KR20160010717A - Novel sucrose isomerase and process for preparing the same - Google Patents

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KR20160010717A
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Abstract

The present invention relates to novel sucrose isomerase which can produce large quantities of trehalulose from sucrose, to polynucleotide for coding the sucrose isomerase, to an expression vector comprising the polynucleotide, to a transformant in which the expression vector is induced in a host cell, and a method for manufacturing the novel sucrose isomerase by using the transformant. The sucrose isomerase provided in the present invention can mass-produce trehalulose from sucrose more than isomaltulose, and can be broadly used for developing a sweetener by using trehalulose.

Description

신규한 수크로스이성화효소 및 이의 제조방법{Novel sucrose isomerase and process for preparing the same}Novel sucrose isomerase and process for preparing the same,

본 발명은 신규한 수크로스이성화효소 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 수크로스로부터 트레할룰로스를 다량으로 생산할 수 있는 신규한 수크로스이성화효소, 상기 수크로스이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 상기 신규한 수크로스이성화효소를 제조하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a novel sucrose isomerase and a process for producing the same. More specifically, the present invention relates to a novel sucrose isomerase capable of producing a large amount of trehalulose from sucrose, A polynucleotide encoding the polynucleotide, an expression vector containing the polynucleotide, a transformant into which the expression vector is introduced into a host cell, and a method for producing the novel sucrose isomerase using the transformant.

당은 생명체에서 사용되는 에너지를 공급하는 주요 공급원으로 사용되고, 생체내의 다양한 활성성분을 구성하는 구성요소로서 사용될 뿐만 아니라, 다양한 식품의 기호성을 증진시키는 물질로서 사용되고 있다. 최근에는, 식품의 기호성을 증진시키기 위한 목적으로 과량의 당이 생체내로 유입되고 있으며, 이러한 당의 과도한 유입으로 인한 위험성이 우려되고 있는데, 예를 들어, 심혈관 질환의 발병율 증가, 비만 및 당뇨성 질환의 발병율 증가, 면역체계 대사교란성 질환의 발병율 증가 등이 우려되고 있다. 이러한 위험성을 저하시키기 위하여, 당의 과도한 유입을 억제하거나, 당의 유입량을 감소시키거나, 유입된 당을 효과적으로 소모시키거나, 위험성이 낮은 당을 개발하는 방안 등이 연구되고 있다. BACKGROUND ART [0002] Sugars are used as a main source for supplying energy used in living organisms, and are used not only as a component constituting various active ingredients in living bodies, but also as a substance for enhancing palatability of various foods. In recent years, an excessive amount of sugar has been introduced into the body for the purpose of enhancing the palatability of food, and there is a concern about the risk due to excessive introduction of such sugar. For example, an increase in the incidence of cardiovascular diseases, Increased incidence, and increased incidence of immune system metabolic disturbances. To reduce these risks, research is under way to curb excessive influx of sugar, to reduce the influx of sugars, to effectively consume imported sugars, and to develop low-risk sugars.

상기 방안 중에서 위험성이 낮은 당을 개발하려는 방안은 식품의 기호성을 증진시킬 수 있으면서도, 당의 과도한 유입으로 인한 위험성을 저하시키는 효과를 나타내기 때문에, 다양한 당 대용품을 개발하는 방향으로 활발한 연구가 진행되고 있다. 지금까지 개발된 당 대용품은 크게 천연 화합물과 인공 화합물로 구분되는데, 상기 천연 화합물로는 이소말툴로스, 스테비아, 타가토스, 타우마린, 에리트리톨, 말티톨, 자일리톨 등이 알려져 있고, 상기 인공 화합물로는 아세설팜 칼륨, 아스파탐, 네오탐, 사카린, 수크랄로스 등이 알려져 있다. 상기 당 대용품 중에서 인공 화합물은 제조가 용이하여 생산단가가 낮다는 장점이 있는 반면, 생체에 미치는 영향에 대한 연구가 아직 미흡하여 그의 사용이 제한되고 있는 반면, 천연 화합물은 생체에 대한 안전성이 입증되었다는 장점이 있는 반면, 상대적으로 생산단가가 높다는 단점이 있다. 현재로서는, 인공 화합물의 생체에 미치는 영향을 연구하는 것 보다는, 천연 화합물의 생산단가를 저하시키는 연구가 더욱 효율적인 것으로 간주되고 있어, 천연 화합물의 생산단가를 저하시키려는 연구가 활발히 진행되고 있다.Among the above measures, a method for developing low-risk sugars has the effect of improving the palatability of foods, but also exhibits an effect of reducing the risk due to excessive introduction of sugars, and active research is under way to develop various substitute products . It is known that isomaltulose, stevia, tagatose, taumarine, erythritol, maltitol, xylitol and the like are known as the natural compounds, and as the artificial compound, Acesulfame potassium, aspartame, neotham, saccharin, sucralose, and the like are known. Among the above-mentioned substitutes, artificial compounds are advantageous because they are easy to produce and have a low production cost. However, studies on the effects on living organisms are still insufficient and their use is limited, while natural compounds have been proved to be safe for living organisms While there are advantages, there is a drawback that the production cost is relatively high. At present, research for lowering the production cost of a natural compound is considered to be more efficient than studying the effect of an artificial compound on a living body, and researches for reducing the production cost of a natural compound are actively conducted.

상기 천연 화합물 중에서 이소말툴로스(palatinose™, α-D-글루코피라노실-1,6-D-프럭토퓨라노스)는 수크로스(α-D-글루코피라노실-1,2-D-프럭토퓨라노스)의 이성질체로서, 수크로스와 동일한 칼로리를 나타내지만, 글리세믹 지수(glycemic index, GI)가 낮아서, 이의 분해로부터 생성되는 글루코스 단량체가 혈액내로 천천히 유입되므로, 당뇨병 환자용 식품의 감미료로 사용될 수 있다고 알려져 있고, 고지혈증 환자에게 투여할 경우에는 혈관병증에 대한 내성을 증진시킨다고 알려져 있다. 뿐만 아니라, 우수한 산 안정성, 낮은 흡습성 등의 물리화학적 특성이 규명되고 있어, 상기 이소말툴로스의 사용범위가 확대되고 있는 실정이다. Among the above natural compounds, isomaltulose (α-D-glucopyranosyl-1,6-D-fructofuranos) is produced by reacting sucrose (α-D-glucopyranosyl-1,2-D-fructofuranos ), Which has the same caloric value as sucrose but has a low glycemic index (GI), and glucose monomer produced from its decomposition is slowly introduced into the blood, so that it can be used as a sweetener for foods for diabetic patients And it is known that when administered to patients with hyperlipidemia, they increase resistance to vascular diseases. In addition, physical and chemical properties such as excellent acid stability and low hygroscopicity have been clarified, and the use range of isomaltulose has been expanded.

상기 이소말툴로스는 수크로스를 효소처리하여 생산될 수 있는데, 부산물로서 트레할룰로스(trehalulose 또는 α-D-글루코피라노실-1,1-d-프럭토퓨라노스)가 함께 생성되며, 이러한 효소활성은 엔테로박터 속(Enterobacter sp.) 미생물, 에르위니아 속(Erwinia sp.) 미생물, 클렙시엘라 속(Klebsiella sp.) 미생물, 판토에아 속(Pantoea sp.) 미생물, 프로타미노박터 속(Protaminobacter sp.) 미생물 등의 다양한 미생물에서 확인되었는데, 이들 미생물로부터 발현되는 수크로스이성화효소(sucrose isomerase) 또는 이소말툴로스 합성효소(isomaltulose synthase, siase, EC5.4.99.11)가 수크로스를 이소말툴로스 및 트레할룰로스로 전환시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 대부분의 수크로스이성화효소는 이소말툴로스를 트레할룰로스 보다도 더 많이 생성하는데, 일부 균주(Pseudomonas mesoacidophila MX-45 및 Agrobacterium radiobacter MX-232)에서 발현되는 수크로스이성화효소는 트레할룰로스를 이소말툴로스보다도 더 많이 생산한다고 알려져 있다. 상기 미생물에서 수크로스이성화효소가 발현되는 원인은 상기 미생물의 특성과 연관된 것으로 알려져 있다. 즉, 상기 미생물 들은 대부분 식물체에 기생하는 미생물로서, 대부분의 식물체가 탄소원으로서 수크로스를 사용하고 있으므로, 식물체로부터 얻어진 수크로스를 식물체가 사용하지 못하는 이소말툴로스 또는 트레할룰로스로 전환시켜, 미생물의 생존성을 향상시키기 위하여, 상기 수크로스이성화효소가 발현되는 것으로 예측되고 있다.The isomaltulose can be produced by enzymatic treatment of sucrose. Trehalulose or? -D-glucopyranosyl-1,1-d-fructofuranos is produced as a by-product. The activity may be selected from the group consisting of Enterobacter sp., Erwinia sp., Klebsiella sp., Pantoea sp., Protaminobacter sp. It has been confirmed in various microorganisms such as microorganisms that sucrose isomerase or isomaltulose synthase (EC 5.4.99.11), which is expressed from these microorganisms, ≪ / RTI > and trehalulose. Most sucrose isomerases produce isomaltulose more than trehalulose, although some strains ( Pseudomonas mesoacidophila MX-45 and Agrobacterium The sucrose isomerase expressed in radiobacter MX-232 is known to produce trehalulose more than isomaltulose. It is known that the cause of the expression of sucrose isomerase in the microorganism is related to the characteristics of the microorganism. That is, most of the microorganisms are microorganisms parasitic to plants, and most plants use sucrose as a carbon source. Therefore, it is possible to convert sucrose obtained from plants into isomaltulose or trehalulose, It is predicted that the sucrose isomerase is expressed.

한편, 상술한 장점에도 불구하고, 이소말툴로스는 수크로스보다도 수용성이 낮아서, 식품의 사용이 제한되고 있다. 예를 들어, 잼, 음료 등에 수크로스 대신 이소말툴로스를 사용할 경우, 일정시간 동안 보관된 후에는 제품내에서 이소말툴로스의 재결정화가 발생하여, 제품의 품질이 저하되는 문제점이 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위한 방안으로서, 이소말툴로스와 함께 생성되는 트레할룰로스를 사용하는 방안이 검토되고 있다. 트레할룰로스는 이소말툴로스와 유사한 특성을 나타내지만 수크로스와 동일한 수준의 수용성을 나타내기 때문에, 이소말툴로스를 대체할 수 있을 것으로 예상되었다. 다만, 수크로스이성화효소에 의하여 이소말툴로스보다 상대적으로 적은 량으로 생성되기 때문에, 이의 생산단가가 상대적으로 높아서, 산업적인 활용성이 낮다는 문제점이 있다. On the other hand, despite the advantages mentioned above, isomaltulose is lower in water solubility than sucrose and the use of food is limited. For example, when isomaltulose is used instead of sucrose in jams, beverages and the like, recrystallization of isomaltulose occurs in the product after storage for a certain period of time, thereby deteriorating the quality of the product. As a solution to this problem, a method of using trehalulose produced with isomaltulose has been studied. Trehalulose was expected to replace isomaltulose because it exhibits similar properties to isomaltulose but exhibits the same level of water solubility as sucrose. However, since it is produced by sucrose isomerase in a relatively smaller amount than isomaltulose, its production unit price is relatively high, and the industrial applicability is low.

이러한 문제점을 해결하기 위한 다양한 연구가 수행되고 있다. 예를 들어, 한국공개특허 제1992-0008192호에는 슈도모나스(Pseudomonas sp.) 또는 아그로박테리움(Agrobacterium sp.) 속에 속하는 미생물에서 발현된 트레할룰로스 생성효소를 이용하여 수크로스로부터 트레할룰로스를 다량으로 생산하는 기술이 개시되어 있고, 미국공개특허 제2013-0295617호에는 펙토박테리움 속 미생물(Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis PBR1692)로부터 유래된 수크로스 이성화효소를 이용하여 수크로스로부터 트레할룰로스를 생산하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 아직까지는 트레할룰로스의 생산성이 낮아서, 산업적으로 트레할룰로스를 이용하는데 어려움이 있으며, 이러한 어려움을 해결하기 위하여, 보다 높은 생산성으로 트레할룰로스를 생산할 수 있는 기술의 개발이 요구되고 있다.
Various studies have been conducted to solve these problems. For example, Korean Patent Publication No. 1992-0008192 discloses a method for producing trehalulose from sucrose using a trehalulose-producing enzyme expressed in a microorganism belonging to the genus Pseudomonas sp. Or Agrobacterium sp. a and discloses technology to produce in large quantities, the US Patent Publication No. 2013-0295617 discloses a number derived from a microorganism of the genus Solarium Peck tobak Te (Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis PBR1692) rule trehalose from sucrose using a cross-isomerase A method of producing a Ross is disclosed. However, since trehalulose has low productivity, it is difficult to use trehalulose in the industry. In order to solve such difficulties, it is required to develop a technology capable of producing trehalulose with higher productivity .

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 보다 높은 생산성으로 트레할룰로스를 생산할 수 있는 기술을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 이소말툴로스에 비하여 트레할룰로스를 다량으로 생산하는 균주를 발굴하고, 이로부터 발현되는 수크로스이성화효소가 수크로스로부터 트레할룰로스를 대량으로 생산할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
Under these circumstances, the present inventors have made extensive efforts to develop a technique capable of producing trehalulose with higher productivity, and as a result, found that a strain producing trehalulose in a large amount as compared with isomaltulose was discovered, The present inventors have completed the present invention by confirming that the sucrose isomerase of the present invention can produce a large amount of trehalulose from sucrose.

본 발명의 하나의 목적은 펙토박테리움 속 미생물(Pectobacterium carotovorum KKH 3-1)로부터 유래된 신규한 수크로스이성화효소를 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide a novel sucrose isomerase derived from a Pectobacterium carotovorum KKH 3-1 microorganism.

