KR20150139292A - 레반 나노입자의 제조 및 이의 생의학적 응용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유방암 표적용 레반 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 레반 나노입자 및 소수성 물질이 담지된 나노입자 복합체는 글루코즈 트랜스 포터 5와 강하게 결합하여 유방암을 효과적으로 표적하는데 유용하며, 질병을 진단하는 진단용 조성물, 진단용 조영제 및 약물을 담지하는 약물전달체로서 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 유방암을 표적할 수 있어 유방암 특이적으로 사용될 수 있다. 또한 레반 나노입자 내에 여러 소수성 물질을 자가-형성(self-assembly)에 의해 간단하게 담지시킬 수 있어 질병의 진단뿐만 아니라 여러 의학적인 분야에서도 유용하게 사용될 수 있다.

Description

레반 나노입자의 제조 및 이의 생의학적 응용{Method for preparing levan nano particles, and biomedical application}
본 발명은 레반 나노입자의 제조 및 이의 생의학적 응용에 관한 것으로, 보다 상세하게는 레반 나노입자 복합체의 제조방법과 이를 포함하는 유방암 진단용 조성물, 진단용 조영제 및 약물전달체에 관한 것이다.
암을 조기에 진단, 치료하기 위해서는 암세포만을 효과적으로 표적하는 것이 중요하며, 최근 나노입자를 통한 암세포의 진단과 치료에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 나노입자가 암세포를 표적하는 방법에는 수동적 타겟팅(passive targeting)과 능동적 타겟팅(active targeting)이 있다. 수동적 타겟팅은 암세포와 조직이 다른 정상 조직보다 혈관이 넓다는 것을 이용하여 나노입자의 사이즈를 조절하여 암세포에만 약물 등을 전달할 수 있게 하는 것이며, 능동적 타겟팅은 암세포에만 특이적으로 발현하는 단백질 등을 인식하는 당쇄, 압타머, 항체 등을 나노입자에 도입하여 암세포만을 진단하고 치료할 수 있는 방법이다. 이에 여러 당쇄 등이 암세포를 표적하는데 이용되고 있다.
레반(levan)은 β2→6 결합한 프럭토오스로 이루어진 다당으로 과당중합체의 일종으로 2,1 부위에 많은 관능기를 가지고 있기 때문에 여러 가지 기능을 부여 할 수 있으며 식품, 사료, 화장품, 의약품의 원료로써 사용 될 수 있는 많은 가능성을 가지는 생체 고분자이다. 레반은 미생물에 의해 천연적으로 생산되는 생체 고분자로써 많은 분야에 응용가능성을 가지고 있다.
레반은 생체적합성이 좋고 다양한 생리적 효능을 가지고 있는 것으로 알려져 있으나, 분자량 조절이나 대량 생산의 어려움 때문에 다른 다당 폴리머인 덱스트란 젤라틴이 생의학적으로 많이 이용되는 것에 비해 응용에 제한이 있었다. 현재까지 프럭토오스(Fructose) 단당체에 이미징 프로브를 결합하여 유방암을 진단한 선행 연구가 보고 되어있지만(Bioconjugate Chem. 2007, 18,628-634), 레반을 이용한 유방암 타겟팅 치료에 관한 연구는 진행 되고 있지 않다.
기존의 항암제를 이용한 화학요법의 가장 큰 문제점은 항암제가 암세포뿐만 아니라 정상 세포까지 죽게 만들어 인체에 심각한 손상을 준다는 것이었다. 그러나 나노입자들은 수십 내지 수백 나노의 크기로 매우 작기 때문에 인체 내로 주입될 수 있고 세포의 인식 및 흡수가 용이하며, 인체 내의 혈관을 따라 이동하다가 EPR(enhanced permeation and retention)이라 불리는 현상에 의해 암세포 주위로 생성된 부실한 혈관 구멍을 통하여 비교적 선택적으로 암세포 주변에 오래 머무르면서 내부에 봉입된 항암제를 서서히 방출시킴으로써 주위에 분포하는 정상 세포의 파괴를 막으면서도 암세포만 골라 사멸시키는 효과를 나타낼 수 있다고 알려져 있다. 하지만 EPR 효과를 이용하는 수동적인 암 세포 타겟팅 방법만으로는 보다 정확하게 암세포만 표적하는 데에는 한계가 있으며, 암세포를 집중 표적할 수 있는 항체, 압타머, 당쇄 등의 표적 물질을 포함한 능동적 타겟팅을 위한 나노입자 소재의 개발이 요구되고 있다.
