KR20150134443A - N-트리메틸 키토산으로 표면 개질된 지용성 약물 함유 고체 지질 나노입자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 N-트리메틸 키토산으로 코팅된 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자의 제조방법; 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자로서, 상기 고체 지질 나노입자는 팔미트산(palmitic acid), 콜레스테롤(cholesterol) 및 TPGS을 포함하며, 상기 고체 지질 나노입자 표면이 N-트리메틸 키토산으로 코팅된 것인 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자; 및 상기 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자를 유효성분으로 포함하는 경구투여용 커큐민 제제에 관한 것이다.
본 발명의 N-트리메틸 키토산으로 코팅한 커큐민을 적재한 고체 지질 나노입자는 상기 코팅으로 인해 산성의 위장 환경에서도 안정하여 경구투여하여도 장관에서 커큐민의 지속적 방출을 가능하게 하므로 높은 커큐민 혈중농도를 유지할 수 있다. 또한, 상기 N-트리메틸 키토산으로 코팅한 커큐민을 적재한 고체 지질 나노입자는 혈관뇌장벽을 투과하여 뇌조직으로의 약물전달이 가능하므로 암질환 뿐만 아니라 알츠하이머 또는 뇌 신경교종 등의 뇌질환의 치료를 위한 경구투여용 제제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

N-트리메틸 키토산으로 표면 개질된 지용성 약물 함유 고체 지질 나노입자{A lipophilic drug-loaded solid lipid nanoparticle surface-modified with N-trimethyl chitosan}
본 발명은 N-트리메틸 키토산으로 코팅된 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자의 제조방법; 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자로서, 상기 고체 지질 나노입자는 팔미트산(palmitic acid), 콜레스테롤(cholesterol) 및 TPGS을 포함하며, 상기 고체 지질 나노입자 표면이 N-트리메틸 키토산으로 코팅된 것인 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자; 및 상기 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자를 유효성분으로 포함하는 경구투여용 커큐민 제제에 관한 것이다.
커큐민(curcumin; C)은 강황 또는 울금(curcuma longa)으로부터 추출한 친유성 폴리페놀 화합물(lipophilic polyphenolic compound)로서, 항-아밀로이드(anti-amyloid), 항산화, 항-말라리아(anti-malarial), 항염증, 항-HIV 및 항암활성을 포함한 광범위한 생물학적 및 약리학적(pharmacological) 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 또한, 커큐민은 폐, 유방, 두경부(head-neck), 골, 전립선 및 위장과 같은 다양한 암세포에 대한 효과를 나타내는 다치료성(multitherapeutic) 및 화학요법제로 잘 알려져 있다. 이와 같은 우수한 치료효과에도 불구하고, 커큐민의 임상적 사용은 낮은 수용성, 중성 및 알칼리성 pH에서의 불안정성, 광범위한 대사(extensive metabolism) 및 빠른 배출(elimination)로 인한 낮은(poor) 경구적 생체이용률과 같은 약동학적 장애에 의해 제한되고 있다.
지난 수십 년에 걸쳐, 친유성 약물의 경구적 생체이용률을 향상시킬 수 있는 신규한 약물 전달 시스템을 고안하기 위한 노력이 진행되고 있다. 고체 지질 나노입자(solid lipid nanoparticles; SLNs)는 가장 널리 사용되는 약물 전달 시스템 중 하나이며, 경구 투여되는 친유성 약물의 지속적 전달(sustained delivery)을 위한 잠재력을 갖는 것으로 보고되고 있다. 이들의 비독성 및 높은 적하능력(payload capacity)과 더불어, 나노전달체 시스템으로서 SLNs은 용해도(solubility), 생체이용률(bioavailability), 전달하는 약물의 안정성을 향상시킬 수 있다. 그러나, 위장관(gastrointestinal tract)에서 약물-적재된 SLNs의 가변적인 방출 패턴은 친유성 약물의 경구 투여의 광범위한 적용에 대한 주된 장애물이다. 약물이 적재된 SLNs는 위강(stomach lumen)의 산성 환경(pH 1-3)에서 폭발적 방출(burst release)을 나타내며, 장 환경(pH 6.8-7.4)에서는 지속성 방출을 나타낸다. 따라서, 산성 환경에서도 안정하여 약물의 폭발적 방출을 나타내지 않는 제제에 대한 추가적인 연구가 여전히 필요한 실정이다.
키토산(chitosan)은 탈아세틸화된 키틴(deacetylated chitin)으로부터 유래된 양이온성 천연 다당류로서, 생체적합성, 생분해성(biodegradability), 점액부착성(mucoadhesivity), 낮은 독성 및 항미생물활성(antimicrobial activity)과 같은 생물학적 응용을 위한 우수한 성질을 나타낸다. 키토산은 산성 pH 조건에서 가용성이며, 이의 양성자화된 형태는 산성환경에서 흡수증강제(absorption enhancer)로서 활성을 나타낸다. 키토산은 약한 염기성이며, 글루코사민 단위(glucosamine units)를 수가용성 양전하형태(water soluble positive charged form)로 전환하기 위하여 충분한 양의 산을 필요로 한다. 잠재적인 경구 약물 전달 적용을 위한 키토산의 사용은 중성 및 알칼리성 환경에서 낮은 수가용성 및 생리학적 pH의 용액에서 응집하고 양전하를 잃는 키토산 분자의 경향으로 인해 제한된다. 최근 광범위한 키토산 기반 생물물질이 키토산의 화학적 개질을 기반으로 신규한 약물전달시스템에서 개발되어 사용되고 있다. 고분자 골격에 트리메틸기 모이어티를 도입하는 키토산의 메틸화는 수가용성을 현저히 향상시켰다. 4차화된 키토산 유도체인 N-트리메틸 키토산(TMC)은 점막부착성 및 중성 pH에서 흡수향상성(absorption enhancing properties)과 더불어 넓은 pH 범위에 걸쳐 우수한 수가용성을 나타낸다.
이에, 본 발명자들은 지용성 약물에 대해 높은 적재능을 갖되 산성 조건에서도 안정하여 적재된 약물의 폭발적 방출이 나타나지 않는 경구투여용 약물전달체를 발굴하고자 예의 연구노력한 결과, 지용성 약물을 적재한 팔미트산, 콜레스테롤 및 D-α-토코페릴 폴리에틸렌글리콜 1000 숙시네이트(D-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate; TPGS)를 포함하는 나노입자의 표면을 키토산 분자를 메틸화시켜 수득한 TMC로 개질한 경우 산성 조건에서도 적재된 약물의 폭발적 방출 없는 지용성 약물 전달체를 제공할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 N-트리메틸 키토산으로 코팅된 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자의 제조방법에 있어서, 용융상태의 커큐민, 팔미트산 및 콜레스테롤의 지질상 혼합물을 준비하는 제1단계; D-α-토코페릴 폴리에틸렌글리콜 1000 숙시네이트(D-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate; TPGS) 수용액을 준비하는 제2단계; 제2단계의 TPGS 수용액을 제1단계의 지질상 혼합물에 첨가하여 균질화하는 제3단계; 제3단계의 생성물을 초음파 처리하여 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자를 형성하는 제4단계; 및 상기 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자에 N-트리메틸 키토산을 첨가하고 교반하여 N-트리메틸 키토산으로 코팅하는 제5단계를 포함하는, N-트리메틸 키토산으로 코팅된 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자로서, 상기 고체 지질 나노입자는 팔미트산(palmitic acid), 콜레스테롤(cholesterol) 및 TPGS을 포함하며, 상기 고체 지질 나노입자 표면이 N-트리메틸 키토산으로 코팅된 것인 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자를 유효성분으로 포함하는 경구투여용 커큐민 제제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 N-트리메틸 키토산으로 코팅된 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자의 제조방법에 있어서, 용융상태의 커큐민, 팔미트산 및 콜레스테롤의 지질상 혼합물을 준비하는 제1단계; D-α-토코페릴 폴리에틸렌글리콜 1000 숙시네이트(D-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate; TPGS) 수용액을 준비하는 제2단계; 제2단계의 TPGS 수용액을 제1단계의 지질상 혼합물에 첨가하여 균질화하는 제3단계; 제3단계의 생성물을 초음파 처리하여 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자를 형성하는 제4단계; 및 상기 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자에 N-트리메틸 키토산을 첨가하고 교반하여 N-트리메틸 키토산으로 코팅하는 제5단계를 포함하는, N-트리메틸 키토산으로 코팅된 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 유제(emulsion) 및 리포좀(liposome)과 같은 종래 약물 전달체에서 나타나는 약물누출, 가수분해, 입자의 성장 및 장기간 저장에 대한 불안정성과 같은 단점을 극복할 수 있는 약물 전달체로서의 고체 지질 나노입자에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 새로운 약물 전달체로 제안된 고체 지질 나노입자를 제조함에 있어서 조성물의 비율을 조절하고, 형성된 고체 지질 나노입자의 표면을 메틸화한 키토산으로 코팅함으로서, 위액과 유사한 산성 환경에서도 봉입된 약물의 폭발적 방출이 현저히 감소되어 지속적 약물 방출이 가능한 약물 전달체를 제공할 수 있음을 최초로 발견한 것에 기초한다.
