KR20160053106A

KR20160053106A - Compositions for Enhancing Cold Stress Tolerance and Transgenic Plants Using the Same

Info

Publication number: KR20160053106A
Application number: KR1020140149589A
Authority: KR
Inventors: 김우택; 민혜조
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2014-10-30
Filing date: 2014-10-30
Publication date: 2016-05-13
Also published as: KR102230148B1

Abstract

The present invention relates to a composition for enhancing resistance to cold stress in plants, and transgenic plants using the same. The composition comprises a nucleotide sequence which codes an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the sequence listing. By using the composition or a method of the present invention, it is possible to effectively enhance tolerance (resistance) to cold stress in plants.

Description

Technical Field [0001] The present invention relates to a composition for promoting tolerance to cold stress in plants,

본 발명은 식물의 저온 스트레스 저항성을 증가시키는 조성물 및 이를 이용한 형질전환 식물체에 관한 것이다.
The present invention relates to a composition for increasing cold stress resistance of plants and a transgenic plant using the same.

식물이 저온 스트레스를 받았을 때 작용하는 유전자들에 대한 연구가 많이 이루어졌으며, 저온 스트레스에 대처하기 위한 식물의 세포학적, 생리학적 반응들도 보고되어지고 있다(Thomashow MF., 2010). 식물의 저온 스트레스 반응 기작에 관여하는 주요한 단백질의 턴-오버에 E3 유비퀴틴 리가아제(ubiquitin ligase)가 기능한다고 밝혀지면서 유비퀴틴화(ubiquitination)-26S 프로테아좀(proteasome) 시스템에 대한 연구의 중요성이 부각되고 있다. There have been many studies of genes that work when plants are subjected to cold stress, and the cytological and physiological responses of plants to cope with cold stress have also been reported (Thomashow MF, 2010). The ubiquitin ligase has been shown to function in the turnover of key proteins involved in the cold stress response mechanism of plants, and the importance of research on the ubiquitination-26S proteasome system has been highlighted. .

벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류, 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류, 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류, 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류, 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류 및 라이그라스, 레드 클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류 등, 경작의 대상이 되는 많은 작물의 경우, 저온에 노출되는 경우, 심각한 피해를 입을 수 있다. 특히 지대가 높은 지역이나 아열대지역은 기온 변화의 폭이 크기 때문에 20℃ 이하의 저온에 자주 노출될 수 있다. 저온은 생장을 저해하고, 광합성 효율을 낮추며, 분얼의 발달 및 벼의 수상화서(spike) 발달을 방해하여 곡출(Grain yield)을 크게 감소시킨다(suh J. et al., 2010). 일례를 들면, 실제로 한국에서는 생식 단계(reproductive stage) 동안에 저온 기후가 발생하였던 지난 1971년, 1980년, 그리고 1993년에 전체 벼 생산면적의 각각 17, 18, 20%가 손실을 입었으며, 1980년에는 최대 3.9 t/ha에 해당하는 손실을 기록한 바 있다(Zhang et al., 2013). Rice, wheat, barley, corn, beans, potatoes, wheat, red beans, oats, And special crops including carrots, ginseng, tobacco, cotton, sesame seeds, sugar cane, beet, perilla, peanut and rapeseed, apple trees, pears, jujube trees, peaches, sheep grapes, Includes grains including plums, plums, apricots and bananas, flowers and roses including red rose, gladiolus, gerbera, carnation, chrysanthemum, lilies and tulips, red clover, orchardgrass, alfalfa, tall fescue and perennial In the case of many crops subject to cultivation, such as forage crops, exposure to low temperatures can cause serious damage. Especially in high-terrain areas and sub-tropical areas, it can be frequently exposed to low temperatures below 20 ° C because of the wide variation in temperature. Low temperatures inhibit growth, lower photosynthetic efficiency, and greatly reduce grain yield by inhibiting the development of tillering and spike development of rice (suh J. et al., 2010). In fact, in Korea, for example, 17, 18, and 20% of total rice production area was lost in 1971, 1980, and 1993, when cold conditions occurred during the reproductive stage, (Zhang et al., 2013) with a maximum loss of 3.9 t / ha.

이러한 저온 스트레스를 해결하기 위한 종래 기술로는 공개특허공보 제10-2005-0117630호 "저온 내성을 증진시키는 저온-유도성 OsAsr1 유전자 및 단백질", 공개특허공보 제10-2014-0043982호 "AtPrx 유전자 도입된 저온저항성 식물체 및 저온 스트레스에 대한 저항성을 갖는 식물체의 제조방법", 공개특허공보 제10-2009-0032462호 "오이 유래의 저온 스트레스 내성 유도 카이네이스 유전자의 프로모터 및 상기 프로모터를 이용한 형질전환 식물"이 공지되어 있다.
As a conventional technique for solving such a low-temperature stress, Japanese Laid-Open Patent Publication No. 10-2005-0117630 entitled " Low Temperature-Induced OsAsr1 Gene and Protein for Improving Low Temperature Resistance ", Published Patent Publication No. 10-2014-0043982 "AtPrx gene Resistant plant and a method for producing a plant having resistance to low-temperature stress ", Laid-Open Publication No. 10-2009-0032462 "A promoter of low-temperature stress tolerance inducing kaineise gene derived from cucumber and a transgenic plant using the promoter "Is known.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

본 발명자들은 저온 스트레스(cold stress)에 대하여 식물체의 내성(저항성)을 증진시킬 수 있는 방법을 발굴하고자 예의 노력하였다. 그 결과 Capsicum annuum cv. Pukang으로부터 유래한 CaPUB1 유전자를 도입한 식물체의 경우에 저온 스트레스 내성이 증진되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다. The present inventors have tried to find a way to enhance tolerance (tolerance) of plants against cold stress. As a result, Capsicum annuum cv. The present inventors have completed the present invention by confirming that cold stress tolerance is enhanced in the case of a plant into which a CaPUB1 gene derived from Pukang is introduced.

따라서, 본 발명의 목적은 식물체의 저온 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공하는데 있다. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a composition for promoting low-temperature stress tolerance of a plant.

본 발명의 다른 목적은 상술한 조성물에 의해 형질전환된 형질전환식물세포를 제공하는데 있다. Another object of the present invention is to provide a transgenic plant cell transformed by the above-mentioned composition.

본 발명의 또 다른 목적은 상술한 조성물에 의해 형질전환된 형질전환식물체를 제공하는데 있다. It is another object of the present invention to provide a transgenic plant transformed by the above-mentioned composition.

본 발명의 또 다른 목적은 저온 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공하는데 있다.
It is still another object of the present invention to provide a method for producing transgenic plants having enhanced cold stress tolerance.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 식물체의 저온 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다. According to one aspect of the present invention, there is provided a composition for promoting low-temperature stress tolerance of a plant comprising a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of the first sequence of Sequence Listing.

본 발명자들은 저온 스트레스(cold stress)에 대하여 식물체의 내성(저항성)을 증진시킬 수 있는 방법을 발굴하고자 예의 노력하였다. 그 결과 Capsicum annuum cv. Pukang으로부터 유래한 CaPUB1 유전자를 도입한 식물체의 경우에 저온 스트레스 내성이 증진되는 것을 확인하였다.The present inventors have tried to find a way to enhance tolerance (tolerance) of plants against cold stress. As a result, Capsicum annuum cv. It was confirmed that the cold stress tolerance was enhanced in the case of the plant in which the CaPUB1 gene derived from Pukang was introduced.

본 명세서에서 용어 "저온 스트레스(cold stress)"는 일반적인 식물 생장 환경에 비하여 낮은 온도를 의미하며, 식물 종에 따라 차이가 발생할 수 있다. 일반적으로 예를 들면, 15℃ 이하, 더 구체적으로 10℃이하, 더욱 더 구체적으로 7℃ 이하, 더욱 더 구체적으로 4℃ 이하의 온도에 의한 스트레스를 의미한다. 이에 따른 식물체의 표현형으로는 잎의 팽창(expansion), 시들음(leaf-wilting), 백화(chlorosis) 및 괴사(necrosis)를 포함하고, 생식기관의 성장 및 발달 저하의 결과를 초래한다. As used herein, the term " cold stress "refers to a lower temperature than a typical plant growth environment, and may vary depending on plant species. Generally refers to a stress caused by, for example, a temperature of 15 DEG C or less, more specifically 10 DEG C or less, more specifically 7 DEG C or less, and still more specifically 4 DEG C or less. Plant phenotype includes leaf expansion, leaf-wilting, chlorosis, and necrosis, resulting in the growth and development of reproductive organs.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것이다. 서열목록 제2서열의 핵산서열은 GenBank Accession number, ABA59556.1에 해당하는 서열이다. 다만, 본 발명에 있어서의 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열인 것으로 족하며, 서열목록 제2서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다. In one embodiment of the invention, the nucleotide sequence of the invention consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. The nucleic acid sequence of Sequence Listing 2 is the sequence corresponding to GenBank Accession number, ABA59556.1. However, it is apparent to those skilled in the art that the nucleic acid sequence in the present invention is a nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence of the first sequence of the sequence listing, and is not limited to the second sequence of the sequence listing.

뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.Variations in nucleotides do not cause changes in the protein. Such nucleic acids include functionally equivalent codons or codons that encode the same amino acid (e.g., by codon degeneration, six codons for arginine or serine), or codons that encode biologically equivalent amino acids &Lt; / RTI >

본 명세서에서 용어 "핵산(nucleic acids)"은 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).As used herein, the term "nucleic acids" means a generic inclusion of DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules. The nucleotide, which is a basic constituent unit in a nucleic acid molecule, includes not only natural nucleotides, Also included are modified analogues (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584 (1990)).

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 저온 스트레스 내성 증진을 위한 CaPUB1 단백질을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 70% 이상의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80% 이상의 상동성, 보다 더욱더 바람직하게는 90% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트(alignment) 방법은 당업계에 공지되어있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981) Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 본 발명은 ClustalX 및 NJ(neighbor-joining) 알고리즘을 이용한다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST; Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST에서 접속가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.
Taking into consideration the mutation having the above-mentioned biological equivalent activity, the nucleic acid molecule of the present invention encoding the CaPUB1 protein for enhancing cold stress tolerance is interpreted to include a sequence showing substantial identity with the sequence described in the sequence listing . The above-mentioned substantial identity is determined by aligning the sequence of the present invention with any other sequence as much as possible and analyzing the aligned sequence using an algorithm commonly used in the art. Or more homology, more preferably at least 70% homology, even more preferably at least 80% homology, even more preferably at least 90% homology, most preferably at least 95% homology . Alignment methods for sequence comparison are known in the art. Various methods and algorithms for alignment are described by Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48: 443 (1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31 (1988); Higgins and Sharp, Gene 73: 237-44 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-3 (1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16: 10881-90 (1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8: 155-65 (1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24: 307-31 (1994), but are not limited thereto. Preferably, the present invention utilizes ClustalX and NJ (neighbor-joining) algorithms. The NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST; Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215: 403-10 (1990)) is accessible from National Center for Biological Information (NBCI) It can be used in conjunction with sequence analysis programs such as blastx, tblastn and tblastx. BLSAT is available at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. A method for comparing sequence homology using this program can be found at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c) 식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터를 포함하는 식물체의 저온 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a nucleic acid comprising (a) a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; (b) a promoter that is operatively linked to the nucleotide sequence and that forms RNA molecules in plant cells; And (c) a recombinant vector for plant expression comprising a poly A signal sequence which acts on plant cells to cause polyadenylation of the 3'-terminal of the RNA molecule. The present invention also provides a composition for promoting low-temperature stress tolerance of a plant.

본 명세서에서 용어 "작동적으로 결합(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독(translation)을 조절하게 된다.As used herein, the term "operatively linked" means a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence (e.g., an array of promoter, signal sequence, or transcription factor binding site) and another nucleic acid sequence, The regulatory sequence regulates transcription and / or translation of the other nucleic acid sequences.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.The vector system of the present invention can be constructed through various methods known in the art, and specific methods for this are disclosed in Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) , Which is incorporated herein by reference.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.The vector of the present invention can typically be constructed as a vector for cloning or as a vector for expression. In addition, the vector of the present invention can be constructed by using prokaryotic cells or eukaryotic cells as hosts.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, pL^λ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pL^λ 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.For example, when the vector of the present invention is an expression vector and a prokaryotic cell is used as a host, a strong promoter capable of promoting transcription (for example, pL ^λ promoter, trp promoter, lac promoter, T7 promoter, tac promoter, etc.) , A ribosome binding site for initiation of translation, and a transcription / translation termination sequence. When E. coli is used as a host cell, the promoter and operator site of the E. coli tryptophan biosynthetic pathway (Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158: 1018-1024 (1984)) and the phage left promoter ^lambda promoter, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14: 399-445 (1980)).

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSK349, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예: λgt·λ4B, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.The vectors that can be used in the present invention include plasmids such as pSK349, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8 / 9, pHC79, pGEX series, pET series and pUC19, ? 4B,? -Charon,?? Z1, and M13) or a virus (e.g., SV40 or the like).

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 CaPUB1 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수 도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다.The vector of the present invention may be fused with other sequences to facilitate the purification of the CaPUB1 protein expressed therefrom. Fusion sequences include, for example, glutathione S-transferase (Pharmacia, USA), maltose binding protein (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) and 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA). Because of the additional sequence for such purification, proteins expressed in the host are rapidly and easily purified through affinity chromatography.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.The vector of the present invention may be a selection marker and may include an antibiotic resistance gene commonly used in the art, for example, ampicillin, gentamycin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, And resistance genes for tetracycline.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.On the other hand, when the vector of the present invention is an expression vector and a eukaryotic cell is used as a host, a promoter derived from a genome of a mammalian cell (for example, a metallothionein promoter) or a mammalian virus Virus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus promoter, and tk promoter of HSV) can be used, and generally have a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.

본 발명의 유전자는 식물에서 분리되었고, 저온 스트레스에 대한 식물체의 내성을 증진하는 작용을 할 수 있으므로, 식물에 대하여 가장 바람직한 유용성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 벡터가 식물 세포에 적용되는 경우, 본 발명에 적합한 프로모터는, 식물체의 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 컬리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제(nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트(ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제(TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(APRT) 프로모터, 옥토파인 신타아제 프로모터, BCB(blue copper binding protein) 프로모터, SP6 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터 및 PM 프로모터를 포함한다. 가장 바람직하게는 본 발명에 적합한 프로모터는 옥수수의 유비퀴틴 프로모터(pUbi)이다.The gene of the present invention has been isolated from plants and has the most favorable utility for plants since it can act to enhance plant tolerance to cold stress. Therefore, when the vector of the present invention is applied to a plant cell, any promoter suitable for the present invention may be any of those conventionally used in the art for gene transfer of a plant, for example, a ubiquitin promoter of corn, (CaMV) 35S promoter, nopaline synthase (nos) promoter, Piguet mosaic virus 35S promoter, water crane basil lipid viral promoter, comeline yellow mothball virus promoter, ribulose-1,5- (TPI) promoter of Arabidopsis, adenine phospholiposyl transferase (APRT) promoter of Arabidopsis, a tryptophan synthase promoter of Octopane synthase (ssRUBISCO), a rice cytosolic triosephosphate isomerase Azeotropic promoter, BCB (blue copper binding protein) promoter, SP6 promoter, T7 promoter , And a T3 promoter, and a promoter PM. Most preferably, the promoter suitable for the present invention is the ubiquitin promoter of maize ( pUbi ).

본 발명에 적합한 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널서열은 아그로박테리움 튜메파시엔스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것(NOS 3' end)(Bevan, et al., Nucleic Acids Research, 11(2):369-385(1983)), 아그로박테리움 튜메파시엔스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 유전자의 3' 말단 부분, CaMV 35S 터미네이터 및 OCS 터미네이터(octopine synthase terminator)서열을 포함한다. 가장 바람직하게는 본 발명에 적합한 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-말단 폴리 A 시그널 서열은 노팔린합성효소(nopaline synthase) 유전자의 종결서열(Tnos)이다.The poly A signal sequence which results in the 3'-terminal polyadenylation according to the present invention is derived from the nopaline synthase gene of Agrobacterium tumefaciens (NOS 3 'end) (Bevan, et al., Nucleic Acid Research, 11 (2): 369-385 (1983)), from the Octopine synthase gene of Agrobacterium tumefaciens, the protease inhibitor I of tomato or potato or the 3 ' 35S terminator and an OCS terminator (octopine synthase terminator) sequence. Most preferably, the 3'-terminal polyA signal sequence causing polyadenylation according to the invention is the nopaline synthase gene terminator sequence (Tnos).

선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자(예: 루시퍼라아제 및 -글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반한다. 또한, 본 발명의 벡터는 선택 표지로서 항생제(예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 또는 제초제(예: 바스타)에 대한 내성 유전자(예: 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제(npt), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제(hpt), 등)를 포함한다.Optionally, the vector further carries a gene encoding a reporter molecule (e.g., luciferase and - glucuronidase). The vector of the present invention can also be used as a selection marker for resistance genes for antibiotics (e.g. neomycin, carbenicillin, kanamycin, spectinomycin, hygromycin, etc.) or herbicides (e.g., Transferase (npt), hygromycin phosphotransferase (hpt), etc.).

본 발명의 식물발현용 재조합벡터의 바람직한 예로는 아그로박테리움(Agrobacterium) 바이너리 벡터를 들 수 있다.A preferable example of the recombinant vector for plant expression of the present invention is an Agrobacterium binary vector.

본 명세서에서 용어 "바이너리 벡터(binary vector)"는 Ti(tumor inducible) 플라스미드에서 이동에 필요한 부분인 LB(left border)와 RB(right border)를 가지는 플라스미드와 타겟 뉴클레오타이드를 옮기는데 필요한 유전자를 가진 플라스미드를 두 개로 나누어 놓은 벡터를 말한다. 본 발명의 형질전환용 아그로박테리움은 본 발명의 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현에 적합한 것이면 어느 것이라도 좋고, 특히 본 발명에서 식물 형질전환용 아그로박테리움 균주로는 통상 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404가 바람직하다.As used herein, the term "binary vector" refers to a plasmid having a LB (left border) and RB (right border) necessary for movement in a Ti (tumor inducible) plasmid and a gene having a gene necessary for transferring the target nucleotide It is a vector divided into two. The transforming Agrobacterium of the present invention may be any strain suitable for expression of the nucleotide sequence of the present invention. In particular, Agrobacterium tumefaciens (Agrobacterium tumefaciens strain) ) LBA4404 is preferred.

