KR20150119269A - 폐암의 진단 및 면역요법을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하나 이상의 폐암 세포에 의해 발현되는 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 중 하나 이상에 대하여 세포독성 T 림프구 특이적 면역 반응을 발생시키는 재조합 종양-관련 항원이 로딩된 항원 제시 세포를 이용한 폐암의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법을 포함한다.
Description
본 발명의 한 양태는 일반적으로는 폐암의 검출 및 이의 면역요법 분야, 구체적으로는 폐암의 진단 및 치료를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
콤팩트 디스크에 기록된 자료의 참조 인용
본 출원은 EFS-웹을 통하여 ASCII 포맷으로 제출된 적이 있는 서열목록을 포함하고 있으며, 여기에 그 내용 전체를 참조로 포함한다. 에 생성된 언급한 ASCII 사본은 파일명이 이며, 크기가 킬로바이트이다.
발명의 범위를 한정하지 않으면서, 발명의 배경을 폐암의 진단 및 치료를 위한 방법 및 조성물과 관련하여 기술한다.
폐암은 전세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인이다. 2012년에 미국에서는 약 226,160여명의 새로운 환자 및 160,340명의 사망자가 발생한 것으로 예측되었다 (1). 세계보건기구는 폐암을 4가지의 주요 조직학적 유형으로 분류하고 있다: (1) 편평세포암종 (SCC), (2) 선암종, (3) 대세포 암종 및 (4) 소세포 폐암종 (SCLC). 비소세포 폐암종 (NSCLC)이라는 용어는 편평세포암종, 선암종 및 대세포 암종을 망라한다.
미국에서는 유방암의 발병이 조금 더 흔한 편이지만, 폐암은 남성의 경우 전립선암에 이어 두번째로, 여성의 경우 유방암과 대장암에 이어 세번째로 흔하게 발병한다. 그러나, 폐암은 암으로 인한 사망의 가장 흔한 원인이다. 통상, 폐암 진단에는 X-레이와 객담 세포진(sputum cytology)을 조합하는 방법이 사용된다. 그러나 불행하게도, 환자가 자신들의 증상에 대해 전문의의 도움을 구할 무렵에는 암은 대개 치유할 수 없을 정도로 진행된 상태가 되고 만다.
폐암 환자의 대부분 (85%)은 비소세포 폐암 (NSCLC) 유형에 해당하며, NSCLC로 진단받은 모든 환자에 있어서 5년 생존율은 20% 미만으로 추정되고 있다. NSCLC의 표준적인 치료법은 화학요법, 방사선 요법, 수술 또는 이러한 치료들의 조합을 포함한다. 그러나 불행하게도, 이러한 치료적 개입은 우려할 만한 부작용을 수반하며 (2), 일반적으로 환자들에게 제공하는 이익도 한정되어 있다 (3). 우리의 의료 설비에 최근 분자 표적 치료가 추가되었지만, NSCLC에 대한 의료 설비에 가장 최근에서야 추가된 것이 표적 치료이다. 그러나 불행히도, 모노클로날 항체인 베바시주맙에 기초한 이러한 시약들로 제공되는 치료적 이점에도 불구하고, 이들은 화학요법으로 치료받는 환자의 16.5%에게만 사용될 수 있다 (1,4). NSCLC는 여전히 세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인이다. 따라서, 이러한 치명적인 질환을 앓고 있는 환자들을 위한 보다 효율적인 치료법을 개발하는 것이 시급히 요구되는 실정이다.
발명의 명칭이 "폐암 마커(Lung cancer marker)"인 미국 특허 제5,773,579호는 인간 폐암 세포에 특이적인 신규한 단백질에 대한 분리되고 정제된 핵산 서열 및 상응하는 아미노산 서열을 개시하고 있다. 이 유전자는 시험된 정상 폐세포, 다른 정상 조직 및 다른 종양 세포주에 비해 이러한 세포들 (폐암 세포)에서 보다 더 높은 수준으로 발현된다. 여기에서는 또한 이러한 유전자 및 단백질의 3개의 추가적인 재조합 형태들도 개시되고 있는데, 처음 두 개의 경우에는 막 스패닝 영역이 제거되어 있고, 세 번째의 경우에는 아미노산이 시험관내 돌연변이 유발에 의해 변화되어 있다.
발명의 명칭이 "폐암 진단(Lung Cancer Diagnosis)"인 미국 특허 출원 공보 제2012/0100558호는 증상이 개시되기 전에 대상체에서 폐암을 진단하는 것에 관한 것으로서, 상기 진단 방법은 하나 이상의 사전 진단 폐암 지표 단백질 (LAMR1을 포함하며, 임의 부가적으로 또는 대안으로 아넥신 I 및/또는 14-3-3-θ 및/또는 규정된 항원과 같이 현재 개시된 여타의 다른 사전 진단 폐암 지표 단백질을 포함함) 에 특이적인 자가항체가 존재하는지의 여부를 확인하기 위해 대상체의 생물학적 유체를 스크리닝하는 단계를 포함한다.
발명의 명칭이 "암고환 항원(Cancer-testis antigen)"인 미국 특허 출원 공보 제2011/0177079호는 암고환 항원과 이들을 암호화하는 핵산 분자를 개시하고 있다. 상기 발명은 또한 암과 같은 질환의 진단 및 치료를 위한 방법 및 조성물에 있어서 상기 핵산 분자, 폴리펩타이드 및 이의 단편의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 상기 발명은 신규한 암고환 (CT) 항원의 발견에 대한 것이다.
발명의 명칭이 "폐암, 특히 비소세포 폐암(NSCLC) 치료용 조성물"인 미국 특허 출원 공보 제2010/0291156호는 포유동물에서 (후천성) 면역 반응을 유도할 수 있는, 2개 이상 (바람직하게는 서로 다른) 항원을 암호화하는 하나 이상의 RNA, 바람직하게는 mRNA를 갖는 활성 (면역자극) 조성물에 대한 것이다. 상기 발명은 또한 상기 활성 (면역자극) 조성물을 포함하는 백신을 교시하고 있으며, (백신 제조용의) 상기 활성 (면역자극) 조성물의 사용 및/또는 폐암, 특히 바람직하게는 편평세포암종, 선암종 및 대세포 암종의 세가지 주요 유형으로부터 선택되는 비소세포 폐암 (NSCLC) 또는 이와 관련된 장애들을 치료하기 위한 (후천성) 면역 반응 유도용 백신의 사용에 대한 것이다.
