KR20160001480A - gHA1 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머 및 그를 포함하는 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 gHA1 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머 및 그를 포함하는 조류 인플루엔자 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 HA12-16 RNA 앱타머는 gHA1 단백질에 특이적으로 결합하여 세포 생존 능력을 강화하고, 이로 인해 숙주 세포로의 바이러스 감염을 억제하는 효과가 있다.

Description

gHA1 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머 및 그를 포함하는 약학 조성물{A RNA aptamer specifically binding to gHA1 protein and pharmaceutical composition including thereof}

본 발명은 gHA1 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머 및 그를 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

조류 인플루엔자(Avian influenza)는 높은 사망율 때문에 가금류 산업에 심각한 손상을 일으키는 급성 바이러스성 호흡기 질환이다. 최근 조류 인플루엔자 바이러스(AIV)에 의해 세계적으로 발생한 조류 인플루엔자는 잠재적으로 인간 사이에도 전염될 수 있어 공중 보건에 심각한 위협이 되고 있다. 인플루엔자 바이러스는 오르소믹소바이러스(Orthomyxoviridae)과에 속하고, 바이러스 외피의 표면에 존재하는, 2개의 주요 면역 표면 당단백질 성분인 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA)과 뉴라미니다제(neuraminidase, NA)의 조합에 따라 추가적인 하위 유형으로 분류된다[1,2].

바이러스 감염의 초기 단계에서, HA는 시알산(sialic acid)을 포함하는 숙주 호흡기 세포 수용체에 결합하고, 이에 따라 바이러스가 엔도솜(endosom) 경로를 통해 숙주 세포에 침입할 수 있다[3, 4]. HA는 구형 머리(globular head)와 줄기 영역(stem region)을 지닌 동형삼량체 막횡단 단백질(homotrimeric transmembrane protein)로서 이들 모두 막의 외부에 노출되어 있다[5]. 이들 영역은 HA의 기능적 특성에 영향을 주는 것으로 알려져 있는 N-결합 올리고당[6]을 포함한다[7,8]. 펩타이드 서열에서 당화 부위는 잘 보존되어 있는데, 이로써 HA 당화가 기능적으로 중요함을 시사한다[9]. HA는 전구체 단백질(HA0)로 합성되어, 단백질 가수분해를 거쳐 HA1 및 HA2 서브 유닛으로 분열된다. HA1은 세포막과의 초기 접촉을 매개하고, HA2는 막 융합을 담당한다[10,11]. HA는 감염-중화성 항체[4]와 핵산 앱타머[12]와 같은 항바이러스제에 대한 주요 표적(primary target)이다. 박테리아에서 발현되고 정제되는 재조합 HA1 서브 유닛은 인간에서 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하여[13], 항바이러스성 RNA 앱타머를 선별하기(screening)에 충분하다[14]. 당화를 유지하는 재조합 HA 단백질은, 향상된 HA 억제 및 바이러스 중화를 나타내는 배큘로바이러스/곤충(baculovirus/insect) 세포 시스템에서 발현되고 생산되고 있다[15].

한편, 앱타머는 특이 표적 분자에 높은 친화력으로 결합하는 핵산 리간드(nucleic acid ligands)이다. 앱타머는 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) 방법을 사용하여 임의의 서열을 가지고 있는 올리고뉴클레오티드 라이브러리에서 얻을 수 있다[16, 17]. 단백질 항체와 비교하여, 앱타머는 높은 친화력, 신속한 합성, 저 비용, 저온 민감도, 대규모 생산 및 화학적 변형의 용이성 등의 많은 장점을 가지고 있다[12]. 지금까지, 앱타머는 의료 진단을 위한 연구 시약, 바이러스 및 암에 대한 바이오 센서나 치료적 도구(therapeutic tools)로서 광범위하게 사용되어지고 있다[18, 19]. 이전에, 본 발명의 발명자는 생체 외(in vitro) 적혈구 응집을 억제하면서 HA1에 특이적으로 결합하는, 하위 유형 H5 AIV의 HA1에 대한 RNA 앱타머를 선별했다[14]. HA1-특이 RNA 앱타머 HAS15-5는 세균(bacteria)에서의 발현으로 인해 당화가 결여된 재조합 HA1-GST 융합 단백질을 사용하여 선별하였다[14]. 그러나, 비당화 HA보다는 당화 HA에 특이적인 RNA 앱타머가 숙주 세포에의 인플루엔자 바이러스 침입을 차단하고 억제하기에는 바람직할 것이다.

한국공개특허 제10-2013-0062053호 (2013. 6. 12 공개) 한국공개특허 제10-2013-0092225호 (2013. 8. 20 공개) 미국공개특허 제10-2010-0021489호 (2010. 1. 28 공개)

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본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 gHA1 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 gHA1 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

전술한 기술적 과제를 달성하기 위해, 본 발명에서는 gHA1(glycosylated Hemagglutinin) 단백질에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열을 포함하는 RNA 앱타머를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 RNA 앱타머 및 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 HA12-16 RNA 앱타머는 gHA1 단백질에 특이적으로 결합하여, 세포 생존 능력을 강화하고, 이로 인해 숙주 세포로의 바이러스 감염을 억제하는 효과가 있다.

