KR20160053972A - 조직 생성물의 효소 처리 방법 - Google Patents

조직 생성물의 효소 처리 방법 Download PDF

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Abstract

조직 매트릭스의 처리 방법 및 상기 방법에 따라 생성되는 조직 매트릭스가 제공된다. 상기 방법은 조직 매트릭스를 단백질분해 효소로 처리하여, 요망되는 조직 매트릭스의 유연성을 생성하고/거나 조직 매트릭스의 면역원성을 조절하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 상기 방법은 적어도 하나의 콜라겐-함유 조직 매트릭스를 단백질분해 효소와 접촉시키는 단계가 적어도 하나의 콜라겐-함유 조직 매트릭스를 변경시켜, 조직 매트릭스에 대한 인간 면역 반응을 감소시키는지를 결정하기 위한 분석을 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 콜라겐 구조의 허용가능하지 않은 변경 없이, 요망되는 유연성을 생성하도록 조절되는 조건하에 알칼라제로 처리하는 단계를 포함할 수 있다.

Description

조직 생성물의 효소 처리 방법{METHOD FOR ENZYMATIC TREATMENT OF TISSUE PRODUCTS}
본 출원은 35 U.S.C. § 120 하에, 2013년 9월 5일에 출원되고, 본원에 전문이 참고로 포함되는 미국 출원 제14/019,274호의 부분계속출원이다.
본 개시내용은 조직 매트릭스, 더욱 특히 매트릭스를 단백질분해 효소로 처리함으로써 조직 매트릭스의 기계적 및/또는 생물학적 특성을 조절하는 방법에 관한 것이다.
이환되거나 또는 손상된 조직 및 기관을 재생하거나, 복구하거나 또는 그렇지 않으면 치료하기 위해, 다양한 조직-유도된 생성물이 사용된다. 그러한 생성물은 온전한 조직 이식편 및/또는 무세포 조직 또는 재구성된 무세포 조직(예를 들면, 세포 씨딩(seeding)과 함께 또는 세포 씨딩 없이, 피부, 장 또는 다른 조직 유래의 무세포 조직 매트릭스)을 포함할 수 있다. 그러한 생성물은 일반적으로 조직 공급원(즉, 기원한 동물 및 조직 유형) 및 조직 생성물을 생성하기 위해 사용되는 처리 변수에 의해 결정되는 기계적 특성을 가진다. 조직 생성물은 종종 수술응용 및/또는 조직 대체 또는 보강에 사용되기 때문에, 조직 생성물의 기계적인 특성은 중요하다. 예를 들면, 외과의는 일반적으로, 천연 조직과 같이 느껴지고/거나 수술 절차 동안 다루기 쉬운 조직을 선호한다. 그러나 일부 조직 생성물은 바람직하지 않게 강성이고/거나 부자연스러운 느낌을 가진다. 따라서, 더욱 바람직한 기계적 특성을 생성하기 위해 조직 생성물을 처리하는 방법이 제공된다.
또한, 체 내에 이식되는 경우, 외인성 물질로부터 유도된 조직 생성물(예를 들어, 다른 동물 또는 환자 유래의 조직 및 임의의 유형의 처리된 조직)은 수여자에서 염증성 또는 면역 반응을 유도할 수 있다. 일부 경우에, 과도한 면역 반응은 이식물이 바람직하지 않은 반흔 조직을 형성하게 하거나 이식 부위에서 조직의 적절한 재생을 방지하여, 유해할 수 있다. 따라서, 이식 시에 조직 생성물의 면역 반응을 감소시키거나 조절하기 위한 조직 생성물의 처리 방법이 제공된다.
특정 구현예에 따르면, 조직 매트릭스의 처리 방법이 제공된다. 상기 방법은 콜라겐-함유 조직 매트릭스를 선택하는 단계 및 조직 매트릭스를 조직 매트릭스에서 요망되는 수준의 유연성을 생성하기에 충분한 조건하에 단백질분해 효소와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 조직 매트릭스의 처리 방법이 제공된다. 상기 방법은 콜라겐-함유 무세포 조직 매트릭스를 선택하는 단계 및 조직 매트릭스를 조직 매트릭스에서 요망되는 수준의 유연성을 생성하고, 조직 매트릭스의 다공성을 증가시키기에 충분한 조건하에 단백질분해 효소와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 무세포 조직 매트릭스가 제공된다. 매트릭스는 무세포 조직 매트릭스를 선택하는 단계 및 조직 매트릭스를 조직 매트릭스에서 요망되는 수준의 유연성을 생성하기에 충분한 조건하에 단백질분해 효소와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
특정 구현예에 따르면, 조직 매트릭스의 처리 방법이 제공된다. 상기 방법은 적어도 하나의 콜라겐-함유 조직 매트릭스를 선택하는 단계; 적어도 하나의 콜라겐-함유 조직 매트릭스를 단백질분해 효소와 접촉시키는 단계; 및 적어도 하나의 콜라겐-함유 조직 매트릭스를 적어도 하나의 단백질분해 효소와 접촉시키는 단계가 적어도 하나의 콜라겐-함유 조직 매트릭스를 변경시켜, 조직 매트릭스가 인간 체 내에 이식되는 경우 조직 매트릭스에 대한 인간 면역 반응을 감소시키는지를 결정하기 위한 분석을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
특정 구현예에 따르면, 조직 매트릭스의 처리 방법이 제공된다. 상기 방법은 진피 조직 매트릭스를 선택하는 단계; 및 진피 조직 매트릭스를 유의미한 콜라겐 분해를 생성하지 않고, 드레이프 시험(drape test)에 의해 결정시 요망되는 조직 매트릭스의 유연성의 증가를 생성하도록 선택된 알칼라제(alcalase) 활성을 갖는 용액에서의 인큐베이션 시간을 포함하는 조건하에 알칼라제와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.
특정 구현예에 따르면, 조직 매트릭스의 처리 방법이 제공된다. 상기 방법은 진피 조직 매트릭스를 선택하는 단계; 및 진피 조직 매트릭스를 알칼라제와 접촉시키는 단계; 및 조직 매트릭스를 방사선으로 처리하는 단계를 포함할 수 있으며, 알칼라제는 방사선으로의 처리 후에 요망되는 조직 매트릭스 유연성을 생성하도록 선택되는 조건하에 제공된다.
본 개시 내용에 따른 특정의 예시적인 구현예가 상세히 참고될 것이며, 그 중 특정 예는 첨부된 도면에 나타나 있다. 가능하다면, 도면을 통해 동일하거나 유사한 부분을 나타내기 위하여 동일한 참조 번호가 사용될 것이다.
본원에서, 특별히 다르게 진술하지 않는 한, 단수 사용은 복수를 포함한다. 본원에서, "또는"을 사용하는 것은 다르게 진술하지 않는 한, "및/또는"을 의미한다. 추가로, "포함하는"이라는 용어뿐만 아니라 "포함한다" 및 "포함된다"와 같은 다른 형태를 사용하는 것은 제한하는 것이 아니다. 본 명세서에 설명된 임의의 범위는 종점 및 종점 사이의 모든 값을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에 사용되는 섹션 제목은 조직적인 목적만을 위한 것이며, 설명되는 대상을 한정하는 것으로 간주되어서는 안된다. 특허, 특허 출원, 논문, 서적 및 협약을 포함하나, 이들에 제한되지 않는, 본원에 인용된 모든 문헌 또는 문헌의 일부는 임의의 목적을 위해 참고로 그들 전문이 명시적으로 본 명세서에 포함된다.
본 명세서에 사용되는 "조직 생성물"은 세포외 매트릭스 단백질을 함유하는 임의의 인간 또는 동물 조직을 지칭할 것이다. "조직 생성물"은 무세포 또는 부분 무세포화된(decellularized) 조직 매트릭스, 외인성 세포로 재증식된 무세포화된 조직 매트릭스 및/또는 세포 조직을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "조직 매트릭스"는 주어진 조직에 대한 콜라겐을 포함하는 세포외 매트릭스를 말하며, 여기서, 매트릭스는 그것이 유도되는 조직 유래의 고유 세포외 매트릭스의 상호연결된 구조적 콜라겐 매트릭스 특징을 보유한다. "무세포 조직 매트릭스"는 고유 조직 세포가 제거된 "조직 매트릭스"를 말한다.
