KR20150139550A - 임플란트 및/또는 이식의 성공 전망의 예측적 평가를 위한 시험관내 방법 - Google Patents

임플란트 및/또는 이식의 성공 전망의 예측적 평가를 위한 시험관내 방법 Download PDF

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크리슈토프 가이쓰마이어
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Abstract

본 발명은 조직 재생 능력 및/또는 세포 잠재성 및/또는 임플란트술 및/또는 이식술의 성공 전망을 예후적으로 평가하기 위한 시험관내 방법으로서, 세포의 전사체 및/또는 유전자 발현 (상기 유전자 발현은 전사체에서 기원함) 이 분석되는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 조직 재생 능력 및/또는 세포 잠재성 및/또는 임플란트술 및/또는 이식술의 성공 전망을 예후적으로 평가하기 위한, 전사체 분석, 더욱 특히 전사체 프로파일 및/또는 전사체에서 기원하는 유전자 발현 프로파일의 용도에 관한 것이다.

Description

임플란트 및/또는 이식의 성공 전망의 예측적 평가를 위한 시험관내 방법 {IN VITRO METHOD FOR PREDICTIVE ASSESSMENT OF THE PROSPECTS OF SUCCESS OF AN IMPLANT AND/OR TRANSPLANT}
본 발명은 조직 재생 능력 및/또는 세포 잠재성 및/또는 임플란트술 및/또는 이식술의 성공 전망을 예후적으로 평가하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다.
유전자 발현 프로파일의 생성 또는 전사체의 분석은, 마이크로어레이 기술의 확립으로, 생물의학 과학에서 중요한 도구가 되었다.
특히 2세대 RNA 서열분석 방법 (차세대 서열분석, NGS) 의 개발은 전사체 분석 수행 비용의 급격한 하락을 초래했을 뿐만 아니라, 지금까지 알려지지 않은 유전자 활성을 확인함에 있어서 정확도를 증가시켰다. 유전자 발현 프로파일의 응용 분야의 예는 질환의 진단 및 예후, 요법의 애프터케어 분석, 유전적 소인의 분석, 작용의 약리학적 메카니즘의 조사 및 또한 세포 및 조직의 성장 및 분화 과정의 정성적 및 정량적 조사이다.
유전자 발현 데이타를 평가하기 위한 관습적 방법은 차등 분석이며, 이를 이용하여 알려진 유전자의 발현이 조사되고, 또한 알려지지 않은 유전자의 탐지가 수행될 수 있다. 상기 방법에서, 조사될 샘플의 발현 데이타가 기준 샘플의 유전자 발현 패턴과 그렇지 않으면 선별된 유전자의 발현 데이타와 정렬 또는 비교된다. 예를 들어, 병리생리학적으로 관련 있는 유전자의 발현을 조사할 때, 건강한 조직 (기준 샘플) 의 발현 데이타가 예를 들어 병든 조직 (측정 샘플) 예컨대 종양 조직의 발현 데이타와 비교된다. 이러한 비교에 기초하여, 선별된 유전자의 정성적 (예/아니오 답변) 또는 정량적 발현 (발현 증가 또는 감소) 에 관한 정보가 제공될 수 있고, 이는 결국 특별한 상태, 예를 들어 병적 상태에 지정될 수 있다.
DE 10 2010 033 565 A1 은 연골세포 (연골 세포) 의 약학적 정체, 순도 또는 잠재성의 시험관내 확인을 위한 다양한 마커를 공개하며, 이러한 마커에 의해 연골세포는 예상한 바와 같이 성공적인 연골세포 이식술에 관한 그들의 적합성에 대해 시험될 수 있다. 상기 마커의 확립은 연골세포, 구체적으로 또다른 공여자로부터의 연골세포에 관하여 하나의 공여자로부터의 연골세포 뿐만 아니라 동일한 공여자로부터의 연골세포가 연골 재생을 위한 임플란트술을 위한 자가 세포로서의 용도에 관한 그들의 적합성에 관하여 크게 다를 수 있다는 사실과 관련되었다. 게다가, 연골세포의 배양이 그들의 특성을 변경하여 그들이 더이상 공여자로부터 단리 직후 만큼 임플란트술에 적합하지 않을 수 있다는 것이 고려될 수 있다.
특히 세포 대사에 관여하는, 몇몇 유전자의 선별적 분석은 확실히 이식될 세포의 품질 보증에서 유력한 결과를 초래할 수 있었지만, 특히 연골세포 분화는 단지 치유 관련 성공을 평가하기 위한 하나의 파라미터이므로, 그러한 접근의 결과는 그럼에도 불구하고 그들의 통계적 유의미에서 제한된다.
이러한 배경과 반대로, 그러므로 본 발명의 목적은 선행 기술의 단점을 극복하고 특히 더욱 유효한 개체 예후를 허용하는 방법을 제공하는 것이다.
이 목적은 독립항 1 의 특색을 갖는 시험관내 방법 및 또한 독립항 21 의 특색을 갖는 용도에 의해 달성된다. 방법의 바람직한 구현예는 종속항 2 내지 20 에 명시되어 있다. 모든 청구항의 자구는 본원에서 표현 참조에 의해 명세서에 포함된다.
본 발명은 조직 재생 능력 및/또는 세포 잠재성 및/또는 임플란트술, 바람직하게는 세포 임플란트술, 및/또는 이식술의 성공 전망을 예후적으로 평가하거나 예측하기 위한, 더욱 특히 임플란트술 및/또는 이식술의 실패를 예후적으로 평가하거나 예측하기 위한 시험관내 방법을 제안한다.
본 발명의 방법은 세포, 더욱 특히 환자로부터의 세포 (환자 세포) 의 전사체, 및/또는 세포, 더욱 특히 환자로부터의 세포 (환자 세포) 의 유전자 발현 (상기 유전자 발현은 전사체에서 기원하거나 전사체에 기초함) 이 시험관내 분석된다는 사실로 특히 주목할 만하다.
전사체 분석 및/또는 전사체에 기초하는 유전자 발현의 분석의 경우에, 특히 유리하게는 - 선행기술에서 알려진 바와 같이 - 몇몇 유전자, 특히 구체적으로 세포 대사에 관한 그들의 유의성에 기초하여 선별된 유전자의 전사 또는 번역 뿐만 아니라, 세포의 모든 유전자의 전사 및/또는 번역 거동을 포착하는 것이 가능하다. 본 발명에 따라 예상되는 전사체 분석은 특히 문제의 세포, 바람직하게는 환자 세포의 유전자 발현 활성에서 발현되는 완전한 대사 프로파일을 생성하는 것을 가능하게 해준다.
이제 놀랍게도 환자 세포의 전사체 분석의 일부로서 수득되는 전사체 및/또는 유전자 발현 프로파일은 문제의 환자(들)에서 조직 재생 능력 및 임플란트술- 및/또는 이식술-관련 조치의 성공 전망의 면에서 치료적 유의성이 지정될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 발명자들은 기질- 또는 지지물-보조 자가 연골세포 이식술 (MACT) 의 예를 사용하여 후향 임상 추적연구의 일부로서 이것을 성공적으로 확인하는 것이 가능했다.
수득되는 프로파일은 전사체의 시험관내 분석 및/또는 전사체에 기초하는 유전자 발현에 기초하므로, 망라적 방법에 비해 더욱 유효한 개체 예후, 즉, 더 큰 통계적 유의미를 갖는 개체 예후가 가능하다.
다시 말하면, 본 발명은 그러므로 조직 재생, 세포 잠재성, 임플란트술의 성공 또는 실패 및/또는 이식술의 성공 또는 실패를 예측하는 방법을 제안한다.
본 발명의 맥락에서, 표현 "세포 임플란트술" 은 세포가 로딩 또는 접종된 임플란트를 사용하는 임플란트술에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서, 표현 "전사체" 는 특별한 시점에 세포에서 DNA 로부터 mRNA (메신저 RNA) 로 전사된 유전자의 총합계 이상을 망라한다. 그러나, 본 발명의 맥락에서, 표현 "전사체" 는 바람직하게는 특별한 시점에 세포에서 DNA 로부터 mRNA 로 전사된 유전자의 총합계, 즉, 세포에서 생산된 모든 RNA 분자 전부를 망라한다.
본 발명의 맥락에서, 표현 "전사체 프로파일" (또는 전사체 패턴) 은 바람직하게는 하이브리드화-기반 및/또는 서열-기반 방법, 더욱 특히 2세대 서열분석 방법을 사용하여 포착가능한 세포의 모든 전사물의 프로파일 (또는 패턴) 을 나타낸다.
본 발명의 맥락에서, 표현 "유전자 발현" 은 전사 및/또는 성숙한 mRNA 서열에 기초하는 단백질 (이차 유전자 산물) 로의 번역 과정에 걸쳐 일어나는 RNA, 더욱 특히 mRNA (일차 유전자 산물), 조절 RNA 및/또는 추가의 RNA 유형의 합성을 망라한다. 조절 RNA 의 예는 마이크로RNA (miRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA) 및/또는 소형 핵 RNA 를 포함한다. 이 단락에서 부가적으로 언급된 추가의 RNA 유형의 예는 리보솜 RNA (rRNA) 및/또는 전달 RNA (tRNA) 이며, 이들은 마찬가지로 일차 유전자 산물에 속한다.
본 발명의 맥락에서, 표현 "유전자 발현 프로파일" (또는 유전자 발현 패턴) 은 조사되는 세포의 유전자 활성의 프로파일 (또는 패턴) 로서의, 바람직하게는 하이브리드화-기반 및/또는 서열-기반 방법, 더욱 특히 2세대 서열분석 방법을 이용하여 생성된 데이타의 해석을 나타낸다.