발명의 개시
한 양태에서, 본 발명은 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 종양 관련 항원 중 하나 이상을 제시하기 위해 로딩되어, 하나 이상의 폐암 세포에 의해 발현되는 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 중 하나 이상에 대하여 각각 세포독성 T 림프구 특이적 면역 반응을 발생시키는 분리된 항원 제시 세포를 포함하는 폐암 치료용 조성물을 포함한다. 한 측면에서, 상기 항원 제시 세포는 수지상 세포이다. 또 다른 측면에서, 상기 항원 제시 세포는 자가(autologous) 수지상 세포이다. 또 다른 측면에서, 상기 조성물은 NYESO-1, XAGE-1, ADAM29 및 MAGEC1 항원 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 또 다른 측면에서, 상기 조성물은 재조합 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 종양 관련 항원을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인간 대상체에서 샘플을 수득하는 단계; 및 항-SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 중 하나 이상에 대하여 특이적인 샘플 내의 특이적 면역글로불린의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는, 폐암을 앓고 있는 것으로 의심되거나 적어도 폐암 발생의 위험이 있는 인간 대상체를 확인하는 방법을 포함하는데, 여기서 상기 샘플 내에서 항-SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 특이적 면역글로불린 중 하나 이상의 존재는 상기 대상체가 폐암을 앓고 있거나 적어도 폐암 발생의 위험이 있음을 지시한다.
본 발명의 또 다른 양태는 개체의 체액 샘플을 수득하는 단계; 상기 개체의 체액 샘플을 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 종양 관련 항원 중 하나 이상과 접촉시키는 단계; 및 체액 샘플 내에 존재하는 하나 이상의 자가항체에 결합된 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 종양 관련 항원 중 하나 이상의 복합체의 존재 또는 부재를 측정하는 단계를 포함하는, 암을 앓고 있는 개체의 종양 마커 프로파일을 측정하는 방법을 포함하는데, 여기서 상기 하나 이상의 자가항체는 상기 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 종양 관련 항원 중 하나 이상에 대해 면역학적으로 특이적이고; 상기 복합체의 존재는 상기 개체의 종양 마커 프로파일을 제공하며; 상기 종양 마커 프로파일은 질환 진행의 징후로서 측정된다. 한 측면에서, 복합체의 존재는 암이 검출되었음을 나타낸다. 또 다른 측면에서, 암은 폐암이다.
본 발명의 또 다른 양태는 하나 이상의 폐암 세포에 특이적인 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 특이적 세포독성 T 림프구를 생성할 수 있는 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 종양 관련 항원 중 하나 이상을 포함하는 암 치료용 면역요법 조성물을 포함한다. 한 측면에서, 상기 조성물은 하나 이상의 항원 제시 세포를 추가로 포함한다. 한 측면에서, 상기 항원 제시 세포는 수지상 세포이다. 또 다른 측면에서, 상기 하나 이상의 항원 제시 세포는 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 종양 관련 항원을 암호화하는 펩타이드 또는 발현 구축물로 감작(pulsed)되거나 로딩된다. 또 다른 측면에서, 상기 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 종양 관련 항원 중 하나 이상은 비소세포 폐암종으로부터 분리된다.
본 발명의 또 다른 양태는 대상체로부터 샘플을 수득하는 단계; 및 상기 샘플 내에 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1의 존재 또는 부재를 측정하는 단계를 포함하는 대상체 내에서 폐암을 검출하는 방법을 포함하는데, 여기서 상기 샘플 내의 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1의 존재는 상기 대상체가 폐암을 앓고 있거나 적어도 폐암 발생의 위험이 있음을 지시한다. 한 측면에서, 상기 샘플은 혈액 샘플이다.
본 발명의 또 다른 양태는 면역자극 항원을 발현하는 핵산 벡터를 포함하는 조성물을 포함하는데, 여기서, 상기 항원은 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 종양 관련 항원 중 하나 이상을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서, 상기 항원은 펩타이드 항원이다.
본 발명의 또 다른 양태는 암의 치료가 필요한 포유동물에게 희석제, 비히클, 부형제 또는 불활성 성분 중 하나 이상 이외에 상승적, 치료적 유효량의 폐암 항원을 투여하는 단계; 상기 폐암 항원으로부터 특이적 세포독성 T 림프구 (CTL)를 생성하는 단계; 및 하나 이상의 종양 세포를 상기 특이적 세포독성 T 림프구 (CTL)로 표적화하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법을 포함한다. 한 측면에서, 상기 폐암 항원은 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1이다.
본 발명의 특징 및 이점을 보다 완전하게 이해시키기 위해, 이제 첨부되는 도면과 함께 발명의 상세한 설명에 하기와 같이 언급한다:
도 1a 내지 1c는 암/고환 항원 (CTA) 발현의 RT-PCR 분석을 나타내는 사진이다.
도 2는 표시된 항체로 항온배양된 세포 및 상응하는 동형 대조군에 대한 유세포 분석을 나타낸다.
도 3은 NSCLC 세포주인 CRL-5928, CRL-5922에 대해, 정상 기관지 상피 유래의 세포인 CRL-2503 및 한 명의 대표 환자에 대해 수행된 면역형광분석을 보여준다.
도 4a 내지 4c는 순환하는 CTA-특이적 IgG의 검출을 위한 효소 결합 면역흡착 측정법 (ELISA) 데이터의 그래프이다.
도 5a 내지 5f는 세포독성 T-림프구 (CTL) 활성 및 특이성을 분석한 그래프이다.
도 6a 내지 6f는 표시된 사이토카인의 수준에 대해 분석한 ELISA 및 자가 종양 세포와 함께 공동배양된 환자의 CTL에 의한 IFN-γ발현의 ELISPOT 분석이다.
도 1a 내지 1c는 암/고환 항원 (CTA) 발현의 RT-PCR 분석을 나타내는 사진이다.
도 2는 표시된 항체로 항온배양된 세포 및 상응하는 동형 대조군에 대한 유세포 분석을 나타낸다.
도 3은 NSCLC 세포주인 CRL-5928, CRL-5922에 대해, 정상 기관지 상피 유래의 세포인 CRL-2503 및 한 명의 대표 환자에 대해 수행된 면역형광분석을 보여준다.
도 4a 내지 4c는 순환하는 CTA-특이적 IgG의 검출을 위한 효소 결합 면역흡착 측정법 (ELISA) 데이터의 그래프이다.
도 5a 내지 5f는 세포독성 T-림프구 (CTL) 활성 및 특이성을 분석한 그래프이다.
도 6a 내지 6f는 표시된 사이토카인의 수준에 대해 분석한 ELISA 및 자가 종양 세포와 함께 공동배양된 환자의 CTL에 의한 IFN-γ발현의 ELISPOT 분석이다.
발명의 설명
본 발명의 다양한 양태의 제조 및 이용에 대하여 하기에 상세히 설명하지만, 본 발명이 광범위하게 다양한 구체적인 상황으로 구현될 수 있는 많은 응용가능한 발명의 개념들을 제공하고 있음을 이해해야 할 것이다. 본원에 거론되는 구체적인 양태들은 단지 발명을 만들어 내고 사용하는 구체적인 방법들을 예시하는 것일 뿐이지, 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 이해를 돕기 위해, 하기에 몇 개의 용어들을 정의하였다. 본원에 정의된 용어들은 본 발명과 관련되는 분야에서 통상적인 기술을 가진 사람에 의해 통상적으로 알려져 있는 의미를 가진다. 용어 하나 및 상기(a, an 및 the)는 단수 형태만을 지칭하도록 의도한 것은 아니고, 예시를 위해 구체적인 예가 사용될 수 있는 일반적 부류를 망라한다. 본원의 전문 용어는 발명의 구체적인 양태들을 기술하기 위해 사용되지만, 이러한 용어의 사용은 청구범위에 개괄되는 바와 같은 경우를 제외하고는 발명을 한정하려는 것은 아니다.