본 발명의 다른 목적은 상기 수크로스이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a polynucleotide encoding said sucrose isomerase.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide an expression vector comprising the polynucleotide.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a transformant into which the above expression vector has been introduced.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 이용하여 상기 수크로스이성화효소를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
It is still another object of the present invention to provide a method for producing the sucrose isomerase using the transformant.

본 발명자들은 보다 높은 생산성으로 트레할룰로스를 생산할 수 있는 기술을 개발하고자, 종래의 수크로스이성화효소를 발현시키는 다양한 균주를 수크로스를 포함하는 배지에서 배양하고, 트레할룰로스와 이소말툴로스를 생산하는 균주를 1차 선별하였다. 상기 선별된 균주 중에서 트레할룰로스의 생산성이 가장 우수한 균주를 선발하고, 이를 동정한 결과, 펙토박테리움 카로토보룸 KKH 3-1 균주(Pectobacterium carotovorum KKH 3-1)임을 확인하였다. 상기 확인된 균주에서 수크로스이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 증폭하고 이의 서열을 결정한 결과, 상기 폴리뉴클레오티드는 종래에 알려지지 않은 새로운 수크로스이성화효소를 코딩하는 유전자임을 확인하였다.In order to develop a technique capable of producing trehalulose with higher productivity, the present inventors cultured various strains expressing conventional sucrose isomerase in a medium containing sucrose, and found that trehalulose and isomaltulose Were selected first. The one among the selected strains selected for the highest productivity of strains rules trehalose, and identified it results peck tobak Te Karo Solarium Sat borum KKH 3-1 strain (Pectobacterium carotovorum KKH 3-1). The polynucleotide encoding the sucrose isomerase was amplified in the above-identified strains and its sequence was determined. As a result, it was confirmed that the polynucleotide was a gene encoding a novel sucrose isomerase not known in the prior art.

상기 유전자로부터 수크로스이성화효소를 발현시키고, 이의 특성을 규명한 결과, 약 69kDa의 크기를 갖고, pH 5.0 내지 10.0에서 활성을 나타내며, pH 6.0에서 최대 활성을 나타내고, 글리신·NaOH 완충액(pH 9)에서는 최대 활성의 50% 이상을 유지하며, 55℃에서 25.7분의 반감기를 나타내고, 변성온도(melting temperature)가 55.5 ± 0.6℃이며, 30 내지 50℃의 온도범위에서 효소활성을 나타내고, 40℃에서 최적 활성을 나타내며, 반응온도가 낮을 수록 트레할룰로스의 생산성이 증가함을 확인하였다.
As a result of identifying the sucrose isomerase from the gene, the enzyme was found to have a size of about 69 kDa, activity at pH 5.0 to 10.0, maximum activity at pH 6.0, glycine NaOH buffer (pH 9) Maintaining a half-life of 25.7 minutes at 55 ° C, a melting temperature of 55.5 ± 0.6 ° C, exhibiting enzyme activity in the temperature range of 30 to 50 ° C, and exhibiting enzyme activity at 40 ° C And the productivity of trehalulose increased as the reaction temperature was lower.

상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 펙토박테리움 속 미생물(Pectobacterium carotovorum KKH 3-1)로부터 유래된 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 수크로스로부터 대량의 트레할룰로스를 생산할 수 있는 신규한 수크로스이성화효소(sucrose isomerase)를 제공한다.
As one embodiment for achieving the above-mentioned object, the present invention relates to a microorganism belonging to the genus Pectobacterium carotovorum KKH 3-1) and provides a novel sucrose isomerase capable of producing a large amount of trehalulose from sucrose.

본 발명의 용어 "수크로스이성화효소(sucrose isomerase)"란, 특정 물질에 작용하여 그의 분자입체구조 또는 특정 원자단의 배지를 변화시키는 효소인 이성화효소 중에서 수크로스를 대상으로 작용하는 효소를 의미하는데, 대체로 수크로스를 이소말툴로스 또는 트레할룰로스로 변화시키는 효소를 의미한다.The term " sucrose isomerase " of the present invention means an enzyme which acts on sucrose among isomerases which act on a specific substance and change its molecular stereostructure or the medium of a specific atomic group. Generally refers to an enzyme that converts sucrose to isomaltulose or trehalulose.

본 발명에 있어서, 상기 수크로스이성화효소는 펙토박테리움 속 미생물의 일종인 펙토박테리움 카로토보룸 KKH 3-1(Pectobacterium carotovorum KKH 3-1) 균주로부터 유래된 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 수크로스로부터 대량의 트레할룰로스를 생산할 수 있는 신규한 수크로스이성화효소로 해석될 수 있는데, 수크로스로부터 이소말툴로스 보다도 트레할룰로스를 대량으로 생산하는 효소활성을 나타낼 수 있는 한, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다양한 아미노산 서열이 부가된 모든 펩타이드를 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드의 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 고안된 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.In the present invention, the sucrose isomerase enzyme is Peck tobak Te tobak the peck type of microorganism of the genus Solarium Te Solarium Caro sat borum KKH 3-1 (Pectobacterium can be interpreted as a novel sucrose isomerase capable of producing a large amount of trehalulose from sucrose containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 derived from a carotovorum KKH 3-1 strain, As long as it can exhibit an enzyme activity that mass-produces trehalulose rather than los, it is possible to include all peptides to which various amino acid sequences are added at the N-terminal or C-terminal of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. In addition, it may further comprise a targeting sequence, a tag, an amino acid sequence designed for specific purposes to increase the stability of the labeled residue, half-life or peptide.

아울러, 수크로스로부터 이소말툴로스 보다도 트레할룰로스를 대량으로 생산하는 효소활성을 나타낼 수 있다면, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 일부 아미노산이 부가, 치환, 결실 등의 방법으로 변이된 변이체 단백질도 본 발명에서 제공하는 수크로스이성화효소의 범주에 포함될 수 있다.In addition, if the amino acid sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is mutated by a method such as addition, substitution, deletion, or the like, as long as it can exhibit an enzyme activity that massively produces trehalulose from sucrose rather than isomaltulose May be included in the category of sucrose isomerase provided by the present invention.

예를 들어, 본 발명에서 제공하는 수크로스이성화효소는 서열번호 1의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다.For example, the sucrose isomerase provided in the present invention may include a polypeptide having a sequence that differs from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 by one or more amino acid residues. Amino acid exchange in proteins and polypeptides that do not globally alter the activity of the molecule is known in the art. The most commonly occurring exchanges involve amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thy / Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu and Asp / Gly. In addition, it may include a protein having increased structural stability or increased protein activity due to mutation or modification of the amino acid sequence, for example, heat, pH, etc. of the protein.

끝으로, 본 발명에서 제공하는 수크로스이성화효소는 당해 분야에 공지된 화학적 펩티드 합성방법으로 제조하거나, 상기 수크로스이성화효소를 코딩하는 유전자를 PCR에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다.
Finally, the sucrose isomerase of the present invention may be prepared by a chemical peptide synthesis method known in the art, or by amplifying the gene encoding the sucrose isomerase by PCR or by a known method, And then expressing the gene.

본 발명에서 제공하는 수크로스이성화효소는 수크로스로부터 이소말툴로스와 트레할룰로스를 생성한다는 점에서는 종래의 수크로스이성화효소와 유사하지만, 상기 이소말툴로스 보다도 트레할룰로스를 더 많이 생산할 수 있다는 점에서 종래의 수크로스이성화효소와 구별된다. 뿐만 아니라, 효소반응온도에 따라, 수크로스로부터 생성되는 트레할룰로스와 이소말툴로스의 생산함량비가 변화되는데, 반응온도가 낮을 수록 트레할룰로스의 생성량이 증가하고, 반응온도가 증가할 수록 이소말툴로스의 생성량이 증가한다. 구체적으로, 본 발명에서 제공하는 수크로스이성화효소의 변성온도(Tm)는 55.5℃이고, 25 내지 55℃에서 효소활성을 나타낼 수 있으며, 30 내지 50℃에서는 최대활성의 60% 이상을 나타낼 수 있다. 본 발명자들이 규명한 바에 의하면, 상기 30 내지 50℃에서 본 발명의 수크로스이성화효소를 이용하여 수크로스로부터 트레할룰로스와 이소말툴로스를 생성할 경우, 50℃에서는 트레할룰로스와 이소말툴로스를 1:1(w/w)의 비율로 생성할 수 있으나, 30℃에서는 트레할룰로스와 이소말툴로스를 약 4:1(w/w)의 비율로 생성할 수 있으며, 이러한 특성을 갖는 수크로스이성화효소는 지금까지 어떠한 균주로부터도 공지되지 않았으며, 본 발명자에 의하여 최초로 밝혀진 것이다.The sucrose isomerase provided by the present invention is similar to the conventional sucrose isomerase in that it produces isomaltulose and trehalulose from sucrose but can produce more trehalulose than isomaltulose And is distinguished from conventional sucrose isomerase. In addition, depending on the enzyme reaction temperature, the production ratio of trehalulose and isomaltulose produced from sucrose is changed. The lower the reaction temperature, the greater the amount of trehalulose produced. As the reaction temperature increases The amount of isomaltulose produced increases. Specifically, the modification temperature (Tm) of the sucrose isomerase provided by the present invention is 55.5 ° C, exhibits enzyme activity at 25 to 55 ° C, and can exhibit 60% or more of the maximum activity at 30 to 50 ° C . According to the present inventors's findings, when trehalulose and isomaltulose are produced from sucrose by using the sucrose isomerase of the present invention at 30 to 50 ° C, trehalulose and isomaltulose Losses can be produced at a ratio of 1: 1 (w / w), but at 30 ° C, trehalulose and isomaltulose can be produced at a ratio of about 4: 1 (w / w) Has not been known from any strain so far and has been discovered for the first time by the present inventors.

실제로, 본 발명의 수크로스이성화효소를 발현시키는 펙토박테리움 카로토보룸 KKH 3-1 균주와 유사한 균주인 펙토박테리움 카로토보룸 브라질리언시스 PBR1692(Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis PBR1692) 균주로부터 발현되는 수크로스이성화효소가 본 발명에서 제공하는 것과 유사한 특성을 나타냄이 공지되어 있다(미국특허공개 제2013-0295617호). 상기 공지된 균주에서 발현되는 수크로스이성화효소는 1 내지 30℃에서 트레할룰로스와 이소말툴로스를 95:5 내지 63:37(w/w)의 비율로 포함하는 반응산물을 생성할 수 있는데, 동일한 반응온도에서는 본 발명에서 제공하는 수크로스이성화효소에 비하여 트레할룰로스의 생산성이 상대적으로 낮은 수준을 나타낸다. 예를 들어, 30℃의 반응온도에서 본 발명의 수크로스이성화효소는 트레할룰로스와 이소말툴로스를 약 4:1(w/w)의 비율로 생성할 수 있으나, 공지된 상기 수크로스이성화효소는 트레할룰로스와 이소말툴로스를 약 1.7:1(w/w)의 비율로 생성할 수 있으므로, 본 발명의 수크로스이성화효소는 트레할룰로스의 생산성의 측면에서, 공지된 수크로스이성화효소보다도 약 2.3배 증가된 효소활성을 나타낸다고 할 수 있다. 본 발명에서 제공하는 수크로스이성화효소는 효소활성을 증진시키기 위하여 인위적으로 변이시킨 것이 아니라, 자연계에 존재하는 미생물로부터 자연적으로 발현되는 것이라는 점을 감안한다면, 공지된 효소보다도 약 2.3배 증가된 효소활성을 나타내는 효소를 새로이 발굴한 것은 극히 이례적인 것이라 할 수 있다.In fact, that is expressed from a peck tobak Te Solarium Caro sat borum KKH 3-1 strain and similar strains of Peg tobak Te Solarium Caro sat borum Brazilian cis PBR1692 (Pectobacterium carotovorum subsp. Brasiliensis PBR1692 ) strains expressing a sucrose isomerase of the present invention It is known that sucrose isomerase exhibits properties similar to those provided by the present invention (US Patent Publication No. 2013-0295617). The sucrose isomerase expressed in the known strains can produce a reaction product containing trehalulose and isomaltulose in a ratio of 95: 5 to 63: 37 (w / w) at 1 to 30 DEG C , And at the same reaction temperature, the productivity of trehalulose is relatively lower than that of the sucrose isomerase provided in the present invention. For example, at a reaction temperature of 30 DEG C, the sucrose isomerase of the present invention can produce trehalulose and isomaltulose at a ratio of about 4: 1 (w / w), but the known sucrose isomerization Since the enzyme can produce trehalulose and isomaltulose at a ratio of about 1.7: 1 (w / w), the sucrose isomerase of the present invention can be produced from known sucrose in terms of productivity of trehalulose Which is 2.3 times higher than that of the isomerization enzyme. In view of the fact that the sucrose isomerase provided in the present invention is not artificially mutated in order to enhance enzyme activity but is naturally expressed from microorganisms existing in nature, it is considered that enzyme activity which is 2.3 times higher than that of known enzyme It is extremely unusual to newly discover the enzyme that represents

이에, 본 발명자들은 본 발명에서 제공하는 신규한 수크로스이성화효소를 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 상기 효소의 아미노산 서열을 2013년 8월 13일자로 GenBank에 기탁하고, 등록번호(accession number) KF317210.1을 부여받았다.
Accordingly, the present inventors deposited the nucleotide sequence of the gene encoding the novel sucrose isomerase and the amino acid sequence of the enzyme provided in the present invention on GenBank on Aug. 13, 2013, and the accession number KF317210. 1.