다양한 인간 및 동물 조직을 사용하여, 환자를 치료하기 위한 생성물을 생성할 수 있다. 예를 들면, 다양한 질병 및/또는 구조적 손상(예를 들면, 외상, 수술, 위축 및/또는 장시간 마모 및 퇴화)으로 인해 손상 또는 손실된 인간 조직을 재생, 복구, 확대, 강화 및/또는 치료하기 위한 다양한 조직 생성물이 생성되어 왔다. 그러한 생성물은 예를 들면, 무세포 조직 매트릭스, 조직 동종이식편 또는 이종이식편, 및/또는 재구성된 조직(즉, 생존가능한 물질을 생성하기 위해 세포가 씨딩된 적어도 부분적으로 무세포화된 조직)을 포함할 수 있다.
수술 응용을 위해, 특정 기계적 특성을 갖는 조직 생성물을 생성하는 것이 종종 바람직하다. 예를 들면, 물질의 시트를 포함할 수 있는 조직 생성물은 의도된 용도의 요구를 견디기에 충분한 강도를 가져야 한다. 특정 조직 생성물은 결함(예를 들면, 탈장)을 복구하기 위해, 주위 조직 또는 이식물(예를 들면, 유방 확대 및/또는 재구성용)을 지지하기 위해, 또는 손상된 또는 손실된 조직(예를 들면, 외상 또는 수술 절제 후)을 대체하기 위해 사용될 수 있다. 특정 용도가 무엇이든지, 조직 생성물은 조직 재생 및/또는 복구가 일어날 때까지 기능하기에 충분한 강도, 탄성 및/또는 다른 기계적 특성을 가져야 한다.
또한, 조직 생성물은 바람직한 느낌을 가져야 한다. 예를 들면, 외과의는 일반적으로 천연 조직-유사 느낌(예를 들면, 충분히 부드럽고, 유연하고/거나 탄성임)을 갖는 물질을 선호한다. 추가로, 이식 후, 조직 생성물이 자연스럽게 느껴지도록 하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 유방 확대에 사용된 조직은 이식 시에 그들이 자연스러운 느낌의 유방을 생성하도록 과도하게 강성이 아니어야 한다.
그러나 일부 조직 생성물은 일부 응용을 위해 과도하게 강성일 수 있다. 예를 들면, 일부 외과의는 STRATTICE™와 같은 돼지-유도된 진피 물질이 ALLODERM®와 같은 인간-진피 생성물보다 덜 유연하다고 언급한다. 그러나 그러한 생성물의 느낌을 개선시키기 위한 방법은 생성물의 생물학적 및/또는 기계적 특성에 불리하게 영향을 미치지 않아야 한다. 구체적으로, 생성물의 느낌을 개선시키기 위한 생성물의 처리는 인장 강도와 같은 다른 기계적 특성을 바람직하지 않게 감소시키지 않아야 하며, 물질이 조직 재생 및/또는 복구를 지지하지 않는 방식으로 단백질 매트릭스를 변경하지 않아야 한다.
본 개시내용은 조직으로부터 생성된 조직 생성물의 느낌을 조절하기 위해 조직을 처리하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한, 상기 처리 방법을 사용하여 생성된 조직 생성물도 제공한다. 또한, 본 개시내용은 조직으로부터 생성된 조직 생성물의 다공성을 조절하기 위해 조직을 처리하는 방법을 제공한다. 일부 경우, 다공성을 조절하면, 세포 침투 및 조직 재생 및/또는 복구를 개선시킬 수 있다.
또한, 본 개시내용은 체 내에 이식되는 경우, 조직 매트릭스에 대한 면역 반응을 조절하거나 감소시키는 방법을 제공한다. 면역 반응은 단핵구 활성화 분석, 식세포작용 분석 및/또는 산화 버스트(oxidative burst) 분석을 포함하는 수많은 면역분석을 사용하여 측정될 수 있다. 또한, 조직의 느낌을 개선시키고/거나 조직의 기계적 특성(본 명세서에 열거된 임의의 기계적 특성 포함)을 조절하고/거나 조직의 다공성을 조절하기 위하여 조직을 처리하면서 면역원성이 조절될 수 있다. 조직 매트릭스의 처리 후에, 매트릭스를 분석으로 처리하여, 조직의 면역원성이 바람직한 방식으로 변경되는지를 결정할 수 있다.
특정 구현예에 따르면, 조직 매트릭스의 처리 방법이 제공된다. 상기 방법은 진피 조직 매트릭스를 선택하는 단계; 및 진피 조직 매트릭스를 유의미한 콜라겐 분해를 생성하지 않고, 드레이프 시험에 의해 결정시 요망되는 조직 매트릭스의 유연성의 증가를 생성하도록 선택된 알칼라제 활성을 갖는 용액에서의 인큐베이션 시간을 포함하는 조건하에 알칼라제와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 효소 처리 조건은 요망되는 드레이프 값의 감소를 제공하도록 선택된다. 본 명세서에 사용되는 "드레이프 시험"은 직경이 알려져 있는 원형 페데스탈(pedestal)의 상측에 원형 면적이 알려져 있는 조직 매트릭스의 샘플을 배치(드레이핑)하는 것을 포함한다. 진피 매트릭스가 페데스탈 위에 드레이프된 후에 진피 매트릭스의 투영된 면적을 조직 매트릭스 원형의 원래 면적으로 나누어 드레이프 값을 결정한다. 이들 2개의 면적을 나누기 전에 페데스탈의 면적을 디스크의 원래 면적 및 드레이핑된 면적으로부터 감하여 드레이프를 결정하는 것을 주의한다. 보다 낮은 드레이프의 값은 보다 부드러운(보다 드레이프성인) 물질을 의미한다.
특정 구현예에서, 효소는 알칼라제이며, 처리 조건은 60 ㎜ 직경 조직 매트릭스 샘플 및 19 ㎜ 페데스탈을 사용하여 10 내지 90%, 20 내지 80%, 30 내지 70%, 40 내지 60% 또는 약 50%(예를 들어, 45 내지 55%) 또는 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60% 또는 적어도 70%의 드레이프 값의 감소를 생성하도록 선택된다. 추가로, 일부 구현예에서, 조건은 진피 무세포 조직에 대하여 0.2 내지 0.4 또는 0.25 내지 0.35 또는 0.4 미만, 0.35 미만, 0.3 미만 또는 0.2 미만의 드레이프 값을 생성하도록 선택된다.
다양한 인자가 최종 드레이프 값에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 조직 유연성에 대한 영향을 조절하기 위하여 달라질 수 있는 인자는 예를 들어, 온도, pH, 사용되는 용액 또는 완충제, 효소 농도, 사용되는 알칼라제의 특정 유형, 조직의 양에 비한 용액의 양 및/또는 용액 중 효소의 억제제의 존재를 포함할 수 있다.
하기에 더욱 상세히 논의된 바와 같이, 알칼라제는 진피 조직 매트릭스의 처리에 있어서 수많은 이익을 갖는 것으로 관찰되었다. 예를 들어, 상대적으로 적은 인큐베이션 시간 및 효소 활성에서, 알칼라제는 콜라겐 구조의 허용가능하지 않은 변경 또는 다른 조직 특성, 예를 들어, 인장 강도, 탄성, 인열 강도, 봉합 강도, 크리프 저항성, 파열 강도(burst strength), 열 전이 온도, 콜라게나제 감수성 또는 그들의 조합의 악화를 야기하지 않고, 조직 유연성의 상당한 증가 및 조직 매트릭스 드레이프 시험의 개선을 제공(즉, 보다 드레이프성인 능력을 제공)하는 것으로 나타났다.