도 1은 (A) 배큘로바이러스/곤충 세포 시스템에서 발현된 AIV HA 단백질의 SDS-PAGE 분석을 나타낸 그림으로서, 레인 1은 곤충 세포(TriEx Sf9) 배양의 전체 상층액이고, 레인 2와 3은 각각 통과액 및 Ni-NTA 친화도 컬럼을 통한 세척 용리액이며, 레인 4 내지 6은 이미다졸 용리에 의해 수집한 분획이고, 레인 7(화살표로 표시)은 겔 여과 크로마토그래피 후 정제된 gHA1이다. (B) PNGase F로 처리된 및 처리되지 않은 재조합 HA1의 이동을 화살표로 표시한 그림이다.
도 2는 SELEX와 RNA 앱타머 서열에 대한 RNA 라이브러리를 나타낸 그림으로서, (A) 시험관내 선택을 위한 RNA 풀의 서열이 표시되고, (B) SELEX의 12라운드를 거친 후에 선택된 RNA 앱타머의 4개 그룹과(빈도가 괄호로 기재됨) 각 그룹의 대표 RNA 서열을 나타낸 그림이다(각 그룹의 보존 서열은 밑줄그어져 있다).
도 3은 gHA1에 대해 선택된 4 RNA 앱타머 후보 및 비당화 HA에 특이적인 1개의 RNA 앱타머(HAS15-5)의 2차 구조를 나타낸 그림이다(각 RNA 앱타머 후보의 보존 서열은 회색으로 표시하였다).
도 4는 gHA1 단백질에 RNA SELEX 풀의 결합을 나타낸 그림으로, gHA1 결합 RNA의 상대적인 양을 나타낸 그래프이다.
도 5는 (A) gHA1 단백질에 결합하는 선택된 RNA 앱터머의 상대적인 백분율을 나타낸 그래프이고, (B) 고정 gHA1 단백질(0.5 μg)을 각 3'-바이오티닐화 RNA 시료(30 ng)와 함께 배양한 후, 스트렙타비딘-결합 HRP를 첨가하여 생성되는, gHA1-앱타머 복합체의 양을 흡광도 450 nm에서 측정한 그래프이다.
도 6은 (A) 인플루엔자 바이러스에 감염된 MDCK 세포의 생존율에 대한, 선택된 앱타머의 항바이러스 효과를 나타낸 그래프이고, (B) 세포의 바이러스 감염에 대한 HA12-16 효과의 현미경 분석을 나타낸 사진이다. (a) MDCK 세포 단독, (b) 인플루엔자 바이러스(0.1 TCID₅₀의 MOI)에 감염된 MDCK 세포, (c) 인플루엔자 바이러스 및 HA12-16 앱타머(30 pmol)로 처리된 MDCK 세포, (d) HA12-16 앱타머 단독으로 처리된 MDCK 세포. (HA 및 핵은 각각 녹색 및 청색 형광으로 나타나 있다.)

이상과 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 gHA1(glycosylated Hemagglutinin) 단백질에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열을 포함하는 RNA 앱타머를 제공한다.

서열번호 1(HA12-5): -GCUUCCAGGAAGAGAAGUGUCAUGUGAUCAGUCCUGGUGGGUGG-

서열번호 2(HA12-8): -GCUUGAAGCUAGCAGUAAGACUAGCGCUACGGAUGGGUGUGCG-

서열번호 3(HA12-14): -GCUUCCGGAGAGAAGGGUCAAAGUUGUGCGGGAGUGUGUUGUGG-

서열번호 4(HA12-16): -GCUUGACGGAGAUCAAGGGCGAGUCUCAUACCAAGUUGAUGGGG-

본 발명의 발명자들은 인플루엔자 바이러스의 gHA1 단백질과 특이적으로 결합하는 RNA 올리고뉴클레오타이드들을 연구하였으며, 40 뉴클레오타이드의 랜덤 서열을 함유하는 RNA 라이브러리로부터 SELEX법을 이용하여 gHA1 단백질과 친화력 있는 RNA 앱타머를 분리하였다. SELEX의 12연속 라운드 후에 얻어진 RNA 앱타머 라이브러리에서 그 단백질에 친화도가 있는 26개의 RNA 앱타머 후보물질을 분리하여 하기에 기재한 바와 같이 gHA1 단백질에 대한 친화도를 확인하였다.

앱타머는 저분자의 올리고뉴클레오타이드로 표적분자에 아주 밀접하고 특이하게 선택적으로 결합하므로 질병의 진단과 치료면에서 효과적이다. 또한, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 분자는 항체에 비해 크기가 월등히 작고, 표적분자와 높은 결합력으로 결합할 수 있기 때문에 항체 이상의 표적 친화력을 가지며, 또한 온도 변화에 민감하지 않으며, 변성이 되었다 하더라도 빠른시간 내 재생이 가능하다는 장점이 있다.

본 발명의 일 태양에서, 상기 gHA1 단백질은 조류 인플루엔자 바이러스에서 유래하는 것을 특징으로 하는 RNA 앱타머를 제공한다.

본 발명의 일 태양에서, 상기 조류 인플루엔자 바이러스는 H5 타입 조류 인플루엔자 바이러스인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 앱타머가 H5 AIV 감염, 특히, AIV의 H5 서브타입에 의한 감염을 앓는 개체를 치료하기 위해 투여될 수 있다. 본 발명의 앱타머는 또한 인플루엔자 유행 발생시 또는 유행이 위협되는 경우, 예방적 조치로 개체에게 투여될 수 있다. 상기 앱타머는 단일 투여량으로 또는 반복적인 투여로 투여될 수 있고, 선택적으로 서방형(slow release form)으로 투여될 수 있다. 투여는 상기 앱타머가 치료 대상 개체의 신체 내의 작용 부위에 도달할 수 있게 하는 수단에 의해, 예를 들면, 정맥내로, 근육내로, 피내로(intradermally), 경구로 또는 비강으로 이루어질 수 있다. 일반적으로, 앱타머는 멸균수용액과 같은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체 중에 담겨서 투여되고, 그 조성물은 하나 이상의 안정화제, 아쥬반트(adjuvant), 가용화제(solubilizer), 완충액 등을 더 포함할 수 있다. 개체의 개별적인 니즈에 따라, 개체의 연령, 체중, 전반적인 건강, 및 개체의 증상의 속성 및 정도 및 적용되는 치료 빈도와 같은 인자들을 고려하여, 정확한 투여 방법, 조성 및 특정한 투여량이 결정되고 적용시 조정될 것이다. 일반적으로, 투여되는 앱타머의 용량은 H5 감염을 앓는 환자를 치료하기 위해 투여되는 경우, 약 0.1 mg/kg 내지 약 l mg/kg 체중의 범위에 속한다. 통상적으로, 투여량은 예방적 수단으로 투여되는 경우, 약 절반으로, 즉, 약 0.05 mg/kg 내지 약 0.5 mg/kg 체중의 범위로 감소된다.