상기 "N-트리메틸 키토산(N-trimethyl chitosan; TMC)"은 메틸화하여 4차화된(quaternized) 키토산 유도체로서, 키토산의 고분자 골격에 트리메틸기를 도입함으로서 키토산에 비해 현저히 높은 수가용성을 갖는 화합물이다. 상기 키토산은 임의로 분포된 β-(1-4)-링크된 D-글로코사민과 N-아세틸-D-글로코사민로 구성된 천연 다당류로 생체적합성, 생분해성, 점액부착성, 낮은 독성 및 항미생물활성 등 생물학적 응용을 위한 이로운 성질을 갖는 화합물이다. 산성 조건에서는 수가용성이나, 생리활성 조건인 중성 또는 염기성 조건에서 낮은 수가용성이며 응집하고 양전하를 잃는 특성은 약물 전달체로서 적용을 위한 키토산의 사용을 저해하는 요인이다. 따라서, 이와 같이 우수한 생물학적 성질을 나타내는 키토산을 화학적으로 개질하여 신규한 약물 전달 시스템에 이용하고자 하는 연구가 진행되고 있다. 이러한 노력의 일환으로 N-트리메틸 키토산이 제공된다. 상기 N-트리메틸 키토산은 개질하지 않은 키토산에 비해 증가된 점막부착성 및 중성 pH에서 흡수 향상성을 나타낼 뿐만 아니라 넓은 pH 범위에 걸쳐 우수한 수가용성을 나타낸다.
상기 "커큐민(curcumin)"은 강황 또는 울금의 성분으로, (1E,6E)-1,7-Bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione의 IUPAC 명을 갖는 화합물이다. 항암 및 항산화 활성을 갖는 것으로 알려져 있으며, 이외에도 간기능 강화, 담즙분비촉진, 위궤양 원인균(파이로리균)에 대한 살균이담작용, 이뇨작용, 멜라닌 색소 침착 방지 등에 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 뿐만 아니라, 지방조직의 증가를 억제하여 살이 찌는 것을 막아주며, 알츠하이머 일명, 치매에도 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 그러나, 이러한 많은 효능에도 불구하고 커큐민은 낮은 흡수율, 빠른 대사 및 빠른 전신 배설 등에 의해 생체이용률이 매우 낮다. 따라서, 이의 흡수를 돕거나 하는 등의 방법으로 생체이용률을 높일 수 있는 제제 또는 제형 등의 발굴이 요구된다.
고체 지질 나노입자(solid lipid nanoparticles; SLNs)는 친유성(lipophilic) 약물의 체내 전달을 위한 약물전달체로서 응용 가능성을 갖는 물질로서, 나노기술의 개발과 더불어 최근 새롭게 제시되고 있는 약물전달 시스템 또는 약학적 제제의 한 형태일 수 있다. 상기 고체 지질 나노입자는 고유한 크기 의존적 성질을 가지므로 새로운 치료제의 개발에 응용될 수 있다. 상기 고체 지질 나노입자는 유제, 리포좀 및 고분자성 나노 및 마이크로입자와 같은 종래의 콜로이드성 전달체(colloidal carriers)의 단점을 극복하기 위하여 제안된 대체 전달체 시스템으로 서브-마이크론 예컨대, 10 nm 내지 1000 nm의 직경을 갖는 입자일 수 있다. 생리적(physiological) 지질을 포함하며 유화제(또는 계면활성제)를 추가로 포함하여 물이나 수용액에 분산될 수 있다. 종래 유화제로 널리 사용되는 물질은 폴리비닐알콜(poly(vinyl alcohol); PVA)로 이는 나노제제로 사용할 경우 나노입자와의 계면에서 상호연결망을 형성하므로 독성을 나타낼 수 있으며, 또한 유화 후 제거가 어려운 단점이 있다. 한편, 전술한 바와 같이 고체 지질 나노입자는 생리적 지질을 포함하므로, 제조과정에 있어서, 생체 내에서 독성을 나타낼 수 있는 유기용매의 사용을 배제할 수 있다. 상기 고체 지질 나노입자는 친유성 약물이 적제된 고체 지질 중심(lipophilic drug-loaded solid lipid core)을 포함하며, 상기 고체 지질 중심은 유화제에 의해 안정화될 수 있다. 바람직하게, 상기 지질은 팔미트산 및 콜레스테롤일 수 있으며, 유화제는 D-α-토코페릴 폴리에틸렌글리콜 1000 숙시네이트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 고체 지질 나노입자는 전술한 바와 같이 그 크기에 따라 다른 성질을 나타낼 수 있다. 따라서, 상기 고체 지질 나노입자를 제조함에 있어서, 일정한 크기 즉, 좁은 입도분포의 입자를 제조할 수 있는 방법이 필요하다. 한편, 고체 지질 나노입자의 크기는 사용하는 지질의 종류 및 양, 유화제의 종류 및 양 등 다양한 인자에 의해 결정될 수 있다. 이를 고려할 때, 본 발명의 다른 특징은 좁은 입도분포의 고체 지질 나노입자를 제공하기 위한 지질 및 유화제의 조합 및 최적의 조성비를 규명한 것에 있다.
본 발명의 고체 지질 나노입자의 제조방법에 사용한 "팔미트산"은 헥사데칸산(hexadecanoic acid)라는 IUPAC 명을 갖는 탄소수 16의 포화지방산으로 CH3(CH2)14COOH의 화학식을 갖는 화합물이다. 야자수 오일의 주성분이며, 고기, 치즈, 버터 및 유제품 등에도 존재한다. 체내에서 과량의 탄수화물은 팔미트산으로 전환될 수 있다. 팔미트산의 지방산 합성과정에서 생성되는 최초의 지방산으로, 보다 긴 지방산의 전구체로 작용할 수 있다. 이와 같은 팔미트산은 동물의 신체를 구성하는 주된 성분이며 인간에서 저장 지방(depot fat)의 상당부분을 차지하며, 인간 모유의 지질 성분이기도 하다. 이와 같이 팔미트산은 자연적으로 체내에 존재하는 물질로 생체 내에서 독성을 나타내지 않는 안전한 물질이다.
본 발명의 고체 지질 나노입자의 제조방법에 사용한 "콜레스테롤"은 일종의 지방유사물질(fat-like substance)로 체내에서 생성되고 지속적으로 존재하는 생리적 지질의 일종이다. 주로 인간을 비롯한 동물의 간에서 생성되며, 예컨대, 인간의 세포는 정상적인 기능을 수행하기 위해 일정량의 콜레스테롤을 필요로 하는 생체 내 필수적인 물질 중 하나이다.
본 발명의 고체 지질 나노입자의 제조방법에 사용한 "D-α-토코페릴 폴리에틸렌글리콜 1000 숙시네이트(D-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate; TPGS)"는 지용성 비타민 E의 수용성 형태의 화합물로, 상기 TPGS의 화학적 구조는 친유성(lipophilic) 및 친수성(hydrophilic) 모이어티를 모두 포함하는, 일반적인 계면활성제와 유사한 형태를 갖는, 양친성(amphiphilic) 화합물이다. 또한, 상기 TPGS의 친유성 알킬 테일(토코페롤 숙시네이트) 및 친수성 극성 헤드 부분(폴리에틸렌 글리콜)은 벌키하여 큰 표면적을 가지며, 약 13.2의 적절한 친수-친유 평형(hydrophile-lipophilic balance; HLB) 값을 갖는다. 종래 유화제로 사용되는 PVA의 HLB 값이 12 내지 16임을 고려할 때, TPGS의 HLB 값은 유화제로서 PVA를 대체할 적절한 물질임을 나타낸다.
