KR20160003848A

KR20160003848A - 치료용 펩티드

Info

Publication number: KR20160003848A
Application number: KR1020157034300A
Authority: KR
Inventors: 스티븐 토마스 독; 앤드류 제임스 카펜터; 3세 로버트 네일 헌터; 유린 우; 베드 피. 스리바스타바
Original assignee: 글락소스미스클라인 인털렉츄얼 프로퍼티 디벨로프먼트 리미티드
Priority date: 2013-05-02
Filing date: 2014-04-30
Publication date: 2016-01-11
Also published as: US20160108098A1; BR112015027528A2; JP2016519130A; US9441023B2; SG11201508469YA; EP2992008B1; AU2014261111A1; TW201534616A; PE20151808A1; UY35548A; CL2015003199A1; MX2015015249A; WO2014178018A1; AU2014261111B2; RU2015144632A; CA2909045C; ES2732291T3; CA2909045A1; BR112015027528B1; HK1214829A1

Abstract

본 발명은 천연 인간 PYY에 비해 개선된 치료 프로파일을 갖는 PYY의 신규한 유사체에 관한 것이다. 이러한 신규한 PYY 유사체는 비만, 당뇨병, 및 다른 장애의 치료에 유용하다.

Description

치료용 펩티드{THERAPEUTIC PEPTIDES}

발명의 분야

본 발명은 비만 및 대사 장애의 치료에 유용한 치료용 펩티드에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 펩티드 YY (PYY)의 신규한 유사체 및 이들의 용도에 관한 것이다.

발명의 배경

미국에서 비만의 유병률이 증가하고 있으며, 2009-2010년에 성인의 35.7%는 비만으로 간주되고 (BMI ≥ 30) 68.8%는 과체중으로 간주되었다 (BMI ≥ 25). 예를 들어, 문헌[Flegal et al. (2012) JAMA 307(5):491-7]을 참조하라. 전세계적으로, 3억이 넘는 사람이 비만으로 간주된다. 타입 2 당뇨병, 고혈압, 심장병, 관절병을 포함하는 비만-관련 질환, 및 일부 유형의 암은 집단이 더 크게 성장함에 따라 유병률이 증가되었다.

식이요법 및 운동을 통한 비만의 예방은 이러한 경향을 제어하기 위해 매우 중요하지만, 일단 환자가 비만이 되면, 체중 감소에 대한 신체의 저항이 상당할 수 있다. 식이요법 및 운동만으로는 심각한 비만 환자에서 현저한 체중 변화를 초래하기에 불충분할 수 있고, 약물 요법 및 수술 둘 모두는 체중 감소에 대한 추가 보조기구로서 효과적인 것이 입증되었다. 비만의 예방 및 치료는 충족되지 않은 높은 의학적 요구의 분야이고, 오랜 체중 감소 요법에 현재 이용가능한 약물요법은 거의 없다.

펩티드 YY (PYY)는 식욕을 제어하는 역할을 하는, 췌장 폴리펩티드 및 신경펩티드 Y와 함께 펩티드의 PP-배 패밀리에 속한다. 예를 들어, 문헌[Schwartz et al. (2002) Nature: 418(6898):595-7]을 참조하라. PYY는 36개 아미노산, 직쇄 폴리펩티드로서 분비된 다음 디펩티딜 펩티다제 IV에 의해 절단되어 PYY(3-36)를 생성한다. 위 우회술 이후 병적으로 비만인 개체에서 PYY의 금식 및 식후 농도는 이들이 극적인 체중 감소에서 역할을 담당함을 제안한다. 예를 들어, 문헌[le Roux (2006) Ann Surg.243(1):108-14]을 참조하라. PYY(3-36)의 주변 주입은 비만 및 야윈 대상체에서 에너지 소모 및 지방 산화율을 증가시키는 것으로 나타났다. 예를 들어, 문헌[Batterham et al. (2003) N Engl J Med. 349(10):941-8, and Sloth et al. (2007) Am J Physiol Endocrinol Metab.: 293(2):E604-9]을 참조하라. PYY(3-36) 비내 스프레이의 투여는 비만 개체의 일일 칼로리 섭취량을 2713 kJ만큼 감소시켜, 6일의 연구 기간 동안 0.6 kg의 체중 감소를 발생시켰다. 예를 들어, 문헌[Gantz et al. (2007) J Clin Endocrinol Metab. 92(5):1754-7]을 참조하라. 이러한 결과는, 내성이 비만에서의 그 치료적 유용성을 제한하는 렙틴과 대조적으로, 비만 대상체가 PYY(3-36)에 대한 민감성을 보유함을 입증한다.

따라서, 비만 및 비만-관련 장애의 치료에 사용하기 위한 개선된 PYY 조성물에 대한 요구가 당 분야에 남아 있다.

발명의 간단 개요

간단히 말해, 한 양태에서, 본 발명은 하기 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 이의 염을 제공한다:

상기 서열에서,

Xaa₁은 Ala, His, 또는 Ser이고;

Xaa₂는 Glu 또는 Lys이고;

Xaa₃은 Pro 또는 Ala이고;

Xaa₄는 Leu 또는 Trp이고;

Xaa₅는 Asn, Ala, 또는 Thr이고;

Xaa₆은 Arg 또는 Lys이고;

Xaa₇은 Ser, Asp, 또는 Ala이고;

Xaa₈은 His 또는 Lys이고;

Xaa₉는 Leu 또는 Ile이고;

Xaa₁₀은 Val 또는 Leu이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 및 이의 염을 제공한다:

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

또한 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 포함한다.

추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 신규한 PYY 폴리펩티드 및 엑센딘-4을 포함하는 약학적 조합물을 제공한다.

또한 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 신규한 PYY 폴리펩티드 및 GLP-1을 포함하는 약학적 조합물을 제공한다.

추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 신규한 PYY 폴리펩티드 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

추가의 양태에서, 본 발명은 대사 장애 또는 비만의 치료가 필요한 대상체에 본 발명의 신규한 PYY 폴리펩티드 또는 약학적 조합물을 투여하는 것을 포함하는, 대사 장애 또는 비만을 치료하는 방법을 포함한다.

본 발명은 또한 비만의 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 폴리펩티드 또는 약학적 조합물의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 대사 장애 또는 비만의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드 또는 약학적 조합물을 제공한다.

도 1은 실시예 5 (유사체 # 5), PYY(3-36)NH₂ (PYY3-36), 및 엑센딘-4에서 단독으로 및 조합하여 보여진 식이요법-유도된 비만 (DIO) 롱 에반스(Long Evans) (LE) 래트의 체중에서의 변화에 대한 펩티드의 효과를 도시한다.
도 2는 실시예 5 (유사체 # 5), PYY(3-36)NH₂ (PYY3-36), 및 엑센딘-4에서 단독으로 및 조합하여 보여진 DIO LE 래트에서 신체 조성 변화에 대한 펩티드의 효과를 도시한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 천연 인간 PYY에 비해 개선된 치료 프로파일을 갖는 PYY의 신규한 유사체를 제공한다. 본 발명의 신규한 PYY 유사체는 천연 PYY 서열에 비해 음식 섭취에 개선된 효과를 나타낸다.

한 양태에서, 신규한 PYY 유사체는 하기 아미노산 서열 또는 이의 염을 포함한다:

상기 서열에서,

Xaa₁은 Ala, His, 또는 Ser이고;

Xaa₂는 Glu 또는 Lys이고;

Xaa₃은 Pro 또는 Ala이고;

Xaa₄는 Leu 또는 Trp이고;

Xaa₅는 Asn, Ala, 또는 Thr이고;

Xaa₆은 Arg 또는 Lys이고;

Xaa₇은 Ser, Asp, 또는 Ala이고;

Xaa₈은 His 또는 Lys이고;

Xaa₉는 Leu 또는 Ile이고;

Xaa₁₀은 Val 또는 Leu이다.

본 발명의 신규한 폴리펩티드는 인간 PYY(3-36)에 비해 야윈 및/또는 식이요법-유도된 비만 동물 모델에서 음식 섭취의 감소에서의 통계적으로 유의한 증가를 나타낸다. 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드는 야윈 및/또는 식이요법-유도된 비만 동물 모델에서 음식의 섭취를 적어도 20%, 적어도 30%, 또는 적어도 40%만큼 감소시킨다. 보다 바람직하게는, 폴리펩티드는 야윈 및/또는 식이요법-유도된 비만 동물 모델에서 음식의 섭취를 적어도 50%만큼 감소시킨다.

달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 폴리펩티드는 아미노산 사슬의 끝에 카르복스아미드 또는 카르복실산을 지닐 수 있다.

본 발명은 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 언급된 폴리펩티드의 염을 포함한다. 그러한 염의 예는 비제한적으로 예를 들어 무기 및 유기산 및 염기, 예를 들어 비제한적으로 황산, 시트르산, 말레산, 아세트산, 옥살산, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로아이오다이드, 니트레이트, 설페이트, 바이설파이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 이소니코티네이트, 아세테이트, 락테이트, 살리실레이트, 시트레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 올레에이트, 탄네이트, 판토테네이트, 바이타르트레이트, 아스코르베이트, 석시네이트, 말레에이트, 겐티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루카로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트 및 파모에이트 (즉, 1,1'-메틸렌-비스-(2-하이드록시-3-나프토에이트)) 염을 포함한다. 또한 유리 아미노기, 예컨대, 예를 들어, 염산, 인산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 옥살산, 및 타르타르산으로 형성된 염이 포함된다. 또한 유리 카르복시기, 예컨대, 예를 들어 소듐, 칼륨, 암모늄, 소듐, 리튬, 칼슘, 수산화제이철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 및 프로카인 염으로 형성될 수 있는 염이 포함된다.

본 발명의 폴리펩티드는 당 분야에 공지된 표준 재조합 발현 또는 화학적 펩티드 합성 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Chan, Weng C., and Peter D. White, eds. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. New York: Oxford UP, 2000, and Howl, John, ed. Peptide Synthesis and Applications (Methods in Molecular Biology). Totowa, NJ: Humana, 2005]을 참조하라.

