KR20150143778A - 미토콘드리아 단백질 작제물 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

무결함 세포 내에 미토콘드리아를 유입시킬 수 있는 기능성 미토콘드리아 단백질을 포함하는 신규한 융합 단백질 작제물이 개시된다. 개시된 융합 단백질 및 이의 조성물에 의해 미토콘드리아 장애를 치료하는 방법이 추가로 개시된다.

Description

미토콘드리아 단백질 작제물 및 이의 용도{MITOCHONDRIAL PROTEINS CONSTRUCTS AND USES THEREOF}
기능성 미토콘드리아 단백질을 포함하는 신규한 융합 단백질 작제물이 개시된다. 개시된 융합 단백질 및 이에 대한 조성물에 의해 미토콘드리아 장애를 치료하는 방법이 추가로 개시된다.
선행기술
현재 개시하는 대상에 대한 배경기술에 적절한 것으로 고려되는 참고문헌들을 이하에 열거한다:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
본 명세서의 상기 참고문헌의 인정은 임의의 방법으로 현재 개시된 대상의 특허성에 관련된다 것을 의미하는 것으로 추론되어서는 안 된다.
미토콘드리아는 세포 항상성에서 주된 그리고 중요한 역할을 하는데 - 그들은 세포내 신호전달 및 세포자멸사에 참여하고, 수많은 생화학적 작업을, 예컨대 시트르산 회로(또한 크렙스 회로로서 지칭됨) 내 피루브산염 산화에서, 그리고 아미노산, 지방산, 뉴클레오타이드 및 스테로이드의 대사에서 수행한다. 그러나, 미토콘드리아의 가장 중요한 작업은 세포의 에너지 대사에서의 그들의 역할이다. 이는 지방산의 β-산화 및 전자-전달계에 의한 ATP의 생성 및 산화적-인산화 시스템을 포함한다[1, 2].
미토콘드리아 내 대략 900개의 유전자 산물 대부분은 핵 DNA(nDNA)에 의해 암호화되는 반면, 미토콘드리아 DNA(mtDNA)는 단지 13개의 단백질 암호화 유전자를 함유한다. nDNA 유전자에 의해 암호화되는 대부분의 폴리펩타이드는 미토콘드리아 표적 서열(mitochondrial targeting sequence: MTS)에 의해 합성되어, 그들을 전좌 기작(translocation machinery: TOM/TIM)을 통해 세포질로부터 미토콘드리아 내로 유입한다. 미토콘드리아 내로 유입 시, MTS는 인식되고, 절단되며, 적절한 과정을 감안하여, 필요하다면 미토콘드리아 효소 복합체로 조립된다[3].
현재, 유전적 미토콘드리아 대사 장애에 대한 치료법은 없으며, 치료는 대부분 고식적이다.
효소 또는 단백질 대체 요법(Enzyme or Protein Replacement Therapy: E/PRT)은 대사 장애에 대한 치료적 접근이며, 이에 의해 결여되거나 또는 없는 단백질/효소는 인공적으로 제조되고, 정제되며, 정기적으로 치료가 필요한 환자에게 정맥내로 투여된다.
다년의 광범위 연구 후에, E/PRT는 고셔병, 파브리병 및 1형 점액성 다당류증(MPS 1)의 감쇠 변이체를 포함하는, 대사 리소좀 저장 질환에 대해 만성의 치료로서 성공적으로 허용되었다. 그러나, 혈액-뇌 장벽을 침투하기 위해 정맥내로 투여된 효소의 불능은 중추 신경계(central nervous system: CNS)를 수반하는 다른 대사 장애의 치료를 위한 이런 접근의 적용을 심하게 제한한다[4, 5].
세포 내로 단백질을 전달하기 위한 일 접근은 거대 분자에 대한 전달 벡터로서 작용하는 짧은 펩타이드의 그룹인 단백질 형질도입 도메인(protein transduction 도메인: PTD)과 그들의 융합이다. 일반적으로, PTD는 생리적 pH에서 순양전하를 지니는 짧고, 수용성 및 부분적으로 소수성 및/또는 다염기 펩타이드(거의 30 내지 35개의 아미노산 잔기)로서 정해진다[6, 7]. PTD의 주된 특징은 그들이 임의의 카이랄 수용체 없이 그리고 상당한 막 손상을 야기하는 일 없이 시험관내와 생체내 둘 다에서 낮은 마이크로몰 농도로 세포막을 침투할 수 있다는 점이다. 더 나아가, 그리고 훨씬 더 중요하게는, 이들 펩타이드는 고효율 및 저독성을 지니는 정전기적으로 또는 공유적으로 결합된 생물학적으로 활성인 화물(cargo)(예컨대, 약물)을 내재화할 수 있다. PTD가 세포 내로 유입되는 메커니즘은 완전히 이해되지 않았다. 잘 특성규명된 PTD 중 하나는 HIV-1 바이러스로부터 유래된 전사 트랜스활성인자(transactivator of transcription: TAT) 펩타이드이다. TAT는 HIV-1 바이러스에 의해 암호화되는 Tat 단백질의 11-아미노산(잔기 47 내지 57) 아르기닌- 및 라이신-풍부 부분이다[8, 9]. TAT-융합 단백질은 마우스 내로 주사될 때, 무결함 조직 및 살아있는 조직인 배양 세포 내로 빠르고 효율적으로 도입되는 것으로 이전에 나타났다[10-12]. 또한 TAT 융합 단백질이 미토콘드리아 막을 가로지르는 것이 입증되었다[13, 38].
시험관내와 생체내 둘 다에서 세포 내로 상이한 거대분자의 전달을 위한 PTD-융합 단백질의 사용에서 큰 진보가 있었다. 이 시스템은 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 뇌 내로의 화물의 전달에 대해서조차 사용될 수 있다. 추가로, 핵, 미토콘드리아 및 리소좀과 같이 특이적 세포내 하위-국소화를 표적화하는 능력은 하위-세포 유기체-표적화 요법의 개발에 대한 전달 시스템의 가능성을 추가로 확장한다. 치료적 적용분야는 거의 제한되어 있지 않은 것으로 보이며, TAT-기반 전달 시스템의 사용은 단백질로부터 매우 다양한 화물, 예컨대 올리고뉴클레오타이드, 영상화제, 저분자량 약물, 나노입자, 마이셀 및 리포좀으로 확장되었다. 나타낼 바와 같이, 이 PTD 시스템은 미토콘드리아 장애, 예를 들어 프리드라이히 운동실조증의 치료를 위해 기능성 미토콘드리아 단백질의 융합 작제물을 개발하는데 사용된다.
프리드라이히 운동실조증은 운동실조, 무반사증, 감각 손실, 무기력, 척추측만증 및 심근증을 특징으로 하는 상염색체 열성 퇴행성 장애이다. 진성 당뇨병, 시신경병증 및 청각 상실이 또한 이 질병으로 고통받는 환자에서 보인다[14, 15]. 프리드라이히 운동실조증(97%)을 지니는 대부분의 환자는 미토콘드리아 단백질 프라탁신(frataxin)을 암호화하는 유전자의 대립유전자 둘 다에서 제1 인트론 내 GAA 반복부의 확장이 있는데[15, 16] 프라탁신의 발현은 프리드라이히 운동실조증에서 감소된다[17]. GAA 반복부 확장의 크기는 프라탁신 발현과 그리고 질환 개시 연령과 역의 상관관계가 있다[16]. 세포 내 프라탁신의 결핍은 미토콘드리아의 철-황 클러스터-함유 효소의 감소된 활성, 미토콘드리아 기질 내 철의 축적, 산화적 스트레스에 대해 증가된 민감성뿐만 아니라 손상된 아데노신 삼인산염(ATP) 생산을 야기한다[18-20].
질병-조절 약물(disease-modifying drug) 개발을 위한 현재의 표적은 미토콘드리아를 표적화하는 작용제(agent)를 포함하며, (1) 산화적 스트레스 및 유리-라디칼 생성을 감소시키고; (2) ATP 생성을 개선시키며; (3) 철 축적을 감소시키고; (4) 프라탁신 생성 및 철-황 클러스터의 조립체를 증가시키는 것을 목적으로 한다[21]. 현재 21종의 작용제 또는 프리드라이히 운동실조증 질환의 연구 파이프라인에 등록된 치료제의 부류가 있다[39]. 프리드라이히 운동실조증 치료제의 연구를 위해 공공, 사적 및 산업 기반 계획으로부터 수백만 달러가 봉헌되었다. 이런 활발한 국제적 노력에도 불구하고, 프리드라이히 운동실조증에 대한 증명된 질병-조절 치료제는 아직 없다[22].
미토콘드리아 장애에서 TAT 전달 시스템을 이용하는 E/PRT의 발생은 리포아마이드 탈수소효소(lipoamide dehydrogenase: LAD) 미토콘드리아 결핍증에 대해 이미 보고되었다[23, 38]. LAD는 미토콘드리아 기지리 내 3개의 α-케토산 탈수소효소 복합체의 E3 서브유닛인데, 이는 탄수화물 및 아미노산의 대사에 중요하다. 이들 복합체는 피루브산 탈수소효소 복합체(pyruvate dehydrogenase complex: PDHC), α-케토글루타르산 탈수소효소 복합체(α-ketoglutarate dehydrogenase complex: KGDHC) 및 분지쇄 케토산 탈수소효소 복합체(branched chain ketoacid dehydrogenase complex: BCKDHC)이다. 이런 앞서 보고된 TAT 전달 시스템은 N-말단의 35개 아미노산 미토콘드리아 표적화 서열(MTS)을 함유하는 인간 LAD의 천연 전구체 서열을 포함하는 TAT-LAD 융합 단백질에 기반하였다. LAD의 천연 MTS는 미토콘드리아 내로 전달 시 TAT-LAD 작제물의 가공을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있고, 따라서 전달된 LAD를 α-케토산 탈수소효소 복합체 내로 혼입시킨다. 이 TAT-LAD 작제물은 환자의 세포에 빠르게 유입되고, 미토콘드리아에 효율적으로 도달되는 것이 입증되었다. 미토콘드리아 내에서, TAT-LAD는 가공되고 LAD 활성을 회복시키는 것으로 나타났다[23]. 게다가, E3-결함 마우스 조직 내로 TAT-LAD의 전달이 또한 입증되었다[24]. 마우스 조직에서, TAT-LAD의 단일 투여는 TAT-LAD-처리 E3-결함 마우스의 간, 심장 및 가장 중요하게는 뇌 내에서 미토콘드리아 복합효소 복합체 피루브산-탈수소효소 복합체의 효소 활성의 상당한 증가를 초래하였다[24].
특히, TAT-LAD는 처리된 환자의 세포 내에서 피루브산 탈수소효소 복합체(PDHC)의 활성을 거의 그것의 정상 수준까지 회복시킬 수 있는 것으로 나타났다. PDHC는 다편 구조 조립체가 수많은 상이한 서브유닛(E1 구성성분(α2β2)(피루브산 탈카복실화효소)의 30개 사량체, E3(LAD, 다이하이드로리포아마이드) 구성성분의 12개 이량체 및 E3 결합 단백질의 12개 단위에 부착된 60개 단위의 E2 구성성분(다이하이드로리포아마이드)의 오각형 코어)을 수반하는 9.5×106 Da 거대분자 기구이다. 모든 α-케토산 탈수소효소 복합체의 구조는 PDHC의 구조와 유사하다. 이 구조의 복잡성은 하나의 돌연변이된 구성성분의 TAT-매개 대체가 효소-결핍 환자의 세포에서 필수적 미토콘드리아 다중-구성성분 효소 복합체의 활성을 저장한다는 것을 나타냄에 있어서 중요성을 강조한다.
미토콘드리아 전달 시스템의 이전의 연구는 미토콘드리아 단백질(예를 들어, LAD)의 천연 MTS를 주로 사용하였고, 천연 MTS는 LAD 효소 기능의 최대 회복을 위해 필요하다는 것을 나타내었다. MTS의 결실은 미토콘드리아 내에서 상당히 더 소량의 LAD 활성을 회복시켰다. TAT는 막을 가로질러 양 방향으로 이동할 수 있고 따라서 미토콘드리아 밖으로 치료적 화물을 잡아당길 수 있기 때문에, MTS가 포함될 때, 기질 가공 펩티다제는 서열을 인식하고 그것을 고정시키며, 화물(예를 들어, 성숙 LAD)은 미토콘드리아 기질 내에 남아있는 한편, TAT 펩타이드는 미토콘드리아의 밖으로 형질도입할 수 있다. 따라서 반복된 투약은 시간을 거쳐서 미토콘드리아 내로 화물 양의 축적을 초래하여야 한다.
프리드라이히 운동실조증의 추정적 치료를 위한 TAT-프라탁신(TAT-FRA, 또한 TAT-FXN으로서 지칭됨) 융합 단백질이 최근에 보고되었다[25]. 이 TAT-FXN 융합 단백질은 시험관내 철에 결합하고, 프리드라이히 운동실조증 결함 섬유아세포의 미토콘드리아 내로 형질도입하며, 또한 외인성 철-산화제 스트레스에 반응하여 카파제-3 활성화를 감소시키는 것으로 나타났다. 이 TAT-FXN 융합 단백질에서, 저자들은 TAT-FXN 융합 단백질을 제조하기 위해 80개의 아미노산 잔기(aa)로 이루어진 프라탁신의 천연 MTS를 사용하였다[26].
FXN mRNA는 미토콘드리아 기질에 수송되고 적어도 두 형태, 즉, FXN42-210 및 FXN81-210으로 가공되는 전구체 폴리펩타이드로 번역되는 것으로 알려져 있다. FXN42-210은 일시적 가공 중간체인 반면, FXN81-210은 성숙 단백질을 나타낸다[27, 28]. 그러나, FXN42-210과 FXN81-210은 둘 다 정상-상태에서 대조군 세포주 및 조직에 존재하고, FXN42-210은 프리드라이히 운동실조증 환자로부터의 샘플에서 FXN81-210보다 지속적으로 더 고갈되는 것이 발견되었다[29].
대부분의 핵-암호화된 미토콘드리아 단백질은 단백질의 미토콘드리아 표적화를 지시하는 절단가능한 N-말단 MTS를 함유하며; 상기 설명한 바와 같이, N-말단 MTS는 3개의 아미노산(aa) 모티프인 잘-보존된 RXY ↓(S/A) 모티프(여기서 X는 임의의 aa, 이후에 세린 또는 알라닌일 수 있음)에서 기질 가공 프로테아제에 의해 절단되고, 절단은 3개의 첫 번째 아미노산 뒤에서 수행된다[26, 30-31]. 이들 N-말단 MTS는 전형적으로 3 내지 5개의 비연속적 염기성 아미노산(아르기닌/라이신) 잔기를 종종 몇몇 세린/트레오닌 잔기와 함께, 그러나 산성 아미노산(아스파트산/글루탐산) 없이, 포함하는 길이로 15 내지 30개의 아미노산이다. 그들의 분자 구조에서, 이들 MTS는 효율적인 미토콘드리아 수송에 필수적인 강한 염기성 양친매성 α-나선을 형성할 수 있다[32]. 따라서, 예로서, 프라탁신의 긴 80-aa 천연 MTS뿐만 아니라 그의 2-단계 가공은 미토콘드리아의 기질 내로 화물의 전달에서 그의 효율성을 감소시킬 수 있다.
HIV-1 전사 트랜스활성인자(TAT) 도메인, 기능성 인간 미토콘드리아 단백질 및 상기 TAT 도메인과 상기 기능성 인간 미토콘드리아 단백질 사이에 위치된 인간 미토콘드리아 표적화 서열(MTS)을 포함하는 융합 단백질이 제공되되, 상기 인간 MTS는 상기 기능성 인간 미토콘드리아 단백질에 대해 이종성이다.
개시된 융합 단백질에서, 상기 기능성 인간 미토콘드리아 단백질은 상기 인간 MTS에 대한 C-말단에 위치될 수 있다.
개시된 융합 단백질에서, 상기 인간 미토콘드리아 단백질은 기능성 인간 미토콘드리아 단백질 그 자체 및/또는 미토콘드리아 다중-구성성분 복합체의 구성성분, 예를 들어, 인간 프라탁신 및 오르니틴 트랜스카바모일라제(ornithine transcarbamoylase: OTC)일 수 있다.
개시된 융합 단백질에서, 상기 MTS는 약 3 내지 약 5개의 비연속적 염기성 아미노산 잔기, 및 선택적으로 약 1 내지 약 3개 또는 4 또는 5개의 세린/트레오닌 잔기를 포함하는, 약 15 내지 약 40개의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
개시된 융합 단백질에 포함된 MTS의 비제한적 예는 인간 미토콘드리아 시트레이트 신타제 MTS(아미노산 및 이를 암호화하는 핵산 서열은 각각 서열번호 23 및 서열번호 3으로 표시됨), 인간 리포아마이드 탈수소효소 MTS(아미노산 및 이를 암호화하는 핵산 서열은 각각 서열번호 24 및 서열번호 5로 표시됨), 인간 C6ORF66 유전자 산물의 MTS(아미노산 및 이를 암호화하는 핵산 서열은 각각 서열번호 25 및 서열번호 4로 표시됨) 및 인간 미토콘드리아 GLUD2의 MTS(서열번호 16으로 표시되는 핵산 서열에 의해 암호화됨) 중 임의의 하나이다.
기능성 인간 미토콘드리아 단백질에 융합된 HIV-1 전사 트랜스활성인자(TAT) 도메인 및 상기 TAT 도메인과 상기 기능성 인간 미토콘드리아 단백질 사이에 위치된 시트레이트 신타제(CS) 및 리포아마이드 탈수소효소(LAD)로부터 선택되는 인간 미토콘드리아 단백질의 인간 미토콘드리아 표적화 서열(MTS)을 포함하는 융합 단백질이 추가로 제공되되, 상기 기능성 인간 미토콘드리아 단백질은 인간 리포아마이드 탈수소효소 또는 인간 시트레이트 신타제의 상기 MTS의 C-말단이다.
본 명세서에 정의된 바와 같은 개시된 융합 단백질은 상기 MTS 서열에 상기 TAT 도메인을 공유적으로 연결하는 링커를 추가로 포함할 수 있다.
개시된 융합 단백질에서, 융합 단백질은 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 프라탁신에 융합된 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 HIV-1 전사 트랜스활성인자(TAT) 도메인 및 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 리포아마이드 탈수소효소의 미토콘드리아 표적화 서열(MTS)을 포함하고, 상기 MTS는 상기 TAT 도메인과 상기 프라탁신 사이에 위치되며, 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 링커를 통해 상기 TAT 도메인에 연결되되, 상기 프라탁신은 인간 리포아마이드 탈수소효소의 상기 MTS에 대해 C-말단이다.
개시된 융합 단백질의 추가 실시형태에서, 융합 단백질은 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 프라탁신에 융합된 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 HIV-1 전사 트랜스활성인자(TAT) 도메인 및 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 시트레이트 신타제의 미토콘드리아 표적화 서열(MTS)을 포함하고, 상기 MTS는 상기 TAT 도메인과 상기 프라탁신 사이에 위치되며, 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 링커를 통해 상기 TAT 도메인에 연결되되, 상기 프라탁신은 인간 시트레이트 신타제의 상기 MTS에 대해 C-말단이다.
생리적으로 허용가능한 담체 및 활성 성분으로서 본 명세서에 기재된 융합 단백질을 포함하는 조성물, 및 생리적으로 또는 약제학적으로 허용가능한 담체 및 활성 성분으로서 본 명세서에 기재된 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물이 추가로 개시된다.
치료가 필요한 대상체에서 결함 또는 결핍 또는 비기능성 인간 미토콘드리아 단백질의 활성을 적어도 부분적으로 회복시키기 위한 약제학적 조성물이 추가로 개시된다. 상기 인간 미토콘드리아 단백질은 그 자체가 활성일 수 있거나, 또는 기능성 미토콘드리아 단백질 복합체의 구성원일 수 있다.
생리적으로 허용가능한 담체 및 활성 성분으로서 인간 프라탁신에 융합된 HIV-1 전사 트랜스활성인자(TAT) 도메인 및 상기 TAT 도메인과 상기 프라탁신 사이에 위치되는 시트레이트 신타제(CS) 및 리포아마이드 탈수소효소(LAD)로부터 선택되는 인간 미토콘드리아 단백질의 인간 미토콘드리아 표적화 서열(MTS)을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 조성물이 추가로 개시되되, 상기 프라탁신은 본 명세서에 개시된 바와 같이 인간 리포아마이드 탈수소효소 또는 인간 시트르산 신타제에 대한 C-말단이다.
본 개시내용은 활성 성분으로서 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질 또는 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질 및 생리적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다.
본 명세서에 개시된 약제학적 조성물은 미토콘드리아 장애, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 프리드라이히 운동실조증 또는 프라탁신의 결핍증 또는 결함 프라탁신과 관련된 임의의 다른 장애 또는 OTC의 결핍증과 관련되거나 또는 결함 OTC와 관련되는 장애를 치료하는 것으로 의도될 수 있다.
치료가 필요한 대상체에 정맥내 투여에 의해 프리드라이히 운동실조증의 치료를 위한 약제학적 조성물이 추가로 개시되되, 상기 조성물은 치료적 유효량의 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질 또는 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 첨가제 및 부형제 중 적어도 하나를 포함한다.
비-제한적 예의 본 명세서에 정의되는 약제학적 조성물은 투여되는 치료적 유효량이 약 0.5㎎/㎏ 내지 약 2㎎/㎏ 대상체의 체중이다.
따라서, 개시된 융합 단백질은 미토콘드리아 장애, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만 프리드라이히 운동실조증 또는 프라탁신의 결핍증 또는 결함 프라탁신과 관련된 임의의 다른 장애 또는 각각 OTC의 결핍증과 관련되거나 또는 결함 OTC와 관련되는 장애의 치료를 위한 방법에서 사용될 수 있다.
미토콘드리아 장애의 치료 또는 완화를 위한 방법이 추가로 제공되며, 상기 방법은 치료가 필요한 대상체에게 치료적 유효량의 본 명세서에 개시된 융합단백질을 투여하는 단계를 포함함으로써, 미토콘드리아 장애를 치료한다.
개시된 방법의 일부 실시형태에서, 기능성 단백질은 각각 프라탁신, OTC이며, 미토콘드리아 장애는 프리드라이히 운동실조증 또는 각각 프라탁신의 결핍증 또는 결함 프라탁신과 관련된 임의의 다른 장애, OTC의 결핍증과 관련되거나 또는 결함 OTC와 관련된 장애이다.
