RACE)를 세균성 RNA에 대한 수정이 반영된 제조자의 지시에 따라서, FirstChoice RLM-RACE 키트(Ambion)을 사용하여 수행하였다. 간략하게는, S. coelicolor M145로부터 추출된 10μg의 전체 DNA을 T4 RNA 리가아제를 이용하여 5’-RACE 어답터에 연결되기 전에 담배산 파이로포스파타아제(tobacco acid pyrophosphatase; TAP)로 처리하였다. 상기 연결된 산물을 SuperScript^TM III 리버스 트랜스크립타아제(Invitrogen)와 함께 sodF 및 sodN에 상보적인 프라이머를 사용하는 역전사를 위한 주형으로 사용하였다. 생산된 cDNA는 어답터-특이적 외부의(outer) 프라이머(표 1) 및 같은 어답터 및 RNA를 위한 한 쌍의 내부의(inner) 프라이머를 사용하는 5-말단 PCR 증폭을 위한 주형으로 사용하였고, 같은 프라이머가 역전사 반응에 프라이머로 사용하였다. 2차 PCR을 각각 어답터 및 RNA에 특이적인 한 쌍의 내부의 프라이머로 수행하였다. 최종의 PCR산물을 아가로스 젤에서 분리하였고, 잘라진 후 Qiagen 젤 추출 키트를 이용하여 분리하여, 서열분석 하였다.

RNA의 엑소뉴클리아제 다이제스쳔

RNA 시료를 YEME에서 지수적으로 성장하는 야생형 타입 및 Δnur 세포로부터 준비하였다. TAP 및 터미네이터 5’-포스파타아제-의존 엑소뉴클리아제(5’-exo)에 의한 RNA 시료의 처리는 이전에 기술된 것처럼 수행하였다. 전체 RNA(각각의 시료당 5mg)을 37℃에서 3시간 동안1㎕ 의 10x TAP 반응 완충용액(0.5M 소디움 아세테이트, pH 6.0, 10mM 에틸렌디아민테트라아세트산, 1% β-머캅토에탄올, 0.1% Triton X-100), 0.5 ml 의 TAP(5 m; Epicentre) 또는 물,및 1 ml의 RNasin (40 m;Promega)을 포함하는 10㎕ 반응 부피에서 항온반응시켰다. 반응 혼합물을 페놀/클로로포름으로 추출하고, RNA를 에탄올로 침전시켰다. 터미네이터 엑소뉴클리아제(Epicenter)에 의한 추가의 다이제스쳔은 30℃에서 3시간 2㎕의 10x 반응 완충용액 (500mM Tris Cl, pH 8.0, 20mM MgCl₂, 1MNaCl), 1 ㎕의 RNasin(40 U; Promega) 및 1 ㎕의 터미네이터 엑소뉴클리아제(1 U; Epicentre) 또는 물을 포함하는 20㎕ 반응 부피에서 수행하였다. 반응물은 페놀/클로로포름으로 추출하였고, 글리코겐이 있는 조건에서 에탄올 침전시키고 상기 설명된 바와 같이 노던 블랏팅 분석을 하였다.

(실시예 1) sodF 및 sodN 유전자의 센스 사슬 사이의 상보성(complementarity)의 존재

sodN (SCO5254) 유전자 및 sodX (SCO5255) 유전자의 사이의 유전자간 지역(여기에서 SodX 가 SodN을 위한 동족 펩티다아제를 암호화하고 있음)이 스트렙토마이세스(Streptomycetes) 사이에서 매우 보존되어 있다). 이 보존된 지역내의 19-bp 서열 스트레치가 sodF 유전자의 다운스트림에서도 나타난다. 이 19-nt 스트레치는 sodF 및 sodN 유전자의 센스 사슬 사이에서 상보적이다(도 1). S. coelicolor Muller에서 이전에 지도화된 각각의 sodF 및 sodN mRNA의 3’- 및 5’-말단은 사이에 상당한 양의 상보적인 서열은 실제로 본 발명에 사용된 S. coelicolor A3(2)M145에서 sodF의 3’ UTR 및 sodN의 5’ UTR 전사체 사이에 염기쌍을 형성할 것이라는 것을 가정하게 하였다. RACE를 통하여 S. coelicolor에서 sodN mRNA의 5’-말단을 결정하였고, Muller 균주에서 결정된 것과 같이 같은 G 뉴클레오타이드에서 출발한다는 것을 알았다(도 1). 상보적인 염기쌍 지역은 sodN mRNA의 처음 18 nt에 걸쳐 있었고, 리보솜 결합 자리의 일부분을 포함하고 있었다(도 1). sodF 및 sodN 전사체 사이에 상보적인 염기쌍이 두 개 유전자의 반대방향으로의 조절을 담당하는지를 그리고, 만약에 그렇다면, 어떻게 그것이 조절되는지를 조사하였다.

