KR20160007012A

KR20160007012A - 아연의 배위 착염을 포함하는 프롤릴 히드록실라제 저해용 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20160007012A
Application number: KR1020140086882A
Authority: KR
Inventors: 양은경; 나유란; 김소연; 정학숙
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2014-07-10
Filing date: 2014-07-10
Publication date: 2016-01-20
Also published as: KR101856032B1

Abstract

아연의 배위 착염, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체를 포함하는 프롤릴 히드록실라제 저해용 조성물 및 이의 용도를 제공한다. 이에 의하면, 아연의 배위 착염, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체가 프롤릴 히드록실라제, 예를 들어 프롤릴 히드록실라제 3을 선택적으로 저해하고, 허혈성 질환, 암, 퇴행성 뇌질환, 염증, 또는 이들의 조합의 질병을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

아연의 배위 착염을 포함하는 프롤릴 히드록실라제 저해용 조성물 및 이의 용도{Composition for inhibiting prolyl hydroxylase including a coordination complex of zinc and using thereof}

아연의 배위 착염을 포함하는 프롤릴 히드록실라제 저해용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

산소 분압의 변화는 심근 경색, 뇌졸중, 및 암과 같은 다양한 질병과 관련되어 있다. 신체 내에서 저산소 상태가 유도되면 적혈구 생성과 신생 혈관 생성과 같은 변화가 유도되는데, 이러한 일련의 과정은 전사 조절 인자인 저산소 유도 인자(hypoxia inducible factor1-α; HIF1-α)에 의해 매개되고, HIF1-α의 아미노산 서열 중 402번째 및 564번째 프롤린(proline) 잔기의 산소 의존적인 수산화에 의해 조절된다. HIF1-α의 프롤린 잔기의 수산화는 프롤릴 히드록실라제(prolyl hydroxylase; PHD)에 의해 일어나고, 프롤린 잔기가 수산화된 HIF1-α는 pVHL(von Hippel-Lindau tumour suppressor)와 결합한다. 그 결과, HIF1-α는 프로테아좀 관련 분해를 통해 분해되어 전사 조절 인자의 기능이 억제된다. HIF1-α는 저산소 상태에서 다양한 유전자의 발현을 조절하고, 혈관 내피 성장 인자(Vascular endothelial growth factor; VEGF)의 발현을 촉진시킴으로써 국소 빈혈에 관한 연구에 유용하다. HIF-1α는 저산소 상태에서 세포주기의 진행을 촉진, 혈관형성의 항진, 또는 세포 생존기능을 항진시켜 관상동맥부전, 뇌부전 및 혈관부전과 같은 허혈성 질환의 치료에 유용한 반면, 정상 산소 상태에서 혈관형성의 억제를 통해 암 조직의 성장을 억제할 수 있으므로 암 예방 또는 치료, 또는 염증 예방 또는 치료에 유용하다.

프롤릴 히드록실라제(PHD)는 포유류에서 PHD1 내지 PHD3의 3종이 알려져 있다. PHD2는 정상 산소 상태에서 HIF1-α를 연속적인 불안정 상태 유지에 매우 중요한 역할을 하고, 신경 성장 인자 손실로 유도된 신경 세포 아팝토시스에 PHD3가 요구된다. 한편, 최근에는 HIF1-α이외에 PHD의 표적 단백질을 찾고 이들의 기능을 밝히기 위한 연구가 진행되고 있다. PHD의 활성은 수산화된 HIF1-α과 VHL 단백질과의 상호작용을 통해 확인할 수 있다. PHD 활성의 저해는 모조 저산소(hypoxia-mimic) 상태를 유도하여　HIF1-α의 기능을 조절할 수 있을 뿐만 아니라 최근 새로이 보고되고 있는 PHD의 표적 단백질의 기능을 조절할 수 있다.

따라서, PHD의 표적 단백질의 기능을 조절하여 허혈성 질환, 암, 및 염증과 같은 질병을 예방 또는 치료하기 위해, PHD의 활성을 억제하는 PHD 저해용 조성물을 개발할 필요가 있다.

프롤릴 히드록실라제(prolyl hydroxylase) 저해용 조성물을 제공한다.

허혈성 질환, 암, 퇴행성 뇌질환, 염증, 또는 이들의 조합의 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

허혈성 질환, 암, 퇴행성 뇌질환, 염증, 또는 이들의 조합의 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

일 양상은 아연의 배위 착염(coordination complex), 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체를 포함하는 프롤릴 히드록실라제(prolyl hydroxylase) 저해용 조성물을 제공한다.