본원에서, "항원"과 "에피토프"라는 용어는 면역 반응을 자극할 수 있는 분자 또는 물질을 지칭한다. 일례에서, 에피토프는 이에 제한되지는 않지만, 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는데, 이때 상기 핵산의 폴리펩타이드로의 발현은 당해 폴리펩타이드가 주조직적합성 복합체 (MHC) 분자 상에서 처리되어 제시될 때 면역 반응을 자극할 수 있다. 일반적으로, 에피토프는 클래스 I 또는 클래스 II MHC의 결합 그루브에 비공유 결합된 세포의 표면 상에 제시된 펩타이드를 포함하는데, 이로써 이들은 T 세포 수용체 및 각 T 세포 부속(accessory) 분자들과 상호작용할 수 있게 된다. 그러나, 항원과 에피토프라는 용어는 항원의 특정 구조에 결합하는 항체의 항원 결합 부분을 거론할 때에도 해당된다.
항원의 단백질 가수분해 처리. 항원 제시 세포 상의 MHC에 의해 제시되는 에피토프는 커다란 펩타이드 또는 단백질 항원 전구체의 분할 펩타이드 또는 산물이다. MHC I 에피토프에 있어서, 단백질 항원은 세포 내에 주재하는 프로테아좀에 의해 분해되는 경우가 많다. 세포 내 프로테아좀에 의한 분해는 차후 MHC 단백질 상에 로딩되는 약 3개 내지 23개의 아미노산 길이의 펩타이드 단편을 만들어낸다. 세포 내 또는 세포 외 환경에서의 추가적인 단백질 가수분해 활성은 이러한 단편들을 추가로 다듬고 가공할 수 있다. MHC 클래스 II 에피토프의 가공 처리는 일반적으로 리소좀/엔도좀 구획의 세포 내 프로테아제를 통해 이루어진다. 본 발명은, 한 양태에서, 펩타이드로 하여금 직접적으로 항원 제시 세포에 대해 향상된 면역 반응을 찾도록 지시하는 항-CD40 항체 (또는 이의 단편)에 부착된 사전 가공 처리된 펩타이드를 포함한다.
면역원성 화합물로서 잠재적으로 유효한 에피토프를 동정하기 위해서는, MHC 결합 단독으로 예측하는 것이 유용하지만 이것만으로 충분치 않은 경우가 많다. 본 발명은 항원 제시 세포와 반응자 T 세포의 특정 공급원을 강구하기 위한 면역 반응을 가장 잘 유도할 것 같은 항원들 내에서 에피토프를 특이적으로 동정하는 방법을 포함한다.
본 발명은 환자 고유의 항원 제시 세포 및 T 세포 레퍼토리를 사용하여 목적하는 면역 반응을 가장 잘 이끌어낼 수 있을 것 같은 에피토프의 동정을 위한 신속하고도 용이한 분석법을 고려하고 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 어느 단백질 서열에도 적용가능하기 때문에, 이로써 사용자는 MHC에 결합할 수 있고 항원에 반응할 T 세포에 적절하게 제시될 수 있는 에피토프를 동정할 수 있다. 따라서, 본 발명은 임의의 특정 표적이나 의학적 병태에 제한되지 않고, 오히려 유용한 임의의 공급원의 모든 MHC 에피토프들을 망라한다.
지난 수년간, 면역요법이 여러 유형의 암, 예컨대 흑색종, 신세포 암종 및, 보다 최근에는 폐암에 대한 유망한 치료법으로 등장하였다 (5). 특정 종양 관련 항원에 대한 항종양 면역 반응의 발생은 정상 조직에 유해한 효과가 거의 없고 독성을 최소화하면서 잠재적으로 신생물(종양) 세포 사멸을 촉진할 수 있다 (5). 암/고환 항원 (CTA)은 고환에 한정되어 발현하고 정상 조직에서는 발현되지 않는 단백질 부류이다. 흥미롭게도, CTA는 많은 종양들에서 mRNA 및 단백질 수준으로 흔히 발현된다 (6-10). 보다 최근에는, CTA인 NY-ESO-1 및 MAGE-A2/3/4/6이 비소세포 폐암 (NSCLC) 1차 종양 내에서 검출된 바 있는데, 이들의 면역원성은 이들이 잠재적으로 유효한 폐암 백신을 위한 유망한 표적임을 시사하는 것이다 (11-14). 본 발명자들은 이전에 난소암, 다발성 골수종 및 전립선암에서 CTA인 SP17, AKAP-4, 로포린(Ropporin) 및 PTTG1의 잠재적 면역요법 표적물로서의 타당성을 검증한 바 있다 (6, 15-17). 폐암 면역요법을 위한 잠재적 표적물로서 사용될 수 있는 신규한 항원을 동정하기 위한 노력으로, 본 발명자들은 본원에서 폐암 환자들의 혈청에서 CTA 특이적 항체 (Ab)의 존재를 측정함으로써, NSCLC 세포주 및 NSCLC 환자들의 1차 종양 샘플에서 SP17, AKAP-4 및 PTTG1의 RNA 및 단백질 발현 패턴과 이들의 면역원성을 입증하였으며, 자가 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)를 사용하여 시험관내에서 CTA-특이적 세포독성 항-종양 반응을 발생시킬 수 있다는 가능성도 입증하였다.
NSCLC는 종양 내로 침윤하는 T 세포의 빈도수가 낮기 때문에 조직학적으로 약한 면역원성을 띄는 것으로 생각되어 왔으나 (21), 뮤린 NSCLC 모델을 사용한 연구들은 DC 기반의 접근법을 사용하여 유효한 면역 반응을 활성화시키는 것이 가능함을 보여주었다 (22, 23). 또한, 종양 항원 특이적 T 세포 반응이 NSCLC를 갖는 환자에게서 감지되었는데 (23), 이는 특정 NSCLC-관련 항원들을 동정하여 이들을 최적의 형태로 면역계에 제시하는 것이 통상 이러한 질환에서는 부재하거나 불활성인 종양 특이적인 효과기 T 세포를 생성할 수 있음을 의미한다 (24). 표준 치료법과 관련된 환자의 생존율을 향상시키고 치사율을 감소시키는데 있어서 면역요법의 잠재적 역할은 최근에 NSCLC를 갖는 환자에서 임상 백신 시험의 메타-분석을 통해 입증된 바 있다 (25). 면역요법 기반의 항암 전략을 연구할 때, 백신의 표적이 될 항원을 선택하는 것은 중요한 단계이다 (5). 이상적인 표적은 정상 세포에서는 발현하지 않지만 암세포에서는 선택적으로 발현되는 높은 면역원성을 갖는 단백질이어야 한다 (5, 10). CTA는 이들의 종양에 고도로 한정적인 발현 패턴과 면역원성 때문에 종양 면역요법에 특히 적합한 종양 관련 항원이다 (7, 9).