바람직하게, 상기 팔미트산, 콜레스테롤 및 TPGS는 사용한 커큐민 1 중량부에 대해 각각 20 내지 40 중량부, 2 내지 6 중량부 및 6 내지 12 중량부로 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 팔미트산, 콜레스테롤, TPGS 및 커큐민을 각각 20 중량부, 2 중량부, 6 중량부 및 1 중량부로 사용할 수 있다. 상기 팔미트산의 사용량이 증가함에 따라 형성되는 입자의 크기 즉, 입자의 평균직경이 증가할 수 있다. 예컨대, 다른 성분의 사용량을 일정하게 유지(콜레스테롤 : TPGS : 커큐민 = 3 : 8 : 1)하고 팔미트산의 사용량을 20 중량부로부터 40 중량부로 증가시킴에 따라, 형성되는 고체 지질 나노입자의 평균직경은 약 240 nm에서 약 515 nm로 눈에 띄게 증가한다. 즉, 팔미트산의 사용량을 조절함으로써 형성되는 입자의 크기를 조절할 수 있다. 다만, 팔미트산을 40 중량부를 초과하여 사용하는 경우, 계면활성제가 지질 중심(core)의 표면을 완전히 커버할 수 없으므로 유화효율(emulsifying efficiency)이 감소하고 이에 따라 입자의 응집이 유발될 수 있다.
커큐민의 봉입효율은 평균 입자크기에 유의한 영향없이 콜레스테롤 사용량을 증가시킴으로써 향상시킬 수 있다.
바람직하게, N-트리메틸 키토산은 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자의 질량에 대해 1/100 내지 1/10배 질량으로 사용할 수 있다. 상기 N-트리메틸 키토산의 사용량이 코팅하고자 하는 고체 지질 나노입자의 질량에 대해 1/100배 미만인 경우, 나노입자 표면 전체가 고르게 코팅되지 못하여 충분히 입자가 안정화되지 못하고, 산성환경에서 적재된 약물의 폭발적 방출을 나타내는 등의 문제점을 야기할 수 있다. 또한 상기 N-트리메틸 키토산의 사용량이 코팅하고자 하는 고체 지질 나노입자의 질량에 대해 1/10배 초과인 경우, 코팅층이 너무 두꺼워지거나, 비특이적인 결합이 증가하는 등의 문제를 야기할 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 제조방법에 있어서, 제1단계는 지질상 혼합물을 지질의 용융점 보다 5 내지 10℃ 높은 온도로 가열함으로써 달성될 수 있다. 고체 지질 나노입자의 제조에 사용되는 공지기술인 열균질화(hot homogenization)에 사용되는 조건으로, 고체 지질 나노입자를 구성하는 지질의 용융점 보다 5 내지 10℃ 높은 온도로 가열함으로써 지질을 용해시키기 위한 별도의 용매 필요없이 용융상의 지질을 제공할 수 있으며, 이를 유사한 온도의 유화제를 포함하는 수용액과 반응시킴으로서 이어지는 제3단계를 수행할 수 있다.
바람직하게, 제1단계 및 제2단계는 독립적으로 수행될 수 있다.
바람직하게, 제3단계는 10,000 내지 12,000 rpm으로 5 내지 10분간 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 균질화하는 단계를 10,000 rpm 미만에서 또는 5분 미만으로 수행하는 경우에는 균일한 분산을 얻을 수 없으며, 12,000 rpm 초과에서 또는 10분 초과하여 수행하는 경우에는 더이상 균질화를 유발하지 않는다.
바람직하게, 제4단계는 3 내지 7분간 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
바람직하게, 제5단계는 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자와 N-트리메틸 키토산을 증류수 또는 인산염 완충액(pH 7.4)에 분산시키고 8 내지 12시간 동안 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자로서, 상기 고체 지질 나노입자는 팔미트산(palmitic acid), 콜레스테롤(cholesterol) 및 TPGS을 포함하며, 상기 고체 지질 나노입자 표면이 N-트리메틸 키토산으로 코팅된 것인 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자를 제공한다.
본 발명에 따른 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자는 표면이 N-트리메틸 키토산으로 코팅되어 pH 1 내지 2의 산성조건에서 입자 내에 적재된 커큐민의 24시간 누적방출율이 10 중량% 미만인 것이 특징이다. 예컨대, 상기 코팅으로 인해 산성 조건에서도 안정한 입자를 제공함으로써 적재된 약물의 폭발적 방출이 현저히 감소된 것이 특징이다.
또한, 본 발명에 따른 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자는 커큐민이 고체 지질 나노입자의 지질 매트릭스의 결정 격자 내에 무정형 또는 분자 분산 형태로 분산되어 있어 약물의 누출이 억제되고 지속적인 방출이 가능한 것이 특징이다.
바람직하게, 본 발명에 따른 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자는 전술한 방법에 따라 제조할 수 있다.
바람직하게, 본 발명에 따른 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자는 팔미트산 20 내지 40 중량부, 콜레스테롤 2 내지 6 중량부, TPGS 6 내지 12 중량부 및 커큐민 1 중량부를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에 따른 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자는 1.0 내지 3.0 ㎍/㎖의 최대혈장농도(Cmax) 및 5 내지 20 h·㎍/㎖의 AUC0 -8h(8시간까지 혈장농도-시간 곡선의 면적)을 나타낼 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자를 유효성분으로 포함하는 경구투여용 커큐민 제제를 제공한다.
본 발명에 따른 고체 지질 나노입자는 산성조건에서도 안정하므로 이를 유효성분으로 포함하는 경구투여용 제제는 위장 환경에서도 안정하여 폭발적으로 약물을 방출하지 않으므로 혈중약물농도를 높은 수준으로 유지할 수 있을 뿐만 아니라, 이를 필요로 하는 조직 예컨대, 병변까지 전달할 수 있다. 바람직하게, 본 발명에 따른 경구투여용 커큐민 제제는 암질환, 알츠하이머 또는 뇌 신경교종(gliomas)의 치료용으로 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 당업계에 공지된 커큐민의 생물학적 활성 예컨대, 항산화 효과, 항염증 효과, 지질생성 억제 등의 효과에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 질환의 예방 또는 치료에 제한없이 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 N-트리메틸 키토산으로 코팅한 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자를 투여하면 개질하지 않은 키토산으로 코팅한 또는 코팅하지 않은 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자 및 커큐민 현탁액을 투여한 경우와 비교하여 위액과 유사한 pH 조건에서도 현저히 낮은 약물방출(도 6)을 나타내므로 지속적 방출이 가능하여 높은 수준의 혈장농도를 유지(도 8A 및 B)할 수 있으므로 경구투여용 커큐민 제제로서 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다. 특히, 커큐민 제제를 경구투여한 마우스 모델에서 많은 양의 커큐민이 혈관 펠렛이 아닌 뇌 실질영역에 존재함을 확인(도 8C)하였으며, 이는 상기 N-트리메틸 키토산으로 코팅한 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자가 뇌 질환의 예방 또는 치료를 위한 경구투여용 제제로서 유용하게 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.
본 발명의 N-트리메틸 키토산으로 코팅한 커큐민을 적재한 고체 지질 나노입자는 상기 코팅으로 인해 산성의 위장 환경에서도 안정하여 경구투여하여도 장관에서 커큐민의 지속적 방출을 가능하게 하므로 높은 커큐민 혈중농도를 유지할 수 있다. 또한, 상기 N-트리메틸 키토산으로 코팅한 커큐민을 적재한 고체 지질 나노입자는 혈관뇌장벽을 투과하여 뇌조직으로의 약물전달이 가능하므로 암질환 뿐만 아니라 알츠하이머 또는 뇌 신경교종 등의 뇌질환의 치료를 위한 경구투여용 제제로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른, 경구투여를 위한 커큐민을 적재한 표면 개질한 고체 지질 나노입자의 제조방법 및 약물방출거동을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 N-트리메틸 키토산(TMC)의 합성방법 및 이에 대한 분광학적 데이터를 나타낸 도이다. (A)는 본 발명에 따른 2단계 메틸화를 포함하는 TMC 합성방법을 나타낸 도이다. (B) 및 (C)는 각각 합성된 TMC에 대한 1H-NMR 및 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 도이다. 대조군으로는 메틸화하지 않은 키토산을 사용하였다.
도 3은 본 발명에 따른 커큐민을 적재한 SLN 제제의 입자크기 분포 및 분산성을 나타낸 도이다. (A) 내지 (C)는 각각 표면 개질하지 않은 SLCNs, 키토산으로 표면 개질한 SLCNs(CH-SLCNs) 및 TMC로 표면 개질한 SLCNs(TMC-SLCNs)의 입자크기 분포를 나타낸 도이며, (D)는 커큐민을 적재한 SLN 제제(SLCNs)와 순수 커큐민의 증류수에 대한 분산성을 비교하여 나타낸 도이다.
도 4는 커큐민, 팔미트산, SLNs 및 SLCNs의 물리적 상태를 나타낸 도이다. (A)에는 분말-XRD, (B)에는 DSC, (C)에는 TGA 및 (D)에는 FT-IR 스펙트럼을 나타내었다.