상기 배위 착염(coordination complex)은 배위 결합에 의해 형성된 복합체를 말한다. 배위 착염은 주로 금속 원자인 중심 원자 또는 이온과 리간드로도 알려진 결합 분자 또는 이온들로 이루어진 화합물이다. 다양한 금속, 특히 전이 금속을 함유하는 화합물이 배위 착염일 수 있다.

상기 아연의 배위 착염은 아연을 중심 원자로 하고 배위 결합에 의해 주위의 분자 또는 이온과 결합하는 복합체일 수 있다. 상기 아연의 배위 착염은 피리치온-아연(bis(2-pyridylthio)zinc1,1'-dioxide; pyrithione-zinc 또는 zinc pyrithione) 일 수 있다. 피리치온-아연은 아연을 중심 원자로 하고, 피리치온의 산소 원자와 황 원자가 아연에 배위 결합된 화합물이다.

상기 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 화합물의 무기 및 유기산 부가염을 말한다. 산 부가염은 무기산류 또는 무독성 유기산으로부터 얻을 수 있다. 무기산류는 예를 들면, 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화 수소산, 아질산 및 아인산이다. 무독성 유기산은 예를 들면, 옥살산, 말레산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류이다. 이러한 약학적으로 무독한 염류는 예를 들면, 술페이트, 피로술페이트, 바이술페이트, 술파이트, 바이술파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부틸레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 숙시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말레이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸 벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시 벤조에이트, 메톡시 벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠 술포네이트, 톨루엔 술포네이트, 클로로벤젠 술포네이트, 크실렌 술포네이트, 페닐 아세테이트, 페닐 프로피오네이트, 페닐 부틸레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시 부틸레이트, 글리콜레이트, 타트레이트, 메탄 술포네이트, 프로판 술포네이트, 나프탈렌-1-술포네이트, 나프탈렌-2-술포네이트 또는 만델레이트일 수 있다.

상기 용어 "유도체(derivative)"는 상기 화합물의 구조 일부를 다른 원자나 원자단으로 치환하여 얻어지는 화합물을 말한다.

상기 프롤릴 히드록실라제(prolyl hydroxylase; PHD)는 프로콜라겐-프롤린 디옥시게나제(procollagen-proline dioxygenase)로도 불릴 수 있다. 프롤릴 히드록실라제는 2-옥소글루타레이트(oxoglutarate)-의존성 디옥시게나제 중 하나로서, 2-옥소글루타레이트, Fe² ⁺, 및 아스코르브산염(ascorbate)를 요구하는 메카니즘을 통해 유기 기질에 산소의 결합을 촉매하여 (2S, 4R)-4-히드록시프롤린을 형성한다. 프롤릴 히드록실라제는 PHD1, PHD2, 또는 PHD3일 수 있다. PHD2는 저산소 유도 인자 프롤릴 히드록실라제(Hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase 2; HIF-PH2) 또는 프롤릴 히드록실라제 도메인 함유 단백질2(prolyl hydroxylase domain-containing protein 2; PHD2)로도 불릴 수 있다. PHD2는 EGLN1 유전자에 의해 암호화될 수 있다. PHD2는 MYND 아연 손가락(zinc finger) 도메인에 상동성이 있는 N-말단 도메인과, 2-옥소글루타레이트 디옥시게나제에 상동성이 있는 C-말단 도메인으로 이루어진 효소이다. 정상 산소 상태에서 PHD2 또는 PHD3는 HIF1-α의 아미노산 서열 중 564번째 아미노산 잔기 및 402번째 아미노산 잔기인 프롤린을 수산화시켜 저산소 유도 인자 1-알파(Hypoxia-inducible factor 1-alpha; HIF1-α)을 유비퀴틴-프로테아좀 관련 분해 경로를 통해 분해시킬 수 있다.

용어 "저해용 조성물"은 용어 "저해제(inhibitor)"와 교환가능하고, 효소의 활성을 감소시키는 물질을 말한다. 저해용 조성물이 효소에 결합함으로써 효소가 기질(substrate) 또는 표적(target) 물질에 결합하는 것을 막아 효소의 활성을 감소시킬 수 있다. 저해용 조성물과 효소의 결합은 가역적 결합 또는 비가역적 결합일 수 있다.

다른 양상은 아연의 배위 착염, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체를 포함하는 허혈성 질환, 암, 퇴행성 뇌질환, 염증, 또는 이들의 조합의 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 아연의 배위 착염, 약학적으로 허용가능한 염, 및 유도체는 전술한 바와 같다.