본 발명의 맥락에서, 표현 "조직 재생" 은 근본적으로 임의의 신체 조직 또는 환자 조직의 재생을 망라할 수 있다. 그러나, 표현 "조직 재생" 은 바람직하게는 지지 조직의 재생, 바람직하게는 연골 조직의 재생, 특히 바람직하게는 관절 연골의 재생, 및/또는 추간판 조직의 재생을 망라한다.
따라서, 본 발명의 맥락에서, 표현 "조직 재생 능력" 은 근본적으로 임의의 신체 조직 또는 환자 조직의 재생 능력, 더욱 특히 지지 조직의 재생 능력, 바람직하게는 연골 조직의 재생 능력, 특히 바람직하게는 관절 연골의 재생 능력, 및/또는 추간판 조직의 재생 능력을 망라할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 표현 "세포 잠재성" 은, 특히 선행 시험관내 배양 후에, 조직-특이적 특성을 발달시키는 및/또는 조직-특이적 특성 발달을 유지 또는 재개하는 조직 세포의 능력을 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 연골세포의 잠재성은, 특히 연골세포가 치료될 결함이 있는 자리에 임플란트될 때, 세포외 기질을 생산하는 및/또는 세포외 기질 생산을 재개하는 능력을 의미하는 것으로 의도된다.
본 발명의 맥락에서, 표현 "기질- 또는 지지물-보조 세포 임플란트술" 또는 "기질- 또는 지지물-보조 세포 이식술" 은 자가 세포가 제공 또는 접종된 임플란트의 임플란트술 또는 이식술을 의미한다.
세포는 근본적으로 인간 및/또는 동물 기원을 가질 수 있다. 다시 말하면, 세포는 인간 및/또는 동물 세포일 수 있다.
바람직하게는, 세포는 인간 환자에서 기원한다.
더욱 특히, 세포는 내인성 또는 자가 세포일 수 있다.
바람직하게는, 세포는 환자로부터 조직 샘플 형태로 추출된다. 샘플의 성질 또는 기원에 따라, 전사체 분석을 수행하기 전에 샘플을 가공하는 것이 유리할 수 있다. 샘플의 적합한 가공은 원심분리, 농축, 균질화, 시험관내 증식과 같은 단계 및 또한 근본적으로 통상의 기술자에게 알려진 추가의 가공 단계를 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 세포의 재생 능력 및/또는 세포 잠재성이 평가될 세포는 환자 조직에서 기원한다.
더욱 특히, 세포는 임플란트술 및/또는 이식술을 이용하여 치료될 결함을 갖는 환자 조직에서 기원한다.
바람직하게는, 세포는 지지 조직, 더욱 바람직하게는 연골 조직, 특히 바람직하게는 관절 연골 조직, 및/또는 추간판 조직에서 기원한다.
추가의 구현예에서, 세포는 지지 조직 세포, 바람직하게는 연골세포 (연골 세포), 및/또는 그의 전구 세포, 특히 바람직하게는 관절 연골세포, 추간판 세포, 더욱 특히 핵 세포 및/또는 고리모양 세포, 및/또는 그의 전구 세포이다.
추가의 구현예에서, 세포는 건강한 세포 또는 건강한 조직 부분 또는 부위에서 기원하는 세포이다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 맥락에서 임플란트술은 기질- 또는 지지물-보조 자가 세포 임플란트술, 바람직하게는 기질- 또는 지지물-보조 자가 연골세포 임플란트술 (MACI) 이다. 적합한 기질은, 특히, 콜라겐 지지물이다. 바람직한 기질 또는 바람직한 콜라겐 지지물은 심낭막 및 콜라겐 스폰지로 구성되는 다층 임플란트이며, 콜라겐 스폰지는 바람직하게는 일방적 동결건조를 이용하여 형성될 수 있는 심낭막에 대해 수직으로 또는 실질적으로 수직으로 배향되어 있는 원주 모양의 공극을 갖는다. 그러한 콜라겐 지지물은 출원인에 의해, 예를 들어 명칭 Novocart® Basic 또는 Novocart® 3D 하에 상업적으로 판매된다. 그러한 콜라겐 지지물의 추가의 특색 및 이점에 관하여, 부가적으로 EP 1 824 420 B1 을 참조하며, 상기 문헌의 공개 내용은 연골 결합의 복구와 관련되는 그안에 기재된 임플란트에 관하여 본원에 표현 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 맥락에서 이식술은 자가 세포 이식술, 바람직하게는 자가 연골세포 이식술이다.
바람직하게는, 전사체 분석 및/또는 전사체에서 기원하는 유전자 발현의 분석을 수행하기 전에 세포가 배양되고, 특히 시험관내 증식된다. 배양은, 예를 들어, 바람직하게는 자가 또는 동종 혈청이 농축된 배양 배지에서 실시된다.
세포는 특히 14 일 내지 30 일, 더욱 특히 17 일 내지 24 일, 바람직하게는 19 일 내지 21 일의 기간에 걸쳐 배양될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 예후 평가는 전사체 분석을 이용하여 수득된 전사체 프로파일 및/또는 전사체 프로파일에서 기원하는 유전자 발현 프로파일에 기초하여 수행된다.
추가의 구현예에서, 전사체 프로파일 및/또는 전사체 프로파일에서 기원하는 유전자 발현 프로파일은 동일한 세포 유형의 전사체 프로파일 및/또는 유전자 발현 프로파일과 비교되고, 후자의 프로파일(들)은 성공적 조직 재생, 성공적 임플란트술 및/또는 성공적 이식술 및/또는 세포 잠재성의 존재의 지표, 또는 특이성 또는 특징이다.
선행 구현예의 대안 또는 보충으로서, 전사체 프로파일 및/또는 전사체 프로파일에서 기원하는 유전자 발현 프로파일은 동일한 세포 유형의 전사체 프로파일 및/또는 유전자 발현 프로파일과 비교되고, 후자의 프로파일(들)은 성공하지 못한 또는 덜 유망한 조직 재생, 성공하지 못한 또는 덜 유망한 임플란트술 및/또는 성공하지 못한 또는 덜 유망한 이식술 및/또는 세포 잠재성의 부재의 지표, 또는 특이성 또는 특징이다.
2 개의 선행 구현예에서 언급된 지표적, 또는 특이적 또는 특징적 전사체 및/또는 유전자 발현 프로파일은, 특별한 이점으로, 가능한 조직 재생 성공, 임플란트술 성공 또는 임플란트 성공 및/또는 이식술 성공 또는 - 다시 말하면 - 가능한 조직 재생 실패, 임플란트술 실패 또는 임플란트 실패 및/또는 이식술 실패의 (더욱) 신뢰할 수 있는 예후를 가능하게 해준다.
성공적 조직 재생, 성공적 임플란트술 및/또는 성공적 이식술 및/또는 세포 잠재성의 존재의 지표, 또는 특이성 또는 특징인 전사체 프로파일 및/또는 유전자 발현 프로파일은 바람직하게는 조직 재생, 임플란트술 및/또는 이식술이 성공적으로 진행된, 및/또는 세포 유형이 잠재성인 환자로부터의 동일한 세포 유형의 전사체 프로파일 및/또는 전사체 프로파일에서 기원하는 유전자 발현 프로파일을 평가함으로써 확인된다.
성공하지 못한 또는 덜 유망한 조직 재생, 성공하지 못한 또는 덜 유망한 임플란트술 및/또는 성공하지 못한 또는 덜 유망한 이식술 및/또는 세포 잠재성의 부재의 지표, 또는 특이성 또는 특징인 전사체 프로파일 및/또는 유전자 발현 프로파일은 바람직하게는 조직 재생, 임플란트술 및/또는 이식술이 성공적이지 못하게 진행된 또는 실패한, 및/또는 세포 유형이 잠재성이 아닌 환자로부터의 동일한 세포 유형의 전사체 프로파일 및/또는 전사체 프로파일에서 기원하는 유전자 발현 프로파일을 평가함으로써 확인된다.
선행 구현예에서 언급된 지표적 전사체 프로파일 및/또는 유전자 발현 프로파일은 바람직하게는 후향 임상 추적연구 또는 요법 결과의 분석의 일부로서 확인된다.
게다가, 지표적 전사체 프로파일 및/또는 유전자 발현 프로파일이 검색 알고리즘, 바람직하게는 컴퓨터-기반 검색 알고리즘을 이용하여 확인되는 것이 바람직하다. 이는, 예를 들어, 응용예에서 제시된 바와 같은, 전사체 데이타에 관한 임의의 (상업적으로) 입수가능한 평가 소프트웨어를 사용하여 실시될 수 있다.
유용한 구현예에서, 전사체 분석을 수행하기 위해 RNA 가 세포로부터 단리된다. 이를 위해, 세포는 일반적으로 RNases (리보뉴클레아제) 가 신속히 변성되는 화학적 환경에서 용해된다. 후속적으로, RNA 가 기타 세포 구성성분 예컨대, 예를 들어, DNA, 단백질, 당, 지질 등으로부터 분리된다. RNA 의 단리는 추출 또는 정제에 기초할 수 있다. 예를 들어, RNA 는 소위 구아니디늄 티오시아네이트 방법과 후속 페놀/클로로포름 추출을 사용하여 단리될 수 있다.