본 발명은 NSCLC의 면역요법에서 3개의 CTA, 즉 SP17, AKAP-4 및 PTTG1의 용도를 제공한다. 본 발명자들은 정상 조직, 3개의 NSCLC 세포주, 하나의 정상 기관지 세포주, 17명의 NSCLC 환자의 1차 종양 세포 및 8명의 건강한 시험 대상자의 기관지 상피 세포의 패널에서 3개의 CTA, 즉 SP17, AKAP-4 및 PTTG1의 차등 발현을 처음으로 분석하였다. 고환을 제외하고는, 종양이 아닌 조직들은 그 어떤 것도 선택된 CTA에 대해 RNA 수준으로 발현하지 못하였다 (7, 10). NSCLC 세포주는 SP17, AKAP-4 및 PTTG1 전사체 및 단백질을 발현하였던 반면, 정상 기관지 상피 세포주는 약한 SP17 RNA 발현만을 나타내었다. 이는 SP17이 섬모 체세포 상피(기도의 상피 포함)에서 발현됨을 보여주는 본 발명자들의 이전 보고서의 내용과 일치한다 (26). 흥미롭게도, 독자적인 전임상 시험들은 SP17-유도된 면역요법이 섬모 세포에서 SP17 발현과 관련된 어떤 독성도 유발하지 않고 있음을 강하게 시사하고 있다 (16, 27, 28). 환자들에서 유래한 모든 폐암 조직은 전사 및 번역 수준에서 SP17 발현을 나타내었던 반면, 대부분의 시험 샘플은 또한 AKAP-4 및 PTTG1 발현을 나타내었다. 단백질 발현에 대한 결과들에 대해서는 유세포 분석법 및 면역형광법에 의해서 일관된 결과를 가짐을 독립적으로 확인하였다. 17명의 NSCLC 대상체 중에서 16명의 종양은 연구된 3개의 CTA 중 2개 이상에서 발현을 나타내었는데, 이는 이 질환에 있어서의 이들의 잠재적 중요성을 시사하는 것이다. 면역요법을 위한 표적으로서 기능하기 위한 단백질은, 면역원성으로 알려진 특징인 강하고 측정가능한 면역 반응을 유발할 수 있어야 한다. 본 발명자들은 대부분의 NSCLC 환자들의 혈청이 2개 이상의 CTA-특이적 항체에 대해 양성임을 발견하였으며, 5번 환자만이 항-AKAP-4 또는 항-PTTG1 IgG가 아닌 항-SP17을 나타내었다. 종양 조직에서는 mRNA와 단백질 발현 데이터 간에는 완벽하게 일치하였던 반면, 혈청에서 항-CTA 항체로서 측정되는 체액성 항-종양 반응은 더 이질적인 결과를 초래하였다. 예를 들어, 3명의 NSCLC 환자 (#2, 13, 14)들은 항-SP17 음성으로 분류되었음에도 불구하고, 이들의 종양은 SP17을 발현하였다. 흥미롭게도, 모든 AKAP-4- 또는 PTTG1-양성 환자들도 그들의 혈청에서 상응하는 특이적 자가항체를 나타내었다. 샨 (Shan Q.) 등에 의한 최근의 연구 (29)에서는 72개의 CTA를 포함하는 저밀도 단백질 마이크로어레이를 제조하고 이를 NSCLC 환자 및 건강한 시험 대상체의 혈청으로 탐침시켰다. 이 연구원들은 NSCLC 환자의 혈청에서 NYESO-1, XAGE-1, ADAM29 및 MAGEC1 Ab가 검출되었음을 보고하였다. 이러한 발견은 항-CTA 항체가 NSCLC에서 진단 도구로서 사용될 수 있음을 의미한다.
SP17, AKAP-4 및 PTTG1 면역원성이 CTA/종양-특이적 CTL 반응을 생성하는지를 알아보기 위해, 본 발명자들은 CTA-로딩된 수지상 세포 (DC)에 대한 T 세포 반응을 검사하였다. DC의 사용은 종양 항원-특이적 T 세포 반응의 자극을 위해 널리 알려진 방법이며, 본 발명자들도 이전에 이 기법을 MM, 자궁암 및 전립선암에서 사용한 바 있다 (6, 15, 30, 31). PBMC로부터 CTA-특이적 CTL을 생성할 수 있는지의 가능성을 연구하기 위해, 본 발명자들은 종양 세포에서 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 단백질 발현에 대해 양성으로 검증된 5명의 환자를 선별하였다. CTA를 제시하는 DC로 자극된 환자들의 PBMC는 자가 폐암 세포 및 NSCLC 유래의 세포주에 대하여 유의미한 용해 활성을 나타내었다. 관찰된 세포독성 효과는 HLA 클래스 I 양성 표적에만 제한적이었는데, 이는 항-HLA 클래스 II 항체가 아닌 항-HLA 클래스 I 항체에 의해 그 효과가 차단되었기 때문이다. CTL 용해 활성에 대한 항원 특이성은 CTA-음성 CRL-2503 세포에 대해, 또는 감작되지 않은 DC 또는 HPV E7 항원이 로딩된 DC에 대한 차후 노출에 대해 세포독성 반응을 생성할 수 없다는 사실로서 확인되었다. 사이토카인 발현 분석을 통하여, 증가된 IFN-γ 및 TNF-α와 감소된 IL-4, IL-5 및 IL-10 수준으로 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명자들의 DC 기반의 CTL 생성 프로토콜이 자극된 PBMC에서 강한 Th-1 분극을 유도함을 알 수 있었다 (6, 16, 19, 31-33). NSCLC 환자가 면역요법에 대한 유의미한 반응에 부정적인 영향을 주는 (35) 비정상적인 Th-2 유형의 사이토카인 패턴을 나타내었기 때문에 (34), T-헬퍼 Th-1 프로파일을 자극하는 CTA 로딩된 DC의 역량은 임상적으로 유의미하다는 점은 가능하다 (그러나 본 발명을 제한하는 것은 아님) (36). 효과기 T 림프구의 활성화는 ELISPOT 분석에 의해 추가로 입증되었는데, 이는 CTA가 로딩된 DC로 프라이밍되고 자가 종양 세포에 노출된 PBMC에서 IFN-γ를 발현하는 세포의 빈도수가 높음을 밝혀낸 것이다. 이는 IFN-γ가 NSCLC 성장에 현저한 억제 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌기 때문에, 유의미한 발견이다 (37). 시험관내 활성 CTA-특이적인 면역 반응을 이끌어 낼 수 있다는 것은, NSCLC 세포에 의한 CTA의 발현이 치료 적합성을 가져 이러한 질병에 대한 신규한 면역요법 전략을 고안하기 위한 근간이 될 수 있음을 의미한다. 더욱이, 효과기 T 세포에 효과적으로 CTA를 제시하기 위해 시험관내 조작된 DC는 NSCLC 종양의 미세환경에서 보이는 면역억제 현상을 극복할 수 있기 때문에, 이러한 질병에 대하여 효과적인 백신접종 전략의 개발을 수행할 수 있게 해준다 (38-40).