본 발명의 재조합 벡터를 아그로박테리움에 도입하는 방법은 당업자에게 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있으며, 예를 들면 입자 충격법(particle bombardment), 전기천공법(electroporation), 형질감염법(transfection), 리튬아세테이트법(lithium acetate method), 열충격법(heat shock) 및 냉동-해빙법(freezethaw method) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. Methods for introducing the recombinant vectors of the present invention into Agrobacterium can be carried out through various methods known to those skilled in the art and include, for example, particle bombardment, electroporation, transfection A lithium acetate method, a heat shock method, and a freeze-thaw method. However, the present invention is not limited thereto.

본 명세서에서 용어 "식물체"는 성숙한 식물뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 수 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미이다. As used herein, the term "plant" includes not only mature plants but also plant cells, plant tissues and plant seeds capable of developing into mature plants.

본 발명의 식물체는 특별히 제한되지 않으며, 상치, 배추, 감자 및 무를 포함하는 대부분의 쌍자엽 식물(dicotyledonous plant) 및 벼, 보리, 바나나 등의 단자엽 식물(monocotyledonous plant)을 포함한다. 특히 토마토와 같이 과피가 얇아 저온 스트레스에 따른 품질 저하가 급격히 나타나는 식용 채소 또는 과일 그리고 잎이 주된 상품으로 거래되는 식물 등에 적용할 경우 저온 스트레스에 대한 저항성을 높이는 데 효과적이다. The plant of the present invention is not particularly limited and includes most of the dicotyledonous plant including the lettuce, cabbage, potato and radish, and a monocotyledonous plant such as rice, barley and banana. Especially, it is effective to increase the resistance to cold stress when it is applied to edible vegetables or fruits and plants which are mainly used as leaves, because the peels are thin like tomatoes and the quality deterioration due to low temperature stress is rapidly increased.

보다 구체적으로, 본 발명의 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드 클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 구성된 군으로부터 선택된다.
More specifically, the plant of the present invention is a food crop including rice, wheat, barley, corn, soybean, potato, wheat, red bean, oats and sorghum; Vegetable crops including Arabidopsis, cabbage, radish, pepper, strawberry, tomato, watermelon, cucumber, cabbage, melon, squash, onions, onions and carrots; Special crops including ginseng, tobacco, cotton, sesame, sugar cane, beet, perilla, peanut and rapeseed; Apple trees, pears, jujubes, peaches, sheep, grapes, citrus, persimmon, plums, apricots and banana; Roses, gladiolus, gerberas, carnations, chrysanthemums, lilies and tulips; And feed crops including ragras, red clover, orchardgrass, alpha-alpha, tall fescue and perennialla grass.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 조성물에 의해 형질전환된 형질전환 식물세포를 제공한다.
According to another aspect of the present invention, the present invention provides a transgenic plant cell transformed by the above-mentioned composition.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 조성물에 의해 형질전환된 형질전환 식물체를 제공한다. According to another aspect of the present invention, the present invention provides a transgenic plant transformed by the above-mentioned composition.

본 발명의 형질전환 식물세포 및 식물체는 상술한 본 발명의 다른 일 양태인 식물체의 저온 스트레스 내성 증진용 조성물을 이용하여 제조되기 때문에, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다. Since the transgenic plant cells and plants of the present invention are produced using the composition for promoting tolerance to low-temperature stress tolerance of plants, which is another embodiment of the present invention described above, the redundant contents are omitted in order to avoid the excessive complexity described in the present specification do.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.Host cells capable of continuously cloning and expressing the vector of the present invention in a stable manner can be used in any host cell known in the art, such as E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli . such as E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus strain, and Salmonella typhimurium, Serratia marcesensus and various Pseudomonas spp. Enterobacteriaceae and strains.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 사람 세포(예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 한편, 본 발명의 CaPUB1 유전자는 식물에서 유용성이 크기 때문에, 상기 형질전환체는 세포 뿐만 아니라, 식물 세포 또는 조직으로부터 유래된 캘러스를 포함한다.When the vector of the present invention is transformed into eukaryotic cells, Saccharomyce cerevisiae, insect cells, human cells (e.g., Chinese hamster ovary, W138, BHK, COS-7, 293 , HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines) and plant cells. On the other hand, since the CaPUB1 gene of the present invention is highly useful in plants, the transformant includes not only cells but also calluses derived from plant cells or tissues.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.The method of delivering the vector of the present invention into a host cell may be carried out by the CaCl ₂ method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973) , Hanahan, D., J. MoI. Biol. , 166: 557-580 (1997)), one method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1983)) and electroporation (Dower, WJ et al., Nucleic Acids Res., 16: 6127-6145 (1988)). In addition, when the host cell is a eukaryotic cell, microinjection (Capecchi, MR, Cell, 22: 479 (1980)), calcium phosphate precipitation (Graham, FL et al., Virology, 52: 456 (Wong, TK et al., Gene, 10: 87 (1980)), DEAE- (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 9568-9572 (1990)) and dextran treatment (Gopal, Mol. Cell Biol., 5: 1188-1190 ) Or the like into the host cell.

숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현되며, 이러한 경우에는 다량의 저온 스트레스 내성 증진을 위한 CaPUB1 단백질을 얻게 된다.
The vector injected into the host cell is expressed in the host cell, and in this case, a large amount of CaPUB1 protein is obtained for the promotion of low-temperature stress tolerance.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 저온 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for producing a transgenic plant having enhanced cold stress tolerance comprising the steps of:

(a) 식물 세포 또는 식물 조직을 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 핵산서열을을 포함하는 벡터로 형질전환하는 단계;(a) transforming a plant cell or plant tissue with a vector comprising a nucleic acid sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID No. 1;

(b) 형질전환된 식물세포 또는 식물조직을 선별하는 단계; 및 (b) screening the transformed plant cell or plant tissue; And

(c) 상기 형질전환된 식물세포 또는 식물조직으로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계.(c) regenerating the plant from the transformed plant cell or plant tissue to obtain a transformed plant.

본 발명의 형질전환 식물체의 제조방법은 상술한 본 발명의 조성물을 이용하여 제조되기 때문에, 이 둘 사이에 공통되는 내용은 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다. Since the method for producing a transgenic plant of the present invention is produced using the composition of the present invention described above, the content common to the two is omitted in order to avoid the excessive complexity described in the present specification.

본 발명의 형질전환 식물세포 및 형질전환 식물체를 제조하기 위하여 당업계에 일반적으로 공지된 방법(Methods of Enzymology, Vol. 153, (1987))에 따라 실시될 수 있다. 외래성 폴리뉴클레오티드를 플라스미드나 바이러스 등과 같은 벡터 등의 운반체에 삽입하여 식물을 형질전환시킬 수 있고, 아그로박테리움 박테리아를 매개체로 사용할 수 있으며(Chilton, et al., Cell, 11:263:271(1977)), 직접 외래성 폴리뉴클레오티드를 식물 세포내로 도입시켜 식물을 형질전환시킬 수 있다(Lorz et ai. Mol. Genet. 199:178-182;(1985)). 예를 들어, T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우에는 전기천공법(electroporation), 입자충격법(microparticle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake)을 이용할 수 있다.(Methods of Enzymology, Vol. 153, (1987)) to produce transgenic plant cells and transgenic plants of the present invention. An exogenous polynucleotide may be inserted into a carrier such as a plasmid, a virus, or the like to transform the plant, and Agrobacterium bacteria may be used as an agent (Chilton, et al., Cell , 11: 263: 271 ), Direct extrinsic polynucleotides can be introduced into plant cells to transform plants (Lorz et al., MoI Genet., 199: 178-182; (1985)). For example, when a vector not containing a T-DNA region is used, electroporation, microparticle bombardment, and polyethylene glycol-mediated uptake may be used.

일반적으로 식물을 형질전환시킴에 있어 많이 사용되는 것이 외래성 폴리뉴클레오타이드로 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로 식물 세포나 종자 등을 감염시키는 방법이다(참조: 미국 등록특허 제5,004,863호, 제5,349,124호 및 제5,416,011호). 당업자는 공지된 적절한 조건하에서 형질전환된 식물 세포나 종자를 배양 또는 재배하여 식물로 발육시킬 수 있다.In general, a commonly used method for transforming plants is to infect plant cells or seeds with Agrobacterium tumefaciens transformed with an exogenous polynucleotide (see U.S. Patent No. 5,004,863 , 5,349,124 and 5,416,011). One of ordinary skill in the art can cultivate or plant transformed plant cells or seeds under suitable known conditions to develop into plants.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드 클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 구성된 군으로부터 선택된다. In one embodiment of the present invention, the plant of the present invention is a food crop including rice, wheat, barley, corn, soybean, potato, wheat, red bean, oats and millet; Vegetable crops including Arabidopsis, cabbage, radish, pepper, strawberry, tomato, watermelon, cucumber, cabbage, melon, squash, onions, onions and carrots; Special crops including ginseng, tobacco, cotton, sesame, sugar cane, beet, perilla, peanut and rapeseed; Apple trees, pears, jujubes, peaches, sheep, grapes, citrus, persimmon, plums, apricots and banana; Roses, gladiolus, gerberas, carnations, chrysanthemums, lilies and tulips; And feed crops including ragras, red clover, orchardgrass, alpha-alpha, tall fescue and perennialla grass.