상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 수크로스이성화효소는 트레할룰로스의 생산성이 우수할 뿐만 아니라, 반응온도를 조절함에 따라, 생성되는 트레할룰로스와 이소말툴로스의 비율을 매우 큰 폭으로 변화시킬 수 있다는 특성을 나타내는데, 상기 인용한 종래의 수크로스이성화효소는 트레할룰로스를 이소말툴로스에 비하여 적어도 1.7배 이상의 비율로 생산함에 반하여, 본 발명의 수크로스이성화효소는 트레할룰로스와 이소말툴로스를 동일비율로 생산할 수도 있다는 특징을 나타낸다.As described above, the sucrose isomerase provided by the present invention is excellent not only in the productivity of trehalulose, but also in controlling the reaction temperature, the ratio of the produced trehalulose to isomaltulose is very large . The conventional sucrose isomerase cited above produces trehalulose at a ratio of at least 1.7 times that of isomaltulose, whereas the sucrose isomerase of the present invention is a trehalulose It is possible to produce Ross and isomaltulose in the same ratio.

이러한 특성은 산업적으로 매우 중요한 의미를 나타낸다. 즉, 본 발명에서 제공하는 수크로스이성화효소를 이용하여 트레할룰로스와 이소말툴로스를 산업적으로 생산할 때, 요구되는 트레할룰로스와 이소말툴로스의 생산요구량이 크게 변화될 경우에도, 설비의 별다는 변경없이 반응온도만을 조절하는 것만으로도, 상기 변화된 생산요구량을 맞출수 있다. 아직까지는 트레할룰로스 보다는 이소말툴로스가 산업적으로 더 넓은 범위에서 사용되고 있어, 트레할룰로스 보다는 이소말툴로스의 수요량이 많다는 점을 감안한다면, 본 발명에서 제공하는 수크로스이성화효소는 종래의 수크로스이성화효소에 비하여 산업적인 유용성이 매우 높다고 할 수 있다. 즉, 본 발명의 수크로스이성화효소는 이소말틀로스의 생산을 위하여도 사용될 수 있다는 것이다.These characteristics are very important in industry. That is, even when the production demand of trehalulose and isomaltulose required for industrially producing trehalulose and isomaltulose using the sucrose isomerase provided by the present invention is greatly changed, It is possible to meet the changed production requirement by merely adjusting the reaction temperature without any change. Considering that isomaltulose is used in a wider range than industrial trehalylulose and tremendous demand of isomaltulose rather than trehalulose, the sucrose isomerase provided in the present invention is a conventional It can be said that the industrial utility is very high compared with the cross isomerization enzyme. That is, the sucrose isomerase of the present invention can also be used for the production of isomaltulose.

아울러, 본 발명에서 제공하는 수크로스이성화효소의 최적활성을 나타낼 수 있는 pH 범위는 pH 5.0 내지 7.0의 중성범위로서, 위험성이 높은 극단적인 pH 수준(예를 들어, 강산성 또는 강알칼리성)이 요구되지도 않으므로, 본 발명의 수크로스이성화효소를 사용할 경우, 생산단계에서 안전성을 최대한 보장할 수 있다는 장점도 있다.
In addition, the pH range capable of exhibiting the optimum activity of the sucrose isomerase provided by the present invention is a neutral range of pH 5.0 to 7.0, and an extremely high dangerous pH level (for example, strong acidity or strong alkalinity) is not required Therefore, when the sucrose isomerase of the present invention is used, safety can be maximally ensured in the production step.

상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 수크로스이성화효소를 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
As another embodiment for achieving the above object, the present invention provides a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding the sucrose isomerase.

본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드를 구성하는 염기서열은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 염기서열 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있는 다양한 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열이 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 염기서열의 5'-말단 또는 3'-말단에 부가된 형태가 될 수 있고, 바람직하게는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 서열번호 2의 염기서열 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있는 다양한 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열이 상기 서열번호 2의 염기서열의 5'-말단 또는 3'-말단에 부가된 형태가 될 수 있다.In the present invention, the nucleotide sequence constituting the polynucleotide may be a nucleotide sequence capable of encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a variety of nucleotides capable of being added to the N- or C-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: The nucleotide sequence encoding the amino acid sequence may be added to the 5'-terminal or 3'-terminal of the nucleotide sequence capable of encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, preferably the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 capable of coding the sequence or the nucleotide sequence encoding various amino acid sequences which may be added to the N-terminus or C-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is the nucleotide sequence of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: Terminal < / RTI > or 3 ' -terminal.

또한, 수크로스로부터 이소말툴로스 보다도 트레할룰로스를 대량으로 생산하는 효소활성을 나타낼 수 있는 단백질을 코딩할 수 있는 한, 상기 염기서열과 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 역시 본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오티드의 범주에 포함될 수 있는데, 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있다.Also, as long as it is capable of encoding a protein capable of exhibiting an enzyme activity that mass-produces trehalulose rather than isomaltulose from sucrose, a polynucleotide comprising a nucleotide sequence homologous to the nucleotide sequence described above May be included in the category of the polynucleotide provided by the present invention. Preferably, the polynucleotide may be a polynucleotide including a nucleotide sequence having 80% or more homology, more preferably a nucleotide sequence having 90% or more homology Polynucleotide, and most preferably a polynucleotide comprising a nucleotide sequence that exhibits at least 95% homology.

한편, 상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 들 수 있다.
On the other hand, the polynucleotide may be mutated by substitution, deletion, insertion, or a combination of one or more bases. When the nucleotide sequence is prepared by chemically synthesizing, it is possible to use a method well known in the art, for example, a method described in Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37: 73-127, 1988 , Triesters, phosphites, phosphoramidites and H-phosphate methods, PCR and other auto primer methods, and oligonucleotide synthesis on solid supports.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
In another embodiment for achieving the above object, the present invention provides an expression vector comprising the polynucleotide.

본 발명의 용어 "발현벡터"란, 적절한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있도록 유전자 삽입물을 포함하고, 상기 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. The term "expression vector" of the present invention means a gene construct comprising a gene insert that is capable of expressing a desired protein in an appropriate host cell, and an essential regulatory element operably linked to the expression of said gene insert. The expression vector includes expression control elements such as an initiation codon, a termination codon, a promoter, an operator, etc. The initiation codon and termination codon are generally regarded as part of the nucleotide sequence encoding the polypeptide, and when the gene product is administered, And must be in coding sequence and in frame. The promoter of the vector may be constitutive or inducible.

본 발명의 용어 "작동가능하게 연결(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.The term "operably linked" of the present invention means a state in which a nucleic acid sequence encoding a desired protein or RNA is functionally linked to a nucleic acid expression control sequence so as to perform a general function . For example, a nucleic acid sequence encoding a promoter and a protein or RNA may be operably linked to affect the expression of the coding sequence. The operative linkage with an expression vector can be produced using gene recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cleavage and linkage can be performed using enzymes generally known in the art.

또한, 상기 발현벡터는 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 수크로스이성화효소의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시 코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널들 및 개시 코돈들은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다. 아울러, 상기 발현벡터는 수크로스이성화효소의 검출을 용이하게 하기 위하여, 임의로 엔도펩티아이제를 사용하여 제거할 수 있는 단백질 태그를 추가로 포함할 수 있다. In addition, the expression vector may include a signal sequence for the release of sucrose isomerase to facilitate the separation of the protein from the cell culture medium. A specific initiation signal may also be required for efficient translation of the inserted nucleic acid sequence. These signals include the ATG start codon and adjacent sequences. In some cases, an exogenous translational control signal, which may include the ATG start codon, should be provided. These exogenous translational control signals and initiation codons can be of various natural and synthetic sources. Expression efficiency can be increased by the introduction of suitable transcription or translation enhancers. In addition, the expression vector may further comprise a protein tag which can be optionally removed using endopeptidase, in order to facilitate detection of the sucrose isomerase.

본 발명의 용어 "태그(tag)"란, 정량가능한 활성 또는 특성을 나타내는 분자를 의미하며, 플로오레세인과 같은 화학적 형광물질(fluoracer), 형광 단백질(GFP) 또는 관련 단백질과 같은 폴리펩타이드 형광물질을 포함한 형광분자일 수도 있고; Myc 태그, 플래그(Flag) 태그, 히스티딘 태그, 루신 태그, IgG 태그, 스트랩타비딘 태그 등의 에피톱 태그일 수도 있다. 특히, 에피톱 태그를 사용할 경우, 바람직하게는 6개 이상의 아미노산 잔기로 구성되고, 보다 바람직하게는 8개 내지 50개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드 태그를 사용할 수 있다.The term "tag " of the present invention means a molecule exhibiting quantifiable activity or property and includes a polypeptide fluorescent substance such as a fluorophore such as fluorescein, a fluorescent protein (GFP) Or may be a fluorescent molecule including; Myc tag, a Flag tag, a histidine tag, a Lucin tag, an IgG tag, or a strap tagidine tag. Particularly, in the case of using an epitope tag, a peptide tag composed of preferably 6 or more amino acid residues, more preferably 8 to 50 amino acid residues can be used.

본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서 본 발명에서 제공하는 수크로스이성화효소를 생산할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는데, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 바람직하게는 숙주세포에서 상기 폴리뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터가 될 수 있으며, 보다 바람직하게는 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)-유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50), λ-파아지(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11 및 λZAP), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 배큘로바이러스(baculovirus) 등이 될 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.
In the present invention, the expression vector is not particularly limited as long as it is capable of producing the sucrose isomerase provided by the present invention by expressing the polynucleotide. The mammalian cell (for example, human, monkey, rabbit, rat, hamster , Or a vector capable of replicating and / or expressing the polynucleotide in an eukaryotic or prokaryotic cell comprising a plant cell, a yeast cell, an insect cell or a bacterial cell (e.g., Escherichia coli, etc.) , Preferably operably linked to a suitable promoter so that the polynucleotide can be expressed in the host cell, and can be a vector comprising at least one selectable marker, more preferably a commercially available plasmid (pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP, etc.), E. coli-derived plasmids (pYG601BR322, pBR325, pUC118 and pUC119) Subtilis (Bacillus subtilis) - derived plasmid (pUB110 and pTP5), yeast-derived plasmids (YEp13, YEp24 and YCp50), λ- phage (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4 , λgt10, λgt11 and λZAP), retroviruses (retrovirus), adenoviruses adenovirus, vaccinia virus, baculovirus, and the like. Since the amount of expression of the protein and the expression of the expression vector are different depending on the host cell, it is preferable to select and use the host cell most suitable for the purpose.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 제공한다.
As another embodiment for accomplishing the above object, the present invention provides a transformant wherein the expression vector is introduced into a host cell.

본 발명에서 제공하는 형질전환체는 상기 본 발명에서 제공하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환시켜서 제작되고, 상기 발현벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서, 본 발명의 수크로스이성화효소를 생산하는데 사용될 수 있다. The transformant provided in the present invention is produced by introducing the expression vector provided in the present invention into a host cell, transforming the polynucleotide, and expressing the polynucleotide contained in the expression vector to produce the sucrose isomerase of the present invention .

본 발명에서 제공하는 상기 발현벡터가 도입될 수 있는 숙주세포는 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서 상기 펩타이드를 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균(E. coli), 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베 등의 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로소필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.The host cell into which the expression vector provided in the present invention can be introduced is not particularly limited as long as it is capable of producing the peptide by expressing the polynucleotide. However, the host cell may be any of E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium Bacterial cells such as; Yeast cells such as Saccharomyces cerevisiae, and ski-inspected caromyces pombe; Fungal cells such as Pichia pastoris; Insect cells such as Drosophila and Spodoptera Sf9 cells; Animal cells such as CHO, COS, NSO, 293, Bowmanella cells; Or plant cells.

또한, 상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 다양한 세포활성을 높은 수준으로 향상시킬 수 있는 효과를 나타내는 본 발명의 수크로스이성화효소를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다.
Further, the transformant may be performed by various methods, though not one capable of producing a sucrose isomerase of the present invention showing the effect which can improve a variety of cellular activity at a high level, specifically limited to, CaCl 2 precipitation, CaCl 2 precipitation to Hanahan method with improved efficiency by using a reducing substance of DMSO (dimethyl sulfoxide), electroporation (electroporation), the calcium phosphate precipitation method, protoplast fusion method, a stirring method using a silicon carbide fiber, Agrobacterium Bacterial-mediated transformation, transformation with PEG, dextran sulfate, lipofectamine, and drying / inhibition-mediated transformation methods.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 형질전환체를 이용하여 본 발명의 수크로스이성화효소를 제조하는 방법을 제공한다.
As another embodiment for achieving the above object, the present invention provides a method for producing the sucrose isomerase of the present invention using the above transformant.

구체적으로, 본 발명의 수크로스이성화효소를 제조하는 방법은 (a) 상기 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및, (b) 상기 배양물로부터 본 발명의 수크로스이성화효소를 회수하는 단계를 포함한다.Specifically, the method for producing the sucrose isomerase of the present invention comprises the steps of: (a) culturing the transformant to obtain a culture; And (b) recovering the sucrose isomerase of the present invention from the culture.

또 다른 방법으로서, 본 발명의 수크로스이성화효소를 제조하는 방법은 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계; (b) 상기 수득한 폴리뉴클레오티드를 클로닝하여 발현벡터를 수득하는 단계; (c) 상기 수득한 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 수득하는 단계; 및, (d) 상기 형질전환체를 배양하고, 이로부터 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 mRFP를 회수하는 단계를 포함한다.
As another method, a method for producing the sucrose isomerase of the present invention comprises the steps of: (a) obtaining a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; (b) cloning the obtained polynucleotide to obtain an expression vector; (c) introducing the obtained expression vector into a host cell to obtain a transformant; And (d) culturing the transformant, and recovering mRFP comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 본 발명의 수크로스이성화효소를 발현시켜서 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.The term "cultivation" of the present invention means a method of growing the microorganism under an appropriately artificially controlled environmental condition. In the present invention, the method for culturing the transformant may be carried out by a method well known in the art. Specifically, the culture is not particularly limited as long as it can be produced by expressing the sucrose isomerase of the present invention. However, it may be cultured continuously in a batch process or an injection batch or a repeated batch batch process .