본 발명의 일 태양에서, 상기 RNA 앱타머는 조류 인플루엔자 바이러스의 gHA1 단백질에 높은 친화도를 보이는 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 HA12-16 RNA 앱타머인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 아니한다.

또한, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 태양에서, 상기 조류 인플루엔자는 H5 타입인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 아니한다.

또한, 본 발명은 상기 RNA 앱타머 및 담체를 포함하는 약학 조성물인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 RNA 앱타머는 그 자체로, 또는 이것을 약학적으로 허용되는 담체와 혼합한 약학조성물의 일부로서 대상에 제공될 수 있다.

인플루엔자 바이러스의 표면 당단백질 헤마글루티닌(HA)은 시알산 함유 숙주 세포 수용체에 바이러스 부착에 대한 책임이 있으며, 바이러스 감염의 초기 단계를 용이하게 한다. 본 발명에서는 SELEX의 12주기 후 HA 단백질(gHA1)의 당화 수용체 결합 도메인에 특이적인 RNA 앱타머를 격리하고, 선택된 앱타머가 숙주 세포에 바이러스 감염을 억제하는 지를 조사하였는 바, 니트로셀룰로오스 필터 결합과 효소-결합 면역 분석(ELISA) 실험은 HA12-16 RNA 앱타머가 gHA1 단백질에 특이적으로 결합함을 보였으며, 세포 생존율 분석은 HA12-16 RNA 앱타머가 세포 생존 능력을 강화하여 숙주 세포에 바이러스 감염을 억제한 것으로 나타났다. 또한, 면역 형광 현미경 분석은 HA12-16 RNA 앱타머가 인플루엔자 바이러스 HA의 수용체 결합 부위를 중화하여 숙주 세포에 바이러스 부착을 억제하는 것을 보여주었다. 이는 상기 RNA 앱타머가 적절한 치료 처방을 통해 인플루엔자에 대한 항바이러스 시약으로 개발될 수 있음을 알 수 있었다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위한 실시예를 제시한다.

그러나, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 설명하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 서열번호 1( HA12 -5) RNA 앱타머의 제조

(1) 곤충 세포 배양

곤충 세포의 현탁 배양을 위해, Sf21(Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 TriExTM Sf9(Novagen, Darmstadt, Germany) 세포를 500 ㎖ 유리 삼각 플라스크에 SF-900TM 무혈청 배지(Gibco BRL, Carlsbad, CA) 및 SFX-InsectTM 세포 배양 배지(Hyclone, Logan, UT) 100 ㎖를 각각 넣어 회전 진탕기에서 90 rpm, 27 ℃로 배양하였다. 곤충 세포를 단층 배양(monolayer cultures)으로 유지하기 위해, 신선한 배지로 5.0 x 10⁵ 세포/㎖의 종배양(seed cultures)에서 2.5 x 10⁴의 세포/㎖ 세포 밀도로 희석하여 3일마다 계대배양하였다.

(2) 재조합 배큘로바이러스 제조

인플루엔자 바이러스 균주 A/wild-duck/Korea/ES/2004(H5N2)로부터 헤마글루티닌(HA1) 수용체 결합 도메인을 코딩하는 전장(full-length) 유전자를 선행기술에 기재된 바에 따라, 얻었다[14]. HA1 유전자를 PCR로 증폭하고, XhoI와 HindIII으로 절단한 다음, 곤충 세포에서 단백질 분비를 위한 신호 펩타이드와 N-말단에 6 히스티딘-태그(His-tag)를 포함하는, pBAC6 배큘로바이러스 전이 벡터(Novagen, Darmstadt, Germany)로 서브클로닝하였다.

BD BaculoGoldTM 배큘로바이러스 발현 시스템 프로토콜(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)에 기재된 방법에 따라, 재조합 pBAC6 플라스미드 및 선형 배큘로바이러스 DNA를 Sf21 곤충 세포로 동시 형질 주입시켰다. 요약하면, 재조합 pBAC6/HA 플라스미드(2 μg) 및 선형 배큘로바이러스 DNA(0.5 μg)를 5분 동안 셀펙틴 시약(Cellfectin reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 혼합한 후, SF-900 무혈청 배지 1 ㎖에 첨가하였다. 실온에서 15분 동안 인큐베이션한 후, DNA 혼합물을 T25 플라스크에 들어있는 Sf21 세포(2.0 × 10⁶ 세포/㎖)에 첨가하고, 앞뒤로 흔들어 주면서 28 ℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 진동 인큐베이션 후, DNA 혼합물을 제거하고, 신선한 SF-900 무혈청 배지 4 ㎖를 곤충 세포에 첨가하였다. 그 후, 곤충 세포를 4일 동안 28 ℃에서 배양하고, 5분 동안 1000 × g에서 원심 분리하여, 재조합 배큘로바이러스(pBAC6/HA)가 상승된 상층액을 회수하였다.

(3) gHA1 의 정제

재조합 pBAC6/HA 배큘로바이러스로 감염된 TriEx-Sf9 세포를 현탁 배양하여 gHA1 단백질을 발현시켰다. 현탁 배양으로 배양된 TriEx-Sf9 세포(2.5 × 10⁵ 세포/㎖)를 3.0의 감염다중도(multiplicity of infection, MOI)를 가진 재조합 pBAC6/HA 배큘로바이러스로 감염시킨 후 3일 동안 28 ℃에서 배양하였다. 배큘로바이러스로 감염 후, 5 분간 1,000 × g에서 원심 분리하여, 분비된 단백질을 함유하는 배양 상층액을 얻었다. 농축 및 투석 여과(diafiltration)를 위하여, 모든 바이러스 상층액을 접선 플로우 여과 시스템(tangential flow filtration system, PALL, Port Washington, NY)을 이용하여, 120 ㎖/분 유속으로 MWCO 5 kDa의 폴리에테르설폰(polyethersulfone, PES) 막을 통해 평형 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM 염화나트륨)으로 한외여과(ultra-filteration)하였다. 평형 완충액으로 미리 평형화된 친화성 컬럼(5 ㎖ Ni-NTA His Trap affinity column, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)에 농축된 시료를 로드(load)하였다. 컬럼은 2회 세척하였고, 평형 완충액에서 0.1에서 1 M 이미다졸 구배로 재조합 gHA1을 용리시켰다. 용리된 분획을 수거하여 센트리콘 플러스-20(Centricon Plus-20, Millipore, Billerica, MA)으로 농축시키고, His-tagged gHA1 단백질의 존재를 12 % SDS-PAGE로 분석하였다.