본 발명에서 이용되는 익스플랜트로는 식물 세포 또는 식물 조직이며, 식물 조직을 이용하는 경우에는 캘러스를 이용하는 것이 바람직하다.The explant used in the present invention is a plant cell or a plant tissue, and when plant tissue is used, a callus is preferably used.

본 발명의 방법에 있어서, 식물세포의 형질전환은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있으며, 이는 전기천공(Neumann, E., et al., EMBO J., 1:841(1982)), 입자 밤바드먼트(Yang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 및 아그로박테리움-매개된 형질전환(미국 등록특허 제 5,004,863호, 제5,349,124호 및 제5,416,011호)을 포함한다. 이 중에서, 아그로박테리움-매개된 형질전환이 가장 바람직하다.In the method of the present invention, transformation of plant cells can be carried out according to conventional methods known in the art, which can be carried out by electroporation (Neumann, E., et al., EMBO J., 1: 841 ), Particle bombardment (Yang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 9568-9572 (1990)) and Agrobacterium-mediated transformation (US Pat. No. 5,004,863 5,349,124 and 5,416,011). Of these, Agrobacterium-mediated transformation is most preferred.

형질전환된 식물세포의 선별은 형질전환 배양물을 선택제(예: 대사 억제제, 항생제 및 제초제)에 노출시켜 실시될 수 있다. 형질전환되고 선택제 내성을 부여하는 표지 유전자를 안정되게 포함하고 있는 식물 세포는 상술한 배양물에서 성장하고 분할한다. 예시적인 표지는, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자, 글리코포스페이트 내성 유전자 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptII) 시스템을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.Selection of transformed plant cells can be carried out by exposing the transformed culture to a selection agent such as a metabolic inhibitor, an antibiotic and a herbicide. Plant cells that stably contain a marker gene that is transformed and conferring selectivity resistance grow and divide in the above-described cultures. Exemplary labels include, but are not limited to, hygromycin phosphotransferase gene, glycophosphate tolerance gene and neomycin phosphotransferase (nptII) system.

식물 원형질 또는 다양한 익스플랜드로부터 식물체의 발달 또는 재분화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.Methods for the development or regeneration of plants from plant protoplasts or from various expansions are well known in the art.

아그로박테리움에 의해 도입된 외래 유전자를 포함하는 식물체의 발달 또는 재분화는 당업계에 공지된 방법에 따라 달성될 수 있다(미국 등록특허 제5,004,863호, 제5,349,124호 및 제5,416,011호).Development or regeneration of plants containing foreign genes introduced by Agrobacterium can be accomplished according to methods known in the art (US Patent Nos. 5,004,863, 5,349,124 and 5,416,011).

본 발명에 있어서, 바람직한 형질전환 방법은 아그로박테리움 시스템을 이용하여 실시되며, 보다 바람직하게는 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)-바이너리 벡터 시스템을 이용하여 실시된다.In the present invention, a preferred transformation method is carried out using an Agrobacterium system, more preferably, an Agrobacterium tumefaciens-binary vector system.

아그로박테리움 시스템을 이용하는 방법에 있어서, 구체적인 일 실시예는 다음의 단계를 포함한다: (a') 식물 세포의 지놈 DNA에 삽입될 수 있고 다음의 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머파시엔스로 식물체의 익스플랜트를 감염시키는 단계: (i) 본 발명의 OsDREB1D 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (ii) 상기 (i)의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; (iii) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위; (b') 상기 감염된 익스플랜트를 재분화 배지에서 재분화하여 형질전환 식물체를 얻는 단계.In a method of using an Agrobacterium system, a specific embodiment includes the following steps: (a ') introducing Agrobacterium tumefaciens, which can be inserted into the genomic DNA of a plant cell and have the following sequence, (I) a nucleotide sequence encoding the OsDREB1D protein of the present invention; (ii) a promoter operably linked to the nucleotide sequence of (i) and acting on plant cells to form RNA molecules; (iii) a 3'-non-detoxified site that acts in plant cells to cause polyadenylation of the 3'-end of the RNA molecule; (b ') Regenerating the infected explant in a regeneration medium to obtain a transformed plant.

식물 세포의 형질전환은 Ti 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움 튜메파시엔스를 가지고 실시된다(Depicker, A., et al., Plant cell transformation by Agrobacterium plasmids. In Genetic Engineering of Plants, Plenum Press, New York(1983)).Transformation of plant cells is carried out with Agrobacterium tumefaciens containing Ti plasmids (Depicker, A., et al., Plant cell transformation by Agrobacterium plasmids. In Genetic Engineering of Plants, Plenum Press, New York 1983).

보다 바람직하게는, pBin19, pRD400, pRD320, pGA1611 및 pGA1991과 같은 바이너리 벡터 시스템이 이용된다(An, G., et al., Binary vectors" In Plant Gene Res. Manual, Martinus Nijhoff Publisher, New York(1986); An et al., 1988; 및 Lee et al., 1999). 본 발명에 적합한 바이너리 벡터는 (i) 식물에서 작동하는 프로모터; (ii) 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 구조 유전자; 및 (iii) 폴리아데닐화 시그널 서열을 포함한다. 선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자(예: 루시퍼라아제 및 글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반한다. 바이너리 벡터에 이용되는 프로모터의 예는 옥수수 유비퀴틴 프로모터, CaMV 35S 프로모터, 1 프로모터, 2 프로모터 및 노팔린 씬타아제(nos) 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.More preferably, binary vector systems such as pBin19, pRD400, pRD320, pGA1611 and pGA1991 are used (An, G., et al., Binary vectors "In Plant Gene Res. Manual, Martinus Nijhoff Publisher, New York (Ii) a structural gene operably linked to said promoter; and (iii) a promoter operably linked to said promoter, wherein said promoter is selected from the group consisting of: ). In addition, the vector additionally carries a gene encoding a reporter molecule (e.g., luciferase and glucuronidase). Examples of promoters used in the binary vector are corn But are not limited to, the ubiquitin promoter, the CaMV 35S promoter, the 1 promoter, the 2 promoter, and the nopaline synthase (nos) promoter.

아그로박테리움 튜메파시엔스에 의한 익스플랜트의 감염은 당업계에 공지된 방법을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 감염 과정은 아그로박테이룸 튜메파시엔스의 배양물에 익스플랜트를 함침시켜 공동배양하는 과정을 포함한다. 이를 통해 아그로박테이룸 튜메파시엔스는 식물내로 감염된다.Infection of the explant by Agrobacterium tumefaciens includes methods known in the art. Most preferably, the infection process comprises co-culturing Agrobacterium tumefaciens culture with an explant. Through this, Agrobacterium tumefaciens is infected into plants.

아그로박테이룸 튜메파시엔스에 의해 형질전환된 익스플랜트는 재분화 배지에서 재분화되며, 이는 최종적으로 형질전환 식물체를 형성한다.The explant transformed by Agrobacterium tumefaciens regulates in the regeneration medium, which ultimately forms the transgenic plant.

본 발명에 따라 형질전환된 식물은 당업계에 공지된 방법에 의해 형질전환 여부가 확인된다. 예를 들어, 형질전환된 식물의 조직으로부터 얻은 DNA 시료를 이용하여, PCR을 실시하면 형질전환 식물의 지놈에 삽입된 외래 유전자가 규명될 수 있다. 택일적으로, 노던 또는 서던 블롯팅을 실시하여 형질전환 여부를 확인할 수 있다(Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)).The transformed plants according to the present invention are confirmed to be transformed by methods known in the art. For example, PCR using DNA samples from tissues of transformed plants can identify foreign genes inserted into the genome of the transgenic plant. Alternatively, Northern or Southern blotting can be performed to confirm the transformation (Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)).

본 발명의 CaPUB1 유전자 및 단백질은 식물체의 저온 스트레스에 대한 내성(저항성)을 증진하는 데 매우 유효하다.
The CaPUB1 gene and protein of the present invention are very effective for enhancing resistance (resistance) to cold stress of a plant.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(a) 본 발명은 식물체의 저온 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다.(a) The present invention provides a composition for promoting low-temperature stress tolerance of a plant.

(b) 본 발명은 상술한 조성물에 의해 형질전환된 형질전환식물세포를 제공한다.(b) The present invention provides a transgenic plant cell transformed with the above-described composition.

(c) 본 발명은 상술한 조성물에 의해 형질전환된 형질전환식물체를 제공한다.(c) The present invention provides a transgenic plant transformed by the above-described composition.

(d) 본 발명은 저온 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다. (d) The present invention provides a method for producing a transgenic plant having enhanced cold stress tolerance.