본 발명은 CTA: SP17, AKAP-4 및 PTTG1이 NSCLC에서 선택적으로 발현됨과, 이들의 발현이 특정 CTL-매개된 항종양 반응을 생성하는데 사용될 수 있다는 점을 보여주고 있다. 다발성 골수종, 난소암 및 전립선암에서 SP17, AKAP-4 및 PTTG1의 발현과 면역원성 (6, 16, 17, 19, 31, 32), 그리고 이제 NSCLC에서의 이들의 발현과 면역원성은, CTA-주도의 백신접종 전략을 가지고 이러한 CTA 발현 종양의 표적화를 이용할 수 있음을 의미한다.
NSCLC 세포주인 CRL-5928 (편평세포암종), CRL-5922 (선암종), 그리고 불멸화시킨, 종양을 형성하지 않는 인간의 기관지 상피 세포주인 CRL-2503 (복제 원점이 결함이 있는 SV40 거대 T 플라스미드로 형질감염시켜 확립됨)은 미국 세포주·균주은행 (American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 마나사스 소재)으로부터 수득하여, 37℃ 및 5% CO2에서 10% V/V FBS (미국 캘리포니아주 칼스바드에 소재하는 인비트로겐사 제조)로 보충된 RPMI-1640 배지 (미국 캘리포니아주 칼스바드에 소재하는 인비트로겐사 제조) 중에서 유지시켰다.
본 발명자들은 외과적 수술 절차로 얻은 17개의 NSCLC 종양 샘플과 기관지 생검을 거친 건강한 시험 대상자로부터 채취한 8개의 샘플을 평가하였다. 앞서 기술된 바와 같이 통상적인 혈액 시험의 시간대에 혈청을 수집하였다 (6). 인간 시험 대상체의 재료는 지역 윤리 위원회(local ethics committee)의 승인과 환자의 사전 동의를 얻어 수득하였다. 펀치 생검한 재료를 다지고 조직 단편들을 완전 배지 (10% FBS, 20 mM HEPES 완충액, 100 U/mL 페니실린, 100 mg/mL 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI-1640 배지) 중에 플레이팅하였다. 세포들을 분석하기 전에 5% CO2 및 37℃에서 24시간 동안 유지시켰다. 정상 조직 패널은 어플라이드 바이오시스템즈사(Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)로부터 입수하였다. SP17: 5'Sp17 PCR 서열번호 1 - 5'-GGC AGT TCT TAC CAA GAA GAT-3'; 3'Sp17 PCR 서열번호 2 - 5'-GGA GGT AAA ACC AGT GTC CTC-3'; AKAP-4: 서열번호 3 - 5'-GCG TAC TCT GAT ACT ACA ATG ATG-3' 및 서열번호 4 - 5'-GGG 6 GTT TTG GGT AAA GTC A-3'; PTTG1: 서열번호 5 - 5'-GGT TTA AAC CAG GAG TGC CGC-3' 및 서열번호 6 - 5'-AAT TCA ACA TCC AGG GTC GAC AG-3'; β-액틴: 서열번호 7 - 5'-CGT CTT CCC CTC CAT CG-3' 및 서열번호 8 - 5'-CTC GTT AAT GTC ACG CAC-3' (35 사이클, 55℃의 어닐링 온도). PCR 산물은 예상되는 크기의 DNA 밴드를 위해 에티디움 브로마이드 아가로스 겔 상에 가시화시켰다. 모든 결과들은 3개의 독립적인 RT-PCR 실험에서 확인하였다.
약 400,000개의 세포를 PBS 1X로 세척하고 완충된 파라포름알데히드 (PBS 1X 중 4% W/V, pH=7.4)로 고정화시켰다. 이후, 세포들을 막투과성 완충액 (PBS 중 0.3 % V/V 사포닌)을 사용하여 얼음통 안에서 5분간 막투과시키고, 특정한 1차 Ab: 염소 항-인간 SP17, 염소 항-인간 AKAP-4 [양자 모두 미국 캘리포니아주 산타 크루즈에 소재하는 산타 크루즈 바이오테크놀로지사(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)로부터 입수함], 또는 래빗 항-인간 PTTG1 [미국 콜로라도주 리틀턴에 소재하는 노버스 바이오로지컬스, 엘엘씨(Novus Biologicals, LLC)로부터 입수함]을 사용하여 항온배양하였다. 음성 대조군은 동량의 일치되는 동형 Ab (미국 콜로라도주 리틀턴에 소재하는 노버스 바이오로지컬스, 엘엘씨)로 항온배양된 세포를 이용하여 수득하였다. 얼음통 안에서 1시간의 항온배양 후, 세포들을 막투과성 완충액 중에서 3회 세척하고, 이후 적절한 FITC-결합된 2차 항체 [미국 캘리포니아주 산호세에 소재하는 BD 바이오사이언시즈(Biosciences)사 제조]를 사용하여 얼음통 안에서 20분간 항온배양하였다. FACS-Canto 유세포 분석기 (BD)를 사용하여 형광 강도를 측정하였다.
CTA 발현의 면역형광법에 의한 평가를 앞서 기술된 바와 같이 수행하였다 (15). 20,000개의 세포를 세포원심분리기에 넣고 슬라이드라이트[SlideRite, 피셔(Fisher)사 제조]로 고정시킨 후, 밤새 통풍 건조시켰다. 각 샘플을 4℃, 15분간 0.1% Triton X-100 시트르산나트륨 완충액 중에서 막 투과시킨 후, 세포들을 유세포 분석법에 기술된 특정된 1차 항체 (PBS/BSA 0.1% 중에서 1:100 희석)를 사용하고, 이후에는 피코에리트린이 결합된 래빗 IgG 2차 항체 (1:500 희석, 7 Abcam)를 사용하여 4℃ 습식 챔버 중에서 밤새 항온배양하였다. 결과를 역상 형광 현미경 (레이저가 구비된 올림푸스 IX71 역상 현미경)으로 분석하고, 60X 대물 배율로 사진을 촬영하였다. 표준 DAPI 염색을 사용하여 핵을 검출하였다.