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족시킬 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.The medium used for culturing can meet the requirements of a specific strain in an appropriate manner while controlling the temperature, pH and the like under aerobic conditions in a conventional medium containing an appropriate carbon source, nitrogen source, amino acid, vitamin, and the like. The carbon sources that can be used include glucose and xylose mixed sugar as main carbon sources, and sugar and carbohydrates such as sucrose, lactose, fructose, maltose, starch and cellulose, soybean oil, sunflower oil, castor oil, Oils and fats such as oils and the like, fatty acids such as palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, alcohols such as glycerol and ethanol, and organic acids such as acetic acid. These materials may be used individually or as a mixture. Nitrogen sources that may be used include inorganic sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium carbonate, and ammonium nitrate; Amino acids such as glutamic acid, methionine and glutamine and organic substances such as peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, fish or their decomposition products, defatted soybean cake or decomposition products thereof . These nitrogen sources may be used alone or in combination. The medium may include potassium phosphate, potassium phosphate and the corresponding sodium-containing salts as a source. Potassium which may be used include potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts. As the inorganic compound, sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate and calcium carbonate may be used. Finally, in addition to these materials, essential growth materials such as amino acids and vitamins can be used.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.In addition, suitable precursors may be used in the culture medium. The above-mentioned raw materials can be added to the culture in the culture process in a batch manner, in an oil-feeding manner or in a continuous manner by an appropriate method, but it is not particularly limited thereto. Basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, or acid compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid can be used in a suitable manner to adjust the pH of the culture.

또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양은 상기 수크로스이성화효소의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 100 시간에서 달성될 수 있다.In addition, bubble formation can be suppressed by using a defoaming agent such as a fatty acid polyglycol ester. An oxygen or oxygen-containing gas (e.g., air) is injected into the culture to maintain aerobic conditions. The temperature of the culture is usually 27 ° C to 37 ° C, preferably 30 ° C to 35 ° C. The culture is continued until the production amount of the sucrose isomerase is maximized. And usually for 10 to 100 hours for this purpose.

아울러, 배양물로부터 상기 수크로스이성화효소를 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 생산된 본 발명의 수크로스이성화효소를 회수할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있다.
In addition, the step of recovering the sucrose isomerase from the culture can be carried out by a method known in the art. Specifically, the recovering method is not particularly limited as long as the recovered sucrose isomerase of the present invention can be recovered, but it is preferably centrifuged, filtered, extracted, sprayed, dried, (Eg ammonium sulfate precipitation), chromatography (for example, ion exchange, affinity, hydrophobicity and size exclusion) can be used.

도 1은 이소말툴로스와 트레할룰로스를 생산하는 11종의 균주의 배양상등액(A) 또는 상기 배양상등액에 인버타제를 처리한 반응산물(B)을 TLC 분석에 적용한 결과를 나타내는 사진으로서, 1번 레인은 G 레인은 글루코스를 나타내고, F 레인은 프럭토스를 나타내며, S 레인은 수크로스를 나타내고, P 레인은 이소말툴로스를 나타내며, T 레인은 트레할룰로스를 나타내고, 1번 레인은 13번 균주를 나타내며, 2번 레인은 14번 균주를 나타내고, 3번 레인은 15번 균주를 나타내며, 4번 레인은 16번 균주를 나타내고, 5번 레인은 23번 균주를 나타내며, 6번 레인은 24번 균주를 나타내고, 7번 레인은 33번 균주를 나타내며, 8번 레인은 34번 균주를 나타내고, 9번 레인은 39번 균주를 나타내며, 10번 레인은 44번 균주를 나타내고, 11번 레인은 45번 균주를 나타낸다.
도 2는 펙토박테리움 카로토보룸 KKH 3-1 균주를 4종의 서로 다른 배지에서 배양하고, 균주의 증식수준(A)과 균주로부터 발현된 수크로스이성화효소의 활성(B)을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 배지에 포함된 수크로스의 농도에 따른 수크로스이성화효소의 활성변화를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명에서 제공하는 신규한 수크로스이성화효소의 아미노산 서열을 공지된 수크로스이성화효소의 서열과 비교분석한 결과를 나타내는데, 수크로스 이성질화 모티프(RLDRD)는 적색 박스로 표시되었고, PCSI는 본 발명의 펙토박테리움 카로토보룸 KKH 3-1(Pectobacterium carotovorum KKH 3-1) 유래 효소를 나타내고, MutB는 슈도모나스 메소액시도필라 MX-45(Pseudomonas mesoacidophila MX-45) 유래 효소를 나타내며, FMB-1는 엔테로박터 속 FMB-1(Enterobacter sp. FMB-1) 유래 효소를 나타내고, ERSI는 에르위니아 라폰티시 NCPPB 1578(Erwinia rhapontici NCPPB 1578) 유래 효소를 나타내며, PalI는 클렙시엘라 속 균주 LX3(Klebsiella sp.strain LX3) 유래 효소를 나타내고, KPSI는 클렙시엘라 플랜티콜라 UQ 14S(Klebsiella planticola UQ 14S) 유래 효소를 나타내며, PDSI는 판토에아 디스퍼사 UQ68J(Pantoea dispersa UQ68J) 유래 효소를 나타내고, SmuA는 프로타미노박터 루브럼 CBS574·77(Protaminobacter rubrum CBS574·77) 유래 효소를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 수크로스이성화효소를 정제하는 과정에서 얻어진 시료를 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타내는 사진으로서, 1번 레인은 음성대조군(대장균 BL21)을 나타내고, 2번 레인은 세포 파쇄물을 나타내며, 3번 레인은 정제된 재조합 수크로스이성화효소를 나타낸다.
도 6은 재조합 수크로스이성화효소의 반응조건에 따른 활성변화를 나타내는데, (A)는 pH 변화에 따른 재조합 수크로스이성화효소의 활성변화를 나타내는 그래프로서, (●)는 소듐 아세테이트 완충액(pH 4.0-5.0)을 나타내고, (○)는 소듐 시트레이트 완충액(pH 5.0-6.0)을 나타내며, (▼)는 소듐 포스페이트 완충액(pH 6.0-8.0)을 나타내고, (△)는 Tris-HCl 완충액(pH 7.0-9.0)을 나타내며, (■)는 글리신-NaOH 완충액(pH 9.0-10.0)을 나타내고; (B)는 온도 변화에 따른 재조합 수크로스이성화효소의 활성변화를 나타내는 그래프이다.
도 7은 재조합 수크로스이성화효소의 온도특성을 나타내는데, (A)는 온도변화에 따른 효소활성의 변화를 로그값으로 표시한 그래프로서, (●)는 50℃를 나타내고, (○)는 55℃를 나타내며, (▼)는 60℃를 나타내고; (B)는 재조합 수크로스이성화효소의 변성온도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.1 is a photograph showing the results of applying the culture supernatant (A) of 11 strains producing isomaltulose and trehalulose, or the reaction product (B) obtained by treating the above culture supernatant with an invertase to TLC analysis, The lane 1 represents a G-lane, the F-lane represents fructose, the S-lane represents sucrose, the P-lane represents isomaltulose, the T-lane represents trehalulose, No. 3 lane represents strain No. 15, No. 4 lane represents No. 16 strain, No. 5 lane represents No. 23 strain, No. 6 lane represents No. 14 strain, No. 2 lane represents No. 14 strain, No. 3 lane represents No. 15 strain, No. 4 lane represents No. 16 strain, No. 5 lane represents No. 23 strain, The lane 7 represents the strain No. 33, the lane No. 8 represents the strain No. 34, the lane No. 9 represents the strain No. 39, the lane No. 10 represents the strain No. 44, the lane No. 11 represents the strain No. 33, 45 < / RTI >
Figure 2 shows the results of culturing the Pectobacterium carotovorum KKH 3-1 strain in four different media and measuring the growth level (A) of the strain and the activity (B) of the sucrose isomerase expressed from the strain Fig.
FIG. 3 is a graph showing the activity of sucrose isomerase according to the concentration of sucrose contained in the medium. FIG.
FIG. 4 shows the result of comparing the amino acid sequence of the novel sucrose isomerase with the sequence of a known sucrose isomerase, wherein the sucrose isomerization motif (RLDRD) is represented by a red box, Represents an enzyme derived from Pectobacterium carotovorum KKH 3-1 of the present invention, and MutB represents an enzyme derived from Pseudomonas mesoacidophila MX-45 (Pseudomonas mesoacidophila MX-45) FMB-1 represents an enzyme derived from Enterobacter sp. FMB-1, ERSI represents an enzyme derived from Erwinia rhapontici NCPPB 1578, PalI represents an enzyme derived from Enterobacter sp. FMB-1, And KPSI represents an enzyme derived from Klebsiella planticola UQ 14S, and PDSI represents an enzyme derived from Pantoea disperse UQ68J. And SmuA represents an enzyme derived from protaminobacter rubrum CBS574 · 77 (Protaminobacter rubrum CBS574 · 77).
FIG. 5 is a photograph showing the result of SDS-PAGE analysis of a sample obtained in the course of purifying the sucrose isomerase of the present invention, wherein lane 1 represents a negative control (E. coli BL21), lane 2 represents cell lysate , And lane 3 represents a purified recombinant sucrose isomerase.
FIG. 6 shows the activity change of recombinant sucrose isomerase according to the reaction conditions. FIG. 6 (A) is a graph showing the activity change of recombinant isozymease according to the pH change, in which (●) represents sodium acetate buffer (?) Represents sodium citrate buffer (pH 5.0-6.0), (?) Represents sodium phosphate buffer (pH 6.0-8.0), and (Δ) represents sodium phosphate buffer 9.0), (1) represents glycine-NaOH buffer (pH 9.0-10.0); (B) is a graph showing the activity change of the recombinant sucrose isomerase according to the temperature change.
FIG. 7 shows the temperature characteristics of the recombinant sucrose isomerase, wherein (A) is a logarithm of the change in enzyme activity with temperature change, () denotes 50 ° C, and () denotes 55 ° C (?) Represents 60 占 폚; (B) is a graph showing the results of measuring the denaturation temperature of the recombinant sucrose isomerase.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예Example 1:  One: 트레할룰로스Trehalulose 생산균주의Production strain 선발 Selection

7종의 엔테로박터 속 미생물, 3종의 판토에아 속 미생물 및 43종의 펙토박테리움 속 미생물을 포함하는 53종의 식물연관 미생물을 야채 및 과일나무를 포함하는 다양한 작물로부터 분리하고, 분리된 균주를 LB 배지(1% (w/v) tryptone, 0.5%(w/v) yeast extract, 및 1% (w/v) NaCl 포함)에서 배양하였다. 배양된 균주를 5 ㎖ SPY(4% sucrose,1% peptone, and 0.4% yeast extract, pH 6.5) 배지에 접종하고, 격렬하게 교반하면서 30℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 배양산물을 분석하여, 이소말툴로스와 트레할룰로스를 생산하는 11종의 균주(13, 14, 15, 16, 23, 24, 33, 34, 39, 44 및 45번 균주)를 1차 선발하였다.53 plant-related microorganisms, including seven species of Enterobacteriaceae, three species of Pantoea subsp. Microorganisms and 43 species of Pectobacterium sp. Microorganisms, were isolated from various crops including vegetables and fruit trees and isolated Were cultured in LB medium (containing 1% (w / v) tryptone, 0.5% (w / v) yeast extract, and 1% (w / v) NaCl). The cultured strains were inoculated into 5 ml of SPY medium (4% sucrose, 1% peptone, and 0.4% yeast extract, pH 6.5) and cultured overnight at 30 ° C with vigorous stirring. 11 strains (13, 14, 15, 16, 23, 24, 33, 34, 39, 44 and 45 strains) producing isomaltulose and trehalulose were analyzed by the first selection Respectively.

상기 선발된 균주의 배양물을 (4℃, 12,000 × g)하여 배양상등액을 수득하고, 이를 TLC 분석에 적용하였다. 구체적으로, 상기 배양상등액 3㎕를 110℃에서 30분동안 활성화된 실리카겔 플레이트(silica gel K5F plates)에 점적하고, 전개액(에틸아세테이트:아세트산:물=4:3:0.8, v/v/v)을 상기 플레이트에 상온에서 2회 가하였다. 이어, 상기 플레이트를 공기건조시키고, 발색시약(0.5%(w/v) N-(1-나프틸)-에틸렌디아민 및 5% (v/v) H2SO4이 용해된 메탄올)에 침지하여 발색시켰으며, 이를 110℃ 오븐에서 10분 동안 건조시켜서 당이 점적된 부위를 나타내었다(도 1의 (A)). 또한, 상기 배양상등액에 인버타제(invertase, Sigma-Aldrich Co.)를 가하여 반응시킨 반응산물을 대상으로 동일한 방법을 수행하였다(도 1의 (B)). 이때, 표준물질로서, 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 이소말툴로스 및 트레할룰로스를 사용하였다.A culture supernatant was obtained by culturing the selected strain (4 ° C., 12,000 × g), and this was applied to TLC analysis. Specifically, 3 μl of the culture supernatant was applied to activated silica gel K5F plates at 110 ° C. for 30 minutes and eluted with a developing solution (ethyl acetate: acetic acid: water = 4: 3: 0.8, v / v / v ) Was added to the plate at room temperature twice. The plate was then air-dried and immersed in a chromogenic reagent (methanol in which 0.5% (w / v) N- (1-naphthyl) -ethylenediamine and 5% (v / v) H 2 SO 4 had been dissolved) And developed in an oven at 110 ° C for 10 minutes to show a sugar-dotted region (Fig. 1 (A)). Also, the same method was applied to the reaction product obtained by adding invertase (Sigma-Aldrich Co.) to the culture supernatant (FIG. 1 (B)). At this time, glucose, fructose, sucrose, isomaltulose and trehalulose were used as standard substances.