(e) 본 발명의 조성물 및/또는 방법을 이용하면 효과적으로 식물체의 저온 스트레스 내성을 증진시킬 수 있다. (e) Using the composition and / or method of the present invention, the cold stress tolerance of the plant can be effectively enhanced.

(f) 본 발명의 조성물 및/또는 방법을 이용하면 저온 스트레스 내성이 증진된 식물체를 제조하여, 식물의 생산성을 효과적으로 높일 수 있다.
(f) Using the composition and / or method of the present invention, a plant with enhanced low-temperature stress tolerance can be produced to effectively increase plant productivity.

도 1a는 CaPUB1 유전자를 운반하기 위해 해당 유전자를 삽입한 바이너리 벡터pGA2897의 보더(border) 부분의 모식도를 나타낸다.
도 1b는 형질전환 T0 식물체에서 RNA를 추출하여 역전사 반응을 통해 cDNA를 합성한 후, CaPUB1을 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 진행함으로써 CaPUB1의 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 CaPUB1을 도입한 형질전환 벼 식물체의 독립 라인 선별을 위해 지노믹 서던 블랏 분석를 수행한 결과를 나타낸다.
도 3a는 CaPUB1이 저온 스트레스에 대한 저항성을 변화시키는지 확인하기 위해 저온 스트레스에 대한 저항성을 관찰한 결과를 나타낸다. 야생종 식물체를 대조군으로 사용하였고, CaPUB1 과다 발현 T3 식물체를 실험군으로 사용하였다.
도 3b는 야생종 식물체와 CaPUB1 과다 발현 T3 식물체에 저온 스트레스를 주고 다시 회복하는 실험을 반복하여, 각각의 식물체의 생존율에 대해 통계 처리한 결과를 보여주는 그래프를 나타낸다.
도 4는 CaPUB1 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 나타낸다. 1A is a schematic diagram of a border portion of a binary vector pGA2897 in which the gene is inserted to carry the CaPUB1 gene.
FIG. 1B shows the results of confirming the expression of CaPUB1 by RT-PCR using primers capable of specifically amplifying CaPUB1 after synthesizing cDNA through reverse transcription by extracting RNA from transformed T0 plants.
Fig. 2 shows the result of performing genomic Southern blot analysis for independent line selection of transgenic rice plants into which CaPUB1 was introduced.
Figure 3a shows the results of observing the resistance to cold stress in order to confirm whether CaPUB1 changes the resistance to cold stress. Wild plants were used as controls and CaPUB1 overexpressed T3 plants were used as experimental groups.
FIG. 3B is a graph showing the results of statistical treatment of the survival rate of each plant by repeating the experiment of restoring cold stress to the wild-type plant and the CaPUB1- overexpressing T3 plant.
Figure 4 shows the nucleic acid sequence encoding the CaPUB1 protein.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예Example

실시예 1: Example 1: Ubi:CaPUB1Ubi: CaPUB1 과다발현 형질전환 벼 식물체 제작 Overexpressed Transgenic Rice Plants

CaPUB1을 과다발현하기 위해 CaPUB1의 cDNA를 pENTR SD-TOPO 벡터(Invitrogen)에 삽입한 후, LR 크로나아제 효소(Invitrogen)를 이용하여 운반벡터 pGA2897에 치환하였다. 이를 벼 식물체에 발현시키기 위해 플라스미드를 아그로박테리움 튜메파시엔스 LBA4404에 전기천공법으로 넣어 LBA4404를 형질 전환하였다. CaPUB1 유전자를 운반하기 위해 해당 유전자를 삽입한 바이너리 벡터 pGA2897의 경계(border) 부분의 모식도를 도 1에 나타내었다. 도 1에서, 좌측 보더(Left border, LB)와 우측 보더(Right border, RB) 사이에 위치하는 DNA 서열이 아그로박테리아 LBA4404에 의해 야생종 식물체 게놈에 삽입된다. CaPUB1 유전자는 유비퀴틴 프로모터(Ubiquitin promoter)에 의해서 항상 발현되도록 조절 받는다. After inserting the cDNA of CaPUB1 to overexpress the CaPUB1 the pENTR SD-TOPO vector (Invitrogen), using the LR SEK enzyme (Invitrogen) it was replaced with the carrier vector pGA2897. The plasmid was transformed into Agrobacterium tumefaciens LBA4404 by electroporation in order to express it in rice plants. A schematic diagram of the border portion of the binary vector pGA2897 into which the gene is inserted to carry the CaPUB1 gene is shown in Fig. In Figure 1, the DNA sequence located between the left border (LB) and the right border (RB) is inserted into the wild-type plant genome by Agrobacterium LBA4404. The CaPUB1 gene is regulated to be constantly expressed by the ubiquitin promoter.

야생종인 동진벼의 종자를 40% 락스(유한-크로락스)에 30분간 살균 처리한 후 멸균한 물로 5회 이상 세척한 후, 1일 동안 저온 처리하였다. 처리된 종자를 3% 수크로스, CHU 배지(4 g/L, Duchedfa Biochem), 카사미노산(casamino acid)(300 mg/L, Duchedfa Biochem), L-프롤린(2.9 g/L, Duchefa Biochem), 2,4-D(2 mg/L, sigma aldrich), 0.002% 겔라이트로 구성된 N6D 배지에 심고 28℃에서 7일 이상 배양하여 배아로부터 캘러스(callus)를 유도하였다. 이 캘러스의 형질전환은 앞서 형질 전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스 LBA4404와 4일간 배양하여 수세하고, 히그로마이신 B 항생제를 이용하여 새롭게 자라나는 캘러스를 선별하였다. 선별된 캘러스는 옥신과 싸이토키닌이 포함된 재분화 배지에 배양하여(Sohn et al., Korean J. Breed. 38(3) : 173~179 (2006)) T0 식물체를 획득하였다. 제작한 형질 전환 식물체는 흙으로 옮겨 온실에서 키웠다.
The seeds of Dongjinbyeo, a wild species, were sterilized in 40% lactose (fin-crolax) for 30 minutes, washed with sterilized water 5 times or more, and then treated at low temperature for 1 day. The treated seeds were seeded in a 3% sucrose, CHU medium (4 g / L, Duchedfa Biochem), casamino acid (300 mg / L, Duchedfa Biochem), L-proline (2.9 g / L, Duchefa Biochem) Callus was induced from embryos by planting in N6D medium consisting of 2,4-D (2 mg / L, sigma aldrich) and 0.002% gelite and incubating at 28 ° C for over 7 days. Transformation of this callus was preceded by incubation with transgenic Agrobacterium tumefaciens LBA4404 for 4 days, and newly emerging callus was selected using hygromycin B antibiotic. The selected calli were cultivated in regeneration medium containing auxin and cytokinin (Sohn et al., Korean J. Breed. 38 (3): 173 ~ 179 (2006)). The transgenic plants were transferred to soil and grown in the greenhouse.

실시예 2: Example 2: Ubi:CaPUB1Ubi: CaPUB1 과다발현 형질전환 벼 식물체에서의 In overexpressed transgenic rice plants CaPUB1CaPUB1 유전자 발현 확인 Confirm gene expression

2-1. Total RNA 추출 방법2-1. Total RNA extraction method

영양생산 단계(vegetative stage)의 야생종과 CaPUB1 과다발현 형질전환 벼 식물체의 잎을 액체질소를 이용해 얼린 후 곱게 갈아서 가루로 만들고 2 ml/g 의 RNA 추출 완충액과 섞어준다. 이어서 200 μl의 클로로포름을 넣어서 다시 섞어준 후, 4℃에서 13000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 상층의 용액을 동량의 침전 완충액과 섞어준다. 다시 4℃에서 13000 rpm으로 원심 분리하여 RNA를 침전하는 방법으로 총 RNA(total RNA)를 추출하였다.
The leaves of vegetative stage wild-type and CaPUB1 overexpressed transgenic rice plants are frozen with liquid nitrogen, finely ground and mixed with 2 ml / g of RNA extraction buffer. Then add 200 μl of chloroform, mix again, and centrifuge for 10 minutes at 13000 rpm at 4 ° C. The solution in the upper layer is mixed with the same volume of precipitation buffer. Total RNA (total RNA) was extracted by centrifugation at 13000 rpm at 4 ° C to precipitate RNA.