실시예 3에 상세히 논의된 바와 같이, 알칼라제로의 처리에 이어서 조사(예를 들어, 최종 멸균 단계로서)는 효소 처리 조건의 변이에 기초하여 조직 기계적 특성에 다양한 영향을 갖는 것으로 관찰되었다. 예를 들어, 상대적으로 낮은 효소 농도 및 처리 시간에 이어서 조사를 사용하여, 생성된 조직은 조직 유연성의 초기의 증가가 예를 들어, 도 11에 나타낸 바와 같이, 특정 지점에서 피크에 달한다. 추가의 알칼라제 처리(예를 들어, 보다 긴 처리 시간 동안 또는 보다 큰 효소 활성 사용)와 함께, 이후의 조사에 의해, 유연성의 소실이 야기된다. 따라서, 일부 구현예에서, 상기 방법은 진피 조직 매트릭스를 선택하는 단계; 및 진피 조직 매트릭스를 알칼라제와 접촉시키는 단계; 및 조직 매트릭스를 방사선으로 처리하는 단계를 포함할 수 있으며, 알칼라제는 방사선으로의 처리 후에 요망되는 조직 매트릭스 유연성을 생성하도록 선택되는 조건하에 제공된다.
생체 내에서 이식된 세포외 매트릭스의 안정성을 유지하기 위하여, 처리 동안 콜라겐 안정성을 유지하는 것이 바람직하다. DSC에 의한 콜라겐 변성 개시 온도 및 콜라게나제 효소로의 처리 동안의 중량 감소는 콜라겐 안정성의 지표이다. 본 명세서에 사용되는 "조직 콜라겐 구조의 허용가능하지 않은 분해"는 1℃ 초과, 2℃ 초과, 3℃ 초과 또는 4℃ 초과 또는 5℃ 초과의 DSC 콜라겐 변성 개시 온도의 변화를 의미한다.
다양한 알칼라제 활성 및 처리 시간이 사용될 수 있다. 알칼라제는 예를 들어, ㎖ 당 1×10-6 Anson 유닛 내지 ㎖ 당 0.015 Anson 유닛의 활성, ㎖ 당 1×10-6 유닛 내지 1.5×10-3 Anson 유닛의 활성 또는 ㎖ 당 약 2×10-5 Anson 유닛 내지 ㎖ 당 약 4×10-5 Anson 유닛의 활성으로 용액 중에 제공될 수 있다. 또한, 처리 시간은 약 4시간 내지 5일로 달라질 수 있다.
일 구현예에서, 조직 매트릭스의 처리 방법이 제공된다. 상기 방법은 콜라겐-함유 조직 매트릭스를 선택하는 단계 및 조직 매트릭스를 조직 매트릭스에서 요망되는 수준의 유연성을 생성하기에 충분한 조건하에 단백질분해 효소와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 조직 매트릭스를 처리하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 콜라겐-함유 무세포 조직 매트릭스를 선택하는 단계 및 조직 매트릭스를 조직 매트릭스에서 요망되는 수준의 유연성을 생성하고 조직 매트릭스의 다공성을 증가시키기에 충분한 조건하에 단백질분해 효소와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 도 1a 내지 도 1d는 본 개시내용의 방법을 사용하여 효소로 처리한 후의 무세포 조직 매트릭스(STRATTICE™) 및 미처리 대조군을 보여준다. 도시된 바와 같이, 처리된 샘플은 미처리 샘플보다 상당히 더 유연하다.
특정 구현예에 따르면, 조직 매트릭스의 처리 방법이 제공된다. 상기 방법은 적어도 하나의 콜라겐-함유 조직 매트릭스를 선택하는 단계; 적어도 하나의 콜라겐-함유 조직 매트릭스를 단백질분해 효소와 접촉시키는 단계; 및 적어도 하나의 콜라겐-함유 조직 매트릭스를 적어도 하나의 단백질분해 효소와 접촉시키는 단계가 적어도 하나의 콜라겐-함유 조직 매트릭스를 변경시켜, 조직 매트릭스가 인간 체 내에 이식되는 경우 조직 매트릭스에 대한 인간 면역 반응을 감소시키는지를 결정하기 위한 분석을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, 단백질분해 효소로 조직 매트릭스를 처리하면, 하나 이상의 생물학적 특성의 악화를 야기하지 않으면서 개선된 기계적 특성이 제공된다. 예를 들면, 조직 매트릭스의 처리는 염증 또는 반흔 형성의 증가를 야기하지 않고/거나 세포 성장 및 재생을 촉진시키는 조직 매트릭스의 능력의 감소를 야기하지 않고 요망되는 강성, 느낌, 촉감 특성 및/또는 요망되는 다공성을 생성할 수 있다.
조직 매트릭스는 다양한 상이한 생물학적 및 기계적 특성을 제공하도록 선택될 수 있다. 예를 들면, 무세포 조직 매트릭스 또는 다른 조직 생성물은, 조직 성장 및 리모델링이 매트릭스가 이식된 부위에서 보통 발견되는 조직의 재생을 돕도록, 선택될 수 있다. 예를 들면, 근막 위에 또는 근막 안으로 이식되는 경우 무세포 조직 매트릭스는, 과도한 섬유증 또는 반흔 형성 없이 근막을 재생시키도록 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 조직 생성물은 ALLODERM® 또는 STRATTICE™로부터 형성될 수 있으며, 이는 각각 인간 및 돼지 무세포 진피 매트릭스이다. 대안적으로, 이하에 추가로 설명되는 바와 같이, 다른 적당한 무세포 조직 매트릭스가 사용될 수 있다. 조직은 피부(진피 또는 전체 피부), 근막, 심막 조직, 경뇌막, 탯줄 조직, 태반 조직, 심장판막 조직, 인대 조직, 지방 조직, 힘줄 조직, 동맥 조직, 정맥 조직, 신경 연결 조직, 방광 조직, 요관 조직 및 장 조직을 포함하는 다양한 조직 공급원으로부터 선택될 수 있다. 본 명세서에 기술된 방법은 임의의 콜라겐 조직 유형을 처리하기 위해, 그리고 임의의 조직 매트릭스 생성물을 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 다수의 생물학적 스캐폴드 물질은 Badylak 등에 의해 설명되어 있으며, 본 개시내용의 방법은 당 분야에 공지된 상기 조직 생성물 또는 다른 조직 생성물을 처리하기 위해 사용될 수 있다. 문헌[Badylak et al., "Extracellular Matrix as a Biological Scaffold Material: Structure and Function," Acta Biomaterialia (2008), doi:10.1016/j.actbio.2008.09.013].
일부 경우, 조직 생성물이 무세포화된 조직 매트릭스로서 제공될 수 있다. 적당한 무세포 조직 매트릭스는 이하에 추가로 설명된다. 다른 경우, 상기 방법은 세포 또는 다른 물질을 제거하기 위해 온전한 조직을 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 조직은 완전히 또는 부분적으로 무세포화되어, 환자를 위해 사용될 무세포 조직 매트릭스 또는 세포외 조직 물질을 생성할 수 있다. 예를 들면, 피부, 장, 뼈, 연골, 지방 조직, 신경 조직(예를 들면, 신경 섬유 또는 경뇌막), 힘줄, 인대 또는 다른 조직과 같은 다양한 조직이 완전히 또는 부분적으로 무세포화되어 환자를 위해 유용한 조직 생성물을 생성할 수 있다. 일부 경우, 이들 무세포화 생성물은 외인성 세포 물질(예를 들면, 줄기 세포)의 첨가 없이 사용될 수 있다. 특정 경우, 이들 무세포화된 생성물은 처리를 용이하게 하기 위해, 자가 공급원 또는 다른 공급원 유래의 세포가 씨딩될 수 있다. 무세포 조직 매트릭스를 생성하기 위한 적당한 방법은 이하에 설명되어 있다.