미토콘드리아 장애를 치료하거나 또는 완화시키기 위한 개시된 방법은 추가적인 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
기능성 미토콘드리아 단백질을 대상체의 미토콘드리아 내로 도입하기 위한 방법이 추가로 제공되며, 상기 방법은 이러한 치료가 필요한 대상체에게 치료적 유효량의 본 명세서에 개시된 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함함으로써, 기능성 인간 미토콘드리아 단백질을 치료가 필요한 대상체의 미토콘드리아 내로 도입한다.
기능성 미토콘드리아 단백질을 대상체의 미토콘드리아 내로 도입하기 위한 개시된 방법에서, 상기 도입된 기능성 인간 미토콘드리아 단백질은 야생형 인간 미토콘드리아 단백질의 적어도 부분적인 활성, 야생형 인간 미토콘드리아 단백질의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 100%까지의 활성을 회복시킬 수 있다.
대상체에게 치료적 유효량의 본 개시내용에 따른 융합 단백질을 투여함으로써, 치료가 필요한 대상체에서 결함 또는 결핍 또는 비-기능성 인간 미토콘드리아 단백질의 활성을 적어도 부분적으로 회복시키기 위한 방법이 추가로 개시된다. 상기 인간 미토콘드리아 단백질은 그 자체가 활성일 수 있거나 또는 기능성 미토콘드리아 단백질 복합체의 구성원일 수 있다.
또한 추가로, 치료가 필요한 대상체에서 산화적 스트레스를 완화시키기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 이러한 치료가 필요한 대상체에게 치료적 유효량의 본 명세서에 개시된 바와 같은 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함함으로써, 상기 대상체에서 산화적 스트레스를 완화한다.
본 명세서에 개시된 대상을 더 잘 이해하고 그것을 실행하는 방법을 예시하기 위해, 이제 실시형태가 단지 비제한적 예로서, 수반하는 도면을 참고하여 기재될 것이다, 이때:
도 1A 내지 도 1D는 다양한 TAT-MTS- FRA 융합 단백질의 개략적 구조 및 이의 예상된 분자량을 도시한 도면
약어: H, His 태그; TAT, 전사 트랜스활성인자; FRA(또는 fra), 프라탁신; MTS, 미토콘드리아 전위 서열; cs, 시트레이트 신타제; orf, C6ORF66; lad, LAD 및kDa, 킬로 달톤.
도 2a 내지 도 2d: TAT- MTSfra - FRA 및 TAT- MTSorf - FRA 융합 단백질의 발현 및 하위 세포 국소화
도 2는 TAT-MTSfra-FRA 융합 단백질을 발현시키는 박테리아 하위 분획의 SDS-PAGE 분석의 영상(도 2a) 및 항-His 항체를 이용하는 이의 웨스턴 블롯 분석의 면역블롯을 제시하며(도 2b); TAT-MTSorf-FRA 융합 단백질을 발현시키는 박테리아 하위-분획의 SDS-PAGE 분석 영상(도 2c) 및 항-His 항체를 이용하는 이의 웨스턴 블롯 분석의 면역블롯이 도 2d에 제시된다.
약어(도 2a 내지 도 2d에 대해): 1, 전세포 추출물; 2, 가용성 분획; 3, 가용성 분획에서;kDa, 킬로 달톤; 및 M = 마커. 화살촉은 융합 단백질을 나타낸다.
도 3a 내지 도 3d: TAT- MTSlad - FRA 및 TAT- MTScs - FRA 융합 단백질의 발현 및 하위 세포 국소화
도 3은 TAT-MTSlad-FRA 융합 단백질을 발현시키는 박테리아 하위-분획의 SDS-PAGE 분석의 영상(도 3a) 및 이의 항-His 항체를 이용하는 웨스턴 블롯 분석의 면역블롯(도 3b); TAT-MTScs-FRA 융합 단백질을 발현시키는 박테리아 하위-분획의 SDS-PAGE 분석의 영상(도 3c)이 제시되며, 항-His 항체를 이용하는 이의 웨스텀 블롯 분석의 면역블롯이 도 3d에 제시된다.
약어(도 3a 내지 도 3d에 대해): 1, 전세포 추출물; 2, 가용성 분획; 3, 가용성 분획에서; KDa, 킬로 달톤; 및 M=마커. 화살촉은 융합 단백질을 나타낸다.
도 4a 내지 도 4d: TAT- MTSfra - FRA 및 TAT- MTSorf - FRA 융합 단백질의 정제를 도시한 도면
도 4는 융합 단백질 TAT-MTSfra-FRA의 친화도 크로마토그래피 정제 프로파일의 영상이 제시되며(도 4a) TAT-MTSfra-FRA에 대해 얻은 정제 단계의 SDS-PAGE 분석의 영상이 도 4b에 제시된다. 융합 단백질 TAT-MTSorf-FRA의 친화도 크로마토그래피 정제 프로파일의 영상은 도 4c에 제시되고, TAT-MTSorf-FRA에 대해 얻은 정제 단계의 SDS-PAGE 분석의 영상은 도 4d에 제시된다.
약어: M, 마커; 1, 전세포 추출물; 2, 실행 전 분획(융합 단백질을 발현시키는 박테리아 세포의 가용성 하위-분획); 3, 통과액; 4, 100mM 이미다졸로 용리; 및 5 내지 9, 250mM 이미다졸로 용리.
도 5a 내지 도 5d: TAT- MTSlad - FRA 및 TAT- MTScs - FRA 융합 단백질의 정제를 도시한 도면
도 5는 융합 단백질 TAT-MTSlad-FRA의 친화도 크로마토그래피 정제 프로파일의 영상을 제시하고(도 5a) TAT-MTSlad-FRA에 대해 얻은 정제 단계의 SDS-PAGE 분석 영상이 도 5b에 제시된다. 융합 단백질 TAT-MTScs-FRA의 친화도 크로마토그래피 정제 프로파일의 영상이 도 5c에 제시되고, TAT-MTScs-FRA에 대해 얻은 정제 단계의 SDS-PAGE 분석 영상이 도 5d에 제시된다.
약어: M, 마커; 1, 전세포 추출물; 2, 실행 전 분획(융합 단백질을 발현시키는 박테리아 세포의 가용성 하위-분획); 3, 통과액; 4, 100mM 이미다졸로 용리; 및 5 내지 9, 250mM 이미다졸로 용리.
도 6a 내지 도 6c: TAT-MTS- FRA 고도로 정제된 융합 단백질의 특성규명을 도시한 도면
4종의 고도로 정제된 TAT-MTS-FRA 융합 단백질을 SDS-PAGE 겔에 의해(도 6a) 그리고 항-His을 이용하는 웨스턴 블롯 분석에 의해(도 6b) 또는 항-프라탁신(도 6c) 항체에 의해 특성규명하였다.
약어: 1, TAT-MTSfra-FRA; 2, TAT-MTScs-FRA; 3, TAT-TSlad-FRA; 4, TAT-MTSorf-FRA; 및 M, 마커.
도 7a 내지 도 7b: TAT- MTSlad - FRA 의 세포 및 그들의 미토콘드리아 내로의 내재화를 도시한 도면
도 7a는 항-His 항체를 이용하는 웨스턴 블롯 분석의 면역블롯을 제시내며, 도 7b는 TAT-MTSlad-FRA 없이(레인 1 및 2) 또는 TAT-MTSlad-FRA의 존재에서(레인 3 내지 7) 인큐베이션시킨 BJAB 세포에 의해 수행한 항 프라탁신 항체를 이용하는 웨스턴 블롯 분석의 면역분석을 제시한다. 인큐베이션 기간의 마지막에, 하위 분획화를 수행하여 세포질 및 미토콘드리아 분획을 얻었다. SDS-PAGE에 의해 분획을 분리시키고 나서, 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다.
약어: 대조군, 비처리 세포: 세포질 (1), 미토콘드리아 (2); 1시간 동안 융합 단백질: 세포질로 처리한 세포(3), 미토콘드리아 (4); 5시간 동안 처리한 세포 : 세포질 (5), 미토콘드리아(6, 7; 두 가지 별개의 실험으로부터); 양성 대조군으로서 고도로 정제된 TAT-MTSlad-FRA 융합 단백질을 (8)에 나타낸다. 화살촉은 융합 단백질(또는 그의 가공 산물, 도 7b에서 더 낮은 화살촉에 의해 표시)을 나타낸다.
도 8A 내지 도 8B: 세포의 미토콘드리아 내로 TAT-MTS- FRA 융합 단백질의 내재화를 도시한 도면
도 8A는 3시간 동안 TAT-MTS-FRA 융합 단백질과 함께 인큐베이션한 세포의 항-프라탁신 항체를 이용하는 웨스턴 블롯 분석을 제시하며, 각각의 융합 단백질의 최종 농도는 0.02㎍/㎕이다. 세포를 세척하고 나서, 그들의 미토콘드리아를 단리시켰다.
도 8B는 상기 설명한 바와 같은 세포의 항-E1α 항체를 이용하는 웨스턴 블롯 분석을 제시한다.
약어: M, 마커; 임의의 처리 없이 대조군 세포로부터 단리시킨 미토콘드리아 (1), TAT-MTSfra-FRA와 함께 인큐베이션시킨 세포(2), TAT-MTScs-FRA와 함께 인큐베이션시킨 세포(3), TAT-MTSlad-FRA와 함께 인큐베이션시킨 세포(4), TAT-MTSorf-FRA와 함께 인큐베이션시킨 세포(5), 정제된 TAT-MTSfra-FRA 융합 단백질 (6), 및 정제된 TAT-MTScs-FRA 융합 단백질 (7).
도 9: FRA 환자의 섬유아세포에 대한 TAT- MTScs - FRA의 내재화를 도시한 도면
2, 6 및 48시간 동안 20㎍/㎖ TAT-MTScs-FRA(또는 비히클)의 존재에서, 24시간 후에 TAT-MTScs-FRA(20㎍/㎖에서)의 새로운 첨가와 함께 인큐베이션시킨 프리드라이히 운동실조증 환자로부터 얻은 섬유아세포(F816)의 미토콘드리아(M) 및 세포질(C) 분획에 대해 항-프라탁신 항체를 이용하는 웨스턴 블롯 분석의 면역블롯을 수행하였다. TAT-MTScs-FRA 및 가공된 프라탁신을 화살표로 표시한다. 약어: kDa, 킬로달톤; TAT, 전사 트랜스활성인자; MTS, 미토콘드리아 표적화 서열; CS, 시트레이트 신타제; FXN, 프라탁신; Std, 가닥.
도 10: TAT- MTScs - FRA와 함께 48시간 인큐베이션시킨 후 프리드라이히 운동실조증 환자로부터 얻은 섬유아세포에서의 아코니타제 활성을 도시한 도면
20㎍/㎖ TAT-MTScs-FRA 단백질 또는 비히클(각각 FXN 또는 VEH) 중 하나와 함께 48시간 동안 인큐베이션시킨 프리드라이히 운동실조증 환자의 섬유아세포(F816)로부터 얻은 미토콘드리아 분획의 아코니타제 활성(mOD/분)을 나타내는 막대 그래프. HepG2 전세포 세포분쇄액은 양성 대조군(POS.CON)으로서 작용하였다. 약어:kDa, 킬로달톤; TAT, 전사 트랜스활성인자; MTS, 미토콘드리아 표적화 서열; CS, 시트레이트 신타제; FXN, 프라탁신; Std, 표준; VEH, 비히클, POS. CON., 양성 대조군.
도 11a 내지 도 11b: TAT-MTS- FRA 융합 단백질은 BSO -유도 산화적 스트레스로부터의 세포를 부분적으로 구조하는 것을 도시한 도면
도 11a는 L-부티오닌-설폭시민(BSO)에 의해 유도된 세포사의 백분율을 나타내는 막대 다이어그램을 제시한다. 정상 림프구 또는 프리드라이히 운동실조증(FRDA) 환자(Lym 43)로부터 얻은 림프구를 파종하고 나서, 다양한 TAT-MTS-FRA 융합 단백질과 함께 5시간 동안 인큐베이션하였고, 이후에 BSO를 상이한 농도에서 추가 48시간 동안 첨가하였다. 인큐베이션 시간의 마지막에, 세포 배양물에 세포 증식 분석을 실시하였다.
도 11b는 아포-원(Apo-ONE) 균질 카스파제 3/7 분석 키트(프로메가(Promega))를 이용하여 평가한, 세포 내에서 카스파제 3 활성과 관련되는 L-부티오닌-설폭시민(BSO)에 의해 유도된 Lym 43의 세포사 백분율을 나타내는 막대 다이어그램을 제시한다. 실험을 세포 생존도 분석과 병행하여 수행하였다.
약어: %, 백분율; YC, 정상 림프구; FRA lym, 프리드라이히 운동실조증 환자로부터 얻은 림프구; HTFRA=TAT-MTSfra-FRA, HT(LAD)FRA=TAT-MTSlad-FRA, HT(ORF)FRA=TAT-MTSorf-FRA, HT(CS)FRA=TAT-MTScs-FRA; BSO, L-부티오닌-설폭시민; 및 PBS, 인산염 완충 식염수.
도 12a 내지 도 12d: TAT-MTS- FRA 융합 단백질이 BSO -유도 산화적 스트레스로부터의 환자로부터 얻은 섬유아세포를 부분적으로 구조한다는 것을 도시한 도면, 비교
도 12a 내지 도 12d는 FRDA 환자로부터 얻은 섬유아세포(Fib. 78)에서 BSO에 의해 유도된 세포사의 백분율의 막대 다이어그램을 제시한다. 세포를 파종하고 나서, TAT-MTSfra-FRA(도 12a), TAT-MTScs-FRA(도 12b), TAT-MTSlad-FRA(도 12c) 및 TAT-MTSorf-FRA(도 12d) 융합 단백질과 함께 24시간 동안 인큐베이션시키고, 이후에 BSO를 상이한 온도에서 추가 48시간 동안 첨가하였다. 인큐베이션 시간의 마지막에, 세포 배양물에 세포 증식 분석을 실시하였다. 약어: %, 백분율; PBS, 인산염 완충 식염수; BSO, L-부티오닌-설폭시민; HTF, TAT-MTSfra-FRA; MTS(cs), TAT-MTScs-FRA; MTS(LAD), TAT-MTSlad-FRA; MTS (ORF), TAT-MTSorf-FRA.
도 13A 내지 도 13B: TAT- MTSorf - FRA는 BSO -유도 산화적 스트레스로부터의 프리드라이히 운동실조증 환자로부터 얻은 림프구 및 섬유아세포를 구조한다
도 13A는 FRDA 환자로부터 얻은 섬유아세포(Fib. 78)에서 BSO에 의해 유도된 세포사의 백분율의 막대 다이어그램을 제시하고, 도 13B는 환자로부터 얻은 림프구(Lym 43)에서 BSO에 의해 유도된 세포사 백분율의 막대 다이어그램을 제시한다. 세포를 파종하고 나서, 24시간 동안 TAT-MTSorf-FRA 융합 단백질과 함께 인큐베이션 시키고, 이후에 BSO를 상이한 농도에서 추가 48시간 동안 첨가하였다. 인큐베이션 시간에, 세포 배양물에 세포 증식 분석을 실시하였다. 약어: PBS, 인산염 완충 식염수; %, 백분율; BSO, L-부티오닌-설폭시민; 및 ORF, C6ORF66.
도 14a 내지 도 14b: TAT- MTSlad - FRA 는 BSO -유도 산화적 스트레스로부터의 환자로부터 얻은 섬유아세포를 구조한다는 것을 도시한 도면
도 14a 및 도 14b는 두 대표적 실험의 FRDA 환자로부터 얻은 섬유아세포(Fib. 78)에서 BSO에 의해 유도된 세포사 백분율의 막대 다이어그램을 제시한다. 세포를 파종하고 나서, 24시간 동안 TAT-MTSlad-FRA 융합 단백질과 함께 인큐베이션시키고, 이후에 BSO를 상이한 농도에서 추가 48시간 동안 첨가하였다. 인큐베이션 시간에, 세포 배양물에 세포 증식 분석을 실시하였다. 약어: %, 백분율; PBS, 인산염 완충 식염수; BSO, L-부티오닌-설폭시민; LAD, 리포아마이드 탈수소효소.
도 15A 내지 도 15D: TAT-MTS- FRA 융합 단백질 작제물을 도시한 도면
도 15A 내지 도 15D는 인간 프라탁신(밑줄)에 융합된, 프라탁신(MTSfra, 도 15A), 시트레이트 신타제(MTScs, 도 15B), 리포아마이드 탈수소효소(MTSlad, 도 15C) 및 C6ORF66(MTSorf, 도 15D)로부터 선택되는 인간 미토콘드리아 단백질(이중-밑줄)의 인간 미토콘드리아 표적화 서열(MTS)에 융합된 GSDP 링커(회색)에 융합된 HIV-1 전사 트랜스활성인자(TAT) 도메인(박스)을 포함하는 TAT-MTS-FRA 융합 단백질 작제물의 개략적 표현이다.
도 16A 내지 도 16E: TAT-MTS-OTC 단백질 작제물의 발현 및 정제를 도시한 도면
도 16A 내지 도 16D는 MTS로서 오르니틴 트랜스카바모일라제(오르니틴 transcarbamoylase: OTC, 도 16A), 시트레이트 신타제(CS, 도 16B), C6ORF66(ORF, 도 16C) 또는 리포아마이드 탈수소효소(LAD 도 16D)를 포함하는 박테리아 발현된 TAT-MTS-OTC 융합 단백질 작제물의 도데실 황산나트륨 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS PAGE) 분석의 영상이다. 융합 단백질 작제물을 화살표로 표시한다. 약 2㎍의 각각의 단백질 및 BSA를 4 내지 20% 겔 상에서 분석한 후에, 쿠마씨 블루 염색하였다. 마커 크기를 도 16E에 제시한다. 약어: M1, 단백질 마커;kDa, 킬로달톤.
도 17A 내지 도 17B: 미토콘드리아 내로 TAT-MTS-OTC 단백질 작제물의 내재화
도 17A는 이글의 최소 필수 배지(Eagle's Minimum Essential Medium: EMEM) 단독으로 또는 표시한 바와 같이 DMSO(D), 트레할로스(T) 또는 오르니틴(O)으로 보충한 EMEM에서 20분, 1 및 3시간 동안 12㎍/㎖의 TAT-MTS-OTC 융합 단백질 TAT-MTSotc-OTC, TAT-MTScs-OTC, TAT-MTSlad-OTC 또는 비히클로 인큐베이션한 HepG2 세포의 미토콘드리아 분획에 대한 웨스턴 블롯 분석의 영상이다. 단백질 표준 TAT-MTSlad-OTC 또는 TAT-MTSorf-OTC(Std.)을 병행하여 실행하고, 단백질 마커(M)의 크기를 도 17B에 제시한다. OTC 융합 단백질의 이동을 화살표로 표시한다. 약어: EMEM, 이글의 최소 필수 배지; TAT, 전사 트랜스활성인자; MTS, 미토콘드리아 표적화 서열; OTC, 오르니틴 트랜스카바모일라제; CS, 시트레이트 신타제; LAD, 리포아마이드 탈수소효소; Std., 표준; T/D, 트레할로스/DMSO; T/D/O, 트레할로스/DMSO/오르니틴; M, 마커.
도 18a 내지 도 18b: TAT-MTS-OTC 단백질 작제물과 함께 인큐베이션한 HepG2 세포의 세포질 분획의 웨스턴 블롯 분석을 도시한 도면
도 18a 및 도 18b는 EMEM 단독으로 또는 표시한 바와 같이 DMSO(D), 트레할로스(T), 또는 오르니틴(O)으로 보충한 EMEM 중에서 20분, 1 및 3시간 동안 12㎍/㎖의 TAT-MTS-OTC 융합 단백질 TAT-MTSotc-OTC, TAT-MTScs-OTC, TAT-MTSlad-OTC 또는 비히클과 함께 인큐베이션시킨 HepG2 세포의 세포질 분획에 대해 수행한 웨스턴 블롯 분석의 영상이다. 단백질 표준 TAT-MTScs-OTC 또는 TAT-MTSorf-OTC(Std.)를 병행하여 실행하였다. 약어: OTC, 오르니틴 트랜스카바모일라제; CS, 시트레이트 신타제; LAD, 리포아마이드 탈수소효소; ORF, C6ORF66; EMEM, 이글의 최소 필수 배지; T/D, 트레할로스/DMSO; T/D/O, 트레할로스/DMSO/오르니틴; M, 마커.
도 19: OTC의 시험관내 효소 활성을 도시한 도면
대조군과 비교하여 492㎚의 광학 밀도(O.D.)에서 시트룰린의 순 흡광도를 검출함으로써 측정한 OTC 단백질 작제물 TAT-MTScs-OTC 및 TAT-MTSotc-OTC의 시험관내 효소 활성을 나타내는 막대그래프. 약어: TAT, 전사 트랜스활성인자; MTS, 미토콘드리아 표적화 서열; OTC, 오르니틴 트랜스카바모일라제; CS, 시트레이트 신타제.
도 20: OTC 융합 단백질에 의한 암모니아 스트레스로부터의 구조를 도시한 도면
비히클-처리 및 비처리 세포에 비교하여 14㎍/㎖의 OTC 단백질 작제물 TAT-MTScs-OTC, 및 TAT-MTSotc-OTC의 존재에서 암모니아 스트레스로 고통받는 HepG2 세포의 세포 생존도를 나타내는 막대 그래프. 형광 신호를 염화암모늄 처리와 비처리 세포 간의 비로서 계산하였다. 약어: TAT, 전사 트랜스활성인자; MTS, 미토콘드리아 표적화 서열; CS, 시트레이트 신타제; OTC, 오르니틴 트랜스카바모일라제.
현재 개시하는 대상은 TAT-MTS-프라탁신 융합 단백질을 암호화하는 다양한 플라스미드 작제물의 제조에 관한 것이며, 미토콘드리아 단백질을 미토콘드리아 내로 전달하기 위한 넓은 범위의 치료적 도구의 기반을 제공한다.
미토콘드리아 단백질뿐만 아니라 TAT 및 미토콘드리아 단백질이 세포막과 미토콘드리아막 둘 다를 가로지를 수 있게 하는 특이적 미토콘드리아 표적화 서열(MTS)을 포함하는 본 명세서에 기재된 단백질 작제물을 발현시키고 나서, 정제하고, 그들의 생물학적 활성을 확인하였다. 현저하게는, 융합 작제물(예를 들어, 프라탁신에 이종성인 MTS를 지니는 프라탁신 융합 단백질 작제물) 내에 존재하는 미토콘드리아 단백질의 천연 MTS가 아닌 MTS를 포함하는 융합 단백질 작제물에 대해 얻은 단백질 수율은 프라탁신의 천연 MTS를 포함하는 프라탁신 융합 단백질 작제물에 대해 얻은 수율보다 우수하였다.