2-2. 역전사 효소(RT)-PCR2-2. Reverse transcriptase (RT) -PCR

획득한 RNA를 정량하고, 각 샘플당 2 μg씩의 동량의 총 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사 효소반응을 진행하였다. 올리고 dT₍₁₈₎ 프라이머와 TOPscript 역전사 효소(enzynomics)를 이용하여 총 RNA로부터 단일가닥 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA 를 주형으로 하여 CaPUB1을 특이적으로 증폭시키는 PCR을 진행하였다. 10X Taq 폴리머라아제 완충용액(Intron) 2 ㎕, dNTP 혼합액(각 1.25 mM) 2 ㎕, CaPUB1에 상보적인 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 각각 10 pmole 씩, 그리고 1 유닛의 Taq DNA 폴리머라아제(intron)를 넣어 반응물의 부피를 20 ㎕ 로 만들었다. BIORAD C-1000 DNA 써멀 사이클러로 PCR을 수행하였다. 95℃에서 3분간 변성시킨 후, 95℃에서 30초, 52℃에서 30초, 72℃에서 60초를 반복하는 것을 25회 수행하였고, 마지막 단계에서 72℃에서 3분간 추가로 중합반응을 수행한 반응물을 아가로오스 겔에 걸어 전기 영동으로 전개하여 확인하였다. 본 실험에 사용된 프라이머는 아래의 표 1에 나타내었다.
The obtained RNA was quantitated and a reverse transcriptase reaction was carried out to synthesize cDNA from the same amount of total RNA at 2 μg per each sample. Single strand cDNA was synthesized from total RNA using oligo dT ₍₁₈₎ primer and TOPscript reverse transcriptase (enzynomics). PCR was performed to specifically amplify CaPUB1 using the synthesized cDNA as a template. 2 μl of 10X Taq Polymerase Buffer (Intron), 2 μl of dNTP mixture (1.25 mM each), 10 pmoles of forward primer complementary to CaPUB1 and 10 pmoles of reverse primer, and 1 unit of Taq DNA polymerase Was added to make the volume of the reaction product 20 mu l. PCR was performed with BIORAD C-1000 DNA thermal cycler. After denaturation at 95 ° C for 3 minutes, the reaction was repeated 25 times at 95 ° C for 30 seconds, 52 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 60 seconds, and the polymerization was further performed at 72 ° C for 3 minutes The reaction product was applied to an agarose gel and developed by electrophoresis. The primers used in this experiment are shown in Table 1 below.

실시예 3: Example 3: Ubi:CaPUB1 Ubi: CaPUB1 과다발현 형질전환 벼 식물체의 독립라인 선별Independent line screening of over-expressing transgenic rice plants

CaPUB1을 과다 발현하는 T0 형질전환 벼 식물체와 야생종의 잎을 액체질소를 이용해 얼려서 곱게 간 후, 0.8 ml의 DNA 추출 완충액(CTAB 버퍼; CTAB 2 g, PVP-40 2 g, 아스코르브산 0.08 g, 5 M NaCl 28.4 ml, 0.5 M EDTA(pH 8.0) 4 ml, 1 M Tris-Cl(pH 8.0)/100 ml)을 넣고 섞어주었다. 65℃에서 10분 동안 배양(incubation)하고 클로로포름을 0.8 ml 넣어 섞어준 후, 4℃에서 13000 rpm으로 원심 분리하여 상층의 용액을 동량의 침전 완충액과 섞어주었다. 다시 4℃에서 13000 rpm으로 원심 분리하여 침전하는 방법으로 지노믹 DNA를 추출하였다. 분리한 지노믹 DNA를 EcoRI 제한효소로 12시간 동안 충분히 잘랐다. 이를 0.8% 아가로오스 겔에 걸어 전기 영동으로 전개한 후 모세관 수송(capillary transfer) 방법을 이용해 나일론 멤브레인(membrane)에 옮긴다. 이 멤브레인에 hph에 상보적이며 32^P로 표지된 프로브를 사용하여 16시간 동안 혼성화(hybridization)를 진행하고, 2X SSPE 완충액으로 20분씩 2번, 1X SSPE 완충액으로 10분씩 2번 씻어준다. 마지막으로 멤브레인을 IP판에 감광하여 독립 라인을 선별하였다. 프로브합성에 사용한 프라이머는 표1에 나타내었다.
The leaves of T0 transgenic rice plants and wild-type plants overexpressing CaPUB1 were frozen in liquid nitrogen and finely ground. Then, 0.8 ml of DNA extraction buffer (CTAB buffer: 2 g of CTAB, 2 g of PVP-40, 0.08 g of ascorbic acid, M NaCl (28.4 ml), 0.5 M EDTA (pH 8.0) 4 ml, and 1 M Tris-Cl (pH 8.0) / 100 ml) were added and mixed. The mixture was incubated at 65 ° C for 10 minutes, and 0.8 ml of chloroform was added thereto. The mixture was centrifuged at 13000 rpm at 4 ° C, and the solution in the upper layer was mixed with the same amount of the precipitation buffer. And then genomic DNA was extracted by centrifugation at 13000 rpm at 4 ° C for precipitation. The separated genomic DNA was sufficiently digested with EcoRI restriction enzyme for 12 hours. It is electrophoresed on a 0.8% agarose gel and transferred to a nylon membrane using a capillary transfer method. Proceed with the hybridization (hybridization) for 16 hours with complementary to the hph and used as a 32 ^P labeled probe on the membrane, and once for 20 minutes with 2X SSPE buffer 2, for 10 minutes and wash twice with 1X SSPE buffer. Finally, the membrane was sensitized to an IP plate to select independent lines. The primers used for the probe synthesis are shown in Table 1.

실시예 4: Example 4: Ubi:CaPUB1Ubi: CaPUB1 과다발현 형질전환 벼 식물체의 저온 저항성 표현형 분석 Phenotypic resistance phenotype analysis of over-expressing transgenic rice plants

CaPUB1을 벼에 도입하였을 때 저온 스트레스에 대한 저항성이 변화되는지 확인하기 위해 야생종 식물체와 CaPUB1 과다 발현 T3 식물체의 종자를 40% 락스(유한-크로락스)에 30분간 소독한 후, 4℃에 1일 동안 저온 처리하였다. 처리한 종자를 각각 0.7% 파이토아가(phytoagar)가 포함된 ㅍMS 배지(MS medium 2.2 g/L(duchefa), 3% 수크로스)에 심어서 28℃ 챔버에서 발아시키고, 2일이 지난 후 CaPUB1 과다발현 식물체는 히그로마이신 B 항생제(Duchefa)가 40 mg/L 농도로 포함된 ㅍMS 배지(비타민들을 함유하는 MS 배지 2.2 g/L(Duchefa), 3% 수크로스, 파이토아가 7 g/1 L)로 옮긴다. 발아일로부터 7일이 지나면 하나의 화분에 야생종과 CaPUB1 과다 발현 식물체를 구분하여 심어주고 28℃ 배양실에서 4주 동안 성장시켰다(16시간 광 조건/8시간 암 조건). 위 화분을 4℃ 챔버에 넣어 저온 환경스트레스에 6일간 노출시킨 후, 다시 28℃ 배양실로 옮겨주었다. 생존율은 생장을 재개하거나 회복 시점으로부터 10일 이상이 지났을 때에도 줄기 부분에 세포 사멸 등이 진행되지 않아 초록색을 띠는 것을 기준으로 분석하였다. 야생종 식물체의 경우 0%에 가까운 생존율을 보였으나 CaPUB1 과다발현 식물체(#2, 4)의 경우 70%에 달하는 생존율을 나타내었다. 이러한 결과를 통해 CaPUB1을 벼에 도입하였을 때 저온 스트레스에 대한 저항성이 월등히 향상되는 것을 확인하였다.
To determine whether resistance to cold stress when CaPUB1 was introduced into rice, seeds of wild-type and CaPUB1- overexpressing T3 plants were sterilized in 40% lactose ( fin-crolax ) for 30 minutes, Lt; / RTI > The treated seeds were germinated in a 28 ° C chamber in a MS medium (MS medium 2.2 g / L (duchefa), 3% sucrose) each containing 0.7% phytoagar and after 2 days CaPUB1 Over-expressing plants were grown in MS medium (MS medium containing vitamins 2.2 g / L (Duchefa), 3% sucrose, 7 g / l phytoacetin) containing hygromycin B antibiotic (Duchefa) L). Seven days after germination, wild plants and CaPUB1 overexpressed plants were planted in a single pot and grown for 4 weeks in a 28 ° C incubator (16 hours light condition / 8 hours dark condition). The stomachs were placed in a 4 ° C chamber, exposed to low temperature environmental stress for 6 days, and then transferred to a 28 ° C culture room. The survival rate was analyzed based on the fact that the cells did not develop cell death at the stem even when the growth was resumed or more than 10 days after the recovery. Wild-type plants showed a survival rate close to 0%, whereas CaPUB1 overexpressed plants (# 2, 4) showed a survival rate of 70%. These results show that CaPUB1 is highly resistant to cold stress when introduced into rice.

결과result

1. 아그로박테리아를 이용하여 1. Using Agrobacterium CaPUB1CaPUB1 유전자를 벼에 도입하는 조직 배양 실험 Tissue culture experiment to introduce genes into rice

아그로박테리아를 이용해 CaPUB1 유전자를 벼에 도입하는 조직 배양 실험을 수행하였다. 야생종 벼의 캘러스를 아그로박테리아가 감염시키도록 3일간 암 조건에서 배양한 이후, 히그로마이신 B가 함유된 배지에서 배양하여 보더(border) 시퀀스가 삽입된 캘러스를 선별하였다. 선별된 캘러스로부터 재분화 과정을 거쳐 CaPUB1을 과다 발현하는 식물체를 제작하였다. 획득한 형질전환 T0 식물체에서 RNA를 추출하여 역전사 반응을 통해 cDNA를 합성한 후, CaPUB1을 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 진행함으로써 CaPUB1의 발현을 확인하였다. 야생종에서는 CaPUB1이 발현되지 않고, 형질전환 식물체에서 CaPUB1이 mRNA 수준에서 발현되고 있음을 확인하였다(참조: 도 1b).
Tissue culture experiments in which CaPUB1 gene was introduced into rice using Agrobacterium bacteria were performed. The callus of the wild-type rice paddy was cultured in a dark condition for 3 days to allow the Agrobacterium to infect, and then cultured in a medium containing hygromycin B to select a callus inserted with a border sequence. After regeneration from the selected calli, the plant overexpressing CaPUB1 was constructed. RNA was extracted from the obtained transformed T0 plants, cDNA was synthesized by reverse transcription, and RT-PCR was performed using a primer capable of specifically amplifying CaPUB1 to confirm the expression of CaPUB1 . The wild species is not CaPUB1 expression, the CaPUB1 in the transgenic plant was confirmed that this is expressed in the mRNA level (Figure 1b).