본 발명의 조성물 및 약학적 조합물은, 예를 들어, 고혈당증(hyperglycemia), 내당능 장애(impaired glucose tolerance), 베타 세포 결핍(beta cell deficiency), 당뇨병 (타입 1 당뇨병, 타입 2 당뇨병, 및 임신성 당뇨병 포함), 비-알콜성 지방간 질환(non-alcoholic steatotic liver disease), 지방간(steatosis of the liver), 다낭성 난소 증후군(polycystic ovarian syndrome), 고지혈증(hyperlipidemia,) 및 대사 증후군(Metabolic Syndrome)을 포함하는 대사 장애의 치료에 유용하다. 조성물 및 약학적 조합물은 비만 또는 과식을 특징으로 하는 질환을 치료하고 식욕을 억제하는데 이용될 수 있다. 상기 방법은 대상체에 치료적 유효량의 본 발명의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체, 바람직하게는 인간 대상체에 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 조성물 및 조합물로 치료될 수 있는 다른 장애는 인슐린 내성(insulin resistance), 인슐린 결핍(insulin deficiency), 고인슐린혈증(hyperinsulinemia), 고혈당증, 이상지질혈증(dyslipidemia), 고지혈증, 고케톤혈증(hyperketonemia), 고글루카곤혈증(hyperglucagonemia), 췌장염(pancreatitis), 췌장 신생물(pancreatic neoplasms), 심혈관 질환(cardiovascular disease), 고혈압(hypertension), 관상 동맥 질환(coronary artery disease), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 신부전(renal failure), 신경병증(neuropathy)(예컨대, 자율 신경병증, 부교감신경 신경병증, 및 다발신경병증), 당뇨 망막병증, 백내장(cataracts), 내분비 장애(endocrine disorder), 및 수면 무호흡, 다낭성 난소 증후군, 유방, 결장, 전립선, 직장, 및 낮소의 신생물, 골관절염(osteoarthritis) 및 지방간을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 본 발명의 컨쥬게이트 또는 융합체를 이용하여 환자에서 인슐린 반응성을 조절하는 방법, 뿐만 아니라 세포에 의한 글루코스 흡수를 증가시키는 방법, 및 세포의 인슐린 민감성을 조절하는 방법을 추가로 포함한다. 또한 본 발명의 조성물을 환자에 투여하는 것을 포함하는, 예컨대 적어도 1회 용량의 조성물, 예컨대 본 발명의 약학적 조성물 또는 약학적 조합물을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 인슐린 합성 및 방출을 자극하거나, 인슐린 흡수로의 지방, 근육 또는 간 조직 민감성을 향상시키거나, 글루코스 흡수를 자극하거나, 분해 공정을 느리게 하거나, 위 배출을 둔화시키거나, 위산 분비를 억제하거나, 췌장 효소 분비를 억제하거나, 식욕을 감소시키거나, 음식 섭취를 억제하거나, 에너지 소비를 변화시키거나, 글루카곤의 분비를 차단하는 방법이 제공된다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 것들과 같은 대사 질환의 치료를 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 조성물의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 임의의 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 폴리펩티드 및 이의 염은 상기 언급된 질환의 치료를 위해 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여 ("약학적 조합물") 이용될 수 있다. 일부 구체에에서, 본 발명의 폴리펩티드 및 추가의 치료제 또는 치료제들은 함께 투여되는 한편, 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드 및 추가의 치료제 또는 치료제들은 별도로 투여된다. 별도로 투여되는 경우, 투여는 동시에 또는 임의의 순서로, 순차적으로 발생할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드(들) 및 다른 치료제(들)의 양 및 상대적인 투여 시점은 요망되는 조합된 치료 효과를 달성하기 위해 선택될 것이다. 본 발명의 화합물을 다른 치료제와 조합시킨 투여는 (1) 둘 모두의 치료제를 포함하는 단일 약학적 조성물; 또는 (2) 각각이 치료제들 중 하나를 포함하는 분리된 약학적 조성물의 동시적 투여에 의한 조합일 수 있다. 대안적으로, 조합물은 순차적인 방식으로 별도로 투여될 수 있고, 이 때 한 치료제가 먼저 투여되고 다른 두 번째 치료제가 투여되거나 그 반대이다. 이러한 순차적인 투여는 시간적으로 가깝거나 시간적으로 떨어져 있을 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명의 약학적 조합물은 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 엑센딘-4 펩티드 (예를 들어, 미국특허 5,424,286호를 참조하라) 또는 이의 단편 또는 유사체를 포함한다. 본 발명에 유용한 엑센딘-4 (Ex -4) 및 이의 유사체는 Byetta® 및 Bydureon® (엑세나티드(exenatide)), Victoza® (리라글루티드(liraglutide)), 릭시세나티드(lixisenatide), LY2189265 (둘라글루티드(dulaglutide)), PF-4856883, ZYD-1, 및 HM11260C (LAPS 엑센딘) 뿐만 아니라 PCT 특허 공개 WO 99/25728호 (Beeley et al.), WO 99/25727호 (Beeley et al.), WO 98/05351호 (Young et al.), WO 99/40788호 (Young et al.), WO 99/07404호 (Beeley et al.), 및 WO 99/43708호 (Knudsen et al.)에 기재된 것들을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 약학적 조합물은 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 GLP-1 (예를 들어, 문헌[Gutniak, M., et al. (1992) N. Engl. J. Bled. 326:1316-22]을 참조하라), 또는 이의 단편 또는 유사체, 예를 들어, GLP-1(7-37), GLP-1(7-36), GLP-1(7-35), GLP-1(7-38), GLP-1(7-39), GLP-1(7-40), GLP-1(7-41)을 포함한다.

추가의 GLP-1 유사체는 GLP-1(7-36) 및 이의 기능적 유도체를 포함하고 GLP-1(1-36) 또는 GLP-1(1-37)의 인슐린자극 활성을 초과하는 인슐린자극 활성을 갖는 펩티드 단편 및 인슐린자극제로서의 이의 용도에 관한 국제특허출원 90/11299호에 기재되어 있다 (특히 본 발명에 사용하기 위한 약물의 예로서, 본원에 참조로서 포함됨).

국제특허출원 WO 91/11457호 (Buckley et al.)는 본 발명에 따른 GLP-1 약물로서 또한 유용할 수 있는 활성 GLP-1 펩티드 GLP-1(7-34), GLP-1(7-35), GLP-1(7-36), 및 GLP-1(7-37)의 유사체를 기재한다 (특히 본 발명에 사용하기 위한 약물 또는 작용제의 예로서, 본원에 참조로서 포함됨).

본 발명의 약학적 조합물은 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 알비글루티드(albiglutide)를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 약학적 조합물은 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 DPP-IV 억제제와 같은 GLP-1 작용의 인핸서 (예컨대, 시타글립틴(sitagliptin) 및/또는 삭사글립틴(saxagliptin))를 포함한다.

다른 구체예에서, 약학적 조합물은 본 발명의 PYY 유사체 및 GLP-1 분비의 직간접적인 자극제인 하나 이상의 치료제, 예컨대 메트포르민(metformin), 담즙산 교환수지(bile acid sequestrant)(예컨대, 콜레스티폴(colestipol), 콜레스트리라민(cholestryramine), 및/또는 콜레세벨람(colesevelam)), 회장 담즙산 수송 (iBAT) 억제제 (예컨대, ALBI-3309, AZD-7806, S-8921, SAR-58304, 또는 US20130029938호에 기재된 것들), 및 SGLT-1 억제제 (예컨대, DSP-3235 및/또는 LX-4211)을 포함한다.

본 발명은 "치료적 유효량"의 본 발명의 폴리펩티드가 그러한 치료가 필요한 대상체에 투여되는 치료 방법을 제공한다. 용어 "치료적 유효량"은 그러한 용량을 수용하지 않은 상응하는 대상체에 비해, 질환, 장애, 또는 부작용의 개선된 치료, 치유 또는 개선, 또는 질환 또는 장애의 진행 속도의 감소를 발생시키는 임의의 양을 의미한다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 치료제의 유효량은 환자의 연령 및 중량, 환자의 신체 상태, 혈당 수준, 획득된 중량 수준 및 다른 요인을 포함하는 다수의 요인에 따라 달라질 것이다.

한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드의 치료적 유효량은 대상체의 식욕을 요망되는 정도로 억제하는데 필요한 양이다. 화합물의 효과적인 일일 식욕-억제 용량은 70 kg의 환자에 대해, 단일 또는 분할된 용량으로 투여되는, 전형적으로 약 0.01 μg 내지 약 500 μg /일, 바람직하게는 약 0.05 μg 내지 약 100 μg/일 및 더욱 바람직하게는 약 1 μg 내지 약 50 μg /일, 가장 바람직하게는 약 5 μg 내지 약 25 μg/일의 범위일 것이다.

한 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 및 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물 및 약학적 조합물은 정맥내, 복강내, 피하 및 근내, 경구, 국소, 경점막, 또는 폐 흡입을 포함하는 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 비경구 (정맥내, 근내 및 피하 포함), 비내 또는 경구 투여에 적합한 제형의 형태로 제공될 수 있다.

다양한 투여 경로를 위한 폴리펩티드의 제형화 및 전달 방법은 당 분야에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Swain et al. (2013) Recent Pat. Biotechnol. 1 Feb 2013 Epub ahead of print, Hovgaard, Lars, Sven Froklaer, and Marco Van De Weert, eds. Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. 2^nd ed. Boca Raton: CRC Press, 2012, and Van Der Walle, Chris, ed. Peptide and Protein Delivery. London: Academic, 2011]을 참조하라.

한 구체예에서, 본 발명은 서방성 제형을 포함한다. 그러한 제형은 치료적 유효량의 치료용 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들이 피하 공간으로의 주입 또는 잔달 후 몇 시간 또는 며칠 동안 혈류에 전달되도록 한다.

본 발명의 서방성 제형은 치료용 폴리펩티드의 방출을 지연시키는데 유용한 하나 이상의 중합체를 포함할 수 있다. 그러한 중합체의 비제한적인 예는 폴리(락트산-코-글리콜산) PLGA, 폴리카프로락톤, 폴리디옥사논, 폴리트리메틸렌 카르보네이트, 폴리안하이드라이드, PEG-PLGA, 폴리글루탐산, 폴리에틸렌 글리콜 터프탈레이트/폴리부틸렌 터프탈레이트/폴리부틸렌 터프탈레이트, 폴리(아미노산)-Leu/Glu 공중합체, 폴리티로신 카르보네이트, 폴리에스테라미드, 폴리(알파 아미노산) 기반 중합성 마이셀, 폴리하이드록시프로필메타크릴아미드, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 콜라겐, 히알루론산, 알부민, 카르복시메틸셀룰로스, 플렉시머(fleximer), 키토산, 말토덱스트린, 덱스트란, 또는 덱스트란 설페이트를 포함한다.

한 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 장기 연속적 또는 간헐적 약물 주입을 제공하도록 설계된 이식가능한 주입 펌프와 같은 소형 장치를 통해 전달될 수 있다. 그러한 장치는 본 발명의 치료용 폴리펩티드를 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내, 경막내, 경막외 또는 뇌실내 경로를 통해 투여하는데 이용될 수 있다. 상기 장치는 침식성, 비-침식성 및/또는 내구성일 수 있다. 그러한 장치의 비제한적인 예는 Durasert™ 장치 (pSivida), DUROS® 삼투 전달 시스템 (Intarcia Therapeutics), MedLaunch™ Polymer Technology (Endo Health)를 포함한다.

본 발명에 따라 이용될 수 있는 다른 장치는 SnychroMed® 펌프 (Medtronic), 및 Codman® 3000 주입 펌프 (Johnson & Johnson), V-Go® 전달 시스템 (Valeritas), OmniPod® 펌프 (Insulet), 및 JewelPump™ (Debiotech)를 포함한다.

본 발명의 폴리펩티드는 동일계내(in situ) 겔 제형으로 투여될 수 있다. 그러한 제형은 전형적으로 수혼화성 유기 용매의 소실에 의해 또는 매트릭스에 존재하는 소수성 도메인의 응집에 의해 겔을 형성하는 액체로서 투여된다. 비제한적인 예는 FLUID CRYSTAL technology (Camurus) 및 SABER technology (Durect), 및 미국특허 일련 번호 5612051, 5714159, 6413539, 6004573, 및 6117949에 개시된 제형을 포함한다.

본 발명의 치료용 폴리펩티드는 또한 피하 주사에 적합한 미소구체-기반 약학적 제형으로 캡슐화될 수 있다. 펩티드의 전달을 위한 미소구체-기반 제형의 비제한적인 예는 Chroniject™ (Oakwood Labs), Medusa® (Flamel's), Q-Sphera (Q-CHIP), 뿐만 아니라 미국특허 일련 번호 4675189, 6669961, 및 문헌[Amin et al. (2001) J of Controlled Release 73: 49-57]에 기재된 것들을 포함한다.