안티-sodN 서열을 포함하는 작은 크기의 sodF RNA가 Nur-의존적인 방법으로 생산됨.

S. coelicolor Muller 균주에서의 이미 결정된 sodF mRNA의 5’ 및 3’-말단은 개시 코돈의 38 nt업스트림 및 종결 코톤의 86 nt 다운스트림에 각각 위치하고 있었다. M145에서 19 nt sodN-상보적인(안티-sodN) 서열은 sodF ORF 종결코돈의 말단에서 19nt(종결코돈의 말단에서 상대적으로 +19에서 +37)에서 시작하였다(도 1). sodF 다운스트림 지역으로부터 생성되는 전사체의 존재 및 경계를 모니터하기 위하여, S1 맵핑과 노던 분석을 수행하였다. S1 맵핑을 위하여 sodF 코딩 서열 부분 및 이의 다운스트림 지역(종결 코돈의 말단에서 상대적으로 -140 에서 +60, 도1)을 포함하는 5’-말단-레이블된 DNA 프로브를 사용하였다. 이 프로브는 두 종류의 RNA를 관찰하였다; 하나는 ~200nt(sodF)의 완전히 보호되는 밴드이고 다른 하나(s-SodF)는 50nt 밴드를 보호하는 것이었다(도 2A). 양 RNA의 양은 니켈이 배양에 첨가되고 Δnur 돌연변이에서 컨스티티튜티브한 방식으로 생산하였을 때 야생형(M145)에서 상당히 의미있는 수준으로 감소하였다. 길게 보호되는 전사체는 Fe-SOD를 암호화하는 sodF mRNA에 상응하는 것으로 보이고, 짧게 보호되는 RNA(s-SodF)는 sodF 코딩 서열이 부족하나 안티-sodN 서열을 포함할 수 있다.

S1 맵핑은 s-SodF RNA의 5’-말단점만을 관측할 수 있기 때문에, 이의 크기를 결정하기 위하여 노던 블랏 분석을 수행하였다. 안티-sodN 서열을 포함하는 22bp의 짧은 DNA 프로브를 이용하여, 작은 RNA들을 분석하기 위해 특이화된 12.5% 폴리아크릴아마이드 젤에서 약 90nt의 작은 RNA를 관측하였다(도 2B). 이 RNA의 양은 니켈의 존재에 의해서 감소하였고 Δnur 돌연변이체에서 컨스티튜티브하게 증가되어, S1 맵핑의 관측과 일관성이 있었다. S-SodF RNA의 양은 ΔsodF 돌연변이체에서 매우 감소하였다. 대조적으로 S. coelicolor에서의 sodF의 파라로그인 sodF2의 결실은 s-SodF의 생산에 영향을 주지 않았고, 이는 s-SodF RNA가 주로 sodF 유전자로부터 생산된다는 것을 제시한다. 노던 블랏 분석은 sodF 다운스트림 지역으로부터 생산되는 작은 RNA 종이 있다는 것을 분명하게 보여주고, s-SodF의 이름을 정당화한다. 이들 결과는 s-SodF RNA의 생산이 니켈 및 Nur에 의해 억제된다는 것을 보인다.

s-SodF RNA의 5’과 3’경계

s-SodF의 정확한 사이즈와 끝을 결정하기 위하여, 고해상도 S1 맵핑을 하였다. 5’- 말단 맵핑을 +78에서 레이블된 프로브로 수행하였다. 결과는 s-SodF의 5’-말단이 뉴클레오타이드 T및 C(종결코돈의 끝단으로 부터 상대적으로 +11 및 +12)에 위치하고, 안티-sodN 서열의 7-8 nt 업스트림에 있었다. 3’-말단 맵핑을 +21에 레이블된 프로브를 이용하여 수행하였다. 그러나 주형 DNA로부터의 서열결정 래더가 보호되는 밴드 사이즈에서 심하게 압축되기 때문에 정확한 3’-말단의 위치를 결정할 수 없었다. 이것은 3’-말단 근처에 안정한 2차구조가 있다는 것을 가르킨다. 3’RACE를 이용한 3’-말단 맵핑 역시 성공적이지 못하였다. 80%의 GC를 가진 15nt 스트레치의 역전된 반복서열의 존재는 안정적인 스템 및 루프 구조(ΔG˚=-34.5 kcal)을 제시하고, 이것은 뉴클레오타이드 서열 래더를 방해할 수 있다. 이러한 스템-루프 구조는 내재적인 전사 종결자로 역할을 할 수 있다. 이것은 ΔG값이 -15 및 -25 kcal 사이의 스템 및 루프, 두 개의 U 잔기 보다 적은 것이 뒤따르는 액티노박테리아에서 가장 널리 분포하는 형태의 종결자와 일치한다. 잠재적인 내재적인 종결자 서열의 존재와 결합하여 S1 맵핑 및 노던 분석에 의한 s-SodF의 추정된 크기로부터 s-SodF RNA의 3’ 경계가 +100 근처의 역전된 반복의 말단에 있는 것으로 추정하였고, s-SodF가 88-90 nt 길이를 가질 것으로 예상하였다(도 3B)