이하에 입증하는 바와 같이, 본 발명자들은 다양한 융합 단백질이 무결함 세포 내에서 미토콘드리아 내로 유입될 수 있다는 것을 나타낸다. 추가로, 본 발명자들은 융합 단백질이 생물학적 활성을 나타낸다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 다양한 TAT-MTS-FRA 융합 단백질은 이하의 실시예에서 입증하는 바와 같이, 프리드라이히 운동실조증 환자로부터 얻은 세포뿐만 아니라 산화적 스트레스로부터의 정상 세포를 구조하는 것으로 나타났다. 놀랍게도, 천연 MTS를 운반하는 융합 단백질 작제물에 의해 입증되는 효과에 비교하여 융합 작제물(즉, 이종성 MTS) 내 존재하는 기능성 미토콘드리아 단백질의 천연 MTS가 아닌 MTS를 운반하는 융합 단백질에 대해 우수한 보호 효과가 관찰되었다.
현재 개시되는 대상은 미토콘드리아에 대한 유입 시 제거되는 것으로 알려진 고전적 MTS 서열인 인간 핵-암호화된 미토콘드리아 단백질의 이종성 MTS를 포함하는 융합 단백질 작제물을 제공한다. 비-제한적 예로서, 프라탁신을 포함하는 본 명세서에 기재된 전달 시스템은 프라탁신의 결핍증 또는 결함 프라탁신과 관련된 임의의 다른 장애의 치료 또는 완화를 위해 사용될 수 있다.
따라서, 현재 개시된 대상은 HIV-1 전사 트랜스활성인자(TAT) 도메인, 기능성 인간 미토콘드리아 단백질 및 상기 TAT 도메인과 상기 기능성 인간 미토콘드리아 단백질 사이에 위치된 인간 미토콘드리아 표적화 서열(MTS)을 포함하는 융합 단백질을 제공하되, 상기 인간 MTS는 상기 기능성 인간 미토콘드리아 단백질에 대해 이종성이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "기능성 인간 미토콘드리아 단백질"은 미토콘드리아의 생물학적 활성에 필수적인 임의의 단백질을 지칭한다. 기능성 인간 미토콘드리아 단백질은 미토콘드리아 단독으로(그 자체가) 존재할 때 활성인 단백질 또는 미토콘드리아 다중-구성성분 복합체(즉, 다른 효소, 보조인자 또는 단백질과 함께)의 구성성분으로서 미토콘드리아 내에 존재하는 단백질일 수 있다. 전형적으로, 기능성 인간 미토콘드리아 단백질은 부재, 결핍 또는 돌연변이될 때 미토콘드리아 장애를 야기하거나 또는 미토콘드리아 장애와 관련되는 단백질이다.
일부 구체적 실시형태에서, 기능성 미토콘드리아 단백질은 단백질의 전장 아미노산 서열을 지칭한다. 다른 실시형태에서, 기능성 미토콘드리아 단백질은 적절하다면, 단독으로 또는 다중-구성성분 복합체의 부분으로서 미토콘드리아 단백질 활성을 제공하는데 충분한 전장 아미노산 서열의 단편이다.
추가 실시형태에서, 기능성 인간 미토콘드리아 단백질은 상기 단백질의 돌연변이된 유도체이되, 천연 아미노산 잔기 중 하나 이상은 결실, 대체 또는 변형되는 한편, (단독으로 또는 다중-구성성분 복합체의 부분으로서) 단백질의 미토콘드리아 기능성을 여전히 유지하였다.
상기 및 다른 실시형태에서, 기능성 인간 미토콘드리아 단백질(또한 "성숙" 단백질을 나타냄)은 그의 미토콘드리아 표적화 서열(MTS)이 없는 단백질을 지칭한다. 다시 말해서, 본 명세서에 제공된 융합 단백질 작제물은 미토콘드리아에 유입 시 그의 성숙, 활성(기능성) 상태에서 융합 단백질 작제물로부터 절단되는 기능성 미토콘드리아 단백질을 포함한다.
비-제한적 예로서, 개시된 대상의 상기 및 다른 실시형태에서, 활성이 본 발명의 융합 단백질에 의해 공급되는 기능성 인간 미토콘드리아 단백질은 인간 프라탁신(서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 서열번호 6으로 표시되는 핵산 서열에 의해 암호화되는 성숙 단백질), 오르니틴 트랜스카바모일라제(OTC,서열번호 39로 표시되는 아미노산 서열을 갖고 서열번호 15로 표시되는 핵산 서열에 의해 암호화되는 성숙 단백질), 인간 리포아마이드 탈수소효소(LAD), 2-옥소아이소발레레이트 탈수소효소 알파 서브유닛(분지쇄 케토산 탈수소효소 E1α)(NCBI 단백질 데이터베이스 등록번호 P12694; OMIM:248600), 2-옥소아이소발레레이트 탈수소효소 베타 서브유닛(분지쇄 케토산 탈수소효소 E1β; P21953), 아실-CoA 탈수소효소, 중간쇄 특이적(Pl 1310; OMIM:201450), 아실-CoA 탈수소효소, 초장쇄 특이적(P49748; OMIM:201475), 삼기능성 효소 알파 서브유닛(장쇄 3 하이드록시아실 CoA 탈수소효소 또는 LCHAD)(P40939; OMIM:609015)(HADHA), 삼기능성 효소 베타 서브유닛(하이드록시아실-CoA 탈수소효소/3-Keto아실-CoA 티올라제/엔오일-CoA 하이드라타제(P55084)(HADHB)), 피루브산 탈수소효소 El 구성성분 베타 서브유닛(Pl 1177; OMIM:208800) 및 피루브산 탈수소효소 El 구성성분 알파 서브유닛(P08559; 0MIM:312170) 중 임의의 하나일 수 있다.
일부 실시형태에서, 인간 미토콘드리아 단백질은 기능성 미토콘드리아 단백질 그 자체가이고/이거나 미토콘드리아 다중-구성성분 복합체의 구성성분이다.
상기 나타낸 바와 같이, 개시한 대상의 기능성 인간 미토콘드리아 단백질은 단독으로 존재할 때 활성인 단백질(즉, 단백질 그 자체가 활성임) 또는 미토콘드리아 내에 존재할 때 미토콘드리아 다중-구성성분 복합체(즉, 다른 효소, 보조인자 또는 단백질과 함께)의 구성성분으로서 기능하는 단백질일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "미토콘드리아 다중-구성성분 복합체"는 미토콘드리아의 생물학적 활성에 필수적인 다른 효소 또는 단백질과 복합체를 형성하는 효소를 지칭한다.
이하의 실시예에 나타내는 바와 같이(도 7), TAT 및 MTS 서열을 포함하는 융합 단백질은 미토콘드리아 내로 유입 시 절단되고, 성숙 활성 단백질이 얻어진다. 따라서 현재 개시된 대상에 의해 제공되는 단백질 작제물은 TAT 및 MTS 도메인에 처음 공유적으로 부착된 인간 미토콘드리아 단백질이 세포막과 미토콘드리아막을 둘 다 가로지르게 하며, 일단 미토콘드리아 내이면, 미토콘드리아 펩티아제에 의해 가공되는 한편 그들의 생물학적 활성 및 적절한 입체구조를 유지한다. 따라서 본 명세서에 기재된 전달 시스템은 인간 미토콘드리아 단백질이 그의 미토콘드리아 기능 그 자체 또는 이의 통합을 미토콘드리아 다중-구성성분 복합체 내에서 유지하게 할 수 있다.
본 개시내용에 의해 포함되는 미토콘드리아 다중-구성성분 복합체는 일련의 반응을 촉매하기 위해 배위 방식으로 작용하는 구체적 비로 함께 조립된 적어도 2종의 상이한 단백질의 군을 지칭한다. 미토콘드리아 다중-구성성분 복합체의 기능은 그의 구조에 의존하며; 따라서, 복합체를 구성하는 단백질은 적절하게 폴딩되고 일련의 반응을 효율적으로 촉매하기 위해 적절한 입체배치에서 함께 물리적 적합화되어야 한다.
모든 실시형태에서, 현재 개시된 대상에 따르는 기능성 인간 미토콘드리아 단백질은 미토콘드리아에 유입 시 융합 단백질 작제물로부터 절단되고, 그 안에서 그의 성숙, 적절하게 폴딩된 활성 상태로 존재한다. 일부 실시형태에서, 기능성 인간 미토콘드리아 단백질은, 이어서, 입체구조적으로-민감한 미토콘드리아 다중-구성성분 복합체 내로 용이하게 통합될 수 있다.
비-제한적 예로서, 현재 개시된 대상은 피루브산 탈수소효소 복합체(PDHC), α-케토글루타르산 탈수소효소 복합체(KGDHC), 및 분지쇄 케토-산 탈수소효소 복합체(BCKDHC), 호흡쇄의 복합체, 및 지방산 β-산화 및 요소회로에 수반된 것 중 임의의 하나인 미토콘드리아 다중-구성성분 복합체를 포함한다. 호흡쇄의 복합체는 복합체 I(NADH-유비퀴논 산화환원효소), 복합체 II(숙신산-유비퀴논 산화환원효소), 복합체 III(유비퀴놀-페리사이토크롬 C 산화환원효소), 복합체 IV (사이토크롬 C 산화환원효소) 및 복합체 V(FIFO ATP 분해효소)이며, 여기서, 각각의 미토콘드리아 다중구성성분 복합체는 본 발명의 별도의 실시형태를 나타낸다.
이하의 실시예 1 내지 3에서 나타내는 바와 같이, 본 발명자들은 단백질 프라탁신을 포함하는 클로닝, 발현 및 정제된 융합 단백질 작제물을 가진다.
미토콘드리아 단백질 인간 프라탁신(FXN)은 미토콘드리아 철 항상성, 특히 철-황(Fe-S) 클러스터 단백질의 드노보 생합성 및 헴 생합성에서 기능하는 것으로 나타난 대부분의 진핵생물 유기체에서 발현되는 필수적이고 고도로 보존된 단백질이다. FXN의 정확한 기능은 규명되지 않았지만, 최근의 연구는 FXN이 Fe-S 클러스터 생합성을 위해 Fe2 +를 이용하는 다른자리 입체성 활성인자로서 작용한다는 것을 시사한다. FXN의 부재는 Fe-S-함유 단백질, 예컨대 아코니타제에서 활성의 손실과 관련될 뿐만 아니라 질환 프리드라이히 운동실조증과 관련된다.
전구체 FXN 단백질(23.1kDa, 210개 아미노산)은 그의 아미노(N) 말단에서 80개 아미노산 미토콘드리아 표적화 서열(MTS)을 포함한다. 미토콘드리아 내에서, 전구체 FXN 단백질은 미토콘드리아 기질 가공 펩티다제(MPP)에 의해 2 단계로 가공된다. FXN의 중간체 형태는 MPP에 의한 잔기 42에서의 절단에 의해 형성되는 것으로 나타났고 얻어진 FXN의 형태(FXN42-210)는 아미노산 81에서 절단되어 예측 분자량이 14.2kDa인 성숙, 130개 아미노산 단백질을 수득하는 것으로 나타났다.
상기 기재한 바와 같이, 프리드라이히 운동실조증은 운동실조, 무반사증, 감각 손실, 무기력, 척추측만증 및 심근증을 특징으로 하는 상염색체 열성 퇴행성 장애이다. 세포 내 프라탁신의 결핍증은 미토콘드리아 기질 내 철의 축적에 대해 미토콘드리아 철-황 클러스터-함유 효소의 감소된 활성, 산화적 스트레스에 대해 증가된 민감도뿐만 아니라 손상된 아데노신 삼인산염(ATP) 생산을 야기한다.
현재 개시된 대상의 상기 및 다른 실시형태에서, 프라탁신은 인간 프라탁신 및 임의의 생물학적으로 활성인 단편 및 자연적(천연) MTS 서열이 없는 이들의 유도체를 지칭한다. 성숙 인간 프라탁신에 대한 비제한적 예는 등록번호 Q16595[81-210]에 의해 그리고 이하의 표 1에 의해 나타내는 바와 같이 제공되며, 여기서 성숙 인간 프라탁신의 아미노산 서열은 서열번호 26에 제시된 바와 같고, 이를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 6에 제시된 바와 같다.
특히, 이하의 실시예 4에 나타낸 바와 같이, TAT-MTS-프라탁신 융합 단백질은 인간 무결함 BJAB 세포의 미토콘드리아에 유입되는 것이 본 발명자에 의해 입증되었다. 세포질로부터 미토콘드리아를 분리시키기 위해, 이들 세포의 하위-세포 분획 분석은 다양한 프라탁신 융합 단백질 작제물(즉, TAT-MTSlad-FRA, TAT-MTSfra-FRA, TAT-MTScs-FRA 및 TAT-MTSorf-FRA)이 확실히 미토콘드리아 내로 성공적으로 전달되었다는 것을 확인하였다. 놀랍게도, 이종성 MTS을 운반하는 융합 단백질 중에서, 시트레이트 신타제(MTScs)의 MTS는 본 발명자들에 의해 가장 효율적인 방식으로 미토콘드리아 내로 전달되는 것으로 나타났다.
미토콘드리아 단백질을 포함하는 융합 단백질의 미토콘드리아 내로의 전달은 일반적으로 미토콘드리아 장애의 치료를 위한 광범위한 치료적으로 유리한 영향을 가지며, 프라탁신의 미토콘드리아 내로의 전달은 특히 프리드라이히 운동실조증의 치료에 대해 구체적 치료적 이점을 가진다.
상기 언급한 바와 같이, 오르니틴 트랜스카바모일라제(OTC, 또한 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제로 불림)는 또한 현재 개시된 대상에 의해 포함된다. OTC는 시트룰린(Cit) 및 포스페이트(Pi)를 형성하기 위해 카바모일 포스페이트(CP)와 오르니틴(Orn) 사이의 반응을 촉매하는 효소적 활성을 갖는 단백질이다. 포유류에서, OTC는 미토콘드리아 내에 위치되고, 요소회로의 부분이다.
OTC는 삼량체이고, 이의 활성 부위는 단백질 단량체 사이의 경계에 위치되어, 단백질의 미토콘드리아 활성에 대해 적절한 폴딩의 중요성을 강조한다. OTC의 결핍증은 암모니아 수준의 증가를 초래하여 신경학적 문제를 야기한다.
첨부하는 실시예에서 입증된 바와 같이, OTC 및 그의 천연 MTS를 포함하는 본 발명에 따른 융합 단백질 작제물뿐만 아니라 OTC 및 이종성 MTS를 포함하는 융합 단백질 작제물은 HepG2 세포 내 미토콘드리아 내로 내재화할 수 있었다(실시예 9). 흥미롭게도, OTC에 이종성인 MTS를 포함하는 융합 단백질 작제물의 내재화 능력은 OTC의 천연 MTS를 포함하는 융합 단백질 작제물의 내재화 능력보다 약간 더 높았다. 단백질 OTC를 포함하는 융합 단백질 작제물은 또한 활성인 것으로 나타났다. 도 20에서 나타나는 바와 같이, MTS로서 OTC 및 시트레이트 신타제를 포함하는 융합 단백질 작제물의 존재에서 세포 생존도 수준은 염화 암모늄에 노출되지 않은 세포에 대한 세포 생존도 수준과 유사하였다(결함 또는 상실된 OTC에 의해 부여된 암모니아 스트레스에 대한 모델로서 작용함).
더 나아가, MTS로서 OTC 및 시트레이트 신타제를 포함하는 융합 단백질 작제물의 존재 하에 세포 생존도 수준은 OTC의 천연 MTS를 포함하는 융합 단백질 작제물로 처리한 세포 내 세포 생존도 수준보다 더 높았다.
따라서, 개시된 대상의 상기 및 다른 실시형태에서, 기능성 인간 미토콘드리아 단백질은 구체적으로는 프라탁신 및 오르니틴 트랜스카바모일라제(OTC) 중 임의의 하나이다. 일부 실시형태에서, 성숙 OTC 단백질을 암호화하는 핵산은 서열번호 15로 표시된다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 OTC 성숙 단백질은 서열번호 39로 표시되는 아미노산 서열을 가진다.
상기 나타낸 바와 같이, 현재 개시된 대상은 HIV-1 전사 트랜스활성인자(TAT) 도메인, 기능성 인간 미토콘드리아 단백질 및 상기 TAT 도메인과 상기 기능성 미토콘드리아 단백질 사이에 위치된 인간 미토콘드리아 표적화 서열(MTS)을 포함하는 융합 단백질을 제공하되, 상기 인간 MTS는 상기 기능성 단백질에 대해 이종성이다.
미토콘드리아와 관련된 대부분의 단백질은 미토콘드리아 표적화(또는 전위) 서열(MTS)에 의해 합성되는데, 이는 그들이 전위 기작을 통해 세포질로부터 미토콘드리아 내로 유입되게 한다. 일단 미토콘드리아에 유입되면, MTS가 인식되고, 절단되어 적절하게 가공되게 하고, 필요하다면 미토콘드리아 효소 복합체 내로 조립된다.
따라서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "미토콘드리아 표적화 서열", MTS 또는 "미토콘드리아 전위 서열"은 단백질, 펩타이드, 아미노산 서열, 또는 이에 부착된 화합물, 및 이의 임의의 생물학적으로 활성인 단편의 미토콘드리아 내로의 수송을 야기할 수 있는 아미노산 서열을 지칭한다. 기능성 미토콘드리아 단백질에 대해 N-말단에 위치된 현재 개시된 대상에 따른 융합 단백질 작제물에서 사용된 MTS는 전형적으로 길이로 약 3 내지 약 5 비연속적 염기성 아미노산(아르기닌/라이신) 잔기(종종 몇몇 세린/트레오닌 잔기가 있지만 산성 아미노산(아스파테이트/글루타메이트) 잔기는 없음)를 포함하는, 약 15 내지 약 40개의 아미노산이다. 그들의 분자 구조에서, 이들 MTS는 효율적인 미토콘드리아 수송에 필수적인 강한 양친매성 α-나선을 형성할 수 있다.
다시 말해서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 융합 단백질이 현재 개시되되, 상기 기능성 인간 미토콘드리아 단백질은 상기 인간 미토콘드리아 표적화 서열(MTS)에 대해 C-말단이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "약"은 일부 경우에 언급된 값, 정수 값을 포함하는 편차 범위 및 적용가능하다면, 마찬가지로 연속적 범위를 구성하는 비-정수 값보다 1%, 더 구체적으로는 5%, 더 구체적으로는 10%, 더 구체적으로는 15%까지 그리고 20%까지 더 높거나 또는 더 낮게 벗어날 수 있는 값을 나타낸다.
상기 및 다른 실시형태에서, MTS는 인간 MTS, 즉, 인간 미토콘드리아 단백질의 MTS이다.
현재 개시된 대상의 상기 및 다른 실시형태에서, MTS는 약 3 내지 약 5개의 비연속적(즉, 순차적 방식으로 하나가 다른 것에 공유적으로 연결되지 않음) 염기성 아미노산 잔기, 및 선택적으로 약 1 내지 약 3개 또는 4 또는 5개의 세린/트레오닌 잔기를 비롯하여, 약 15 내지 약 40개의 아미노산 잔기를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "아미노산 잔기"는 자연적으로 생기는 아미노산 및 합성 아미노산뿐만 아니라 자연적으로 생기는 아미노산과 유사한 방식으로 작용할 수 있는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연적으로 생기는 아미노산은 유전자 암호에 의해 암호화되는 것뿐만 아니라 이후에 변형되는 해당 아미노산, 예를 들어, 하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. "아미노산 유사체 및 아미노산 모방체"는 자연적으로 생기는 아미노산과 동일한 기본적인 화학적 구조를 갖는 화합물을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R기 또는 변형된 펩타이드 백본을 갖지만, 자연적으로 생기는 아미노산과 동일한 기본적 화학 구조를 유지한다. 아미노산은 본 명세서에서 그들의 통상적으로 공지된 3글자 기호에 의해 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에 의해 권고되는 1글자 기호에 의해 지칭될 수 있다.
아미노산 잔기는 그들의 화학적 특성에 따라, 특히, 수반된 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 특성에 기반하여 다양한 기로 나뉘어질 수 있다는 것이 당업계에 잘 공지되어 있다.
예를 들어, 비극성 "소수성" 아미노산은 발린(V), 아이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 시스테인(C), 알라닌(A), 타이로신(Y), 히스티딘(H), 트레오닌(T), 세린(S), 프롤린(P), 글라이신(G), 아르기닌(R) 및 라이신(K)으로 이루어진 군으로부터 선택되고; "극성" 아미노산은 아르기닌 (R), 라이신 (K), 아스파트산(D), 글루탐산(E), 아스파라긴(N), 글루타민(Q)으로 이루어진 군으로부터 선택되며; "양으로 하전된" 아미노산은 아르기닌 (R), 라이신 (K) 및 히스티딘(H)으로 이루어진 군으로부터 선택되고, "산성" 아미노산은 아스파트산(D), 아스파라긴(N), 글루탐산(E) 및 글루타민(Q)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. "염기성" 아미노산은 히스티딘(H), 라이신(K) 및 아르기닌(R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는데, 이는 그들의 pKa 미만의 pH에서 극성이고 양으로 하전되며, 매우 친수성이다.
상기 나타낸 바와 같이, 현재 개시된 대상은 인간 성숙 프라탁신 및 이의 임의의 생물학적으로 활성인 단편 및 자연적(천연) MTS 서열이 없는 유도체를 포함한다. 용어 "생물학적으로 활성인 단편 및 유도체"는 프라탁신의 생물학적 활성을 변용하지 않은 현재 개시된 대상에 따라, 성숙 프라탁신의 아미노산 서열에서(또는 이를 암호화하는 핵산에서) 하나 이상의 아미노산 잔기, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산 잔기의 결실, 치환 및/또는 삽입을 포함하는 임의의 변이를 의미한다.
본 발명은 추가로 현재 개시된 대상의 핵산 서열 또는 이의 생물학적으로 기능성인 단편 및 유도체를 포함하는 DNA 작제물에 관한 것이다. 현재 개시된 대상의 작제물은 본 발명의 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 추가적인 구성요소, 예컨대 프로모터, 조절 및 제어 구성요소, 번역, 발현 및 다른 신호를 추가로 포함할 수 있다.