제형은 항균제 또는 항진균제, 예컨대 메타-크레솔, 벤질 알콜, 파라벤 (메틸, 프로필, 부틸), 클로로부탄올, 페놀, 페닐수은염, 예컨대 아세테이트, 보레이트, 또는 니트레이트, 또는 소르브산을 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 저장을 위해 동결건조되고 사용 전에 적합한 담체에서 재구성될 수 있다. 임의의 적합한 동결건조 방법 (예컨대, 분무 건조, 케익 건조) 및/또는 재구성 기법이 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명은 본원에 기재된 동결건조된 (냉동 건조된) 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다.

특정 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 및 그러한 핵산을 함유하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 예컨대 프로모터와 같은 하나의 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결된 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함한다.

본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 또는 재조합 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포가 또한 포함된다. 본 발명에 따른 적합한 숙주 세포는 원핵생물 숙주 세포 및 진핵생물 숙주 세포 둘 모두를 포함한다. 가능한 숙주 세포는, 비제한적으로, 포유동물 숙주 세포, 박테리아 숙주 세포 (예컨대, E. 콜리(E. coli), 효모 숙주 세포, 및 식물 숙주 세포를 포함한다.

본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 및 재조합 발현 벡터는 선택된 숙주 세포에 적절한 임의의 방법, 예컨대 형질전환, 트랜스펙션, 일렉트로포레이션, 또는 감염을 이용하여 적합한 숙주 세포에 도입되어 재조합 숙주 세포를 생성할 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 또는 재조합 발현 벡터는 숙주 세포 유전체에 통합된다. 생성된 재조합 숙주 세포는 발현에 적합한 조건하에 유지될 수 있어 (예컨대, 인듀서의 존재 하에, 적합한 동물에서, 적절한 염, 성장 인자, 항생제, 영양 보충물 등이 보충된 적합한 배양 배지에서), 이에 의해 인코딩된 폴리펩티드가 생성된다. 요망되는 경우, 인코딩된 펩티드 또는 폴리펩티드는 분리되거나 회수될 수 있다.

본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 생성하는 방법을 추가로 제공하고, 여기서 상기 방법은 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 또는 재조합 발현 벡터를 포함하는 상기 기재된 것들과 같은 숙주 세포를 상기 핵산 또는 재조합 발현 벡터의 발현에 적합한 조건 하에 유지시키는 것을 포함한다. 숙주 세포에서 폴리펩티드의 재조합 발현을 위한 방법은 당 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Rosalyn M. Bill, ed. Recombinant Protein Production in Yeast: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 866), Humana Press 2012; James L. Hartley, ed. Protein Expression in Mammalian Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press 2012, Loic Faye and Veronique Gomord, eds. Recombinant Proteins From Plants: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press 2008; and Argelia Lorence, ed. Recombinant Gene Expression (Methods in Molecular Biology), Humana press 2011]을 참조하라.

특정 구체예에서, 본 발명의 핵산은 "분리된다". 본원에서 "분리된" 것으로 언급된 핵산은 이의 원래 환경 (예컨대, 세포에서 또는 라이브러리와 같은 핵산의 혼합물에서)에서 다른 물질 (예컨대, 유전체 DNA, cDNA 및/또는 RNA와 같은 다른 핵산)로부터 분리된 핵산이다. 분리된 핵산은 재조합 발현 벡터의 일부로서 분리될 수 있다.

하기 실시예는 예시로만 제공되며 어떠한 식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.

실시예

하기 실시예는 다음 약어를 이용한다:

amu 원자 질량 단위

Fmoc 9-플루오레닐메톡시카르보닐

HBTU 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸 우로늄 헥사플루오로포스페이트

HCTU 2-(6-클로로-1-H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 헥사플루오로포스페이트

DMF N,N-디메틸포름아미드

NMM N-메틸모르폴린

DIPEA N,N-디이소프로필에틸아민

TFA 트리플루오로아세트산

Trt 트리틸

t-Bu 3차-부틸

Boc 3차-부틸카르보닐

Pbf 2,2,4,6,7-펜타메틸디하이드로-벤조푸란-5-설포닐

MAL 말레이미드

PBS 포스페이트 완충된 염수

ivDde 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소사이클로헥실리덴)-3-메틸부틸

MALDI 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화

BMPS N-β-말레이미도프로필옥시석신이미드 에스테르

DODT 2,2'-(에틸렌디옥시)디에탄티올

TIPS 트리이소프로필실란

MPA 메르캅토프로피온산

rt 체류 시간

RPM 분당 회전수

펩티드 합성

하기 실시예에 제시된 펩티드는 자동 펩티드 합성기 (model Prelude or Overture; Protein Technologies, Tucson, AZ) 상에서, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 및 염기로서 N-메틸모르폴린 (NMM), Fmoc 탈보호를 위한 20% 피페리딘/DMF에서 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸 우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU)에 의한 Fmoc 전략 또는 2-(6-클로로-1-H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 헥사플루오로포스페이트 (HCTU) 활성화 (5배 몰 과량)를 이용한 고체상 방법에 의해 합성되었다. 수지는 20 - 400 μmol 규모로 0.29 - 0.38 mmol/g의 부하량을 갖는 Rink Amide MBHA LL (Novabiochem) 또는 Rink Amide AM LL (Novabiochem)였다. 이용된 측쇄 보호기는 Asn, Gln, Cys 및 His에 대해 Trt; Ser, Thr, 및 Tyr에 대해 t-Bu; Lys 및 Trp에 대해 Boc; Asp 및 Glu에 대해 Ot-Bu; 및 Arg에 대해 Pbf였다. 펩티드-수지의 절단은 트리플루오로아세트산 (TFA):아니솔:물:트리이소프로필실란 (88:5:5:2)의 혼합물로 달성되었다. 미정제 펩티드를 찬 디에틸 에테르에 침전시키고, 디에틸 에테르를 디캔팅하고, 고형물을 다시 찬 디에틸 에테르로 분쇄하였다. 그 후 미정제 고형물을 30 mL/min의 유량, λ-215 nm에서 30-45분에 걸쳐 0.1% TFA와 함께 5-75% 아세토니트릴/물의 범위 내의 구배를 이용하여, Waters XBridge™ BEH 130, C18, 10 μm, 130Å, 30 X 250 mm ID 컬럼 상에서 역상 HPLC에 의해 정제하였다.

LC/MS 조건

방법 A: 0.5 mL/min의 유량, λ-215 nm, 280 nm로 30분 동안 0.05% TFA와 함께 5-65% 아세토니트릴/물을 이용하여, Phenomenex UPLC Aeris™ 펩티드 XB C18 컬럼, 1.7 μm, 2.1 X 100 mm 또는 ACQUITY BEH300 또는 BEH130 C18 컬럼, 1.77 μm, 2.1 X 100 mm을 이용하여 수행하였다.

C18 HPLC 조건:

방법 A: 1.5 mL/min의 유량, 40℃, λ-215 nm, 280 nm로 15분 동안 0.1% TFA와 함께 5-70% 아세토니트릴/물을 이용하여, Waters XBridge™ BEH130 C18 컬럼, 5 μm, 4.6 X 250 mm를 이용하여 수행하였다.

방법 B: 1.5 mL/min의 유량, λ-215 nm, 280 nm로 20분 동안 0.1% TFA와 함께 Waters XBridge™ BEH130 C18 컬럼, 5 μm, 4.6 X 250 mm, 5-75% 아세토니트릴/물을 이용하여 수행하였다.

방법 C: 1.0 mL/min의 유량, 60℃, λ-215 nm, 280 nm로 15분 동안 0.1% TFA와 함께 Waters XBridge™ BEH130 C18 컬럼, 5 μm, 4.6 X 250 mm, 20-37.5% 아세토니트릴/물을 이용하여 수행하였다.

방법 D: 1.5 mL/min의 유량, λ-215 nm, 280 nm로 15분 동안 0.1% TFA와 함께 Waters XBridge™ BEH300 C18 컬럼, 5 μm, 4.6 X 250 mm, 5-70% 아세토니트릴/물을 이용하여 수행하였다.

실시예 1. PKPEAPGKDASPEELNRYYASLRHYLNWVTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:3)

실시예 1은 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 35 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1369 amu 및 (M+4)/4 - 1027 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4105 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (25 mg, 8개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 8.90 min)에 의해 확인되었다.

실시예 2. PKPEAPGKDASPEELNRYYASLRKYLNWLTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:4)

실시예 2는 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 35 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1371 amu 및 (M+4)/4 - 1028 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4111 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (20 mg, 8개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 9.46 min)에 의해 확인되었다.

실시예 3. PKPEAPGKDASPEELNRYYASLRHYLNWLTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:5)

실시예 3은 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 35 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1374 amu 및 (M+4)/4 - 1031 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4120 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (16 mg, 8개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 9.42 min)에 의해 확인되었다.

실시예 4. PKPEAPGKDASPEEWNRYYADLRKYLNWLTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:6)

실시예 4는 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 35 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1405 amu 및 (M+4)/4 - 1054 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4212 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (18 mg, 8개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 9.54 min)에 의해 확인되었다.

실시예 5. PKPEAPGKDASPEEWNRYYADLRHYLNWLTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:7)

실시예 5는 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 6X50 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1407 amu 및 (M+4)/4 - 1056 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4221 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (180 mg, 8개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 9.27 min) 에 의해 확인되었다.