단리된 RNA 는 품질 분석 및/또는 양 분석에 적용될 수 있다. 단리된 RNA 의 정성적 확인은, 예를 들어, 일반적으로 220 ㎚ 내지 450 ㎚ 의 핵산 스펙트럼을 생성하기 위해 통상적으로 오직 매우 적은 샘플 양을 요구하는 광도계를 사용하여 달성될 수 있다. 전형적으로, 측정되는 것은, 첫째로, 260 ㎚/280 ㎚ 흡광도 비율 및, 둘째로, 260 ㎚/230 ㎚ 흡광도 비율이다. 260 ㎚/280 ㎚ 흡광도 비율은 1.8 내지 2.0 일 것이다. 그것은, 특히, 단백질 오염에 관해 결론을 내리는 것을 허용한다. 260 ㎚/230 ㎚ 흡광도 비율은 1.8 초과일 것이고, 특히, 용매, 염 및 단백질에 의한 오염을 시사한다. 품질 분석 및/또는 양 분석을 위한 추가의 적합한 방법은 단리된 RNA 가 특수 칩에서 모세관 전기영동에 의해 분리되어 소위 RNA 일렉트로페로그램 (electropherogram) 이 수득되는 전기영동 분석이다.
추가의 구현예에서, 전사체 분석의 일부로서 비코딩 RNA, 더욱 특히 비코딩 및 비조절 RNA 가 제거된다.
바람직하게는, 전사체 분석의 일부로서 리보솜 RNA (rRNA) 및/또는 전달 RNA (tRNA) 가 제거된다. 이것은, 특별한 이점으로, 코딩 RNA 및/또는 조절 RNA 의 농축을 달성하고, 전사체 분석이 기타 RNA 로부터의 파괴적 간섭 없이 수행되는 것을 허용한다. 다시 말하면, 전사체 분석을 단지 코딩 RNA 및/또는 조절 RNA 에 기초하여 수행하는 것이 바람직하다. 특히 바람직하게는, rRNA 의 고갈이 수행된다.
리보솜 RNA 의 제거 (rRNA) 를 위해, 다양한 제조사로부터의 제조 키트가 근본적으로 입수가능하다. 예를 들어, 총 RNA 의 푸울로부터 흔히 존재하는 대형 리보솜 RNA 분자의 선별적 제거에 기초하는 RiboMinusTM Eukaryote Kit (Life Technologies 로부터의) 를 사용하여 rRNA 가 제거될 수 있다. 이것은 이들 rRNA 를 서열-특이적 비오틴-표지된 올리고뉴클레오티드 탐침에 하이브리드화시켜 달성된다. 하이브리드화된 복합체는 그 후 부동화되고 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드에 의해 제거된다. rRNA-고갈된 생성물은 일반적으로 후속적으로 부가적으로 농축된다.
비코딩 및, 특히, 비조절 RNA, 바람직하게는 리보솜 RNA (rRNA) 및/또는 전달 RNA (tRNA) 의 제거 후에, 품질 분석 및/또는 양 분석이 (다시) 수행될 수 있다. 이와 관련하여, 단리된 RNA 와 관련하여 위에 기재된 품질 및/또는 양 분석을 전부 참조한다.
특히 바람직한 구현예에서, 전사체 분석은 단지 mRNA (메신저 RNA) 에 기초하여 수행된다. mRNA 는 특히 이미 소위 스플라이싱을 통과한, 즉, pre-mRNA 또는 천연 DNA 와 대조적으로 인트론 (비코딩 분절) 을 더이상 함유하지 않는 가공된 RNA 이다.
추가의 구현예에서, 전사체 분석은 RNA, 바람직하게는 mRNA 의 조각화를 포함한다. 조각화는 효소적 소화를 이용하여, 예를 들어 일반적으로 RNase (리보뉴클레아제) 예컨대 RNase III 을 이용하여, 및/또는 물리적 수단에 의해, 예를 들어 초음파를 이용하여 달성될 수 있다. 본 발명에 따른 방법에 적합한 조각은 30 내지 1000 개 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 조각화는 rRNA 의 제거 후에 수행된다.
추가의 구현예에서, 전사체 분석은 역전사, 즉, RNA, 더욱 특히 mRNA 의, cDNA (상보성 DNA) 로의 전사를 수행하는 것을 포함한다. 전사는 바람직하게는 RNA 의 조각화 후에 수행된다. 일반적으로, 전사는 역전사효소를 사용하여 달성된다. 역전사에서 주로 수득되는 산물은 원래의 RNA 가닥에 하이브리드화되는 cDNA 가닥이다. 후자는 그 후 RNase H 를 사용하여 붕괴될 수 있다. 추가의 단계에서, DNA-의존적 DNA 폴리머라제 (프라이머를 통해) 를 사용하여 이미 존재하는 단일 cDNA 가닥에 상보적인 DNA 가닥을 합성하여, 이중 나선 cDNA 가 수득된다.
추가의 구현예에서, 전사체 분석은 이중 나선 cDNA 의 복제 또는 증폭을 포함한다. 바람직하게는, cDNA 는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 더욱 특히 에멀전 폴리머라제 연쇄 반응 (에멀전 PCR) 을 이용하여 복제 또는 증폭된다.
역전사 및 역전사의 일부로서 수득된 cDNA 의 후속적 증폭은, 특별한 이점으로, cDNA 라이브러리를 생성하는 것을 가능하게 해준다.
유용한 구현예에서, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) 을 이용하는 이중 나선 cDNA 의 크기 선별은 복제 또는 증폭 전에 수행될 수 있다.
추가의 구현예에서, cDNA 는 서열분석 방법에 적용된다.
바람직하게는, 전사체 분석은 하이브리드화-기반 마이크로어레이 또는 마크로어레이 방법 (또한 DNA 하이브리드화 어레이 방법으로 언급됨), 또는 서열-기반 방법, 바람직하게는 2세대 서열분석 방법을 포함한다.
마이크로어레이 또는 마크로어레이 방법 및 서열-기반 방법 둘 모두, 각 경우에, 하나의 실험에서 수천 개 유전자의 발현의 차이의 동시 탐지를 허용함으로써 유전자 발현 분석의 게놈와이드 접근으로의 확장을 허용한다.
그것의 기능적 원리의 면에서, 마이크로어레이 또는 마크로어레이 방법은 분자 생물학에서의 종래의 하이브리드화 기술 예컨대, 예를 들어, 노던 또는 서던 블롯 분석을 닮았다. 이들 방법은 핵산이 서로 서열-특이적 방식으로 하이브리드화하는 특성을 이용한다. 하이브리드화는 서로 상보적인 2 개의 핵산 단일 가닥의 비공유 결합을 의미하는 것으로 이해되며, 상기 결합은 주로 핵산 분자의 헤테로시클릭 염기 사이의 수소 결합의 형성에 기초한다.
마이크로어레이 또는 마크로어레이 방법 또는 DNA 하이브리드화 어레이 방법에서, 알려진 서열의 핵산, 소위 탐침이 일반적으로 로봇의 도움으로 지지체에 공간적으로 분해된 방식으로 많은 수로 높은 밀도로 적용되고 그 위에 부동화된다. 이들 DNA 하이브리드화 어레이는 후속적으로 표지된 핵산에 하이브리드화된다. 표지를 위해, 예를 들어, 일반적으로 mRNA 의, cDNA 로의 역전사 동안 방사성 또는 형광 표지된 뉴클레오티드를 편입시키는 것이 가능하다. 하이브리드화는 오직 상보성 핵산 분자 사이에서 일어나므로, 측정된 신호의 강도는 달성된 하이브리드화의 빈도에 비례한다. 탐침의 각각의 위치는 특별한 유전자 또는 유전자 분절에 상응하므로, 상기 위치에서 측정된 신호 강도는 상기 유전자의 상대 발현 수준의 측정을 제공한다. 이용가능한 유전자 탐침의 수 및 그들의 지지체에 적용되는 밀도에 따라, 그러한 어레이를 사용하여 수천개의 유전자를 동시에 분석하는 것이 가능하다.
2세대 서열분석 방법은 소위 Sanger 방법의 경우와 같이 모세관 전기영동을 통한 DNA 의 분리에 더이상 기초하지 않고, 그 대신 cDNA 조각의 고체 지지체로의 커플링 및 개별 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 상보성 결합에 기초하며, 그의 결합은 고해상도 카메라를 사용하여 확인된다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 구현예에서, 전사체 분석은 파이로시퀀싱, 합성에 의한 서열분석, 및 결찰에 의한 서열분석을 포함하는 군으로부터 선택되는 2세대 서열분석 방법을 포함한다.
파이로시퀀싱의 경우에, DNA 조각은, 일반적으로 올리고-펩티드 어댑터 형태의, 링커 분자를 통해 비드에 하이브리드화된다 (비드 1 개 당 조각 1 개). DNA 조각은 그 후 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 을 이용하여 복제된다. 이를 위해, 비드는 PCR 시약을 함유하는 에멀전에 들어간다. 폴리머라제 연쇄 반응의 결과 새롭게 형성된 DNA 카피는 마찬가지로 비드 위에 잡혀 있다. 서열분석을 위해, 비드를 후속적으로 서열분석 수행에 요구되는 효소 및 프라이머를 함유하는 웰을 갖는 적당한 역가 플레이트, 바람직하게는 PicoTiter 플레이트 위에 분포시킨다. 차례로, 4 개의 뉴클레오티드 데옥시아데노신 트리포스페이트 (dATP), 데옥시구아노신 트리포스페이트 (dDTP), 데옥시시티딘 트리포스페이트 (dCTP) 및 데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP) 가 그 후 첨가된다. 뉴클레오티드의 각각의 편입으로, 파이로포스페이트가 방출되며, 이는 ATP 로서, 예를 들어 효소 루시퍼라제를 자극하여 루시페린을 옥시루시페린 및 빛으로 전환시킨다. 역가 플레이트의 상응하는 웰이 빛이 밝혀진다. 서열분석 단계 당 오직 하나의 뉴클레오티드가 첨가되므로, DNA 조각의 서열은 따라서 신호에 기초하여 확인될 수 있다.