또한 현재 소수성의 성질을 가진 많은 약물과 조영제의 가용화 및 안정화를 위해 여러 연구가 진행되고 있으나, 선행 연구 등은 방법이 복잡하고 여러 단계를 거쳐야 하는 단점이 있으므로 보다 간단한 방법이 요구되고 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은 암을 타겟팅하기 위한 나노입자 및 이를 이용한 새로운 진단용 조영제와 약물전달체를 제조하기 위하여 연구, 노력한 결과, 레반 나노입자 및 소수성 물질이 담지된 레반 나노입자 복합체를 자가-형성(self-assembly)에 의한 간단한 방법으로 제조하였으며, 상기 레반 나노입자 및 나노입자 복합체가 유방암을 효과적으로 표적하며, 질병을 진단하는 진단용 조성물, 진단용 조영제 및 약물을 담지하는 약물전달체로서 기능함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 유방암 표적용 레반 나노입자, 레반 나노입자 복합체 및 그의 제조방법을 제공함을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 레반 나노입자 또는 레반 나노입자 복합체를 포함하는 유방암 진단용 조성물, 진단용 조영제 및 약물전달체를 제공함을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 유방암 표적용 레반 나노입자, 레반 나노입자 복합체 및 그의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 레반 나노입자 또는 레반 나노입자 복합체를 포함하는 유방암 진단용 조성물, 진단용 조영제 및 약물전달체를 제공한다.
본 발명에 따른 레반 나노입자 및 소수성 물질이 담지된 레반 나노입자 복합체는 글루코즈 트랜스 포터 5와 강하게 결합하여 유방암을 효과적으로 표적하는데 유용하며, 질병을 진단하는 진단용 조성물, 진단용 조영제 및 약물을 담지하는 약물전달체로서 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 유방암을 표적할 수 있어 유방암 특이적으로 사용될 수 있다. 또한 레반 나노입자 내에 여러 소수성 물질을 자가-형성(self-assembly)에 의해 간단하게 담지시킬 수 있어, 질병의 진단뿐만 아니라 여러 의학적인 분야에서도 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 인도시아닌 그린-레반 나노입자 복합체의 제조방법을 모식도로 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 양자점 나노입자-레반 나노입자 복합체의 제조방법을 모식도로 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 마그네타이트 나노입자-레반 나노입자 복합체의 제조방법을 모식도로 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 파크리탁셀을 포함하는 인도시아닌 그린-레반 나노입자 복합체의 제조방법을 모식도로 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명에 따른 인도시아닌 그린-레반 나노입자 복합체의 크기 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명에 따른 인도시아닌 그린-레반 나노입자 복합체의 흡광도를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명에 따른 양자점 나노입자-레반 나노입자 복합체의 TEM 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명에 따른 양자점 나노입자-레반 나노입자 복합체의 크기 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명에 따른 마그네타이트 나노입자-레반 나노입자 복합체의 TEM 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명에 따른 마그네타이트 나노입자-레반 나노입자 복합체의 크기 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명에 따른 파크리탁셀을 포함하는 인도시아닌 그린-레반 나노입자 복합체의 크기 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 레반과 GLUT5의 결합도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명에 따른 인도시아닌 그린-레반 나노입자 복합체를 세포주에 처리한 후 이미징한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 GLUT5 억제제가 본 발명에 따른 인도시아닌 그린-레반 나노입자 복합체의 흡수에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명에 따른 인도시아닌 그린-레반 나노입자 복합체를 이용하여 동물모델에서 유방암을 이미징한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 본 발명에 따른 인도시아닌 그린-레반 나노입자 복합체를 이용하여 각 장기에 분포된 형광 시그널을 이미징한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 유방암 표적용 레반(levan) 나노입자를 제공한다.