세포질 내에서 생성되고 미토콘드리아 내로 수송된 각각의 미토콘드리아 효소는 전구체 단백질로서 생성되어 그의 자연적 MTS를 운반하는 것이 공지되어 있다. 따라서, 전구체 미토콘드리아 단백질은 이미 그의 천연 MTS를 가진다. 그러나, 전구체 단백질에서 이 자연적으로 생기는 서열은 임의의 다른 공지된 MTS로 교환될 수 있다.
본 명세서에 예시된 바와 같이, 본 발명자에 의해 제조된 프라탁신 또는 오르니틴 트랜스카바모일라제를 포함하는 융합 단백질 작제물은 리포아마이드 탈수소효소(서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열의 그리고 서열번호 5로 표시되는 핵산 서열에 의해 암호화되는, MTSlad), C6ORF66(서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열의 그리고 서열번호 4로 표시되는 핵산 서열에 의해 암호화되는, MTSorf), 또는 시트레이트 신타제(서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열의 그리고 서열번호 3으로 표시되는 핵산 서열에 의해 암호화되는, MTScs)의 MTS를 추가로 포함하였다.
대안적으로, 본 발명자에 의해 제조된 프라탁신 또는 오르니틴 트랜스카바모일라제를 포함하는 융합 단백질 작제물은 각각 프라탁신의 천연 MTS(서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열의 그리고 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열에 의해 암호화되는, MTSfra) 또는 오르니틴 트랜스카바모일라제의 천연 MTS(서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열의 그리고 서열번호 37로 표시되는 핵산 서열에 의해 암호화되는, MTSotc)를 포함하였다.
추가로, 본 발명자들은 발현 및 정제 단계 동안 이종성 MTS를 포함하는 융합 단백질 작제물에 대해 얻은 더 높은 수율에 기반하여, 프라탁신 및 프라탁신의 천연 MTS가 아닌 MTS 서열(즉, 이종성 MTS)을 포함하는 융합 단백질 작제물이 천연 MTS를 포함하는 프라탁신 융합 단백질 작제물보다 우수하다는 것을 나타내었다.
놀랍게도, 프라탁신 및 이종성 MTS를 포함하는 융합 단백질 작제물은 또한 천연 MTS를 포함하는 프라탁신 융합 단백질 작제물에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는 것이 본 발명자들에 의해 입증되었다(실시예 5). 특히, 프라탁신 및 시트레이트 신타제 MTS를 포함하는 융합 단백질 작제물은 BSO의 독성을 감소시킴에 있어서 가장 높은 효과를 나타내었다(도 11a 및 도 11b). 이하의 실시예 4에 나타내는 바와 같이, 프라탁신 및 시트레이트 신타제 MTS를 포함하는 융합 단백질 작제물은 또한 이종성 MTS를 포함하는 예시된 작제물 중에서 미토콘드리아 내로 전달되는 가장 높은 능력을 나타내었다.
상기 결과와 일치되게, 프라탁신 및 다른 이종성 MTS, 즉, 리포아마이드 탈수소효소(LAD)의 MTS를 포함하는 융합 단백질 작제물은 또한 도 12c에서 입증되는 바와 같이 프라탁신 천연 MTS을 포함하는 프라탁신 융합 단백질 작제물에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는 것이 본 발명자에 의해 입증되었다. 도 12로부터 분명한 바와 같이, 이 융합 단백질 작제물의 생물학적 활성은 시트레이트 신타제 MTS를 포함하는 융합 단백질 작제물의 생물학적 활성과 비슷하였다.
상기 상술한 바와 같이, FXN mRNA는 미토콘드리아 기질에 수송되고 적어도 2가지 형태, 즉, FXN42-210 및 FXN81-210으로 가공되는 전구체 폴리펩타이드로 번역되는 것으로 알려져 있으며, 여기서 FXN42-210은 일시적 가공 중간체이고, FXN81-210은 성숙 단백질을 나타낸다. 다시 말해서, 일시적 프라탁신 폴리펩타이드 FXN42-210은 천연 프라탁신 MTS의 일부를 포함하는 반면, FXN81-210은 천연 MTS가 없는 성숙 단백질 그 자체이다. 이론에 의해 구속되는 일 없이, 프라탁신을 포함하는 융합 단백질 작제물 내 이종성 MTS를 사용함으로써, 성숙 프라탁신은 단일 단계에서 융합 단백질로부터 방출됨으로써, 프라탁신 및 그의 천연 MTS를 포함하는 융합 단백질 작제물에 비해 미토콘드리아에서 이 단백질의 생물학적 이용가능성을 상승시키는 것으로 예상된다.
따라서, 현재 개시된 대상에 의해 포함된 MTS는 핵 DNA에 의해 암호화되고, 세포질에서 번역(생성)되고 나서, 미토콘드리아 내로 수송되고, 본 발명에 따른 융합 단백질 작제물 내에 존재하는 기능성 단백질의 천연 N-말단 MTS 서열이 아닌, 임의의 인간 MTS이다. 다시 말해서, MTS 서열은 기능성 단백질의 천연 N-말단 MTS 서열이 아니며, 즉, 이종성이다. 다양한 MTS는 그 자체 중에서도 각각의 미토콘드리아 효소로 교환될 수 있다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "이종성"은 본 개시내용에 따른 기능성 인간 미토콘드리아 단백질에 융합된 MTS를 지칭할 때, 다른 (별도의) 미토콘드리아 단백질로부터 얻어진 MTS, 즉, 상기 기능성 단백질의 자연적으로 생기는 MTS가 아닌 MTS를 의미한다.
비-구속적 예로서, 본 개시내용에 따른 이종성 MTS는 본 명세서에 예시된 바와 같은 미토콘드리아 단백질 프라탁신에 대해 또는 미토콘드리아 단백질 오르니틴 트랜스카바모일라제(OTC)에 대해 이종성인 MTS이며, 임의의 인간 미토콘드리아 단백질의 MTS, 예를 들어, 비-제한적 예로 리포아마이드 탈수소효소의 MTS(서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열의 그리고 서열번호 5로 표시되는 핵산 서열에 의해 암호화되는, MTSlad), C6ORF66(서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열의 그리고 서열번호 4로 표시되는 핵산 서열에 의해 암호화되는, MTSorf) 및 시트레이트 신타제의 MTS(서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열의 그리고 서열번호 3으로 표시되는 핵산 서열에 의해 암호화되는, MTScs)일 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
따라서, 현재 개시된 융합 단백질 작제물의 실시형태에서, MTS는 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 미토콘드리아 시트레이트 신타제 MTS, 서열번호 24으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 리포아마이드 탈수소효소 MTS, 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 C6ORF66 유전자 산물의 MTS 및 서열번호 16으로 표시되는 핵산 서열에 의해 암호화되는 인간 미토콘드리아 GLUD2의 MTS 중 임의의 하나일 수 있다.
현재 개시된 융합 단백질 작제물의 다른 실시형태에서, MTS는 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 미토콘드리아 시트레이트 신타제 MTS 및 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 리포아마이드 탈수소효소 MTS 중 임의의 하나이다.
일부 실시형태에서, 인간 프라탁신 및 TAT 도메인과 상기 프라탁신 사이에 위치되는 리포아마이드 탈수소효소(LAD) 및 시트레이트 신타제(CS)로부터 선택되는 인간 미토콘드리아 단백질의 인간 미토콘드리아 표적화 서열(MTS)에 융합된 HIV-1 전사 트랜스활성인자(TAT) 도메인을 포함하는 융합 단백질이 개시되며, 상기 프라탁신은 인간 리포아마이드 탈수소효소 또는 인간 시트레이트 신타제의 상기 MTS에 대해 C-말단이다.
다른 실시형태에서, 인간 오르니틴 트랜스카바모일라제(OTC)에 융합된 HIV-1 전사 트랜스활성인자(TAT) 도메인 및 상기 TAT 도메인과 상기 OTC 사이에 위치되는 리포아마이드 탈수소효소(LAD) 및 시트레이트 신타제(CS)로부터 선택되는 인간 미토콘드리아 단백질의 인간 미토콘드리아 표적화 서열(MTS)을 포함하는 융합 단백질이 개시되되, 상기 OTC는 인간 리포아마이드 탈수소효소 또는 인간 시트레이트 신타제의 상기 MTS에 대해 C-말단이다.
상기 나타낸 바와 같이, 현재 개시된 대상에 따른 융합 단백질은 상기 정의한 바와 같은 MTS에 대해 N-말단인 융합 단백질의 N-말단에 위치되며, 결국 기능성 인간 미토콘드리아 단백질에 대해 N-말단에 위치되는 HIV-1 전사 트랜스활성인자(TAT) 도메인을 포함한다(개략적 표현을 위해 도 1을 참조).
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 HIV-1 전사 트랜스활성인자(TAT) 도메인은 서열번호 21에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 YGRKKRRQRRR을 갖는 HIV-I Tat 단백질의 11-아미노산(잔기 47 내지 57) 아르기닌- 및 라이신-풍부 부분인 단백질 형질도입 도메인을 지칭한다. TAT-융합 단백질 작제물은 무결함 조직 및 살아있는 조직인 배양 세포 내로 도입되며, 혈액-뇌 장벽(BBB)을 가로지르는 것이 당업계에 공지되어 있다. TAT 융합 단백질은 또한 미토콘드리아 막을 가로지르는 것으로 알려져 있다[13].
현재 개시된 대상은 또한 상기 정의한 TAT 도메인의 임의의 단편을 포함한다. 예를 들어, 현재 개시된 대상에 따른 TAT 도메인은 약 아미노산 서열 YGRKKRRQRRR(서열번호 21)을 갖는 HIV-I TaT 단백질의 약 3 내지 약 11개(예를 들어, 4 내지 11, 5 내지 11, 6 내지 11, 7 내지 11, 8 내지 11, 9, 10 또는 11개) 순차적 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 정의한 TAT 도메인의 단편은 이하에 예시되는 융합 단백질 작제물의 제조에서 사용되는, 서열번호 27에 제시한 바와 같은 RKKRRQRRR의 아미노산 서열을 갖고, 서열번호 1로 표시되는 핵산 서열에 의해 암호화되는 HIV-I Tat 단백질의 9개 순차적 아미노산 잔기를 포함한다.
따라서, 현재 개시된 대상의 이런 실시형태 및 다른 실시형태에서, 융합 단백질은 그의 N-말단에서 TAT 도메인 및 그의 C-말단에서 기능성 미토콘드리아 단백질을 포함하며, 둘 다 상기 TAT 도메인과 상기 기능성 미토콘드리아 단백질 사이에 위치된 MTS에 공유적으로 연결(융합)된다. 다시 말해서, 개시내용은 프라탁신에 대해 도 1에 개략적으로 제시한 바와 같이 기능성 단백질의 N-말단에 융합된 MTS의 N-말단에 융합된 N-말단 TAT를 포함하는 단백질 작제물을 제공한다.
현재 개시된 대상에 따른 융합 단백질은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예로서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 융합 단백질은 이하에 예시되는 바와 같이, 표준 분자 생물학 및 클로닝 기법에 의해 제조될 수 있다.
본 명세서의 내용에서 용어 "융합 단백질"은 주로(반드시는 아니지만) 펩타이드 결합에 의해 서로 연결되는 아미노산의 서열에 관한 것이다. 본 발명의 융합 단백질에 따라 용어 "융합된"은 적어도 3종의 유래의 아미노산 서열, 즉, TAT 도메인, 이종성 미토콘드리아 표적화 도메인의 서열(MTS) 및 기능성 미토콘드리아 단백질이 직접적으로 또는 아미노산 서열을 결합하는(브릿징, 컨쥬게이팅, 공유적 결합) 아미노산 링커를 통해 공유 결합에 의해 서로 연결되는 사실을 지칭한다. 융합은 펩타이드를 컨쥬게이팅하기 위해 사용되는 당업계의 방법의 상태를 이용하는 것과 같은 화학적 컨쥬게이션에 의할 수 있다.
본 발명의 내용에서 융합 단백질은 또한 선택적으로 융합 단백질 작제물의 상이한 도메인을 공유적으로 결합하는 적어도 하나의 링커를 포함할 수 있다.
본 발명의 내용에서 용어 "링커"는 상이한 융합 단백질 도메인 사이에 위치되고 그들을 함께 공유적으로 결합하는 약 4 내지 약 20개의 아미노산 잔기로부터의 아미노산 서열에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명에 따른 링커는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산 길이일 수 있다. 링커는 종종 가요성 아미노산 잔기, 예를 들어, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 글라이신 및 세린으로 구성되고, 따라서, 인접한 단백질 도메인은 서로에 대해 자유롭게 이동한다. 용어 "링커"는 "스페이서"와 상호호환적으로 사용될 수 있다.
단백질의 다양한 도메인의 적절한 폴딩을 가능하게 하는 링커의 설계는 당업계에 잘 공지되어 있다. 링커의 비-결합 예는 융합 단백질 His TAT MTS(cs) 81-210 FRA(서열번호 17로 표시됨), His TAT MTS(fra) 81-210 FRA(서열번호 18로 표시됨), His TAT MTS(lad) 81-210 FRA(서열번호 19로 표시됨) 및 His TAT MTS(orf) 81-210 FRA(서열번호 20으로 표시됨)뿐만 아니라 OTC를 포함하는 몇몇 융합 단백질을 구성하는 이하의 실시예에서 사용되는 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열 GSDP(Gly-Ser-Asp-Pro)이다.
따라서 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 상기 MTS 서역에 상기 TAT 도메인을 공유적으로 연결하는 링커를 추가로 포함하는 본 명세서에 정의된 바와 같은 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 내용에서 융합 단백질은 또한 선택적으로 이하에 예시되는 융합 단백질의 경우와 같이 그의 N-말단에서 적어도 하나의 메티오닌(M) 잔기를 포함할 수 있다. 메티오닌은 TAT 도메인에 대해 N-말단에 위치된다.
융합은 또한 재조합 기법에 의해, 즉, 전체 융합 단백질에 대한 핵산 서열 암호(모든 세그먼트에 대한 암호)의 구성에 의해 달성될 수 있고, 따라서 모든 결합은 본질적으로 펩타이드 결합이다.
본 명세서에 기재된 단백질 작제물의 정제를 용이하게 하기 위해, 본 발명에 따른 융합 단백질 작제물은 또한 최종 융합 작제물에서 제거 또는 유지될 수 있는 N-말단 태그(예를 들어, 이하에 예시된 바와 같은 His 태그, 몇 개만 예를 들면, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 말토스-결합 단백질(MBP), FLAG 옥타펩타이드)를 포함할 수 있다. 이러한 태그는 TAT 및 MTS 서열과 함께 미토콘드리아에 유입 시 융합 단백질로부터 정상적으로 절단된다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 17, 즉, His TAT MTS(cs) FRA, 서열번호 19, 즉 His TAT MTS(lad) FRA, 서열번호 20, 즉, His TAT MTS(orf) FRA, 서열번호 45, 즉, His TAT MTS(cs) OTC, 서열번호 46, 즉, His TAT MTS(orf) OTC뿐만 아니라 서열번호 47, 즉, His TAT MTS(lad) OTC에 제시되어 있다.
본 발명에 따른 융합 단백질 작제물은 또한 N-말단 태그 없이 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 28, 즉 TAT MTS(cs) FRA, 서열번호 30, 즉 TAT MTS(lad) FRA, 서열번호 31, 즉, TAT MTS(orf) FRA, 서열번호 49, 즉 TAT MTS(cs) OTC, 서열번호 50, 즉 TAT MTS(orf) OTC뿐만 아니라 서열번호 51, 즉 TAT MTS(lad) OTC에 제시되어 있다.
따라서 본 개시내용은 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 프라탁신에 융합된 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 HIV-1 전사 트랜스활성인자(TAT) 도메인 및 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 리포아마이드 탈수소효소의 미토콘드리아 표적화 서열(MTS)을 포함하는 융합 단백질을 추가로 포함하며, 상기 MTS는 상기 TAT 도메인과 상기 프라탁신 사이에 위치되며 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 링커를 통해 상기 TAT 도메인에 연결되되, 상기 프라탁신은 인간 리포아마이드 탈수소효소의 상기 MTS의 C-말단이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 융합 단백질은 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 프라탁신에 융합된 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 HIV-1 전사 트랜스활성인자(TAT) 도메인 및 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 시트레이트 신타제의 미토콘드리아 표적화 서열(MTS)을 포함하며, 상기 MTS는 상기 TAT 도메인과 상기 프라탁신 사이에 위치되고, 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 링커를 통해 상기 TAT 도메인에 연결되되, 상기 프라탁신은 인간 시트레이트 신타제의 상기 MTS의 C-말단이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 융합 단백질은 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 서열번호 39로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 오르니틴 트랜스카바모일라제(OTC)에 융합된 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 HIV-1 전사 트랜스활성인자(TAT) 도메인 및 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 시트레이트 신타제의 미토콘드리아 표적화 서열(MTS)을 포함하며, 상기 MTS는 상기 TAT 도메인과 상기 OTC 사이에 위치되고, 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 링커를 통해 상기 TAT 도메인에 연결되되, 상기 OTC는 인간 시트레이트 신타제의 상기 MTS의 C-말단이다.
현재 개시된 대상은 생리적으로 허용가능한 담체 및 활성 성분으로서 본 명세서에 정의된 바와 같은 융합 단백질을 포함하는 조성물을 추가로 제공한다.
구체적 실시형태에서, 현재 개시된 대상은 활성 성분으로서 서열번호 45로 표시되고, 서열번호 30으로 표시됨 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질 및 생리적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
또한 약제학적으로 허용가능한 담체 및 활성 성분으로서 본 명세서에 정의된 바와 같은 융합 단백질 작제물을 포함하는 약제학적 조성물이 현재 개시된 대상에 의해 제공된다.
본 명세서에 정의된 바와 같은 "조성물"은 일반적으로 완충제, 이의 오스몰 농도를 조절하는 작용제, 및 선택적으로, 당업계에 공지된 바와 같은 하나 이상의 약제학적으로(또는 생리적으로) 허용가능한 담체, 희석제, 첨가제 및 부형제를 포함한다. 보충적 활성 성분이 또한 조성물 내로 혼입될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글라이세롤, 프로필렌 글라이콜 및 액체 폴리에틸렌 글라이콜 등), 이의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 각각의 담체는 경우에 따라 다른 성분과 양립가능하고 환자에게 해롭지 않다는 점에서 생리적으로 또는 약제학적으로 허용가능하여야 한다.
첨가제는 프로테아제 저해제, 예를 들어, 페닐메탄설포닐플루오라이드 또는 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF), 나파모스타트 메실레이트, 4-(2-아미노에틸)벤젠설포닐 플루오라이드 하이드로클로라이드(AEBSF), 베스타틴, 펩스타틴 A, E-64, 류펩틴, 1, 10-페난트롤린 및 당업계에 공지된 임의의 다른 프로테아제 저해제 중 적어도 하나일 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
현재 개시된 대상의 "약제학적 조성물"은 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 애주번트 및/또는 부형체 및/또는 당업계에 공지된 바와 같은 첨가제를 포함하는, 상기 기재한 바와 같은 조성물이다.
현재 개시된 대상은 미토콘드리아 장애를 치료하거나 또는 완화시키기 위해 본 명세서에 정의된 바와 같은 약제학적 조성물을 추가로 제공한다.
현재 개시된 대상에 의해 포함되는 바와 같은 용어 "미토콘드리아 장애"는 간, 근육, 뇌 및 심장과 같이 다량의 에너지를 소모하는 신체의 해당 영역 내에서 에너지 부족을 야기하는 미토콘드리아에 대한 선천적 또는 후천적 손상에 의해 야기되는 전신 질환의 군을 지칭한다. 결과는 종종 간 부전, 근육 약화, 피로 및 심장, 눈 및 다양한 다른 계의 문제이다.
미토콘드리아 장애는 프리드라이히 운동실조증을 야기하거나 또는 프리드라이히 운동실조증과 관련된 프라탁신 결핍증; OTC(OTC 유전자에서 비-보존적 돌연변이에 의해 야기되는 X-연관 열성 유전자 장애); LAD 결핍증과 관련된 장애 중 임의의 하나일 수 있거나; 또는 미토콘드리아 대사 장애는 복합체 I 결핍증(OMIM:252010)이다. 복합체 I 결핍증은 이의 임의의 서브유닛에서의 돌연변이에 의해 야기될 수 있다. 대안적으로, 복합체 I 결핍증은 NDUFVl(OMIM: 161015), NDUFV2(OMIM:600532), NDUFSl(OMIM: 157655), NDUFS2(OMIM:602985), NDUFS3(OMIM:603846), NDUFS4(OMIM:602694), NDUFS6(OMIM:603848), NDUFS7(OMIM:601825), NDUFS8(OMIM:602141) 및 NDUF A2(OMIM: 602137)로부터 선택되는 유전자 내 돌연변이에 의해 야기된다.
다른 실시형태에서, 미토콘드리아 장애는 복합체 IV 결핍증(사이토크롬 C 옥시다제; OMIM:220110)이다. 복합체 IV 결핍증은 이의 임의의 서브유닛에서의 돌연변이에 의해 야기될 수 있다. 다른 실시형태에서, 복합체 IV 결핍증은 MTCOl(0MIM:516030), MTCO2(0MIM:516040), MTCO3(0MIM:516050), COXlO(OMIM:602125), COX6B1(OMIM: 124089), SCOl(OMIM:603644), FASTKD2(0MIM:612322) 및 SC02(OMIM:604272)로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자에서의 돌연변이에 의해 야기된다.
다른 실시형태에서, 미토콘드리아 장애는 신경퇴행성 질환이다. 본 명세서에서 제공되는 바와 같이, 본 발명의 조성물은 혈액-뇌 장벽(BBB)을 가로지르는 능력을 나타낸다.