서열분석 방법 "합성에 의한 서열분석" 의 경우에, 가역적 종료자 뉴클레오티드가 사용된다. 서열분석되는 DNA 조각은 플로우 셀의 유리 표면에 결합되고 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 을 이용하여 복제된다. PCR 카피는 원래의 DNA 조각 주위에 고정되어, 동일한 분자의 그룹을 초래한다. 서열분석은 - Sanger 방법과 유사하게 - 가역적 종료자 뉴클레오티드를 수반한다. 합성 시약 (프라이머, DNA 폴리머라제 및 4 가지 상이한 형광 염료-표지된 가역적 종료자 뉴클레오티드) 이 플로우 셀에 첨가된다. 종료자 뉴클레오티드 4 가지 중 하나가 DNA 조각에 부착하는 경우, 형광단이 추가의 합성을 차단한다. 반응은 잠시 중단되고, 염료 및 종료자 뉴클레오티드가 절단되고, 새로운 라운드가 시작하기 전에 빛 신호가 기록된다.
서열분석 방법 "결찰에 의한 서열분석" 의 경우에, 실제 서열분석 반응은 비드 위에서의 에멀전 폴리머라제 연쇄 반응 (에멀전 PCR) 후에 일어난다. 첫번째 라운드에서 (총 5 개 중), 보편적 서열분석 프라이머 (길이 n) 및 4 가지 상이한 옥타머 올리고뉴클레오티드의 혼합물 둘 모두가 반응에 첨가된다. 상기 옥타머의 위치 1 및 2 는 형광 염료 4 가지 중 하나에 의해 코딩되는 규정된 염기를 갖는다 (16 가지 가능한 디뉴클레오티드 쌍 중 4 가지; 5 회 라운드에서, 모든 16 가지 가능한 디뉴클레오티드가 사용된다). 적당한 옥타머 올리고뉴클레오티드는 PCR 조각에 하이브리드화하고, 마찬가지로 하이브리드화된 서열분석 프라이머에 결찰된다. 형광 신호가 측정되고, 염료가 마지막 3 개의 뉴클레오티드와 함께 제거된다. 이들 단계는 DNA 길이에 따라 여러번 반복된다 (30-35 개 염기의 경우에, 이는 6-7 회 라운드일 것이고, 다음 사이클에서, 염기 6/7, 그 후 11/12 가 심문된다). 마지막으로, 모든 결찰된 올리고-프라이머 구축물이 제거 (재설정) 된다. 새로운 라운드가 길이 n-1 의 새로운 서열분석 프라이머 및 4 가지 다른 형광 표지된 디뉴클레오티드로 시작한다. 이제. 첫번째 사이클 라운드에서, 염기 n-1 및 1, 그 후 염기 5/6, 10/11 등이 그에 따라 확인된다. 3 회의 추가의 라운드 (프라이머 n-2, n-3 및 n-4) 후에, 서열이 입수가능하다; 각각의 염기는 2 가지 상이한 올리고뉴클레오티드에 의해 점검되었다.
현재 확립된 고처리 서열분석 방법의 개관에 관하여, Niedringhaus 등에 의한 출판물 (Landscape of Next-Generation Sequencing Technologies, Anal. Chem. 2011, 83, 4327-4341) 및 Hurd 등에 의한 출판물 (Advantages of next-generation sequencing versus the microarray in epigenetic research, BRIEFINGS IN FUNCTIONAL GENOMICS AND PROTEOMICS. VOL 8. NO. 3. 174-183) 및 또한 Hollricher 에 의한 논문 (Hochleistungs-Sequenzieren [High-performance sequencing], Laborjournal 2009, 4, 44-48) 을 참조하며, 그안에 기재된 서열분석 방법에 관하여 이들의 공개 내용은 각 경우에 본 명세서에 표현 참조에 의해 포함된다.
추가의 구현예에서, 전사체 분석은 서열분석된 cDNA 또는 cDNA 조각의 조립 또는 결합을 포함한다. 이는 기능 또는 진화 관계에 관하여 및 따라서 원래의 서열에 관하여 결론을 내리는 것을 허용한다. 조립은 통상의 기술자에게 익숙한 적당한 생물정보 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
추가의 구현예에서, 조립된 cDNA 조각은 유전자 주석달기 (annotation) 에 적용되며, 이는 특히 구별하여 조절되는 유전자의 정보-보유 서열의 식별을 허용한다. 유전자 주석달기는 생물정보 방법에 의해 지지되는 것이 유용하며, 그것을 이용하여, 특히 대사 및 조절 네트워크에 관하여, 패턴 또는 프로파일 및 관계가 발견되고 알려진 지식과 관련될 수 있다. 근본적으로, 이들 데이타의 분석은, 예를 들어 클러스터링 방법에 의한, 실제 가공 전에 정규화를 요구한다. 데이타는 처리 실험 및 기준 실험을 통해 측정된 값들로 구성된 지수 형태이고, 정규화는 일반적으로 로그 형성에 의해 달성된다. 기타 정규화는, 예를 들어, 벡터 노름, 계층, 균일 분산 또는 소위 z-점수에 기초한다. 마지막은 특정 값이 평균 값보다 유의하게 작은지, 그와 같은지 또는 큰지 여부를 결정하는 방법이다. 이와 관련하여, 음성 값은 평균 값보다 작은 값의 지표이고, 양성 값은 평균 값보다 큰 값의 지표이다. 그 후 표준 편차의 분석은 부가적으로 이러한 편차의 유의성을 전달한다. 이들 데이타의 시각화에 이용가능한 것은 일반적으로, 첫째로, 상이한 기능 카테고리에 기초하는 데이타의 구조화 및, 둘째로, 실시된 카테고리화에 따른 시각화를 허용하는 다양한 소프트웨어 시스템이다. 기능의 부여, 또는 카테고리화는 근본적으로 알려진 검색 알고리즘과 결합된 이용가능한 주석달기에 기초하여 그렇지 않으면 이용가능한 주석달기와 개별적으로 발견된 검색 알고리즘의 조합에 의해 달성될 수 있다. 그러한 검색 알고리즘의 기초는 통상적으로 조사되는 샘플의 유전자 발현 패턴이 특별한 병리생리학적 표현형을 묘사하는 기준 샘플과 비교되는 차이 분석에 의해 형성된다. 이들 데이타에 기초하여, 검색 알고리즘을 식별될 세포 상태에 특이적으로 맞춰 프로그램하는 것이 가능하다.
게다가, 본 발명은 조직 재생 능력 및/또는 세포 잠재성 및/또는 임플란트술, 더욱 특히 세포 임플란트술, 및/또는 이식술의 성공 전망을 예후적으로 평가하기 위한, 전사체 분석, 더욱 특히 전사체 프로파일 및/또는 전사체에서 기원하거나 전사체에 기초하는 유전자 발현 프로파일의 용도에 관한 것이다. 불필요한 반복을 회피하기 위해, 추가의 특색 및 이점에 관하여 지금까지의 명세서를 전부 참조한다.
본 발명의 추가의 특색 및 이점은 하기 구현예에 의해 도면, 도면 설명, 하나의 실시예 및 또한 종속항을 참조하여 밝혀진다. 여기에서, 본 발명의 개별 특색은 단독으로 또는 서로와의 조합으로 실형될 수 있다. 기재된 구현예는 단지 본 발명을 설명하고 본 발명의 더 나은 이해를 제공하는 역할을 하고, 어떤 식으로든 제한적으로 이해되면 안된다.
도면 설명
도 1 은 qRT-PCR (정량적 실시간 PCR) 을 이용하여 확인된 GAPDH (A) 및 6 가지 선별된 마커 유전자 (B) 의 발현 값이다. 각각의 유전자에 관해, 박스 플롯은 25%-75% 범위 (회색 박스), 5%/95% 범위 (박스 위 및 아래의 수평선), 중간치 (박스 내부의 선) 및 또한 이상치 (검은색 점) 를 보여준다. A: GAPDH 발현 값을 3 회 반복 측정으로 총 mRNA 발현으로 표준화했다 (각각 전체 422 명의 환자 샘플을 사용함). 3 개의 데이타세트 사이의 차이는 통계적으로 유의하지 않으며 (단순 ANOVA), 이는 qRT-PCR 방법의 신뢰성을 보여준다. B: 6 가지 마커 유전자의 발현이 GAPDH 에 관하여 음성 dCt 값으로서 나타나 있다. 지지물 (Novocart® Basic) 의 콜로니화 직전에 단층 세포 배양물의 수집시 일상적 품질 제어의 일부로서 데이타를 수집했다. 각각의 환자에 관해 수득된 mRNA 발현 값을 문제의 환자의 cDNA 표준으로 표준화하고 (cDNA 합성 키트에 관한 제조사의 정보에 따라), 따라서 각각의 6 가지 선별된 유전자에 관한 발현 데이타의 직접 비교가능성이 보장된다. COL1: COL1A2, 콜라겐 유형 I 알파-2 사슬; COL2: COL2A1, 콜라겐 유형 IIb 알파-1 사슬; AGG: ACAN, 아그레칸; IL1: IL1-β, 인터루킨-1β; BSP2: 뼈 시알로단백질 2; FLT-1: 혈관 내피 성장 인자 수용체 1.
도 2 는 배양된 인간 연골세포 내의 상이한 단백질 패밀리의 발현 수준의 분포를 보여준다. 대수 스케일로 제시된 RPKM 발현 값은 각각의 20 개 샘플에 관해 전사체 분석의 일부로서 수집했다. 각각의 유전자에 관해, 박스 플롯은 25%-75% 범위 (회색 박스), 중간치 (박스 내부의 선) 및 또한 전체 범위 (박스 위 및 아래의 수평선) 를 보여준다. 삼각형은 연골에 관하여 양성 (예를 들어, FGF-2) 또는 동화 특성 (예를 들어, ACAN) 이 부여될 수 있는 유전자를 표지한다. 다이아몬드는 원치 않는 (예를 들어, 콜라겐 I) 또는 음성 또는 이화 특성 (예를 들어, 인터루킨-1, ADAM-TS5) 이 부여되는 유전자를 표지한다. 유전자 명칭은 NCBI 명명법에 상응한다.