이어서 50 kDa에 해당하는 밴드로 확인된 gHA1-함유 분획을 HiLoad Superdex 200(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) 상에 로드하고, 유속 1.5 ㎖/분으로 용리시켰다. 순수 단백질 분획을 완충액(20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1.0 mM EDTA, 5 mM DTT, 20 % glycerol, 0.5 %(v/v) Triton X-100, 150 mM NaCl)에 대해 투석하였다. 대조 표준물질로서 소 혈청 알부민(BSA)을 사용하고, 브래드포드 단백질 분석 키트(Bio-Rad)를 사용하여 정제된 gHA1을 정량하였다. 정제된 단백질의 확인은 마우스 AIV H5N1 HA 다클론 항체(mouse AIV H5N1 HA polyclonal antibodies, ProSci, Poway, CA) 및 항-마우스 IgG-홀스래디쉬 과산화효소 복합체(anti-mouse IgG-horseradish peroxidase conjugate, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX)의 2차 항체를 사용한 면역블러팅으로 결정하였다.

(4) 재조합 HA1 당단백질의 탈당화

재조합 gHA1 단백질의 당화 상태는 복합 올리고당을 N-결합 당화 위치에서 분해하는 펩티드-N-글리코시다제 F(Peptide-N-Glycosidase F, PNGase F)로 측정하였다. 요약하면, 제조업체의 프로토콜에 따라 정제된 gHA1(3 μg)을 버퍼(0.5 % SDS, 4 mM DTT)에서 변성시키고, 10분 동안 100 ℃로 가열하여, 그 후 PNGase F(New England Biolabs, Beverly, MA)와 함께 인큐베이션하였다. 반응 생성물을 12 % SDS-PAGE로 용해시켰고, 이후 HA1의 존재는 전술한 바와 같이 면역블러팅에 의해 결정하였다.

(5) gHA1 에 대한 RNA 앱타머의 시험관내 선택

SELEX 절차를 수행하기 위해, 전술한 바와 같이 PCR 및 임의의 뉴클레오티드 40개를 포함하는 DNA 주형(template)의 시험관 내 전사에 의해 임의의 서열(RNA library)의 RNA 풀(pool)을 제조하였다[20]. His-tagged HA1 당단백질(50 μg)을 Ni-NTA 스핀 트랩 컬럼(Ni-NTA spin trap columns, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)에 고정하였다. 임의의 RNA 라이브러리(6 μg)를 85 ℃에서 5분 동안 변성시킨 후, 실온의 바인딩(binding) 버퍼(20 mM sodium phosphate, pH 7.5, 500 mM NaCl, and 20 mM imidazole)에서 인큐베이션하였다. SELEX를 반복할 때마다, 별도의 Ni-NTA 스핀 트랩 컬럼을 통해 RNA 풀을 통과함으로써 컬럼에서 Ni-NTA 수지에 결합하는 RNA를 제거하는 음성 선택(negative selection)을 수행하였다. 음성 선택을 세번 반복한 후, 결합되지 않은 RNA를 수집하여, His-tagged gHA1으로 충전된 새로운 NI-NTA 스핀 트랩 컬럼에 다시 로드하였다. 이후, 바인딩 버퍼로 컬럼을 3회 세척하고, 결합된 RNA를 용리 버퍼(elution buffer, 20 mM sodium phosphate, pH 7.5, 500 mM NaCl, and 300 mM imidazole)로 용리시켰다. RNA는 페놀-클로로포름 추출 및 후속 에탄올 침전으로 정제하였다. 정제된 RNA는 RT-PCR과 시험관내 전사를 실시하여 SELEX의 다음 라운드(next round)를 위한 RNA 라이브러리를 생성하였다.

SELEX에 사용되는 His-tagged HA1 당단백질의 양은 선택 과정의 엄격성을 향상시키기 위해 50에서 5 μg로 점차 감소시켰다. SELEX를 12 라운드 거친 후, 증폭된 cDNA를 pGEM T-이지 벡터(pGEM T-Easy vector, Promega, Madison, WI)에 클로닝하였고, 이후 42 ℃ 열 충격(heat shock)으로 대장균에 형질전환시켰다. 각 클론의 플라스미드 DNA를 제조하고 서열분석하였으며, 각 RNA 앱타머는 RNA 앱타머 서열을 포함하고 있는 선형 재조합 플라스미드를 이용한 시험관내 전사로 제작하였다. 선택된 RNA 앱타머 서열의 이차 구조는 Zuker 알고리즘(Zuker’s algorithm)에 기초한 M-폴드 웹 서버(M-Fold web server)에 의해 예측하였다[21].

SELEX의 최종 라운드에서 유래한 RNA 앱타머의 4개의 그룹 중 첫번째의 임의의 40개의 염기서열은 다음과 같다.

서열번호 1(HA12-5): -GCUUCCAGGAAGAGAAGUGUCAUGUGAUCAGUCCUGGUGGGUGG-

실시예 2. 서열번호 2( HA12 -8) RNA 앱타머의 제조

<실시예 1>과 동일하게 상기 (1) 곤충 세포 배양, (2) 재조합 배큘로바이러스 제조, (3) gHA1의 정제, (4) 재조합 HA1 당단백질의 탈당화, (5) gHA1에 대한 RNA 앱타머의 시험관내 선택에 대한 실험을 수행하였으며, SELEX의 최종 라운드에서 유래한 RNA 앱타머의 4개의 그룹 중 두번째의 임의의 40개의 염기서열은 다음과 같다.