현재 개시된 대상의 추가 실시형태에서, 미토콘드리아 장애는 격렬한 젖산 산증, 고암모니아혈증 및 응고장애에 의해 수반되는 뇌증 및 간부전으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 미토콘드리아 장애는 오르니틴 트랜스카바모일라제 결핍증(고암모니아혈증)(OTCD), 카르니틴 O-팔미토일트랜스퍼라제 II 결핍증(CPT2), 푸마라제 결핍증, 리증후군과 관련된 사이토크롬 c 옥시다제 결핍증, 메이플 시럽 요증(MSUD), 중간쇄 아실-CoA 탈수소효소 결핍증(MCAD), 아실-CoA 탈수소효소 초장쇄 결핍증(LCAD), 삼기능성 단백질 결핍증, 미토콘드리아 DNA 결실에 의한 진행성외안근마비(POLG), DGUOK, TK2, 피루브산 탈카복실화효소 결핍증 및 리증후군(LS)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 미토콘드리아 대사 장애는 알퍼스병; 바르트 증후군; 베타 -산화 결함; 카르니틴- 아실-카르니틴 결핍증; 카르니틴 결핍증; 코-엔자임 QlO 결핍증; 복합체 II 결핍증(OMIM:252011), 복합체 III 결핍증(OMIM: 124000), 복합체 V 결핍증(OMIM:604273), LHON-레버 시신경 위축증; MM- 미토콘드리아 근병증; LIMM-치명적 유아성 미토콘드리아 근병증; MMC-모계 근병증 및 심근증; NARP-신경원성 근위축증, 운동실조, 및 망막색소변성증; 리병; FICP-치명적 유아성 심근증 플러스, MELAS-관련 심근증; 젖산산증 및 뇌졸중양 사건들에 의한 MELAS-미토콘드리아 뇌근병증; LDYT-레버 유전성 시신경 위축증 및 근육긴장이상; MERRF-근간대뇌전증 및 적납근섬유; MHCM-모계 유전성 비후성 심근증; CPEO-만성 진행성 외안근마비; KSS-컨스-세르 증후군; DM-진성 당뇨병; DMDF 진성 당뇨병 + 난청; CIPO-근병증 및 안근마비에 의한 만성 거짓 장폐색; DEAF-모계 유전성 난청 또는 아미노글라이코사이드-유도 난청; PEM-진행성 뇌증; SNHL-감각 신경성 청력손실; 뇌근병증; 미토콘드리아 세포변성; 확장성 심근증; GER-위장내 역류; DEMCHO-치매 및 무도병; AMDF-운동실조, 간대성 근경련증; 운동 과민증; ESOC 뇌전증, 뇌졸중, 시신경 위축, 및 인지력 감퇴; FBSN 가족성 양방향 선조 괴사; FSGS 국소사구체경화증; LIMM 치명적 유아성 미토콘드리아 근병증; MDM 근병증 및 진성 당뇨병; MEPR 근간대뇌전증 및 정신과 운동의 발달 퇴행; MERME MERRF/MELAS 중첩 질환; MHCM 모계 유전성 비후성 심근증; MICM 모계 유전성 심근증; MILS 모계 유전성 리증후군; 미토콘드리아 뇌심장 근병증; 다중 시스템 미토콘드리아 장애(근병증, 뇌증, 실명, 청력 손실, 말초신경병증); NAION 비동맥 전방 국소 빈혈성 시신경병증; NIDDM 비-인슐린 의존성 진성 당뇨병; PEM 진행성 뇌증; PME 진행성 간대성 근경련증 뇌전증; RTT 레트 증후군; SIDS 유아 돌연사 증후군; MIDD 모계 유전성 당뇨병 및 난청; 및 MODY 소아성인형 당뇨병 및 MNGIE로 이루어진 군으로부터 선택된다.
각각의 미토콘드리아 질환은 본 발명의 실시형태를 나타낸다.
상기 및 다른 실시형태에서, 현재 개시된 대상은 프리드라이히 운동실조증 또는 프라탁신의 결핍증 또는 결함 프라탁신과 관련된 임의의 다른 장애의 치료에서 사용을 위해 또는 OTC의 결핍증과 관련되거나 또는 결함 OTC와 관련된 장애의 치료에서 사용을 위해 본 명세서에 정의된 바와 같은 약제학적 조성물을 제공한다.
또한 추가 실시형태에서, 현재 개시된 대상은 치료가 필요한 대상체에게 정맥내 투여에 의해 프리드라이히 운동실조증의 치료를 위한 약제학적 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 치료적 유효량의 본 명세서에 정의된 바와 같은 융합 단백질을 포함한다.
구체적 실시형태에서 현재 개시된 대상은 치료가 필요한 대상체에게 정맥내 투여에 의해 프리드라이히 운동실조증의 치료를 위한 약제학적 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 치료적 유효량의 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 갖거나 또는 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 포함한다.
추가 구체적 실시형태에서, 현재 개시된 대상은 치료가 필요한 대상체에게 정맥내 투여에 의해 프리드라이히 운동실조증의 치료를 위한 약제학적 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 치료적 유효량의 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 포함한다.
또한 추가 구체적 실시형태에서, 현재 개시된 대상은 치료가 필요한 대상체에게 정맥내 투여에 의해 프리드라이히 운동실조증의 치료를 위한 약제학적 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 치료적 유효량의 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 포함한다.
현재 개시된 대상은 미토콘드리아 장애의 치료를 위한 방법에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 융합 단백질을 추가로 제공한다.
현재 개시된 대상의 상기 및 다른 실시형태에서, 기능성 인간 미토콘드리아 단백질은 프리드라이히 운동실조증 또는 프라탁신의 결핍증 또는 결함 프라탁신과 관련된 임의의 다른 장애의 치료 또는 완화를 위한 방법에서 사용하기 위한 프라탁신이다.
현재 개시된 대상의 상기 및 다른 실시형태에서, 기능성 인간 미토콘드리아 단백질은 OTC의 결핍증과 관련되거나 또는 결함 OTC와 관련된 장애의 치료 또는 완화를 위한 방법에서 사용하기 위한 OTC이다.
이하의 실시예 7에서 나타내는 바와 같이, 본 발명자들은 TAT, MTS 및 프라탁신(TAT-MTS-FRA)을 포함하는 융합 단백질이 산화적 스트레스로부터 프리드라이히 운동실조증 환자로부터 얻은 세포뿐만 아니라 정상 세포를 부분적으로 구조해서, 현재 개시된 대상의 융합 단백질 작제물의 분명한 생물학적 활성을 나타낼 수 있다는 것을 나타낸다.
L-부티오닌 설폭시민(BSO)은 감마-글루타밀시스테인 합성효소(감마-GCS)의 저해제이며, 결과적으로 조직 글루타티온(GSH) 농도를 저하시킨다. GSH는 티오에터 컨쥬게이트의 형성을 통해 매우 다양한 독성 친전자체에 대한 세포 방어에서 중요한 역할을 한다. 따라서, BSO는 드노보 글루타티온 합성을 저해함으로써, 활성 산소종(reactive oxygen species: ROS)에 대해 이들 세포 고유의 방어의 중요한 구성성분을 고갈시키고, 세포사를 초래하는 것으로 알려진 천연 세포 과정에 의해 생성되는 ROS를 축적시키는 그의 능력을 통해 산화적 스트레스를 모델링하기 위해 본 발명자들에 의해 사용되었다.
프리드라이히 운동실조증 세포는 그들이 프라탁신을 결여하기 때문에 정상세포에 비해 BSO-유도 산화적 스트레스에 극도로 민감하고, 따라서 프라탁신이 없는 장기간 결과의 시험관내 모델로서 사용되는 것이 알려져있다.
이하의 실시예에서 나타내는 바와 같이, 산화적 스트레스는 환자로부터 얻은 세포뿐만 아니라 정상의 건강한 세포에서 다양한 농도의 BSO에 의해 유도되었고, 세포사에 대한 다양한 TAT-MTS-FRA 융합 단백질의 효과가 측정되었다. 도 11에서 알 수 있는 바와 같이, BSO는 정상 림프구뿐만 아니라 프리드라이히 운동실조증 환자로부터 얻은 세포의 세포사를 야기하였다. 그러나, 환자로부터 얻은 세포는 이전의 발견과 일치되게 BSO-유도 산화적 스트레스에 더 민감하였다. 가장 중요하게는, 산화적 스트레스 유도 몇 시간 전에 첨가된 다양한 TAT-MTS-FRA 융합 단백질은 정상 림프구뿐만 아니라 세포사로부터의 환자 세포 둘 다를 부분적으로 구조하는 것이 입증되었다. 이 부분적 구조는 세포사의 감소와 카파제 3 활성의 감소 둘 다에 의해 결정되었다.
놀랍게도, 도 11에 또한 나타낸 바와 같이, 이종성 MTS를 운반하는 3개의 융합 단백질 중 적어도 둘(즉, MTSorf 및 MTScs)은 천연 MTS를 운반하는 융합 단백질에 의해 입증되는 효과에 대해 우수한 보호 효과를 입증하였다.
추가로, 도 12에서 나타내는 독립적 비교 실험에서, 산화적 스트레스에 대한 다양한 TAT-MTS-FRA 융합 단백질의 효과가 시험되었고, 다른 이종성 MTS, 즉, MTSlad를 운반하는 융합 단백질은 또한 천연 MTS를 운반하는 융합 단백질에 의해 입증되는 효과에 대해 우수한 보호 효과를 입증하였다(도 12c).
따라서, 현재 개시된 대상은 미토콘드리아 장애를 치료하거나 또는 완화시키기 위한 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 이러한 치료가 필요한 대상체에게 치료적 유효량의 본 명세서에 정의된 바와 같은 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함함으로써, 미토콘드리아 장애를 치료한다.
상기 및 다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 미토콘드리아 장애를 치료하거나 또는 완화시키기 위한 방법이 제공되되, 상기 기능성 단백질은 프라탁신 또는 OTC이고, 미토콘드리아 장애는 프리드라이히 운동실조증 또는 프라탁신의 결핍증 또는 결함 프라탁신과 관련된 임의의 다른 장애 또는 각각 OTC의 결핍증과 관련되거나 또는 결함 OTC와 관련된 장애이다.
본 명세서에 정의된 바와 같은 용어 "치료하다" 또는 "치료" 또는 이의 형태들은 치료가 필요한 대상체에서 질환 또는 병태의 악화 방지 또는 저지 또는 완화 또는 치유하는 것을 의미한다. 따라서, 의도하는 내용에서 용어 "치료", "치료하는" 또는 "완화시키는"은 질환을 야기하는 돌연변이 유전자를 변화시키지 않는다면, 질병의 완전한 치유를 지칭하지는 않는다. 이 용어는 질환과 관련된 바람직하지 않은 증상 중 적어도 하나를 완화시키고, 대상체의 삶의 질을 개선시키며, 질환-원인 사망률을 감소시키거나, 또는 주로 고에너지 요구가 있는 기관 미치 조직에 대해 (초기에 충분히 치료제가 투여된다면) 미토콘드리아 장애가 생기기 전에 그것의 완전한 징후를 예방하는 것을 지칭한다. 치료는 만성 질환에 대해 연속적 장기간 치료 또는 격렬한 젖산 산증, 고암모니아혈증 및 응고장애를 수반하는 뇌증 및 간부전과 같은 급성 병태의 치료를 위한 단일, 몇몇 또는 다수 투여일 수 있다.
특히, 대사 또는 미토콘드리아 장애의 경우에, 단백질 활성을 100%까지 다시 회복시킬 필요는 없지만, 기본적 단백질 활성에 따라서 환자에 따라 다를 수 있는 특정 에너지 역치 초과로 상승시킬 필요는 있다.
추가로, 대체 요법을 이용하는 미토콘드리아 장애의 치료는 세포질 유전자 잔물의 대체보다 필연적으로 더 복잡하며, 미토콘드리아에서 다수 막을 표적화하고 가로지를 필요뿐만 아니라 미토콘드리아 내 다수 단백질이 적절하게 통합하기 위해 적절한 조립체를 필요로 하는 다중-구성성분 복합체로서 작용한다는 사실을 고려하여야 한다. 추가적으로, 다수의 미토콘드리아 유전자 결함은 주된 또는 대부분의 우세한 표현형으로서 중증의 신경 증상을 야기하고, 상기 언급한 바와 같이, BBB를 가로지르는 약물 전달은 어렵다.
치료 제형은 임의의 통상적인 경로 및 투약 제형에서 투여될 수 있다. 제형은 전형적으로 상기 정의한 바와 같이 적어도 하나의 활성 성분을 이의 하나 이상의 허용가능한 담체와 함께 포함한다. 따라서, 투여는 정맥내, 복강내, 근육내 및 척수강내 투여 중 임의의 하나일 수 있다. 경구 투여가 또한 고려된다.
본 명세서에 정의된 목적을 위한 용어 "치료적 유효량"(또는 양들)의 펩타이드는 의학적 병태를 치유 또는 적어도 저지 또는 적어도 완화시키기 위해 당업계에 공지된 바와 같은 사항에 의해 결정된다.
상기 나타낸 바와 같이, 대사성 또는 미토콘드리아 장애의 경우에, 단백질 활성을 다시 100%로 회복시킬 것이 필요하지는 않다. 오히려, 기본적 단백질 활성에 따라서 환자에 따라 다를 수 있는 특정 에너지 역치 값 초과로 단백질 활성을 상승시키는 것은 치료적 효과를 제공하기에 충분할 수 있다.
일부 실시형태에서, 치료적 유효량은 환자의 기본적 단백질 활성에 기반하여 각각의 환자에 대해 개별적으로 결정될 수 있다. 환자의 기본적 단백질 활성 또는 단백질 활성 수준은 결국 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여, 예를 들어 환자로부터 얻은 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액(백혈구), 피부 섬유아세포, 전체 조직 생검)에 시험관내 효소 분석 또는 면역조직화학 또는 PET와 같은 임의의 특이적 영상화를 실시함으로써 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 기능성 인간 미토콘드리아 단백질은 OTC이고, 환자의 기본적 OTC 활성은 간 생검에 의해 결정된다.
일부 실시형태에서, 현재 개시된 대상에 따른 치료적 유효량은 약 7㎎/㎏ 내지 약 25㎎/㎏의 마우스에서의 유효량의 인간 등가 용량(HED)인, 약 0.5㎎/㎏ 내지 약 2.0㎎/㎏ 치료가 필요한 환자의 체중이다.
따라서 구체적 실시형태에서 본 명세서에 정의된 바와 같은 약제학적 조성물이 개시되되, 투여되는 치료적 유효량은 약 0.5㎎/㎏ 내지 약 2㎎/㎏ 상기 환자의 체중이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "치료가 필요한 대상체"는 본 명세서에 정의된 바와 같은 미토콘드리아 장애로 고통받고 있는 인간을 의미한다.
상기 및 다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 미토콘드리아 장애를 치료 또는완화시키기 위한 방법은 추가적인 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
본 명세서에 정의되는 바와 같은 용어 "추가적인 치료제"는 질환 또는 장애와 관련된 증상을 완화시키기 위해 본 발명에 따른 융합 단백질에 추가로 바람직한 치료가 투여되는 임의의 작용제를 지칭한다. 개시된 대상의 상기 및 임의의 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질 및 상기 추가적인 치료제는 동시에 투여된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 상기 융합 단백질 및 상기 추가적인 치료제는 상이한 시점에, 투여 사이의 상이한 간격에서, 상이한 지속시간 동안 또는 상이한 순서로 투여된다.
개시된 대상은 대상체의 미토콘드리아 내로 기능성 미토콘드리아 단백질을 도입하기 위한 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 이러한 치료가 필요한 대상체에게 본 명세서에 정의된 바와 같은 치료적 유효량의 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함함으로써 기능성 미토콘드리아 단백질을 이러한 치료가 필요한 대상체의 미토콘드리아 내로 도입한다.
일부 실시형태에서, 이에 의해 도입된 기능성 인간 미토콘드리아 단백질은 야생형 인간 미토콘드리아 단백질의 활성을 적어도 부분적으로, 예를 들어, 야생형 인간 미토콘드리아 단백질의 활성의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 100%까지 회복시킨다.
따라서, 개시된 대상은 대상체에게 본 명세서에 개시된 바와 같은 융합 단백질을 투여함으로써 치료가 필요한 대상체에서 결함 또는 결핍 또는 비기능성 인간 미토콘드리아 단백질의 활성을 적어도 부분적으로 회복시키기 위한 방법을 추가로 제공한다. 인간 미토콘드리아 단백질은 그 자체가 활성일 수 있거나, 또는 미토콘드리아 단백질 복합체의 구성원일 수 있다.
그의 양태 중 다른 하나에 의해, 개시된 대상은 치료가 필요한 대상체에서 산화적 스트레스를 완화시키기 위한 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 이러한 치료가 필요한 대상체에게 치료적 유효량의 본 명세서에 정의된 바와 같은 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함함으로써 상기 대상체에서 산화적 스트레스를 완화시킨다.
본 명세서에 정의된 바와 같은 용어 "산화적 스트레스"는 활성 산소종(ROS)의 전신적 증세와 반응 중간체를 용이하게 해독하거나 또는 얻어진 손상을 수선하기 위한 생물학적 시스템의 능력 간의 불균형을 지칭한다. 세포의 정상 산화환원 상태에서의 장애는 세포의 모든 구성성분을 손상하는 과산화물 및 유리 라디칼의 생성을 통해 독성 효과를 야기할 수 있다. 추가로, 일부 활성 산소종은 산화환원 신호전달에서 세포 전령으로서 작용하기 때문에, ROS의 축적은 세포 신호전달의 정상 메커니즘에서 장애를 야기할 수 있다. 인간에서, 산화적 스트레스는 다양한 장애 및 병태, 특히 몇가지 예를 들면, 암, 파킨슨병, 알츠하이머병의 발생에 연루되는 것으로 생각된다.
명확함을 위해 별도의 실시형태의 내용에서 기재되는 현재 개시된 대상의 특정 특징은 또한 단일 실시형태와 조합하여 제공될 수 있다는 것이 인식된다. 반대로, 간략함을 위해 단일 실시형태의 내용에서 기재되는 본 발명의 다양한 특징은 또한 별도로 또는 임의의 적합한 하위 조합으로 또는 본 발명의 임의의 다른 기재된 실시형태에서 적합하게 제공될 수 있다. 다양한 실시형태의 내용에서 기재되는 특정 특징은 실시형태가 해당 구성요소 없이 작동하지 않는 한, 해당 실시형태의 필수적 특징으로 고려되어서는 안 된다.
본 발명은 본 명세서에 개시된 특정 실시예, 과정 단계 및 물질로 제한되지 않는데, 이러한 단계들 및 물질들은 다소 다를 수 있기 때문이라는 것이 이해되어야 한다는 것이 개시되고 설명된다. 또한 본 명세서에 사용된 용어는 단지 특정 실시형태를 설명하는 목적을 위해 사용되고, 제한하는 것으로 의도되지 않는데, 본 발명의 범주는 단지 첨부되는 특허청구범위 및 이의 동등물에 의해서만 제한되는 것이 이해되어야 한다.
본 명세서 및 첨부하는 특허청구범위에서 사용되는 바와 같은 단수 형태는 달리 명확하게 지시되지 않는 한, 복수 대상을 포함하는 것을 주의하여야 한다.
본 명세서 및 다음의 특허청구범위 전체적으로, 달리 필요로 되지 않는 한, 단어 "포함하다" 및 변형어, 예컨대 "포함하다" 및 "포함하는"은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 군의 포함을 의미하지만, 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 군의 제외를 의미하지 않는다는 것이 이해될 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 관련된 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 다음의 용어는 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 목적을 위해 정의된다.
다음의 실시예는 본 발명의 양태를 수행함에 있어 본 발명자에 의해 사용된 기법을 대표한다. 이들 기법이 본 발명의 실행을 위한 바람직한 실시형태의 예시이지만, 당업자는 본 개시내용에 비추어 본 발명의 정신 및 의도된 범주로부터 벗어나는 일 없이 수많은 변형이 만들어질 수 있다는 것을 인식할 것으로 이해되어야 한다.
실시예
추가적인 정교화 없이, 당업자는 앞의 설명을 이용하여 본 발명을 그의 가장 완전한 정도로 이용할 수 있다는 것을 믿는다. 따라서, 다음의 바람직한 구체적 실시형태는 단지 예시적이며, 특허청구된 본 발명의 임의의 방식으로 제한하지 않는다는 것이 이해되어야 한다.
본 명세서에 구체적으로 기재되지 않은 당업계에 공지된 표준 분자 생물학 프로토콜은 본질적으로 문헌[Sambrook & Russell, 2001]에서와 같이 일반적으로 따른다.
실험 절차
세포 배양물
프리드라이히 운동실조증 환자로부터의 림프구(Lym 43) 및 섬유아세포(Fib. 78 및 Fib. 65, F816)를 코리엘 셀 리파지토리즈(Coriell Cell Repositories)(뉴저지주 캠던에 소재)로부터 얻었고, 권장되는 배지(얼(Earle)의 염 및 비필수 아미노산을 지니는 이글의 최소 필수 배지(EMEM) 중의 섬유아세포, 및 2mM L-글루타민을 지니는 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institute: RPMI) 배지 1640 중의 림프구, 모두 불활성화되지 않은 15% 소 태아 혈청으로 보충함)에서 성장시켰다. 인간 BJAB 세포(EBV-음성 버킷 림프종 세포; 이스라엘 예루살렘에 소재한 하다사 메디컬 센터(Hadassah Medical Center)의 한나 벤 바셋(Hanna Ben-Bassat)에 의해 제공됨)를 20% 열-불활성화된 송아지 태아 혈청(FCS), 2mM L-글루타민, 100 U/㎖ 페니실린, 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신으로 보충한 RPMI 배지 중에서 성장시켰다. 정상 림프구[20]를 10% 송아지 태아 혈청(FCS) 및 상기와 같은 항생제로 보충한 RPMI 1640에서 성장시켰다. HepG2 세포(ATCC: HB-8065)를 10% FCS, 2mM L-글루타민, 비-필수 아미노산, 항생제 및 피루브산나트륨으로 보충한 EMEM에서 성장시켰다. 모든 배양 세포를 37℃에서 5% CO2와 함께 성장시켰다. 모든 배지 및 보충물을 바이올로지컬 인더스트리즈(Biological Industries)(이스라엘 베트 하에멕에 소재)로부터 구입하였다. 세포를 37℃에서 5% CO2와 함께 습한 분위기에서 유지하였다. 모든 배양물을 마이코플라스마 오염에 대해 시험하고 나서, 음성이 되는 것을 발견하였다.