도 1은 이소말툴로스와 트레할룰로스를 생산하는 11종의 균주의 배양상등액(A) 또는 상기 배양상등액에 인버타제를 처리한 반응산물(B)을 TLC 분석에 적용한 결과를 나타내는 사진으로서, 1번 레인은 G 레인은 글루코스를 나타내고, F 레인은 프럭토스를 나타내며, S 레인은 수크로스를 나타내고, P 레인은 이소말툴로스를 나타내며, T 레인은 트레할룰로스를 나타내고, 1번 레인은 13번 균주를 나타내며, 2번 레인은 14번 균주를 나타내고, 3번 레인은 15번 균주를 나타내며, 4번 레인은 16번 균주를 나타내고, 5번 레인은 23번 균주를 나타내며, 6번 레인은 24번 균주를 나타내고, 7번 레인은 33번 균주를 나타내며, 8번 레인은 34번 균주를 나타내고, 9번 레인은 39번 균주를 나타내며, 10번 레인은 44번 균주를 나타내고, 11번 레인은 45번 균주를 나타낸다. 도 1에서 보듯이, 균주에 따라 트레할룰로스 및 이소말툴로스를 생산하는 수준이 서로 상이함을 확인하였다. 즉, 14번 균주(2번 레인), 16번 균주(4번 레인), 44번 균주(10번 레인) 및 45번 균주(11번 레인)는 대부분의 수크로스로부터 대량의 이소말툴로스와 트레할룰로스를 생성하였고, 13번 균주(1번 레인), 15번 균주(3번 레인) 및 39번 균주(9번 레인)는 일부의 수크로스로부터 일정수준의 이소말툴로스와 트레할룰로스를 생성하였으며, 23번 균주(5번 레인), 24번 균주(6번 레인) 및 33번 균주(7번 레인)는 미량의 수크로스로부터 소량의 이소말툴로스와 트레할룰로스를 생성하였고, 34번 균주(8번 레인)는 다양한 산물을 생성하였다. 또한, 배양상등액에 인버타제를 처리하여 배지내에 존재하는 수크로스를 글루코스와 프럭토스로 분해한 경우에는, 13번 균주(1번 레인), 15번 균주(3번 레인), 23번 균주(5번 레인), 24번 균주(6번 레인), 33번 균주(7번 레인), 34번 균주(8번 레인) 및 39번 균주(9번 레인)는 배양물에 잔류하는 수크로스가 분해되어 글루코스와 프럭토스를 형성하였으나, 14번 균주(2번 레인), 16번 균주(4번 레인), 44번 균주(10번 레인) 및 45번 균주(11번 레인)는 배양물에 잔류하는 수크로스가 없어서 글루코스와 프럭토스가 형성되지 못함을 확인하였다. 이에 따라, 모든 수크로스를 이소말툴로스와 트레할룰로스로 전환시킨 4종의 균주(14, 16, 44 및 45번 균주)를 2차 선발하였다.1 is a photograph showing the results of applying the culture supernatant (A) of 11 strains producing isomaltulose and trehalulose, or the reaction product (B) obtained by treating the above culture supernatant with an invertase to TLC analysis, The lane 1 represents a G-lane, the F-lane represents fructose, the S-lane represents sucrose, the P-lane represents isomaltulose, the T-lane represents trehalulose, No. 3 lane represents strain No. 15, No. 4 lane represents No. 16 strain, No. 5 lane represents No. 23 strain, No. 6 lane represents No. 14 strain, No. 2 lane represents No. 14 strain, No. 3 lane represents No. 15 strain, No. 4 lane represents No. 16 strain, No. 5 lane represents No. 23 strain, The lane 7 represents the strain No. 33, the lane No. 8 represents the strain No. 34, the lane No. 9 represents the strain No. 39, the lane No. 10 represents the strain No. 44, the lane No. 11 represents the strain No. 33, 45 < / RTI > As shown in FIG. 1, it was confirmed that levels of trehalulose and isomaltulose were different depending on strains. That is, strains 14 (2 lanes), 16 strains (4 lanes), 44 strains (10 lanes) and 45 strains (11 lanes) (Lane 1), strain 15 (lane 3) and strain 39 (lane 9) were prepared from some sucrose at a level of isomaltulose and trehalulose And strain 23 (strain 5), strain 24 (strain 6) and strain 33 (strain 7) produced small amounts of isomaltulose and trehalulose from trace sucrose, Strain # 34 (lane 8) produced various products. When the sucrose present in the culture medium is decomposed into glucose and fructose by treatment of the invertase in the culture supernatant, the strains 13 (lane 1), 15 (strain 3) and 23 (Lane 7), Lane 34 (Lane 8), and Strain 39 (Lane 9), the sucrose remaining in the culture is degraded Glucose and fructose were formed. However, strains 14 (No. 2 lane), No. 16 strain (No. 4 lane), No. 44 strain (No. 10 lane) and No. 45 strain (No. 11 lane) It was confirmed that glucose and fructose were not formed due to no cross. Thus, four strains (strains 14, 16, 44 and 45), in which all sucrose was transformed into isomaltulose and trehalulose, were secondly selected.

상기 2차 선발된 균주의 배양액을 HPAEC 분석법에 적용하여, 생성된 당을 정량하였다. 구체적으로, 상기 2차 선발된 균주의 배양상등액을 여과하여 불순물을 제거하고, 불순물이 제거된 각 배양상등액을 ED50 전기화학적 검출기가 구비된 Dionex model DX-600 시스템에 연결된 분석용 CarboPac PA1 컬럼(0.4 cm × 25 cm; Dionex Co.,Sunnyvale, CA, USA)에 적용한 다음, 200 mM NaOH를 사용하여 1 ㎖/min의 속도로 10 내지 40분동안 선형구배에 의한 등용매 분리를 수행하여 각각의 당을 정량분석하였다. 그 결과, 45번 균주에서 이소말툴로스와 트레할룰로스의 생산수율이 가장 우수함을 확인하여, 상기 45번 균주를 최종 선발하였다.The culture of the second selected strain was applied to the HPAEC analysis method to quantify the produced sugars. Specifically, the culture supernatant of the second selected strain was filtered to remove impurities, and each of the supernatants in which the impurities were removed was placed in an analytical CarboPac PA1 column (0.4) connected to a Dionex model DX-600 system equipped with an ED50 electrochemical detector cm × 25 cm; Dionex Co., Sunnyvale, Calif., USA), followed by isocratic separation by linear gradient for 10 to 40 minutes at a rate of 1 ml / min using 200 mM NaOH, Were quantitatively analyzed. As a result, it was confirmed that the production yield of isomaltulose and trehalulose was the best in the strain No. 45, and the strain No. 45 was finally selected.

상기 최종 선발된 45번 균주를 동정한 결과, 상기 45번 균주는 펙토박테리움 속 미생물의 일종인 펙토박테리움 카로토보룸 KKH 3-1(P. carotovorum KKH 3-1) 임을 확인하였다.
As a result of the identification of the finally selected strain No. 45, it was confirmed that the strain No. 45 was Pectobacterium carotovorum KKH 3-1 (P. carotovorum KKH 3-1), which is a kind of microorganism of the genus Pektobacterium.

실시예Example 2:  2: 펙토박테리움Pectobacterium 카로토보룸Carrotoborum KKHKKH 3-1 균주의 특성분석 3-1 Characterization of strains

상기 실시예 1에서 최종 선발된 펙토박테리움 카로토보룸 KKH 3-1 균주를 LB 배지, 영양배지(NB; 0.5% peptone and 0.3% beef extract), 우수배지(TB; 1.2% tryptone, 2.4% yeast extract, and 0.4% glycerol) 및 펩톤-효모추출물 함유 배지(PY; 1% peptone and 0.4% yeast extract)에 각각 접종하고 30℃에서 30시간 동안 배양한 다음, 균주의 증식정도 및 각 균주에서 발현된 수크로스이성화효소의 활성을 비교하였다(도 2).0.5% peptone and 0.3% beef extract, 1.2% tryptone and 2.4% tryptone were added to the selected strain of Pectobacterium carotovorum KKH 3-1, which was finally selected in Example 1, yeast extract, and 0.4% glycerol) and peptone-yeast extract medium (PY; 1% peptone and 0.4% yeast extract) and incubated at 30 ° C for 30 hours. The activity of the sucrose isomerase was compared (Fig. 2).

도 2는 펙토박테리움 카로토보룸 KKH 3-1 균주를 4종의 서로 다른 배지에서 배양하고, 균주의 증식수준(A)과 균주로부터 발현된 수크로스이성화효소의 활성(B)을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 2에서 보듯이, TB 배지에서 배양된 펙토박테리움 카로토보룸 KKH 3-1 균주는 가장 높은 증식수준과 가장 낮은 수크로스이성화효소 활성을 나타낸 반면, PY 배지에서 배양된 펙토박테리움 카로토보룸 KKH 3-1 균주는 낮은 증식수준과 가장 높은 수크로스이성화효소 활성을 나타냄을 확인하였다.
Figure 2 shows the results of culturing the Pectobacterium carotovorum KKH 3-1 strain in four different media and measuring the growth level (A) of the strain and the activity (B) of the sucrose isomerase expressed from the strain Fig. As shown in FIG. 2, the Pctobacterium carotovorum KKH 3-1 strain cultured in the TB medium showed the highest proliferation level and the lowest sucrose isomerase activity, whereas the Pctobacterium luciferum cultured in the PY medium The tobomu KKH 3-1 strain showed low proliferation level and the highest sucrose isomerase activity.

이어, 상기 PY 배지에 0 내지 20%(w/v)의 수크로스를 가하여, 서로 다른 함량의 수크로스를 포함하는 배지를 제작하고, 상기 제작된 각 배지에 펙토박테리움 카로토보룸 KKH 3-1 균주를 접종한 후, 30℃에서 30시간 동안 배양하고, 수크로스이성화효소의 활성을 측정하였다(도 3). 이때, 수크로스이성화효소의 활성은 DNS(3,5-dinitrosalicylic acid) 방법을 사용하여 수행하였고, 수크로스이성화효소 1unit의 활성도는 1분동안 1μM 의 수크로스 이성질체를 제조할 수 있는 효소의 양으로 정의하였다.Subsequently, 0 to 20% (w / v) sucrose was added to the PY medium to prepare a medium containing different amounts of sucrose. To each of the prepared medium, Pectobacterium carotovorum KKH 3 -1 strain, and then cultured at 30 ° C for 30 hours to measure the activity of sucrose isomerase (FIG. 3). The activity of the sucrose isomerase was determined by DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) method. The activity of 1 unit of sucrose isomerase was determined by the amount of enzyme capable of producing 1 μM sucrose isomer Respectively.

도 3은 배지에 포함된 수크로스의 농도에 따른 수크로스이성화효소의 활성변화를 나타내는 그래프이다. 도 3에서 보듯이, 14%(w/v)까지의 수크로스를 포함하는 배지에서는 수크로스의 함량이 증가할 수록 수크로스이성화효소의 활성이 증가하였으나, 그 이상의 수크로스를 포함하는 배지에서는 수크로스의 함량이 증가할 수록 수크로스이성화효소의 활성이 감소함을 확인하였다.
FIG. 3 is a graph showing the activity of sucrose isomerase according to the concentration of sucrose contained in the medium. FIG. As shown in Fig. 3, in the medium containing sucrose up to 14% (w / v), the activity of sucrose isomerase was increased as the sucrose content was increased. However, in the medium containing sucrose, The activity of sucrose isomerase decreased as the content of cross increased.

실시예Example 3:  3: 펙토박테리움Pectobacterium 카로토보룸Carrotoborum KKHKKH 3-1 균주로부터  From strain 3-1 유래된Derived 수크로스이Sucross 성화효소 유전자의 Of the truncated enzyme gene 클로닝Cloning

실시예Example 3-1:  3-1: 수크로스이성화효소Sucrose isomerase 유전자의 규명 Identification of genes

먼저, 다양한 수크로스이성화효소에서 보존적인 아미노산 서열에 기초하여 하기 프라이머를 설계하였다.
First, the following primers were designed based on conservative amino acid sequences in various sucrose isomerases.

정방향 프라이머: 5'-CAT ATG TAC GAA CAA GTC TCC CAC TCG-3'(서열번호 3)Forward primer: 5'-CAT ATG TAC GAA CAA GTC TCC CAC TCG-3 '(SEQ ID NO: 3)

역방향 프라이머: 5'-CTC GAG AAG CTG TAA CCA ATA AAA GCC-3'(서열번호 4)
Reverse primer: 5'-CTC GAG AAG CTG TAA CCA ATA AAA GCC-3 '(SEQ ID NO: 4)

다음으로, 상기 펙토박테리움 카로토보룸 KKH 3-1 균주의 배양물로부터 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 설계한 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여 DNA 단편을 수득하였다. 이때, PCR은 95℃ 5분, 25 사이클(95℃ 30초, 55℃ 30초 및 72℃ 2분) 및 72℃ 5분의 조건으로 수행하였다. 상기 수득한 DNA 단편의 염기서열을 분석하고(서열번호 1), 분석된 염기서열을 BLASTN 및 BLASTP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 적용하여 뉴클레오티드 서열 및 이로부터 유추된 아미노산 서열(서열번호 2)의 동일성을 검색하였다(도 4). Next, PCR was performed using the genomic DNA extracted from the culture of the above-mentioned Pectobacterium carotovorum KKH 3-1 strain as a template and the primer designed above to obtain a DNA fragment. The PCR was carried out at 95 ° C for 5 minutes, 25 cycles (95 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 2 minutes) and 72 ° C for 5 minutes. The nucleotide sequence of the obtained DNA fragment was analyzed (SEQ ID NO: 1), and the analyzed nucleotide sequence was applied to BLASTN and BLASTP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) to identify the nucleotide sequence and its analog (SEQ ID NO: 2) was searched (Fig. 4).