상기 아연의 배위 착염, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체는 프롤릴 히드록실라제를 저해하여, 프롤릴 히드록실라제의 기질 단백질 또는 표적 단백질의 기능을 조절할 수 있다. 프롤릴 히드록실라제의 기질 단백질 또는 표적 단백질은 예를 들어 HIF1-α일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 허혈(ischemia)은 조직, 장기의 산소 요구에 대해 그 공급원인 혈류가 절대적 또는 상대적으로 부족한 상태를 말한다. 허혈성 질환은 허혈에 의해 야기된 질병을 말하고, 허혈성 질환은 예를 들어 관상동맥부전, 뇌부전, 혈관 부전, 또는 이들의 조합일 수 있다. 관상동맥부전은 예를 들어 심근 경색증 또는 협심증일 수 있다. 뇌부전은 예를 들어 허혈성 뇌졸중일 수 있다. 혈관 부전은 예를 들어 동맥부전증 또는 정맥부전증일 수 있다.

상기 암은 예를 들어 폐암, 위암, 대장암, 간암, 유방암, 두경부암, 식도암, 담도암, 췌장암, 부인암, 비뇨기암, 혈액암, 뇌종양, 골연부육종, 또는 피부암일 수 있다.

상기 퇴행성 뇌질환은 예를 들어 알츠하이머병, 파킨슨병, 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 용어 "예방(prevention)"은 조성물의 투여에 의해 질병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다. 상기 용어 "치료(treatment)"는 조성물의 투여에 의해 질병의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.

상기 약학적 조성물은 아연의 배위 착염, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체를 전체 조성물 총 중량에 대하여 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 또는 약 0.001 중량% 내지 약 1 중량%로 포함될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 경구 투여를 위한 제제 또는 비경구 투여를 위한 제제로 제형화될 수 있다.

상기 약학적 조성물에 있어서, 경구 투여를 위한 고형 제제는 예를 들면, 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제일 수 있다. 상기 고형 제제는 부형제를 더 포함할 수 있다. 부형제는 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 또는 젤라틴일 수 있다. 또한, 상기 고형 제제는 마그네슘 스테아레이트, 또는 탈크와 같은 윤활제를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물에 있어서, 경구를 위한 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 또는 시럽제일 수 있다. 상기 액상 제제는 물, 또는 리퀴드 파라핀을 포함할 수 있다. 상기 액상 제제는 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 또는 보존제를 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물에 있어서, 비경구 투여를 위한 제제는 예를 들면, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조, 좌제 또는 흡입제일 수 있다. 비수성용제 또는 현탁제는 식물성 기름 또는 에스테르를 포함할 수 있다. 식물성 기름은 예를 들면, 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 또는 올리브 오일일 수 있다. 에스테르는 예를 들면 에틸올레이트일 수 있다. 좌제의 기제는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 또는 글리세로젤라틴일 수 있다. 흡입제는 활성 화합물을 분말 또는 액상으로 하고, 흡입용 분사제 및/또는 담체 중에 배합하고, 그 혼합물을 적당한 기화기(vaporizer)에 충전함으로써 제조될 수 있다. 활성 화합물이 분말인 경우에는 통상의 기계적 분말 기화기를, 화합물이 액상의 경우에는 네뷸라이저 등의 기화기를 사용할 수도 있다. 또한 흡입제는 필요에 따라서 종래부터 사용되고 있는 계면활성제, 오일, 향료, 시클로덱스트린 또는 그의 유도체를 선택적으로 배합할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 담체, 부형제 및 희석제는 예를 들면, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 또는 광물유를 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 아연의 배위 착염, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체는 약 0.0001 mg/체중 kg 내지 약 100 mg/체중 kg, 또는 약 0.001 mg/체중 kg 내지 약 10 mg/체중 kg의 양을 1일에 1회, 1일에 수회, 또는 수일에 1회 투여할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 쥐, 마우스, 개, 소, 말, 및 인간을 포함한 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방법은 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 유효 성분 이외에 약학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 상기 약학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어 허용 가능한 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약학적 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제, 또는 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다.

다른 양상은 개체에 아연의 배위 착염, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체를 투여하는 단계를 포함하는, 허혈성 질환, 암, 퇴행성 뇌질환, 염증, 또는 이들의 조합의 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

상기 아연의 배위 착염, 약학적으로 허용가능한 염, 유도체, 허혈성 질환, 암, 퇴행성 뇌질환, 예방, 및 치료는 전술한 바와 같다.

상기 용어 "개체"는 쥐, 마우스, 개, 소, 말, 및 인간을 포함한 포유동물을 포함한다.

아연의 배위 착염, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체를 개체에 경구 또는 비경구로 1일에 1회, 1일에 수회, 또는 수일에 1회를 단위 용량으로 투여할 수 있다.