융합 단백질을 암호화하는 플라스미드의 클로닝
His-TAT- MTSfra - FRA
플라스미드 His-TAT-LAD를 이전에 보고한 바와 같이 제조하였고[23] BamHI 및 XhoII를 이용하여 절당해서 LAD 서열을 제거하고, 따라서, His-TAT 도메인을 암호화하는 벡터 단편을 얻었다. 주형으로서 프라탁신 클론(오픈 바이오시스템 엘티디(Open Biosystem, Ltd.), 클론 번호 4842134)을 이용하고 및 그의 천연 MTS, 각각 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 바와 같은 5'-CGCGGATCCGTGGACTCTCGGGCGCCG-3'(정방향) 및 5'-ACGCTCGAGTCAAGCATCTTTTCCGGAATAGGC-3'(역방향)를 포함하는 전체 서열을 아우르는 짝짓기 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 전장 프라탁신을 생성하였다. BamHI 및 XhoII를 이용하여 PCR 단편을 절단하고 나서, 벡터 단편과 결찰시키고, 이에 의해 His-TAT-MTSfra-FRA 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드를 얻었다.
His- MTSlad - FRA
His-TAT-MTSfra-FRA를 암호화하는 플라스미드를 BamHI 및 BsaI을 이용하여 절단해서 MTSfra 서열을 제거하였다. 주형으로서 플라스미드 His-TAT-LAD[23]를 이용하고 다음의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR에 의해 MTSlad(리포아마이드 탈수소효소의 천연 MTS)를 얻었다: 각각 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 바와 같은 5'-CGCGGATCCACAGAGCTGGAGTCGTGTGTA-3'(정방향) 및 5'-CATAGG-TGGTCTCATCTAGAGAGCCTGGGTGGCCCAAAGTTCCAGATGCGTAAGTTCTCAGAGGCA-3'(역방향). PCR 산물을 BamHI 및 BsaI를 이용하여 절단하고 나서, 벡터 단편에 결찰시키고, 이렇게 해서 His-TAT-MTSlad-FRA 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드를 얻었다.
His-TAT- MTSorf - FRA
His-TAT-MTSfra-FRA를 암호화하는 플라스미드를 BamHI 및 BsaI를 이용하여 절단하여 상기 기재된 바와 같은 MTSfra 서열을 제거하였다. 주형으로서 플라스미드 His-TAT-ORF를 이용하고 다음의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR에 의해 MTSorf(단백질 C6ORF66 조립체 인자의 천연 MTS)를 얻었다: 각각 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 바와 같은 5'-CGCGGATCCGGGAGCACTAGTGATTCGC-3'(정방향) 및 5'-CATAGGTG GTCTCATCTAGAGAGCCTGGGTGGCCCAAAGTTCCAGAAGAGGGGTGTCTGGGAGCGA-3'(역방향). PCR 산물을 BamHI 및 BsaI를 이용하여 절단하고 나서, 벡터 단편에 결찰시키고, 이렇게 해서 His-TAT-MTSorf-FRA 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드를 얻었다.
His-TAT- MTScs - FRA
His-TAT-MTSfra-FRA를 암호화하는 플라스미드를 BamHI 및 BsaI를 이용하여 절단하여 상기 기재된 바와 같은 MTSfra 서열을 제거하였다. MTScs 서열 및 말단에서 BamHI 및 BsaI 부위: 각각 서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 바와 같은 5'-GATCCGGCTTTACTTACTGCGGCCGCCCGGCTCTTGGGAACCAAGAATGCATCTTGTCTTGTTCTTGCAGCCCGGCATGCCAGTTCTGGAACTTTGGGCCACCCAGGCTCTC-3'(정방향) 및 5'-TCTAGAGAGCCTGGGTGGCCCAAAGTTCCAG AACTGGCATGCCGGGCTGCAAGAACAAGACAAGATGCATTCTTGGTTCCCAAGAGCCGGGCGGCCGCAGTAAGTAAAGCCG-3'(역방향)을 아우르는 두 올리고뉴클레오타이드를 합성함으로써 MTScs(단백질 시트레이트 신타제의 천연 MTS)를 생성하였다. 올리고뉴클레오타이드를 벡터 단편에 결찰시키고, 이렇게 해서 His-TAT-MTScs-FRA 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드를 얻었다. 이하에 기재하는 일부 분석에서, 사용한 His-TAT-MTScs-FRA 융합 단백질 작제물을 젠스크립트(Genscript)(로트(Lot) #342511S03/P10011312; 50mM 트리스-HCl, 300mM NaCl, 10% 글라이세롤, pH 8.0 중의 2.5㎎/㎖ 저장액)로부터 얻었다.
제한 효소 및 서열화 분석에 의해 모든 플라스미드를 확인하였다.
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상기 표 1은 상기 기재한 바와 같은 프라이머의 핵산 서열(nt)(즉, 서열번호 7 내지 서열번호 14로 표시되는 프라이머), TAT 도메인의 아미노산 서열(aa)(서열번호 21로 표시됨), 본 개시내용에서 사용되는 TAT 도메인의 단편의 아미노산 서열(서열번호 27로 표시됨) 및 이를 암호화하는 핵산 서열(서열번호 1로 표시됨), 다양한 MTS, 즉 MTS fra, MTS cs, MTS orf 및 MTS lad의 아미노산 서열(각각 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 25 및 서열번호 24로 표시됨) 및 이를 암호화하는 핵산 서열(각각 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시됨), 성숙 프라탁신의 아미노산 서열(서열번호 26으로 표시됨) 및 이를 암호화하는 핵산 서열(서열번호 6으로 표시됨)뿐만 아니라 OTC 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 인간 미토콘드리아 GLUD2의 MTS(각각 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시됨)을 요약한다. GSDP의 아미노산 서열을 갖는 4개-아미노산 길이 링커를 또한 상기 표 1에 열거하고, 서열번호 32로 표시된다.
추가로, 상기 표 1은 성숙 프라탁신, 즉, His TAT MTS(cs) 81-210 FRA, His TAT MTS(fra) 81-210 FRA(또한 본 명세서에서 "HT프라탁신"으로서 나타냄), His TAT MTS(lad) 81-210 FRA 및 His TAT MTS(orf) 81-210 FRA(각각 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20으로 표시됨)을 포함하는 다양한 His TAT MTS 81-210 FRA 작제물의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20으로 표시되는 다양한 His TAT MTS 81-210 FRA 작제물은 모두 서열번호 32로 표시되는 짧은 펩타이드 링커를 포함하며, 이는 TAT 및 MTS 도메인에 결합한다.
상기 표 1은 그들의 N-말단에 His 태그가 없고 서열번호 32로 표시되는 짧은 펩타이드 링커(TAT 및 MTS 도메인에 결합)를 지니도록 구성된 다양한 융합 작제물의 아미노산 서열을 추가로 나타낸다. 이들 작제물은 각각 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30 및 서열번호 31로 표시되는 TAT, 링커, MTS 및 성숙 프라탁신(81-210 FRA), 즉 TAT MTS(cs) 81-210 FRA, TAT MTS(fra) 81-210 FRA, TAT MTS(lad) 81-210 FRA 및 TAT MTS(orf) 81-210 FRA를 포함한다.
추가로 상기 표 1은 His 태그 없이 그리고 링커 없이 구성된 다양한 융합 작제물의 아미노산 서열을 나타낸다. 이들 융합 작제물은 각각 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35 및 서열번호 36으로 표시되는 TAT, MTS 및 성숙 프라탁신(81-210 FRA), 즉, TAT MTS(cs) 81-210 FRA Δ 링커, TAT MTS(fra) 81-210 FRA Δ 링커, TAT MTS(lad) 81-210 FRA Δ 링커 및 TAT MTS(orf) 81-210 FRA Δ 링커를 포함한다.
단백질 발현 및 정제
융합 단백질을 암호화하는 플라스미드를 이용하여 형질전환한 이콜라이(E. coli) BL21-코돈플러스(CodonPlus)(λDE3) 또는 HMS 적격 세포를 카나마이신(50㎍/㎖), 테트라사이클린(12.5㎍/㎖) 및 클로람페니콜(34㎍/㎖)을 함유하는 식염수 락토스 브로스(SLB 배지) 내 37℃에서 인큐베이션시켰다. 0.2 내지 0.3의 OD600에서, 0.1% 글라이세롤 및 0.1mM 글루탐산 칼륨을 배양물에 첨가하고, 이어서, 42℃에서 20 내지 30분 동안 열충격을 가하고, 이후에 0.8의 OD600까지 박테리아를 37℃에서 성장시켰다. 아이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG, 최종 농도에 대해 이하의 표 2를 참고)를 첨가함으로써 단백질 발현을 유도하였다. 22℃에서 18시간의 인큐베이션 후에, 세포를 원심분리에 의해 채취하였다(4℃에서 15분 동안 500g).
정체 절차를 위해, 발현 세포의 0.5ℓ 배양물로부터의 박테리아 펠렛을 결합 완충제(PBS, pH 7.4, 0.4 M NaCl, 10% 글라이세롤, 1mM 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF) 및 30mM 이미다졸(미국 미조리주 세인트루이스에 소재한 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich))) 중에서 초음파 처리하였다. 현탁액을 원심분리(4℃에서 30분 동안 35,000g)에 의해 정화시키고 나서, 융합 단백질을 함유하는 상청액을 결합 완충제 사전-평형화한 하이트랩 킬레이팅 HP(HiTrap Chelating HP) 칼럼(스웨덴 웁살라에 소재한 애머샴-파마시아 바이오테크(Amersham-Pharmacia Biotech))을 이용하여 천연 조건 하에 정제하였다. 이미다졸 농도를 증가시키면서 단계적으로 첨가하여 칼럼을 세척하였다. 최종적으로, 표적 단백질을 용리 완충제(PBS, pH 7.4, 0.4 M NaCl, 10% 글라이세롤, 250mM 이미다졸)를 이용하여 용리시켰다. FPLC 시스템 AKTA(애머샴-파마시아 바이오테크)를 이용하여 모든 정제 절차를 수행하였다. PD-10 탈염 칼럼(미국 뉴저지주 피츠카타웨이에 소재한 GE 헬스케어(GE Healthcare))을 이용하여 PBS에 정제된 단백질을 옮김으로써 이미다졸, NaCl 및 글라이세롤을 제거하였다. 단백질의 알리쿼트를 사용할 때까지 -80℃에서 냉동을 유지하였다.
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융합 단백질의 특성규명
단백질 농도의 결정 브래드포드(Bradford) 시약 및 BSA의 표준 곡선을 이용하는 브래드포드 방법에 따라 단백질 농도를 측정하였다. 단백질 농도를 595㎚의 파장에서 결정하였다.
전기영동에 의한 단백질의 분리 다양한 단백질 분획(5 내지 20㎍ 단백질/레인)으로부터의 샘플을 12% 또는 15%(w/v) SDS-PAGE 겔 상에 장입하였다. 스튜어디어 슬랩(Sturdier Slab) 겔 전기영동 장치를 이용하여 제조업자의 설명서(미국 캘리포니아주 샌디에이고에 소재한 호에페르 스치 인스트루먼츠(Hoefer Sci Instruments))에 따라 단백질의 분리를 행하였다.
웨스턴 블롯 분석 단백질(5 내지 20㎍ 단백질/레인)을 12%-15% SDS-PAGE 겔 상에서 분해하고 나서, 임모빌론-피(Immobilon-P) 수송막(미국 펜실베니아주 브래드포드에 소재한 밀리포어(Millipore)) 상에 옮겼다. 웨스턴 블롯 분석을 항-프라탁신(앱캠(Abcam)) 또는 항-His(애머샴-파마시아 바이오테크(Amersham-Pharmacia Biotech)) 항체 중 하나를 각각 1:600 및 1:30,000의 희석에서 사용하여 수행하여 적절한 단백질을 동정하였다. 호스래디쉬 페록시다제(HRP)에 컨쥬게이트된 적합한 2차 항체(1:10,000)를 이용하여 블롯팅함으로써 1차 항체 결합을 검출하였다. 강화 화학발광 키트(EZ-ECL, 이스라엘 베이트-하에멕에 소재한 바이올로지컬 인더스트리즈(Biological Industries))를 이용하여 밴드 시각화를 행하였다.
환자의 섬유아세포의 미토콘드리아 내로 TAT-MTS- FRA 의 내재화
FA 환자 섬유아세포(코리엘 리포지토리(Coriell repository), #GM03816, F816로 칭함)를 해동시키고 나서, 적어도 2 내지 3회 계대시킨 후 성능을 분석하고, 이어서, 프라탁신 및 미토콘드리아 표적화 서열(MTS)로서 시트레이트 신타제를 포함하는 융합 단백질 작제물 TAT-MTS(cs)-FRA(20㎍/㎖)의 존재에서 2, 6 및 48 시간 동안 인큐베이션시키고, 24시간 후에 TAT-MTS(CS)-FXN(20㎍/㎖에서)를 새로 첨가하였다. 비히클을 음성 대조군으로서 첨가하였다. 세포를 미토콘드리아 단리 키트(밀리포어, MIT1000)를 이용하여 세포질(C) 및 미토콘드리아(M) 분획으로 분획화하였다. 모든 분획을 차단 용액 중에서 1:500으로 희석시킨 프라탁신의 C-말단 영역으로 향하는 단클론성 항-프라탁신 항체(앱노바(Abnova), 카탈로그 번호 H00002395-M02, 로트 08078-3F3)를 이용하여 웨스턴 블롯 분석에서 분석하였다. 차단 용액 중에서 1:20,000으로 희석시킨 1㎎/㎖ 의 염소 항 마우스 IgG-h+l 알칼린 포스파타제 컨쥬게이트된 항체(BETHYL, 카탈로그 번호 A90-116AP-16)에서 1㎖를 이용하여 검출을 수행하였다. BCIPO/NBT-블루(시그마(Sigma), B3804)를 면역블롯하는데 사용하기 위한 바로 사용 가능한 완충 알칼리 포스파타제 기질을 이용하여 신호를 발생시켰다.
아코니타제 활성 분석
상업적 키트(앱캠, ab109712, 마이크로플레이트 분석 키트)를 이용하여 제조업자의 설명서에 따라 아코니타제 활성 분석을 수행하였다. 아이소시트레이트의 시스-아코니테이트로의 전환을 구체적 시점에 OD 240㎚의 흡광도에서의 증가로서 측정하고 나서, 활성 속도(mOD/분)로서 계산한다.
산화적 스트레스를 유도하기 위한 BSO 실험
정상 림프구 또는 환자의 림프구(4X103개 세포/100㎕)를 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, 이스라엘 베트 하에멕)에서 페놀 레드 및 피루브산나트륨(실험 배지) 없이 파종하였고, 3 내지 4시간 후, 시험 TAT-MTS-FRA 융합 단백질(0.1㎍/㎕의 최종 농도에서)을 5 또는 24시간 동안 세포에 첨가하였다. 융합 단백질과 함께 인큐베이션 시간 후에, L-부티오닌-설폭시민(BSO, 시그마 B2640)을 상이한 농도로 추가 48시간의 기간 동안 첨가하였다. 인큐베이션 시간의 마지막에, 세포 배양물에 이하에 상술하는 바와 같이 셀타이터-블루(CellTiter-Blue)(상표명) 키트(위스콘신주 메디슨에 소재한 프로메가(Promega))를 이용하여 제조업자의 설명서에 따라 세포 생존도 또는 세포 증식 분석을 실시하였다. 섬유아세포에서 수행한 실험에서, 세포(3X103개 세포/100㎕)를 상기 구체화한 바와 같이 성장 배지 중에 씨딩하고 나서, 24시간 동안 세포를 부착시켰다. 24시간 후에, 배지를 실험 배지로 변화시키고 나서, 상기 림프구에 대해 기재한 바와 같이 실험을 계속하였다.
세포 증식 분석
현탁액 중에서 성장하는 104/100㎕/웰 세포 또는 5 x 103/100 ㎕/웰 부착 세포를 파종하고 나서, 48 내지 72시간 동안 융합 단백질의 농도를 증가시키면서 처리하였고, 이후에 셀타이터-블루(등록상표) 시약(위스콘신주 메디슨에 소재한 프로메가)을 제조업자의 설명서에 따라 첨가하여 세포 생존을 결정하였다. 모든 처리를 3회 중복해서 수행하였다.
시험관내 카스파제 3 활성 분석
현탁액 중에서 성장하는 104/100개 ㎕/웰 세포 또는 5 x 103/100 ㎕/웰 부착 세포를 융합 단백질(0.15㎎/㎖, 최종 농도)로 처리하였다. 세포 내에서 카스파제3 활성을 아포-온(Apo-ONE)(등록상표) 균질 카스파제3/7 분석 키트(프로메가)에 의해 평가하였다. 카스파제 3 활성 분석을 세포 생존도 분석과 병행하여 수행하였다.
His-TAT-MTS-OTC 작제물의 제조
His-TAT-MTS 단편, 즉, His-TAT-MTS(otc)-OTC, His-TAT-MTS(lad)-OTC, His-TAT-MTS(cs)-OTC 및 His-TAT-MTS(orf)-OTC에 컨쥬케이트된 오르니틴 트랜스카바모일라제(OTC)를 포함하는 융합 단백질 작제물을 젠스크립트(GenScript)로부터 얻었다. 이들 융합 단백질 작제물을 이콜라이 세포에서 이들 작제물을 보유하는 벡터를 발현시킴으로써 제조하였고, Ni 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 약 80% 순도로 봉입체로부터 정제하였다.
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표 3은 OTC 단백질의 MTS의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(각각 서열번호 38 및 서열번호 37로 표시됨), 성숙 OTC의 아미노산 서열(서열번호 39로 표시됨), 및 융합 단백질 작제물 His-TAT-MTS(otc)-OTC Δ 링커, His-TAT-MTS(cs)-OTC, His-TAT-MTS(orf)-OTC 및 His-TAT-MTS(lad)-OTC를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(각각 서열번호 40로 표시되고, 서열번호 41, 서열번호 42 및 서열번호 43으로 표시됨)을 열거한다.
표 3은 또한 융합 단백질 작제물 His-TAT-MTS(otc)-OTC Δ 링커, His-TAT-MTS(cs)-OTC, His-TAT-MTS(orf)-OTC 및 His-TAT-MTS(lad)-OTC의 아미노산 서열(각각 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46 및 서열번호 47로 표시됨)을 나타낸다.
또한 미토콘드리아 활성 단백질 OTC를 포함하는 융합 단백질 작제물이 열거되며, 여기서 융합 단백질 작제물은 His 태그, 즉, 서열번호 48로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 작제물 TAT-MTS(otc)-OTC Δ 링커, TAT-MTS(cs)-OTC(서열번호 49로 표시됨), TAT-MTS(orf)-OTC(서열번호 50으로 표시됨) 및 TAT-MTS(lad)-OTC(서열번호 51로 표시됨)를 포함하지 않는다.
본 개시내용에 따른 융합 단백질 작제물은 TAT와 MTS 단편 사이에 위치된 링커의 존재 하에 또는 그것 없이 제조될 수 있다. 따라서 표 3은 또한 His-TAT-MTS(otc)-OTC Δ 링커, TAT-MTS(cs)-OTC Δ 링커, TAT-MTS(orf)-OTC Δ 링커, TAT-MTS(lad)-OTC Δ 링커로 칭해지는 융합 단백질 작제물의 서열(각각 서열번호 44, 서열번호 52, 서열번호 53 및 서열번호 54로 표시됨)을 열거한다.
미토콘드리아 내로 His-TAT-MTS-OTC 작제물의 내재화
107개 HepG2 세포의 배양물(ATCC, #HB-8065)을 T-75 플라스크에 파종시켰다. 다음날, 상기 기재한 바와 같이 12㎍/㎖로 제조한 OTC, CS 또는 LAD 중 하나를 포함하는 TAT-MTS-OTC 융합 단백질 작제물을 20분, 1 또는 3 시간의 인큐베이션을 위해 이글의 최소 필수 배지(EMEM) 완전 배지 내 또는 DMSO(1%) 및 트레할로스(30mM)로 보충한 EMEM 배지 내 또는 DMSO(1%), 트레할로스(30mM) 및 오르니틴(1mM)으로 보충한 EMEM 배지 내 세포에 첨가하였다. 이어서, 세포를 미토콘드리아 단리 키트(밀리포어, MIT1000)를 이용하여 제조업자의 설명서에 따라 세포질 및 미토콘드리아 분획으로 분획화하였다. 분획을 1:1000로 희석시킨 1㎎/㎖에서의 OTC의 C 말단 영역으로 향하는 단클론성 항-프라탁신 항체(아비바 시스템즈 바이올로지(Aviva Systems Biology), 카탈로그 번호 ARP41767_P050)를 이용하여 웨스턴 블롯 분석에서 분석하였다. 차단 완충제() 중에서 1:20,000으로 희석시킨 0.8㎎/㎖에서 컨쥬게이트된 염소 항 토끼 IgG(H_L) 2차 항체 페록시다제(잭슨 아피니퓨어(Jackson AffiniPure), 코드 111-035-003)를 이용하여 검출을 수행하였다. 화학발광 혼합물(SC-2048 산타 크루즈(Santa Cruz))을 이용하여 제조업자의 설명서에 따라 신호를 발생시켰다.
OTC의 효소 활성에 의한 시트룰린의 시험관내 생성
상기 기재한 바와 같이 제조한 OTC 또는 CS의 MTS를 포함하는 정제한 TAT-MTS-OTC 융합 단백질 작제물을 [40]에 기재한 바와 같이 그들의 효소적 활성에 대해 시험하였다. 간략하게, 단백질을 미토콘드리아 용해 완충제(0.5% 트리톤, 10mM HEPES, pH 7.2 및 2mM 다이티오트레이톨) 중에서 80㎕의 용적 중의 20㎍의 농도로 희석시켰다. 이어서, 각각의 반응 혼합물의 용적을 520㎕ 반응 혼합물(5mM 오르니틴, 15mM 카바모일 포스페이트, 및 270mM 트라이에탄올아민, pH 7.7)의 첨가에 의해 600㎕로 완료하였다. 교반시킨 후에, 각각의 반응 혼합물을 2개의 별개의 관에 나누고 나서, 제1 관을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰고, 제2관은 "반응이 없는" 배경으로서 작용하였고, OTC 단백질의 내인성 신호를 차감하기 위해 사용하였다. 150㎕의 1:3 황산/인산(용적으로)의 첨가에 의해 반응을 종결시켰다. 이어서, 20㎕의 3% 2,3-부탄다이온 모노옥심을 첨가하고, 15분 동안 암실에서 100℃에서 인큐베이션시키고 나서 490㎚에서 흡광도를 측정함으로써 시트룰린 생성을 결정하였다. 바실러스 서브틸리스로부터의 상업적으로 입수가능한 OTC(Bacillus subtilis)(시그마, 5ng)를 양성 대조군으로서 사용하였다(데이터 미제시).