도 5는 본 발명에 따른 SLN 제제(SLCNs, CH-SLCNs 및 TMC-SLCNs)의 저장 조건에 따른 비교안정성 연구결과를 나타낸 도이다. (A) 및 (B)는 각각 90일까지 냉장 또는 실온에서 보관한 제제의 입자크기 및 제타전위를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명에 따른 SLN 제제(SLCNs, CH-SLCNs 및 TMC-SLCNs)의 커큐민 방출 프로파일을 나타낸 도이다. (A) 및 (B)는 각각 모의 위액(simulated gastric fluid; SGF, pH 1.2) 및 모의 장액(intestinal fluid; SIF, pH 7.4)에서의 커큐민 방출을 24시간까지 누적 백분율로 나타낸 도이다. 통계적으로, SLCNs, CH-SLCNs 및 TMC-SLCNs로부터 커큐민 방출에 있어서 유의적인 차이가 관찰되었다(***p<0.05). 데이터는 누적 백분율 커큐민 방출의 평균±S.D로 나타내었다(n=3).
도 7은 본 발명에 따른 SLN 제제(SLCNs, CH-SLCNs 및 TMC-SLCNs), 약물 비적재 SLNs(Plain SLNs) 및 유리 커큐민(Free Curcumin)의 암세포종에 대한 시험관 내 세포독성효과를 나타낸 도이다. (A) 인간유방선암 세포주(human breast adenocarcinoma), MCF-7 및 (B) 마우스흑색종(mouse melanoma), B16F10에 대한 세포독성을 24시간 및 48시간 인큐베이션 후 MTT 어세이로 확인하였다.
도 8은 마우스에 50 mg/kg 용량으로 다양한 커큐민 제제의 경구투여 후 혈장 내에서 커큐민의 혈장농도(plasma concentration)-시간 프로파일 및 뇌조직에서 커큐민 분포를 나타낸 도이다. TMC-SLCNs은 커큐민 현탁액(***p<0.05) 및 다른 SLCNs제제(**p<0.05)에 비해 보다 높은 혈장 농도 및 AUC를 나타내었다(A 및 B). 혈장에 대한 뇌의 커큐민 비를 사용하여 뇌분획에서 커큐민 분포를 계산하였다(C). 커큐민 현탁액(***p<0.05) 및 다른 SLCNs 제제(*p<0.05)에 비해 TMC-SLCNs 처리시 뇌분포가 현저히 증가하였다. 데이터는 평균±S.E(n=3)로 나타내었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<물질>
15 kDa 분자량을 갖는 키토산을 Polysciences 사(PA, USA)로부터 구입하였다. 커큐민, 레스베라트롤(resveratrol) 내부표준(internal standard) 및 N-메틸-2-피롤리디논(N-methyl pyrollidinone; NMP)은 TCI 사(Tokyo, Japan)로부터 구입하였다. 살부타몰(salbutamol), 요오드화메틸(methyl iodide), 요오드화나트륨(sodium iodide), 수산화나트륨(sodium hydroxide), 염화나트륨(sodium chloride), 팔미트산 및 D-α-토코페릴 폴리에틸렌글리콜 1000 숙시네이트(TPGS)는 Sigma-Aldrich 사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 콜레스테롤은 Wako Pure Chemical Industries 사(Osaka, Japan)로부터 구입하였다. 용매인 아세토니트릴(acetonitrile, Avantor, PA, USA)과 물(Fisher Scientific Korea LTD, Korea)은 HPLC용(HPLC grade)을 사용하였다. 본 발명에 사용된 모든 다른 화합물 및 시약은 분석용(analytical grade)으로 추가적인 정제과정 없이 사용하였다.
<실험방법>
1 H- NMR 및 FT - IR 스펙트럼 분석
Bruker 600 MHz Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer(Bruker Analytik, Germany)를 이용하여 합성된 TMC(N-트리메틸 키토산)의 1H NMR 스펙트럼을 기록하였다. 분석을 위해 2 mg의 고분자 생성물 시료를 700μL D2O에 용해시켰다. 사차화도(degree of quaternization; DQ) 지수(index)로 간주되는 N-트리메틸기 혼성화(incorporation) 정도(extent)를 하기 수식을 이용하여 1H NMR에 의해 결정하였다:
Figure pat00001
상기 [CH3]3는 3.3 ppm에서 트리메틸화된 아미노기로부터의 9개 수소원자에 상응하는 피크 적분이며, [H]는 글루코사민의 글리코피라노스 고리의 C-1에 결합된 수소원자를 나타내는 4.7 내지 5.7 ppm(참조신호) 사이의 1H 피크 적분이다.
키토산 및 TMC의 FT-IR 스펙트럼을 2 cm-1 해상도 및 4 스캔으로 4000 cm-1 내지 500 cm-1 영역에서 작동하는 FT-IR 분광기(Bruker Analytik, Rheinstetten, Germany)를 이용하여 얻은 4 스캔을 이용하여 기록하였다.
봉입효율 ( encapsulation efficiency ) 및 적재율( loading capacity )의 결정
표면 개질된 또는 비개질된 커큐민을 적재한 고체 지질 나노입자(SLCN)를 합성한 후, 아미콘® 여과 튜브(Millipore, Carrigtwohill, Ireland)를 이용한 초원심분리에 의해 봉입되지 않은 커큐민의 양을 측정하였다. 구체적으로, 500 ㎕ SLCNs을 0.5 ㎖ 원심분리 여과 튜브에 옮기고, 4℃에서 14,000 rpm으로 30분 동안 원심분리하였다. 상층액 중의 봉입되지 않은 커큐민의 양을 HPLC-UV 시스템으로 결정하였다. 봉입효율(encapsulation efficiency; EE) 및 적재율(loading capacity; LC)은 하기의 식으로 계산하였다:
Figure pat00002
Figure pat00003
이때, TCur은 SLCNs 중의 커큐민의 총량, SCur은 상층액에서 측정된 커큐민의 양 및 TL은 SLCNs 중 지질의 총 질량이다.
HPLC 분석
가변적인 파장 검출기를 구비한 애질런트 1100 시리즈 HPLC 시스템을 커큐민 정량분석에 사용하였다. 또한 Sepax BR-C18 컬럼(5μm, 120Å, 4.6×150 mm) 및 이동상으로서 아세토니트릴과 물의 1:1(v/v) 혼합물을 사용하였다. 내부 표준물질로서 레스베라트롤을 첨가하고 에틸아세테이트로 액체-액체 추출하고 적절한 부피의 이동상으로 희석하여 다른 SLN 제제로부터 커큐민을 분석하였다. 20 ㎕ 분액(aliquot)을 HPLC 시스템에 주입하고 425 nm 파장에서 커큐민 함량을 정량하였다. 획득한 데이터는 Chem Station 소프트웨어(Agilent technologies, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 처리하였다. 커큐민 농도에 대한 커큐민과 레스베라트롤 피크의 면적비에 기초한 검정곡선은 0.5 내지 90 ㎍/㎖ 농도 범위에서 선형임을 확인하였다. 선형회귀분석(Linear regression analysis)으로 검정 그래프로부터 최적합 곡선(line of best fit)의 방정식이 y=0.1226x-0.026(R2=0.99)임을 확인하였다.
입자크기, 다분산지수 ( polydispersity index ; PDI ) 및 제타전위 분석
SLCNs를 적절한 농도로 증류수에 분산시켰다. 평균입자크기, 다분산지수(polydispersity index; PDI) 및 제타전위를 동적 광 산란법(dynamic light scattering method) 기반 제타전위 및 입자크기 분석기 ELSZ-1000(Photal OTSUKA Electronics, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. 모든 실험은 3회 반복하여 수행하였다.
시차주사열량분석( differential scanning calorimetry ; DSC )
Mettler DSC 장치(Mettler Toledo; Melbourne, Australia)를 이용하여 시료(커큐민, 팔미트산, 보통 SLNs 및 SLCNs)의 물리적 상태 및 열적거동을 분석하였다. DSC 측정을 위하여, 각 시료를 2 ㎎씩 표준 알루미늄 팬(standard aluminum pan)에 개별적으로 투입하고 밀봉하였다(hermetically sealed). DSC 분석은 20 내지 220℃ 온도 범위에서, 10, 2.5 및 0.2℃/min의 주사속도로, 50 ㎖/min 유속의 건조 질소 기체 하에서 수행되었다.
분말 X-선 회절 ( PXRD ) 분석
구리 애노드(Cu Kα radiation, 40 kV, 30 mA)를 구비한 분말 X-선 회절기(PANalytical, Almelo, Netherlands)시료의 결정학적 구조를 분석하였다. 커큐민, 팔미트산, 동결건조한 보통 SLNs 및 SLCNs 시료를 0.05°의 2θ 스텝크기 및 1.00 초의 스텝시간으로 1°에서 100°까지 스캔하여 상온(ambient temperature)에서 분석하였다.