일 양상에 따른 아연의 배위 착염을 포함하는 프롤릴 히드록실라제 저해용 조성물 및 이의 용도에 의하면, 프롤릴 히드록실라제 예를 들어 프롤릴 히드록실라제 3을 선택적으로 저해하고, 프롤릴 히드록실라제의 표적 단백질의 기능을 조절하여 허혈성 질환, 암, 퇴행성 뇌질환, 염증, 또는 이들의 조합의 질병을 예방 또는 치료하는데 이용할 수 있다.

도 1은 화합물 라이브러리에 의한 PHD3의 저해율(%)을 나타내는 그래프이다.
도 2a 내지 도 2c는 각각 PHD2F, PHD2CT, 및 PHD3의 농도(nM 또는 μM))에 따른 형광 편광도를 나타내는 그래프이다.
도 3은 PHD2F, PHD2CT, 또는 PHD3의 존재 하에서 2-옥소글루타레이트(2OG)의 농도(μM)에 따른 형광 편광도를 나타내는 그래프이다.
도 4a 내지 도 4c는 각각 피리치온-아연의 농도(μM)에 따른 PHD2F, PHD2CT, 및 PHD3에 의한 형광 편광도를 나타내는 그래프이다.
도 5a 내지 도 5c는 각각 피리치온의 농도(μM)에 따른 PHD2F, PHD2CT, 및 PHD3에 의한 형광 편광도를 나타내는 그래프이다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 프롤릴 히드록실라제 3 저해제의 스크리닝

1.1 VBC 단백질의 준비

프롤릴 히드록실라제(prolyl hydroxylase; PHD) 3는 저산소 유도성 인자 1-알파(hypoxia inducible factor 1-alpha; HIF1-α)의 아미노산 서열 중 564번째 아미노산인 프롤린 잔기를 수산화시키는 효소이고, PHD 3에 의해 HIF1-α의 프롤린 잔기가 수산화되면, 수산화된 HIF1-α는 폰 히펠 린다우(von hippel-Lindau; VHL) 단백질과 결합하고, 그 후 HIF1-α는 유비퀴틴 시스템을 통해 단백질 가수분해된다. 따라서, PHD 3의 저해제를 스크리닝하기 위해, VHL 단백질, Elongin B 단백질, 및 Elogin C 단백질의 복합체(VBC 단백질)를 준비하였다.

구체적으로, 인간 VHL 단백질(GenBank Accession No: NP_000542.1)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(GenBank Accession No: NM_000551.3)에서 VHL 단백질의 54번째 내지 213번째 아미노산 서열에 상응하는 폴리뉴클레오티드 단편과, 인간 Elongin B 단백질(GenBank Accession No: NP_009039.1)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(GenBank Accession No: NM_007108.3)에서 Elongin B 단백질의 1번째 내지 118번째 아미노산 서열에 상응하는 폴리뉴클레오티드 단편을 pGEX-4T-1(GE Healthcare Life Sciences)에 삽입한 플라스미드 pGEX4T-VHL-EB를 준비하였다. 또한, 인간 Elogin C 단백질(GenBank Accession No: NP_005639.1)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(GenBank Accession No: NM005648.3)에서 Elogin C 단백질의 17번째 내지 112번째 아미노산 서열에 상응하는 폴리뉴클레오티드 단편을 pET29b(Novagen)에 삽입하여 플라스미드 pDEV-EC를 준비하였다. 준비된 pGEX4T-VHL-EB와 pET29b를 DNA를 받아들이기 쉬운 상태로 만들어진 형질 전환용 대장균 BL21(DE3)(Enzynomic)으로 형질 전환시켰다. 이 때 플라스미드와 BL21(DE3) 세포의 혼합액에 heat shock를 가하여 형질전환시켰다.

형질 전환된 세포를 100 ㎍/㎖의 암피실린(ampicillin)(Sigma-Aldrich)과 100 ㎍/㎖의 카나마이신(kanamycin)(Sigma-Aldrich)을 함유한 LB 배지(Sigma-Aldrich)에 접종하고, 파장 600 nm에서 흡광도가 0.6이 될 때까지 37℃에서 배양하였다. 배양액에 1 mM의 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)(Sigma-Aldrich)를 첨가한 후, 18℃에서 15시간 동안 인큐베이션시켜 형질전환시킨 단백질들의 발현을　유도하였다. 배양된 세포는 원심 분리하여 수득하고, 수득된 펠렛에 110 mM NaCl(Sigma-Aldrich), 1 mM DTT(Sigma-Aldrich), 0.2 mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)(Sigma-Aldrich), 및 1 ㎎/10 ㎖의 리소자임(lysozyme)(Sigma-Aldrich)을 함유한 10 mM 인산염 완충용액(phosphate based saline buffer; PBS)에 현탁한 후 4℃에서 소니케이션하여 대장균을 용해시켰다. 용해물에 1%(v/v) 트리톤 X-100(Triton X-100)(Sigma-Aldrich)을 첨가하고 잘 섞어준 다음, 반응액을 4℃에서 10분 동안 인큐베이션하고 4℃의 온도에서 10,000 rpm의 속도로 30분간 원심 분리하였다.