상기 90nt의 s-SodF RNA(+11 에서 +100; 도 3B)의 이차구조를 엠폴드(mfold) 프로그램을 이용하여 예측하였다. 도 3C는 s-SodF가 전체 ΔG˚값이 약 -59kcal인 두 개의 스템 루프가 있는 구조를 형성할 수 있음을 보인다. 5’-근처 스템-루프는 스템의 중간으로 시작하여 전체 루프에 걸치는 안티-sodN 서열을 가지고 있다. 이 스템-루프는 약 -22kcal의 예상된 ΔG˚를 가진 버블들과 하나의 벌지(bulge)을 포함하고 있었다. 예상된 구조는 sodN mRNA의 5’-말단은 루프 지역에 있는 안티-sodN 서열을 통하여 s-SodF와 쉽게 짝지음될 수 있다. 종결 스템-루프는 약 -36kcal의 예측된 ΔG˚을 가진 완벽하게 짝지어진 16 bp 스템(말단 G-U 염기쌍을 포함)을 가지고 있다.

s-SodF는 sodF mRNA의 가공으로부터 만들어짐.

s-SodF RNA가 Nur- 의존적인 방식으로 생산된다는 관측은 스몰 RNA의 개시 지점근처에 지놈에서 Nur 결합 서열의 존재 여부를 찾도록 하였다. 제시된 Nur-box 컨세서스(tTGCaa-N5-ttGCAA)와 맞는 어떤 서열도 발견되지 않았다. S1 맵핑 분석을 위해 사용된 200 bp을 가지는 DNA 프로브를 이용한 전기영동적 이동성 변이 분석(Electrophoretic mobility shift assay)는 Ni-보충된 YEME 배지에서 성장한 야생형 세포로부터 준비된 세포 추출물에서 어떤 결합 단백질도 찾지 못했다. 때문에 s-SodF 합성을 위한 자신의 Nur-의존성 프로모터로부터 전사가 일어날 가능성은 매우 낮았다.

s-SodF RNA의5’ 인산화 상태를 5’-인산-의존성 엑소뉴클리아제를 사용하여 관측하였다. 야생형(M145) 또는 Δnur 돌연변이체 세포로부터 분리된 야생형(M145) 또는 Δnur 돌연변이 세포로부터 분리한 전체 RNA을 이전에 기술한 방식으로 5’-단일인산 의존성 엑소뉴클리아제로 처리하였고, 12.5% PAGE를 걸고 노던 분석을 하였다. 도 4의 결과(상단 패널)는 5’ 엑소뉴클리아제가 23S 및 16S rRNA의 벌크에게 하는 것처럼(하단 패널) 효율적으로 s-SodF RNA를 효율적으로 분해하였다. 신생성(de novo) 전사된 세균 mRNA의 5’-삼인산으로부터 피로포스페이트를 제거하는 TAP로의 처리는 어떤 차이를 만들지 않았다. 때문에, s-SodF RNA의 5’-말단을 단일인산화된 것으로 보이고, 신생성(de novo) 전사에 의해서 생성된 것이 아니라 긴 RNA의 분해로부터 만들어진 것으로 보인다. 때문에 sodF mRNA는 코딩 지역 뿐만 아니라 안티-sodN 서열을 포함하는 다운스트림 UTR을 포함하고, s-SodF는 sodF mRNA로부터 5’쪽의 T(+11) 또는 C(+12) 잔기에서의 분해에 의해서 생겼을 가능성이 높다(도 3).

s-SodF RNA는 sodN mRNA의 안정성을 감소시킴.