서열번호 2(HA12-8): -GCUUGAAGCUAGCAGUAAGACUAGCGCUACGGAUGGGUGUGCG-

실시예 3. 서열번호 3( HA12 -14) RNA 앱타머의 제조

<실시예 1>과 동일하게 상기 (1) 곤충 세포 배양, (2) 재조합 배큘로바이러스 제조, (3) gHA1의 정제, (4) 재조합 HA1 당단백질의 탈당화, (5) gHA1에 대한 RNA 앱타머의 시험관내 선택에 대한 실험을 수행하였으며, SELEX의 최종 라운드에서 유래한 RNA 앱타머의 4개의 그룹 중 세번째의 임의의 40개의 염기서열은 다음과 같다.

서열번호 3(HA12-14): -GCUUCCGGAGAGAAGGGUCAAAGUUGUGCGGGAGUGUGUUGUGG-

실시예 4. 서열번호 4( HA12 -16) RNA 앱타머의 제조

<실시예 1>과 동일하게 상기 (1) 곤충 세포 배양, (2) 재조합 배큘로바이러스 제조, (3) gHA1의 정제, (4) 재조합 HA1 당단백질의 탈당화, (5) gHA1에 대한 RNA 앱타머의 시험관내 선택에 대한 실험을 수행하였으며, SELEX의 최종 라운드에서 유래한 RNA 앱타머의 4개의 그룹 중 네번째의 임의의 40개의 염기서열은 다음과 같다.

서열번호 4(HA12-16): -GCUUGACGGAGAUCAAGGGCGAGUCUCAUACCAAGUUGAUGGGG-

< 실험예 >

(1) gHA1에 대한 RNA 앱타머의 결합

각 라운드에서 RNA 라이브러리의 결합 친화도를 비교하기 위해, 반-정량적(semi-quantitative) RT-PCR을 전술한 바와 같이 실시하였다[14]. 요약하면, gHA1 단백질 1.5 μg을 로드하고, Ni-NTA 스핀 트랩 컬럼에 고정하였다. SELEX의 각 라운드에서의 RNA 풀 4 μg을 컬럼에 로드하였다. 이후, RNA-단백질 복합체를 포함하는 컬럼을 SELEX에 사용하는 바인딩 버퍼 200 μL로 3회 세척하고, 결합되지 않은 RNA를 통과액으로 수집하였다. 이어서, gHA1 단백질에 결합된 RNA를 SELEX에 사용된 용출 버퍼 200 ㎕로 3번 연속 세척하여 컬럼으로부터 용리시켰다.

이어서 단백질-결합 RNA를 페놀-클로로포름 및 에탄올 침전에 의해 추출하고, 각 용리로부터 추출한 RNA에 대하여 앱타머-특이적 프라이머를 이용한 RT-PCR을 실시하였다. PCR의 조건은 다음과 같다: 30초 동안 94 ℃, 30초 동안 55 ℃ 및 30초 동안 72 ℃의 11회(11 cycles). PCR 생성물은 각각의 용리액에서 증폭된 DNA의 양을 측정하기 위해 1.5 % 아가로스 겔상에서 전기영동시키고, 증폭된 겔상에서의 DNA 밴드는 겔-프로 분석기 소프트웨어(Gel-Pro analyzer software, Media Cybernetics, Bethesda, MD)를 사용하여 정량하였다.

또한, SELEX의 최종 라운드에서 유래한 각 RNA 앱타머 후보를 비교하기 위해, 니트로셀룰로오스 필터 바인딩 분석(nitrocellulose filter binding assay)을 수행하여, gHA1 단백질에 대한 RNA 앱타머의 결합 친화도를 측정하였다[22]. 시험관내 전사에 의해 생성된 각 RNA 앱타머를 탈인산화하여, T4 폴리뉴클레오티드 키나제(New England Biolabs)에 의해 [γ-³²P] ATP로 5'-말단 표지했다. 5'-³²P 말단 표지된 RNA 앱타머(5 nM)를 실온에서 30분 동안 바인딩버퍼(30 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, and 1.3 mM MgCl₂)에서 gHA1 단백질(500 nM)과 함께 인큐베이션시켰다.

진공 하에서 96-웰 도트-블롯 장치(96-well dot-blot apparatus, Bio-Rad)를 사용하여 니트로셀룰로스 막(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) 아래에 양으로 하전된 N+ 하이본드(Hybond) 막으로 이루어진 이중 필터 상에 반응 혼합물을 여과시켰다. 이후, 막을 세척 버퍼(20 mM Tris-HCl, pH 7.5, and 50 mM NaCl)로 두번 세척하고, 실온에서 건조시켰다.

이후, 니트로셀룰로오스 막과 하이본드 N+ 막 각각에 보유된 단백질-결합 RNA 및 유리 RNA에 남아있는 방사능을 분석하였다. Cyclone PhosphorImager(Packard Instrument Co., Meriden, CT)에서 방사능을 측정하고 정량하였다. 그리고 단백질-결합 RNA 분획은 2개 막에 존재하는 RNA의 총량에 대한 니트로셀룰로오스 막에 남아있는 RNA의 양을 이용하여 결정하였다.

(2) 효소-결합 면역 분석(ELISA)

3'-바이오티닐화 RNA(3′-biotinylated RNAs)는 3'-말단 바이오티닐화 키트(Pierce, Rockford, IL)를 사용하여 RNA의 3'-말단에 바이오티닐화된 시티딘을 결찰(ligation)하여 제조하였다. 간략하게, 비표지된 RNA들(50 pmol)은 5분 동안, 85 ℃에서 가열하고, 즉시 얼음에 넣은 후, RNA 리가아제(RNA ligase) 반응 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 7.8, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, and 1 mM ATP) 내 반응 혼합물(40 U RNase inhibitor, 1 nM biotinylated cytidine(bis) phosphate, T4 RNA ligase, and 30% polyethylene glycol)에 첨가하였다. 결찰 효율을 증가시키기 위해 반응 혼합물을 16 ℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 3'-바이오티닐화 RNA를 페놀-클로로포름 및 에탄올 침전에 의해 추출하였다.