대안적으로, 실시예 5는 15℃로 냉각된 250 mL의 자켓 반응기를 이용한 수동 합성을 통해 제조되었다. Rink Amide AM Resin LL (100-200 메시, 13.8 g, 0.29 mmol/g 부하량)를 각각 질소 살포와 함께 DMF (50 mL)로 10분간 3회 팽창시켰다. Fmoc 기를 질소 살포와 함께 5분 동안 DMF (200 mL)에서 20% 피페리딘으로 제거한 다음, 질소 살포와 함께 12분 동안 DMF (200 mL)에서 20% 피페리딘으로 제거하였다. 그 후 수지를 DMF (100 mL)로 세척한 다음 질소 살포와 함께 1분 동안 DMF (100 mL)로 2회 세척하였다. Fmoc 탈보호 및 DMF 세척 후에, 제 1 아미노산 (100 mL, DMF 중 200 mM 용액)을 첨가한 다음 DIPEA 용액을 첨가하였다 (50 mL, DMF 중 800 mM 용액). DMF 중 HCTU의 용액 (50 mL, 400 mM)을 연동 펌프를 통해 12분의 기간 동안 첨가하였다. 최소 15분 후에, 수지의 분취량에 대해 Kaiser 시험을 수행하여 완전한 반응을 보장하였다. 그 후 수지를 DMF (100 mL)에 이어 질소 살포와 함께 1분 동안 DMF (100 mL)로 2회 세척하였다. 이러한 순서 (20% 피페리딘/DMF로 Fmoc 탈보호; 세척; 아미노산 커플링; Kaiser 시험; 세척)를 위치 24에 있는 히스티딘을 제외한, 펩티드의 나머지 서열에 대해 수행하였다. 아미노산 (His) 및 DIPEA 용액을 약 ~10℃로 냉각시키고 반응기에 첨가하였다. 반응기의 냉각기를 5℃로 설정하고 반응 혼합물을 ~15분 동안 6.3℃로 냉각하였다. DMF (50 mL) 중 HCTU의 냉각된 (~10℃) 용액을 연동 펌프를 통해 2 mL/min으로 25분 기간 동안 적가하였고, 그 기간 동안 용액은 7.8℃로 가온되었다. 15분 후에, Kaiser 시험은 완전한 반응을 나타내었다. 남아 있는 아미노산을 표준 프로토콜을 이용하여 커플링시켰다. 합성의 완료시에 (프롤린 1이 커플링되었다), 이어서 수지를 질소 살포와 함께 1분 동안 DMF (100 mL)로 2회 세척한 다음, 질소 살포와 함께 5분 동안 DCM (200 mL)으로 3회 세척한 후, 마지막으로 질소 살포와 함께 5분 동안 메탄올 (200 mL)로 3회 세척하였다. 수지를 질소 살포로 30분 동안 건조시켜 37.5 g의 건조 수지를 수득하였다. 수지를 부분들로 절단하였다. 10 그램의 수지를 질소 살포와 함께 45분 동안 120 mL DMF로 팽창시켰다. DMF를 배수시키고 최종 N-말단 Fmoc를 질소 살포와 함께 5분 동안 DMF (150 mL) 중 20% 피페리딘으로 제거한 다음, 질소 살포와 함께 12분 동안 DMF (150 mL) 중 20% 피페리딘으로 제거하였다. 이어서 수지를 DMF (100 mL)로 세척한 다음, 질소 살포와 함께 1분 동안 DMF (100 mL)로 2회 세척하고, 이어서 질소 살포와 함께 5분 동안 DCM (120 mL)으로 3회 세척한 후, 마지막으로 질소 살포와 함께 5분 동안 메탄올 (120 mL)로 3회 세척하였다. 수지를 질소 살포로 30분 동안 건조시켰다. 수지로부터 펩티드의 절단이 100 - 120 mL의 절단 칵테일:TFA:페놀:DODT:물:TIPS (90:2.5:2.5:2.5:2.5)를 이용하여 2.5 내지 3시간 동안 수행되었다. 여과액을 용기로 분할하고, 찬 디에틸 에테르로 처리하였다. 용기를 10분 동안 3000 RPM에서 원심분리시키고 상청액을 부어 버렸다. 물질을 다시 찬 디에틸 에테르로 처리하고, 진탕시킨 다음, 추가 10분 동안 3000 RPM에서 원심분리시켰다. 상청액을 다시 부어 버렸다. 용기로부터의 고형물을 0.1% 수성 TFA를 이용하여 합치고 동결건조시켜 배치 1을 수득하였다. 수지를 동일한 절차를 이용하여 두 번째 절단시켜 배치 2를 수득하였다. 이러한 공정 (Fmoc 탈보호; 세척; 수지로부터의 절단, 분쇄/재현탁, 및 동결건조)은 ~9 g의 수지를 이용하여 3회 반복되어 동결건조 후 총 ~11 g의 미정제 펩티드가 수득되었다. 이러한 물질을 0.1%의 수성 TFA에 용해시켜 75 mg/mL의 대략적인 농도를 수득하였고 물질을 역상 HPLC에 의해 여러 회 주입을 이용하여 (각각 2 내지 3 mL) 하기 단계 구배: 75분에 걸쳐 0.1% TFA와 함께 5-41.25% 아세토니트릴/물; XBridge™ Prep C18, 50 x 250 mm, 10 μm, 유량 50 mL/min을 이용하여 정제하였다. >93% 순도 (HPLC 방법 C)를 갖는 생성물을 함유하는 분획을 합쳤다. 불순 분획 (~88-93%의 순도)도 모아서 정제 조건에 다시 적용시켰다. 그 후 모든 순수한 분획 (>93%)을 합치고, 냉동-건조시켜 요망되는 펩티드를 백색 고형물로서 수득하였다. > 93%의 순도는 분리된 펩티드 (2.8g, 8개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대해 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 C, rt = 14.12 min)에 의해 확인되었다.

펩티드 합성기 및 수동 합성에 의해 제조된 실시예 5를 이용한 TFA에서 HOAc로의 염 교환은 2 x 60 mL Agilent StratoSpheres™ PL-HCO3 MP SPE 컬럼을 이용하여 수행되었다. 컬럼은, 먼저 50 mL의 MeOH로 처리된 다음 50 mL의 DI 수로 처리됨에 의해 평형화되었다. 그 후 컬럼을 2 x 50 mL의 1 N HOAc에 이어 2 x 50 mL의 0.1 N HOAc로 처리하고, 여과액을 모니터하여 pH ~ 3 (pH 페이퍼)을 보장하였다. 0.1 N HOAc 중 실시예 5의 용액 (상기 기재된 대로 제조된 2.8 g 및 이전에 제조된 배치로부터 유래된 0.7 g을 포함하는 ~3.5 g)을 SPE 컬럼들에 동등하게 분할한 다음 5 x 50 mL의 0.1 N HOAc로 용리시켰다. 그 후 컬럼을 5 x 50 mL의 MeOH로 세척하였다. 생성물을 함유하는 메탄올 분획 (HPLC에 의해 확인됨, 방법 C)을 회전 증발기를 통해 ~40 mL로 농축시키고, 이를 0.1 N HOAc 세척액에 첨가하였다. 용액을 3일에 걸쳐 동결-건조시켜 요망되는 분리된 펩티드를 백색 고형물로서 수득하였다. > 95%의 순도는 분리된 펩티드 (2.95g, 8개 아세트산 염으로서)에 대해 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 C, rt = 14.14 min)에 의해 확인되었다.

실시예 6. PKPEAPGKDASPEEWNRYYASLRKYLNWLTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:8)

실시예 6은 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 35 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1395 amu 및 (M+4)/4 - 1047 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4184 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (18 mg, 8개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 9.45 min) 에 의해 확인되었다.

실시예 7. PKPEAPGKDASPEEWNRYYASLRHYLNWLTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:9)

실시예 7은 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 35 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1398 amu 및 (M+4)/4 - 1049 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4193 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (27 mg, 8개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 9.47 min) 에 의해 확인되었다.

실시예 8. PKPEAPGKDASPEEWNRYYADLRKYLNWVTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:10)

실시예 8은 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 35 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1400 amu 및 (M+4)/4 - 1050 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4198 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (21 mg, 8개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 9.35 min) 에 의해 확인되었다.

실시예 9. PKPEAPGKDASPEEWNRYYADLRHYLNWVTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:11)

실시예 9는 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 35 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1403 amu 및 (M+4)/4 - 1052 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4207 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (22 mg, 8개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 9.36 min) 에 의해 확인되었다.

실시예 10. PKPEAPGKDASPEEWNRYYASLRKYLNWVTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:12)

실시예 10은 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 35 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1391 amu 및 (M+4)/4 - 1043 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4170 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (23 mg, 8개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 9.23 min) 에 의해 확인되었다.

실시예 11. PKPEAPGKDASPEEWNRYYASLRHYLNWVTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:13)

실시예 11은 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 35 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1393 amu 및 (M+4)/4 - 1045 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4179 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (22 mg, 8개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 9.24 min)에 의해 확인되었다.

실시예 12. PKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNWVTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:14)

실시예 12는 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 35 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1369 amu 및 (M+4)/4 - 1027 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4106 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (22 mg, 7개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 9.60 min)에 의해 확인되었다.

실시예 13. PKPEHPGKDASPEEWNRYYAALRKYLNWVTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:15)

실시예 13은 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 35 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1407 amu 및 (M+4)/4 - 1056 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4220 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (22 mg, 9개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 9.46 min)에 의해 확인되었다.

실시예 14. PKPEHPGKDASPEELNKYYAALRHYLNWVTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:16)

실시예 14는 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 35 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1377 amu 및 (M+4)/4 - 1033 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4128 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (27 mg, 9개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 8.88 min)에 의해 확인되었다.

실시예 15. PKPEHPGKDASPEELNRYYASLRHYINWVTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:17)

실시예 15는 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 35 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1391 amu 및 (M+4)/4 - 1044 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4172 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (29 mg, 9개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 8.77 min)에 의해 확인되었다.

실시예 16. PKPEHPGKDASPEELARYYASLRHYLNWVTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:18)

실시예 16은 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 35 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1377 amu 및 (M+4)/4 - 1033 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4129 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (30 mg, 9개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 8.89 min)에 의해 확인되었다.

실시예 17. PKPEHPGKDASPEEWNRYYASLRHYINWVTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:19)

실시예 17은 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 35 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 미정제 고형물을 8 mL의 25% 아세트산에서 수 시간 동안 교반시켜 수지로부터의 절단 동안 형성된 트립토판 CO₂ 부가물을 최소화하였다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1416 amu 및 (M+4)/4 - 1062 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4245 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (35 mg, 9개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 8.88 min)에 의해 확인되었다.

실시예 18. PKPEHPGKDASPEEWNRYYADLRHYINWVTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:20)

실시예 18은 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 35 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 미정제 고형물을 8 mL의 25% 아세트산에서 수 시간 동안 교반시켜 수지로부터의 절단 동안 형성된 트립토판 CO₂ 부가물을 최소화하였다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1425 amu 및 (M+4)/4 - 1069 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4273 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (17 mg, 9개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 8.98 min)에 의해 확인되었다.

실시예 19. PKPEHPGKDASPEEWNRYYADLRHYLNWVTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:21)

실시예 19는 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 35 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 미정제 고형물을 8 mL의 25% 아세트산에서 수 시간 동안 교반시켜 수지로부터의 절단 동안 형성된 트립토판 CO₂ 부가물을 최소화하였다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1425 amu 및 (M+4)/4 - 1069 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4273 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (34 mg, 9개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 8.98 min)에 의해 확인되었다.

실시예 20. PKPESPGKDASPEEWNRYYADLRHYINWVTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:22)

실시예 20은 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 35 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1408 amu 및 (M+4)/4 - 1057 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4223 amu 인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (28 mg, 8개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 8.30 min)에 의해 확인되었다.

실시예 21. PKPESPGKDASPEEWNRYYADLRHYLNWVTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:23)

실시예 21은 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 35 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1408 amu 및 (M+4)/4 - 1057 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4223 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (28 mg, 8개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 8.68 min)에 의해 확인되었다.

실시예 22. PKPEHPGKDASPEEWNRYYADLRHYLNWLTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:24)

실시예 22는 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 40 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 미정제 고형물을 8 mL의 25% 아세트산에서 수 시간 동안 교반시켜 수지로부터의 절단 동안 형성된 트립토판 CO₂ 부가물을 최소화하였다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1430 amu 및 (M+4)/4 - 1073 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4287 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (24 mg, 9개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 9.65 min)에 의해 확인되었다.

실시예 23. PKPEHPGKDASPEEWAKYYAALRHYINWVTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:25)

실시예 23은 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 40 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 미정제 고형물을 8 mL의 25% 아세트산에서 수 시간 동안 교반시켜 수지로부터의 절단 동안 형성된 트립토판 CO₂ 부가물을 최소화하였다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1386 amu 및 (M+4)/4 - 1040 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4158 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (20 mg, 9개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 9.28 min)에 의해 확인되었다.

실시예 24. PKPEAPGKDASPEEWNRYYADLRHYINWVTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:26)

실시예 24는 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 40 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 미정제 고형물을 8 mL의 25% 아세트산에서 수 시간 동안 교반시켜 수지로부터의 절단 동안 형성된 트립토판 CO₂ 부가물을 최소화하였다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1403 amu 및 (M+4)/4 - 1053 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4207 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (28 mg, 8개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 9.22 min)에 의해 확인되었다.