조직 매트릭스를 처리하기 위해 다수의 상이한 효소가 사용될 수 있다. 예를 들면, 적당한 효소는 설프하이드릴 프로테아제, 예를 들어, 브로멜라인을 포함할 수 있다. 또한, 그들은 브로멜라인, 파파인, 피신, 악티니딘, 알칼라제, 트립신 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 효소는 상업용으로 구입하거나, 또는 과일 공급원으로부터 추출될 수 있다. 예를 들면, 브로멜라인의 한 공급원은 MCCORMICK MEAT TENDERIZER®이지만, 이 효소는 파인애플에서 추출하고/거나, 의료등급 제제로 구입할 수도 있다.
다른 기계적 및/또는 생물학적 특성을 바람직하지 않게 저하시키지 않으면서, 조직의 유연성을 증가시키기 위해 효소를 조직과 접촉시킬 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 논의된 효소 처리와 함께 또는 효소 처리 없이 한 뱃치(batch)의 물질이 제조되는 경우, 효소 처리는 인장 강도, 인열 강도, 봉합 강도, 크리프 저항성, 탄성, 콜라게나제 감수성, 파열 강도, 열 전이 온도, 또는 그들의 조합 중 적어도 하나의 바람직하지 않은 변화를 생성하지 않을 것이다. 일부 경우, 바람직하지 않은 변화는 인장 강도, 인열 강도, 봉합 강도, 크리프 저항성, 글리코스아미노글리칸 함량, 렉틴 함량, 파열 강도 중 어느 하나의 통계적으로 유의한 감소, 콜라게나제 감수성의 증가 또는 (시차주사 열량계를 사용한 측정시) 열 전이 온도의 변화(상향 또는 하향)이다.
상기 언급된 바와 같이, 일부 구현예에서, 조직은 조직의 다공성을 증가시키기 위해 효소로 처리된다. 다양한 구현예에서, 채널의 수 및/또는 크기를 증가시키기 위해 조직의 다공성의 증가가 수행되고, 이는 세포 침투 및 조직 재생의 속도를 개선시킬 수 있다.
일부 경우, 효소는 효소가 조직 내의 단백질의 부위-특이적 절단을 야기하도록 선택된다. 예를 들면, 브로멜라인으로 돼지 진피 물질을 처리하면, 특정량의 처리 후 매트릭스 구조가 추가로 변형되지 않음을 발견하였다. 그러므로, 브로멜라인으로 진피를 처리하면, 연장된 노출로, 또는 연장된 시간 이후에 매트릭스가 추가로 변경되지 않는다.
또한, 다양한 적당한 용액 내의 조직에 효소가 적용될 수 있다. 예를 들면, 브로멜라인은 생리 식염수 내의 조직에 적용되는 경우 효과적인 것으로 밝혀졌지만, 다른 적당한 완충제(예를 들면, PBS)가 사용될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 효소로의 처리 후에, 적어도 하나의 콜라겐-함유 조직 매트릭스를 적어도 하나의 단백질분해 효소와 접촉시키는 단계가 적어도 하나의 콜라겐-함유 조직 매트릭스를 변경시켜, 조직 매트릭스가 인간 체 내에 이식되는 경우 조직 매트릭스에 대한 인간 면역 반응을 감소시키는지를 결정하기 위해 분석을 수행할 수 있다. 수많은 적당한 분석이 수행될 수 있다. 예를 들면, 적당한 분석은 단핵구 활성화 분석, 식세포작용 분석 및 산화 버스트 분석을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 처리된 조직의 한 세그먼트 또는 부분에서 분석을 수행할 수 있으며, 조직의 다른 부분을 이후의 의료 또는 수술 절차에 사용할 수 있다. 다른 구현예에서, 한 뱃치의 다수의 샘플 유래의 하나 이상의 샘플에서 분석을 수행할 수 있으며, 분석을 겪지 않은 샘플을 이후에 환자의 치료에 사용하기 위해 선택할 수 있다.
특정 구현예에서, 체온에서 변성을 가능하게 할 열 전이 온도를 갖는 물질 내의 콜라겐 또는 다른 단백질을 제거하도록 효소 처리가 선택된다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 진피 무세포 조직이 선택되며, 효소 처리는 DSC를 사용하여 측정시, 약 30℃ 내지 40℃의 열 피크를 제거하도록 선택된다. 이러한 작은 ECM 피크로, 인간 체온에서 자발적으로 변성하는 것이 예상되며, 이식 후에 발생하는 상이한 염증 반응에 기여할 수 있다.
무세포 조직 매트릭스
본 명세서에 사용된 용어 "무세포 조직 매트릭스"는 일반적으로, 세포 및/또는 세포 성분이 실질적으로 없는 임의의 조직 매트릭스를 말한다. 피부, 피부의 부분(예를 들면, 진피) 및 다른 조직, 예를 들면 혈관, 심장 판막, 근막, 연골, 지방 조직, 뼈 및 신경 연결 조직이 본 개시내용의 범주 내에서 무세포 매트릭스를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 무세포 조직 매트릭스는 그들이 세포 및/또는 세포 성분이 실질적으로 없는 지를 측정하기 위해 다수의 방식으로 시험 또는 평가될 수 있다. 예를 들면, 세포(살아있는 세포 또는 죽은 세포) 및/또는 세포 성분이 남아있는지를 측정하기 위해, 처리된 조직을 광학 현미경으로 조사할 수 있다. 또한, 세포 또는 세포 성분의 존재를 확인하기 위해 특정 분석을 사용할 수 있다. 예를 들면, 조직 매트릭스 내 남아있는 핵 물질을 정량화하기 위해, DNA 또는 다른 핵산분석을 사용할 수 있다. 일반적으로, 남아있는 DNA 또는 다른 핵산의 부재는 완전한 무세포화(즉, 세포 및/또는 세포 성분의 제거)의 지표가 될 것이다. 마지막으로, 조직 매트릭스가 무세포인지를 측정하기 위해, 세포-특이적 성분(예를 들면, 표면 항원)을 확인하는 다른 분석이 사용될 수 있다. 피부, 피부의 부분(예를 들면, 진피) 및 다른 조직, 예를 들면 혈관, 심장 판막, 근막, 연골, 뼈 및 신경 연결 조직이 본 개시내용의 범주 내에서 무세포 매트릭스를 형성하기 위해 사용될 수 있다.
일반적으로, 무세포 조직 매트릭스의 생성에 수반되는 단계는 공여자(예를 들면, 인간 시체 또는 동물 공급원)로부터 조직을 수집하는 단계 및 생물학적 및 구조적 기능을 보존하는 조건하에 세포를 제거하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 세포 제거와 함께 또는 세포 제거 이전에, 조직을 안정화하고, 생화학적 및 구조적 분해를 피하기 위한 화학적 처리를 포함한다. 다양한 구현예에서, 안정화 용액은 삼투분해, 저산소분해, 자가분해 및 단백질분해를 정지시키고 막으며, 미생물 오염에 대하여 보호하고, 예를 들면, 평활근 성분(예를 들면, 혈관)을 함유하는 조직에 의해 일어날 수 있는 기계적인 손상을 감소시킨다. 안정화용액은 적당한 완충제, 하나 이상의 산화방지제, 하나 이상의 종양 제제, 하나 이상의 항생제, 하나 이상의 프로테아제 억제제, 및/또는 하나 이상의 평활근 이완제를 함유할 수 있다.
그 후, 조직을 무세포화 용액에 넣어, 콜라겐 매트릭스의 생물학적 및 구조적 온전성을 손상시키지 않으면서 구조적 매트릭스로부터 생존가능한 세포(예를 들면, 상피 세포, 내피 세포, 평활근 세포 및 섬유아세포)를 제거한다. 무세포화 용액은 적당한 완충제, 염, 항생제, 하나 이상의 세제, 하나 이상의 가교방지제, 하나 이상의 프로테아제 억제제 및/또는 하나 이상의 효소를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서는, 조직을 무세포화 용액 내에서 90 rpm에서 온건하게 진탕시키면서 37℃에서 밤새 인큐베이션시킨다. 특정 구현예에서는, 조직 샘플로부터 지방을 제거하기 위해, 추가의 세제를 사용할 수 있다.