효소-결합 면역 분석(ELISA)을 위하여, 니켈-코팅된 플레이트(Pierce, Rockford, IL)의 웰을 4 ℃에서 정제된 gHA1(0.5 μg)과 함께 밤새 인큐베이션하였다. 트윈이 들어있는 인산 버퍼 식염수(PBS-T; 0.1% Tween 20 in PBS, pH 7.4)로 웰을 3번 세척하였고, 비-특이적 결합을 피하기 위하여 1시간 동안 실온에서 PBS 중 1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 차단(block)하였다. 세척 후, 3'-바이오티닐화 RNA 30 ng를 웰에 첨가하고(웰당 PBS 100 μL) 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그후, 각 웰을 PBS-T로 3회 세척하였고, 실온에서 1시간 동안 스트렙타비딘-결합 고추냉이 과산화효소(PBS-T에 1:8000으로 희석, Pierce) 100 ㎕와 함께 인큐베이션하여 단백질-결합 바이오티닐화 RNA를 측정하였다. 세척 후, 발색은 3,3’,5,5’-테트라메틸벤지딘(tetrametylbenzidine, TMB) 기질 용액(Pierce, Rockford, IL) 100 μl를 각 웰에 첨가하여 개시하고, 2 M의 황산을 첨가하여 중지하였다. 각 웰의 흡광도를 VICTOR X3 다중 레이블 플레이트 리더(VICTOR X3 Multilabel Plate Reader, PerkinElmer, Waltham, MA)를 사용하여 450 nm에서 측정하였다.

(3) MDCK 세포 생존율 측정(MTT Assay)

원위세뇨관(Madin-Darby Canine Kidney, MDCK) 세포(KCLB, 서울, 한국)는 열-불활성화된 10 % 소 태아 혈청과 1 % 페니실린-스트렙토마이신(Hyclone, Logan, UT)을 포함한 Dulbecco's modified Eagle's 배지(DMEM, Hyclone, Logan, UT)에서 배양했다. 11-일령 발육란(embryonated hen eggs)의 요막강(allantoic cavity)에서 배양된 인플루엔자 바이러스 균주 A/Victoria/210/2009(Reassortant NYMC X-187) H3N2를 사용하여 MDCK 세포에 감염시켰다. 조직 배양 감염 용량이 50 % 감염된 세포(TCID50)로 이어지기 때문에 감염에 사용된 바이러스의 역가는 MDCK 세포의 발현을 동반한 감염으로 평가하였다[23]. 실험 24시간 전에 MDCK 세포를 96-웰 플레이트(5×10³/well) 상에 접종하였다. 24시간 인큐베이션한 후, 세포를 그대로 유지하거나, 선택된 RNA 앱타머(50 nm)의 존재 또는 부재하에 0.1 TCID₅₀의 MOI의 인플루엔자 바이러스 H3N2로 감염시켰다. 세포를 추가로 24시간 동안 37 ℃에서 무혈청 DMEM 배지에서 인큐베이션하였다. 그 후 배지를 제거하고, PBS에 녹인 5 ㎎/㎖ MTT(Sigma)를 각 웰에 첨가하고, 37 ℃에서 4시간 동안 인큐베이션하여 세포 생존율을 측정하였다. 상층액을 제거하고, 포르마잔 염료(formazan dyes)를 100 μL/웰 디메틸설폭시드(dimethylsulfoxide, DMSO, Sigma)에 용해하였다. 흡광도는 VICTOR X3 다중 레이블 플레이트 리더(VICTOR X3 Multilabel Plate Reader, PerkinElmer, Waltham, MA)를 사용하여 570 nm에서 측정하였다.

(4) MDCK 세포의 면역형광 염색 분석(Immunofluorescence staining analysis)

실험 전에 8-웰 챔버 슬라이드 글라스(Nunc, Penfield, NY)에 MDCK 세포를 5×10⁴/wells로 넣었다. 세포를 PBS로 두번 세척한 다음, 바이러스 및 지정된 앱타머를 포함하는 혼합물에 첨가하였다. MDCK 세포는 그대로 유지 또는 HA12-16 RNA 앱타머(100 nM)와 30분 전-배양(30 min of pre-incubation) 또는 미처리하여 0.1 TCID₅₀의 MOI의 인플루엔자 바이러스 H3N2로 감염시켰다. 또한 대조군으로서 바이러스 감염없이 RNA 앱타머로 MDCK 세포를 처리했다. 24시간 배양 후, 3 % 파라포름알데히드로 고정한 후, 세포를 0.5 % 트리톤 X-100(0.5% Triton X-100)으로 투과시켰다.

배양물을 마우스 항-H3(H3N2) 항체(mouse anti-H3(H3N2) antibody, PBS에서 1:100으로 희석, Abcam, Cambridge, UK)와 함께 인큐베이션하여 인플루엔자 바이러스 항원 HA를 검출하였다. 항체는 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였고, 세척할 때마다 적어도 5분 동안 PBS로 3회 세척하였다. FITC-결합 염소 다클론 항-마우스 면역글로블린(goat polyclonal anti-mouse immunoglobulin) 2차 항체(Abcam)로 1차 항체를 검출하였다. 핵은 DAPI(시그마) 염색법을 사용하여 확인하였다. Axio 영상 A1 현미경(Axio Imager A1 microscope, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)이 장착된 AxioCam MRc5 디지털 카메라를 사용하여 세포의 면역 형광 이미지를 얻었다.

<결과>

(1) 곤충 세포로부터의 gHA1의 정제

AIV의 헤마글루티닌 HA1 서브 유닛은 이전에 비당화 단백질을 생산하는 대장균에서 발현되고, 정제되었다[14]. HA는 구형의 머리 및 줄기 영역을 가진 N-당화된 당단백질이고[24], 적절한 번역 후 당화 및 단백질 접힘(folding)이 그 기능에 있어서 필수적일 수 있다[9]. 따라서, 본 발명의 발명자들은 AIV의 당화 HA를 얻기 위해 배큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 곤충 세포에서 재조합 HA1을 발현시켰다[15]. 배큘로바이러스 발현 시스템은 곤충 세포에서 번역 후 변형된, 생물학적으로 활성이 있는 재조합 단백질을 생성할 수 있다. 전장 HA1 유전자를 운반하는 pBAC6 배큘로바이러스 플라스미드를 클로닝하여, SF21 곤충 세포 내로 형질주입하였다. 감염된 곤충 세포의 형태는 점차 커지고, 불규칙적으로 되었다(데이터 미도시). 감염 4일 후, 분비된 재조합 HA1을 수집하여 정제하였다. His-tagged gHA1 재조합 단백질은 Ni-NTA His Trap 친화성 크로마토그래피 및 겔여과를 함께 사용하여 정제하였다.