s-SodF RNA가 sodN 유전자 발현에 영향을 주는지를 알아 보기로 하였다. 발명자들은 여러 유전적 배경에서 sodN mRNA의 반감기를 측정하였다. 성장 조건에 따라 sodN mRNA에 대한 sodF의 비율은 달랐다. 리팜피신에 의한 전사의 개시의 억제 후에 RNA의 붕괘 속도를 측정하였다. 세포를 YEME에서 0.8의 OD₆₀₀이 될 때까지 성장시킨 후 리팜피신(300mg/ml)을 처리하고 다른 시간에서(0-20분)에서 RNA를 준비하기 위해서 수확하였다. 각각의 시료에서 sodF mRNA, s-SodF 및 sodN mRNA의 S1 맵핑을 하나의 반응 튜브에서 RNA-특이적인 프로브를 사용하여 수행했다. 도 5에 보여진 바와 같이, 야생형 균주에서의 sodN mRNA는 ~3 분의 t1_/2의 속도로 붕괘되었다. sodF mRNA는 약 10분의 반감기로 붕괘되는 반면에, s-SodF RNA는 >> 20분 이상의 t_1/2값으로 상대적으로 안정적이었다. ΔsodF 돌연변이체에서는 어떤 sodF 전사체도 생산되지 않았고, sodN mRNA의 반감기는 16분으로 증가하였고, 이는 sodF 전사가 sodN mRNA의 안정성을 감소시킨다는 것을 제시한다. ΔsodF 돌연변이체에서 관찰된 잔류하는 sodF-크기의 밴드는 비특이적인 것으로 생각되고, pSET-유래 플라스미드로 도입된 돌연변이체에서는 관찰되지 않았다. s-SodF RNA 단독의 효과를 확인하기 위하여, 발명자들은 ΔsodF 돌연변이체에게 삽입 벡터 pSET162에서 발현이 강력한 ermE^*프로모터에 의해 이끌어지는 s-SodF RNA를 위한 하나의 과발현 플라스미드를 도입하였다. 도 5는 s-SodF RNA가 sodF mRNA의 부존재 상태에서 안정적으로 발현될 때, sodN mRNA의 반감기는 약 7분이었고, 이것은 ΔsodF에서 관찰된 ~16분 보다 상당히 짧았다. ΔsodF 에서 s-SodF RNA의 발현 수준은 야생형에서 보다 낮았기 때문에, sodN 반감기는 야생형의 수준(~3분)으로 내려가지 않았다고 생각된다. 이 실험은 s-SodF RNA 단독의 생산은 sodN mRNA의 양을 감소시키는데 충분하다는 것을 분명하게 보여준다. ΔsodF에서 s-SodF RNA의 발현 수준은 야생형에서의 수준보다 낮았기 때문에, sodN 반감기는 야생형의 수준(~3 분)에 까지 내려가지 않은 것으로 생각된다. 이 실험은 s-SodF RNA 단독으로 sodN mRNA의 양을 감소시키는데 충분하다는 것을 명확하게 보인다.

s-SodF 의 항-sodN 지역에서의 돌연변이가 이의 억제적 기능을 불활성화시킴.

s-SodF 내에서의 항-sodN 서열이 sodN mRNA의 양을 감소시키는데 정말로 결정적인지를 시험하기 위해서, 이 지역에서의 돌연변이를 제조하였다. 예상되는 7-뉴클레오타이드 루프 지역(V1) 및 그 다음 연속되는 7개 뉴클레오타이드(V2)에서 변이가 있는 변이체를 돌연변이 생성 프라이머를 이용하여 사이트 디렉티드 돌연변이화를 통하여 제조하였다(도 6). mFOLD에 의한 2차 구조 예측은 V1가 -59 kcal의 ΔG°값으로 야생형과 거의 동일한 구조를 가지고, V2가 -55 kcal의 ΔG°값으로 더 큰 루프와 비슷한 구조를 가질 것으로 보였다. 삽입벡터(pSET162)에서 돌연변이 s-SodF 유전자를 클론 하였고, 이들을 야생형 s-SodF를 위한 발현 구조체를 만드는 것과 같은 방법으로 S. coelicolor의 ΔsodF 균주의 염색체로 이들을 도입하였다(도 5 참조). 결과들은 s-SodF 야생형의 도입은 sodN mRNA의 수준을 어떤 s-SodF 유전자가 없는 대조 균주 것의 약 40%까지 감소시켰다. 다른 한편, s-SodF의 V1 및 V2 변이체는, 비록 이들이 야생형보다 더 높은 수준으로 발현되었지만, sodN mRNA의 수준에 영향을 주지 않았다(도 6B). V1 및 V2 s-SodF RNA의 수준은 야생형 수준 보다 각각 약 7배 및 3배 높은 수준이었다. 이 차별적인 발현이 도입된 플라스미드의 숫자 뿐만 아니라 RNA 안정성의 차이로부터 일어날 수 있다. 발명자들은 CCTCG 에서 AACAT로 항-sodN 서열에서 이의 최종 5개의 뉴클레오타이드가 변경된 또 다른 스템-변이체 돌연변이(V3)를 시험하였다. 그러나, 이 변이체는 이의 효과를 관찰하기에는 너무 낮게 발현이 되었고, 이는 스템에서 발생되는 중앙부 벌지로부터 예상되는 안정성에서 극적인 감소에서 기인할 것으로 가정된다. 이를 종합하면, 이들 실험은 s-SodF의 항-sodN 지역의 서열, 예상되는 루프를 포함하는 적어도 최초의 14개의 뉴클레오타이드가 s-SodF의 억제적 활성에 결정적이라는 것을 보인다.