도 4는 본 발명에서 제공하는 신규한 수크로스이성화효소의 아미노산 서열을 공지된 수크로스이성화효소의 서열과 비교분석한 결과를 나타내는데, 수크로스 이성질화 모티프(RLDRD)는 적색 박스로 표시되었고, PCSI는 본 발명의 펙토박테리움 카로토보룸 KKH 3-1(Pectobacterium carotovorum KKH 3-1) 유래 효소를 나타내고, MutB는 슈도모나스 메소액시도필라 MX-45(Pseudomonas mesoacidophila MX-45) 유래 효소를 나타내며, FMB-1는 엔테로박터 속 FMB-1(Enterobacter sp. FMB-1) 유래 효소를 나타내고, ERSI는 에르위니아 라폰티시 NCPPB 1578(Erwinia rhapontici NCPPB 1578) 유래 효소를 나타내며, PalI는 클렙시엘라 속 균주 LX3(Klebsiella sp.strain LX3) 유래 효소를 나타내고, KPSI는 클렙시엘라 플랜티콜라 UQ 14S(Klebsiella planticola UQ 14S) 유래 효소를 나타내며, PDSI는 판토에아 디스퍼사 UQ68J(Pantoea dispersa UQ68J) 유래 효소를 나타내고, SmuA는 프로타미노박터 루브럼 CBS574·77(Protaminobacter rubrum CBS574·77) 유래 효소를 나타낸다. 도 4에서 보듯이, 상기 펙토박테리움 카로토보룸 KKH 3-1 균주로부터 유래된 수크로스이성화효소는 아미노산 서열의 측면에서 종래의 다른 미생물로부터 유래된 수크로스이성화효소와 동일하지 않은 아미노산 서열로 구성됨을 확인하였다. 뿐만 아니라, 본 발명의 펙토박테리움 카로토보룸 KKH 3-1 균주와 동일한 속에 속하는 펙토박테리움 속 미생물(Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis PBR1692)로부터 유래된 수크로스이성화효소와도 약 95%의 동일성을 나타낼 뿐, 완전히 동일하지는 않은 새로운 아미노산 서열로 구성됨을 확인하였다.
FIG. 4 shows the result of comparing the amino acid sequence of the novel sucrose isomerase with the sequence of a known sucrose isomerase, wherein the sucrose isomerization motif (RLDRD) is represented by a red box, Represents an enzyme derived from Pectobacterium carotovorum KKH 3-1 of the present invention, and MutB represents an enzyme derived from Pseudomonas mesoacidophila MX-45 (Pseudomonas mesoacidophila MX-45) FMB-1 represents an enzyme derived from Enterobacter sp. FMB-1, ERSI represents an enzyme derived from Erwinia rhapontici NCPPB 1578, PalI represents an enzyme derived from Enterobacter sp. FMB-1, And KPSI represents an enzyme derived from Klebsiella planticola UQ 14S, and PDSI represents an enzyme derived from Pantoea disperse UQ68J. And SmuA represents an enzyme derived from protaminobacter rubrum CBS574 · 77 (Protaminobacter rubrum CBS574 · 77). As shown in FIG. 4, the sucrose isomerase derived from the above-mentioned Pfactobacterium carotovorum KKH 3-1 strain has an amino acid sequence which is not identical to the sucrose isomerase derived from other conventional microorganisms in terms of amino acid sequence Respectively. In addition, about 95% identity with the sucrose isomerase derived from Pectobacterium carotovorum subsp. Brasiliensis PBR1692 belonging to the same genus as the Pectobacterium carotovorum KKH 3-1 strain of the present invention But it is composed of a new amino acid sequence which is not completely identical.

이에, 본 발명자들은 상기 신규한 수크로스이성화효소를 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 상기 효소의 아미노산 서열을 2013년 8월 13일자로 GenBank에 기탁하고, 등록번호(accession number) KF317210.1을 부여받았다.
The present inventors deposited the nucleotide sequence of the gene encoding the novel sucrose isomerase and the amino acid sequence of the enzyme on GenBank on Aug. 13, 2013 and received accession number KF317210.1 .

실시예Example 3-2:  3-2: 수크로스이성화효소Sucrose isomerase 유전자의  Gene 클로닝Cloning , 발현 및 정제, Expression and purification

상기 실시예 3-1에서 수득한 DNA 단편을 정제키트(QIA quick Gel extraction kit, Qiagen, Valencia, CA, USA)에 적용하여 정제하고, 상보적 제한효소 절단부위를 사용하여 pGEMT-easy 벡터에 클로닝하였다. 이어, 클로닝된 벡터에서 수크로스이성화효소 유전자를 추출하고, 추출된 유전자를 pET-21a(+) 벡터에 도입하여 발현벡터인 pET-PCSI를 제작하였다. 이때, 상기 발현벡터에서 발현된 수크로스이성화효소는 단백질의 C-말단에 6개의 히스티딘이 결합된 형태로 발현되도록 발현벡터를 설계하였다. The DNA fragment obtained in Example 3-1 was purified by applying to a purification kit (QIA quick gel extraction kit, Qiagen, Valencia, CA, USA) and cloned into a pGEMT-easy vector using a complementary restriction enzyme cleavage site Respectively. Then, the sucrose isomerase gene was extracted from the cloned vector, and the extracted gene was introduced into the pET-21a (+) vector to prepare an expression vector pET-PCSI. At this time, an expression vector was designed so that the sucrose isomerase expressed in the expression vector is expressed in the form that 6 histidine is bound to the C-terminal of the protein.

상기 제작된 발현벡터 pET-PCSI를 대장균 BL21에 도입하여 형질전환체를 수득하고, 수득한 형질전환체를 0.1 mg/㎖의 앰피실린이 포함된 1L의 LB 배지에 접종한 다음, 37℃에서 교반하면서 배양하였다. 600 nm에서 배양물의 흡광도가 0.5가 될 때, 1 mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 가하여 37℃에서 3시간 동안 수크로스이성화효소의 발현을 유도하였다. 그런 다음, 배양물을 4℃에서 6000 × g 로 20분 동안 원심분리하여 균체를 수득하고, 50 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)으로 2회 세척하였다. 상기 세척된 균체를 10㎖의 세포용해 완충액(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl 및 10 mM 이미다졸, pH 7.0)에 현탁시키고, 냉온수조에서 초음파를 처리(4분 × 5분, output control 4, 50% duty cycle; VC-600, Sonics & Materials, Inc., Newtown, CT, USA)한 다음, 4℃에서 12,000 × g 로 20분 동안 원심분리하여 상등액을 수득하였다. The prepared expression vector pET-PCSI was introduced into Escherichia coli BL21 to obtain a transformant. The obtained transformant was inoculated into 1 L of LB medium containing 0.1 mg / ml of ampicillin, . When the absorbance of the culture reached 0.5 at 600 nm, 1 mM IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) was added to induce expression of sucrose isomerase at 37 ° C. for 3 hours. The culture was then centrifuged at 6000 x g for 20 minutes at 4 DEG C to obtain cells and washed twice with 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0). Wherein the washed cells were suspended in cell lysis buffer 10㎖ (50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl and 10 mM imidazole, pH 7.0), treated in an ultrasonic hot water tank (4 min × 5 bun, output control 4, 50% duty cycle; VC-600, Sonics & Materials, Inc., Newtown, CT, USA) and centrifuged at 12,000 x g for 20 minutes at 4 占 폚.

상기 상등액을 세포용해 완충액으로 평형화시킨 Ni-NTA(nickel-nitrilotriacetic acid) 친화성 컬럼 크로마토그래피에 적용하고, 세척용 완충액(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl 및 20 mM 이미다졸, pH 7.0)으로 3회 세척한 다음, 용출완충액(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl 및 250 mM 이미다졸, pH 7.0)을 사용하여 재조합 수크로스이성화효소를 용출하였다. 끝으로, 용출된 재조합 수크로스이성화효소를 포함하는 분획을 투석하여 과량의 이미다졸을 제거함으로써, 재조합 수크로스이성화효소를 정제하였다(도 5).The supernatant was applied to nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) affinity column chromatography equilibrated with a cell lysis buffer and washed with washing buffer (50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl and 20 mM imidazole, pH 7.0) It washed three times and then elution buffer (50 mM NaH 2 PO 4, 300 mM NaCl and 250 mM imidazole, pH 7.0) to be eluted using recombinant cross-isomerase. Finally, the fraction containing the eluted recombinant sucrose isomerase was dialyzed to remove excess imidazole to thereby purify the recombinant sucrose isomerase (FIG. 5).

도 5는 본 발명의 수크로스이성화효소를 정제하는 과정에서 얻어진 시료를 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타내는 사진으로서, 1번 레인은 음성대조군(대장균 BL21)을 나타내고, 2번 레인은 세포 파쇄물을 나타내며, 3번 레인은 정제된 재조합 수크로스이성화효소를 나타낸다.
FIG. 5 is a photograph showing the result of SDS-PAGE analysis of a sample obtained in the course of purifying the sucrose isomerase of the present invention, wherein lane 1 represents a negative control (E. coli BL21), lane 2 represents cell lysate , And lane 3 represents a purified recombinant sucrose isomerase.

실시예Example 4:  4: 펙토박테리움Pectobacterium 카로토보룸Carrotoborum KKHKKH 3-1 균주로부터  From strain 3-1 유래된Derived 수크로스이Sucross 성화효소의 특성 평가Characterization of the enrichment enzyme

상기 실시예 3-2에서 정제한 재조합 수크로스이성화효소의 특성을 분석하였다.
The characteristics of the recombinant sucrose isomerase purified in Example 3-2 were analyzed.

실시예Example 4-1:  4-1: pHpH 변화에 따른 효소활성분석 Analysis of Enzyme Activities by Changes

소듐 아세테이트 완충액(pH 4.0-5.0), 소듐 시트레이트 완충액(pH 5.0-6.0), 소듐 포스페이트 완충액(pH 6.0-8.0), Tris-HCl 완충액(pH 7.0-9.0) 및 글리신-NaOH 완충액(pH 9.0-10.0)의 조건하에서, 상기 재조합 수크로스이성화효소의 활성변화를 DNS 방법으로 측정한 후, 비교하였다(도 6의 (A)).Sodium acetate buffer (pH 5.0-6.0), sodium phosphate buffer (pH 6.0-8.0), Tris-HCl buffer (pH 7.0-9.0) and glycine-NaOH buffer (pH 9.0-5.0) 10.0), the change in the activity of the recombinant sucrose isomerase was measured by the DNS method and compared (Fig. 6 (A)).

도 6의 (A)는 pH 변화에 따른 재조합 수크로스이성화효소의 활성변화를 나타내는 그래프로서, (●)는 소듐 아세테이트 완충액(pH 4.0-5.0)을 나타내고, (○)는 소듐 시트레이트 완충액(pH 5.0-6.0)을 나타내며, (▼)는 소듐 포스페이트 완충액(pH 6.0-8.0)을 나타내고, (△)는 Tris-HCl 완충액(pH 7.0-9.0)을 나타내며, (■)는 글리신-NaOH 완충액(pH 9.0-10.0)을 나타낸다. 도 6의 (A)에서 보듯이, pH 5.0 내지 7.0에서 재조합 수크로스이성화효소가 높은 활성을 나타내었고, pH 6.0에서 최적 활성을 나타냄을 확인하였다.
FIG. 6A is a graph showing changes in the activity of the recombinant sucrose isomerase according to pH change. FIG. 6A shows sodium acetate buffer (pH 4.0-5.0), and FIG. 6C shows changes in sodium citrate buffer (?) Represents sodium phosphate buffer (pH 6.0-8.0), (?) Represents Tris-HCl buffer (pH 7.0-9.0) and (?) Represents glycine-NaOH buffer 9.0-10.0). As shown in FIG. 6 (A), the recombinant sucrose isomerase exhibited high activity at pH 5.0 to 7.0, and showed optimal activity at pH 6.0.

실시예Example 4-2: 온도 변화에 따른 효소활성분석 4-2: Enzyme activity analysis by temperature change

25 내지 60℃의 온도조건하에서, 상기 재조합 수크로스이성화효소의 활성변화를 DNS 방법으로 측정한 후, 비교하였다(도 6의 (B)).The activity change of the recombinant sucrose isomerase was measured by a DNS method under the temperature condition of 25 to 60 ° C and then compared (FIG. 6 (B)).

도 6의 (B)는 온도 변화에 따른 재조합 수크로스이성화효소의 활성변화를 나타내는 그래프이다. 도 6의 (B)에서 보듯이, 30 내지 50℃의 온도조건하에서 재조합 수크로스이성화효소가 높은 활성을 나타내었고, 40℃에서 최적 활성을 나타냄을 확인하였다.
6 (B) is a graph showing changes in the activity of the recombinant sucrose isomerase according to the temperature change. As shown in FIG. 6 (B), the recombinant sucrose isomerase exhibited high activity under temperature conditions of 30 to 50 ° C and showed optimal activity at 40 ° C.

실시예Example 4-3: 반감기온도( 4-3: half-life temperature ( halfhalf -- lifelife temperature온도 ) 측정) Measure

소듐 시트레이트 완충액(pH 6.0)에서 50, 55 및 60℃의 온도조건하에서 30분동안 상기 재조합 수크로스이성화효소의 활성변화를 측정하여, 반감기온도를 결정하였다(도 7의 (A)).The half-life temperature was determined by measuring the activity change of the recombinant sucrose isomerase in sodium citrate buffer (pH 6.0) for 30 minutes under temperature conditions of 50, 55 and 60 캜 (Fig. 7 (A)).