분리된 상층액을 글루타치온-세파로즈(glutathione-sepharose) 4B(GE Healthcare)와 혼합하고 4℃에서 2시간 동안 교반한 후 4℃에서 2,000 rpm의 속도로 5분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거한 후 상층액의 10배 부피의 인산염 완충용액(137 mM NaCl, 2.7 mM KC, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KHPO₄), 1M NaCl을 함유하는 인산염 완충용액, 및 50 mM Tris-pH8.0 용액을 이용하여 글루타치온-세파로즈 4B 수지에 결합하지 않은 단백질들을 제거하였다. 일회용 바이오스핀 크로마토그래피 컬럼(Bio-spin Disposable chromatography Columns)(Bio-Rad)에 상기 반응물을 첨가하고 10 ㎖의 50 mM Tris-pH8.0 용액으로 세척하였다. 그 다음, 10 mM 글루타치온(Glutathione)(GE healthcare)을 함유한 50 mM Tris-pH8.0 용액으로 용리시켜 GST-VBC 단백질을 수득하였다.

수득된 GST-VBC 단백질은 SDS-PAGE로 확인하였고, Bradford 단백질 분석법(Bio-Rad)을 이용하여 정량하였다.

1.2 프롤릴 히드록실라제(PHD)의 준비

PHD3를 선택적으로 저해하는 저해제를 스크리닝하기 위해, PHD3 단백질을 준비하였다. 비교군으로서 PHD2 전장 단백질과, PHD3와 구조가 유사하게 PHD2의 N-말단 도메인이 제거되고 촉매(Catalytic) 도메인인 C-말단 도메인만 갖는 PHD2 단백질을 준비하였다.

구체적으로, 인간 egl-9 family hypoxia-inducible factor 1 단백질(PHD2 단백질, GenBank Accession No: CAC42509.1)을 암호화는 폴리뉴클레오티드(GenBank Accession No: AJ310543.1)에서 PHD2 단백질의 1번째 내지 426번째 아미노산 서열(PHD2 전장 단백질; PHD2F)에 상응하는 폴리뉴클레오티드 단편, 또는 PHD2 단백질의 184번째 내지 426번째 아미노산 서열(C-말단 도메인만 갖는 PHD2 단백질; PHD2CT)에 상응하는 폴리뉴클레오티드 단편을 준비하였다. 준비된 폴리뉴클레오티드 단편을 pET21b(Novagen)에 삽입하여 플라스미드 pET21b-PHD2F 및 pET21b-PHD2CT를 준비하였다. 또한, 인간 egl-9 family hypoxia-inducible factor 3 단백질(PHD3 단백질, GenBank Accession No: CAC42511.1)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(GenBank Accession No: AJ310545.1)의 1번째 내지 225번째 아미노산 서열에 상응하는 폴리뉴클레오티드 단편을 pET22b(Novagen)에 삽입하여 플라스미드 pET22b-PHD3를 준비하였다. 준비된 플라스미드 pET21b-PHD2F, pET21b-PHD2CT, 및 pET22b-PHD3를 각각 DNA를 받아들이기 쉬운 상태로 만들어진 대장균 BL21(DE3)(Enzynomic)으로 형질 전환시켰다. 이 때 플라스미드와 BL21(DE3) 세포의 혼합액에 heat shock를 가하여 형질 전환시켰다.

형질 전환된 세포를 100 ㎍/㎖의 암피실린(ampicillin)(Sigma-Aldrich)을 함유한 LB 배지(Sigma-Aldrich)에 접종하고, 파장 600 nm에서 흡광도가 0.6이 될 때까지 37℃에서 배양하였다. 배양액에 1 mM의 IPTG(Sigma-Aldrich)를 첨가한 후, 18℃에서 15시간 동안 인큐베이션시켜 형질전환시킨 단백질들의 발현을　유도하였다. 배양된 세포는 원심 분리하여 수득하고, 수득된 펠렛에 0.014 mM 2-머캅토에탄올(Sigma-Aldrich), 0.2 mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)(Sigma-Aldrich), 및 1 ㎎/10㎖의 리소자임(lysozyme)(Sigma-Aldrich)을 함유한 세포 용해액(50 mM Na₂PO₄, 500 mM NaCl, 10 mM 이미다졸(Sigma-Aldrich)에 현탁한 후 4℃에서 소니케이션하여 용해물에 1%(v/v) 트리톤 X-100(Triton X-100)(Sigma-Aldrich)을 첨가하고 잘 섞어준 다음, 반응액을 4℃에서 10분 동안 인큐베이션하고 4℃의 온도에서 10,000 rpm의 속도로 30분간 원심 분리하였다.