실시예 25. PKPEHPGKDASPEEWNRYYASLRKYLNWVTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:27)

실시예 25는 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 40 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 미정제 고형물을 8 mL의 25% 아세트산에서 수 시간 동안 교반시켜 수지로부터의 절단 동안 형성된 트립토판 CO₂ 부가물을 최소화하였다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1412 amu 및 (M+4)/4 - 1060 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4236 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (21 mg, 9개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 9.09 min)에 의해 확인되었다.

실시예 26. PKPEHPGKDASAEEWAKYYAALRHYINWVTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:28)

실시예 26은 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 20 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1378 amu 및 (M+4)/4 - 1034 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4132 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (19 mg, 9개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 9.44 min)에 의해 확인되었다.

실시예 27. PKPEAPGKDASAEEWNRYYASLRHYLNWVTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:29)

실시예 27은 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 20 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1385 amu 및 (M+4)/4 - 1039 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4153 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (16 mg, 8개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 9.31 min)에 의해 확인되었다.

실시예 28. PKPEHPGKDASAEELARYYASLRHYLNWVTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:30)

실시예 28은 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 20 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1368 amu 및 (M+4)/4 - 1027 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4103 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (14 mg, 9개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 9.27 min)에 의해 확인되었다.

실시예 29. PKPEAPGKDASAEEWNRYYASLRKYLNWVTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:31)

실시예 29는 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 20 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1382 amu 및 (M+4)/4 - 1037 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4144 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (27 mg, 8개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 9.31 min)에 의해 확인되었다.

실시예 30. PKPESPGKDASAEEWTKYYAALRHYINWVTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:32)

실시예 30은 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 20 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1371 amu 및 (M+4)/4 - 1029 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4112 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (33 mg, 8개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 9.59 min)에 의해 확인되었다.

실시예 31. PKPEAPGKDASPEELNRYYASLRKYLNWVTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:33)

실시예 31은 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 35 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 미정제 고형물을 8 mL의 25% 아세트산에서 수 시간 동안 교반시켜 수지로부터의 절단 동안 형성된 트립토판 CO₂ 부가물을 최소화하였다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1366 amu 및 (M+4)/4 - 1025 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4097 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (21 mg, 8개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 8.93 min)에 의해 확인되었다.

실시예 32. PKPEHPGEDASPEEWAKYYAALRHYINWVTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:34)

실시예 32는 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 20 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1387 amu 및 (M+4)/4 - 1041 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4159 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (9.4 mg, 8개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 LC/MS (LC/MS 방법 A, rt = 13.58 min)에 의해 확인되었다.

실시예 33. PKPEAPGEDASAEEWNRYYASLRHYLNWVTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:35)

실시예 33은 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 20 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1385 amu 및 (M+4)/4 - 1039 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4154 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (7.7 mg, 7개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 LC/MS (LC/MS 방법 A, rt = 13.35 min)에 의해 확인되었다.

실시예 34. PKPESPGEDASPEEWTKYYAALRHYINWVTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:36)

실시예 34는 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 20 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1381 amu 및 (M+4)/4 - 1036 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4139 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (8.2 mg, 7개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 LC/MS (LC/MS 방법 A, rt = 13.98 min)에 의해 확인되었다.

실시예 35. PKPEAPGEDASPEEWNRYYADLRHYLNWLTRQRY-NH₂ (SEQ ID NO:37)

실시예 35는 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 20 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1408 amu 및 (M+4)/4 - 1056 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4222 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (7.5 mg, 7개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 LC/MS (LC/MS 방법 A, rt = 13.84 min)에 의해 확인되었다.

실시예 36-43은 하기 중간체들을 참조한다:

중간체 1

(SEQ ID NO:39)

중간체 2

α-[3-(3-말레이미도-1-옥소프로필)아미노]프로필-ω-메톡시, 폴리옥시에틸렌 (NOF Corporation 또는 JenKEM Technology USA Inc.로부터 이용가능함)

중간체 3

(SEQ ID NO:40)

중간체 4

(SEQ ID NO:41)

중간체 5

N-석신이미딜-3-말레인이미도프로피오네이트

중간체 6

M-SH-40K, JenKem Technology USA Inc.로부터 이용가능함

중간체 7

(SEQ ID NO:42)

중간체 8

(SEQ ID NO:43)

중간체 9

(SEQ ID NO:44)

중간체 10

(SEQ ID NO:43)

중간체 11

(SEQ ID NO:45)

실시예 36

중간체 1은 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 400 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1377 amu 및 (M+4)/4 - 1033 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4128 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (76 mg, 7개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 B, rt = 10.98 min)에 의해 확인되었다.

pH 7.4의 3.5 mL의 1X PBS 완충제 중 중간체 1 (24.1 mg, 4.89 μmol) 및 중간체 2 (NOF Corporation, ME-400MA, 226 mg, 5.14 μmol)의 혼합물을 45분 동안 진탕시켰고, 그 시간 동안 반응물은 균질해졌다. 그 후 반응물을 0.1 M 수성 HCl 중 20% MeOH의 용액으로 희석시키고, 이온 교환 크로마토그래피 (세파로스 FF 매질, 5 컬럼 부피가 넘는 20% 메탄올/10 mM 수성 HCl 중 5-50% 1 M NaCl, 유량 5mL/min, λ-254 nm)에 의해 정제시켰다. 정제된 컨쥬게이트는 크기 배제 크로마토그래피 (GE HiPrep 26/10 탈염 컬럼, 0.1 M 아세트산-, λ-254 nm)를 이용하여 탈염시켜 동결건조 후 백색 고형물을 수득하였다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 47379 amu (MALDI)의 정점을 갖는 양성 단편 이온 분포에 의해 확인되었다. 실시예 36 (107 mg, 7개 아세트산 염으로서)은 크기 배제 HPLC (Phenomenex BioSep-SEC-S3000 컬럼, 7.8 x 300 mm, 5 μm, 20분에 걸쳐 0.5% TFA와 50% 아세토니트릴/물, 유량 0.75 mL/min, λ-220 nm)를 이용하여 9.95분과 동등한 체류 시간을 제공하였다.

실시예 37

중간체 3은 펩티드의 위치 8에 있는 리신이 ivDde 기로 보호되고, 위치 1에 있는 프롤린이 Boc로 보호되는 것을 제외하고, 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 40 μmol 규모로 제조되었다. 마지막 아미노산 (프롤린 1)의 커플링 후, ivDde를 DMF 중 4% 하이드라진의 반복된 처리로 제거하고, Fmoc-Cys(Trt)-OH를 커플링시켰다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1464 amu 및 (M+4)/4 - 1098 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4390 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (32 mg, 9개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 D, rt = 9.61 min)에 의해 확인되었다.

pH 7.4의 5 mL의 1X PBS 완충제 중 중간체 3 (10 mg, 1.85 μmol) 및 중간체 2 (JenKem Technology USA Inc., 74 mg, 1.85 μmol)의 혼합물을 밤새 진탕시켰고, 그 시간 동안 반응물은 균질해졌다. 그 후 반응물을 10 mM 수성 HCl 중 5 mL의 20% MeOH로 희석시키고 이온 교환 크로마토그래피 (세파로스 FF 매질, 7 컬럼 부피가 넘는 20% 메탄올/10 mM 수성 HCl 중 0-60% 1 M NaCl, 유량 5 mL/min, λ-254 nm)에 의해 정제시켰다. 정제된 컨쥬게이트를 크기 배제 크로마토그래피 (Sephadex G 25 Fine 탈염 컬럼, 0.1 M 아세트산, λ-254 nm)를 이용하여 탈염시켜 동결건조 후 백색 고형물을 수득하였다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 44568 amu (MALDI)의 정점을 갖는 양성 단편 이온 분포에 의해 확인되었다. 실시예 37 (35 mg, 9개 아세트산 염으로서)은 크기 배제 HPLC (Phenomenex BioSep-SEC-S3000 컬럼, 7.8 x 300 mm, 5 μm, 20분에 걸쳐 30 mM PBS 중 0.15 mM NaCl, pH 6.8, 유량 0.75 mL/min, λ-215 nm)를 이용하여 11.58분과 동등한 체류 시간을 제공하였다.

실시예 38

중간체 4는 펩티드의 위치 8에 있는 리신이 ivDde 기로 보호되고, 위치 1에 있는 프롤린이 Boc로 보호되는 것을 제외하고, 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 40 μmol 규모로 제조되었다. 마지막 아미노산 (프롤린 1)의 커플링 후, ivDde를 DMF 중 4% 하이드라진의 반복된 처리로 제거하고, 링커를 활성화제 (HCTU) 또는 염기 (NMM)를 사용하지 않고, 활성화된 석신이미드 에스테르 시약 중간체 5, N-β-말레이미도프로필옥시석신이미드 에스테르를 이용하여 커플링시켰다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1442 amu 및 (M+4)/4 - 1082 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4323 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (29 mg, 8개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 8.79 min)에 의해 확인되었다.

pH 7.4의 5 mL의 1X PBS 완충제 중 중간체 4 (10 mg, 1.91 μmol) 및 중간체 6 (JenKem Technology USA Inc., 76 mg, 1.91 μmol)의 혼합물을 밤새 진탕시켰고, 그 시간 동안 반응물은 균질해졌다. 그 후 반응물을 10 mM 수성 HCl 중 5 mL의 20% MeOH로 희석시키고 이온 교환 크로마토그래피 (세파로스 FF 매질, 7 컬럼 부피가 넘는 20% 메탄올/10 mM 수성 HCl 중 0-60% 1 M NaCl, 유량 5 mL/min, λ-254 nm)에 의해 정제시켰다. 정제된 컨쥬게이트를 크기 배제 크로마토그래피 (Sephadex G 25 Fine 탈염 컬럼, 0.1 M 아세트산, λ-254 nm)를 이용하여 탈염시켜 동결건조 후 백색 고형물을 수득하였다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 44346 amu (MALDI)의 정점을 갖는 양성 단편 이온 분포에 의해 확인되었다. 실시예 38 (27 mg, 8개 아세트산 염으로서)은 크기 배제 HPLC (Phenomenex BioSep-SEC-S3000 컬럼, 7.8 x 300 mm, 5 μm, 20분에 걸쳐 30 mM PBS 중 0.15 mM NaCl, pH 6.8, 유량 0.75 mL/min, λ-215 nm)를 이용하여 12.19분과 동등한 체류 시간을 제공하였다.

실시예 39

중간체 7은 펩티드의 위치 8에 있는 리신이 ivDde 기로 보호되고, 위치 1에 있는 프롤린이 Boc로 보호되는 것을 제외하고, 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 40 μmol 규모로 제조되었다. 마지막 아미노산 (프롤린 1)의 커플링 후, ivDde를 DMF 중 4% 수성 하이드라진의 반복된 처리로 제거하고, Fmoc-Gly-OH 및 Fmoc-Cys(Trt)-OH를 커플링시켰다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1433 amu 및 (M+4)/4 - 1075 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4298 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (28.4 mg, 8개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 LC/MS (LC/MS 방법 A, rt = 13.68 min)에 의해 확인되었다.

pH 7.4의 10 mL의 1X PBS 완충제 중 중간체 7 (10.1 mg, 1.94 μmol) 및 중간체 2 (JenKem Technology USA Inc., 78 mg, 1.94 μmol)의 혼합물을 밤새 진탕시켰다. 그 후 반응물을 10 mM 수성 HCl 중 10 mL의 20% MeOH 용액으로 희석시키고 이온 교환 크로마토그래피 (세파로스 FF 매질, 7 컬럼 부피가 넘는 20% 메탄올/10 mM 수성 HCl 중 0-60% 1 M NaCl, 유량 5 mL/min, λ-215 nm)에 의해 정제시켰다. 정제된 컨쥬게이트를 크기 배제 크로마토그래피 (Sephadex G 25 Fine, 50 x 130 mm 컬럼, 0.1 M 아세트산, λ-254 nm)를 이용하여 탈염시켜 동결건조 후 백색 고형물을 수득하였다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 44384 amu (MALDI)의 정점을 갖는 양성 단편 이온 분포에 의해 확인되었다. 실시예 39 (26.7 mg, 8개 아세트산 염으로서)는 크기 배제 HPLC (Phenomenex BioSep-SEC-S3000 컬럼, 7.8 x 300 mm, 5 μm, 20분에 걸쳐 30 mM PBS 중 0.15 mM NaCl, pH 6.8, 유량 0.75 mL/min, λ-215 nm)를 이용하여 12.30분과 동등한 체류 시간. 및 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A)에 의해 12.31분과 동등한 체류 시간을 제공하였다.