또한, 본 발명은 소수성 물질이 담지된 유방암 표적용 레반 나노입자 복합체를 제공한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
레반(Levan)은 식물체 및 일부 미생물에서 발견되는 바이오폴리머로 수천에서 수십만 개의 과당이 연결된 과당중합체(fructan)로서, 양친매성 당고분자로 수용액 상태에서 나노입자를 형성하고, 유방암에 과발현하는 글루코오즈 트랜스포터 5(GLUT; glucose transporter5)와 강하게 결합하는 것을 특징으로 하며, 본 발명의 레반 나노입자 및 나노입자 복합체는 상기 특성으로 인해 유방암을 표적한다.
상기 레반 나노입자의 글루코오즈 트랜스포터 5와의 결합력은 프럭토오스보다 강하므로 프럭토오스보다 더욱 높은 효율로 유방암을 표적 할 수 있다.
본 발명에서는 수만~수천만 KDa의 분자량을 가지는 레반을 사용할 수 있으며, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 레반 나노입자 복합체는 레반 나노입자와 소수성 물질이 결합한 것으로, 상기 소수성 물질은 소수성 조영제 및/또는 소수성 약물일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 소수성 조영제는 인도시아닌 그린(indocyanine green), 근적외선 형광 조영제, 양자점(Quantum Dot) 나노입자, 자성 나노입자, MRI용 조영제, 초음파 조영제 또는 방사선 조영제가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 인도시아닌 그린(indocyanine green)이나 이에 한정하지 않는다. 상기 조영제는 암을 이미징할 수 있는 물질로서, 낮은 안정성 등으로 오랜 시간 암을 추적하고 진단하는 데에는 어려움이 있으나 레반 나노입자와 결합하여 상기 문제점이 해결 가능하다.
상기 소수성 약물은 파클리탁셀(paclitaxel), 메소트렉세이트(methotrexate), 독소루비신(doxorubicin), 5-플로로우라실(5-fluorouracil), 마이토마이신-C(mitomycin-C), 스티렌 말레산 네오카르지노스타틴(Styrene maleic acid neocarzinostatin (SMANCS)), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 카뮤스틴(carmustine (BCNU)), 다카바진(dacabazine), 에토포사이드(etoposide) 또는 다우노마이신(daunomycin)이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 레반 및 소수성 물질은 자가-형성(self-assembly)에 의해 결합하며, 특별한 조작을 필요로 하지 않고, 레반 나노입자 내에 여러 소수성 물질을 간단하게 담지시킬 수 있어 질병의 진단뿐만 아니라 여러 의학적인 분야에서 유용하게 사용될 수 있다. 레반 나노입자에 담지된 소수성 물질은 레반 나노입자 내에 내포(inclusion)되어 있는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은
(a) 레반을 용매에 용해시키는 단계;
(b) 소수성 물질을 용매에 용해시키는 단계; 및
(c) 상기 (a) 단계 및 (b) 단계에서 제조된 각각의 용액을 혼합하여 정제하는 단계;를 포함하는 소수성 물질이 담지된 유방암 표적용 레반 나노입자 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 레반 나노입자 복합체의 제조과정을 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.
상기 (a) 단계 및 (b) 단계는 레반 및 소수성 물질을 용매에 용해시켜 각각의 용액을 제조하는 단계이다.
상기 (b) 단계의 소수성 물질은 소수성 조영제 및/또는 소수성 약물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 소수성 조영제는 인도시아닌 그린(indocyanine green), 근적외선 형광 조영제, 양자점(Quantum Dot) 나노입자, 자성 나노입자, MRI용 조영제, 초음파 조영제 또는 방사선 조영제가 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 소수성 약물은 파클리탁셀(paclitaxel), 메소트렉세이트(methotrexate), 독소루비신(doxorubicin), 5-플로로우라실(5-fluorouracil), 마이토마이신-C(mitomycin-C), 스티렌 말레산 네오카르지노스타틴(Styrene maleic acid neocarzinostatin (SMANCS)), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 카뮤스틴(carmustine (BCNU)), 다카바진(dacabazine), 에토포사이드(etoposide) 또는 다우노마이신(daunomycin)이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 (c) 단계는 (a) 단계 및 (b) 단계에서 제조된 각각의 용액을 반응시키는 단계로, 상기 반응 용액을 20~40℃에서 10~30시간 동안 교반한 후 정제하여 소수성 물질이 담지된 레반 나노입자 복합체를 수득한다.