도 3 은 COL1A2, COL2A1, ACAN 및 IL-1β 의 발현 데이타에 기초하는 qRT-PCR 및 RNA 서열분석 (NGS, 차세대 서열분석) 사이의 상관관계 분석을 보여준다. COL1A2, COL2A1, ACAN 및 IL-1β 에 관한 발현 값을, 첫째로, 422 개 샘플로부터 종래의 qRT-PCR 을 이용하여 (표 1 참조) 및, 둘째로, 20 개 샘플로부터 NGS-기반 RNA 서열분석을 이용하여 수득했다. ΔCt 값 및 RPKM 발현 값이 대수적으로 제시되어 있다. 이차 도면은 RPKM 발현 값의 대수 전환 전의 플롯을 보여주며, 그들의 매우 양호한 상관관계를 더욱더 명백히 알 수 있다.
도 4 는 3114 가지 가장 고도로 발현된 유전자의 유전자 발현 비율에 관한 수치 값의 분포를 막대그래프 형태로 보여준다. 수치 값은 임플란트 실패를 갖는 군 (S11 내지 S20) 으로부터의 평균 값에 대한 양호한 임상 결과를 갖는 군 (S1 내지 S10) 으로부터의 각각의 전사된 유전자의 평균 RPKM 값의 비율로부터 수득했다. 수치 값 > 1 은 양호한 임상 결과와 상관관계가 있다. 수치 값 < 1 은 임플란트 실패와 상관관계가 있다. 각각의 막대는 전체 포착된 범위의 1/100 을 나타낸다 (최소 수치 값: 0.006; 최대 수치 값: 4.9).
도 5 는 20 개 샘플 (S1 내지 S20) 의 게놈와이드 발현 데이타에 기초하는 계층적 클러스터링을 보여준다. 클러스터링은 인접 연결 알고리즘을 사용하는 샘플의 모든 유전자의 발현 값 사이의 Pearson 상관관계에 기초한다. 샘플은 문제의 환자에서의 임플란트술의 임상 결과에 따라 "양성" 또는 "음성" 으로 언급된다. 음성 샘플 간의 분산은 양성 샘플 간의 분산보다 상당히 더 높지만, 근원적 임상 결과 사이의 명백한 분리가 등록될 수 있다. 이러한 분리는 임상 결과 - 양성으로 또는 음성으로 진행한 이식술 - 가 임플란트술에 사용된 세포의 전사체 표현형에 부여될 수 있다는 것을 시사한다.
도 6 은 샘플 S1 내지 S20 의 RPMK 수치 값으로부터 Pearson 상관관계 클러스터 분석의 2 개의 열지도 (heatmap) 평가, A 및 B 를 보여준다. 값은 그들의 관계에 따라 배열되었고, 밀접하게 관련된 발현 패턴은 서로 가깝다. A: 여기에서 고려된 것은 모든 그들의 엑손을 갖는 완전한 유전자였다. B: 엑손을 개별적으로 mRNA 구조에 독립적으로 분석했다. S2 및 S11 외에는, 이러한 평가로 근원적 임상 진행에 따라 샘플 S1 내지 S20 의 분리를 달성하는 것이 가능했다 (S1-S10: 양성 진행; S11-S20: 임플란트 실패).
실시예 섹션
1. 재료 및 방법
1.1 연구의 구조
수행된 것은 아래 정의된 바와 같은 환자 집단에서 초기 결과, 유해 효과 및 통증, 기능 및 부기에 관한 출발 상태의 변화의 후향 조사였다. 안전성 및 환자 결과에 대한 환자, 생산 및 세포 생물학 특성의 영향을 조사하기 위해 추가의 분석을 수행했다. 적응 및 재활을 포함하는 임상 및 수술 절차는 표준 작업 절차 (SOP) 에 정의되어 있다. 외과의는 그들이 임플란트를 처음으로 사용하기 전에 연골 회복 및 임플란트 수술에 관해 수술 기술을 훈련했다. 환자가 고지에 입각한 동의를 한 후에, 치료 지시가 관절경검사에 의해 확인되었다. 영향을 받은 관절에서, 2 내지 3 개의 연골-뼈 조각을 융기사이오목 (스트레스받지 않은 영역) 으로부터 멸균 및 유효 표준 트레핀 (Aesculap AG, Tuttlingen, Germany, 절단 직경: 4 mm) 을 사용하여 제거했다.
1.2 임상 데이타 수집
각각의 환자의 외과의는 병력 (병인학), 기본 인구통계 데이타 (연령, 성별) 및 수술 절차와 환자와의 마지막 접촉 사이의 기간을 포함하는 데이타 수집 시트를 완성할 것을 요청받았다. 환자와 함께, 통증 강도, 기능 및 부기를 절차 전 상담 및 절차 후 상담 둘 모두에서 10-점 스케일로 평가했다. 결과 평가 스케일은 시각적 아날로그 스케일 (VAS) 로부터 적응되었다. 더 높은 값은 더 나은 결과를 시사한다 (즉, 10 은 "통증 없음", "부기 없음", "기능 장애 없음" 을 의미한다). 이러한 10-점 결과 등급매기기는 각각의 외과의에 의해 환자 상담에서 수행되었고, 추가의 임상 진행에 관한 조기 지표로서 사용되었다. 참여하는 외과의는 또한 발생한 모든 유해 효과 및, 유사하게, 후속적으로 요구되는 임의의 처리를 명시하도록 요청받았다. 설문지는 환자가 더 이른 관절경검사 또는 기타 수술 연골 복구 방법에 부적당하게 응답했는지 여부를 조사하지 않았다. 극단적인 사례에서, 원치 않는 효과는 비치유 또는 떼어짐 (tear-out) 의 결과로서 임플란트 실패였다.
1.3 연구 집단
조사는 독일에서 61 개의 센터에서 수행되었고, 여기에서 433 명의 환자가 처리되었다. 데이타는 총 422 명의 환자 (97.4%) 에 관해 보고되었다. 나머지 11 명의 환자는 나머지 연구 및 RNA 분석에서 배제되었다. 422 명의 환자 중에서, 140 명은 여성이고, 282 명은 남성이었다. 그들의 평균 연령은 33.4 세 (최소: 14.7 세, 최대: 66.3 세) 였다. 대부분의 일차 연골 결함 (International Cartilage Repair Society (ICRS) 의 분류에 따른 등급 III 내지 IV 의 손상) 은 무릎의 안쪽 넙다리 관절융기 (68.5%), 그에 뒤이어 가쪽 관절융기 (14.9%), 슬개후 영역 (10.2%), 도르래 (5%) 및 정강뼈 (0.2%) 에 대해 확인되었다. 6 명의 환자 (1.4%) 에서, 결함은 목말뼈에 대해 확인되었다. 대부분의 환자는 단일 결함을 가졌다 (93%). 결함 크기는 1 내지 20 ㎠ 로 달랐다. 평균 크기는 5.9 ㎠ 였다. 환자 애프터케어의 평균 지속기간은 6.9 개월이었다. 총 83 명의 환자의 경우에, 수술 절차 이후 외과의에 의해 등록된 마지막 방문일까지 1 년 이상이 경과했다 (표 1).
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표 1: 연구 집단 (422 명의 환자)
표 1 은 연구 집단을 상응하는 환자 특색으로 보여준다. 특색은 배정된 절대 환자 수 및, 해당되는 경우, 백분율이다. 1 개 초과의 영역에 영향을 미치는 결함을 갖는 1 명의 환자에게 복수의 진단이 가능했다.
1.4 배양
뼈, 광화 연골 및 표재 연골로부터 제거 후에, 연골세포를 나머지 연골로부터 기계적 및 효소적 추출에 의해 단리하고, 표준 방법에 따라 조건화하고, 우수 제조관리 기준 (GMP) (TETEC AG, Reutlingen, Germany) 에 따라 허용되는 장비에서 일차 배양으로서 시험관내 증식시켰다. 단계는, 세포 단리 후에, 자가 혈청이 강화된 배양 배지에서의 세포 증식, 트립신화에 의한 수집 및 스카폴드 (Novocart Basic) 에서의 콜로니화를 포함했고, 이는 연골 회복에 관한 관절경검사 후 21 일에 일어났다. 스카폴드를 평균 세포 용량 1.36 x 106 세포/㎠ 으로 콜로니화했다. 전형적으로, 세포를 직접 일차 배양물로부터 적용했다. 특수한 상황 (예를 들어, 환자 질환) 하에, 세포를 사용 전에 저온보존하고 이차 배양물로부터 투여했다 (사례 중 10% 미만).
1.5 고처리 RNA 서열분석
선행 섹션에 기재된 뱃치로부터 20 개의 RNA 샘플을 분석했으며, 이들 중, 10 개는 임상적으로 성공적인 처리로부터 나왔고, 10 개는 음성 결과를 갖는 환자로부터 수득되었다. 각각의 샘플은 독특한 바코드 서열을 부여받았고, 바코드화된 샘플의 분취물을, 환자 결과 (양성 결과, 음성 결과) 에 따라, 2 개의 군으로 조합했다.