무세포화 과정 이후에, 조직 샘플을 철저하게 세척한다. 일부 예시적인 구현예에서, 예를 들면 외인성 물질이 사용되는 경우, 무세포화 조직을 이어서 데옥시리보뉴클레아제(DNase) 용액으로 처리한다. 완충제가 적당한 DNase 활성을 제공하는 한 임의의 적당한 완충제가 사용될 수 있다.
무세포 조직 매트릭스가 무세포 조직 매트릭스 이식편의 수여자와 동일한 종의 하나 이상의 개체로부터 제조될 수 있지만, 반드시 꼭 그런 것은 아니다. 따라서, 예를 들면 무세포 조직 매트릭스는 돼지 조직으로 제조되어, 사람 환자에 이식될 수 있다. 무세포 조직 매트릭스의 수여자 및 무세포 조직 매트릭스의 생성을 위한 조직 또는 기관의 공여자로서 기능할 수 있는 종은 제한 없이, 포유류, 예를 들면, 인간, 비인간 영장류(예를 들면, 원숭이, 비비 또는 침팬지), 돼지, 소, 말, 염소, 양, 개, 고양이, 토끼, 기니피그, 게르빌루스쥐, 햄스터, 랫트 또는 마우스를 포함한다.
콜라겐-함유 물질로부터 α-gal 에피토프를 제거하면, 콜라겐-함유 물질에 대한 면역 반응을 감소시킬 수 있다. α-gal 에피토프는 비-영장류 포유류 및 광비원류(남아프리카 원숭이)뿐만 아니라 거대분자, 예를 들면 세포외 성분의 프로테오글리칸에서 발현된다. 문헌[U. Galili et al., J. Biol. Chem. 263: 17755 (1988)]. 그러나, 이러한 에피토프는 구세계 영장류(아시아 및 아프리카의 원숭이 및 유인원) 및 인간에게는 부재한다. 상동. 항-gal 항체는 위장 박테리아 상의 α-gal 에피토프 탄수화물 구조에 대한 면역 반응의 결과로서 인간 및 영장류에서 생성된다. 문헌[U. Galili et al., Infect. Immun. 56: 1730 (1988)]; 문헌[R. M. Hamadeh et al., J. Clin. Invest. 89: 1223 (1992)].
비-영장류 포유류(예를 들면, 돼지)가 α-gal 에피토프를 생성하므로, 이들 포유류로부터 영장류로 콜라겐-함유 물질을 이종이식하면, 콜라겐-함유 물질 상의 이들 에피토프로의 영장류 항-Gal 항체 결합 때문에 종종 거부가 일어난다. 문헌[U. Galili et al., Immunology Today 14: 480 (1993)]; 문헌[M. Sandrin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11391 (1993)]; 문헌[H. Good et al., Transplant. Proc. 24: 559 (1992)]; 문헌[B. H. Collins et al., J. Immunol. 154: 5500 (1995)]. 그리고, 이종이식은 면역계의 주요 활성화를 야기하여, 증가된 양의 고친화성 항-gal 항체를 생성한다. 따라서, 일부 구현예에서, α-gal 에피토프를 생성하는 동물이 조직 공급원으로 사용되는 경우, 콜라겐-함유 물질의 세포외 성분 및 세포로부터 α-gal 에피토프를 실질적으로 제거하고, 세포성 α-gal 에피토프를 재발현하는 것을 막으면, α-gal 에피토프로의 항-gal 항체 결합과 관련된 콜라겐-함유 물질에 대한 면역 반응을 감소시킬 수 있다.
α-gal 에피토프를 제거하기 위해, 특정 면역원성 항원이 샘플에 존재한다면, 이를 제거하기 위해, 조직 샘플을 하나 이상의 효소 처리로 처리할 수 있다. 일부 구현예에서, α-gal 에피토프가 조직 내에 존재한다면 이를 제거하기 위해, 조직 샘플을 α-갈락토시다제 효소로 처리할 수 있다. 일부 구현예에서, pH 6.0의 100 mM 인산염 완충제에서 제조된 300 U/ℓ의 농도로 α-갈락토시다제로 조직 샘플을 처리한다. 다른 구현예에서, 수집된 조직으로부터 α-gal 에피토프를 적당하게 제거하기 위해, α-갈락토시다제의 농도를 400 U/ℓ로 증가시킨다. 항원의 충분한 제거가 달성되는 한 임의의 적당한 효소 농도 및 완충제가 사용될 수 있다.
대안적으로, 조직을 효소로 처리하는 것보다는, 하나 이상의 항원 에피토프가 결실되도록 유전적으로 변형된 동물을 조직 공급원으로 선택할 수 있다. 예를 들면, 말단 α-갈락토스 모이어티가 결실되도록 유전적으로 조작된 동물(예를 들면, 돼지)을 조직 공급원으로 선택할 수 있다. 적절한 동물의 설명을 위해, 동시계류 중인 미국 특허 출원 제10/896,594호 및 미국 특허 제6,166,288호를 참고하며, 그 개시내용은 그들 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 또한, α-1,3-갈락토스 모이어티의 양을 감소시키거나 또는 그를 결실시키면서 또는 그것 없이, 무세포 매트릭스를 생성하기 위한 예시적인 특정한 조직의 처리 방법은 문헌[Xu, Hui. et al., "A Porcine-Derived Acellular Dermal Scaffold that Supports Soft Tissue Regeneration: Removal of Terminal Galactose-α-(1,3)-Galactose and Retention of Matrix Structure," Tissue Engineering, Vol. 15, 1-13 (2009)]에 설명되어 있으며, 이는 전문이 참고로 포함된다.
무세포 조직 매트릭스가 형성된 후, 생존가능한 조직적합성 세포를 무세포 조직 매트릭스에 선택적으로 씨딩하여, 숙주에 의해 추가로 리모델링될 수 있는 이식편을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 생존가능한 조직적합성 세포는 이식하기 전에 표준 시험관내 세포 동시-배양 기술에 의해, 또는 이식 후 생체내 재증식에 의해 매트릭스에 첨가될 수 있다. 생체내 재증식은 수여자 자체의 세포가 무세포 조직 매트릭스로 이동함으로써, 또는 수여자로부터 얻은 세포 또는 다른 공여자로부터의 조직적합성 세포를 무세포 조직 매트릭스로 동소에 주입 또는 주사함으로써 이루어질 수 있다. 배아 줄기 세포, 성인 줄기 세포(예를 들면, 간엽 줄기 세포) 및/또는 신경 세포를 포함하는 다양한 세포 유형이 사용될 수 있다. 다양한 구현예에서, 이식 직전 또는 직후에, 세포를 무세포 조직 매트릭스의 내부에 직접 적용할 수 있다. 특정 구현예에서, 이식되는 무세포 조직 매트릭스 내에 세포를 배치하고, 이식하기 전에 배양할 수 있다.
도 1a 내지 도 1d는 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 효소로 처리한 후의 무세포 조직 매트릭스 및 미처리 대조군을 보여준다.
도 2는 실시예 1의 방법에 따른, 처리된 샘플 및 대조군 샘플에 대한 인장 강도 시험 데이터의 박스 플롯이다.
도 3은 실시예 1의 방법에 따른, 처리된 샘플 및 대조군 샘플에 대한 봉합 강도 시험 데이터의 박스 플롯이다.
도 4는 실시예 1의 방법에 따른, 처리된 샘플 및 대조군 샘플에 대한 인열 강도(tear strength) 시험 데이터의 박스 플롯이다.
도 5는 실시예 1의 방법에 따른, 처리된 샘플 및 대조군 샘플에 대한 탄성 시험 데이터의 박스 플롯이다.
도 6은 실시예 1의 방법에 따른, 처리된 샘플 및 대조군 샘플에 대한 크리프 저항성(creep resistance) 시험 데이터의 박스 플롯이다.