2. 2. CaPUB1CaPUB1 을 도입한 형질전환 벼 식물체의 독립 라인 선별Screening of independent lines of transgenic rice plants introduced

CaPUB1을 도입한 형질전환 벼 식물체의 독립 라인 선별을 위해 지노믹 서던 블랏 분석을 수행하였다. 야생종과 CaPUB1 과다발현 식물체의 잎에서 지노믹 DNA를 추출한 후, EcoRI 제한효소로 충분히 자른다. 처리한 지노믹 DNA를 아가로오스 겔에 걸어 전기 영동으로 전개한 후 나일론 멤브레인에 옮겨서 hph에 상보적이며 32^P로 표지된 프로브를 사용하여 혼성화를 진행함으로써 독립 라인을 선별하였다(참조: 도 2).
Genomic Southern blot analysis was performed for independent line selection of transgenic rice plants transfected with CaPUB1 . After extracting genomic DNA from the leaves of wild-type and CaPUB1- overexpressing plants, digest with EcoRI restriction enzyme. The processed genomic DNA was electrophoresed on an agarose gel, transferred to a nylon membrane, hybridized with a probe labeled with 32 ^p complementary to hph to select independent lines (see FIG. 2 ).

3. 저온 스트레스에 대한 저항성 관찰3. Resistance to cold stress

CaPUB1이 저온 스트레스에 대한 저항성을 변화시키는지 확인하기 위해 저온 스트레스에 대한 저항성을 관찰하였다. 야생종 식물체와 CaPUB1 과다 발현 T3 식물체를 28℃ 챔버에서 발아시켜 7일 키운 후, 하나의 화분에 야생종 식물체와 CaPUB1 과다 발현 식물체를 옮겨 심는다. 28℃에서 4주 동안 추가로 키운 다음, 4℃ 저온 챔버에 넣어 저온 스트레스를 6일간 준 후, 다시 28℃ 배양실로 옮겨 생장이 회복되는지 확인하였다. 야생종 식물체의 경우 저온 스트레스로부터 회복한 지 한 달이 지난 후에도 거의 모든 개체가 살지 못하였다. 반면, CaPUB1 과다발현 식물체(#2, 4)의 경우 야생종에 비해 훨씬 많은 개체가 생존하였으며, 저온 스트레스로 인해 정지되었던 생장이 회복 이후에 다시 진행되는 표현형을 나타내었다(참조: 도 3a). Resistance to cold stress was observed to determine if CaPUB1 changes resistance to cold stress. Wild plant and CaPUB1 overexpressed T3 plants were germinated in a 28 ° C chamber for 7 days and then transplanted with wild-type and CaPUB1 overexpressed plants in a single pot. After incubation at 28 ° C for 4 weeks, the cells were placed in a 4 ° C low-temperature chamber, subjected to cold stress for 6 days, and then transferred to a 28 ° C incubator for growth recovery. Almost all of the wild-type plants did not survive after one month of recovery from cold stress. On the other hand, in CaPUB1 overexpressed plants (# 2, 4), much more individuals survived than in wild type, and the growth stopped after cold stress showed a phenotype that resumed after recovery (see Figure 3A).