sodN 및 sodF의 성장시기-의존적 길항적 발현

야생형 균주에서 sodN mRNA의 반감기를 측정하기 위하여 노력할 때, 과량의 변이를 경험하였다. 곧 우리는 sodN mRNA의 양이 감소하고, 반면에 세포 성장이 지수적 성장기의 초기에서 늦은 단계로 진행될 때 sodF RNA는 증가하는 것을 발견하였다. 초기의 지수적 성장기(OD₆₀₀< 0.5)에서, sodN RNA는 sodF RNA 보다 더 우세하였고, 여기에서 상대적인 양은 늦은 성장기에서 역전되었다. 발명자들은 다음으로 리팜피신 체이스 실험에 의해 다른 OD에서 sodN mRNA의 반감기를 측정하였다. 대표적인 결과를 도 7에 보였다. 도 7은 성장의 늦은 기에서, sodF RNA의 양이 증가하는 곳에서 sodN mRNA의 반감기는 짧아졌다. sodF mRNA에 대한 sodN mRNA의 상대적인 양과 함께, 지수적 성장기에서 성장이 진행됨에 따라 sodN mRNA 반감기에서의 변화를 도식으로 나타냈다. 도 7B에서의 결과는 sodF 전사체가 sodN mRNA의 안정성을 떨어뜨린다는 제안과 잘 일치하였다.

기능적인 RNA로부터 생산된 작은 조절 RNA는 길항적으로 관련된 유전자의 발현을 억제

여러 가지의 조절기능을 수행하는 비-코딩 RNA의 리스트는 계속적으로 증가하고 있다(Waters,L.S. and Storz,G. (2009) Regulatory RNAs in bacteria. Cell, 136, 615-628.; Storz,G., Vogel,J. and Wassarman,K.M. (2011) Regulation by small RNAs in bacteria: expanding frontiers. Mol. Cell, 43, 880-891). 많은 경우에 있어서, 특히 그람-음성 세균에서 이들 sRNA는 단일 또는 여러 유전자의 발현을 조절하기 위해서 RNA-결합 모듈레이터 Hfg와 함께 기능하고, 넓은 특이성(specificity)를 보인다. 시아노박테리아 및 데이노코사이(deinococci)와 함께 액티노마이세테스, 높은 GC양을 가진 그람-양성균은 어떤 분명한 Hfq-상동성체(homologue)을 가지고 있지 않다. 실험적 확인과 분리된 작은 RNA의 클로닝, RNA의 지놈 스케일의 딥시퀀싱과 함께 생물정보학을 통해 꽤 많은 작은 RNA가 액티노마이세테스(주로 스트렙토마이세테스 및 마이코박테리아)에서 발견이 되었다. 비록 성장 시기 및 분화와 어떤 관련성이 보여졌지만, 액티노마이세티스로부터의 작은 RNA의 직접적 타겟 및 생리적기능에 대해서는 매우 제한적인 샘플에서만 발견되었다. 이것은 기능적인 작은 RNA을 동정하는 것 뿐만 아니라 높은 GC 양을 가진 지놈을 가진 박테리아에서 그들의 생리적인 타겟을 확인하거나 예상하는 것의 어려운 점 때문이다. 시퀴언스 컴플리먼터리티(sequence complementarity)에 기초하여, 기능성 mRNA 3'UTR의 잘라진 생산물인 독특한 트랜스-활성 작은 RNA을 알아냈고, 이것이 다른 mRNA를 분해시키고 전사를 억제해, 결과적으로 길항작용을 일으킬 수 있다는 것을 알아냈다. 도 8에 도시된 모델은 sodF와 sodN 유전자 발현의 길항적 조절 기작을 요약하였다. 이 모델에 따르면, 회분(batch) 배양에서 성장후반기에서 나타나는 니켈이 제한된 조건에서, 공동억제자인 니켈이 없는 Nur는 sodF 프로모터를 겹치는 Nur-공통(Nur-box) 서열에 대한 친화도를 잃는다. sodF 유전자의 전사 유도는 전장(full-length)의 sodF mRNA를 생산하고, 이로부터 19 nt의 항-sodN 서열을 포함하고 있는 90 nt 길이의 3'UTR 부분이 잘려져 안정적인 작은 조절기능의 RNA(s-SodF)로 작용한다. 이 s-SodF RNA는 18bp 까지 sodN mRNA의 5'-터미널 부분과 완벽한 베이스 페어링을 할 수 있다. 이 베이스 페어링은 sodN mRNA의 분해를 촉진하고 리보솜 결합을 막음으로서 전사를 억제할 것이고, 이는 Ni-SOD의 생산의 빠른 감소를 가져온다. 이와 같은 방식으로, 세포는 비-니켈 효소(Fe-SOD)를 생산할 수 있고 니켈을 요구하는 효소(Ni-SOD)의 합성을 빠르게 중지시킬 수 있다.