정제된 단백질은 SDS-PAGE로 분리하였고, 면역블러팅 분석으로 확인하였다. 도 1(A)에 나타난 바와 같이, His-tag 융합된 gHA1 단백질은 SDS-PAGE에서 50 kDa 분자량을 가진 하나의 밴드로 나타났다. gHA1 분자량은 His-tag과 10 kDa의 시그널 서열을 포함하여 약 46 kDa로 계산되지만, 아마도 당화로 인해, SDS-PAGE에서 50 kDa의 약간 더 높은 분자량으로 나타난 것으로 추측된다.

정제된 재조합 HA1이 번역 후 가공되는 과정 동안에 N-당화되었는지 여부를 확인하기 위해, 정제된 단백질을 단백질로부터 글리칸을 분리하는 PNGase F로 처리하였다. 도 1(B)에 나타난 바와 같이, PNGase F-처리된 시료는 글리칸의 손실로 인해 밴드는 좀 더 이동하였고, 이때의 비당화 HA1의 예상 크기는 약 46 kDa이다. 따라서, 정제된 재조합 HA 단백질은 N-당화된 상태로 이후 RNA 앱타머 선택 과정(SELEX)에서 사용되었음을 알 수 있었다.

(2) 당화 헤마글루티닌에 대한 RNA 앱타머의 선택

SELEX를 사용하여 AIV의 gHA1에 특이적인 항바이러스성 RNA 앱타머를 얻기 위하여, 처음에 40개의 임의의 뉴클레오티드(~1024 핵산 서열)를 함유하는 RNA 라이브러리를 PCR 및 이후 DNA 주형(도 2(A))의 시험관내 전사에 의해 제조하였다. 선택 과정에서, 라운드를 진행함에 따라 gHA1 단백질에 결합하는 RNA의 엄격성을 증가시키면서 12라운드를 수행하였다. 5라운드를 시작하면서, 각 후속 라운드에서 단백질 농도를 감소시켜 더 엄격한 조건을 사용하였다: 25 μg(라운드 5-6), 12.5 μg (라운드 7-8), 6.25 μg(라운드 9-10) 및 5 μg(11-12 라운드).

12 라운드의 선택과 증폭 후, 최종 라운드의 증폭된 cDNA를 서브클로닝한 후, 26 개별 앱타머 클론을 서열분석하였다. 이들 클론의 축퇴성(degenerated) 서열에 기초하여, 26개 클론의 서열을 4개 그룹으로(도 2(B)) 분류하였다. 선택된 RNA 앱타머의 개체수 빈도는 백분율 순위(도 2(B))로 42.3 > 26.9 > 19.2 > 11.5% 이었다. 각 RNA 앱타머 그룹은 gHA1 단백질에 특이적 결합 부위로 간주될 수 있는 보존 서열을 갖는다. 12번째 선택 풀에서 확인된 4개의 RNA 앱타머 서열은 Zuker 알고리즘을 기초한 M-폴드 프로그램을 사용하여 RNA 2차 구조에 대해 예측했다[21].

RNA 앱타머는 다수의 스템 및 루프 구조를 포함하는 것으로 보이고, 여기서, 보존 서열은 RNA 이차 구조(도 3)의 스템-및-루프 구조(stem-and-loop region)에 주로 존재한다. 각 RNA 앱타머에서의 이러한 보존 서열은 HA1 단백질과의 상호 작용을 용이하게 하기 위해 노출될 것으로 추정된다. 다른 서열의 스템 구조는 단지 RNA의 2차 구조를 안정화할 수 있는 반면, 보존 서열은, gHA1에 특이적인 결합 모티프(binding motif)를 구성할 수 있다[14,20,25].

반복 SELEX 주기의 12라운드 후, 12번째 RNA 풀의 gHA1 단백질 결합 친화력을 최초 RNA 풀의 결합 친화력과 비교하였고, 5번째 및 9번째 RNA 풀은 표적 단백질에 결합된 RNA의 반-정량적인 RT-PCR 증폭을 통해 비교하였다(도 4). 이 실험을 위해, 각 라운드에서의 동일한 양의 RNA를 gHA1 단백질로 로드된 친화도 컬럼에 로드했다. 친화도-용리 분획(gHA1 결합 RNA)을 수집하여 RT-PCR을 실시하였다. PCR 사이클은 cDNA 증폭의 포화를 방지하기 위해 11주기로 한정하였다[14]. cDNA를, gHA1 결합 RNA의 양을 반영하는, 아가로스겔 상의 에티디움 브로마이드 염색으로 확인하고 정량하였다. 증폭된 cDNA의 정량에 기초하여, 12 라운드 RNA 풀은 관련이 없는 RNA 서열(도 4)를 포함하는 음성 대조군 또는 RNA 풀의 다른 라운드보다 gHA1에 더 강력히 결합했다.

(3) 선택된 앱타머 후보의 결합 친화도 분석

선택된 앱타머 후보의 gHA1에 대한 결합 친화도를 평가하기 위해, 본 발명의 발명자들은 단백질-RNA 상호 작용을 분석하기 위해 니트로셀룰로오스-필터 결합에 대한 이중-필터 분석을 수행하였다[22,26]. 탈인산화 RNA 앱타머를 T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 [γ-³²P] ATP로 말단 표지했다. 각 ³²P-말단 표지된 RNA 앱타머(5 nM)를 실온에서 30분 동안 gHA1(500 nM)과 함께 배양하고, 반응 혼합물을 니트로셀룰로오스 막(0.45 μM)을 함유하는 이중 필터를 통해 여과하였다. 도 5(A)에 도시한 바와 같이 단백질에 결합된 방사성 RNA 앱타머의 시각화를 위한 니트로셀룰로오스 막의 노출 후, 방사능을 정량화하고 표준화하였다. 이전에 비당화 HA1 단백질[14]에 대해 선택된, RNA 앱타머 HAS15-5는, 당화 HA1 단백질에는 크게 결합하지 않았다. 반면, gHA1에 대한 선택된 RNA 앱타머 후보 중, HA12-16 앱타머는 가장 높은 친화도를 나타냈다.