도 7의 (A)는 온도변화에 따른 효소활성의 변화를 로그값으로 표시한 그래프로서, (●)는 50℃를 나타내고, (○)는 55℃를 나타내며, (▼)는 60℃를 나타낸다. 도 7의 (A)에서 보듯이, 50℃에서는 수크로스이성화효소의 활성이 지속적으로 유지되었으나, 55℃에서는 25.7분이 경과된 시점에서 수크로스이성화효소의 활성이 50%로 감소하였으며, 60℃에서는 수크로스이성화효소의 활성이 거의 나타나지 않음을 확인하였다.
7 (A) is a graph showing the change in enzyme activity with temperature change as a log value, in which () indicates 50 ° C, () indicates 55 ° C, and () indicates 60 ° C . As shown in FIG. 7 (A), the activity of sucrose isomerase was maintained at 50 ° C., but the activity of sucrose isomerase decreased to 50% at 25 ° C. at 55 ° C., It was confirmed that the activity of the sucrose isomerase was almost not exhibited.

실시예Example 4-4: 변성온도( 4-4: Denaturation temperature ( meltingmelting temperature온도 ) 측정) Measure

DSF(differential scanning fluorimetry) 방법을 이용하여 재조합 수크로스이성화효소의 변성온도(melting temperature)를 측정하였다. DSF (differential scanning fluorimetry) method was used to measure the melting temperature of the recombinant sucrose isomerase.

구체적으로, 10 ㎕의 효소용액(0.1 mg/㎖)과 10 ㎕의 SYPRO orange(10×)를 혼합하여 시료를 준비하고, 상기 시료를 실시간 PCR 시스템에 적용하고, 30 내지 99℃ 까지 1℃씩 증가시켰다. 이때, 모든 형광값의 측정은 Applied Biosystems 7500 Fast RT-PCR system (Applied Biosystems,Grand Island, NY, USA)을 사용하여 수행되었고, 컴퓨터 프로그램(Sigma Plot 12.0 software, Systat Software Inc., Chicago, IL,USA 및 액셀 프로그램)을 사용하여 그래프분석 및 데이터 통계분석을 수행하였다(도 7의 (B)).Specifically, a sample was prepared by mixing 10 μl of an enzyme solution (0.1 mg / ml) and 10 μl of SYPRO orange (10 ×), applying the sample to a real-time PCR system and incubating the mixture at 30 ° C to 99 ° C Respectively. All fluorescence values were measured using an Applied Biosystems 7500 Fast RT-PCR system (Applied Biosystems, Grand Island, NY, USA) and run on a computer program (Sigma Plot 12.0 software, Systat Software Inc., Chicago, IL, USA and Accel program) were used to perform graph analysis and data statistical analysis (Fig. 7 (B)).

도 7의 (B)는 재조합 수크로스이성화효소의 변성온도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 7의 (B)에서 보듯이, 재조합 수크로스이성화효소의 변성온도는 55.5 ± 0.6℃임을 확인하였다.
7 (B) is a graph showing the results of measurement of the denaturation temperature of the recombinant sucrose isomerase. As shown in FIG. 7 (B), the denaturation temperature of the recombinant sucrose isomerase was found to be 55.5 ± 0.6 ° C.

실시예Example 4-5:  4-5: 수크로스Sucrose 이성질체의 생산 Production of isomers

재조합 수크로스이성화효소의 반응온도에 따라, 반응산물이 변화되는지의 여부를 확인하기 위하여, 30 내지 50℃의 온도범위에서 수크로스를 기질로 사용하여 효소반응시켰다. 반응산물은 HPAEC 분석법에 적용하여, 생성된 글루코스, 프럭토스, 트레할룰로스 및 이소말툴로스를 정량하였다(표 1).
In order to confirm whether or not the reaction product was changed according to the reaction temperature of the recombinant sucrose isomerase, enzyme reaction was performed using sucrose as a substrate at a temperature range of 30 to 50 ° C. The reaction products were applied to the HPAEC analysis to quantitate the resulting glucose, fructose, trehalulose and isomaltulose (Table 1).

반응온도변화에 따른 재조합 수크로스이성화효소의 활성변화 Changes in activity of recombinant sucrose isomerase according to reaction temperature 반응온도
(℃)Reaction temperature
(° C) 글루코스 및
프럭토스(%)Glucose and
Fructose (%) 트레할룰로스
(%)Trehalulose
(%) 이소말툴로스
(%)Isomaltulose
(%) 비율
(트레할룰로스/이소말툴로스)ratio
(Trehalulose / isomaltulose) 30
35
40
45
5030
35
40
45
50 0.06
0.35
0.89
1.64
2.560.06
0.35
0.89
1.64
2.56 79.16
70.92
63.26
54.61
47.5479.16
70.92
63.26
54.61
47.54 20.72
28.38
34.96
42.10
47.3320.72
28.38
34.96
42.10
47.33 79/21
71/29
64/36
56/44
50/5079/21
71/29
64/36
56/44
50/50

상기 표 1에서 보듯이, 반응온도가 낮을수록 트레할룰로스의 생성량이 증가하는 반면, 반응온도가 증가할수록 이소말툴로스의 생성량이 증가하는 양상을 나타냄을 확인하였다.
As shown in Table 1, it was confirmed that the amount of trehalulose increased as the reaction temperature was lower, while the amount of isomaltulose increased as the reaction temperature increased.

실시예Example 4-6: 다양한  4-6: Various 수크로스이성화효소의Sucrose isomerase 특성 평가 Character rating

본 발명에서 제공하는 재조합 수크로스이성화효소와 종래에 알려진 다양한 균주로부터 발현되는 수크로스이성화효소의 주요 특성을 비교하여, 본 발명에서 제공하는 수크로스이성화효소의 특성을 평가하였다(표 2).
The characteristics of the sucrose isomerase provided in the present invention were evaluated by comparing the main characteristics of the sucrose isomerase expressed from various strains known in the art with the recombinant sucrose isomerase provided in the present invention (Table 2).

다양한 균주에서 유래된 수크로스이성화효소의 정보 및 효소특성Information and enzymatic characteristics of sucrose isomerase from various strains 균주
번호Strain
number 등록번호
Registration Number
상동성
(%)Homology
(%) 분자량
(kDa)Molecular Weight
(kDa) pIpI 최적온도
(℃)Optimum temperature
(° C) 최적 pHOptimum pH 산물비(%)Product Ratio (%) 트레할룰로스Trehalulose 이소말툴로스Isomaltulose #1
#2
#3
#4
#5
#6
#7
#8#One
#2
# 3
#4
# 5
# 6
# 7
#8 KF317210
ACF42098.1
AAP57084.1
AAP57085.1
AAK82938.1
AAP57083.1
EKF64560
ABC33903.1KF317210
ACF42098.1
AAP57084.1
AAP57085.1
AAK82938.1
AAP57083.1
EKF64560
ABC33903.1 100
66
67
70
70
66
68
67100
66
67
70
70
66
68
67 68.8
70.2
73.3
70.0
69.9
69.4
69.6
66.868.8
70.2
73.3
70.0
69.9
69.4
69.6
66.8 5.96
6.02
6.62
6.62
6.58
6.99
7.11
5.305.96
6.02
6.62
6.62
6.58
6.99
7.11
5.30 40
50
30
35
35
35
30
4040
50
30
35
35
35
30
40 6.0
5.0-6.0
7.0
6.0
6.0
5.0
5.5
5.86.0
5.0-6.0
7.0
6.0
6.0
5.0
5.5
5.8 64
22
15
15
21
3
9
9164
22
15
15
21
3
9
91 36
78
85
66
83
91
86
836
78
85
66
83
91
86
8

균주번호 #1은 Pectobacterium carotovorumKKH 3-1을 나타내고, #2는 Enterobacter sp. FMB-1을 나타내며, #3은 Erwinia rhapontici NCPPB 1578을 나타내고, #4는 Klebsiella planticola UQ 14S를 나타내며, #5는 Klebsiella sp. LX3을 나타내고, #6은 Pantoea dispersa UQ68J를 나타내며, #7은 Protaminobacter rubrum CBS574-77을 나타내고, #8은 Pseudomonas mesoacidophila MX-45를 나타낸다.
Strain # 1 represents Pectobacterium carotovorum KKH 3-1, and # 2 represents Enterobacter sp. FMB-1, # 3 represents Erwinia rhapontici NCPPB 1578, # 4 represents Klebsiella planticola UQ 14S, and # 5 represents Klebsiella sp. LX3, # 6 represents Pantoea disperse UQ68J, # 7 represents Protaminobacter rubrum CBS574-77, and # 8 represents Pseudomonas mesoacidophila MX-45.

상기 표 2에서 보듯이, 본 발명에서 제공하는 수크로스이성화효소는 대부분의 다른 균주에서 유래된 수크로스이성화효소보다도 트레할룰로스의 생산성이 우수함을 알 수 있었다.
As shown in Table 2, the sucrose isomerase provided by the present invention was found to be superior to the sucrose isomerase derived from most of the other strains in productivity of trehalulose.