암모니아의 존재 하에 HepG2 세포 내 OTC의 효소적 활성
웰 당 HepG2 세포 2.5x105개(ATCC, #HB-8065)를 2개의 6-웰 플레이트에 파종시켰다. 다음 날, OTC 또는 CS의 MTS를 포함하는 TAT-MTS-OTC 융합 단백질 작제물(상기 기재한 바와 같이 제조함)을 각각 24시간 후에 보충과 함께 72시간 동안 세포에 적용하였다. 융합 단백질의 최종 농도는 3㎖ 완전 배지에서 14㎍/㎖였고, 최종 완충 희석제는 1:85였다. 단백질 저장 완충제(1×PBS, pH 7.4에서 0.5% 라우로일 사르코신나트륨)는 비히클 대조군으로서 작용하고 비처리 세포는 음성 대조군으로서 작용하였다. 분석의 종결 전 48시간에, 세포를 5mM 염화암모늄의 존재 하에 또는 염화암모늄 없이 0.5% 혈청 성장 배지로 처리하였다. 알라마블루 세포 생존도 분석 시약(alamarBlue Cell Viability Assay)(피어스)을 이용하여 4시간 동안 모니터링하였다. 544㎚에서 여기 및 590㎚에서 방출에 의해 형광 신호를 얻었다.
실시예 1
TAT-MTS- FRA 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드의 클로닝
TAT-융합 단백질을 암호화하는 발현 플라스미드를 당업계에 공지된 표준 분자 생물학 도구에 의해 클로닝하고 제조하였다. 일반적 참고를 위해, 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory manual (2001) Joseph Sambrook and David William Russell]을 참조. 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 TAT [9](서열번호 1로 표시되는 핵산 서열에 의해 암호화됨)를 성숙 인간 프라탁신 단백질(서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 갖고 서열번호 6으로 표시되는 핵산 서열에 의해 암호화됨)에 융합시켰다(N-말단).
프라탁신의 천연 미토콘드리아 표적화 서열(본 명세서에서 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 갖고 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열에 의해 암호화되는 MTSfra로서 지칭됨), 또는 리포아마이드 탈수소효소(본 명세서에서 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열을 갖고 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열에 의해 암호화되는 MTSlad로서 지칭됨), C6ORF66(본 명세서에서 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 갖고 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 의해 암호화되는 MTSorf로서 지칭됨) 및 시트레이트 신타제(본 명세서에서 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 갖고 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열에 의해 암호화되는 MTScs로서 지칭됨)를 포함하는 인간 미토콘드리아 단백질의 다른 정의된 MTS인 인간 프라탁신의 N 말단에 존재하는(따라서 TAT와 상기 기재한 성숙 인간 프라탁신 사이에 위치됨) 미토콘드리아 표적화 서열과 상이한 다양한 융합 작제물이 제조된다. 다양한 TAT-MTS-FRA 융합 단백질을 이하의 표 4에 요약하며 도 1에서 개략적으로 제시한다.
모든 플라스미드를 암호 서열의 5' 말단에서 His-태그로 클로닝하고 나서, 모든 암호 서열은 T7 프로모터의 제어 하에 있었다. 모든 클론을 제한 효소 및 서열화 분석에 의해 확인하였다.
클로닝한 플라스미드 작제물
번호 플라스미드 명칭 약칭되는 명칭
1 His-TAT-MTSfra-FRA FRA
2 His-TAT-MTSlad-FRA (lad)FRA
3 His-TAT-MTSorf-FRA (orf)FRA
4 His-TAT-MTScs-FRA (cs)FRA
약어: lad, 리포아마이드 탈수소효소 단백질(E3 subunit); orf, C6ORF66 조립체 인자; 및 cs, 시트레이트 신타제.
상기 나타낸 바와 같이, 상기 표 4에서 1 내지 4로서 나타내는 바와 같은 클로닝한 플라스미드 작제물로부터 얻은 융합 단백질의 아미노산 서열을 각각 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 17로 표시된다.
실시예 2
이콜라이 숙주 내 융합 단백질의 발현
이하에 기재한 바와 같이 이콜라이 숙주에서 융합 단백질의 발현을 수행하고 나서, 최적 발현 조건을 위해 교정하였다. 당업계에 공지된 바와 같이, 몇몇 상이한 박테리아 발현 시스템이 있다. 재조합 단백질의 성공적인 발현은 종종 사용하는 박테리아 발현 시스템의 균주에 의존한다. 따라서, 상기 기재한 바와 같이 제조한 각각의 융합 단백질에 대해, 4종의 상이한 이콜라이 박테리아 균주: BL21-코돈플러스(CodonPlus), BL21, 로제타(Rosetta) 및 HMS(미국에 소재한 인비트로젠(Invitrogen))를 시험하고 나서, 이에 의해 발현을 위한 숙주를 선택하였다. 유도자 아이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)의 농도 및 유도 성장 조건(즉, 온도, 화학물질의 첨가 등)의 길이를 포함하는 몇몇 파라미터를 변화시킴으로써 각각의 TAT-융합 단백질에 대해 발현을 위한 조건을 또한 교정하였다.
발현 시, 박테리아 세포를 파쇄시키고 나서, 하위-분획을 제조하여 가용성 및 비-가용성 분획을 분리시켰다. 융합 단백질이 발현되고 하위-세포 분획에서 그것이 축적하는지 여부를 시험하기 위해 도데실 황산나트륨 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 겔 상에서 전-세포 박테리아(W.C. 또는 전-세포 추출물), 가용성 분획(Sol) 및 불용성 분획(Insol)에 대한 분석을 수행하였다. 장래의 정제를 위해 발현 박테리아의 가용성 하위-분획에서 상이한 TAT-융합 단백질의 고발현 수준을 얻는 것이 목적이다. 상이한 TAT-융합 단백질을 또한 항-His과 항-프라탁신 항체를 둘 다 이용하는 웨스턴 블롯 분석에 의해 특성규명하였다. 상기 표 2는 박테리아 숙주, IPTG 농도 및 상이한 MTS 서열을 운반하는 각각의 TAT-MTS-FRA 융합 단백질의 생성을 위한 온도를 요약한다.
SDS-PAGE 및 항-His 항체를 이용하는 웨스턴 블롯에 의해 특성규명한 바와 같은 각각의 4종 융합 단백질의 전형적 발현 및 하위-세포 국소화를 도 2에서 및 도 3에서 입증한다. His-TAT-MTSfra-FRA 융합 단백질의 발현을 도 2a 내지 도 2b에 나타내고, His-TAT-MTSorf-FRA 융합 단백질의 발현을 도 2c 내지 도 2d에 나타내며, His-TAT-MTSlad-FRA 융합 단백질의 발현을 도 3a 내지 도 3b에 나타내고, His-TAT-MTScs-FRA 융합 단백질의 발현을 도 3c 내지 도 3d에 나타낸다. 이들 실험은 상이한 TAT-융합 단백질의 전장 발현 및 그들의 동일성을 확인하였다.
항-His 항체는 항체 상호작용을 위해 최종 단백질 제제에서 His 서열의 노출 또는 이용가능성에 따라서 거의 상이한 효능을 지니는 다양한 융합 단백질을 인식한다는 것을 지적하여야 한다. 따라서, 다양한 융합 단백질의 발현 수준을 SDS-PAGE 겔에 기반하여 결정한다.
도 2 및 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, TAT-MTSfra-FRA 융합 단백질(도 2a 및 도 2b)를 가장 잘 교정된 조건 하에서조차 이종성 MTS를 운반하는 다른 3종의 융합 단백질에 비해 저수준의 박테리아 숙주에서 발현시켰다(도 2c 및 도 2d 및 도 3a 내지 도 3d). 따라서, 천연 프라탁신-MTS 대신 이종성 MTS를 이용하는 것은 박테리아 숙주 내 그의 발현 수준에서 이점을 가진다. 이는 생성되는데 다량의 융합 단백질이 필요한 인간 용도를 위한 그의 장래의 개발에 대해 주된 영향을 가진다(또한 이하를 참조).
실시예 3
TAT-MTS- FRA 융합 단백질의 정제
발현시킨 TAT-MTS-FRA 융합 단백질의 가용성 분획을 상기 상술한 바와 같이 이들 단백질을 친화도-정제하기 위해 니켈-킬레이팅 칼럼 상에 장입하였다. 친화도 칼럼 상에 융합 단백질의 결합, 그의 용리 및 최종 단백질 제제로부터 이미다졸의 제거를 위한 구체적 조건을 포함하는 교정 실험을 각각의 융합 단백질에 대해 수행하였다. 각각의 융합 단백질의 하나의 전형적인 정제 실행을 도 4(His-TAT-MTSfra-FRA 및 His-TAT-MTSorf-FRA에 대해) 및 도 5(His-TAT-MTSlad-FRA 및 His-TAT-MTScs-FRA에 대해)에서 입증하였다.
예를 들어, 도 4a는 융합 단백질 TAT-MTSfra-FRA에 대해 얻은 친화도 크로마토그래피 정제 프로파일의 영상을 나타낸다. 이 단백질 작제물의 정제 단계의 SDS-PAGE 분석의 영상인 도 4b에서 알 수 있는 바와 같이, 도 4b, 레인 7에 나타낸 단백질 분획은 250mM 이미다졸에서 칼럼으로부터 용리된 융합 단백질 TAT-MTSfra-FRA를 나타낸다.
대응하는 분석은 도 4c 및 도 4d에서 TAT-MTSorf-FRA에 대해, 도 5a 및 도 5b에서 TAT-MTSlad-FRA에 대해 나타내며, TAT-MTScs-FRA에 대해 대응 분석을 도 5c 및 도 5d에 나타낸다.
도 6a에서 나타내는 바와 같이, 용리된 단백질은 예상된 크기(대략 20 내지 27kDa)의 주요 밴드를 나타내고, SDS-PAGE 분석 및 항-His(도 6b)과 항-Fra 항체(도 6C)를 둘 다 이용하는 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정하여 순도가 95% 초과였다. 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 이종성 MTS를 운반하는 TAT-MTS-FRA 융합 단백질은 단백질 분해에 대한 증거가 없는 전장 무결함 단백질이었다(TAT-MTScs-FRA에 대해 레인 2, TAT-TSlad-FRA에 대해 레인 3 및 TAT-MTSorf-FRA에 대해 레인 4 참조). 그러나, 천연 MTS 서열을 운반하는 TAT-MTSfra-FRA는 부분적으로 분해되었다(도 6b 및 도 6c에서 레인 1 참조). 따라서, TAT-FRA 융합 단백질에 대한 이종성 MTS 서열을 이용하는 것은 또한 융합 단백질 무결함 및 안정성을 유지하는데 이점을 가진다.
추가로, 동일한 출발 용적의 박테리아 배양물로부터 생성한 각각의 융합 단백질의 총량 및 농도와 비교할 때, 이종성 MTS를 운반하는 융합 단백질을 천연 MTS를 운반하는 융합 단백질에 비해 다량으로 그리고 더 고농도에서 생성하였다(이하 표 5). 이는 다량의 융합 단백질이 고농도로 필요한 인간 용도를 위한 그의 장래의 개발에 대해 주된 영향을 가진다. 게다가, 생성된 융합 단백질의 안정성은 추가적인 이점을 가진다.
Figure pct00030
실시예 4
TAT-MTS- FRA 융합 단백질의 내재화
무결함 세포 내에서 미토콘드리아에 도달하는 융합 단백질의 능력을 시험하기 위해, 인간 BJAB 세포를 정제한 융합 단백질 중 하나, 즉, TAT-MTSlad-FRA와 함께 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 하위-세포 분획을 제조하여 미토콘드리아 및 사이토졸을 분리시켰다. 이어서, 미토콘드리아를 프로테이나제 K(시그마 P2308)로 처리하여 외막에 비특이적으로 흡착된 단백질을 분해함으로써, 미토콘드리아 추출물이 미토콘드리아 내에서 단지 단백질을 나타내었다는 것을 보장하였다. 이어서, 샘플을 항-His과 항-FRA 항체를 둘 다 이용하여 FRA-기반 융합 단백질의 존재에 대해 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석하였다(도 7 참조).
도 7a에 나타내는 바와 같이, 항-His 항체를 이용하여, 결과는 인큐베이션의 1 및 5시간 후에 처리 세포의 미토콘드리아 분획 내에서 His-태그 TAT-MTSlad-FRA 융합 단백질의 존재를 나타내었다(각각 레인 4 및 레인 6 및 7).
도 7b에 나타내는 바와 같이, 항-FRA 항체를 이용하여, 미토콘드리아 내부의 프라탁신 융합 단백질 작제물의 존재를 나타낸다. 도 7b의 레인 2로부터, 융합 단백질로 처리하지 않은 대조군 세포는 거의 성숙 아이소폼과 중간체 아이소폼(두 화살표로 표시됨)인 내인성 FRA 단백질을 가진다는 것은 명백하다.
도 7b(레인 4, 6, 7)에서 나타내는 바와 같이, TAT-MTSlad-FRA 융합 단백질로 처리 시, 비가공 융합 단백질뿐만 아니라 성숙 단백질 둘 다의 상대적 양은 인큐베이션 시간에 따라 증가되었다(도 7b; 각각 상부 밴드 및 하부 밴드). 이론에 의해 구속되는 일 없이, 상부 밴드에서의 증가는 미토콘드리아에 유입되고 가공되지 않은 융합 단백질 작제물에 의해 설명된다.
세포의 미토콘드리아 내로 프라탁신을 포함하는 융합 단백질의 내재화를 도 8A에서 나타내는 바와 같이 다른 TAT-MTS-FRA 융합 단백질, 즉, TAT-MTSfra-FRA, TAT-MTScs-FRA, 및 TAT-MTSorf-FRA에 대해(뿐만 아니라 TAT-MTSlad-FRA에 대해) 시험하였다. 이 실험에서, 세포를 3시간 동안 각각의 TAT-MTS-FRA 융합 단백질과 함께(0.02㎍/㎕의 최종 농도에서) 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 세척하고 나서, 그들의 미토콘드리아를 단리시키고, 이어서, 프라탁신 단백질의 C-말단으로 보내지는 단클론성 항-FRA 항체(대만에 소재한 앱노바; 1㎍/㎕)를 이용하는 웨스턴 블롯 분석에 따랐다.
도 8A, 레인 2 내지 5에서 입증하는 바와 같이, 다양한 융합 단백질 작제물 중에서 약간의 크기 변화를 관찰하였는데, 이는 다양한 MTS 폴리펩타이드 길이의 변화로부터 초래되었다(도 1 참조).
도 8A에서 나타내는 바와 같이, 미토콘드리아 내로 내재화를 모두 4종의 TAT-MTS-FRA 융합 단백질에 대해 관찰하였다. 현저하게는, 도 8A의 레인 3에서 나타내는 바와 같이, 프라탁신에 이종성인 MTS를 지니는 융합 단백질 중에서, 시트레이트 신타제 MTS(MTScs)는 미토콘드리아 내로 가장 효율적으로 전달되는 것을 입증하였다.
상기 나타낸 바와 같이, 미토콘드리아에 유입된 융합 단백질 작제물 길이의 약간의 변화가 있는데, 이는 본 실험 조건 하에서(즉, 각각의 TAT-MTS-FRA 융합 단백질과 함께 3시간 동안 세포의 인큐베이션) 프라탁신 단백질이 미토콘드리아 내에서 그의 각각의 His-TAT-MTS-프라탁신 작제물로부터 절단되지 않는다는 것을 나타낸다(무결함 His-TAT-MTS-프라탁신을 여전히 포함하는 단백질 작제물을 이하에 "비-가공 융합 작제물"로서 칭함).
특히, 도 8A는 또한 프라탁신에 이종성인 MTS, 즉, 시트레이트 신타제(cs), 리포아마이드 탈수소효소(lad) 및 C6ORF66(orf)의 MTS를 포함하는 융합 단백질에 대해, 미토콘드리아 내에서 단일 밴드(비가공 융합 작제물을 나타냄)만이 입증되었지만, 프라탁신의 천연 MTS를 포함하는 융합 단백질에 대해 2개의 별개 밴드가 나타났다는 것을 나타낸다(도 8A, 레인 2). 이론에 의해 구속되지 않고, 이는 TAT 및 천연 프라탁신 MTS 영역을 포함하는 무결함 융합 단백질의 불안정성의 결과일 수 있다.
도 7b에 제시한 내재화 분석에서 프라탁신을 검출하기 위해 사용하는 항체는 인간 프라탁신으로 향하는 다클론성 항체였다. 이들 항체는 전장, 비가공 인간 프라탁신을 매우 잘 인식할 뿐만 아니라 그의 가공된 산물을 인식한다. 이하에 언급하는 도 8에서, 프라탁신 단백질의 C-말단으로 특이적으로 향하는 단클론성 항체를 이용하여 검출을 수행하였다. 이들 단클론성 항체는 도 8에서 검출되는 단백질의 양에서 특히 단백질을 인식함에 있어 덜 효율적이기 때문에, 도 7 및 도 8의 결과를 비교할 수 없다.
1:1,000의 희석으로 항-E1α 항체(오리건주 유진에 소재한 몰레큘러 프로브(Molecular Probes))를 이용하는 대조군 웨스턴 블롯 분석을 도 8B에서 나타낸다.
실시예 5
His-TAT-MTS(cs)- FRA는 환자의 섬유아세포 의 미토콘드리아에 유입된다
인간 BJAB 세포의 미토콘드리아에 유입되는 프라탁신 융합 단백질의 능력을 입증하는 상기 결과에 추가로, 프리드라이히 운동실조증 환자로부터 얻은 섬유아세포의 미토콘드리아 내로 시트레이트 신타제의 MTS를 포함하는 프라탁신 융합 단백질의 내재화를 이하에 상술하는 바와 같이 예시하였다.
프리드라이히 운동실조증 환자로부터 얻은 섬유아세포를 상기 기재한 바와 같이 처리하고 나서, 2, 6 및 48시간 동안 His-TAT-MTS(cs)-FRA(20㎍/㎖에서)의 존재 하에 인큐베이션시키고, 24시간 후에 새로 첨가하였다. 섬유아세포의 미토콘드리아 및 세포질 분획을 상기 기재한 바와 같이 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석하였다.
도 9에서 입증하는 바와 같이, 융합 단백질 작제물 His-TAT-MTS(cs)-FRA을 2, 6 및 48시간의 인큐베이션 후에 섬유아세포의 미토콘드리아 분획에서 검출하였다. 항-프라탁신 항체에 의해 검출한 2개의 밴드(도 9에서 상부 화살표 및 하부 화살표에 의해 표시함)는 융합 단백질이 미토콘드리아 내에서 가공되었다는 것을 나타낸다. 프라탁신은 모든 His-TAT-MTS(cs)-FRA 융합 단백질 작제물이 미토콘드리에 유입되었다는 것을 나타내는 섬유아세포의 세포질 분획에서 검출되지 않았다.
실시예 6
His-TAT-MTS(cs)- FRA의 투여 후 환자로부터 얻은 섬유아세포 내 아코니타제 활성
미토콘드리아 내에서 프라탁신 수준의 감소는 몇몇 조직 유형에 대해 2가지 직접적 효과, 즉, 철-황 (Fe-S) 클러스터의 손상된 형성 및 세포내 활성 산소종(ROS)의 증가를 가진다는 것이 보고되었다[35]. 헴, 전자전달쇄(electron transport chain: ETC) 복합체 I 내지 III 및 크렙스 회로 단백질 아코니타제와 같은 Fe-S 함유 단백질의 감소는 세포 호흡을 심각하게 손상시키는데[36], 이는 이들 미토콘드리아 단백질에 대한 동시의 산화적 손상에 의해 추가로 복잡하게 된다. 이들 사건은 모두 세포사를 초래하는 세포 에너지 필요를 충족시키는 미토콘드리아의 불능으로 끝이 난다[35].
미토콘드리아 내에서 프라탁신의 활성을 평가하기 위해, 프리드라이히 운동실조증 환자로부터 얻은 미토콘드리아 내 아코니타제의 수준을 His-TAT-MTS(cs)-FRA의 투여 시 시험하였다.
상기 기재한 바와 같이 처리하고 48시간 동안 His-TAT-MTS(cs)-FRA 또는 비히클의 존재 하에 인큐베이션한 프리드라이히 운동실조증 환자로부터 얻은 섬유아세포(F816)의 미토콘드리아 분획(각각 FXN 또는 VEH)에서 상기 기재한 바와 같이 아이소시트레이트의 시스-아코니테이트로의 전환을 따름으로써 아코니타제 활성(mOD/분)을 측정하였다. His-TAT-MTS(cs)-FRA를 20㎍/㎖로 투여하고 나서, 제1 투여의 24시간 후에 추가적인 용량의 20㎍/㎖를 투여하였다. HepG2 전세포 세포분쇄액은 양성 대조군(POS.CON)으로서 작용하였다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 아코니타제 활성은 비히클 대조군(VEH, 10.5)의 존재 하에 인큐베이션시킨 섬유아세포에 비해 His-TAT-MTS(cs)-FRA(FXN, 14.5)와 함께 인큐베이션시킨 섬유아세포에서 더 높았다. 이 발견은 융합 단백질이 미토콘드리아에 유입될 뿐만 아니라 그의 다양한 세포 활성에 대해 활성이고 이용가능하다는 분명한 입증이다.
HepG2 전세포 세포분쇄액은 양성 대조군(POS.CON)으로서 작용하였다.
실시예 7
TAT-MTS- FRA 융합 단백질은 산화적 스트레스로부터 FA-환자의 세포뿐만 아니라 정상 세포를 부분적으로 구조한다
상기 나타낸 바와 같이, 미토콘드리아 내에서 프라탁신 수준의 감소는 세포내 활성 산소종(ROS)의 상승을 야기한다[35].
L-부티오닌 설폭시민(BSO)은 감마-글루타밀시스테인 합성효소(감마-GCS)의 저해제이며, 결과적으로 조직 글루타티온(GSH) 농도를 낮춘다. GSH는 티오에터 컨쥬게이트의 형성을 통해 매우 다양한 독성 친전자체에 대한 세포 방어 또는 보호에서 중요한 역할을 한다. 따라서, 활성 산소종(ROS)에 대해 이들 세포의 고유 방어의 중요한 구성성분을 고갈시키고, 세포사를 초래하는 것으로 알려진 천연 세포 과정에 의해 생성되는 ROS를 축적시키는 드노보 글루타티온 합성을 저해하기 위해 BSO 분석을 사용하였다[37]. BSO가 GSH의 생성을 저해하고 세포사를 초래하는 메커니즘을 문헌[Richardson, T. E. et al.]에 의해 기재하였다[37]. 그들은 프라탁신이 없기 때문에, 프리드라이히 운동실조증 세포는 정상 세포에 비해 BSO-유도 산화적 스트레스에 대해 극도로 민감하며[37], 따라서, 프라탁신이 없는 장기간 결과의 시험관내 모델로서 사용된다.