표적 단백질, gHA1에 대한 HA12-16 앱타머의 결합 친화도를 측정하기 위한 다른 시도로, 우리는 고정된 표적 단백질에 3'-바이오티닐화 앱타머 RNA를 첨가하여 샌드위치 ELISA 분석(sandwich ELISA assay)을 수행하였다. 도 5(B)에 도시된 바와 같이, HA12-16 앱타머 RNA는 최초 RNA 라이브러리와 HAS 15-5 앱타머와 같은 다른 RNA들에 비해 더 높은 흡광도 값을 나타내었다. 이러한 결과는 gHA1에 대한 선택된 RNA 앱타머(HA12-16)가 이전에 비당화 HA1에 대해 선택된 HAS15-5 RNA 앱타머와 다르다는 것을 나타낸다.

(4) 선택된 앱타머의 항바이러스 활성 평가

바이러스 표면 당단백질 HA는 바이러스 및 숙주 세포막 간의 막 융합 매개에서 중요한 역할을 한다[4,12]. 우리는 gHA1 특이 RNA 앱타머가 숙주 세포에서의 결합에 의해 바이러스 감염을 억제하고, 이에 따라 인플루엔자 바이러스에 노출된 숙주 세포의 생존을 촉진한다는 가설을 세웠다. 이 가설을 시험하기 위해, 우리는 숙주 세포 생존율 측정을 수행함으로써 gHA1 바이러스 표면 단백질을 표적하는 RNA 앱타머 후보들의 항 바이러스 효과를 조사하였다. MDCK 세포를 0.1 MOI에서 인플루엔자 바이러스 H3N2로 감염시켰고, 선택된 RNA 앱타머 후보로 처리하였다. 숙주 세포에 바이러스 감염을 촉진하기 위해 24시간 배양한 후, 세포 생존율을 MTT 시약을 사용하여 측정하였다.

도 6(A)에 도시된 바와 같이, 50 % 이상의 숙주 세포가, 1개의 RNA 앱타머 후보(HA12-5)를 제외하고, gHA1 특이 RNA 앱타머의 존재하에서 살아 남았다. 또한, 최초 RNA 풀과 비당화 HA1(HAS15-5)에 특이 RNA 앱타머는 다른 RNA 앱타머 후보에 비해 숙주 세포에서 바이러스 감염을 억제하지 않았다. 앱타머 후보 중, HA12-16 앱타머는 감염되지 않은 세포에서와 유사한 세포 생존을 나타내어 가장 높은 항바이러스 활성을 나타내었다. 중요한 것은, 결합 분석(도 5(A))에 의해 밝혀진 바와 같이, 세포 생존 능력의 정도는 gHA1에 대한 RNA 앱타머의 결합 친화도와 양의 상관 관계가 있다. 이러한 결과는 가장 유효한 앱타머, HA12-16가 gHA1 바이러스 표면 단백질에 강하게 결합하여 인플루엔자 감염을 방지하고, 그것에 의해 숙주 세포의 사망률은 감소시키는 것을 나타낸다.

추가로 숙주 세포에 바이러스 결합 및 침입을 차단함에 있어서 HA12-16 앱타머의 항바이러스 활성을 확인하기 위해, 우리는 바이러스 감염을 받은 세포의 형광 현미경 분석을 수행하였다. 분석을 위해, MDCK 세포를 24시간 동안 37 ℃에서 HA12-16 앱타머 존재/비존재 하에서 인플루엔자 바이러스와 함께 배양하였다. 인플루엔자 바이러스의 존재는 항-HA 1차 항체에 결합한 FITC-결합 2차 항체로 형광분석하였다.

앱타머-gHA1 결합(도 6(B))을 통해 세포막에 바이러스 부착의 억제로 인하여 HA12-16 앱타머의 첨가가 FITC-형광을 현저히 감소시킨 반면, 바이러스에 감염된 MDCK 세포는 세포막에 부착된 바이러스 때문에 현저히 형광을 나타내었다. 세포를 HA12-16 앱타머로만 처리하였을 때, 세포에서의 FITC 형광은 바이러스와 앱타머로 처리한 것과 유사한 것으로 나타났다. 이 결과로써 HA12-16 RNA 앱타머는 바이러스 복제 억제를 가져오는 인플루엔자 바이러스 HA의 수용체 결합 부위를 중화하여 숙주 세포에 대한 바이러스 부착을 억제하는 것을 알 수 있었다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> A RNA aptamer specifically binding to gHA1 protein and pharmaceutical composition including thereof <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 44 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> RNA library <400> 1 gcuuccagga agagaagugu caugugauca guccuggugg gugg 44 <210> 2 <211> 43 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> RNA library <400> 2 gcuugaagcu agcaguaaga cuagcgcuac ggaugggugu gcg 43 <210> 3 <211> 44 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> RNA library <400> 3 gcuuccggag agaaggguca aaguugugcg ggaguguguu gugg 44 <210> 4 <211> 44 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> RNA library <400> 4 gcuugacgga gaucaagggc gagucucaua ccaaguugau gggg 44

Claims (7)

1. gHA1(glycosylated Hemagglutinin) 단백질에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열을 포함하는 RNA 앱타머.
2. 제1항에 있어서,
   상기 gHA1 단백질은 조류 인플루엔자 바이러스에서 유래하는 것을 특징으로 하는 RNA 앱타머.
3. 제2항에 있어서,
   상기 조류 인플루엔자 바이러스는 H5 타입 조류 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 하는 RNA 앱타머.
4. 제1항에 있어서,
   상기 RNA 앱타머는 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA 앱타머.
5. 제1항 내지 제4항의 RNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 예방 및 치료용 약학 조성물.
6. 제5항에 있어서,
   상기 조류 인플루엔자는 H5 타입인 것을 특징으로 하는 조류 인플루엔자 예방 및 치료용 약학 조성물.
7. 제1항 내지 제4항의 RNA 앱타머 및 담체를 포함하는 약학 조성물.

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