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Novel sucrose isomerase and process for preparing the same <130> PA131372/KR <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 591 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pectobacterium carotovorum KKH 3-1, sucrose isomerase <400> 1 Met Leu Ala Ala Gly Leu Ser Phe Ser Ala Val Asn Tyr Ala Ala Thr 1 5 10 15 Asn His Asn Glu Gln Asp Thr Lys Thr Val Ile Ala Val Asn Asp Gly 20 25 30 Val Ser Ala His Pro Val Trp Trp Lys Glu Ala Val Phe Tyr Gln Val 35 40 45 Tyr Pro Arg Ser Phe Lys Asp Ser Asn Gly Asp Gly Ile Gly Asp Leu 50 55 60 Lys Gly Leu Thr Glu Lys Leu Asp Tyr Leu Lys Thr Leu Gly Ile Asn 65 70 75 80 Ala Ile Trp Ile Asn Pro His Tyr Asp Ser Pro Asn Thr Asp Asn Gly 85 90 95 Tyr Asp Ile Arg Asp Tyr Arg Lys Ile Met Lys Glu Tyr Gly Thr Met 100 105 110 Asp Asp Phe Asp Asn Leu Ile Ala Glu Met Lys Lys Arg Asp Met Arg 115 120 125 Leu Met Ile Asp Val Val Val Asn His Thr Ser Asn Glu His Lys Trp 130 135 140 Phe Val Glu Ser Lys Lys Ser Lys Asp Asn Pro Tyr Arg Asp Tyr Tyr 145 150 155 160 Ile Trp Arg Asp Gly Lys Asp Gly Thr Pro Pro Asn Asn Tyr Pro Ser 165 170 175 Phe Phe Gly Gly Ser Ala Trp Gln Lys Asp Asn Val Thr Gln Gln Tyr 180 185 190 Tyr Leu His Tyr Phe Gly Val Gln Gln Pro Asp Leu Asn Trp Asp Asn 195 200 205 Pro Lys Val Arg Glu Glu Val Tyr Asp Met Leu Arg Phe Trp Ile Asp 210 215 220 Lys Gly Val Ser Gly Leu Arg Met Asp Thr Val Ala Thr Phe Ser Lys 225 230 235 240 Asn Pro Ala Phe Pro Asp Leu Thr Pro Glu Gln Leu Lys Asn Phe Ala 245 250 255 Tyr Thr Tyr Thr Gln Gly Pro Asn Leu His Arg Tyr Ile Gln Glu Met 260 265 270 His Gln Lys Val Leu Ala Lys Tyr Asp Val Val Ser Ala Gly Glu Ile 275 280 285 Phe Gly Val Pro Leu Glu Glu Ala Ala Pro Phe Ile Asp Gln Arg Arg 290 295 300 Lys Glu Leu Asp Met Ala Phe Ser Phe Asp Leu Ile Arg Leu Asp Arg 305 310 315 320 Ala Val Glu Glu Arg Trp Arg Arg Asn Asp Trp Thr Leu Ser Gln Phe 325 330 335 Arg Gln Ile Asn Asn Arg Leu Val Asp Met Ala Gly Gln Tyr Gly Trp 340 345 350 Asn Thr Phe Phe Leu Ser Asn His Asp Asn Pro Arg Ala Val Ser His 355 360 365 Phe Gly Asp Asp Arg Pro Glu Trp Arg Ile Arg Ser Ala Lys Ala Leu 370 375 380 Ala Thr Leu Ala Leu Thr Gln Arg Ala Thr Pro Phe Ile Tyr Gln Gly 385 390 395 400 Asp Glu Leu Gly Met Thr Asn Tyr Pro Phe Thr Ser Leu Ser Glu Phe 405 410 415 Asp Asp Ile Glu Val Lys Gly Phe Trp Gln Asp Phe Val Glu Thr Gly 420 425 430 Lys Val Lys Pro Asp Val Phe Leu Glu Asn Val Lys Gln Thr Ser Arg 435 440 445 Asp Asn Ser Arg Thr Pro Phe Gln Trp Ser Asn Ala Glu Gln Ala Gly 450 455 460 Phe Thr Thr Gly Thr Pro Trp Phe Arg Ile Asn Pro Asn Tyr Lys Asn 465 470 475 480 Ile Asn Ala Glu Asp Gln Thr Gln Asn Pro Asp Ser Ile Phe His Phe 485 490 495 Tyr Arg Gln Leu Ile Ala Leu Arg His Ala Thr Pro Ala Phe Thr Tyr 500 505 510 Gly Ala Tyr Gln Asp Leu Asp Pro Asn Asn Asn Glu Val Leu Ala Tyr 515 520 525 Thr Arg Glu Leu Asn Gln Gln Arg Tyr Leu Val Val Val Asn Phe Lys 530 535 540 Glu Lys Pro Val His Tyr Ala Leu Pro Lys Thr Leu Ser Ile Lys Gln 545 550 555 560 Thr Leu Leu Glu Ser Gly Gln Lys Asp Lys Val Ala Pro Asn Ala Thr 565 570 575 Ser Leu Glu Leu Gln Pro Trp Gln Ser Gly Ile Tyr Gln Leu Asn 580 585 590 <210> 2 <211> 1776 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pectobacterium carotovorum KKH 3-1, sucrose isomerase <400> 2 atgctggcgg caggattatc attctcagcc gttaattatg cggcaacaaa tcataatgag 60 caggatacaa agacggtaat agccgtcaat gatggcgttt ctgcgcatcc cgtgtggtgg 120 aaagaagctg tgttctatca ggtttatcca cgttcattta aagacagtaa cggtgatggg 180 attggtgatc ttaaaggcct gaccgaaaag ctcgattatt taaaaacact cggtattaat 240 gccatctgga ttaaccccca ttatgattca ccgaataccg ataacggata cgatattcgt 300 gattatcgaa agataatgaa agaatatggc acaatggatg acttcgacaa cctcattgca 360 gaaatgaaaa agcgtgatat gcgactaatg atagatgttg tcgttaatca caccagcaat 420 gaacacaaat ggtttgttga aagtaagaaa tcaaaagata atccttatcg cgactattac 480 atttggcgcg atggtaaaga tggcacaccg cctaataatt acccctcctt cttcggcggt 540 tccgcctggc agaaagataa cgtaacacag caatattatt tacactattt tggcgtacag 600 cagcccgatc tgaattggga taatcccaaa gtacgtgaag aagtgtacga tatgctgcgt 660 ttctggattg ataaaggcgt ttccgggcta cgtatggata ccgtagcaac cttctctaag 720 aatccggcat ttcccgatct cacgccagaa caattgaaaa acttcgctta tacctacaca 780 caaggtccaa atctgcaccg ttacattcag gaaatgcacc agaaggtgct ggcaaaatac 840 gacgtcgttt ccgcaggtga aattttcggt gtaccgcttg aagaagcggc cccgtttatc 900 gatcaacgtc gtaaagagct cgatatggcc ttctcattcg atcttatccg tctcgatcgc 960 gccgtagaag aaagatggcg acggaatgat tggacgctat cccagttccg tcagatcaac 1020 aatcgactgg tcgatatggc cgggcaatat ggctggaata ctttcttcct gagcaaccat 1080 gataacccgc gtgctgtatc acacttcggt gacgatcgcc ctgagtggcg tatccgttct 1140 gctaaagcgt tggcaaccct agcgttaaca cagcgagcga ccccgtttat ttatcaaggg 1200 gacgaattgg gcatgaccaa ctatccgttt acctccttgt ctgaatttga tgacattgaa 1260 gttaaaggtt tctggcagga ctttgtagag accggaaaag tgaaacctga tgtctttttg 1320 gaaaacgtga aacaaacgag tcgcgataac agccgaaccc cattccaatg gagcaatgcg 1380 gaacaggcgg gctttactac aggtacgccc tggttccgta ttaaccccaa ctacaagaac 1440 atcaatgcag aggatcaaac gcaaaaccca gattccatct tccatttcta ccgtcagctg 1500 atcgcactgc gtcacgccac gccggcgttc acctacggag cctatcagga tctcgatccg 1560 aataataacg aggtacttgc ttatactcgt gaactcaacc agcaacgtta tctggttgtg 1620 gtgaacttta aagagaaacc ggtgcattac gcgctgccga aaacgctttc catcaagcaa 1680 acactgttgg aaagtgggca gaaagataag gtagcaccga atgcaacctc acttgagctc 1740 cagccgtggc aatctggtat ttatcagctg aactag 1776 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 catatgtacg aacaagtctc ccactcg 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 ctcgagaagc tgtaaccaat aaaagcc 27 <110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Novel sucrose isomerase and process for preparing same <130> PA131372 / KR <160> 4 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 591 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pectobacterium carotovorum KKH 3-1, sucrose isomerase <400> 1 Met Leu Ala Ala Gly Leu Ser Phe Ser Ala Val Asn Tyr Ala Ala Thr   1 5 10 15 Asn His Asn Glu Gln Asp Thr Lys Thr Val Ile Ala Val Asn Asp Gly              20 25 30 Val Ser Ala His Pro Val Trp Trp Lys Glu Ala Val Phe Tyr Gln Val          35 40 45 Tyr Pro Arg Ser Phe Lys Asp Ser Asn Gly Asp Gly Ile Gly Asp Leu      50 55 60 Lys Gly Leu Thr Glu Lys Leu Asp Tyr Leu Lys Thr Leu Gly Ile Asn  65 70 75 80 Ala Ile Trp Ile Asn Pro His Tyr Asp Ser Pro Asn Thr Asp Asn Gly                  85 90 95 Tyr Asp Ile Arg Asp Tyr Arg Lys Ile Met Lys Glu Tyr Gly Thr Met             100 105 110 Asp Asp Phe Asp Asn Leu Ile Ala Glu Met Lys Lys Arg Asp Met Arg         115 120 125 Leu Met Ile Asp Val Val Val Asn His Thr Ser Asn Glu His Lys Trp     130 135 140 Phe Val Glu Ser Lys Lys Ser Lys Asp Asn Pro Tyr Arg Asp Tyr Tyr 145 150 155 160 Ile Trp Arg Asp Gly Lys Asp Gly Thr Pro Pro Asn Asn Tyr Pro Ser                 165 170 175 Phe Phe Gly Gly Ser Ala Trp Gln Lys Asp Asn Val Thr Gln Gln Tyr             180 185 190 Tyr Leu His Tyr Phe Gly Val Gln Gln Pro Asp Leu Asn Trp Asp Asn         195 200 205 Pro Lys Val Arg Glu Glu Val Tyr Asp Met Leu Arg Phe Trp Ile Asp     210 215 220 Lys Gly Val Ser Gly Leu Arg Met Asp Thr Val Ala Thr Phe Ser Lys 225 230 235 240 Asn Pro Ala Phe Pro Asp Leu Thr Pro Glu Gln Leu Lys Asn Phe Ala                 245 250 255 Tyr Thr Tyr Thr Gln Gly Pro Asn Leu His Arg Tyr Ile Gln Glu Met             260 265 270 His Gln Lys Val Leu Ala Lys Tyr Asp Val Val Ser Ala Gly Glu Ile         275 280 285 Phe Gly Val Pro Leu Glu Glu Ala Ala Pro Phe Ile Asp Gln Arg Arg     290 295 300 Lys Glu Leu Asp Met Ala Phe Ser Phe Asp Leu Ile Arg Leu Asp Arg 305 310 315 320 Ala Val Glu Glu Arg Trp Arg Arg Asn Asp Trp Thr Leu Ser Gln Phe                 325 330 335 Arg Gln Ile Asn Asn Arg Leu Val Asp Met Ala Gly Gln Tyr Gly Trp             340 345 350 Asn Thr Phe Leu Ser Asn His Asp Asn Pro Arg Ala Val Ser His         355 360 365 Phe Gly Asp Asp Arg Pro Glu Trp Arg Ile Arg Ser Ala Lys Ala Leu     370 375 380 Ala Thr Leu Ala Leu Thr Gln Arg Ala Thr Pro Phe Ile Tyr Gln Gly 385 390 395 400 Asp Glu Leu Gly Met Thr Asn Tyr Pro Phe Thr Ser Leu Ser Glu Phe                 405 410 415 Asp Asp Ile Glu Val Lys Gly Phe Trp Gln Asp Phe Val Glu Thr Gly             420 425 430 Lys Val Lys Pro Asp Val Phe Leu Glu Asn Val Lys Gln Thr Ser Arg         435 440 445 Asp Asn Ser Arg Thr Pro Phe Gln Trp Ser Asn Ala Glu Gln Ala Gly     450 455 460 Phe Thr Thr Gly Thr Pro Trp Phe Arg Ile Asn Pro Asn Tyr Lys Asn 465 470 475 480 Ile Asn Ala Glu Asp Gln Thr Gln Asn Pro Asp Ser Ile Phe His Phe                 485 490 495 Tyr Arg Gln Leu Ile Ala Leu Arg His Ala Thr Pro Ala Phe Thr Tyr             500 505 510 Gly Ala Tyr Gln Asp Leu Asp Pro Asn Asn Asn Glu Val Leu Ala Tyr         515 520 525 Thr Arg Glu Leu Asn Gln Gln Arg Tyr Leu Val Val Val Asn Phe Lys     530 535 540 Glu Lys Pro Val His Tyr Ala Leu Pro Lys Thr Leu Ser Ile Lys Gln 545 550 555 560 Thr Leu Leu Glu Ser Gly Gln Lys Asp Lys Val Ala Pro Asn Ala Thr                 565 570 575 Ser Leu Glu Leu Gln Pro Trp Gln Ser Gly Ile Tyr Gln Leu Asn             580 585 590 <210> 2 <211> 1776 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pectobacterium carotovorum KKH 3-1, sucrose isomerase <400> 2 atgctggcgg caggattatc attctcagcc gttaattatg cggcaacaaa tcataatgag 60 caggatacaa agacggtaat agccgtcaat gatggcgttt ctgcgcatcc cgtgtggtgg 120 aaagaagctg tgttctatca ggtttatcca cgttcattta aagacagtaa cggtgatggg 180 attggtgatc ttaaaggcct gaccgaaaag ctcgattatt taaaaacact cggtattaat 240 gccatctgga ttaaccccca ttatgattca ccgaataccg ataacggata cgatattcgt 300 gattatcgaa agataatgaa agaatatggc acaatggatg acttcgacaa cctcattgca 360 gaaatgaaaa agcgtgatat gcgactaatg atagatgttg tcgttaatca caccagcaat 420 gaacacaaat ggtttgttga aagtaagaaa tcaaaagata atccttatcg cgactattac 480 atttggcgcg atggtaaaga tggcacaccg cctaataatt acccctcctt cttcggcggt 540 tccgcctggc agaaagataa cgtaacacag caatattatt tacactattt tggcgtacag 600 cagcccgatc tgaattggga taatcccaaa gtacgtgaag aagtgtacga tatgctgcgt 660 ttctggattg ataaaggcgt ttccgggcta cgtatggata ccgtagcaac cttctctaag 720 aatccggcat ttcccgatct cacgccagaa caattgaaaa acttcgctta tacctacaca 780 caaggtccaa atctgcaccg ttacattcag gaaatgcacc agaaggtgct ggcaaaatac 840 gacgtcgttt ccgcaggtga aattttcggt gtaccgcttg aagaagcggc cccgtttatc 900 gatcaacgtc gtaaagagct cgatatggcc ttctcattcg atcttatccg tctcgatcgc 960 gccgtagaag aaagatggcg acggaatgat tggacgctat cccagttccg tcagatcaac 1020 aatcgactgg tcgatatggc cgggcaatat ggctggaata ctttcttcct gagcaaccat 1080 gataacccgc gtgctgtatc acacttcggt gacgatcgcc ctgagtggcg tatccgttct 1140 gctaaagcgt tggcaaccct agcgttaaca cagcgagcga ccccgtttat ttatcaaggg 1200 gacgaattgg gcatgaccaa ctatccgttt acctccttgt ctgaatttga tgacattgaa 1260 gttaaaggtt tctggcagga ctttgtagag accggaaaag tgaaacctga tgtctttttg 1320 gaaaacgtga aacaaacgag tcgcgataac agccgaaccc cattccaatg gagcaatgcg 1380 gaacaggcgg gctttactac aggtacgccc tggttccgta ttaaccccaa ctacaagaac 1440 atcaatgcag aggatcaaac gcaaaaccca gattccatct tccatttcta ccgtcagctg 1500 atcgcactgc gtcacgccac gccggcgttc acctacggag cctatcagga tctcgatccg 1560 aataataacg aggtacttgc ttatactcgt gaactcaacc agcaacgtta tctggttgtg 1620 gtgaacttta aagagaaacc ggtgcattac gcgctgccga aaacgctttc catcaagcaa 1680 acactgttgg aaagtgggca gaaagataag gtagcaccga atgcaacctc acttgagctc 1740 cagccgtggc aatctggtat ttatcagctg aactag 1776 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 catatgtacg aacaagtctc ccactcg 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 ctcgagaagc tgtaaccaat aaaagcc 27

Claims (8)

펙토박테리움 속 미생물(Pectobacterium carotovorum KKH 3-1)로부터 유래된 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 수크로스로부터 대량의 트레할룰로스를 생산할 수 있는 수크로스이성화효소(sucrose isomerase).
A sucrose isomerase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 derived from Pectobacterium carotovorum KKH 3-1 and capable of producing a large amount of trehalulose from sucrose.
제1항에 있어서,
상기 수크로스이성화효소의 변성온도(Tm)는 55.5℃이고, 25 내지 55℃에서 효소활성을 나타내며, 30 내지 50℃에서 최대활성의 60 내지 100%를 나타내는 것인 수크로스이성화효소.
The method according to claim 1,
Wherein the sucrose isomerase has a denaturation temperature (Tm) of 55.5 DEG C, exhibiting enzyme activity at 25 to 55 DEG C and 60 to 100% of the maximum activity at 30 to 50 DEG C.
제1항에 있어서,
상기 수크로스이성화효소는 pH 5.0 내지 7.0에서 최대활성의 80 내지 100%를 나타내는 것인 수크로스이성화효소.
The method according to claim 1,
Wherein said sucrose isomerase exhibits 80-100% of maximum activity at pH 5.0-7.0.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 수크로스이성화효소를 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
A polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a sucrose isomerase of any one of claims 1 to 3.
제4항에 있어서,
서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
5. The method of claim 4,
2. A polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
제4항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
An expression vector comprising the polynucleotide of claim 4.
제6항의 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체.
A transformant wherein the expression vector of claim 6 is introduced into a host cell.
(a) 제7항의 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및,
(b) 상기 배양물로부터 본 발명의 수크로스이성화효소를 회수하는 단계를 포함하는, 수크로스이성화효소의 제조방법.
(a) culturing the transformant of claim 7 to obtain a culture; And
(b) recovering the sucrose isomerase of the present invention from the culture.
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