폴리스티렌 96-웰 플레이트를 50㎕의 카보네이트 코팅 완충액 (10㎍/웰) 중에서 부드러운 교반 하에 23℃에서 2시간 동안 인간의 재조합 단백질 (SP17, AKAP-4 또는 PTTG1, 모두 미국 콜로라도주 리틀턴에 소재하는 노버스 바이오로지컬스, 엘엘씨로부터 입수함)을 사용하여 코팅하였다. 100㎕의 PBS로 2회 세척 후, 비특이적인 결합 부위들을 23℃에서 1시간 동안 PBS 중의 1% W/V BSA로 차단시켰다. 이후, BSA를 제거하고 50㎕의 혈청을 첨가하였다 (PBS 중에서 1:5 희석). 34℃에서 1시간의 항온배양 후, 플레이트들을 100㎕의 세척 완충액 (PBS 중의 0.05% V/V Tween-20)으로 2회 세척하고, HRP-결합된 마우스 항-인간 IgG (Abcam, PBS 중 1:4,000 희석)로 항온배양하였다. 22℃ 암실에서 1시간의 항온배양 후, 플레이트들을 100㎕의 세척 완충액으로 2회 세척한 후, 22℃에서 5분간 암실에서 HRP 기질 용액 (Kpl ABST
퍼옥시다아제 기질 시스템)으로 항온배양하였다. 흡광도를 405 nm에서 판독하였다 (0.1s/웰). 음성 대조군 (시판되는 항체로 항온배양된 항원이 없는 웰)의 흡광도는 혈청으로 항온배양된 웰 중에서 수득된 것에서 차감하였다.
헤파린을 첨가한 혈액을 피콜-하이페크(Ficoll-Hypaque) 농도 구배로 원심분리하여 환자 5명의 PBMC를 분리하였다. PBMC를 3mL의 RPMI-1640 배지와 10% FBS를 사용하여 8-10 x 106 개의 세포/웰로 6-웰 배양 플레이트 내에 씨딩하였다. 37℃, 5% CO2에서 2시간 후, 본 발명자들은 부착되지 않은 세포는 제거하고, 부착된 세포를 10% FBS, 1000 IU/mL 인터루킨 4 (IL-4) 및 800 IU/mL 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 8 (GM-CSF)로 보충된 RPMI-1640 중에서 배양하였다. 1주일 배양 후, DC를 수확하고 기술된 바와 같이 인간 재조합 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1로 감작시켰다 (6, 15).
DC를 2회 세척하고 50mL의 폴리프로필렌 튜브 중에 넣어 두었다. 재조합 단백질들을 양이온성 지질 DOTAP (독일 만하임 소재의 로슈사 제조)과 실온에서 20분간 혼합하고, 간헐적으로 교반하면서 37℃에서 3시간 동안 DC에 첨가하였다.
항원으로 감작된 DC를 10% 자가 혈청, 10 IU/mL의 IL-2 및 5 ng/mL의 IL-7을 넣은 RPMI-1640 중에서 1:10의 비율로 신선한 자가 PBMC (6)와 함께 37℃, 5% CO2에서 공동 배양하였다. 방사선 조사된 자가 PBMC 피더(feeder) 세포 및 재조합 CTA (50㎍/mL)를 1주일에 한번 첨가하였고, IL-2는 3일 간격으로 첨가하였다. 재조합 CTA는 독소센서 발색성 LAL 내독소 분석 키트[ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit, 뉴저지주 08854에 소재하는 젠스크립트 USA 인코포레이티드사 (GenScript USA Inc.) 제조]를 통해 수행된 내독소 검출 분석에 의해 확인된 바와 같이 내독소가 없었다.
CTA-자극된 T 세포의 세포독성 활성을 시험하기 위해, 본 발명자들은 제조업자의 지침에 따라 DELFIA® EuTDA 시스템 (미국 소재의 퍼킨 엘머사 제조)을 사용하는 EUROPIUM-기반의 세포독성 분석법을 수행하였다. 표적 세포는 자가 DC (자극시키지 않았거나 폐암과 연관이 없는 HPV-E 항원으로 감작됨) 및 자가 종양 세포를 (40:1, 20:1 또는 10:1의 효과기-표적물의 비율로) 포함한다. HLA 클래스 I (W6/32) 및 HLA 클래스 II (L243)에 대한 항체를 25㎍/mL의 농도로 첨가하여 HLA에 한정된 세포독성을 평가하였다 (고정된 20:1의 효과기:표적 세포의 비율).
4시간 공동배양 (20:1 효과기:표적물 비율)한 활성화된 PBMC 및 자가 종양 세포의 상청액에 대해 ELISA를 수행하였다. 인간 IL-4, IL-5, IL-10, 인터페론 (IFN)-γ 및 종양 괴사 인자 α(TNF)-α를 검출하기 위해 제조업자의 지침에 따라 U-CyTech 샌드위치 ELISA 키트 (네덜란드 위트레흐트에 소재하는 U-CyTech사 제조)를 사용하였다. TMB 마이크로웰(Microwell) 기질을 첨가하여 반응을 진행시키고, 2M H2SO4를 첨가해 반응을 중지시켰다. 흡광도를 450 nm에서 판독하였다. 데이터는 활성화된 PBMC로 측정된 OD를 항원이 없이 자가 DC로 배양된 PBMC로 수득된 OD로 나눈 것으로서 제시된다 (OD 비율).
환자들의 CTL에 의한 IFN-γ 발현 (20:1 효과기:표적물 비율)에 대해서는, 본 발명자들이 다른 곳에서 기술한 바 (15)와 같이, 제조업자의 지침에 따라 ELISPOT 분석법 (네덜란드 위트레흐트에 소재하는 U-CyTech사 제조)을 이용하여 평가하였다. 스팟의 계수는 AID ELISPOT 판독기 시스템 (미국 메릴랜드주 콜롬비아에 소재하는 셀 테크놀로지 인코포레이티드사 제조)을 이용하여 수행하였다.
도 1a 내지 1c는 CTA 발현의 RT-PCR 분석을 나타내는 사진이다. 도 1a는 정상 조직 패널로부터 제조된 cDNA에 대한 PCR을 보여주는 겔 사진이다. 도 1b는 NSCLC 세포주 CRL-5928 (1), CRL-5922 (2), 또는 정상 기관지 상피 유래 세포인 CRL-2503 (3)으로부터 제조된 cDNA에 대한 PCR을 보여주는 겔 사진이다. 도 1c는 NSCLC 1차 종양으로부터 제조된 cDNA에 대한 PCR을 보여주는 겔 사진이다. 양성 대조군은 고환으로부터 제조된 cDNA이었던 반면, 음성 대조군은 사전의 역전사 없이 (RT 없음) RNA를 사용하여 수행된 PCR (RT 없음)및 주형 없이 수행된 PCR (주형 없음)이었다. β-액틴을 사용하여 성공적인 역전사를 확인하였다. SP17/AKAP-4/PTTG1 RNA가 종양이 없는 세포주 및 조직들에 의해서가 아닌, NSCLC 세포주 및 1차 종양에 의해 선택적으로 발현된다는 사실을 발견하였다. SP17, AKAP-4 및 PTTG1의 유전자 발현은 도 1a에 보이는 것과 같이 정상 조직의 패널의 RNA를 사용하여 RT-PCR로 측정하였다. 3개의 세포주 (2개는 NSCLC에서 유래하였고, 1개는 정상 기관지 상피로부터 유래함)를 도 1b에 나타내었고, NSCLC로 새로이 진단된 환자 17명의 집단을 도 1c에 나타내었다. 양성 대조군으로서, 본 발명자들은 고환에서 CTA 발현을 분석하였던 반면 (6, 16, 17), 음성 대조군은 역전사를 거치지 않은 (오염된 유전체 DNA의 증폭 가능성을 배제하기 위함) 군집 RNA를 사용하여 수득하였고, 여기서 RT-PCR은 주형 없이 수행하였다. 그 어떤 정상 조직도 SP17, AKAP-4 및 PTTG1에 대해서는 검출가능한 RNA 수준을 발현하지 못하였던 반면 (도 1a에 보이는 바와 같음), 정상 기관지 세포주인 CRL-2503은 SP17 RNA의 약한 발현을 나타내었다 (도 1b에 보이는 바와 같음). NSCLC 세포주 CRL-5928 및 CRL-5922는 평가된 3개의 CTA에 대해 현저한 RNA 발현을 나타내었다 (도 1b에 보이는 바와 같음). 또한, 17명의 NSCLC 환자의 종양은 모두 SP17에 대해 양성이었으며, 종양의 65%는 AKAP-4를 발현하였으며(11/17), 59%는 PTTG1을 발현하였다 (10/17) (도 1c에 보이는 바와 같음).