환자의 세포에서뿐만 아니라 정상의 건강한 세포에서 다양한 농도의 BSO를 이용하여 산화적 스트레스를 유도하였고, 세포사에 대한 다양한 TAT-MTS-FRA 융합 단백질의 효과를 측정하였다. 도 11에서 알 수 있는 바와 같이, BSO는 정상 림프구뿐만 아니라 프리드라이히 운동실조증 환자로부터 얻은 세포의 세포사를 야기하였다. 그러나, 환자의 세포는 BSO-유도 산화적 스트레스에 더 민감하였는데, 이는 이전의 발견과 일치되고, 더 높은 세포사 백분율을 나타낸다. 가장 중요하게는, 산화적 스트레스 유도 몇 시간 전에 첨가한 다양한 TAT-MTS-FRA 융합 단백질은 세포사로부터 정상 림프구뿐만 아니라 환자의 세포를 부분적으로 구조하는 것이 입증되었다. 도 11b에서 입증한 바와 같이, 세포사의 감소와 카스파제 3 활성의 감소에 의해 이 부분적 구조를 결정하였다.
도 11a 및 도 11b에서 나타내는 바와 같이, 이종성 MTS를 운반하는 3종의 융합 단백질 중 적어도 둘(즉, MTSorf 및 MTScs)은 BSO-유도 산화적 스트레스로부터 환자의 세포에서뿐만 아니라 건강한 세포에서 천연 MTS를 운반하는 융합 단백질에 의해 입증된 효과에 대해 우수한 보호 효과를 입증하였다.
상기 상술한 바와 같이 수행한 환자의 섬유아세포의 BSO-유도 산화적 스트레스를 구조하는 다양한 TAT-MTS-FRA 융합 단백질의 능력의 비교 연구를 융합 단백질 작제물 TAT-MTSfra-FRA, TAT-MTScs-FRA, TAT-MTSlad-FRA 및 TAT-MTSorf-FRA에 대해 각각 도 12a 내지 도 12d에서 나타낸다.
흥미롭게도, 도 12b 및 도 12c에서 각각 입증한 바와 같이, 이종성 MTS를 포함하는 단백질 작제물 중 둘, 즉, TAT-MTScs-FRA 및 TAT-MTSlad 융합 단백질은 환자의 섬유아세포의 BSO-유도 산화적 스트레스를 부분적으로 구조함에 있어서 천연 프라탁신 MTS (TAT-MTSfra-FRA)을 포함하는 융합 단백질보다 더 효율적이었다.
다양한 농도의 BSO를 이용하여 유도한 환자의 세포에서 유사한 보호 효과를 또한 TAT-MTSorf-FRA 및 TAT-MTSlad 융합 단백질에 대해 단독으로 분석할 때 관찰하였다(각각 도 13 및 도 14).
실시예 8
프리드라이히 운동실조증 마우스에서 TAT-MTS- FRA 융합 단백질의 약역학적 및 약동학적 평가
진행 중인 연구에, 프리드라이히 운동실조증 전임상 마우스 모델에서 TAT-MTS-FRA 융합 단백질의 약역학적, 약동학적(PK/PD) 및 안전성을 평가하기 위해, 마우스 모델 JR# 18299 FVB; B6- Tg(FXN)1Sars Fxn tm1Mkn /J를 진행 중인 연구에서 사용한다. 이들 연구로부터 얻은 정보를 추가 임상 연구를 위해 용량 및 시간 간격을 결정하는데 사용할 것이다. 간략하게, 연구는 마우스 프라탁신 자리에서 표적화된 돌연변이에 대해 동형 접합성이고 이식유전자에 대해 반접합성인 6 내지 8주령의 45마리 암컷 마우스를 필요로 한다. 균주 18299는 우수한 품종 성능에 기인하여 본래의 C57BL/6J 유사유전자형 균주에 걸쳐 선택되는 혼합된 유전자 배경에 대해 본래의 사르세로(Sarsero) 마우스라는 것을 주목하며, 이는 어떤 행동 표현형도 이 연구에서 수행되지 않기 때문이다.
전임상 연구를 수행하기 위해, 2 용량의 TAT-MTScs-FRA 융합 단백질(100㎍ 및 400㎍에서)을 꼬리 정맥 주사를 통해 18229 FVB;B6-Tg(FXN)1Sars Fxntm1Mkn/J 마우스 내로 비히클과 함께 최대 3주의 기간 동안 1주 당 2회 투여한다. 주사 후 1, 4, 7, 14 또는 21일에 마우스를 희생시키고, 이어서, 혈액을 심장천자에 의해 수집하며, 다양한 조직을 채취한다(예를 들어, 뇌, 심장, 간 및 신장). 아코니타제 활성을 측정하기 위해 뇌 및 심장 조직을 가공한다. ELISA 분석에 의해 미토콘드리아 추출물 내 프라탁신 수준을 측정하기 위해 또한 뇌 및 심장 조직을 가공한다. 혈액, 간 및 심장을 새로 냉동시키고 나서, 저장한다.
이어서, 채취한 조직에서 처리 효과를 평가한다.
실시예 9
TAT-MTS-OTC 단백질 작제물은 미토콘드리아 내로 내재화한다
His-TAT-MTS에 융합된 OTC를 포함하는 융합 단백질 작제물을 상기 기재한 바와 같이 제조하였다. 도 16에 나타낸 바와 같이, OTC의 천연 MTS, 시트레이트 신타제의 MTS, C6ORF66의 MTS 및 리포아마이드 탈수소효소의 MTS를 포함하는 정제된 융합 단백질 작제물을 얻었다(각각 도 16A, 도 16B, 도 16C 및 도 16D). 얻어진 정제한 융합 단백질 작제물의 크기는 그들의 겔 이동을 도 16E에 나타낸 단백질 마커의 이동과 비교하는 것에 기반하여 결정된 바와 같이 약 40kDa이었다. 제조한 모두 4개의 융합 단백질 작제물에 대해 유사한 발현 수율을 얻었다.
미토콘드리아에 유입되는 다양한 OTC 융합 단백질 작제물의 능력을 시험하기 위해, HepG2 세포를 OTC의 천연 MTS 또는 OTC에 이종성인 MTS 중 하나를 포함하는 OTC 융합 단백질 작제물, 즉, 상기 기재한 바와 같은 His-TAT-MTSotc-OTC, His-TAT-MTScs-OTC 및 TAT-MTSlad-OTC의 존재 하에 인큐베이션시켰다.
우선, 도 17A에서 나타내는 바와 같이, 융합 단백질 작제물 His-TAT-MTSotc-OTC, His-TAT-MTScs-OTC 및 His-TAT-MTSlad-OTC(및 His-TAT-MTSorf-OTC, 데이터 미제시)는 침전 또는 분해 산물이 검출되지 않았다는 사실에 기반하여 다양한 분석 조건 하에 가용성이었다는 것은 주목할 만하다.
상기 작제물과 함께 인큐베이션한 HepG2 세포의 미토콘드리아 분획의 분석은 OTC의 천연 MTS를 포함하는 OTC 융합 단백질 작제물(His-TAT-MTSotc-OTC)뿐만 아니라 OTC 단백질, 즉 시트레이트 신타제(cs) 및 리포아마이드 탈수소효소(lad)에 이종성인 MTS를 포함하는 OTC 융합 단백질 작제물이 1시간의 인큐베이션 기간 후에 미토콘드리아에 유입될 수 있다는 것을 나타내었다(도 17A). 도 17A는 또한 3시간까지 인큐베이션 기간의 연장이 미토콘드리아 내에서 융합 단백질 작제물 수준의 증가를 야기한다는 것을 나타낸다.
흥미롭게도, OTC의 천연 MTS를 포함하는 단백질 작제물(His-TAT-MTSotc-OTC)의 능력을 OTC 단백질에 이종성인 MTS를 포함하는 OTC 융합 단백질 작제물(즉, His-TAT-MTScs-OTC 및 His-TAT-MTSlad-OTC)의 능력과 비교함으로써, 예를 들어 EMEM에서 3시간의 인큐베이션 시, OTC에 이종성인 MTS를 포함하는 융합 단백질 작제물의 내재화 능력은 OTC의 천연 MTS를 포함하는 융합 단백질 작제물의 내재화 능력보다 약간 더 높은 것으로 나타난다.
미토콘드리아 내로 OTC 융합 단백질 작제물의 내재화를 추가로 확인하기 위해, 다양한 His-TAT-MTS-OTC 단백질 작제물과 함께 인큐베이션한 세포의 세포질 분획을 또한 분석하였다. 도 18a 및 도 18b에서 나타낸 바와 같이, 임의의 분석 세포질 분획에서 어떤 융합 단백질도 관찰되지 않았다.
실시예 10
OTC의 시험관내 효소적 활성
상기 나타낸 바와 같이, OTC는 시트룰린과 포스페이트를 형성하기 위해 카바모일 포스페이트와 오르니틴 간의 반응을 촉매하는 효소 활성을 갖는 단백질이다. 본 명세서에서 상기 기재한 OTC를 포함하는 정제된 융합 단백질 작제물의 활성을 평가하기 위해 다양한 융합 단백질 작제물에 의한 오르니틴 및 카바모일 포스페이트로부터의 시트룰린의 생성을 상기 기재한 바와 같이 평가하였다.
도 19에서 나타내는 바와 같이, 분석한 융합 단백질 작제물 His-TAT-MTScs-OTC는 상대적으로 낮은 효소적 활성을 갖는데, 여기서 융합 단백질 작제물 His-TAT-MTSotc-OTC는 활성이 없었다. 이론에 의해 구속되는 일 없이, 이는 OTC가 그의 효소적 활성이 필요한 그의 천연 삼량체 상태에서 반응 혼합물 중에 존재할 가능성이 없다는 사실에 기인할 수 있으며, His-TAT-MTS 단편에 컨쥬게이트되기 때문이다.
그러나, 도 19에서 나타내는 바와 같이, 낮은 수준의 효소적 활성이 사실 CS의 MTS를 포함하는 융합 단백질 작제물에 대해 관찰되었다.
실시예 11
암모니아 스트레스로 고통받는 HepG2 세포에서 OTC의 효소적 활성
OTC 결핍증은 인간에서 가장 통상적인 요소회로 장애이다. 이 장애에서 결함 효소인 OTC는 요소회로의 근위 부분에서의 최종 효소이고, 상기 나타낸 바와 같이 카바모일 포스페이트 및 오르니틴의 시트룰린으로의 전환을 초래한다. 심하게 병에 걸린 개체에서, 암모니아 농도는 빠르게 발생하는 운동실조, 무기력 및 신속 개입이 없는 사망을 증가시킨다.
세포 내 암모니아 스트레스를 구조하는 OTC 융합 단백질 작제물의 능력을 시험하기 위해, HepG2 세포를 OTC의 천연 MTS를 포함하는 융합 단백질 작제물과 함께 또는 CS의 MTS를 포함하는 융합 단백질 작제물과 함께 매일(3일 동안) 투여하고, 이어서 염화암모늄으로 처리하고 나서, 최종적으로, 그들의 세포 생존도를 상기 기재한 바와 같이 알라마블루(alamarBlue)를 이용하여 평가하였다.
도 20에서 나타내는 바와 같이, MTS로서 OTC 및 시트레이트 신타제를 포함하는 융합 단백질 작제물의 존재에서 세포 생존도 수준은 염화암모늄에 노출되지 않은 세포(비처리 세포)에 대한 세포 생존도 수준과 유사하였다. 더 나아가, MTS로서 OTC 및 시트레이트 신타제를 포함하는 융합 단백질 작제물의 존재 하에 세포 생존도 수준은 OTC의 천연 MTS를 포함하는 융합 단백질 작제물로 처리한 세포에서의 세포 생존도 수준보다 더 높았다.
종합하면, 상기 결과는 TAT, MTS 및 OTC를 포함하는 융합 단백질 작제물 및 특히 OTC에 이종성인 MTS를 포함하는 그러한 융합 단백질은 미토콘드리아에 유입될 수 있고, 이어서, OTC는 가공됨으로써 그의 효소적 활성을 가능하게 한다는 것을 입증한다.
결과는 또한 암모니아가 없는 융합 단백질 작제물이 세포독성이 아니었다는 것을 나타내었다(데이터 미제시).
실시예 12
마우스에서 TAT-MTS-OTC 융합 단백질 작제물의 간 유입 및 용량 결정의 역학
OTC의 간 유입의 역학을 평가하기 위해, 본 명세서에 기재된 임의의 TAT-MTS-OTC 융합 단백질 작제물의 간 수준을 OTC-결핍 spf ash 마우스(그룹에서 3마리 반접합성 수컷 및 3마리 동형 접합성 암컷)에서 OTC를 포함하는 융합 단백질 작제물(500㎍/마우스)의 투여 4, 8, 24 및 48 시간 후에 결정한다. 이어서, 간 조각 및 다른 조직(예를 들어, 골격근, 뇌)을 채취하고 나서, 웨스턴 블롯 분석에 의해 그들의 OTC 단백질에 대해 분석하였다. 추가로, OTC의 활성을 OTC 효소적 분석(예를 들어, 상기 기재한 시트룰린 분석)을 이용함으로써 채취한 간에서 시험하였다.
혈액을 심장천자에 의해 수집하고 나서, 혈장을 간기능 시험(ALT/AST), 아미노산(시트룰린을 포함), 암모니아 결정 및 OTC 단백질 수준(웨스턴 블롯)에 대해 단리한다. 오로트산 분석을 위해 소변을 수집한다.
상기 실험이 수컷과 암컷 사이의 임의의 차이를 나타내지 않는 경우에 추가 연구를 위해 수컷 마우스를 사용한다.
이어서, 가장 높은 OTC 단백질 수준이 상기 분석에서 검출된 시점에 다양한 용량의 TAT-MTS-OTC 융합 단백질 작제물(100 내지 500㎍/마우스)로 투여한 마우스의 조직에서 단백질 수준을 결정한다.
실시예 13
TAT-MTS-OTC 융합 단백질 작제물에 의한 표현형 보호
OTC-결핍 spf ash 마우스(6마리 수컷 또는 3마리 수컷 및 3마리 암컷)를 문헌[Cunningham, S. C. et al.]에 따라 OTC-shRNA 녹다운 rAAV와 함께 투여한다[41]. 표시한 시점에(OTC-shRNA 배취의 활성 및 상기 실험으로부터 얻은 결과에 기반) 각각의 마우스의 시험군에 주 당 0, 1, 2 또는 3회 용량(들)을 투여함으로써 TAT-MTS-OTC 융합 단백질 작제물의 투여를 시작한다.
OTC-shRNA 녹다운 rAAV의 주사 전에 암모니아, 아미노산(시트룰린을 포함) 및 ALT/AST뿐만 아니라 소변 오로트산의 기준 혈장 수준을 처음 측정함으로써 분석을 수행한다. 혈액 및 소변을 상기 분석을 위한 TAT-MTS-OTC 융합 단백질 작제물의 투여 전에 다시 수집하고, 이어서, 실험의 지속기간 동안 매주 수집한다.
고암모니아혈증의 임상적 징후(무기력, 떨림, 운동실조)의 관찰 시 또는 TAT-MTS-OTC 융합 단백질 작제물의 주사 후 1개월에 마우스를 모니터링하고 희생시킨다. 실험의 종료 시, 간, 근육 및 뇌를 액체 질소 중에서 냉동시키거나 또는 벡터 복제 분석(정량적 PCR), OTC 활성(간 용해물 및 냉동 절편에서) 및 단백질 수준(웨스턴 블롯)을 위해 4% PFA 중에 고정시킨다.
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Claims (28)

  1. 융합 단백질로서, HIV-1 전사 트랜스활성인자(transactivator of transcription: TAT) 도메인, 기능성 인간 미토콘드리아 단백질 및 상기 TAT 도메인과 상기 기능성 인간 미토콘드리아 단백질 사이에 위치된 인간 미토콘드리아 표적화 서열(mitochondria targeting sequence: MTS)을 포함하되, 상기 인간 MTS는 상기 기능성 인간 미토콘드리아 단백질에 대해 이종성인, 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 기능성 인간 미토콘드리아 단백질은 상기 인간 MTS에 대해 C-말단인, 융합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 미토콘드리아 단백질은 기능성 인간 미토콘드리아 단백질 그 자체이고/이거나 미토콘드리아 다중-구성성분 복합체의 구성성분인, 융합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능성 인간 미토콘드리아 단백질은 프라탁신(frataxin) 및 오르니틴 트랜스카바모일라제(ornithine transcarbamoylase: OTC) 중 어느 하나인, 융합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MTS는 약 3 내지 약 5개의 비연속적 염기성 아미노산 잔기, 및 선택적으로 약 1 내지 약 3개 또는 4 또는 5개의 세린/트레오닌 잔기를 포함하는, 약 15 내지 약 40개의 아미노산 잔기를 포함하는, 융합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MTS는 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 미토콘드리아 시트레이트 신타제 MTS, 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 리포아마이드 탈수소효소 MTS, 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 C6ORF66 유전자 산물의 MTS 및 서열번호 16으로 표시되는 핵산에 의해 암호화되는 인간 미토콘드리아 GLUD2의 MTS 중 임의의 하나인, 융합 단백질.
  7. 제6항에 있어서, 상기 MTS는 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 미토콘드리아 시트레이트 신타제 MTS 및 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 리포아마이드 탈수소효소 MTS 중 임의의 하나인, 융합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MTS 서열에 상기 TAT 도메인을 공유적으로 연결하는 링커를 더 포함하는, 융합 단백질.
  9. 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질로서, 서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 프라탁신에 융합된 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 HIV-1 전사 트랜스활성인자(TAT) 도메인 및 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 시트레이트 신타제의 미토콘드리아 표적화 서열(MTS)을 포함하되, 상기 MTS는 상기 TAT 도메인과 상기 프라탁신 사이에 위치되고, 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 링커를 통해 상기 TAT 도메인에 연결되며, 상기 프라탁신은 인간 시트레이트 신타제의 상기 MTS에 대해 C-말단인, 융합 단백질.
  10. 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질로서, 서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 프라탁신에 융합된 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 HIV-1 전사 트랜스활성인자(TAT) 도메인 및 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 리포아마이드 탈수소효소의 미토콘드리아 표적화 서열(MTS)을 포함하되, 상기 MTS는 상기 TAT 도메인과 상기 프라탁신 사이에 위치되고, 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 링커를 통해 상기 TAT 도메인에 연결되며, 상기 프라탁신은 인간 리포아마이드 탈수소효소의 상기 MTS에 대해 C-말단인, 융합 단백질.
  11. 생리적으로 허용가능한 담체 및 활성 성분으로서 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 포함하는 조성물.
  12. 약제학적으로 허용가능한 담체 및 활성 성분으로서 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 미토콘드리아 장애를 치료하거나 또는 완화시키기 위한, 약제학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 장애는 프리드라이히 운동실조증 또는 프라탁신의 결핍증과 관련되거나 또는 결함 프라탁신과 관련된 임의의 다른 장애 또는 OTC의 결핍증과 관련되거나 또는 결함 OTC와 관련된 장애인, 약제학적 조성물.
  15. 제12항에 있어서, 치료가 필요한 대상체에서 결함 또는 결핍 또는 비기능성 인간 미토콘드리아 단백질의 활성을 적어도 부분적으로 회복시키되, 상기 인간 미토콘드리아 단백질은 그 자체가 활성일 수 있거나, 또는 기능성 미토콘드리아 단백질 복합체의 구성원일 수 있는, 약제학적 조성물.
  16. 미토콘드리아 장애의 치료 또는 완화를 위한 방법에서 사용하기 위한 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 융합 단백질.
  17. 제16항에 있어서, 상기 기능성 인간 미토콘드리아 단백질은 프리드라이히 운동실조증 또는 프라탁신의 결핍증과 관련되거나 또는 결함 프라탁신과 관련된 임의의 다른 장애의 치료 또는 완화를 위한 방법에서 사용하기 위한 프라탁신인, 융합 단백질.
  18. 제16항에 있어서, 상기 기능성 인간 미토콘드리아 단백질은 OTC의 결핍증과 관련되거나 또는 결함 OTC와 관련된 장애의 치료 또는 완화를 위한 방법에서 사용하기 위한 OTC인, 융합 단백질.
  19. 미토콘드리아 장애를 치료하거나 또는 완화시키는 방법으로서, 치료가 필요한 대상체에게 치료적 유효량의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함함으로써, 미토콘드리아 장애를 치료하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 기능성 단백질은 프라탁신, 각각 OTC이고, 상기 미토콘드리아 장애는 프리드라이히 운동실조증 또는 프라탁신의 결핍증과 관련되거나 또는 결함 프라탁신과 관련된 임의의 다른 장애 또는, OTC의 결핍증과 관련되거나 또는 결함 OTC과 관련된 장애인, 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 방법은 추가적인 치료제를 투여하는 단계를 더 포함하는, 미토콘드리아 장애를 치료하거나 또는 완화시키는 방법.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 상기 대상체에게 정맥내로 투여되는, 방법.
  23. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여되는 치료적 유효량은 약 0.5㎎/㎏(상기 대상체의 체중) 내지 약 2㎎/㎏인, 방법.
  24. 기능성 미토콘드리아 단백질을 대상체의 미토콘드리아 내로 도입하는 방법으로서, 치료가 필요한 대상체에게 치료적 유효량의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함함으로써, 치료가 필요한 대상체의 미토콘드리아 내로 기능성 인간 미토콘드리아 단백질을 도입하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 기능성 인간 미토콘드리아 단백질은 야생형 인간 미토콘드리아 단백질의 적어도 부분적인 활성을 회복시키는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 기능성 인간 미토콘드리아 단백질은 야생형 인간 미토콘드리아 단백질의 활성의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 100%를 회복시키는, 방법.
  27. 대상체에게 치료적 유효량의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 투여함으로써 치료가 필요한 대상체에서 결함 또는 결핍 또는 비기능성 인간 미토콘드리아 단백질의 활성을 적어도 부분적으로 회복시키는 방법.
  28. 치료가 필요한 대상체에서 산화적 스트레스를 완화시키는 방법으로서, 이러한 치료가 필요한 대상체에게 치료적 유효량의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함함으로써, 상기 대상체에서 산화적 스트레스를 완화시키는, 방법.
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