열중량분석( Thermogravimetric analysis ; TGA )
열중량분석기(Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland)를 이용하여 시료의 열분해를 측정하였다. 각 분석을 위해, 시료 2 ㎎을 칭량하여 알루미늄 팬에 위치시켰다. 가열 온도를 증가시키면서(10℃/min 가열속도로 25℃로부터 500℃까지) 20 ㎖/min 질소 흐름 하에서 TGA 분석을 수행하였다.
병행연구( compatibility study )- FT - IR 스펙트럼 분석
고체 지질 중심(solid lipid core)과 병합된 약물(incorporated drug) 간의 가능한 상호작용을 FT-IR(Bruker Analytik, Germany) 분광법을 이용하여 확인하였다. 500 내지 4000 cm-1 범위에서 2 cm-1 해상도로 순수한 커큐민, 보통 SLNs 및 SLCNs의 FT-IR 분석을 수행하였다.
데이터분석
혈장 농도-시간 데이터를 분석하였다. WinNonlin 소프트웨어(version 2.1, Pharsight, USA)에서 비구획적 분석(non-compartmental analysis; NCA)을 사용하여 시간(Tmax)에 따른 최대 혈장농도(Cmax), 혈장농도-시간 곡선 하의 면적(area under the plasma concentration-time curve; AUC), 배출반감기(elimination half-life; t1 /2) 및 평균 체류시간(mean residence time; MRT)을 포함하는 약동학 변수를 계산하였다.
통계분석
모든 데이터는 평균 ± S.D로 나타내었다. 프리즘 4.0 소프트웨어(Graph Pad software)를 이용하여 수행한 분석으로, 스튜던트 t 검정과 결합시킨 ANOVA를 이용하여, 통계적 유의성(statistical significance)을 확인하였다. 0.05 이하의 p-값을 유의한 것으로 판단하였다.
실시예 1: N- 트리메틸 키토산( TMC )의 제조 및 특성분석
1.1. N- 트리메틸 키토산( TMC ) 고분자의 합성
도 2A에 도시한 2단계 메틸화 경로를 포함하는, 공지의 방법에 따라 TMC 고분자를 합성하고 특성을 분석하였다. 합성된 TMC를 양성자 핵자기공명 분광법(proton nuclear magnetic resonance spectroscopy; 1H-NMR) 및 푸리에 전환-적외선 분광법(Fourier transform-infrared spectroscopy; FT-IR)으로 분석하였다. 간략하게, 1 g 키토산 및 2.4 g 요오드화나트륨을 60˚C로 가열하는 수조 상에서 교반하면서 N-메틸-2-피롤리돈(N-methyl-2-pyrrolidone; NMP) 40 ㎖ 및 15% 수산화나트륨 수용액 6 ㎖의 혼합물에 용해시켰다. 키토산을 용해시킨 후, 요오드화메틸 6.5 ㎖을 반응 혼합물에 첨가하고 1시간 동안 교반하였다. 에탄올과 디에틸에테르 혼합물 200 ㎖를 이용하여 생성물을 침전시켰다. 원심분리하여 생성물을 분리하고 디에틸에테르로 세척하였다. 생성물을 20 ㎖의 탈이온수에 용해시키고, 요오드로부터 염소로 상대이온을 치환시키기 위하여 1M HCl 125 ㎖을 첨가하였다. 고도로 4차화된(with high degree of quaternization) TMC의 합성은 하기 추가적인 단계를 요구하였다: 침전시키기 전, 3 ㎖의 요오드화메틸과 3 ㎖의 15% 수산화나트륨을 혼합물에 첨가하고 추가로 1시간 동안 교반하였다. 고도로 4차화된(with high degree of quaternization) TMC에 대한 최종 반응 생성물을 20 ㎖의 10% NaCl(HCl 대신)에 용해시켜 요오드를 치환하였다. 수득한 생성물을 에탄올로 침전시켜 원심분리하고 디에틸에테르로 세척하였다. 40℃에서 진공 하에 건조시킨 후, 흰색의 수용성 고체인 TMC를 수득하였다.
1.2. 1H- NMR 및 FT - IR 스펙트럼 분석
상기 실시예 1.1.에서 합성된 N-트리메틸 키토산 유도체의 1H NMR 스펙트럼에서 N-메틸화를 입증하는 특성피크는 2.47-3.37 ppm 영역에서 나타날 것으로 예상되었다. 따라서, 3.25 ppm에서 관찰된 신호는 사차화된 자리에 기인하였다(도 2B). 전술한 바와 같이 반응 단계를 수정하여 48%의 높은 DQ 값을 갖는 TMC 고분자를 수득하였다.
키토산 및 TMC 고분자의 FT-IR 스펙트럼에서 4개의 특징적인 밴드는 NH2 및 OH의 신축진동(stretching vibration)의 복합된 피크(3425 cm-1), 아세트아미도기(acetamido groups)의 C=O 결합(1658 cm-1), 아미노기의 N-H 결합(1564 cm-1) 및 메틸기의 C-H 결합(1479 cm-1)에 상응한다. 키토산 및 TMC의 FT-IR 스펙트럼은, TMC 스펙트럼에서만 관찰되는 1479 cm-1에서의 C-H의 변형진동을 나타내는 신호로 구분되며, 거의 일치하였다. 따라서, FT-IR 스펙트럼 분석은 키토산의 아미노기가 메틸기로 치환되었음을 나타내는 것이다(도 2C).
실시예 2: 커큐민 -적재된( loaded ) 고체 지질 나노입자( solid lipid nanoparticles; SLCNs )의 제조 및 특성분석
고전단균질화(high shear homogenization) 및 초음파처리법(ultra-sonication technique)으로 하기 표 1에 나타난 SLCNs 제제(formulations)의 조성(compositions)을 갖는 커큐민-적재된 SLNs(SLCNs)을 제조하였다. 간략히, 지질을 완전히 용융시키기 위하여 지질상 팔미트산 및 콜레스테롤을 지질의 용융점보다 5 내지 10℃ 높은 온도로 가열하였다. 미리 가열한 TPGS를 포함하는 수용액을 상기 지질상에 첨가하고 Ultra-Turrax homogenizer(IKA-Werke, Germany)를 이용하여 11,000 rpm으로 5분 동안 균질화를 수행하였다. 생성된 선-유화액(pre-emulsion)을 탐침형 초음파발생기(probe sonicator, Vibracell VCX130; Sonics, USA)를 이용하여 5분 동안 초음파처리(sonication)하였다. 생성된 SLCNs를 동결건조기(freeze-drying, Scan Vac, South Korea)를 이용하여 동결건조하고(lyophilized), 이후 실험을 위하여 4℃에 보관하였다.
Figure pat00004
상기 다양한 조성으로 제조한 SLNs 제제(formulations)의 평균입자크기, 제타전위, 봉입효율 및 적재율(loading capacity)을 표 1에 함께 나타내었다. 콜레스테롤 2 ㎎ 및 TPGS 6 ㎎을 동일한 양으로 유지하면서 팔미트산의 농도를 20 ㎎으로부터 40 ㎎까지 변화시키면서 입자크기에 대한 팔미트산 농도의 효과를 결정하였다. 그 결과는 팔미트산 농도를 증가시킬 때, 입자의 크기가 243.6 ± 15.8 nm로부터 513.9 ± 71.3 nm까지 증가하였다. 이는 보다 높은 지질 농도에서 분산매질(dispersion medium)의 더 높은 점도에 의해 보다 큰 입자크기가 유도될 수 있고, 이에 따라 보다 큰 입자크기 분포가 유도될 수 있음을 나타내는 것이다. 또한, 계면활성제가 높은 지질농도에서 지질 중심(core)의 표면을 완전히 커버할 수 없으므로, 유화효율(emulsifying efficiency)이 감소하고 입자 응집(particle agglomeration)의 증가가 유발될 수 있음을 뒷받침하는 것이다.
상기 다양한 조성의 SLNs 제제에 대해 측정된 커큐민 봉입효율(encapsulation efficiency; EE)은 평균입자크기에 대한 유의한 영향 없이 콜레스테롤의 양이 증가함에 따라 증가하였다. 상기 EE는, 팔미트산과 콜레스테롤에서 커큐민의 소수성 상호작용 및 높은 용해도로부터 야기되는 바와 같이, 지질 성분의 질량에 비례하여 증가하였다.