실시예 40

중간체 8은 펩티드의 위치 8에 있는 리신이 ivDde 기로 보호되고, 위치 1에 있는 프롤린이 Boc로 보호되는 것을 제외하고, 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 40 μmol 규모로 제조되었다. 마지막 아미노산 (프롤린 1)의 커플링 후, ivDde를 DMF 중 4% 수성 하이드라진의 반복된 처리로 제거하고, Fmoc-Gly-OH 및 Fmoc-Cys(Trt)-OH를 커플링시켰다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1440 amu 및 (M+4)/4 - 1080 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4318 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (39 mg, 9개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 LC/MS (LC/MS 방법 A, rt = 13.16 min)에 의해 확인되었다.

pH 7.4의 10 mL의 1X PBS 완충제 중 중간체 8 (10.43 mg, 1.95 μmol) 및 중간체 2 (JenKem Technology USA Inc., 86 mg, 2.15 μmol)의 혼합물을 2시간 동안 교반시켰다. 그 후 반응물을 10 mM 수성 HCl 중 10 mL의 20% MeOH 용액으로 희석시키고 이온 교환 크로마토그래피 (세파로스 FF Media, 7 컬럼 부피가 넘는 20% 메탄올/10 mM 수성 HCl 중 0-60% 1 M NaCl, 유량 5 mL/min, λ-215 nm)에 의해 정제시켰다. 정제된 컨쥬게이트를 크기 배제 크로마토그래피 (Sephadex G 25 Fine, 50 x 130 mm 컬럼, 0.1 M 아세트산, λ-254 nm)를 이용하여 탈염시켜 동결건조 후 백색 고형물을 수득하였다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 44514 amu (MALDI)의 정점을 갖는 양성 단편 이온 분포에 의해 확인되었다. 실시예 40 (35 mg, 9개 아세트산 염으로서)은 크기 배제 HPLC (Phenomenex BioSep-SEC-S3000 컬럼, 7.8 x 300 mm, 5 μm, 20분에 걸쳐 30 mM PBS 중 0.15 mM NaCl, pH 6.8, 유량 0.75 mL/min, λ-215 nm)를 이용하여 14.90분과 동등한 체류 시간, 및 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A)에 의해 12.08분과 동등한 체류 시간을 제공하였다.

실시예 41

중간체 9는 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 40 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1407 amu 및 (M+4)/4 - 1056 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4220 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (30 mg, 8개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A, rt = 8.98 min)에 의해 확인되었다.

pH 7.4의 5 mL의 1X PBS 완충제 중 중간체 9 (13.2 mg, 2.57 μmol) 및 중간체 2 (JenKem Technology USA Inc., 113 mg, 2.83 μmol)의 혼합물을 1시간 동안 진탕시켰고, 그 시간 동안 반응물은 균질해졌다. 그 후 반응물을 10 mM 수성 HCl 중 5 mL의 20% MeOH로 희석시키고 이온 교환 크로마토그래피 (세파로스 FF 매질, 7 컬럼 부피가 넘는 20% 메탄올/10 mM 수성 HCl 중 0-60% 1 M NaCl, 유량 5 mL/min, λ-254 nm)에 의해 정제시켰다. 정제된 컨쥬게이트를 크기 배제 크로마토그래피 (Sephadex G 25 Fine 탈염 컬럼, 0.1 M 아세트산, λ-254 nm)를 이용하여 탈염시켜 동결건조 후 백색 고형물을 수득하였다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 44239 amu (MALDI)의 정점을 갖는 양성 단편 이온 분포에 의해 확인되었다. 실시예 41 (41 mg, 8개 아세트산 염으로서)은 크기 배제 HPLC (Phenomenex BioSep-SEC-S3000 컬럼, 7.8 x 300 mm, 5 μm, 20분에 걸쳐 30 mM PBS 중 0.15 mM NaCl, pH 6.8, 유량 0.75 mL/min, λ-215 nm)를 이용하여 9.20분과 동등한 체류 시간을 제공하였다.

실시예 42

중간체 10은 펩티드의 위치 8에 있는 리신이 ivDde 기로 보호되고, 위치 1에 있는 프롤린이 Boc로 보호되는 것을 제외하고, 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 40 μmol 규모로 제조되었다. 마지막 아미노산 (프롤린 1)의 커플링 후, ivDde를 DMF 중 4% 수성 하이드라진의 반복된 처리로 제거하고, Trt-메르캅토프로피온산 (MPA)을 커플링시켰다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1416 amu 및 (M+4)/4 - 1062 amu에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4246 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (22.2 mg, 8개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 LC/MS (LC/MS 방법 A, rt = 13.88 min)에 의해 확인되었다.

pH 7.4의 10 mL의 1X PBS 완충제 중 중간체 10 (10.2 mg, 1.98 μmol) 및 중간체 2 (JenKem Technology USA Inc., 87 mg, 2.18 μmol)의 혼합물을 밤새 진탕시켰다. 그 후 반응물을 10 mM 수성 HCl 중 10 mL의 20% MeOH 용액으로 희석시키고 이온 교환 크로마토그래피 (세파로스 FF 매질, 7 컬럼 부피가 넘는 20% 메탄올/10 mM 수성 HCl 중 0-60% 1 M NaCl, 유량 5 mL/min, λ-215 nm)에 의해 정제시켰다. 정제된 컨쥬게이트를 크기 배제 크로마토그래피 (Sephadex G 25 Fine, 50 x 130 mm 컬럼, 0.1 M 아세트산, λ-254 nm)를 이용하여 탈염시켜 동결건조 후 백색 고형물을 수득하였다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 44392 amu (MALDI)의 정점을 갖는 양성 단편 이온 분포에 의해 확인되었다. 실시예 42 (32.2 mg, 8개 아세트산 염으로서)는 크기 배제 HPLC Phenomenex BioSep-SEC-S3000 컬럼, 7.8 x 300 mm, 5 μm, 20분에 걸쳐 30 mM PBS 중 0.15 mM NaCl, pH 6.8, 유량 0.75 mL/min, λ-215 nm)를 이용하여 13.83분과 동등한 체류 시간, 및 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A)에 의해 12.06분과 동등한 체류 시간을 제공하였다.

실시예 43

중간체 11은 일반적인 방법을 이용하여 백색 고형물로서 35 μmol 규모로 제조되었다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 단편 이온 (M+3)/3 - 1378 amu 및 (M+4)/4 - 1034에 의해 확인되었고, 이는 부모 분자량이 4133 amu인 펩티드에 해당한다 (ESI-MS, LC/MS 방법 A). 분리된 펩티드 (13 mg, 8개 트리플루오로아세트산 염으로서)에 대한 >90%의 순도는 LC/MS (LC/MS 방법 A, rt = 13.77 min)에 의해 확인되었다.

pH 7.4의 10 mL의 1X PBS 완충제 중 중간체 11 (9.54 mg, 1.89 μmol) 및 중간체 2 (JenKem Technology USA Inc., 83 mg, 2.08 μmol)의 혼합물을 밤새 주위 온도에서 교반시켰다. 그 후 반응물을 10 mM 수성 HCl 중 10 mL의 20% MeOH 용액으로 희석시키고 이온 교환 크로마토그래피 (세파로스 FF 매질, 7 컬럼 부피가 넘는 20% 메탄올/10 mM 수성 HCl 중 0-60% 1 M NaCl, 유량 5 mL/min, λ-215 nm)에 의해 정제시켰다. 정제된 컨쥬게이트를 크기 배제 크로마토그래피 (Sephadex G 25 Fine, 50 x 130 mm 컬럼, 0.1 M 아세트산, λ-254 nm)를 이용하여 탈염시켜 동결건조 후 백색 고형물을 수득하였다. 분리된 펩티드의 분자 질량은 44117 amu (MALDI)의 정점을 갖는 양성 단편 이온 분포에 의해 확인되었다. 실시예 43 (32 mg, 8개 아세트산 염으로서)은 크기 배제 HPLC (Phenomenex BioSep-SEC-S3000 컬럼, 7.8 x 300 mm, 5 μm, 20분에 걸쳐 30 mM PBS 중 0.15 mM NaCl, pH 6.8, 유량 0.75 mL/min, λ-215 nm)를 이용하여 10.65분과 동등한 체류 시간, 및 C18 HPLC (C18 HPLC 방법 A)에 의해 12.10분과 동등한 체류 시간을 제공하였다.

생물학적 실시예

인간 신경펩티드 Y 수용체 타입 2에 있는 PYY 유사체의 효능

인간 신경펩티드 Y 수용체 타입 2에 있는 PYY 유사체의 상대 효능을 본질적으로 문헌[Jayawickreme et al. (2005) Current Protocols in Pharmacology 12.9.1-12]에 기재된 대로 멜라닌색소포 검정을 이용하여 확인하였다.

음식 섭취에 대한 PYY 유사체의 효과

음식 섭취의 지속적 모니터링을 위한 BioDaQ 시스템 (Research Diets Inc., New Brunswick, NJ)에서 6시간 후의 누적 음식 섭취가 야윈 (모델 A) 또는 식이요법-유도된 비만 (DIO) (모델 B) C57BL/6 마우스에서 PYY 유사체에 대해 측정되었다. 모델 A는 정상 사료 (Purina PMI 5001)가 공급된 10주령 수컷 C57BL/6 마우스 (Taconic, Germantown, New York)를 이용한 한편, 모델 B는 20주 동안 45% 고지방 사료가 공급된 25주령 수컷 C57BL/6 마우스를 이용하였다 (Research Diets D12451). 마우스를 BioDaQ 케이지에 단독으로 두고 최소 6일 동안 순응시켰고 사료와 물에 임의로 접근하게 하였다. 소등하기 약 1시간 전에, 동물에게 비히클 (20 mM 아세테이트 완충제, pH 4.9 또는 물 중 20% DMSO) 또는 비히클에 용해된 유사체 (1 mg/kg) (그룹 당 8마리 동물)를 피하 투여하였다. 일단 모든 동물에게 투여되면, 공급장치 문을 열어서 사료에 자유롭게 접근하게 하였다. 지속적인 음식 섭취가 모니터되었고 15시간 동안 수집되었다. 시간 당 음식 섭취, 뿐만 아니라 6 및 15시간의 누적 음식 섭취를 비히클 대조군에 대한 % 억제로서 요약하였다. 데이터를 합동 분산(pooled variance) t-시험을 이용하여 인간 PYY(3-36)NH₂로 처리된 그룹에 비해 JMP 6.0.0 (SAS Institute, Cary, NC)에서 분석하였다. P-값 < 0.05는 처리 그룹들 간의 유의한 차이를 나타내는 것으로 고려되었다.