도 2는 표시된 항체로 배양된 세포 (채색된 히스토그램) 및 상응하는 동형 대조군 (흑색 히스토그램)의 유세포 분석을 나타낸다. FACS-Canto 유세포 분석기 (BD)를 사용하여 FL1 채널 (Log 스케일) 내의 FSC/SSC-게이팅된 세포 (10,000개의 사건)에 대해 형광 강도를 측정하였다. 세포주 및 1차 환자의 샘플에 있어서 SP17, AKAP-4 및 PTTG1에 따라 그래프를 정렬하였다. SP17, AKAP-4 및 PTTG1은 NSCLC 세포주 및 1차 환자의 샘플에서는 단백질 수준으로 발현되었지만, 정상 기관지 상피에서는 발현되지 않았다. CTA 패널의 단백질 수준의 발현을 연구하기 위해, 본 발명자들은 막 투과된 세포의 CTA-특이적 항체 염색에 의한 유세포 분석법을 수행하였다. 도 2는 SP17, AKAP-4 및 PTTG1가 정상 기관지 유래의 세포주에 의해서가 아니라, NSCLC 유래의 세포주에 의해 발현됨을 보여주고 있다. 중요한 점은, SP17 유전자가 약하게나마 발현되었음에도 불구하고, 종양이 없는 CRL-2503 세포는 SP17 단백질에 대해 음성이었다는 것이다 (도 1b 및 2). 본 발명자들은 환자 유래의 NSCLC 종양/조직에 대해 유사한 분석을 수행하였는데, 이는 RT-PCR 데이터와 완전하게 일치하였다. 도 2는 3명의 환자에 대한 대표적인 결과를 보여주고 있다. CTA 발현의 특이성은 평가된 건강한 한 대상체로부터 유래한 조직에 있어서 SP17, AKAP-4 및 PTTG1 양성 염색이 부재했던 것에 의해 확인되었다 (예를 들어, 도 2에 대표적인 결과가 도시되어 있다). 종양 세포 및 정상 세포에서 선택된 CTA의 발현을 추가로 평가하기 위해, 본 발명자들은 세포 원심분리된 NSCLC 세포주, 정상 기관지 세포주 및 1차 종양 유래의 세포에 대해 면역형광 분석을 수행하였다.
도 3은 NSCLC 세포주인 CRL-5928, CRL-5922에 대해, 정상 기관지 상피 유래의 세포인 CRL-2503 및 한 명의 대표 환자에 대해 수행된 면역형광분석을 보여준다. NSCLC 세포주인 CRL-5928, CRL-5922에 대해, 정상 기관지 상피 유래의 세포인 CRL-2503 및 한 명의 대표 환자(#7)에 대해 대표적인 면역형광분석을 수행하였다. 본 발명자들은 SP17, AKAP-4 및 PTTG1에 대해 세포질 내 양성 염색으로 나타내었다 (녹색 표시). 역형광 현미경 (올림푸스 IX71)을 사용하여 60X 배율로 사진을 촬영하였다. SP17, AKAP-4 및 PTTG1에 대하여 일어날 수 있는 체액성 반응을 측정하기 위해, 본 발명자들은 간접 ELISA를 이용하여 NSCLC 환자의 혈청 내에 순환하는 CTA-특이적 IgG 자가항체의 수준과 건강한 대상체에서의 이들의 수준을 비교하였다. ELISA 신호가 건강한 대상체에서 나타나는 평균 신호보다 3 표준편차 이상 높은 경우, 대상체는 양성으로 간주된다 (20).
도 4a 내지 4c는 SP17, AKAP-4 및 PTTG1에 있어서 순환하는 CTA-특이적 IgG의 검출을 위한 ELISA 데이터의 그래프이다. 도 4a 내지 4c는 순환하는 CTA-특이적 IgG의 검출을 위한 ELISA이다. 그래프들은 3회에 걸쳐 수행한 연구로부터 산출된 평균 OD 값을 도시하고 있다 (사각형, NSCLC 환자의 혈청; 다이아몬드형, 건강한 대상체의 혈청). 가로로 그은 선은 건강한 대조군 그룹으로부터 수득한 평균값을 3배하여 산출된 양성 컷오프(positivity cut-off)를 나타낸다. RT-PCR, 유세포분석 및 면역형광의 발현 데이터와 동일하게, 도 4a 내지 4c는 대부분의 NSCLC 환자가 CTA 특이적 순환 자가항체를 나타내고 있음을 보여준다.
도 5a 내지 5f는 CTL의 활성 및 특이성을 분석한 그래프이다. 히스토그램은 표시된 서로 다른 조건 하에서 비방사성 EUROPIUM-기반의 분석법을 통해 수득한 비용해도(specific lysis)의 백분율을 나타낸다. 왼쪽 패널은 효과기 세포 (E): 표적 22 (T) 세포의 서로 다른 비율에서의 CTL 활성을 보여주고 있다. 막대들은 3번 수행한 실험의 평균치를 나타내며, 오차 막대들은 표준 편차를 나타낸다. 오른쪽 패널은 CTL의 특이성을 분석한 것을 나타낸다. 막대들은 선택된 5명의 환자에 대해 수행한 실험으로부터 수득한 평균값을 나타내며, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. HLA 클래스 I (W6/32) 및 HLA 클래스 II (L243)에 대한 항체를 25㎍/mL의 농도로 첨가하여 HLA에 한정된 세포독성을 평가하였다. CTL은 세포독성 T 림프구를 의미하며; DC는 수지상 세포; HLA는 인간 백혈구 항원; E7은 HPVE7 항원; PBMC는 말초 혈액 단핵구 세포를 의미한다. 본 발명자들은 도 5a 내지 f 왼쪽 컬럼에 보이는 바와 같이 5명의 환자의 자가 종양 세포를 효율적으로 사멸시킬 수 있는 CTL을 성공적으로 제조하였다. 이 분석을 위해, 본 발명자들은 종양 세포에서 단백질 수준으로 특정 CTA 발현을 나타내는 환자를 선택하였다. 세포독성 효과의 특이성은 자가 종양 세포 및 NSCLC-유래의 세포주의 높은 용해도 백분율 (40% 내지 80% 이상)에 의해 뒷받침되는 반면, 종양이 없는 세포 (DC, 관련이 없는 HPV-E7 항원으로 감작된 DC 및 정상 기관지 유래의 세포주인 CRL-2503)는 <10%에서 용해되었다 (도 5a 내지 f, 오른쪽). HLA 클래스 I 제한은 도 5a 내지 f 오른쪽 컬럼에 보이는 바와 같이, HLA 클래스 II 분자가 아니라 단일 형태의 HLA 클래스 I 분자에 대한 항체에 의한 용해 억제로 나타나 있다.