또한 팔미트산의 양(20 ㎎)은 유지하면서 TPGS의 농도를 6 ㎎으로부터 12 ㎎으로 변화시키면서 평균입자크기에 대한 TPGS의 상대 양의 효과를 분석하였다. TPGS의 양이 증가함에 따라, 평균입자크기 또한 증가하였다. 이러한 결과는 매우 낮은 농도에서 TPGS는 입자의 표면 상에 직접 흡착되었음을 나타내는 것이다. 그러나, 높은 농도에서는, 루프 및 테일의 생성 및 고체 지질 중심의 표면에서 유화제 분자(emulsifier molecules)의 압착(compression)이 현저하게 관찰되었으며, 궁극적으로 SLNs 간의 다리(bridge) 형성을 유발하였다.
평균입자크기 및 봉입효율에 대한 적재된 커큐민의 다른 농도에 의한 효과를 1 ㎎으로부터 3 ㎎까지 확인하였다. SLCNs 시스템은 고체 지질 조성을 갖는 1 ㎎ 커큐민까지 안정하였다. 그러나, 1 ㎎을 초과하는 커큐민 농도에서 입자크기는 현저히 증가하는 한편 EE는 감소하였다. 상기 평가한 각각의 지질은 구별되는(distinct) 약물 적재능(drug loading capacity)을 나타내었으며, 과량의 약물 첨가는 제제 내에 봉입되지 않은 자유 약물의 양을 증가시킴을 확인하였다. 이로부터, 20 : 2 : 6 : 1 ㎎ 수준으로 팔미트산 : 콜레스테롤 : TPGS : 커큐민을 포함하는 SLNs 조성이 소형 입자 제제에 최적임을 확인하였다.
실시예 3: 키토산 또는 TMC 로 표면 개질된 SLCNs ( CH - SLCNs 또는 TMC - SLCNs )의 제조
키토산 또는 TMC를 이용하여 최적화된 SLCNs의 표면 개질을 수행하였다. 구체적으로, 상기 실시예 2를 통해 20 : 2 : 6 : 1 wt/wt 상대 조성의 팔미트산 : 콜레스테롤 : TPGS : 커큐민이 소형 입자 제제의 제조에 최적임을 확인하여, 이후 실험을 위하여 상기 조성을 이용하였다. 표면전하 상호작용(surface charge interaction)에 의해 SLCNs을 TMC로 표면 개질하였다. 음으로 하전된 SLCNs과 양이온성 TMC(50 : 1 w/w)를 동일한 부피로 포함하는 용액을 증류수에 분산시키고 10시간 동안 교반하였다. 최종적으로, 13,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 TMC-SLCNs을 회수하고 동결건조하였다. 유사하게, 키토산으로 표면 개질한 SLCNs(CH-SLCNs)을 제조하여 대조군으로 사용하였다.
표면 개질 전과 후의 SLCNs의 입자크기 및 제타전위를 비교하여 표면 개질을 평가하였다(표 2 및 도 2). 키토산 또는 TMC를 이용하여 표면 개질한 SLCNs은 개질되지 않은 SLCNs(평균직경 138.8 ± 7.6 nm)에 비해 더 큰 입자크기(평균직경 311.9 ± 67.7 nm 및 412.0 ± 79.7 nm)를 나타내었으며, 이는 키토산 또는 TMC가 SLCNs 표면을 완전히 커버하였음을 명백히 나타내는 것이다. 또한, 키토산 또는 TMC의 첨가로 SLCNs의 음성 표면 전하(제타전위), -29.67 ± 1.20 mV를 각각 27.08 ± 0.86 mV 및 35.70 ± 1.03 mV로 전환되었으며, 이는 SLCN표면이 개질되었음을 나타내는 것이다.
Figure pat00005
실시예 4: 봉입효율( encapsulation efficiency ; EE )
상기 실시예 2 및 3에 따라 제조한 SLCNs, CH-SLCNs 및 TMC-SLCNs에 대한 봉입효율(EE)을 측정하였다. 각각에 대해 측정된 EE는 93.13 ± 0.11%, 93.12 ± 0.06% 및 93.12 ± 0.08 %로 확인되었다. 커큐민의 고 친유성에 의해 고체 지질 중심에서 약물의 높은 EE가 유도되었으며, 또한 이는 고 친유성 분자를 수용할 수 있는 팔미트산 및 콜레스테롤의 능력에 기인함을 나타내는 것이다.
실시예 5: 물리적 상태에 대한 특성분석
5.1. DSC 분석
DSC는 상전이 온도 및 에너지 변이를 측정함으로써 자유 약물 및 제제에 봉입된 약물의 물리적 상태를 정량적으로 확인하기 위한 중요한 방법이다. 커큐민, 팔미트산, 보통 SLNs 및 SLCNs의 DSC 열분석도(thermogram)를 도 4A에 나타내었다. 커큐민의 열분석도는 183℃에서 커큐민의 용융점(melting point)에 상응하며 이의 결정성을 반영하는 예리한 흡열성(endothermic) 피크를 나타내었다. 팔미트산의 열분석도는 상기 지질의 용융점에 관련된 63℃에서 피크를 나타내었다. SLCNs의 열분석도는 고체 지질 중심 내에서 보다 높은 정도의 커큐민 혼화성 또는 봉입(entrapment)으로 인해 커큐민에 대한 특이적인 온도에서 어떠한 흡열성 피크도 나타내지 않았다. 이는 지질 중심에서 보다 높은 커큐민 봉입이 검출된 봉입효율 분석 결과와 일치한다. 팔미트산에 상응하는 흡열성 피크는 나노입자 형태로의 지질의 변형 및 약물, 계면활성제 및 제제 첨가물의 존재로 인해 SLCNs 및 보통 SLNs에서 다소 변화하였다.
5.2. 분말-XRD( powder X- ray diffraction) 연구
순수한 커큐민, 보통 SLNs, SLCNs 및 팔미트산 지질 매트릭스의 분석으로 얻은 분말-XRD 패턴을 도 4B에 나타내었다. 순수한 커큐민에 대한 분말-XRD 회절도(diffractogram)는 2θ 산란된 각에서 많은 예리한 피크를 나타내었으며, 이는 높은 결정성을 나타내는 것이다. SLCNs과 커큐민의 XRD 패턴을 비교하면, SLCNs 패턴은 커큐민의 특성적인 결정 피크를 나타내지 않았으며, 이는 커큐민이 지질 매트릭스의 결정 격자 내에서 무정형 또는 분자 분산형태로 완전히 분산되었음을 나타내는 것이다. 또한, 보통 SLNs 및 SLCNs의 회절 패턴 사이에는 눈에 띠는 차이가 나타나지 않았다. 이는 SLNs 내로 커큐민의 결합이 SLNs의 성질에 영향을 주지 않음을 나타내는 것이다. SLCNs 및 지질 매트릭스의 회절 패턴은 피크의 세기 및 해상도에서 차이를 보였으며, 이는 주로 입자크기 및 시료의 양과 같은 인자에 기인한다. 커큐민의 적재율, 수용성 및 경구적 생체이용률을 향상시키기 위하여 무정형의 커큐민을 SLNs 내에 사용하였다.
5.3. TGA 연구
TGA 분석을 이용하여 자유 약물, 지질 및 제제에 봉입된 약물의 열적 안정성을 확인하였다. 도 4C에 나타난 바와 같이, SLCNs 제제는 0 내지 100℃에서 높은 열적 안정성 및 미량의 질량손실을 나타내었다. 따라서, 커큐민 및 SLNs의 성질은 증가된 온도 수준에서의 실험에서도 변화하지 않을 것이다.
5.4. FT - IR 스펙트럼 분석
순수한 약물, 보통 SLNs 및 SLCNs의 FT-IR 스펙트럼을 도 4D에 나타내었다. 보통 SLNs, SLCNs 및 순수한 커큐민으로부터의 FT-IR 스펙트럼은 특성적인 작용기 피크의 피크이동 및 손실을 나타내지 않았다. 따라서, 본 발명에 따른 FT-IR 분석에서는 커큐민과 고체 지질 중심 간의 어떠한 상호작용도 검출되지 않았으며, 이는 커큐민이 약물 제제로서 SLNs의 지질성분과 양립할 수 있음(compatible)을 나타내는 것이다.
실시예 6: 90일에 걸친 장기안정성( long - term stability )
모든 동결건조된 SLNs 제제를 평가하기 위한 안정성 연구를 다른 보관 조건에서 수정된 ICH 지침을 따라 수행하였다. 동결건조된 시료를 냉장 온도(2 내지 8℃) 및 실온에서 90일 동안 보관하였다. 합성 즉시, 45일 또는 90일 간 보관 후, 입자크기, 제타 전위 및 봉입효율을 측정하였다.