각각의 샘플로부터, 연골세포의 총 RNA 1 내지 10 ㎍ 을 출발 재료로서 사용했다. 총 RNA 를 기구 모델 Bioanalyzer 2100 에서 Agilent RNA 6000 Nano Chip (5067-1511) 을 사용하여 양 및 완전성에 관해 분석했다. 리보솜 RNA (rRNA) 의 고갈을 제조사의 프로토콜에 따라 RNA-Seq (A10837-08, life technologies) 에 관한 RiboMinusTM Eukaryote Kit 에 의한 2-3 회 런 (run) 을 사용하여 수행했다. 농축을 RiboMinus Concentration Module (K1550-05, life technologies) 을 사용하여 수행했다. rRNA 제거의 효율을 점검하고, 기구 모델 Bioanalyzer 2100 에서 Agilent RNA 6000 Nano Chip (5067-1511) 위에서 분취물 런으로 확인했으며, rRNA 피크의 완전한 제거가 보였다.
라이브러리를 SOLiDTM 총 RNA-Seq Kit (4445373, life technologies) 를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 생성했다. 간략히, 리보솜 결핍 후에 10 내지 100 ng 의 RNA 를 첫째로 RNase III 을 이용하여 37℃ 에서 10-분 길이 소화에 의해 조각내고, 다시 RiboMinus Concentration Module (K1550-05, life technologies) 을 사용하여 정제하고, 12 ㎕ 의 RNase-미함유 물로 용출했다. 조각 크기를 SOLiD4 기구의 최적 크기 범위 (150 내지 200 개 뉴클레오티드) 에 관해 점검하고, 다시 기구 모델 Bioanalyzer 2100 에서 Agilent RNA 6000 Nano Chip (5067-1511) 에서 분취물 런을 수행했다.
cDNA 라이브러리의 구축을 위해, RNA 조각을 가닥-특이적 방식으로 어댑터에 연결시키고, 역전사 및 그에 뒤이어 PAGE 를 사용하는 크기 선별 및 PCR 에 의한 증폭을 이용하여 이중 나선 cDNA 라이브러리로 전환시킨다. PCR 증폭 동안, 특이적 바코드-특이적 오버행을 보유하는 3'-어댑터 프라이머로 바코드 서열을 삽입한다. 이러한 방법은 바코드 어댑터가 라이브러리에 직접 연결될 때 보고된 바코드 왜곡을 회피한다. 다시 한 번, 조각 크기를 기구 모델 Bioanalyzer 2100 에서 Agilent DNA 1000 Chip (5067-1504) 에서 분취물 런으로 150 내지 200 개 뉴클레오티드의 영역에 관해 점검한다.
Bioanalyzer 의 농도 측정을 계산 및 바코드화된 샘플 S1-S10 (양호한 임상 결과) 및 S11-S20 (음성 임상 결과) (각각의 경우에 바코드 1-10) 의 등몰 혼합에 사용했다. 에멀전 PCR (emPCR) 을 각각의 조합된 라이브러리에 관해, 각각의 경우에 0.5 pM 의 최종 라이브러리 농도로 제조사의 권고에 따라 E20 스케일로 수행했다. 에멀전의 파괴 및 비드의 세정 및 또한 비드의 농축을 제조사의 프로토콜에 따라 수동으로 수행했다. 주형 비드의 품질 및 양을 SOLiD4.0 기구에서 1 천 5 백만 개 농축된 주형 비드의 작업흐름 분석 (WFA) 런으로 측정했다. 양쪽 라이브러리에서, 신호-대-잡음 비율은 4% 이었고, P2/P1 비율은 100% 였으며, 이는 모노클로날 비드의 높은 백분율을 시사한다. 라이브러리의 1 억 5 천 8 백만 개 주형 비드를 각각의 경우에 SOLiD4.0 담체의 쿼드 필드 (1/4) 에 적용하고, 어댑터 P1 로부터 결찰에 의해 서열분석하고, 그에 따라 50 bp 조각 해독 기록을 수득했다.
1.6 데이타 생성
유해 효과에 관한 데이타 및 환자 결과를 수집하고, Excel spreadsheet 에 입력했다. 생산의 품질 제어 데이타 및 또한 공변수 (인구통계학, 환자 및 생성물 방출과 관련된 특색) 를 동일한 데이타베이스에 입력한다. 모든 입력된 데이타를 일치에 관해 점검했다.
1.7 개체 파라미터 데이타의 통계 및 공변 분석
유해 효과의 양, 효능 결과 및 환자 특성을 보여주기 위해 평균 값, 표준 편차, 범위 및 신뢰 구간을 포함하는 요약 통계를 사용했다. 임플란트 생산 특색 및 환자 결과 사이의 연관성을 확인하기 위해 각각의 생성물의 방출 특성을 조사 데이타와 비교했다. 생산 특성 또는 방출 특성과 하기를 포함하는 환자 안전성 조사에서의 5 개의 결과 측정 사이의 연관성에 관해 점검하기 위해 다수의 카이 제곱 시험 및 회귀 모델을 생성했다: 임플란트-관련 유해 효과 (임플란트 실패, 탈착, 비대, 관절섬유증, 유착, 연골연화증, 관절 감염 및 유리 관절체의 출현율의 통합으로서 정의됨), 추가의 작업 (어떠한 이유에서건) 및 통증, 기능 및 부기에 관한 출발 상태에서의 변화. 바이오마커와 흥미로운 결과 사이의 연관성의 모델링과 관련된 회귀를 각각의 바이오마커 및 모든 바이오마커 둘 모두에 관해 동시에 핏팅했다. 임플란트-관련 유해 효과의 출현율 및 추가의 작업의 출현율에 대한 독립적 공변의 영향을 확인하기 위해 지수 회귀 모델링을 사용했다. 통증, 기능 및 부기에 관한 출발 상태에서의 변화를 모델링하기 위해 선형 모델을 사용했다. 0.05 에서, p-값을 유의하다고 추정했다. 모든 회귀 모델은 수술 절차로부터 환자와의 마지막 의료 약속까지의 기간을 포함했으며, 그 이유는 이것이 결과에 관한 유의한 독립적 예측적 값으로 의심되었기 때문이다.
1.8 모든 전사체 데이타의 통계적 분석
BioScope 1.32 소프트웨어 (Applied Biosystems) 의 Whole Transcriptome Analysis Pipeline 을 사용하여, 해독 서열을 인간 게놈 (UCSC 버전 HG 19) 으로 지도화했다. UCSC refSeq (2010 년 11 월 7 일에 다운로드됨) 의 주석달기로부터 진행하여, 유전자에 관한 발현의 RPKM 값을 계산했다. 간략히, RPKM 값 (지도화된 백만 당 킬로베이스 엑손 모델 당 해독) 은 샘플 당 서열분석 깊이 (총 분절 수) 및 모든 엑손의 길이 (bp) 에 의해 정규화된, 주어진 전사의 엑손으로 지도화된 서열분석된 분절의 수이다. 이들 값을 초기 확인에 사용했다. 샘플-특이적 기술 왜곡을 제거하기 위해 Bullard 등 (J.H. Bullard, E. Purdom, K.D. Hansen, S. Dudoit, Evaluation of statistical methods for normalization and differential expression in mRNA-Seq experiments. BMC Bioinformatics 11: 94 (2010)) 에 의해 기재된 스케일 정규화 방법을 사용했고, 수득된 발현 값을 대수 스케일로 지도화했다. 샘플을 그들의 전체 전사체 발현 프로파일 사이의 Pearson 상관관계 거리에 기초하는 인접 연결 알고리즘 (N. Saitou and M. Nei, The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4 (4): 406-425 (1987)) 을 사용하여 클러스터링했다. 차등 발현에 관해 점검하기 위해 비파라미터 순위 생성 방법 (nonparametric rank product method) (R. Breitling, P. Armengaud, A. Amtmann, P. Herzyk, Rank products: a simple, yet powerful, new method to detect differentially regulated genes. FEBS Letters 573 (1): 83-92 (2004)) 을 사용하여, pfp 값 (퍼센트 거짓 양성 값, FDR-보정된 p-값과 비슷한 척도) 을 산출했고, pfp < 0.05 및 0.9 초과의 배수 변화의 절대 값 (즉, 2 배된 또는 반으로 줄어든 발현) 을 갖는 전사물이 유의한 차등 발현으로 여겨졌다. 특정 기능 카테고리 (과표현 분석, 초기하 시험, 거짓 발견율에 관해 보정된 p-값) 의 강화에 관해 점검하기 위해 차등 발현된 단백질-인코딩 전사물을 사용했다. 모든 분석에, Mayday (F. Battke, S. Symons, K. Nieselt, Mayday -Integrative analytics for expression data. BMC Bioinformatics 11 (1): 121 (2010)) 에 의해 기재된 기술을 사용했다. Integrative Genomics Viewer IGV (J.T. Robinson, H. Thorvaldsdottir, W. Winckler, M. Guttman, E.S. Lander, G. Getz, J.P. Mesirov, Integrative genomics viewer. Nat. Biotech. 29: 24-26 (2011)) 를 사용하여, 관심의 개체 유전자의 분절을 상세히 연구했다.
2. 결과
2.1 환자 결과에 관한 출발 상태에서의 변화
수술 절차 전에 및 이어지는 환자 방문에서, 의사는 관절 통증, 기능 및 부기를 10-점 스케일로 확인했으며, 더 높은 값은 더 나은 결과를 시사한다. 절차 전에 및 절차 후에 모두 질문에 관해 대답한 환자는 모든 3 회 측정에서 출발 상태에 비해 유의한 개선을 달성했다 (p < 0.0001, Wilcoxon 부호 순위 시험). 수술 절차 이후 평균 지속기간은 6.9 개월 (범위: 2 내지 30 개월) 이었고, 이는 ACI 결과의 대부분의 기타 요약에 명시된 것보다 현저히 더 짧은 시간 스케일이다. 후향 연구는 관절 연골의 복구와 관련된 현재의 지식에 중요한 측면을 기증했다. 83 명 환자의 하위군에서, 그들의 수술 절차 이후 12 개월 이상에서, 그들은 전체 환자 집단보다 모든 3 회 결과 측정에서 평균적으로 더 강한 변화를 보였다고 보고되었다 (표 2).