도 7은 실시예 2.2에 따른, 미처리 조직 및 브로멜라인(bromelain) 및 알칼라제를 사용하여 처리된 조직에 대한 DSC 서모그램(thermogram)을 보여준다.
도 8a 및 도 8b는 실시예 2.4에 기재된 단핵구 활성화 검정을 사용하여, 다양한 조직과 동시-배양된 단핵구에서의 활성화 마커 CD14(a) 및 CD163(b)의 발현 패턴을 보여준다.
도 9a 내지 도 9f는 실시예 2.5에 기재된 바와 같은, 외식 후의 미처리 pADM(9a 내지 9c) 및 효소 처리된 pADM(9d 내지 9f)의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 섹션이다.
도 10a 내지 도 10d는 실시예 2.5에 기재된 바와 같은, 미처리 pADM(9a 및 9b) 및 효소 처리된 pADM(9c 및 9d) 외식편의 H&E 섹션이다.
도 11은 실시예 3에 기재된 방법을 사용하여 알칼라제로 처리한 후의 조직 매트릭스 및 미처리 대조군에 대한 드레이프 시험 결과를 보여주는 막대 그래프이다.
도 12는 실시예 3에 기재된 방법을 사용하여 알칼라제로 처리한 후의 조직 매트릭스 및 미처리 대조군에 대한 콜라게나제 분해 분석 결과를 보여주는 선 그래프이다.
도 13은 미처리 조직 및 실시예 3에 따라 알칼라제를 사용하여 처리된 조직에 대한 변성 개시 온도를 포함하는 DSC 결과를 보여준다.
도 14는 실시예 3에 기재된 방법을 사용하여 알칼라제로 처리한 후의 조직 매트릭스 및 미처리 대조군에 대한 최대 로드/단위 너비의 구간 플롯이다.
도 15는 실시예 3에 기재된 방법을 사용하여 알칼라제로 처리한 후의 조직 매트릭스 및 미처리 대조군에 대한 탄성의 구간 플롯이다.
실시예 1: 유연성을 증가시키기 위한 조직 매트릭스의 처리
하기의 실시예는 돼지 진피 무세포 조직 매트릭스를 포함하는 물질을 브로멜라인으로 처리하여, 물질의 유연성을 증가시키는 방법을 보여준다. 이하에 논의되는 바와 같이, 처리는, 다양한 기계적 특성의 바람직하지 않은 변화를 야기하지 않았다. 또한, 처리는 물질의 다공성을 증가시키고, 이는 세포 침투 및 조직 재생 속도를 개선시킬 수 있다.
본 실험을 위해, LIFECELL CORPORATION(Branchburg, NJ)으로부터 수득되는 바와 같은 STRATTICE™ 무세포 조직 매트릭스를 사용하였다. STRATTICE™는 유연한 형태 및 보다 견고한 버전으로 이용가능하다. 본 실험에는 두 유형 모두를 사용하였다. 시험에 사용한 샘플을 4등분하여 절단하고, 3/4을 처리하였다. 미처리 샘플(1/4)을 대조군으로 사용하였다. 대조군은 처리 동안에 냉장보관하였다. STRATTICE™를 용액 중에 패키징하므로, 재수화를 필요로 하지 않는다. MCCORMICK MEAT TENDERIZER 55 g을 함유하는 차가운 수돗물 0.5 리터에 처리된 샘플을 두었다.
도 1a 내지 도 1d는 본 개시내용의 방법을 사용하여 효소로 처리한 후의 무세포 조직 매트릭스 및 미처리 대조군을 보여준다. 도 2 내지 도 6은 각 처리된 샘플 및 대조군 샘플에 대한 인장 강도, 봉합 강도, 인열 강도, 탄성 및 크리프 저항성의 박스 플롯이다. 처리된 샘플은 대조군과 비교하여, 유연성이 두드러지게 증가하였지만 다른 기계적 특성은 유의미하게 감소되지 않았다. 또한, 열 전이 온도 또는 콜라게나제 감수성에 있어서는 유의미한 변화가 발견되지 않았다. 전체 대응 T-검정은 대조군과 처리군 사이에 통계적으로 차이가 없음을 보여주었다.
실시예 2: 이식시의 면역 반응을 조절하기 위한 조직 매트릭스의 처리
1. 돼지 무세포 진피 매트릭스(pADM)의 제조
돼지 피부를 도살장으로부터 수집하고, 표피 및 피하 지방을 물리적으로 제거하였다. 남아 있는 진피 조직을 항생제를 함유하는 PBS 중에 24시간 동안 37℃에서 오염물을 제거하였다.
오염물 제거 후에, 조직을 무균 조건하에 처리하였다. 진피 조직을 24시간 동안 세제를 사용하여 무세포화시켜, 생존가능한 세포를 제거하고, 염수로 세척하고, 다시 24시간 동안 DNAse/α-갈락토시다제로 처리하였다. 세포 데브리스 및 잔류 화학물질을 PBS 중에서의 세척에 의해 제거하였다. 생성된 돼지 무세포 진피 매트릭스(pADM)를 사용할 때까지 주위 온도에 보관하였다.
2. 효소-처리된 pADM의 제조
pADM을 2가지 프로테아제 효소(알칼라제 또는 브로멜라인) 중 하나로 37℃에서 밤새 처리하였다. 100 유닛/ℓ의 농도의 브로멜라인을 사용하여, 무세포화 이전 또는 DNAse/α-갈락토시다제 단계 이후에 pADM을 처리하였다. 무세포화 단계 이전에 알칼라제를 0.003 Anson 유닛/㎖의 농도로 사용하여 pADM을 처리하였다.
3. 처리된 샘플의 시차 주사 열량계
돼지 조직 ECM에 대한 브로멜라인 효소 처리의 영향을 시차 주사 열량(DSC) 분석을 사용하여 평가하였다. 조직 샘플을 기밀 밀봉하고, 2℃에서 120℃까지 3℃/분으로 스캐닝하였다. 미처리 조직 및 실시예 2.2에 따라 효소(브로멜라인 및 알칼라제)를 사용하여 처리된 조직에 대한 DSC 써모그램은 도 7에 나타나 있다. 써모그램은 효소 처리 후의 조직 ECM의 소수의 변경을 보여준다. 먼저, 무세포화, 미처리 대조군 조직과 대조적으로, 효소-처리된 ECM은 30℃ 내지 40℃에서 작은 피크(약 2%)를 보이지 않았다. 이러한 작은 ECM 피크로, 인간 체온에서 자발적으로 변성하는 것이 예상되며, 이는 미처리 및 효소 처리 pADM에 의해 유도되는 상이한 염증 반응에 기여할 수 있다. 두번째로, 55℃ 초과의 2개의 주요 ECM 피크는 약간, 평균하여 0.9℃ 감소하였다. 세번째로, 전체 ECM 변성 엔탈피는 효소 처리 후에 평균 약 7.5% 증가하였다.
4. 시험관내 단핵구 활성화
단핵구는 선천적 면역계의 부분을 형성하는 백혈구이다. 그들은 염증성 제제에 반응하여, 신속하게 활성화되고, 염증 반응을 개시한다. 효소 처리 및 미처리 조직에 대한 인간 염증 반응을 예측하기 위하여, 단핵구를 인간 말초 혈액으로부터 단리하고, 밤새 조직과 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 세포를 세척하고, 활성화를 모니터링하기 위해 사용되는 2개의 표면 마커, CD14 및 CD163에 대한 항체로 염색하였다.