커큐민은 산소 및 광 민감성으로 알려져 있으며, 잠재적 임상적용에서 실용적 실행가능성(practical feasibility)을 위한 결정적인 변수인 다른 보관조건에서 안정성을 유지할 수 있다. 제조 직후 및 다양한 조건 하에 45일 또는 90일 보관 후 입자크기 및 제타전위에서의 변화를 측정하여 동결건조된 SLN 제제의 물리적 안정성을 결정하였다. 냉장보관 또는 실온에서 보관된 SLN 제제 간에는 측정된 변수에서 어떠한 차이도 관찰되지 않았다(P>0.05)(도 5). 우수한 안정성을 나타내는 상기 결과에 기초하여, 냉장 또는 실온 보관된 SLN 제제를 이후 연구 및 활성포장(active packaging)을 위한 응용에 이용하였다.
실시예 7: 시험관 내 방출 연구
공지의 삼투 주머니 확산법(dialysis bag diffusion technique)을 이용하여 SLCNs 및 표면 개질된 SLCNs로부터 커큐민의 누적 방출을 측정하였다. 930 ㎍/㎖ 커큐민을 포함하는 SLN 제제를 모의 위액(simulated gastric fluid; SGF, pH 1.2) 및 모의 장액(simulated intestinal fluid; SIF, pH 7.4) 용액에 분산시키고 삼투 주머니(분자량 차단(cutoff) 3 KDa)에 옮겼다. 삼투 주머니의 양 말단을 봉하고 모의 매질(simulated medium)을 포함하는 수용구획(receptor compartment)에 담궜다. 교반기(shaker)로 37±1℃에서 분당 50타(strokes)로 시료를 수평으로 교반하였다. 정해진 시간 간격(0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12 및 24시간)에 수용구획으로부터 매질 1 ㎖를 채취하고 동일한 부피의 신선한 매질로 치환하여 잠김조건(sink condition)을 유지하였다. 모든 채취한 시료를 HPLC-UV법으로 분석하였다.
전술한 바와 같이, 2가지 다른 매질, SGF(pH 1.2) 및 SIF(pH 7.4)에서 SLNs 제제로부터 커큐민의 시험관 내(in vitro) 방출 연구를 수행한 결과, 측정된 커큐민의 누적 방출 프로파일을 도 6에 나타내었다. 24시간 후 SGF 및 SIF에서 SLCNs로부터 방출된 커큐민은 각각 약 84.73 ± 1.34% 및 67.35 ± 3.8%로, 커큐민 방출은 pH-의존적이었다. CH-SLCNs 내의 커큐민 제제는 24시간 후 SGF 및 SIF에서 각각 80.87 ± 1.90% 및 48.19 ± 5.08%의 방출을 나타내었다. 두 가지 제제 모두 SIF에서 보다 SGF에서 더 높은 커큐민 방출율을 나타내었다. TMC-SLCNs로부터의 커큐민 방출은 SGF에서 미량(8.71 ± 0.36%)이었으며, SIF에서 보통(41.68 ± 2.39%)이었다.
실시예 8: 시험관 내 세포생존율 연구
MTT 어세이를 수행하여 SLCNs 제제의 인간유방선암(human breast adenocarcinoma) MCF-7 및 마우스 흑색종(mouse melanoma) B16F10세포주에 대한 항암효과를 확인하였다. 구체적으로, 세포를 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지를 이용하여 멸균 인큐베이터에서 습식 5% (v/v) CO2 조건 하에 37℃에 배양하였다. 96 웰 플레이트의 각 웰에 3×104개 세포를 분주하고 37℃에 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 1 μM로부터 20 μM까지 다양한 농도의 SLCNs 제제를 포함하는 배지 100 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 추가로 24 또는 48시간 인큐베이션 후, 배지를 10 ㎕(5 ㎎/㎖) MTT 시약(3-[4,5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)으로 교체하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 배지를 제거하고 100 ㎕ DMSO를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 교반기 상에 유지하여 DMSO 내의 포르마잔 결정의 가용화를 보장하였다. 최종적으로, 마이크로플레이트 리더(BioTek, Winooski, USA)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 비처리 세포를 대조군으로 사용하여 처리한 세포의 흡광도로부터 상대 세포생존율을 계산하였다. 모든 실험은 n=8로 수행하였다.
암세포주에 대한 세포생존율에 대한 SLCNs의 시험관 내 효과를 전술한 바와 같이 MCF-7 및 B16F10 세포에서 MTT 어세이로 확인하였다. SLCNs은 상기 세포들에 대해 농도 및 시간 의존적 세포독성 효과를 나타내었다. 다른 SLCNs 제제와 인큐베이션 후 세포생존율(비처리 세포에 대한 %로 표시)을 도 7에 나타내었다. 보통 SLNs로의 처리는 사용한 세포주 어느 것에 대해서도 세포독성 효과를 나타내지 않았다. SLCNs 에 의한 세포 성장 억제는 인큐베이션이 24시간으로부터 48시간으로 연장되었을 때 및 SLCNs 농도가 1 μM 로부터 20 μM로 증가되었을 때 향상되었다. SLCNs 및 표면-개질된 SLCNs은 유리 커큐민과 비교하여 보다 강한 시험관 내 항암효과를 나타내었다. 24시간 및 48시간 인큐베이션 후, SLCNs 및 표면-개질된 SLNs은 MCF-7 및 B16F10 세포에 대해 연장된 억제효과를 유도하였다.
실시예 9: 약동학연구( pharmacokinetic studies )
9.1. 실험동물 및 투여량
생체 내(in vivo) 약동학연구를 위하여, 20 내지 25 g 체중의 4주령 수컷 Balb/c 마우스를 사용하였다. 실험동물과 관련된 모든 프로토콜은 가천대 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Ethics Committee of Gachon University)의 승인을 받았다. 개체 간의 변이를 최소화하기 위하여 각 군 당 n=3으로 4개 군으로 마우스를 임의로 분류하였다. 일군의 동물에는 25% Tween 80에 희석시킨 유리 커큐민 50 ㎎/㎏을 경구투여하였다. 나머지 군들에는 SLCNs, CH-SLCNs 또는 TMC-SLCNs을 포함하는 SLN 제제로서 50 ㎎/㎏ 커큐민을 경구로 투여하였다. 모든 SLNs 제제는 경구투여 직전에 증류수에 분산시켰다. 투여 후, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 4 및 8시간에 복재정맥(saphenous vein)으로부터 혈액시료 20 ㎕를 채취하였다. 0.5 ㎖ 헤파린화된 폴리에틸렌 튜브에 혈액시료를 회수하여 4℃에서 4000 rpm으로 10분간 원심분리하여 혈장을 수득하였다. 8시간에 동물을 치사시키고(sacrificed) 참수하여(decapitated) 뇌를 조심스럽게 제거하였다. 모든 혈장시료 및 뇌 조직은 추가 액체 크로마토그래피-병렬 질량분광법(liquid chromatography-tandem mass spectroscopy; LC-MS/MS) 분석시까지 -80℃에 보관하였다.
본 발명에 따른 약동학적 연구를 위하여, 3가지 SLN 제제(SLCNs, CH-SLCNs 및 TMC-SLCNs) 및 커큐민 현탁액(suspension)을 각각 마우스에 경구투여하였다. 제제의 경구투여 후 혈장 농도-시간 프로파일을 도 8 및 표 3에 나타내었다. 커큐민 현탁액은 0.27 ± 0.03 h·㎍/㎖의 AUC0 -8h 값으로 투여 후 0.5 시간(Tmax)에 0.24 ± 0.05 ㎍/㎖의 최대 혈장농도(Cmax)를 나타내었다. 이는 낮은 경구 흡수율, 효소적 분해 및 빠른 배출을 포함하는 커큐민의 경구투여의 특징적인 단점을 명확히 나타내는 것이다. 역으로, SLCNs 및 CH-SLCNs 내의 커큐민 투여는 현저히 더 높은 Cmax 값(SLCNs 및 CH-SLCNs에 대해 각각 0.58 ± 0.03 및 0.69 ± 0.16 ㎍/㎖), 두 가지 제제 모두에서 2시간의 Tmax 및 SLCNs 및 CH-SLCNs에 대해 각각 1.85 ± 0.36 및 2.08 ± 0.49 h·㎍/㎖의 AUC0 -8h 값을 나타내었다. 모든 연구된 제제 중에서, TMC-SLCNs은 1.21±0.12 ㎍/ml의 Cmax 및 6.23 ± 0.75 h·㎍/㎖의 AUC0 -8h를 갖는 최적의 약동학 프로파일을 나타내었다. 시험한 모든 SLCNs 제제의 Tmax는 커큐민 현탁액 보다 더 높았다. SLNs로부터 커큐민의 지연된 방출로 인해 커큐민 현탁액에 비해 현저히 더 높은 평균 체류시간(mean residence time; MRT)을 나타내었다. 모든 SLNs 제제 투여 후 측정한 AUC0 -∞는 커큐민 현탁액 투여 후 관찰한 값보다 현저히 더 높았으며, 이는 SLNs이 위장관(GI tract)에서 흡수과정 동안 효소적인 분해로부터 커큐민을 보호할 수 있기 때문인 것으로 사료된다. TMC-SLCNs은 CH-SLCNs, C-SLNs 및 커큐민 현탁액에 비해 보다 긴 배출 반감기(t1 /2)(12.26 ± 4.77시간)를 나타내었으며, 이는 TMC-SLCNs 내 투여 후 연장된 약물 체류 및 위장관에서 커큐민의 더 긴 흡수를 나타내는 것이다.