표 1은 실시예 1-35에 제시된 PYY 유사체에 대한 인간 신경펩티드 Y 수용체에서의 효능 및 음식 섭취 감소를 나타낸다.

표 2는 인간 신경펩티드 Y 수용체에서 효능을 갖지만 6시간 시점에 인간 PYY(3-36)NH₂ 보다 큰 음식 섭취 감소를 나타내지 않는 PYY 유사체의 예를 제시한다.

체중, 신체 조성 및 음식 섭취 감소에 대한 엑센딘-4와 함께 실시예 5의 효과

실시예 5 단독으로 및 항-비만 작용제로서 엑센딘-4와 함께 실시예 5의 효능 및 지속력을 조사하기 위해 비만에 대한 설치류 모델 (식이요법-유도된 비만 (DIO) 롱 에반스 래트)에서 장기 (41일) 생체내 효능 연구를 수행하였다.

수컷 식이요법-유도된 비만 (DIO) 롱 에반스 (LE) 래트를 이용하였고 (Harlan Laboratories, Inc., Indianapolis, IN), 이유를 시작할 때 (약 3주령), 래트에 고지방 사료 (Teklad TD 95217, 지방으로부터 40% kcal, Harlan Laboratories, Madison, WI)를 공급하였다. 래트는 연구 시작에 17주령이었다. 래트는 케이지 당 1마리가 수용되었고 TD.95217 사료 및 물에 자유롭게 접근하였으며, 21℃ 및 50% 상대 습도에서 5:00 AM부터 5:00 PM까지 12시간의 광/암 주기로 유지되었고 기준선을 측정하기 전에 적어도 7일 동안 순응시켰다. 기준선 지방 질량 및 비-지방 질량 측정치는 펩티드 주입을 시작하기 3일 전 및 치료 40일차에 QMR 기계 (Echo Medical Systems, Houston, TX)를 이용하여 취해졌다. 래트는 이들의 퍼센트 체지방 질량에 따라 6 그룹으로 무작위화되었다: (1) 비히클 (멸균수, n=8), (2) 엑센딘-4 (ED₅₀=0.15 mg/kg/day, n=8), (3) 실시예 5 (ED₅₀=0.03mg/kg/day, n=8), (4) PYY(3-36)NH₂ (1.5 mg/kg/day, n=8), (5) 엑센딘-4+ 실시예 5 (n=8) 및 (6) 엑센딘-4+ PYY(3-36)NH₂ (n=8). AlZET® 미니-삼투 펌프 (6주; Model 2006, Durect Corporation, Cupertino, CA)는 수술 하루 전날 비히클 또는 펩티드로 무균 조건 하에 채워졌다. 각각의 래트에 이들의 처리 그룹에 따라 비히클 또는 펩티드를 견갑골 부위에 삼투 펌프를 이용하여 피하 주입하였다. 체중 및 음식 섭취를 41일 치료 기간의 3일 전부터 시작하여 매주 2회 측정하였다. 치료 41일차에, 이소플루란 마취 하에 심장 천자에 의해 전혈을 수집하였다. 그 후 혈장 및 혈청을 혈청 화학 분석을 위해 전혈로부터 준비하였다. 모든 데이터는 평균 ± SEM으로서 표시된다. 데이터를 스튜던트 T-시험을 이용하여 Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA) 또는 엑셀에서 분석하여 각각의 그룹을 적절한 대조군과 비교하였다. P-값 < 0.05는 처리 그룹들 간의 유의한 차이를 나타내는 것으로 고려되었다.

모든 절차는 동물 복지법, USDA 규정을 준수하여 수행되었고 GlaxoSmithKline Institutional Animal Care and Use Committee에 의해 허가되었다.

DIO 래트에서, 40일 동안 중량 손실에 대한 ED₅₀의 실시예 5의 투여는 비히클에 비해 -6.1% (p<0.05)의 중량 손실을 발생시킨 반면, ED₅₀의 천연 PYY(3-36)NH₂는 -1.3% (p=0.46)의 중량 손실을 발생시켰다 (도 1). 40일 동안 콤보 ED₅₀ 용량의 실시예 5 및 엑센딘-4의 조합물은 비히클에 비해 -30.9%의 지속적이고 현저한 중량 손실을 발생시켰는데 (p<0.05), 이는 엑센딘-4 및 실시예 5를 단독으로 투여했을 때의 중량 손실 (각각 -11.3% 및 -6.1%, 추정되는 부가 중량 손실 -17.4%)에 기반하여 예상된 부가 효과를 훨씬 초과한 것이다. 반면, 엑센딘-4와 조합된 천연 PYY(3-36)NH₂는 비히클에 비해 -10.2% 중량 손실을 발생시켰고, 이는 엑센딘-4 및 PYY(3-36)NH₂를 단독으로 투여했을 때의 중량 손실 (각각 -11.3% 및 -1.3%, 추정되는 부가 중량 손실 -12.6%)을 기준으로 낮은-부가 효과였다.

신체 조성에서의 변화는, 비-지방 질량에서의 일부 변화와 함께, 주로 체지방 질량 손실에 의해 유도되었고 모든 처리 그룹에서 체중 변화를 반영하였다 (도 2). 구체적으로, 치료 기간 동안 실시예 5로 처리된 동물은 비히클 대조군으로부터 -34.2 그램의 지방 질량을 상실하였고 (p<0.05), PYY(3-36)NH₂ 동물은 -10.9 그램의 지방 질량을 상실하였고 (비히클 대조군에 비해 p=0.12) 및 엑센딘-4로 치료된 동물은 -55.8 그램의 지방 질량을 상실하였다 (비히클 대조군에 비해 p<0.05). 실시예 5 + 엑센딘-4 조합물은 지방 질량에 대해 부가 효과보다 더 큰 효과를 지녔고, 여기서 조합물은 -110.1 그램을 상실하였는데 (비히클 대조군에 비해 p<0.05), 이는 -90 그램 (p<0.05)의 예측된 부가 값보다 현저하게 더 큰 것이었다 (도 3). 대조적으로, 엑센딘-4와 조합된 PYY(3-36)NH₂는 -66.7 그램의 예측된 부가 값보다 낮은 -54.0 그램의 지방 질량 손실을 비히클에 비해 발생시켰다 (p<0.05).

또한, PYY(3-36)NH₂ + 엑센딘-4 조합물 이용시 -18.8% 억제 (비히클 대조군에 비해 p=0.87)에 비해, 실시예 5를 엑센딘-4와 공동-투여했을 때 누적 음식 섭취의 ~57.1% 억제 (비히클 대조군에 비해 p<0.05)가 관찰되었다. 단독으로 투여되는 각각의 펩티드의 음식 섭취 억제를 기준으로 (각각 -11.5% 및 -20.1%, 추정되는 부가 음식 섭취 억제 -31.6%) 실시예 5 + 엑센딘-4 조합물 이용시 부가 효능보다 큰 효능이 있는 것으로 보인다. 대조적으로, 천연 PYY(3-36)NH₂ + 엑센딘-4 조합물은 단독으로 투여되는 각각의 펩티드의 음식 섭취 억제를 기준으로 (PYY(3-36)NH₂에 대해 -0.7% 및 엑센딘-4에 대해 -20.1%, 추정되는 부가 음식 섭취 억제 -20.8%) 낮은-부가 음식 섭취 억제를 발생시켰다.

엑센딘-4와 조합된 실시예 23은 당뇨병 ZDF 래트에서 글루코스 파라메터에 부가 효과보다 큰 효과를 야기한다

실시예 23 단독으로 및 항-당뇨병 작용제로서 엑센딘-4와 함께 실시예 23의 효능 및 지속력을 조사하기 위해 당뇨병에 대한 설치류 모델 (Zucker Diabetic Fatty (ZDF) rat)에서 장기 (26일) 생체내 효능 연구를 수행하였다.

수컷 ZDF 래트는 연구 시작에 12주령이었다 (Charles River, Inc., Boston, MA). ZDF 래트는 케이지 당 1마리가 수용되었고 식이 (Purina PMI 5008) 및 물에 자유롭게 접근하였으며, 21℃ 및 50% 상대 습도에서 5:00 AM부터 5:00 PM까지 12시간의 광/암 주기로 유지되었고 기준선을 측정하기 전에 적어도 6일 동안 그리고 수술 전 10일 동안 순응시켰다. 기준선 지방 질량 및 비-지방 질량 측정치는 펩티드 주입을 시작하기 3일 전 및 치료 26일차에 QMR 기계 (Echo Medical Systems, Houston, TX)를 이용하여 취해졌다. 약물 투여를 시작하기 2일 전에 글루코스 값 및 % HbA1c 값을 측정하기 위해 꼬리를 잘라 혈액 샘플을 수득하였다; 이러한 데이터를 이용하여 동물을 7 그룹으로 무작위화하였다: (1) 야윈 비히클 대조군 (멸균 포스페이트 완충된 염수 (PBS), pH 4.9, n=8), (2) ZDF 비히클 대조군 (멸균 PBS, pH 4.9, n=8), (3) 엑센딘-4 (ED₂₀=0.0055 mg/kg/day, n=8), (4) 실시예 23 (ED₂₀=0.02mg/kg/day, n=8), (5) PYY(3-36)NH₂ (0.02 mg/kg/day, n=8), (6) 엑센딘-4+실시예 23 (n=4) 및 (7) 엑센딘-4+ PYY(3-36)NH₂ (n=8). ALZET® 미니-삼투 펌프 (4주; Model 2006, Durect Corporation, Cupertino, CA)는 수술 하루 전날 비히클 또는 펩티드로 무균 조건 하에 채워졌다. 미니-펌프의 유사한 수술적 주입을 상기 DIO 래트에 대해 기재된 대로 수행하였다 (동물에 리도카인 (0.1 mL의 0.125% 리도카인)을 ID 주입한 것은 예외이다). 체중 및 음식 섭취를 26일 치료 기간의 3일 전부터 시작하여 매주 2회 측정하였다. 치료 26일차에, 이소플루란 마취 하에 전혈을 심장 천자에 의해 수집하였다. 전혈을 이용하여 % HbA1c를 결정하고 혈청을 이용하여 글루코스를 측정하였다. 데이터를 스튜던트 T-시험을 이용하여 Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA) 또는 엑셀에서 분석하여 각각의 그룹을 적절한 대조군과 비교하였다. P-값 < 0.05는 처리 그룹들 간의 유의한 차이를 나타내는 것으로 고려되었다.

표 3은 실시예 23, PYY(3-36)NH₂, 또는 엑센딘-4를 단독으로 또는 조합하여 이용한 장기 치료 후 (26일) 기준선으로부터 및 비히클 대조군 ZDF 동물로부터 (ΔΔ) 글루코스 및 당화된 HbA1c 변화를 도시한다. 단독으로, 엑센딘-4 및 실시예 23만이 PYY(3-36)NH₂ (ΔΔ-33.1; p=0.11)에 비해 비히클 대조군 (각각 ΔΔ -53.9 및 -54.5 mg/dL; p<0.05)으로부터 통계적으로 유의한 글루코스 저하를 달성하였다. HbA1c 저하를 위한 ED₂₀ 용량의 실시예 23 및 엑센딘-4 콤보의 조합물을 이용한 26일 동안의 치료는 현저한 글루코스 저하 ΔΔ -152.3 mg/dL (비히클 대조군에 비해 p<0.05)를 발생시켰고, 이는 엑센딘-4 및 실시예 23을 단독으로 투여했을 때의 글루코스 저하 (ΔΔ -53.9 및 -54.5 mg/dL, 비히클 대조군에 비해 추정되는 부가 글루코스 저하 -108.4 mg/dL)를 기준으로 예상된 부가 효과를 초과한 것이다. ΔΔ %HbA1c 수준은 모든 치료 그룹에서 글루코스 변화를 반영하였으나, 어떤 그룹도 통계적으로 유의한 것으로 고려되지 않았다.