s-SodF RNA의 구조 및 가능한 조절 기작

이제까지 발견된 작은 비-암호화 RNA들은 그들 자신의 프로모터로부터 터미네이터까지 독립적인 단위로 전사되었다. 어떤 경우에는 전사된 작은 RNA가 더 가공되어 보다 더 안정 및/또는 기능적인 형태가 되었다. 최근에 Salmonella 에서 Hfp-결합 작은 RNA의 딥시퀀싱(deep sequencing)은 이들 중의 상당한 부분이 전사되는 유전자의 3’UTR(코딩 지역의 다운스트림)으로부터 생산된다는 것을 보였다. 이것은 코딩 지역의 mRNA와 평행적으로 전사되거나 존재하고 있던 RNA로부터 가공된 sRNA의 발견 가능성을 높였다. Salmonella에서의 하나의 특성적인 예에서, DapZ가 라이신 생합성 효소를 암호화 하는 dapB 암호화 지역의 다운스트림에 위치하는 자신의 프로모터로부터 전사되었다. DapZ small RNA 발현은 dapB 발현과 독립적이고, ABC 트랜스포터를 암호화하는 적어도 두 개의 mRNA를 전사하도록 한다. 몇몇의 sRNA가 프로모터가 없고, 5’-모노포스페이트 말단이 없는 것으로부터 기존에 존재하는 mRNA로부터 전사되었을 것이라고 제안되었다. 그러나, 코딩 지역에서의 모든 절단은 모(母)된 mRNA를 불활성화 시킨다. 현재 s-SodF RNA가 지금까지 알고 있는 지식으로서는 이의 상응하는 암호화 서열에 영향을 주지 않으면서 가공된 3’UTR 산물로써 생산되는 것이다. s-SodF RNA의 예상되는 2차 구조(도 3C)는 두 개의 스템-루프, 항-sodN 서열을 가진 5’에 근접한 구조 및 터미네이션 스템 루프를 보인다. 항-sodN 서열은 sodN mRNA의 5’말단 잔기와 페어링할 수 있는 루프 지역에 위치하는 방식으로 존재한다. 때문에, s-SodF와 sodN mRNA사이의 시드(seed) 페어링은 이 단일-가닥 루프 지역을 통해 일어날 것이라고 생각할 수 있다. 나머지 컴플리먼트 서열이 있는 스템 지역은 쉽게 쪼개져서 sodN mRNA와 수소결합을 하는 버블을 가진 상대적으로 약한 베이스 페어링으로 구성되어 있다. 예상되는 루프 지역(V1) 및 이에 뒤따르는 스템 지역(V2)에서의 서열 변화에 의해 억제 활성이 소실되는 것은 적어도 14bp에서의 베이스 페어링이 s-SodF의 억제적 기능을 위해서 필요하다는 것을 예상하게 한다(도 6참조). 두 분자 사이의 베이스 페어링이 어떤 RNA-결합 단백질 모듈레이터가 필요한지 여부는 추가의 연구가 필요하다. S. coelicolor에서, 트랜스-활성small RNA(scr5239)와 이의 타겟(아가라아제를 암호화 하는 dagA mRNA)의 상호작용이 보고 되었고, 여기에서 하나의 베이스 페어링이 1 개의 벌지(bulge)를 가진 17 nt 길이의 부근의 완벽한 매칭이 관여하는 것으로 제안되었다. 75% 이상의 GC양을 가진 RNA에 대해서는, sRNA와 mRNA 사이의 엄격한 베이스 페어링이 낮은 ΔG 값을 가진 전반적인 분자내부간 이차 구조와 경쟁하기 위해서 필요할 것이다. 지놈에서 상대적으로 긴 컴플리먼터리 서열 스트레치에 대한 탐색은 sRNA의 가능한 상호작용 파트너를 발견할 가능성을 높인다. s-SodF RNA 가공 및 sodN mRNA를 분해하는 RNase에 대한 추가의 연구가 필요하다.