단핵구는 활성화시에 그들의 표면상에 CD14 및 CD163 둘 모두의 발현을 감소시킨다. 이러한 발현 패턴을 알려져 있는 단핵구의 활성화제인 지질다당류(LPS)를 사용하여 확인하였다. 도 8a 및 도 8b는 다양한 조직과 동시-배양된 단핵구에서의 활성화 마커 CD14(a) 및 CD163(b)의 발현 패턴을 보여준다. 비-유도된 단핵구(흑색) 내의 CD14 및 CD163의 발현 수준은 기준선 음성 대조군으로 삼았다. 비교를 위하여, 비-유도된 단핵구 내의 이들 마커의 발현 패턴은 음성 대조군으로 삼았다. 효소-처리된 pADM은 둘 모두의 마커의 발현 패턴에 의해 입증되는 바와 같이 미처리 pADM보다 훨씬 더 낮은 수준의 활성화를 유도하였다. 사실상, 효소-처리된 pADM에 노출되는 단핵구에서의 CD14 발현의 패턴 및 수준은 비-유도된 단핵구의 것과 매우 유사하다. 효소-처리된 pADM에 노출된 단핵구는 CD163의 발현을 약간 감소시켰으나 미처리 pADM 또는 LPS 중 어느 하나에 노출된 단핵구보다 훨씬 더 적은 정도였다.
상기 결과는 효소-처리된 pADM이 인간 단핵구에서 최소의 염증 반응을 유도하는 것을 나타낸다. 단핵구 활성화시에, CD14 및 CD163 둘 모두의 발현은 감소한다. 이러한 패턴은 알려져 있는 단핵구 활성화제, 지질다당류(LPS)와 동시-배양되는 세포에 의해 확인된다. 미처리 pADM(적색)은 효소-처리된 pADM(녹색)에 비하여 더 낮은 CD14 및 CD163의 발현을 보이며, 이는 효소 처리가 단핵구 활성화를 감소시키는 것을 나타낸다. 따라서, 효소-처리된 pADM은 인간 단핵구에서 보다 적은 염증 반응을 유도한다.
5. pADM 및 효소-처리된 pADM의 생체내 성능
pADM 및 효소-처리된 pADM의 생체내 성능을 평가하기 위하여, pADM 및 효소 처리된 pADM의 1㎝ × 1㎝ 조각을 면역 적격 랫트의 피하 조직에 이식하였다. 이식 후 2주 및 4주에, 조직을 외식하고, 염증, 세포 재증식 및 혈관재생의 조직학적 평가를 위해 처리하였다.
도 9a 내지 도 9f는 상기 기술된 바와 같은 외식 후의 미처리 pADM(9a 내지 9c) 및 효소 처리 pADM(9d 내지 9f)의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 섹션이다. 도 10a 내지 도 10d는 상기 기술된 바와 같은, 미처리 pADM(9a 및 9b) 및 효소 처리 pADM(c 및 d) 외식편의 H&E 섹션이다. 효소 처리된 pADM은 최소의 염증의 유도 내지 염증을 유도하지 않는 한편, 미처리 pADM은 풍부한 면역 세포의 존재를 특징으로 하는 중등 내지 고도의 염증 반응을 유도하였다. 추가로, 효소-처리된 pADM 외식편은 미처리 pADM에 비하여, 증가된 세포 재증식 및 혈관재생을 나타내었다. 미처리 pADM에서, 섬유아세포-유사 세포 및 혈관 구조는 주로 조직의 주변에 존재하였다. 대조적으로, 동일한 세포 및 혈관 구조가 조직의 가운데를 포함하여, 효소 처리된 pADM의 도처에서 관찰되었다.
6. 콜라게나제 분해 분석
동결 건조된 pADM 및 효소-처리된(브로멜라인, 트립신 및 알칼라제 사용) pADM의 상이한 분취물을 칭량하고, 다양한 기간 동안 콜라게나제 I형으로 분해하였다. 각 시점에, 분해된 샘플의 일부 분취물을 원심분리에 의해 콜라게나제 I 용액으로부터 분리하고, 물로 세척하여, 잔류 콜라게나제 I 용액을 제거하였다. 모든 분취물을 다시 동결 건조시키고, 칭량하였다. 분해된 샘플의 건조 중량 대 초기 샘플의 건조 중량의 비를 얻음으로써 각 시점에 남아 있는 매트릭스의 백분율을 계산하였다.
효소 처리는 콜라게나제 분해에 대한 pADM의 감수성에 불리하게 영향을 미치지 않았다. pADM 및 효소 처리된 pADM 둘 모두는 동일한 정도와 동일한 속도로 콜라게나제 I형으로 분해되었다. 따라서, 본 개시내용의 방법은 콜라게나제 감수성의 저하를 야기하지 않고, 이식시에 개선된 면역학적 특성을 제공하는 것으로 관찰되었다.
실시예 3: 조절된 알칼라제 활성으로의 조직의 처리
돼지 진피를 pH가 대략 중성인 수용액 중에서 16시간 동안 3 × 10-5 내지 0.015 Anson 유닛/㎖의 다양한 활성을 갖는 알칼라제로 처리하였다. 이후에, 돼지 진피를 무세포화시키고, 소독하고, 전자빔을 사용하여 멸균시켜, 멸균 무세포 진피 매트릭스를 제조하였다. 다양한 시험을 수행하여, 다양한 기계적, 구조적 및 생물학적 특성에 대한 알칼라제의 영향을 연구하였다.
도 11은 실시예 3에 기술된 방법을 사용하여 알칼라제로 처리한 이후의 조직 매트릭스 및 미처리 대조군에 대한 드레이프 시험 결과를 보여주는 막대 그래프이다. 드레이프 시험은 60 ㎜ 직경의 원의 진피 매트릭스를 19 ㎜ 직경의 페데스탈의 상측에 배치하는 것을 포함한다. 진피 매트릭스가 페데스탈 위에 드레이프된 후에, 진피 매트릭스의 투영된 면적을 60 ㎜ 직경의 원의 원래 면적으로 나누어 드레이프 값을 결정하였다. 이들 2개의 면적을 나누기 전에 페데스탈의 면적을 디스크의 원래 면적 및 드레이핑된 면적으로부터 감하여 드레이프를 결정하는 것을 주의한다. 보다 낮은 드레이프의 값은 보다 부드러운(보다 드레이프성인) 물질을 의미한다. 데이터는 3 × 10-5 Anson 유닛/㎖의 가장 낮은 효소 농도에 대하여 드레이프가 유의미하게 감소함(부드러워진 물질)을 보여준다. 3 × 10-5 Anson 유닛/㎖ 초과에서, 선택된 처리 시간, 온도 및 pH에서, 드레이프 값이 증가하고, 1.5 × 10-3 Anson 유닛/㎖ 초과에서 안정기를 유지하는 것으로 보인다.
도 13은 실시예 3에 기술된 방법을 사용하여 알칼라제로 처리한 후의 조직 매트릭스 및 미처리 대조군에 대한 콜라게나제 분해 분석 결과를 보여주는 선 그래프이다. 데이터는 보다 낮은 농도의 알칼라제에 대하여 대조군과 유사한 분해 프로파일과 함께, 보다 높은 농도의 알칼라제에 노출된 매트릭스에 대하여 분해 속도 증가를 보여준다.
도 14는 미처리 조직 및 실시예 3에 따라 알칼라제를 사용하여 처리된 조직에 대한 DSC 결과, 즉, 변성 개시를 보여준다. 콜라게나제 감수성 시험을 사용하여 측정된 콜라겐 안정성과 유사하게(도 13), 증가된 알칼라제 농도에 의한 보다 낮은 변성 개시는 알칼라제 처리 농도의 함수로서 콜라겐 안정성의 감소를 나타낸다.
도 15는 실시예 3에 기술된 방법을 사용하여 알칼라제로 처리한 후의 조직 매트릭스 및 미처리 대조군에 대한 최대 로드/단위 너비의 구간 플롯이다. 이러한 데이터를 힘을 측정하면서, 대략 1 ㎝ 너비의 물질의 스트립을 파괴시까지 인장 시험함으로써 생성하였다. INSTRON 기계 시험 시스템을 사용하여 시험을 수행하였다. 데이터는 모든 처리에 대하여 유사한 강도를 보여준다.