표 3. ZDF 래트에서 실시예 23 및/또는 엑센딘-4를 단독으로 및 조합하여 이용하여 치료한 지 26일 후 글루코스 및 HbA1c에서의 변화

SEQUENCE LISTING <110> GlaxoSmithKline Intellectual Property (No. 2) Ltd. Dock, Steven Carpenter, Andrew Hunter, Robert Srivastava, Ved Yulin, Wu <120> THERAPEUTIC PEPTIDES <130> PR65431 <150> US 61/818,624 <151> 2013-05-02 <160> 67 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X = A, H, or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X = E or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> X = P or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> X = L or W <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> X = N, A, or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> X = R or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> X = S, D, or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> X = H or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> X = L or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> X = V or L <400> 1 Pro Lys Pro Glu Xaa Pro Gly Xaa Asp Ala Ser Xaa Glu Glu Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Tyr Tyr Ala Xaa Leu Arg Xaa Tyr Xaa Asn Trp Xaa Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 2 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X = A, H, or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X = E or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> X = P or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> X = L or W <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> X = N, A, or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> X = R or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> X = S, D, or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> X = H or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> X = L or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> X = V or L <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 2 Pro Lys Pro Glu Xaa Pro Gly Xaa Asp Ala Ser Xaa Glu Glu Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Tyr Tyr Ala Xaa Leu Arg Xaa Tyr Xaa Asn Trp Xaa Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 3 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY Analog <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 3 Pro Lys Pro Glu Ala Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 4 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 4 Pro Lys Pro Glu Ala Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg Lys Tyr Leu Asn Trp Leu Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 5 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 5 Pro Lys Pro Glu Ala Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Leu Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 6 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 6 Pro Lys Pro Glu Ala Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Asp Leu Arg Lys Tyr Leu Asn Trp Leu Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 7 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 7 Pro Lys Pro Glu Ala Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Asp Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Leu Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 8 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 8 Pro Lys Pro Glu Ala Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg Lys Tyr Leu Asn Trp Leu Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 9 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 9 Pro Lys Pro Glu Ala Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Leu Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 10 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 10 Pro Lys Pro Glu Ala Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Asp Leu Arg Lys Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 11 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 11 Pro Lys Pro Glu Ala Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Asp Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 12 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 12 Pro Lys Pro Glu Ala Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg Lys Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 13 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 13 Pro Lys Pro Glu Ala Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 14 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 14 Pro Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 15 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 15 Pro Lys Pro Glu His Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ala Leu Arg Lys Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 16 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 16 Pro Lys Pro Glu His Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Lys Tyr Tyr Ala Ala Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 17 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 17 Pro Lys Pro Glu His Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Ile Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 18 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 18 Pro Lys Pro Glu His Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Ala 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 19 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 19 Pro Lys Pro Glu His Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Ile Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 20 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 20 Pro Lys Pro Glu His Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Asp Leu Arg His Tyr Ile Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 21 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 21 Pro Lys Pro Glu His Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Asp Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 22 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 22 Pro Lys Pro Glu Ser Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Asp Leu Arg His Tyr Ile Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 23 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 23 Pro Lys Pro Glu Ser Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Asp Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 24 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 24 Pro Lys Pro Glu His Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Asp Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Leu Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 25 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 25 Pro Lys Pro Glu His Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Ala 1 5 10 15 Lys Tyr Tyr Ala Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 26 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 26 Pro Lys Pro Glu Ala Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Asp Leu Arg His Tyr Ile Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 27 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 27 Pro Lys Pro Glu His Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg Lys Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 28 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 28 Pro Lys Pro Glu His Pro Gly Lys Asp Ala Ser Ala Glu Glu Trp Ala 1 5 10 15 Lys Tyr Tyr Ala Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 29 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 29 Pro Lys Pro Glu Ala Pro Gly Lys Asp Ala Ser Ala Glu Glu Trp Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 30 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 30 Pro Lys Pro Glu His Pro Gly Lys Asp Ala Ser Ala Glu Glu Leu Ala 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 31 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 31 Pro Lys Pro Glu Ala Pro Gly Lys Asp Ala Ser Ala Glu Glu Trp Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg Lys Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 32 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 32 Pro Lys Pro Glu Ser Pro Gly Lys Asp Ala Ser Ala Glu Glu Trp Thr 1 5 10 15 Lys Tyr Tyr Ala Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 33 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 33 Pro Lys Pro Glu Ala Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg Lys Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 34 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 34 Pro Lys Pro Glu His Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Ala 1 5 10 15 Lys Tyr Tyr Ala Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 35 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 35 Pro Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Ala Glu Glu Trp Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 36 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 36 Pro Lys Pro Glu Ser Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Thr 1 5 10 15 Lys Tyr Tyr Ala Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 37 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 37 Pro Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Asp Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Leu Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 38 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <400> 38 Pro Lys Pro Glu Ala Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Asp Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Leu Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 39 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Residue is modified as illustrated in specification. <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 39 Pro Lys Pro Glu Ala Pro Gly Cys Asp Ala Ser Ala Glu Glu Trp Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 40 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Residue is modified as illustrated in specification. <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 40 Pro Lys Pro Glu His Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Asp Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Leu Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 41 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Residue is modified as illustrated in specification. <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 41 Pro Lys Pro Glu His Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 42 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Residue is modified as illustrated in specification. <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 42 Pro Lys Pro Glu Ser Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Thr 1 5 10 15 Lys Tyr Tyr Ala Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 43 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Residue is modified as illustrated in specification. <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 43 Pro Lys Pro Glu His Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Ala 1 5 10 15 Lys Tyr Tyr Ala Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 44 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Residue is modified as illustrated in specification. <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 44 Pro Lys Pro Glu His Pro Gly Cys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 45 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Residue is modified as illustrated in specification. <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 45 Pro Lys Pro Glu His Pro Gly Cys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Ala 1 5 10 15 Lys Tyr Tyr Ala Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 46 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 46 Pro Lys Pro Glu Ala Pro Gly Cys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg Lys Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Asn Tyr <210> 47 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 47 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu Glu Ala Val 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 48 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 48 Pro Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Lys Glu Trp Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg Lys Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 49 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 49 Pro Lys Pro Glu His Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr His Ala Ala Leu Arg Ala Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 50 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 50 Pro Lys Pro Glu His Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ala Leu Arg Ala Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln 20 25 30 Lys Tyr <210> 51 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 51 Pro Lys Pro Glu His Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ala Leu Arg Ala Tyr Leu Asn Leu Val Thr Lys Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 52 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 52 Pro Gln Pro Glu Ser Pro Gly Cys Asn Ala Ser Pro Glu Glu Leu Ala 1 5 10 15 Lys Tyr His Ala Ala Leu Arg His Tyr Val Asn Leu Ile Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 53 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 53 Ile Lys Pro Pro Tyr Pro Gly Cys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Gln Asn 1 5 10 15 Lys Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg Ala Tyr Trp Asn Leu Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 54 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 54 Pro Lys Pro Glu Ser Pro Gly Ser Asn Ala Ser Pro Glu Asp Trp Ala 1 5 10 15 Lys Tyr Gln Ala Ala Val Arg His Tyr Val Asn Leu Ile Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 55 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 55 Pro Glu Pro Glu His Pro Gly Cys Asp Ala Ser Pro Glu Asp Gln Asn 1 5 10 15 Lys Tyr His Ala Ser Leu Arg Lys Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 56 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 56 Ile Lys Pro Pro Glu Pro Gly Cys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Gln Asn 1 5 10 15 Lys Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Trp Asn Leu Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 57 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 57 Ile Glu Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 58 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 58 Pro Lys Pro Glu Ser Pro Gly Ser Asp Ala Ser Pro Glu Asp Leu Ala 1 5 10 15 Lys Tyr His Ala Ala Val Arg His Tyr Val Asn Leu Ile Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 59 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 59 Pro Lys Pro Glu Ala Pro Gly Cys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Trp Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg Lys Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln 20 25 30 His Tyr <210> 60 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 60 Pro Lys Pro Val Ala Pro Gly Cys Asp Ala Ser Pro Ala Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Gln Tyr Ser Asp Leu Arg Asn Tyr Trp Asn Leu Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 61 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 61 Ile Gln Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 62 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 62 Pro Lys Pro Glu Ser Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Asp Leu Ala 1 5 10 15 Lys Tyr His Ala Ala Val Arg His Tyr Val Asn Leu Ile Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 63 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 63 Pro Gln Pro Glu Ser Pro Glu Gly Asn Ala Ser Pro Glu Asp Trp Ala 1 5 10 15 Cys Tyr His Ala Ala Val Arg His Tyr Val Asn Leu Ile Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 64 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 64 Ile His Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 65 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 65 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Gln Leu Met 1 5 10 15 Ala Gln Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 66 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 66 Pro Lys Pro Glu Ala Pro Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu Glu Ala Val 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 67 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY ANALOG <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 67 Pro Lys Pro Glu Ala Pro Gly Cys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Gln Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr

Claims

하기 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 이의 염:

상기 서열에서,
Xaa₁은 Ala, His, 또는 Ser이고;
Xaa₂는 Glu 또는 Lys이고;
Xaa₃은 Pro 또는 Ala이고;
Xaa₄는 Leu 또는 Trp이고;
Xaa₅는 Asn, Ala, 또는 Thr이고;
Xaa₆은 Arg 또는 Lys이고;
Xaa₇은 Ser, Asp, 또는 Ala이고;
Xaa₈은 His 또는 Lys이고;
Xaa₉는 Leu 또는 Ile이고;
Xaa₁₀은 Val 또는 Leu이다.
하기 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드 또는 이의 염:

상기 서열에서,
Xaa₁은 Ala, His, 또는 Ser이고;
Xaa₂는 Glu 또는 Lys이고;
Xaa₃은 Pro 또는 Ala이고;
Xaa₄는 Leu 또는 Trp이고;
Xaa₅는 Asn, Ala, 또는 Thr이고;
Xaa₆은 Arg 또는 Lys이고;
Xaa₇은 Ser, Asp, 또는 Ala이고;
Xaa₈은 His 또는 Lys이고;
Xaa₉는 Leu 또는 Ile이고;
Xaa₁₀은 Val 또는 Leu이다.
제 2항에 있어서, 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드:
제 1항에 있어서, 하기 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드:
제 1항에 있어서, 하기 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드:
제 2항에 있어서, 하기 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드:
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 및 엑센딘-4를 포함하는 약학적 조합물.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 및 GLP-1을 포함하는 약학적 조합물.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 약학적 조합물을 대사 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 인간 대상체에서 대사 장애를 치료하는 방법.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 약학적 조합물을 비만의 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 인간 대상체에서 비만을 치료하는 방법.
대사 장애의 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에서의 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 약학적 조합물의 용도.
비만의 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에서의 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 약학적 조합물의 용도.
대사 장애의 치료에 사용하기 위한 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 약학적 조합물.
비만의 치료에 사용하기 위한 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 약학적 조합물.
제 10항, 제 12항 또는 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 대사 장애가 타입 2 당뇨병인 방법 또는 용도.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 핵산 분자.
제 17항에 따른 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
제 18항에 따른 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포.