비슷한 조절의 발생 예상

공중의 지놈 데이터베이스에서, 여러 그룹의 박테리아가 sodN과 sodF 유전자를 가지고 있는 것으로 예상되었다. 이것은 대부분의 Streptomyces spp., 얼마정도의 액티노마이세테스, 시아노박테리아, 글라미디애, 플란크토마이세테스, 감마-, 델타- 및 알파-프로테오박테리아를 포함한다. 하나의 sodN 유전자를 가진 S. cattleya를 제외하고 지놈이 조사된 10개의 Streptomyces 종이 sodF 와 sodN 유전자의 센스 가닥 사이에 컴플리먼터리 서열을 보였다. 이들은 sodF 3’ UTR과 sodN 5’ UTR 사이에 16 내지19nt 범위의 컴플리먼터리티(complementarity)를 보였다. 이들 다른 스트렙토마이세스가 비슷한 s-SodF RNA를 생산하고, S. coeilcolor와 같은 방식으로 sodN을 조절하는지는 연구해야 할 좋은 질문이다. 세 개의 Streptomyces spp.의 비-암호화 RNA들의 지놈-범위의 분석에서 S. coelicolor 에서 s-SodF RNA의 존재와 S. avermitilis 및 S. venesuelae에서 이의 상동성체(homolog)를 발견했다. 이것은 비슷한 조절이 이들 개체에서 일어날 가능성을 지지한다. S. bingchenggensis BCW-1에서, S. coelicolor에서와 같이 두 개의 sodF 유사 유전자가 존재한다. 그러나 S. coelicolor에서 기능적인 SodF 단백질을 암호화하는 두 개의 sodF 유전자(sodF 및 sodF2)와는 달리, S. bingchenggensis 에서는 단지 하나의 유전자(sodF; SBI_02504)가 기능적인 sodF를 암호화 하고, 억제적 기능을 수행할 수 없을 것으로 보이는 8nt의 매치되지 않는 퇴화된 항-sodN서열이 뒤따른다. 다른 한편 sodF2 유전자(SBI_01257)는 코딩 지역에 큰 인프레임(in-frame) 결실이 있으나, 상당히 좋은 항-sodN 서열을 유지하고 있다. 만약에 서열 결정하는데 잘못이 없다면, 이는 근접한 코딩 서열이 더 이상 기능적인 SodF를 생산하지 않는다 하여도 Streptomyces spp.의 진화를 통하여 s-SodF로의 조절 경로가 보전되었다는 것을 제시한다. 이 같은 형태의 3’UTR-생산 조절 small RNA를 이용하는 다른 유전자 짝 또는 레귤론(Regulon)이 있는지 여부에 대한 추가적인 생물정보학적 및 실험적 연구가 필요하다. 지놈내에서 멀리 떨어진 지역 사이의 컴플리먼터리티(complementarity)의 탐색(특히 3’ UTR 지역과 어디에 있든 먼 코딩 주변 지역과의 탐색)은 생산적인 힌트를 줄 것으로 보인다. 이것은 추정되는 타겟을 가진 조절 small RNA의 발굴을 촉진할 것이다.

동위효소(isoenzyme)과 길항적 단백질의 역방향 조절

Fe-포함 및 Ni-포함 효소의 동형단백질(isoform) 사이의 길항적 조절은 전례가 없는 것이 아니다. 육식동물에 서식하는 Helicobacter mustelae 에서는 Fe-포함 우레아제(UreA2B2)를 니켈-결핍 조건에서 생산한다. 이 경우에, 니켈-특이적 조절자 NikR이, ureA2B2 및 ureAB 전사를 각각 억제 및 활성화하는 두 개의 오페론을 조절한다. FeSOD 및 MnSOD 및 NiSOD와 같은 다른 금속을 포함한 이의 동위효소 사이의 역방향 조절의 존재는 주목할 만하다. SOD는 풍부한 단백질이고, 공기에 노출된 생명체에게는 중요하기 때문에, 특정 선호되는 금속의 가용성 및 산화적 조건에 대응할 때 길항적 조절은 세포의 경제적 이점이 된다. 토양에 서식하는 스트렙토마이세테스들에게, 호기성 토양 환경에서 풍부한 니켈은 니켈이 철 사용 전에 이용되도록 sodF가 억제되는 유전자 조절시스템의 진화를 가져왔을 것이다. 조건적 호기성 E.coli에서 혐기적 철-풍부 조건이 혐기적 조건에서는 SodB가 선호되고, 산소 또는 산화적 스트레스의 존재에서는 SodA가 유도되는 유전자 시스템을 진화시켰을 것이다.

Fur 패밀리 조절자에 의해 발휘되는 역방향 조절이 매개자로서 small RNA가 참여하는 것은 매우 흥미롭다. E. coli에서 Fur에 의한 RyhB-매개 조절, Pseudomonas에서 Fur에 의한 PrrF1/F2-매개 조절 및 B. subtilis에서 Fur에 의한 FsrA-매개 조절 모두 Fe- 대 비-Fe 단백질의 역방향 조절을 가능하게 한다. S. coelicolor에서 s-SodF의 발견은 Fur-패밀리 멤버에 의한 small RNA-연관 조절의 리스트를 추가한다. 이들 예들은 멀리 떨어진 박테리아에 걸쳐서 특정의 금속 보조인자를 가진 동위 효소의 조정된 합성에서 금속-특이적인 Fur-패밀리 조절자 및 small RNA에 의하여 중재되는 진화적으로 견고한 조절 회로의 존재를 지지한다.