도 16은 실시예 3에 기술된 방법을 사용하여 알칼라제로 처리한 후의 조직 매트릭스 및 미처리 대조군에 대한 탄성의 구간 플롯이다. 탄성은 변위-힘 곡선의 선형 부분에서 보다 큰 로드에서의 물질의 강성의 척도이다. 탄성은 매우 낮은 로드(조직에 대한 중력)에서의 강성을 반영하는 드레이프 척도와 대조적이다. 탄성의 유의미한 변화가 처리군 간에 관찰되지 않았다.
상기 시험은 알칼라제 처리가 초기의 처리에 의해 pADM의 유연성을 효과적으로 증가시키며, 이후 계속된 처리에 의해 유연성을 증가시킴을 보여준다. 또한, 낮은 수준의 알칼라제 노출은 최대 로드, 콜라게나제 감수성 및 탄성에 불리하게 영향을 미치지 않는다.

Claims (42)

  1. 조직 매트릭스를 선택하는 단계; 및
    상기 조직 매트릭스를, 유의미한 콜라겐 분해를 생성하지 않고 상기 조직 매트릭스의 드레이프 시험(drape test)에 의해 결정되는 요망되는 유연성의 증가를 생성하도록 선택된 알칼라제(alcalase) 활성을 갖는 용액에서의 인큐베이션 시간을 포함하는 조건하에 알칼라제와 접촉시키는 단계를 포함하는 조직 매트릭스의 처리 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조직 매트릭스가 인장 강도, 인열 강도(tear strength), 봉합 강도, 크리프 저항성(creep resistance), 파열 강도(burst strength), 열 전이 온도, 콜라게나제 감수성 또는 그들의 조합 중 적어도 하나의 바람직하지 않은 변화를 생성하지 않는 조건하에 단백질분해 효소와 접촉되는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조건이 조직 유연성의 실질적으로 최대의 증가를 제공하도록 선택되는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 매트릭스가 비-영장류 조직 매트릭스인 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 매트릭스가 돼지 조직 매트릭스인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 매트릭스가 바람직하지 않은 탄성의 변화를 생성하지 않는 조건하에 상기 단백질분해 효소와 접촉되는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 매트릭스를 처리하여, 상기 조직 매트릭스로부터 세포 및 세포 성분 중 적어도 일부를 제거하는 단계를 더 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 조직 매트릭스로부터 모든 세포 및 세포 성분의 제거를 포함하는 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 매트릭스가 무세포 조직 매트릭스인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 매트릭스가 진피 조직 매트릭스를 포함하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 매트릭스를 알칼라제와 접촉시키는 단계가 상기 조직 매트릭스를 1×10-6 유닛 내지 0.015 Anson 유닛/㎖의 활성을 갖는 알칼라제를 갖는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 매트릭스를 알칼라제와 접촉시키는 단계가 상기 조직 매트릭스를 1×10-6 유닛 내지 1.5×10-3 Anson 유닛/㎖의 활성을 갖는 알칼라제를 갖는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 매트릭스를 알칼라제와 접촉시키는 단계가 상기 조직 매트릭스를 약 2×10-5 유닛 내지 약 4×10-5 Anson 유닛/㎖의 활성을 갖는 알칼라제를 갖는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 매트릭스를 패키징하는 단계를 더 포함하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 매트릭스를 멸균하는 단계를 더 포함하는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 매트릭스가 적어도 30%의 드레이프 값의 감소를 생성하는 조건하에 알칼라제와 접촉되는 방법.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 매트릭스가 적어도 40%의 드레이프 값의 감소를 생성하는 조건하에 알칼라제와 접촉되는 방법.
  18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 매트릭스가 적어도 50%의 드레이프 값의 감소를 생성하는 조건하에 알칼라제와 접촉되는 방법.
  19. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 매트릭스가 적어도 60%의 드레이프 값의 감소를 생성하는 조건하에 알칼라제와 접촉되는 방법.
  20. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 매트릭스가 0.2 내지 0.4의 드레이프 값을 생성하는 조건하에 알칼라제와 접촉되는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 드레이프 시험이 직경이 알려져 있는 원형 페데스탈(pedestal)의 상측에 원형 면적이 알려져 있는 조직 매트릭스를 배치하는 단계 및 상기 조직 매트릭스가 상기 페데스탈 위에 드레이프된 후에 상기 조직 매트릭스의 투영된 면적을 상기 조직 매트릭스 원형의 원래 면적으로 나누어 드레이프 값을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 무세포 조직 매트릭스.
  23. 0.4 미만의 드레이프 값을 갖는 돼지 무세포 조직 매트릭스를 포함하는 조직 매트릭스.
  24. 제23항에 있어서, 상기 드레이프 값이 0.35 미만인 조직 매트릭스.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 드레이프 시험이 직경이 알려져 있는 원형 페데스탈의 상측에 원형 면적이 알려져 있는 조직 매트릭스를 배치하는 단계 및 상기 조직 매트릭스가 상기 페데스탈 위에 드레이프된 후에 상기 조직 매트릭스의 투영된 면적을 상기 조직 매트릭스 원형의 원래 면적으로 나누어 드레이프 값을 결정하는 단계를 포함하는 조직 매트릭스.
  26. 진피 조직 매트릭스를 선택하는 단계; 및
    상기 진피 조직 매트릭스를 알칼라제와 접촉시키는 단계; 및
    상기 조직 매트릭스를 방사선으로 처리하는 단계로서, 상기 알칼라제가 방사선으로의 처리 후에 요망되는 조직 매트릭스 유연성을 생성하도록 선택되는 조건하에 제공되는 단계를 포함하는 조직 매트릭스의 처리 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 조직 매트릭스가 인장 강도, 인열 강도, 봉합 강도, 크리프 저항성, 파열 강도, 열 전이 온도, 콜라게나제 감수성 또는 그들의 조합 중 적어도 하나의 바람직하지 않은 변화를 생성하지 않는 조건하에 단백질분해 효소와 접촉되는 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 조건이 실질적으로 최대의 조직 유연성의 증가를 제공하도록 선택되는 방법.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 매트릭스가 비-영장류 매트릭스인 방법.
  30. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 매트릭스가 돼지 조직 매트릭스인 방법.
  31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 매트릭스를 처리하여, 상기 조직 매트릭스로부터 세포 및 세포 성분 중 적어도 일부를 제거하는 단계를 더 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 조직 매트릭스로부터 모든 세포 및 세포 성분의 제거를 포함하는 방법.
  33. 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 매트릭스가 무세포 조직 매트릭스인 방법.
  34. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 유연성은, 직경이 알려져 있는 원형 페데스탈의 상측에 원형 면적이 알려져 있는 조직 매트릭스를 배치하는 단계 및 상기 조직 매트릭스가 상기 페데스탈 위에 드레이프된 후에 상기 조직 매트릭스의 투영된 면적을 상기 조직 매트릭스 원형의 원래 면적으로 나누어 드레이프 값을 결정하는 단계를 포함하는 드레이프 시험을 사용하여 측정되는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 조직 매트릭스가 적어도 30%의 드레이프 값의 감소를 생성하는 조건하에 알칼라제와 접촉되는 방법.
  36. 제34항에 있어서, 상기 조직 매트릭스가 적어도 40%의 드레이프 값의 감소를 생성하는 조건하에 알칼라제와 접촉되는 방법.
  37. 제34항에 있어서, 상기 조직 매트릭스가 적어도 50%의 드레이프 값의 감소를 생성하는 조건하에 알칼라제와 접촉되는 방법.
  38. 제34항에 있어서, 상기 조직 매트릭스가 적어도 60%의 드레이프 값의 감소를 생성하는 조건하에 알칼라제와 접촉되는 방법.
  39. 제34항에 있어서, 상기 조직 매트릭스가 0.2 내지 0.4의 드레이프 값을 생성하는 조건하에 알칼라제와 접촉되는 방법.
  40. 제26항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 매트릭스가 진피 조직 매트릭스를 포함하는 방법.
  41. 제26항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방사선이 E-빔 방사선을 포함하는 방법.
  42. 제26항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방사선이 감마 방사선을 포함하는 방법.
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