Figure pat00006
9.2. LC - MS / MS 에 의한 뇌 조직 중의 커큐민 함량분석
뇌 조직 중의 커큐민 양을 정량하기 위하여, 모세관 고갈법(capillary depletion method)을 사용하였다. 구체적으로, 빙냉 유리 균질화기(ice-cold glass homogeniser)를 이용하여 뇌를 0.8 ㎖ RHB-완충액에 균질화(homogenized, 10타)하였다. 덱스트란(26% 용액 1.6 ㎖)을 첨가한 후, 추가로 균질화(3타)하였다. 4℃에서 5400 g로 15분간 원심분리하여 균질액(homogenate)을 상층액(뇌 실질(parenchymal) 분획)과 펠렛(혈관성분(vascular elements) 함유)으로 분리하였다. 총 뇌 균질액 및 분리된 뇌 분획의 추출 후 커큐민 함량을 분석하였다.
커큐민을 분리하기 위한 250 ㎕ 에틸에테르로의 액체-액체 추출에 앞서, 1분간 볼텍싱(vortexing)하여 마우스 혈장(10 ㎕) 또는 뇌 균질액 시료(50 ㎕)를 이동상을 포함하는 10 ㎕ 살부타몰(salbutamol) 내부표준(200 ng/mL) 및 10 ㎕ 0.5 M 수산화나트륨(커큐민 추출을 향상시키기 위하여)과 혼합하였다. 4℃에서 10,000 rpm으로 10분간 원심분리 후, 유기층을 분리하고 진공에서 증발하여 건조시켰다. 최종적으로, 증발된 잔여물을 20 ㎕ 이동상(아세토니트릴 및 0.01% 포름산, 50:50, v/v)으로 재구성하고(reconstituted) 1분간 볼텍싱하여 LC-MS/MS 분석에 사용하였다.
ESI 애질런트 제트 스트림 시스템을 구비한 6490 삼중(triple) 4중극(quadrupole) 질량분광기에 연결된 애질런트 HPLC(1100 시리즈, USA) 시스템을 마우스 혈장 및 뇌 균질액 시료 중 커큐민 수준에 대한 LC-MS/MS 측정에 사용하였다. 분석 Sepax BR-C18(5 ㎛, 120Å 1.0×100 mm) 컬럼 상에서 컬럼 온도를 30℃로 유지하면서 HPLC 분리를 수행하였다. 아세토니트릴과 0.1% 포름산(50:50, v/v)으로 구성된 이동상을 0.2 ㎖/min의 일정한 유속으로 흘려주었다. 각 시료의 주입된 부피는 2 ㎕였다. 충돌기체로 아르곤 기체를 포함하는 양성 ESI 모드에서 5 kV 모세관 전압, 225℃ 기체온도, 15.1 I/min 기체유속, 40℃ 소스온도 및 커큐민 및 살부타몰에 대해 각각 14 및 12 eV 충돌 에너지로 MS 이온화를 수행하였다. 커큐민에 대해 369-285 m/z 및 살부타몰에 대해 240-148 m/z의 이온 전이(ion transitions)를 모니터하기 위하여 다중 반응 모니터링(multiple reactions monitoring; MRM)을 이용하여 분석을 정량화하였다.
경구투여 후 펠렛 내에, 상층액 내에 뿐만 아니라 전체 뇌 균질액에 분포된 커큐민을 커큐민 현탁액, SLCNs, CH-SLCNs 및 TMC-SLCNs에 대해 8시간 동안 측정하였다. 도 8C는 뇌 분획에 존재하는 커큐민 분포를 나타낸다. 커큐민 현탁액의 경우, 커큐민 농도는 균질액에서 검출되지 않았다. 반면, SLCNs, CH-SLCNs 및 TMC-SLCNs은 투여 8시간 후 균질액, 상층액 및 펠렛에서 검출가능한 커큐민 농도를 나타내었다. 상기 결과는 모든 SLCNs 제제로부터 커큐민은 커큐민 현탁액 보다 뇌 조직으로 주로 분포됨을 나타내는 것이다. 다른 제제와 비교하여 TMC-SLCNs은 균질액 및 상층액에서 보다 높은 커큐민 농도를 나타내었다.

Claims (15)

  1. N-트리메틸 키토산으로 코팅된 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자의 제조방법에 있어서,
    용융상태의 커큐민, 팔미트산 및 콜레스테롤의 지질상 혼합물을 준비하는 제1단계;
    D-α-토코페릴 폴리에틸렌글리콜 1000 숙시네이트(D-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate; TPGS) 수용액을 준비하는 제2단계;
    제2단계의 TPGS 수용액을 제1단계의 지질상 혼합물에 첨가하여 균질화하는 제3단계;
    제3단계의 생성물을 초음파 처리하여 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자를 형성하는 제4단계; 및
    상기 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자에 N-트리메틸 키토산을 첨가하고 교반하여 N-트리메틸 키토산으로 코팅하는 제5단계를 포함하는,
    N-트리메틸 키토산으로 코팅된 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 팔미트산, 콜레스테롤 및 TPGS는 사용한 커큐민 1 중량부에 대해 각각 20 내지 40 중량부, 2 내지 6 중량부 및 6 내지 12 중량부로 사용하는 N-트리메틸 키토산으로 코팅한 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    제5단계에서 N-트리메틸 키토산은 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자의 질량에 대해 1/100 내지 1/10배 질량으로 사용하는 것인 N-트리메틸 키토산으로 코팅한 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    제1단계는 지질상 혼합물을 지질의 용융점 보다 5 내지 10℃ 높은 온도로 가열함으로써 달성되는 것인 N-트리메틸 키토산으로 코팅한 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    제3단계는 10,000 내지 12,000 rpm으로 5 내지 10분간 수행하는 것인 N-트리메틸 키토산으로 코팅한 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    제4단계는 3 내지 7분간 수행하는 것인 N-트리메틸 키토산으로 코팅한 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    제5단계는 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자와 N-트리메틸 키토산을 증류수 또는 인산염 완충액에 분산시키고 8 내지 12시간 동안 수행하는 것인 N-트리메틸 키토산으로 코팅된 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자의 제조방법.
  8. 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자로서, 상기 고체 지질 나노입자는 팔미트산(palmitic acid), 콜레스테롤(cholesterol) 및 TPGS을 포함하며, 상기 고체 지질 나노입자 표면이 N-트리메틸 키토산으로 코팅된 것인 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자.
  9. 제8항에 있어서,
    pH 1 내지 2의 산성조건에서 커큐민의 24시간 누적방출율이 10 중량% 미만인 것인 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자.
  10. 제8항에 있어서,
    커큐민이 고체 지질 나노입자의 지질 매트릭스의 결정 격자 내에 무정형 또는 분자 분산 형태로 분산되어 있는 것인 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자.
  11. 제8항에 있어서,
    제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 것인 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자.
  12. 제8항에 있어서,
    팔미트산 20 내지 40 중량부, 콜레스테롤 2 내지 6 중량부, TPGS 6 내지 12 중량부 및 커큐민 1 중량부를 포함하는 것인 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자.
  13. 제8항에 있어서,
    1.0 내지 3.0 ㎍/㎖의 최대혈장농도(Cmax) 및 5 내지 20 h·㎍/㎖의 AUC0 -8h(8시간까지 혈장농도-시간 곡선의 면적)을 나타내는 것인 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자.
  14. 제8항에 기재된 커큐민 적재된 고체 지질 나노입자를 유효성분으로 포함하는 경구투여용 커큐민 제제.
  15. 제14항에 있어서,
    암질환, 알츠하이머 또는 뇌 신경교종(gliomas)의 치료용인 것인 경구투여용 커큐민 제제.

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