야생종 식물체와 CaPUB1 과다 발현 T3 식물체에 저온 스트레스를 주고 다시 회복하는 실험을 반복하여 각각의 식물체의 생존율을 통계 처리를 하여 생존율 그래프로 나타내었다. #2의 경우 3번의 실험을 반복 수행하였고(참조: 표 2), #4의 경우 4번의 실험을 반복 수행하였다(참조: 표 3). CaPUB1 과다 발현 형질전환 식물체가 저온 스트레스에 저항성이 있음을 확인할 수 있었다(참조: 도 3b).Survival rates of each plant were statistically analyzed by the survival rate graph by repeating the experiment in which the wild type plant and the CaPUB1 overexpressing T3 plant were subjected to cold stress and restored again. In case # 2, three experiments were repeated (see Table 2), and in case of # 4, four experiments were repeated (see Table 3). It was confirmed that the CaPUB1 over-expressing transgenic plants were resistant to cold stress (see FIG. 3B).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Compositions for Enhancing Cold Stress Tolerance and Transgenic Plants Using the Same <130> PN140524 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 407 <212> PRT <213> Capsicum annuum cv. Pukang <400> 1 Met Glu Glu Ile Gln Val Pro Pro Tyr Phe Leu Cys Pro Ile Ser Leu 1 5 10 15 Glu Met Met Lys Asp Pro Val Thr Ile Ser Thr Gly Ile Thr Tyr Asp 20 25 30 Arg Glu Asn Ile Glu Arg Trp Ile Phe Ser Ala Lys Asn Asn Thr Cys 35 40 45 Pro Val Thr Lys Gln Ser Leu Thr Ser Ile Glu Leu Thr Pro Asn Val 50 55 60 Thr Leu Arg Arg Phe Ile Gln Ser Trp Cys Thr Leu Asn Ala Ser His 65 70 75 80 Gly Ile Glu Arg Phe Pro Thr Pro Lys Pro Pro Val Ser Lys Ala Gln 85 90 95 Ile Leu Lys Leu Met Lys Glu Ala Lys Ser Arg Glu Met Gln Met Lys 100 105 110 Ser Leu Asn Thr Leu Arg Ser Ile Ala Ser Val Asn Asp Ala Asn Lys 115 120 125 Arg Cys Met Glu Ser Ala Gly Ala Ala Glu Phe Leu Ala Ser Val Val 130 135 140 Ile Asp Ser Ser Asp Val Leu Gly Glu Glu Gly Phe Met Ser Thr Lys 145 150 155 160 Asp Glu Ala Leu Ser Ile Leu Tyr Gln Leu Lys Leu Ser Glu Asp Gly 165 170 175 Leu Arg Ser Leu Ile Thr Ser Gly Asn Gly Glu Phe Ile Glu Ser Leu 180 185 190 Thr Arg Val Met Gln Arg Gly Ser Tyr Glu Ser Arg Ala Tyr Ala Val 195 200 205 Met Leu Met Lys Asp Met Phe Glu Ala Ser Thr Leu Pro Thr Leu Phe 210 215 220 Ser Ser Leu Lys Lys Glu Phe Phe Ala Gln Val Val Arg Val Leu Arg 225 230 235 240 Asp Glu Ile Ser Gln Lys Ala Thr Lys Ala Ser Leu Gln Val Leu Ala 245 250 255 His Ala Cys Pro Phe Gly Arg Asn Arg Val Lys Ala Ala Glu Ala Gly 260 265 270 Ala Val Arg Val Leu Val Asp Leu Leu Leu Asp Ser Ser Glu Lys Arg 275 280 285 Thr Cys Glu Leu Met Leu Ile Leu Leu Asp Gln Ile Cys Gln Ser Ala 290 295 300 Glu Gly Arg Ala Glu Leu Leu Asn His Pro Gly Gly Leu Ala Ile Val 305 310 315 320 Ser Lys Lys Ile Leu Arg Val Ser Lys Val Gly Ser Glu Arg Ala Ile 325 330 335 Lys Ile Leu His Ser Ile Ser Lys Phe Ser Ser Thr Gln Ser Val Val 340 345 350 Gln Glu Met Leu Ser Leu Gly Val Val Ala Lys Leu Cys Leu Val Leu 355 360 365 Gln Val Asp Cys Gly Ser Lys Ala Lys Asp Arg Ala Arg Asp Ile Leu 370 375 380 Lys Ile His Ala Lys Ala Trp Arg Asn Ser Pro Cys Ile Pro Met Asn 385 390 395 400 Leu Leu Ser Ser Tyr Pro Phe 405 <210> 2 <211> 1405 <212> DNA <213> Capsicum annuum cv. Pukang <400> 2 gggatccggc acgaggcttg tttttagtca tatttgcaat ctttcttata agattctcct 60 ccttcgaata atcttgaaaa attttcaaag tacaaatgga agaaattcaa gtaccacctt 120 atttcctctg tccgatttca ctggagatga tgaaagatcc agtcacgatc tcgactggaa 180 taacatacga tcgagagaac atcgagagat ggatattctc agctaagaac aatacgtgtc 240 cggttacgaa gcaatccctt acgagcatag agttgacccc taatgtcact ctacgacgat 300 tcatccaatc gtggtgtact ctcaatgcgt cccatggcat cgagaggttc cctacaccga 360 agcctccggt cagcaaagct caaatcttaa agctcatgaa agaagcgaaa tcgcgcgaaa 420 tgcaaatgaa atcactcaac acacttagat ccatagcttc tgtgaacgat gctaacaagc 480 gttgcatgga gtctgcgggc gcagcggagt tcttagcctc tgttgtgatt gattcgagtg 540 atgtgttggg tgaagagggt ttcatgagta ctaaagatga agcattaagc atcctctacc 600 aactcaagtt atcagaagat ggattgaggt cactcatcac gagtggaaat ggtgaattca 660 tcgagtcact gacacgcgtc atgcagcgtg ggagctatga gtcaagggct tacgcggtga 720 tgctgatgaa agacatgttc gaagcatcca cactaccaac tctattttcg agcttgaaga 780 aagagttctt cgctcaagtg gttcgagtct tgagggatga gatctctcaa aaggccacca 840 aagcgtcatt gcaagtgcta gcgcacgcgt gtccatttgg gaggaacaga gtgaaagcag 900 ctgaggcagg agccgttagg gttttggtgg accttctgct cgattcatcc gagaaaagga 960 cctgcgaact gatgctaatc ttgctggatc aaatttgtca gagcgcagaa gggagagccg 1020 agctgttgaa tcatccggga gggttagcca tcgtctcgaa gaaaatactt agggtttcga 1080 aagtagggag cgaaagggca atcaagatat tgcattcgat atcaaagttt tcatcaacac 1140 aaagtgttgt tcaagagatg ttgagtttgg gtgttgtggc aaagctttgt ttggtacttc 1200 aagttgattg tggaagtaaa gctaaggata gagctagaga tattctcaaa attcatgcaa 1260 aggcatggag gaattctcct tgtataccta tgaatttatt atcttcatat ccattttagg 1320 aaaataggac caaaagagca aacaattgta atgatttgat agaaatagga aacacaaaaa 1380 agaaatcagt aaatgatttg tgtac 1405 <110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Compositions for Enhancing Cold Stress Tolerance and Transgenic Plants Using the Same <130> PN140524 <160> 2 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 407 <212> PRT <213> Capsicum annuum cv. Pukang <400> 1 Met Glu Glu Ile Gln Val Pro Pro Tyr Phe Leu Cys Pro Ile Ser Leu 1 5 10 15 Glu Met Met Lys Asp Pro Val Thr Ile Ser Thr Gly Ile Thr Tyr Asp 20 25 30 Arg Glu Asn Ile Glu Arg Trp Ile Phe Ser Ala Lys Asn Asn Thr Cys 35 40 45 Pro Val Thr Lys Gln Ser Leu Thr Ser Ile Glu Leu Thr Pro Asn Val 50 55 60 Thr Leu Arg Arg Phe Ile Gln Ser Trp Cys Thr Leu Asn Ala Ser His 65 70 75 80 Gly Ile Glu Arg Phe Pro Thr Pro Lys Pro Pro Val Ser Lys Ala Gln 85 90 95 Ile Leu Lys Leu Met Lys Glu Ala Lys Ser Arg Glu Met Gln Met Lys 100 105 110 Ser Leu Asn Thr Leu Arg Ser Ser Ale Ser Val Asn Asp Ala Asn Lys 115 120 125 Arg Cys Met Glu Ser Ala Gly Ala Ala Glu Phe Leu Ala Ser Val Val 130 135 140 Ile Asp Ser Ser Asp Val Leu Gly Glu Glu Gly Phe Met Ser Thr Lys 145 150 155 160 Asp Glu Ala Leu Ser Ile Leu Tyr Gln Leu Lys Leu Ser Glu Asp Gly 165 170 175 Leu Arg Ser Leu Ile Thr Ser Gly Asn Gly Glu Phe Ile Glu Ser Leu 180 185 190 Thr Arg Val Met Gln Arg Gly Ser Tyr Glu Ser Arg Ala Tyr Ala Val 195 200 205 Met Leu Met Lys Asp Met Phe Glu Ala Ser Thr Leu Pro Thr Leu Phe 210 215 220 Ser Ser Leu Lys Lys Glu Phe Phe Ala Gln Val Val Arg Val Leu Arg 225 230 235 240 Asp Glu Ile Ser Gln Lys Ala Thr Lys Ala Ser Leu Gln Val Leu Ala 245 250 255 His Ala Cys Pro Phe Gly Arg Asn Arg Val Lys Ala Ala Glu Ala Gly 260 265 270 Ala Val Arg Val Leu Val Asp Leu Leu Leu Asp Ser Ser Glu Lys Arg 275 280 285 Thr Cys Glu Leu Met Leu Ile Leu Leu Asp Gln Ile Cys Gln Ser Ala 290 295 300 Glu Gly Arg Ala Glu Leu Leu Asn His Pro Gly Gly Leu Ala Ile Val 305 310 315 320 Ser Lys Lys Ile Leu Arg Val Ser Lys Val Gly Ser Glu Arg Ala Ile 325 330 335 Lys Ile Leu His Ser Ile Ser Lys Phe Ser Ser Thr Gln Ser Val Val 340 345 350 Gln Glu Met Leu Ser Leu Gly Val Val Ala Lys Leu Cys Leu Val Leu 355 360 365 Gln Val Asp Cys Gly Ser Lys Ala Lys Asp Arg Ala Arg Asp Ile Leu 370 375 380 Lys Ile His Ala Lys Ala Trp Arg Asn Ser Pro Cys Ile Pro Met Asn 385 390 395 400 Leu Leu Ser Ser Tyr Pro Phe 405 <210> 2 <211> 1405 <212> DNA <213> Capsicum annuum cv. Pukang <400> 2 gggatccggc acgaggcttg tttttagtca tatttgcaat ctttcttata agattctcct 60 ccttcgaata atcttgaaaa attttcaaag tacaaatgga agaaattcaa gtaccacctt 120 atttcctctg tccgatttca ctggagatga tgaaagatcc agtcacgatc tcgactggaa 180 taacatacga tcgagagaac atcgagagat ggatattctc agctaagaac aatacgtgtc 240 cggttacgaa gcaatccctt acgagcatag agttgacccc taatgtcact ctacgacgat 300 tcatccaatc gtggtgtact ctcaatgcgt cccatggcat cgagaggttc cctacaccga 360 agcctccggt cagcaaagct caaatcttaa agctcatgaa agaagcgaaa tcgcgcgaaa 420 tgcaaatgaa atcactcaac acacttagat ccatagcttc tgtgaacgat gctaacaagc 480 gttgcatgga gtctgcgggc gcagcggagt tcttagcctc tgttgtgatt gattcgagtg 540 atgtgttggg tgaagagggt ttcatgagta ctaaagatga agcattaagc atcctctacc 600 aactcaagtt atcagaagat ggattgaggt cactcatcac gagtggaaat ggtgaattca 660 tcgagtcact gacacgcgtc atgcagcgtg ggagctatga gtcaagggct tacgcggtga 720 tgctgatgaa agacatgttc gaagcatcca cactaccaac tctattttcg agcttgaaga 780 aagagttctt cgctcaagtg gttcgagtct tgagggatga gatctctcaa aaggccacca 840 aagcgtcatt gcaagtgcta gcgcacgcgt gtccatttgg gaggaacaga gtgaaagcag 900 ctgaggcagg agccgttagg gttttggtgg accttctgct cgattcatcc gagaaaagga 960 cctgcgaact gatgctaatc ttgctggatc aaatttgtca gagcgcagaa gggagagccg 1020 agctgttgaa tcatccggga gggttagcca tcgtctcgaa gaaaatactt agggtttcga 1080 aagtagggag cgaaagggca atcaagatat tgcattcgat atcaaagttt tcatcaacac 1140 aaagtgttgt tcaagagatg ttgagtttgg gtgttgtggc aaagctttgt ttggtacttc 1200 aagttgattg tggaagtaaa gctaaggata gagctagaga tattctcaaa attcatgcaa 1260 aggcatggag gaattctcct tgtataccta tgaatttatt atcttcatat ccattttagg 1320 aaaataggac caaaagagca aacaattgta atgatttgat agaaatagga aacacaaaaa 1380 agaaatcagt aaatgatttg tgtac 1405

Claims

A composition for promoting low-temperature stress tolerance of a plant comprising a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID No. 1.

2. The composition of claim 1, wherein the nucleotide sequence comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.

(a) a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; (b) a promoter that is operatively linked to the nucleotide sequence and that forms RNA molecules in plant cells; And (c) a recombinant vector for plant expression comprising a poly A signal sequence that acts in plant cells to cause polyadenylation of the 3'-terminal of the RNA molecule.

A transformed plant cell transformed by the composition of any one of claims 1 to 3.

A transgenic plant transformed by the composition of any one of claims 1 to 3.

A method for producing a transgenic plant having enhanced cold stress tolerance comprising the steps of:
(a) transforming a plant cell or plant tissue into a vector comprising a nucleotide sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence of Sequence Listing 1;
(b) screening the transformed plant cell or plant tissue; And
(c) regenerating the plant from the transformed plant cell or plant tissue to obtain a transformed plant.