상기 용매는 증류수, PBS(phosphate buffer saline), 알코올, 헥산, 톨루엔 또는 DMSO(dimethyl sulfoxide)일 수 있으며, 이에 한정하지 않고 소수성 물질을 용해시킬 수 있는 용매가 모두 해당된다.
상기 소수성 물질이 양자점 나노입자 또는 자성 나노입자인 경우,
(d) 제조된 용액의 용매를 증발시키는 단계; 및
(d) 소량의 용매를 추가로 첨가하여 시료를 분산시키는 단계;를 더 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 레반 나노입자 또는 레반 나노입자 복합체를 포함하는 유방암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유방암 진단용 조성물을 포함하는 유방암 진단용 조영제를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 레반 나노입자 또는 레반 나노입자 복합체를 포함하는 약물전달체를 제공한다.
본 발명에 따른 약물전달체는 유방암을 타겟팅할 수 있어 유방암 특이적 약물전달체로서 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 레반 나노입자 및 인도시아닌 그린이 담지된 레반 나노입자 복합체의 제조
0.5% 레반(Realbiotech)을 3차 증류수에 용해시켜 레반 나노입자 수용액을 제조하였다. 그 후 4 mg의 인도시아닌 그린 (sigma-aldrich) (1 mg/ml)을 3차 증류수에 용해시켜 먼저 용해시킨 레반 나노입자 수용액에 넣고 24시간동안 교반기를 통해 상온에서 교반시켰다. 교반 후 원심 분리기를 통해 13500 rpm에서 원심분리를 하여 미반응물을 제거하여 인도시아닌 그린이 담지된 레반 나노입자 복합체를 제조하였다. 침전물은 다시 3차 증류수에 분산시키고 냉장 보관하였다. 상기 인도시아닌 그린이 담지된 인도시아닌 그린-레반 나노입자 복합체의 제조방법을 도 1에 모식도로 나타내었다.
실시예 2. 양자점 나노입자가 담지된 레반 나노입자 복합체의 제조
양자점 나노입자를 레반에 담지시킨 양자점 나노입자-레반 나노입자 복합체의 제조방법을 도 2에 모식도로 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 저분자량 레반(Realbiotech) 50 mg을 5 ml 증류수에 용해시킨 후 5 mg/mL QD(양자점 나노입자)(Evidot 20 mg/mL in toluene Fort orange)(즉, 250 uL QD)를 첨가하였다. 소니케이터(Sonicator)를 이용하여 약 15분정도 혼합시켜준 후 증발기(evaporator)를 사용하여 용매를 증발시켰다. 여기에 증류수 1 ml를 첨가하여 시료를 분산시켜 양자점 나노입자가 담지된 레반 나노입자 복합체를 수득하였다.
실시예 3. 자성 나노입자가 담지된 레반 나노입자 복합체의 제조
자성 나노입자인 마그네타이트 나노입자를 레반에 결합시킨 마그네타이트 나노입자-레반 나노입자 복합체의 제조방법을 도 3에 모식도로 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 저분자량 레반(Realbiotech) 0.25%를 증류수에 용해시킨 후 자성 나노입자인 마그네타이트 나노입자(in hexane)를 첨가하였다. 소니케이터(Sonicator)를 이용하여 약 15분정도 혼합시켜준 후 증발기(evaporator)를 사용하여 용매를 증발시켰다. 여기에 증류수 1 ml를 첨가하여 시료를 분산시켜 자성 나노입자가 담지된 레반 나노입자 복합체를 수득하였다.