분리된 상층액을 Ni-NTA 아가로스(Quiagen)와 혼합하고 4℃에서 1시간 동안 교반한 후 4℃에서 2,000 rpm의 속도로 5분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거한 후 상층액의 10배 부피의 세척 용액(50 mM Na₂PO₄, 500 mM NaCl, 20 mM 이미다졸)을 첨가하고 200 rpm에서 5분간 원심 분리하여 상층액을 제거하는 과정을 3회 반복하였다. 일회용 바이오스핀 크로마토그래피 컬럼(Bio-spin Disposable chromatography Columns)(Bio-Rad)에 상기 반응물을 첨가하고 10 ㎖의 세척 용액으로 세척하였다. 그 다음, 용리 용액(50 mM Na₂PO₄, 500 mM NaCl, 300 mM 이미다졸)을 사용하여 각각 PHD2F, PHD2CT, 및 PHD3 단백질을 수득하였다. 수득된 단백질은 SDS-PAGE로 확인하였고, Bradford 단백질 분석법(Bio-Rad)을 이용하여 정량하였다.

1.3 형광 표지된 HIF1 -α 폴리펩티드의 준비

형광 편광 기반 어세이를 이용한 PHD3의 활성을 저해하는 화합물을 스크리닝하기 위해, PHD에 의해 수산화되는 564번째 아미노산 잔기인 프롤린을 포함하고 VBC 단백질이 결합하는 HIF1-α의 556번째 내지 575번째 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 준비하고, 준비된 폴리펩티드의 N-말단에 아미노헥사노익 애시드 링커(aminohexanoic acid linker)(Sigma-Aldrich)를 사용하여 형광 프로브인 FITC(fluorescein isothiocyanate)(Invitrogen)를 결합시킨 폴리펩티드를 (주)펩트론(Korea)에 의뢰하여 합성하였다(F-p564). 또한, 양성 대조군으로 사용하기 위해 상기 F-P564 펩타이드의 564번째 프롤린이 수산화된 펩타이드(F-Hyp564)를 합성하였다.

1.4 저해제의 스크리닝

1,040종의 생물학적 활성을 가진 화합물들(NINDS Custom Collection Ⅱ, Microsource Discovery Systems)을 사용하여 PHD3의 활성을 저해하는 저해제를 스크리닝하였다.

최종 농도가 20 μM의 화합물에 실시예 1.2에서 준비한 0.2 내지 600 nM의 PHD3를 첨가하고 잘 혼합하였다. 그 후, 2 mM 아스코르브산(Sigma-Aldrich)과 1 mM 2-옥소글루타레이트(2-oxoglutarate)(Sigma-Aldrich), 및 완충용액(20 mM Tris-HCl, pH8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0.5%(v/v) NP-40(Sigma-Aldrich))을 첨가하였다. 실시예 1.3에서 준비한 최종 농도 1 μM의 F-P564 펩타이드를 첨가한 후 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션시켜 수산화를 유도하였다. 반응물에 실시예 1.1에서 준비한 250 nM의 VBC 단백질을 함유한 결합 용액(50 mM Tris, 120 mM NaCl, 0.5%(v/v) NP-40(Sigma-Aldrich))을 첨가하고, 실온에서 섞어준 후 96 웰 플레이트에 옮겨 VICTOR(Perkin-Elmer)를 이용하여 형광 편광도를 측정하였다.

각각의 화합물에 의한 형광 편광도를 측정하여 산출된PHD3의 저해율(%)을 도 1에 나타내었다. PHD3의 저해율(%)은 이미 프롤린이 수산화된 100 nM의 F-HyP564 폴리펩티드와 250 nM의 VBC 단백질의 결합 시 측정된 형광 편광도 값을 기준으로 하였을 때 화합물에 의해 감소된 PHD3의 활성을 백분율 퍼센트로 표시한 것이다. 처리한 화합물에 의한 PHD3의 활성이 약 60% 이상 저해되는 12종의 화합물을 확인하였고, 그 중 하나가 피리치온-아연(Pyrithione-Zn)이었다.

실시예 2. 피리치온 -아연에 의한 PHD 활성 저해의 확인

2.1 PHD 의 농도의 결정

피리치온-아연에 의한 PHD의 활성 저해 정도를 분석하는데 사용할 PHD의 농도를 결정하기 위해, 최종 농도 1 μM의 F-P564 단백질을 90% 수산화시키는데 필요한 PHD의 농도를 결정하였다.