Figure pct00002
표 2: 개체 결과 측정
2.2 유해 효과의 출현율
표 3 은 보고된 유해 효과의 출현율을 보여준다. 임플란트 실패의 출현율은 전체 환자 집단에서 3.1% 였고 그들의 절차 이후 12 개월 이상이 경과한 환자의 하위군에서 6% 였다. 일반적으로, 임플란트-관련 합병증 사례의 보고된 수는 전체 환자 집단에서 매우 적었다. 탈착 (박리), 관절섬유증 및 비대가 각각 1.7%, 2.4% 및 0.7% 에서 관찰되었다. 총 36 명의 환자 (8.5%) 가 추가의 작업 및/또는 교정을 요구했다. 추가의 작업을 요구한 환자에서 보고된 가장 흔한 유해 효과는 임플란트 실패 (13, 이들 사례에서 기원하는 전사체 분석에 의해 추가로 조사된 10 개의 샘플), 탈착 (6), 관절섬유증 (7), 윤활막염 (7), 유착 (5) 및 통증 (6) 이었다. 그들의 절차 이후 12 개월 이상이 경과한 83 명의 환자의 하위군은 13.3% 의 추가의 작업율을 보였다. 대부분의 추가의 작업은 관절경검사로 수행되었다.
Figure pct00003
표 3: 보고된 합병증
2.3 결과와 독립적 위험 인자의 연관성
모든 처리된 결함의 크기는 임의의 측정된 환자 결과와의 임의의 상관관계를 보이지 않았다. 환자의 기능의 경우에 출발 상태에서의 변화에 관해, 환자 연령과의 유의한 연관성이 발견되었다 (즉, 더 낮은 연령의 경우에, 평균적으로 더 큰 개선이 명백했다, p = 0.004, 제시되지 않음). 표 4 는 일차 결함의 위치와 임플란트-관련 유해 효과의 출현율의 연관성과 관련된 카이 제곱 시험의 결과를 명시한다. 임플란트-관련 유해 효과 및 추가의 작업의 출현율 둘 모두 무릎뼈 결함을 제외한 일차 결함의 위치에 매우 독립적이었다는 것이 밝혀졌다. 임의의 경우에, 영향받은 개체에서, 그러한 사건의 확률은 일차 결함이 무릎뼈에 위치할 때 더 컸다 (p < 0.0001).
Figure pct00004
표 4: 결함의 위치에 따른 임플란트-관련 합병증 및 추가의 작업
표 5 는 연골 손상의 분류와 임플란트-관련 유해 효과 및 추가의 작업의 출현율 사이의 연관성에 관련된 카이 제곱 시험의 결과를 명시한다. 임플란트-관련 유해 효과의 경우에, 영향받은 개체에서, 그러한 사건의 확률은 연골 결함이 퇴행성으로 분류되었을 때 더 컸다 (p = 0.005). 그러나, 환자에서, 그러한 사건의 확률 박리뼈연골염에 의해 야기된 연골 결함이 존재했을 때 더 낮았다 (p = 0.04).
Figure pct00005
표 5: 결함의 성질에 따른 임플란트-관련 합병증 및 추가의 작업
표 6 은 환자 결과와 한편으로는 세포 배양 변수, 다른 한편으로는 6 가지 선별된 마커 유전자의 mRNA 발현 값 (섹션 2.4.1 참조) 사이의 연관성을 다변량 p-값으로서 보여준다. 유의한 관계 및 미미한 추세가 강조표시되어 있다. 임플란트술 전에 세포의 임시 냉동보존은 임플란트-관련 합병증 (IRC) 의 강화된 출현율 또는 임의의 기타 결과 측정 (추가의 작업 FO, 통증, 기능, 부기) 과의 연관성을 전혀 보이지 않았다. 세포 생활력에 관하여, 동일한 결과가 관찰되었다. 그러나, 적은 수의 투여된 세포가 추가의 작업 (FO) 과 유의하게 연관되었다 (p = 0.06; 표 6).
Figure pct00006
표 6: 환자 결과와 세포 배양 변수 또는 6 가지 선별된 마커 유전자의 mRNA 발현 값 사이의 관계
2.4 발현 데이타
2.4.1 특이적 유전자 발현
정량적 실시간 PCR (qRT-PCR) 을 사용하여 하기 6 가지 선별된 마커 유전자의 발현을 확인했다: 아그레칸 (ACAN), 세포외 연골 기질의 통합 구성성분; 통상적으로 연골 조직에서 발생하지 않는 유형 I 콜라겐 (COL1A2); 연골-특이적 유형 II 콜라겐 (COL2A1); 인터루킨-1β (IL-1β), 염증성 사이토카인; FLT-1, 혈관 내피 성장 인자 수용체의 동형; 및 뼈 시알로단백질 BSP-2, 뼈 성장 인자. 마지막 2 가지 언급된 유전자의 선별 이유는 합병증이 특히 임플란트된 연골 조직의 혈관신생 또는 임플란트된 연골 조직 내의 골증식체의 형성으로부터 초래될 수 있기 때문이다.
이들 6 가지 마커 유전자의 발현 값 (dCt) 이 도 1 에 나타나 있고, 유의한 차이를 보여준다. 모든 422 개 샘플 사이에서 한 자릿수 내에서 다른, 가장 안정적인 mRNA 수준이 아그레칸에 관해 발견되었다. 세 자릿수 내의 최고 변이가 모두 합쳐 매우 낮은 탐지 수준으로 FLT-1 에 관해 발생했다. 예를 들어 유형 I 콜라겐에 관해, 평균적으로 1000 개 mRNA 전사물/세포 를 계산하는 것이 가능했지만, FLT-1 의 경우에, 오직 10 개 mRNA 전사물/1000 개 세포 가 계산되었다. 비교를 위해, 예를 들어, 500 배 이상 더 많은 FLT-1 mRNA 전사물이 시험관내 배양된 인간 정맥 내피 세포에 존재한다.
이들 변이에도 불구하고, 그럼에도 불구하고 이들 마커 유전자 중 일부와 임상 결과 사이에 유의한 또는 적어도 미미한 상관관계를 관찰하는 것이 가능했다 (표 6 및 7). 예를 들어, 임플란트-관련 합병증 (IRC) 과 증식된 연골세포 내의 상승된 FLT-1 발현 수준 사이에 유의한 연관성을 확인하는 것이 가능했다 (p = 0.02, 표 6). 그와 대조적으로, 상승된 IL-1β 수준과 저하된 유형 II 콜라겐 수준에 관해 오직 미미한 관계를 확인하는 것이 가능했다 (둘다 p = 0.08, 표 6). 그러나, 계산 모델에서 모든 마커 유전자를 고려할 때, IL-1β (p = 0.02, 표 6) 및 FLT-1 (p = 0.08, 표 6) 에 관해 IRC 에 관한 유의한 또는 미미한 관계를 발견하는 것이 가능했다.
6 가지 마커 유전자에 관해 회귀 계수 뿐만 아니라 절차 이후 경과된 시간을 고려하는 다변량 p-값을 보여주는 표 7 에 따르면, 임의의 마커 유전자의 발현을 통증, 기능 및 부기에 관해 유의한 것으로 분류하는 것은 가능하지 않았다. 환자 결과 IRC 및 FO (추가의 작업) 에 관한 계수를 지수 회귀를 이용하여 계산했다; 통증, 기능 및 부기에 관한 계수를 선형 회귀를 이용하여 계산했다. p-값 (두번째 열) 은 문제의 관계의 유의성을 나타내고, 유의한 관계 및 미미한 동향이 강조표시되어 있다.
Figure pct00007
표 7: 환자 결과와 절차 이후 시간 또는 6 가지 선별된 마커 유전자의 mRNA 발현 값 사이의 관계의 다변량 분석
2.4.2 게놈와이드 발현
포착된 발현 데이타 전체는 약 30 000 개 유전자와 매우 다양한 엑손 데이타를 포함했고, 2 억 개 초과의 개체 데이타 분절을 산출했다. 군 S1-10 (양호한 임상 결과) 에 관해, 42 716 671 개 분절 (75.3%) 이 명료하게 지도화되었고, 3 828 740 개 분절 (6.7%) 이 스패닝 (spanning) 엑손 연접부였고, 엑손 연접부 중 3 791 685 개가 알려져 있었고, 37 055 개가 새로웠다. 군 S11-20 (임플란트 실패) 에 관해, 총 43 429 958 개 분절 (76.0%) 이 명료하게 지도화되었고, 3 991 606 개 분절 (7.0%) 이 스패닝 엑손 연접부였고, 엑손 연접부 중 3 958 041 개가 알려져 있었고, 33 565 개가 새로웠다. 지도화된 분절을 UCSC refSeq 데이타베이스 (2010 년 11월 7 일에 다운로드됨) 에 존재하는 각각의 엑손에 관해 Bioscope 1.3 으로 RPKM 값 ("지도화된 백만 당 킬로베이스 당 해독" 값) 을 계산하는데 사용했다. 첫번째 RPKM 조사를 고려되는 연골세포에 "전형적인" 패밀리 일원을 포함하는 유전자 패밀리, 예를 들어 콜라겐 ("연골 콜라겐" 으로서 유형 II, IX 및 XI 콜라겐을 포함) 또는 프로테오글리칸 (전형적 대표로서 아그레칸 (ACAN) 을 포함) 를 사용하여 수행했다 (도 2). 데이타가 엑손 변이성을 시사하는 표준 편차와 함께 그래프로 제시되어 있다. 또한, 도 2 에서와 같이, 발현 값은 여러 자릿수에 걸쳐 있었고, 오직 대수 스케일로 제시될 수 있었다. 결과는 고전적 "연골세포" 표현형이 결과를 지배하지 않는다는 것을 직접 보여준다. 예를 들어 IGF-관련 또는 PDGF/VEGF-관련 유전자를 포함하는, 기타 유전자 패밀리의 추가의 분석은 이러한 추정을 확인해준다. 인터루킨 사이토카인의 발현은 다양해졌다. 이들 성장 인자의 발현은 상보성 결합 단백질 또는 연관된 수용체가 사용되었을 때 더욱더 복잡해졌다. 동일하게, 메탈로프로테이나제의 확장된 클러스터의 전사는 매우 광범위하다 (도 2).