실시예 4. 약물(Taxol)이 포함된 인도시아닌 그린-레반 나노입자 복합체의 제조
소수성 약물인 파크리탁셀 및 인도시아닌 그린을 레반에 담지시킨 나노입자 복합체의 제조방법을 도 4에 모식도로 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 0.5% 레반(저분자량, Realbiotech)을 3차 증류수에 용해시켰다. 4 mg의 인도시아닌 그린(sigma-aldrich)(1 mg/ml)을 3차 증류수에 용해시켰으며, 5 mg의 파크리탁셀(paclitaxel)을 메탄올에 용해시키고 초음파를 가해준 후 24시간 동안 자석 교반기로 교반시켰다. 그 후 원심 분리기를 통해 13500 rpm에서 원심분리를 하여 미반응물을 제거하였다. 침전물은 다시 3차 증류수에 분산시키고 냉장 보관하였다.
실험예 1. 레반 나노입자 복합체의 특성 분석
1-1. 레반 나노입자 및 인도시아닌 그린-레반 나노입자 복합체의 특성
상기 실시예 1에서 제조한 레반 나노입자 및 레반 나노입자 복합체의 크기를 DLS(dyunamic light scattering, Otsuka, 일본)로 측정하였으며, 이를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 0.5% 레반 나노입자의 크기는 약 50 nm였고(도 5의 왼쪽), 인도시아닌 그린이 결합한 레반 나노입자 복합체의 크기는 평균 130 nm임을 확인하였다(도 5의 오른쪽).
또한, 인도시아닌 그린과 레반의 결합 여부를 UV 스펙트럼으로 확인하였으며, 이를 도 6a에 나타내었다.
도 6a에 나타낸 바와 같이, 인도시아닌 그린이 결합한 레반 나노입자 복합체의 흡광도가 780 nm에서 나타나는 것을 확인하였으며, 이를 통해 인도시아닌 그린이 잘 결합하였음을 확인하였다.
또한, 나노입자를 TX-100 용액에 희석한 후 흡광도를 측정하고 증류수에 희석하여 측정한 결과와 비교하였으며, 이를 도 6b에 나타내었다.
도 6b에 나타낸 바와 같이, 나노입자를 TX-100 용액에 희석한 경우 흡광도가 약간 장파장으로 이동(레드 시프트)하였고 증류수에 희석한 경우에 비해 약 6배 높게 나타남을 확인하였다. 이는 소수성 결합으로 담지된 나노입자가 계면 활성제에 의해 풀린 것으로, 레반과 인도시아닌 그린이 소수성-소수성 상호작용으로 결합하였음을 나타낸다.
1-2. 양자점 나노입자-레반 나노입자 복합체의 특성
상기 실시예 2에서 제조한 레반 나노입자 복합체의 모양 및 크기를 TEM(transmission electron microscope) 및 DLS(dyunamic light scattering)로 측정하였으며, 그 결과를 도 7 및 도 8에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이 레반이 QD을 잘 둘러싸고 있는 것을 확인하였으며, 도 8에 나타낸 바와 같이, 양자점 나노입자-레반 나노입자 복합체의 크기는 평균 193 nm임을 확인하였다.
1-3. 자성 나노입자-레반 나노입자 복합체의 특성
상기 실시예 3에서 제조한 레반 나노입자 복합체의 모양 및 크기를 TEM(transmission electron microscope) 및 DLS(dyunamic light scattering)로 측정하였으며, 그 결과를 도 9 및 도 10에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이 레반이 마그네타이트를 잘 둘러싸고 있는 것을 확인하였으며, 도 10에 나타낸 바와 같이, 마그네타이트 나노입자-레반 나노입자 복합체의 크기는 평균 95 nm임을 확인하였다.
1-4. 파크리탁셀 및 인도시아닌 그린이 담지된 레반 나노입자 복합체의 특성
상기 실시예 4에서 제조한 레반 나노입자 복합체의 크기를 DLS를 통해 측정하였으며, 이를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 상기 레반 나노입자 복합체의 크기는 평균 178 nm임을 확인하였다.