PHD2CT와 PHD2F의 경우 20 μM의 2-옥소글루타레이트에 0 μM 내지 4.5 μM PHD을 첨가하고 잘 섞었다. 실시예 1.3에서 준비한 F-p564 폴리펩티드를 반응물에 완충용액(20 mM Tris-HCl, pH7.5, 5 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂)에 용해시켜 1 μM의 F-p564 폴리펩티드를 준비하였다. 반응물에 200 μM의 아스코르브산(Sigma-Aldrich)과 1 μM의 F-p564 폴리펩티드를 첨가한 다음, 30℃에서 2 시간 동안 인큐베이션시켜 F-p564 폴리펩티드의 수산화 반응을 유도하였다. PHD3의 경우 1 mM의 2-옥소글루타레이트에 0 μM 내지 4.5 μM의 PHD을 첨가하고 잘 섞었다. 실시예 1.3에서 준비한 F-p564 폴리펩티드를 반응물에 완충용액(20 mM Tris-HCl, pH7.5, 5 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂)에 용해시켜 1 μM의 F-p564 폴리펩티드를 준비하였다. 반응물에 2 mM의 아스코르브산(Sigma-Aldrich)과 1 μM의 F-p564 폴리펩티드를 첨가한 다음, 30℃에서 2 시간 동안 인큐베이션시켜 F-p564 폴리펩티드의 수산화 반응을 유도하였다. 각각의 반응물에 200 nM의 실시예 1.1에서 준비된 VBC 단백질을 포함하는 결합 용액을 첨가한 다음, 96-웰 플레이트로 옮겨 Appliskan(Thermo Scientific)을 사용하여 형광 편광도(fluorescence polarization)를 측정하고, PHD의 농도(0 내지 30 μM)에 따른 PHD2F, PHD2CT, 및 PHD3에 의한 형광 편광도를 각각 도 2a 내지 도 2c에 나타내었다.

도 2a 내지 도 2c에 나타난 바와 같이, 최종 농도 1 μM의 F-P564 폴리펩티드를 약 90% 수산화시키기 위해서는 약 400 nM의 PHD2F, 약 50 nM의 PHD2CT, 및 약 0.83 μM의 PHD3가 요구됨을 확인하였다.

2.2 PHD 활성에 필요한 2- 옥소글루타레이트 농도의 결정

PHD에 의한 HIF1-α의 프롤린 잔기의 수산화는 보조 인자인 2-옥소글루타레이트(2-oxoglutarate: 2OG)를 요구한다. 동일한 조건에서 실시예 1-4에서 스크리닝된 피리치온-아연이 실시예 1.2에서 준비한 여러 종류의 PHD에 대한 활성 억제 수준을 비교하기 위하여, PHD2F, PHD2CT, 및 PHD3 단백질 모두가 활성을 갖는데 필요한 2-옥소글루타레이트의 농도를 결정하였다.

최종 농도 0 μM 내지 1000 μM의 2-옥소글루타레이트(Sigma-Aldrich)와 실시예 2.1에서 1 μM의 기질 펩티드(F-P564)를 약 90% 수산화시키는 것으로 확인된 종도인 400 nM의 PHD2F 단백질, 50 nM의 PHD2CT 단백질, 또는 0.83 μM의 PHD3를 준비하고, 각각의 농도의 2-옥소글루타레이트에 준비된 PHD를 첨가하고 잘 섞었다.

실시예 1.3에서 준비한 F-p564 폴리펩티드를 반응물에 완충용액(20 mM Tris-HCl, pH7.5, 5 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂)에 용해시켜 1 μM의 F-p564 폴리펩티드를 준비하였다. 반응물에 200 μM의 아스코르브산(Sigma-Aldrich)과 1 μM의 F-p564 폴리펩티드를 첨가한 다음, 30℃에서 2 시간 동안 인큐베이션시켜 F-p564 폴리펩티드의 수산화 반응을 유도하였다. 반응물에 200 nM의 실시예 1.1에서 준비된 VBC 단백질을 포함하는 결합 용액을 첨가한 다음, 96-웰 플레이트로 옮겨 Appliskan(Thermo Scientific)을 사용하여 형광 편광도(fluorescence polarization)를 측정하고, 2-옥소글루타레이트의 농도에 따른 PHD2F, PHD2CT, 및 PHD3에 의한 형광 편광도를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 300 μM의 2-옥소글루타레이트의 존재 하에서 PHD2F, PHD2CT, 및 PHD3 단백질 모두 활성을 갖는다는 것을 확인하였다.