<110> SNU R&DB Foundation <120> RNA molecule for controlling biological activity and methods of control of biological activity by using thereof <130> PN140002 <160> 21 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 37 <212> RNA <213> Streptomyces coelicolor <400> 1 gaaggccccc gcgaggacgu gacucgcggg ggccuuc 37 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> Streptomyces coelicolor <400> 2 gaaggccccc gcgaggacgt gactcgcggg ggccttc 37 <210> 3 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for ermE* promoter fragment <400> 3 gtaaaacgac ggccagtgaa ttcgagctcg gtaccagccc gacccgagca 50 <210> 4 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sodF-ermE* fused primer for overlapping PCR <400> 4 gaagacgatc acgaggcggg acgacgtcag atcctccccg cacctctcgc 50 <210> 5 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ermE*-sodF fused primer for overlapping PCR <400> 5 gcgagaggtg cggggaggat ctgacgtcgt cccgcctcgt gatcgtcttc 50 <210> 6 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for s-SodF overlapping PCR <400> 6 tctacgagat caagcggacc ctctagaagg gcccggactt cagcaacctg 50 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for sodN S1 probe <400> 7 ctcggtctcc tgcgacagtt gctc 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for sodN S1 probe <400> 8 catcttctcc tggacggcct tcac 24 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for construction of pGEM-sodF200 <400> 9 agcacgcctt ctacctgc 18 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for construction of pGEM-sodF200 and S1 probe to detect sodF and s-sodF <400> 10 cattccgccc gcccggtgaa gg 22 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for construction of pGEM-sodF346 <400> 11 gatctacgac caccagggca ac 22 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for construction of pGEM-sodF346 and 5' end mapping of s-SodF <400> 12 cctcgcgggg gccttcctca 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sodF gene specific primer for 5' RACE <400> 13 gttgatcgag ccccacgtct 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sodN gene specific primer for 5' RACE <400> 14 ctgctccttg atgaccgtgg 20 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adaptor specific primer for 5' RACE outer PCR <400> 15 gctgatggcg atgaatgaac actg 24 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adaptor specific primer for 5' RACE inner PCR <400> 16 cgcggatccg aacactgcgt ttgctggctt tgatg 35 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Northern probe to detect S-sodF <400> 17 gttgagaaga cgatcacgag gc 22 <210> 18 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for V1 variant <400> 18 cccgcctcgt gatcgtacca cacaccttca ccgggcggg 39 <210> 19 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for V1 variant <400> 19 cccgcccggt gaaggtgtgt ggtacgatca cgaggcggg 39 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for V2 variant <400> 20 tcgtcccgcc tcgctccatc cttctcaacc ttc 33 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for V2 variant <400> 21 gaaggttgag aaggatggag cgaggcggga cga 33

Claims

서열번호 1의 RNA 분자를 포함하는 생리활성 조절 물질.
제 1 항에 있어서, 상기 RNA 분자는 생리 활성 조절에 관계하는 목적 RNA와 결합할 수 있는 상보적 서열을 가지는 RNA 분자와 결합된 것을 특징으로 하는 생리활성 조절 물질.
제 1 항에 있어서, 상기 서열번호 1의 RNA분자는 헤어핀-루프 형태의 이차적 구조를 가지고 있는 것을 특징으로 하는 생리활성 조절 물질.
서열번호 1의 RNA 분자를 암호화 하는 DNA 서열.
제 4 항에 따른 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터.
제 5 항에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 세포.
제 6 항에 있어서, 상기 세포는 원핵세포인 것을 특징으로 하는 세포.
제 7 항에 있어서, 상기 세포는 방선균 세포인 것을 특징으로 하는 세포
서열번호 1의 RNA 분자와 생리 활성 조절에 관계하는 목적 RNA와 결합하는 단계;
상기 결합된 RNA 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및
상기 재조합된 벡터를 숙주 세포로 형질전환시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포의 생리 활성 조절 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 생리 활성 조절은 생리활성 억제 물질을 억제하여 생리활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 생리 활성 조절 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 생리 활성 조절은 생리활성 촉진물질을 억제하여 생리활성을 억제시키는 것을 특징으로 하는 생리 활성 조절 방법.
제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 원핵세포인 것을 특징으로 하는 생리 활성 조절 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 방선균인 것을 특징으로 하는 생리 활성 조절 방법.
서열번호 1의 RNA 분자와 임의의 안티센스 타입의 목적 RNA와 결합하는 단계;
상기 결합된 RNA 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및
상기 재조합된 벡터를 숙주 세포로 형질전환시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포의 목적 RNA의 기능 분석 방법.