실험예 2. 레반 및 글루코오스 트랜스포터 5의 결합 확인
레반 및 글루코오스 트랜스포터 5(GLUT5; glucose transporter 5)의 결합을 확인하기 위하여 96웰의 ELISA plate에 1% 레반을 코팅하였다. 대조군으로 BSA(bovine serum albumin)와 프럭토오스(fructose)도 코팅하였다. 비특이적인 결합을 막기 위하여 레반 및 프럭토오스를 코팅한 웰에 BSA로 블록킹(blocking)하였다. 0.5μg의 재조합 GLUT5 단백질을 100 μl의 표본 완충액에 녹인 후 2시간 동안 각 웰에서 37℃로 반응시켰다. 이를 비오틴(biotin)이 담지된 항 GLUT5 항체로 1시간 반응시킨 후 세척 완충액으로 헹구고 avidin-HRP로 1시간 반응 후 TMB 처리하고 종결액(stop solution)으로 반응을 멈추었다. 이의 흡광도를 450 nm에서 측정하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 레반에서의 흡광도가 프럭토오스 및 BSA보다 높은것을 확인하였다. 이는 재조합 GLUT5 단백질과 레반이 가장 강하게 결합함을 나타낸다.
실험예 3. 레반 나노입자 복합체의 유방암 이미징 확인
MDAMB231(인간 유방암 세포주), KB (인간 비인두암세포주) 또는 A549(인간 폐암 세포주) 세포를 10% 혈청을 포함하는 RPMI 배지(페니실린(100 units/mL) 및 스트렙토마이신(100 ㎍/mL) 포함)에서 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. HeLa(인간 자궁암 세포주), SKOV3(인간 난소암세포주) 또는 NIH3T3(마우스 섬유아세포)는 10% 혈청을 포함하는 DMEM(항생제 첨가) 배지에서 상기와 동일한 배양 조건으로 배양하였다. 인도시아닌 그린 이미징을 위하여, 각각의 세포들을 8웰 챔버 슬라이드에 배양하고(1×104/well), 인도시아닌 그린-레반 나노입자 복합체 100 μg을 1시간 동안 처리한 후 PBS로 헹구었다. 그 후 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 세포를 고정하고 컨포칼 현미경을 이용하여 관찰하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, GLUT5 과발현 MDAMB231(인간 유방암 세포주)에서 나노입자의 흡수(uptake)가 가장 강하였고 다른 세포에서는 인도시아닌 그린 시그널이 거의 보이지 않았다.
또한 인도시아닌 그린-레반 나노입자 복합체가 유방암 세포의 GLUT5를 통해 흡수되는 것을 증명하기 위하여, 상기 세포에 GLUT5 억제제(inhibitor)로서 염화수은(mercuric chloride)을 처리하였으며, 그 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타낸 바와 같이, GLUT5 억제제에 의해 인도시아닌 그린-레반 나노입자 복합체의 흡수가 줄어들어 인도시아닌 그린의 형광이 거의 보이지 않는 것을 확인하였다. 이는 레반 나노입자 복합체가 GLUT5와의 결합을 통해 유방암 세포로 들어 간다는 것을 나타낸다.
실험예 4. 레반 나노입자 복합체를 이용한 동물모델에서의 형광 이미징 측정
모든 동물실험은 KRIBB(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)의 동물보호위원회(Animal Care Committees)에 의해 승인된 실험 과정으로 수행하였다. 제노그라프트 종양 모델은 MDAMB-231(인간 유방암 세포주) 세포를 누드마우스(BALB/c mice (female, 5-6주령) 중앙실험동물, 한국)의 피하에 주사하여 유도하였다. 종양 크기가 500 m3이 되었을 때 상기 실시예 1에서 제조한 인도시아닌 그린-레반 나노입자 복합체 2 mg을 꼬리 정맥주사로 투여하였다. 일정 시간 후, IVIS Lumina imaging system(Xenogen, 미국)을 이용하여, 생체 내 인도시아닌 그린 이미징을 확인하였으며, 이를 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 24시간 후 인도시아닌 그린-레반 나노입자 복합체를 투여한 마우스에서는 암부분에서 형광 시그널이 나타나는 것을 확인하였다. 그러나 대조군인 인도시아닌 그린만 투여한 마우스에서는 암부분의 형광은 보이지 않고 간 부분에서 시그널이 관찰되었다. 48시간 후에는 인도시아닌 그린-레반 나노입자 복합체 투여군에서는 정확히 암 부분에서 형광 시그널이 모여지는 것이 관찰되었지만 인도시아닌 그린 투여군은 인도시아닌 그린이 배출되어 시그널이 보이지 않는 것을 확인하였다.