2.3 피리치온 -아연에 의한 PHD2F , PHD2CT , 또는 PHD3 활성 저해의 정량적 분석

피리치온-아연에 의한 PHD 활성 저해 정도를 정량적으로 분석하기 위해, 실시예 2.1에서 결정된 양의 PHD에 실시예 2.2에서 결정된 농도인 300 μM의 2-옥소글루타레이트를 첨가하고 잘 섞었다. 최종 농도 0 mM 내지 8 mM의 피리치온-아연의 존재 하에서 실시예 2.1과 동일한 방법 방법으로 F-p564 폴리펩티드의 수산화 반응을 유도한 후, 형광 편광도를 측정하고, 피리치온-아연의 농도에 따른 PHD2F, PHD2CT, 및 PHD3에 의한 형광 편광도를 도 4a 내지 도 4c에 나타내었다.

피리치온-아연의 농도에 따른 PHD2F, PHD2CT, 및 PHD3에 의한 형광 편광도로부터 PHD의 활성을 50% 저해하는 피리치온-아연의 농도를 SigmaPlot™ 프로그램(Systat Software Inc.)을 사용하여 산출하였다. 그 결과, PHD2F, PHD2CT, 및 PHD3에 대한 피리치온-아연의 50% 저해 농도(IC₅₀)는 각각 약 8300.77 μM, 약 1024.22 μM, 및 약 2.47 μM이었다. PHD2F 와 PHD2CT는 피리치온-아연에 의해 거의 저해되지 않았지만, PHD3의 IC₅₀ 값은 PHD2F의 IC₅₀ 값에 비해 약 3360배 낮았다. 따라서, 피리치온-아연이 PHD3에 대하여 선택적으로 저해함을 확인하였다.

2.4 피리치온에 의한 PHD3 활성 저해의 정량적 분석

피리치온-아연 중 피리치온이 PHD3를 선택적으로 저해하는 것인지 확인하기 위해, 아연이 없는 피리치온에 의한 PHD3의 활성 저해를 확인하였다.

최종 농도 0 mM 내지 1 mM의 피리치온(Sigma-Aldrich)의 존재 하에서, 실시예 2.1과 동일한 방법 방법으로 F-p564 폴리펩티드의 수산화 반응을 유도한 후, 형광 편광도를 측정하고, 피리치온의 농도에 따른 PHD2F, PHD2CT, 및 PHD3에 의한 형광 편광도를 도 5a 내지 도 5c에 나타내었다.

피리치온의 농도에 따른 PHD2F, PHD2CT, 및 PHD3에 의한 형광 편광도로부터 PHD의 활성을 50% 저해하는 피리치온의 농도를 SigmaPlot™ 프로그램(Systat Software Inc.)을 사용하여 산출하였다. 그 결과, PHD2F, PHD2CT, 및 PHD3에 대한 피리치온의 50% 저해 농도(IC₅₀)는 각각 약 590.99 μM, 약 318.98 μM, 및 약 20.36 μM이었다. PHD3에 대한 피리치온의 IC₅₀ 값은 PHD2F의 IC₅₀ 값에 비해 약 30배 낮았다. 또한, PHD3에 대한 피리치온의 IC₅₀ 값은 PHD3에 대한 피리치온-아연의 IC₅₀ 값에 비해 약 8 배 높았다. 따라서, 피리치온은 피리치온-아연에 비하여 PHD3 활성 억제에 대해 낮은 선택성을 갖는다는 것을 확인하였다.

Claims

아연의 배위 착염(coordination complex), 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체를 포함하는 프롤릴 히드록실라제(prolyl hydroxylase; PHD) 저해용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 아연의 배위 착염은 피리치온-아연(pyrithione-zinc)인 것인 프롤릴 히드록실라제 저해용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 프롤릴 히드록실라제는 프롤릴 히드록실라제 3(PHD3)인 것인 프롤릴 히드록실라제 저해용 조성물.
아연의 배위 착염, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체를 포함하는 허혈성 질환, 암, 퇴행성 뇌질환, 염증, 또는 이들의 조합의 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 4에 있어서, 상기 아연의 배위 착염은 피리치온-아연(pyrithione-zinc)인 것인 약학적 조성물.
청구항 4에 있어서, 상기 허혈성 질환은 관상동맥부전, 뇌부전, 혈관부전, 또는 이들의 조합인 것인 약학적 조성물.
청구항 4에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 또는 이들의 조합인 것인 약학적 조성물.
개체에 아연의 배위 착염, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그의 유도체를 투여하는 단계를 포함하는, 허혈성 질환, 암, 퇴행성 뇌질환, 염증, 또는 이들의 조합의 질병의 예방 또는 치료 방법.