2.5 qRT-PCR 에 의한 전사체 데이타의 보정
2 가지 방법에서 데이타의 비교가능성을 추정하기 위해, 상관관계 분석을 COL1A2, COL2A1, ACAN 및 IL-1β 의 발현 데이타에 기초하여 수행했다 (도 1 참조). 이들 유전자는 10 중 7 파워의 범위 내에서 연골세포에서의 전형적 발현 값을 보여준다. 2 가지 방법으로부터의 값의 상관관계는 성공적이었고, 지수 함수에서 1.0 의 상관 계수를 산출했다 (도 3).
2.6 전사체 데이타와 임상 결과 사이의 상관관계
임상 결과와 (가상적으로) 관련되는 특이적 패턴에 관한 정보를 수득하기 위해, 2 가지 평가 방법을 선별했다. 첫번째 접근에서, 임플란트 실패를 갖는 군 (S11 내지 S20) 으로부터의 평균 값에 대한 양호한 임상 결과를 갖는 군 (S1 내지 S10) 으로부터의 각각의 전사된 유전자의 평균 RPKM 값의 발현 비율을 확인했다. 이는 수치 값 < 1 (이는 임플란트 실패와 양성 상관관계를 가짐) 에 관하여 수치 값 > 1 (이는 양호한 결과와 양성 상관관계를 가짐) 의 목록을 산출했다. 1 에 가까운 수치 값은 유전자가 결과에 관하여 중립적으로 거동하는 것을 시사한다. 결과는 도 4 에 막대그래프로서 제시되어 있다. 막대그래프는 3114 개의 가장 강하게 발현된 유전자에 관한 값을 함유한다. 1803 개의 값은 > 1 였고, 1311 개의 값은 < 1 였다. 이들 중에서, 62 개의 값은 > 2 (이는 양호한 결과를 갖는 군 S1-10 에서 2 배 더 강한 발현을 의미함) 였고, 70 개의 값은 < 0.5 (이는 임플란트 실패를 갖는 군에서 2 배 더 강한 발현을 의미함) 였다. 다시 말하면, 이들 2 가지 유전자 클러스터는 후속 연구에 관한 품질 파라미터 유전자의 제한된 목록에 대한 후보이다. 상기 목록은 조절 RNA 를 함유하지 않는다.
두번째 접근에서, 상관관계 클러스터 분석을 RPKM 수치 값으로부터 수행했다: Pearson 상관 계수를 유전자 내의 각각의 샘플 쌍 (S1-S20) 에 관해 계산했고, 통합된 열지도 함수로 상관관계 매트릭스의 소위 "열지도" 의 플롯팅을 수행했다. 이러한 상관관계 뒤의 가설은 위에 언급된 데이타에서 개요서술된 관계가 통계적으로 유의할 때 양호한 결과를 임상 실패 사례와 분리하는 20 개 임상 결과에 관한 분류된 목록을 계산이 산출한다는 것을 추정한다. 결과가 도 5 에 제시되어 있다. 도 6A 에서, 모든 그들의 엑손을 갖는 완전한 유전자에 관한 데이타가 수집되었다. 도 6B 에서, 엑손이 개별적으로 mRNA 구조에 독립적으로 분석되었다. 다시 말하면, 대안적 스플라이싱이 도 6A 에서 무시되었지만, 그것은 도 6B 에 제시되어 있다. 데이타가 그들의 기원에 상응하여 분류되었음이 명백해졌고, 군 S1-10 은 군 S11-20 과 분리된다. 예외는 샘플 S2 및 샘플 S11 이며, 샘플 S2 는 유전자에 관해 분석되었을 때 2 개의 군 사이의 전이 구역에 분류되었고, 엑손에 관해 분석되었을 때 실패 군으로 추가로 이동했고, 샘플 S11 은 "틀린" 클러스터에서 안정적으로 유지되었다. 전체적으로, 열지도는 사례 20 개 중 18 개에서, 또는 90% 의 확률로 임상 결과의 올바른 "예측" 을 산출했다.

Claims (21)

  1. 조직 재생 능력 및/또는 세포 잠재성 및/또는 임플란트술, 바람직하게는 세포 임플란트술, 및/또는 이식술의 성공 전망을 예후적으로 평가하기 위한 시험관내 방법으로서, 세포의 전사체 및/또는 유전자 발현 (상기 유전자 발현은 전사체에서 기원함) 이 분석되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 세포가 인간 및/또는 동물 기원, 바람직하게는 인간 기원을 갖는 것을 특징으로 하는 시험관내 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 세포의 재생 능력 및/또는 세포 잠재성이 평가될 세포가 환자 조직에서 기원하는 특징으로 하는 시험관내 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 세포가 임플란트술 및/또는 이식술을 이용하여 치료될 결함을 갖는 환자 조직에서 기원하는 것을 특징으로 하는 시험관내 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 지지 조직, 바람직하게는 연골 조직, 특히 바람직하게는 관절 연골 조직, 및/또는 추간판 조직에서 기원하는 것을 특징으로 하는 시험관내 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 지지 조직 세포, 바람직하게는 연골세포, 더욱 특히 관절 연골세포, 및/또는 추간판 세포인 것을 특징으로 하는 시험관내 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 건강한 세포인 것을 특징으로 하는 시험관내 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 임플란트술이 지지물-보조 자가 연골세포 임플란트술인 것을 특징으로 하는 시험관내 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 이식술이 자가 연골세포 이식술인 것을 특징으로 하는 시험관내 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 전사체 분석을 수행하기 전에, 특히 14 일 내지 30 일, 바람직하게는 17 일 내지 24 일, 특히 바람직하게는 19 일 내지 21 일의 기간에 걸쳐 세포가 배양되는 것을 특징으로 하는 시험관내 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 전사체 분석을 이용하여 수득된 전사체 프로파일 및/또는 전사체 프로파일에서 기원하는 유전자 발현 프로파일에 기초하여 예후 평가가 수행되는 것을 특징으로 하는 시험관내 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 전사체 프로파일 및/또는 유전자 발현 프로파일이 동일한 세포 유형의 전사체 프로파일 및/또는 유전자 발현 프로파일과 비교되고, 후자의 프로파일(들)이 성공한 또는 성공하지 못한 조직 재생, 세포 잠재성의 존재 또는 부재, 성공한 또는 성공하지 못한 임플란트술 및/또는 성공한 또는 성공하지 못한 이식술의 지표인 것을 특징으로 하는 시험관내 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 조직 재생, 임플란트술 및/또는 이식술이 성공적으로 진행된, 및/또는 세포 유형이 잠재성인 환자로부터의 동일한 세포 유형의 전사체 프로파일 및/또는 전사체 프로파일에서 기원하는 유전자 발현 프로파일을 평가함으로써, 성공적 조직 재생, 임플란트술 및/또는 이식술 및/또는 세포 잠재성의 존재의 지표인 전사체 프로파일 및/또는 유전자 발현 프로파일이 확인되는 것을 특징으로 하는 시험관내 방법.
  14. 제 12 항에 있어서, 조직 재생, 임플란트술 및/또는 이식술이 성공적이지 못하게 진행된, 및/또는 세포 유형이 잠재성이 아닌 환자로부터의 동일한 세포 유형의 전사체 프로파일 및/또는 전사체 프로파일에서 기원하는 유전자 발현 프로파일을 평가함으로써, 성공하지 못한 조직 재생, 임플란트술 및/또는 이식술 및/또는 세포 잠재성의 부재의 지표인 전사체 프로파일 및/또는 유전자 발현 프로파일이 확인되는 것을 특징으로 하는 시험관내 방법.
  15. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 지표적 전사체 프로파일 및/또는 유전자 발현 프로파일이 후향 임상 환자 연구의 일부로서, 특히, 검색 알고리즘, 바람직하게는 컴퓨터-기반 검색 알고리즘을 이용하여 확인되는 것을 특징으로 하는 시험관내 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 전사체 분석이 리보솜 RNA 의 제거를 포함하는 것을 특징으로 하는 시험관내 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 전사체 분석이 단지 코딩 RNA, 바람직하게는 mRNA, 및/또는 조절 RNA 에 기초하여 수행되는 것을 특징으로 하는 시험관내 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 전사체 분석이 RNA, 바람직하게는 mRNA 의 조각화를 포함하는 것을 특징으로 하는 시험관내 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 전사체 분석이 RNA 의 이중 나선 상보성 DNA 로의 전사 및, 특히, 바람직하게는 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하는, 상보성 DNA 의 증폭을 포함하는 것을 특징으로 하는 시험관내 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 전사체 분석이 하이브리드화-기반 마이크로어레이 방법 또는 서열-기반 방법, 바람직하게는, 특히 파이로시퀀싱, 합성에 의한 서열분석 및 결찰에 의한 서열분석을 포함하는 군으로부터 선택되는, 2세대 서열분석 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 시험관내 방법.
  21. 조직 재생 능력 및/또는 세포 잠재성 및/또는 임플란트술, 더욱 특히 세포 임플란트술, 및/또는 이식술의 성공 전망을 예후적으로 평가하기 위한, 전사체 분석, 더욱 특히 전사체 프로파일 및/또는 전사체에서 기원하는 유전자 발현 프로파일의 용도.
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