또한, 나노입자의 생체 내에서의 분산을 확인하기 위해서 투여 48시간 후에 마우스를 해부하여 형광 시그널을 관찰하였으며, 이를 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 인도시아닌 그린-레반 나노입자 복합체 투여군의 암부분과 간에서 형광 시그널을 확인하였다. 이는 인도시아닌 그린-레반 나노입자 복합체가 유방암을 이미징 하는데 효과적이라는 것을 나타낸다.

Claims (17)

  1. 유방암 표적용 레반(levan) 나노입자.
  2. 소수성 물질이 담지된 유방암 표적용 레반 나노입자 복합체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 소수성 물질은 소수성 조영제 및 소수성 약물로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 레반 나노입자 복합체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 소수성 조영제는 인도시아닌 그린(indocyanine green), 근적외선 형광 조영제, 양자점(Quantum Dot) 나노입자, 자성 나노입자, MRI용 조영제, 초음파 조영제 및 방사선 조영제로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 레반 나노입자 복합체.
  5. 제3항에 있어서, 상기 소수성 약물은 파클리탁셀(paclitaxel), 메소트렉세이트(methotrexate), 독소루비신(doxorubicin), 5-플로로우라실(5-fluorouracil), 마이토마이신-C(mitomycin-C), 스티렌 말레산 네오카르지노스타틴(Styrene maleic acid neocarzinostatin (SMANCS)), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 카뮤스틴(carmustine (BCNU)), 다카바진(dacabazine), 에토포사이드(etoposide) 및 다우노마이신(daunomycin)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 레반 나노입자 복합체.
  6. 제3항에 있어서, 상기 소수성 물질과 레반 나노입자는 자가-형성(self-assembly)에 의해 담지된 것을 특징으로 하는, 레반 나노입자 복합체.
  7. 제3항에 있어서, 상기 소수성 물질은 레반 나노입자 내에 내포(inclusion)되어 있는 것을 특징으로 하는, 레반 나노입자 복합체.
  8. (a) 레반을 용매에 용해시키는 단계;
    (b) 소수성 물질을 용매에 용해시키는 단계; 및
    (c) 상기 (a) 단계 및 (b) 단계에서 제조된 각각의 용액을 혼합하여 정제하는 단계;를 포함하는 소수성 물질이 담지된 유방암 표적용 레반 나노입자 복합체의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 소수성 물질은 소수성 조영제 및 소수성 약물로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 레반 나노입자 복합체의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 소수성 조영제는 인도시아닌 그린(indocyanine green), 근적외선 형광 조영제, 양자점(Quantum Dot) 나노입자, 자성 나노입자, MRI용 조영제, 초음파 조영제 및 방사선 조영제로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 레반 나노입자 복합체의 제조방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 소수성 약물은 파클리탁셀(paclitaxel), 메소트렉세이트(methotrexate), 독소루비신(doxorubicin), 5-플로로우라실(5-fluorouracil), 마이토마이신-C(mitomycin-C), 스티렌 말레산 네오카르지노스타틴(Styrene maleic acid neocarzinostatin (SMANCS)), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 카뮤스틴(carmustine (BCNU)), 다카바진(dacabazine), 에토포사이드(etoposide) 및 다우노마이신(daunomycin)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 레반 나노입자 복합체의 제조방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 용매는 증류수, PBS(phosphate buffer saline), 알코올, 헥산, 톨루엔 및 DMSO(dimethyl sulfoxide)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 레반 나노입자 복합체의 제조방법.
  13. 제8항에 있어서, 상기 교반은 20~40℃에서 10~30시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 레반 나노입자 복합체의 제조방법.
  14. 제1항의 나노입자 또는 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항의 나노입자 복합체를 포함하는 유방암 진단용 조성물.
  15. 제14항의 조성물을 포함하는 유방암 진단용 조영제.
  16. 제1항의 나노입자 또는 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항의 나노입자 복합체를 포함하는 약물 전달체.
  17. 제16항에 있어서, 상기 약물전달체는 유방암에 특이적인 것을 특징으로 하는 약물전달체.
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