도 6a, 6c 및 6e는 표시된 사이토카인의 수준에 대해 분석한 ELISA이며, 도 6b, 6d 및 6f는 자가 종양 세포와 함께 공동배양된 환자의 CTL에 의한 IFN-γ발현의 ELISPOT 분석이다. 도 6a, 6c 및 6e는 표시된 사이토카인의 수준에 대해 분석된, 자가 종양 세포 및 CTA로 감작되거나 변형되지 않은 DC로 자극된 PBMC의 공동 배양물 (20:1 효과기:표적물 비율)의 상청액에 대한 ELISA이다. 모든 측정은 3회 수행하였다. 결과는 활성화된 PBMC로 측정된 평균 OD를 항원이 없이 자가 DC로 항온배양된 PBMC로 수득된 평균 OD로 나눈 것으로서 나타냈다 (OD450 비율). 도 6b, 6d 및 6f는 재료 및 방법 섹션에서 상술한 바와 같이 ELISPOT 분석법을 이용하여 평가한, 자가 종양 세포와 공동배양한 환자의 CTL에 의한 IFN-γ 발현 (20:1 효과기:표적물 비율)의 ELISPOT 분석이다. 스팟의 계수는 AID ELISPOT 판독기 시스템 (미국 메릴랜드주 콜롬비아에 소재하는 셀 테크놀로지 인코포레이티드사 제조)을 이용하여 수행하였고, 106개의 PBMC 마다 정규화하였다. 결과를 3회 수행한 분석의 평균 ± 표준 편차로 나타내었다. Th1 효과기 표현형에 대한 T 세포 활성화 및 분극은 사이토카인 발현의 ELISA 기반 측정에 의해 확인할 수 있었다: CTA-감작된 DC를 사용한 자극 및 종양 세포와의 공동배양 후, IFN-γ및 TNF-α의 수준은 50배 이상 증가되었던 반면, IL-4, IL-5 및 IL-10은 실질적으로 변화하지 않았다 (도 6a, 6c 및 6e에 보여진 바와 같음). IFN-γ에 대한 ELISPOT 결과로, 자가 종양 세포로 공동배양된 로포린-제시 DC를 사용하여 활성화된 PBMC 중에서 IFN-γ를 생성하는 세포의 발생 빈도가 높게 증가함이 추가로 확인되었다 (도 6a, 6c 및 6e).
SP17/AKAP-4/PTTG1 RNA는 종양이 없는 세포주 및 조직에서가 아니라, NSCLC 세포주 및 1차 종양에 의해 선택적으로 발현된다.
SP17, AKAP-4 및 PTTG1의 유전자 발현은 정상 조직 (도 1a), 3개의 세포주 (2개는 NSCLC에서 유래하였고, 1개는 정상 기관지 상피로부터 유래함, 도 1b) 및 NSCLC로 새로이 진단된 환자 17명의 집단(도 1c)의 패널의 RNA를 사용하여 RT-PCR로 측정하였다. 양성 대조군으로서, 본 발명자들은 고환에서 CTA 발현을 분석하였던 반면 (6, 16, 17), 음성 대조군은 역전사를 거치지 않은 (오염된 유전체 DNA의 증폭 가능성을 배제하기 위함) 군집 RNA를 사용하여 수득하였고, 여기서 RT-PCR은 주형 없이 수행하였다(도 1a 내지 c). 그 어떤 정상 조직도 SP17, AKAP-4 및 PTTG1에 대해서는 검출가능한 RNA 수준을 발현하지 못하였던 반면 (도 1a), 정상 기관지 세포주인 CRL-2503은 SP17 RNA의 약한 발현을 나타내었다 (도 1b). NSCLC 세포주 CRL-5928 및 CRL-5922는 평가된 3개의 CTA에 대해 현저한 RNA 발현을 나타내었다 (도 1b). 또한, 17명의 NSCLC 환자의 종양은 모두 SP17에 대해 양성이었으며, 종양의 65%는 AKAP-4를 발현하였으며(11/17), 59%는 PTTG1을 발현하였다 (10/17) (도 1c).
SP17/AKAP-4/PTTG1는 정상 기관지 상피에 의해서가 아니라, NSCLC 세포주 및 환자의 1차 샘플에 의해 단백질 수준으로 발현된다.
우리의 CTA 패널의 단백질 수준의 발현을 연구하기 위해, 본 발명자들은 막 투과된 세포의 CTA-특이적 항체 염색에 의한 유세포 분석법을 수행하였다. 도 2는 SP17/AKAP-4/PTTG1가 정상 기관지 유래의 세포주에 의해서가 아니라, NSCLC 유래의 세포주에 의해 발현됨을 보여주고 있다. 중요한 점은, SP17 유전자가 약하게나마 발현되었음에도 불구하고, 종양이 없는 CRL-2503 세포는 SP17 단백질에 대해 음성이었다는 것이다 (도 1b 및 2). 본 발명자들은 환자 유래의 NSCLC 종양/조직에 대해 유사한 분석을 수행하였는데, 이는 RT-PCR 데이터와 완전하게 일치하였다. 도 2는 3명의 환자에 대한 대표적인 결과를 보여주고 있다. CTA 발현의 특이성은 평가된 건강한 한 대상체로부터 유래한 조직에 있어서 SP17/AKAP-4/PTTG1 양성 염색이 부재했던 것에 의해 확인되었다 (도 2에 대표적인 결과가 도시되어 있다). 종양 세포 및 정상 세포에서 선택된 CTA의 발현을 추가로 평가하기 위해, 본 발명자들은 세포 원심분리된 NSCLC 세포주, 정상 기관지 세포주 및 1차 종양 유래의 세포에 대해 면역형광 분석을 수행하였다. 도 3은 유세포 분석의 결과와 동일하게, 종양 세포에서 SP17/AKAP-4/PTTG1의 세포질 국소화를 나타내며, 정상 기관지 세포주인 CRL-2503에서는 그러한 현상이 아예 없거나 경계선상에 해당되는 정도의 현상이 있었다.
순환하는 CTA-특이적 자가항체는 NSCLC 환자의 혈청에서 검출가능하다.
SP17/AKAP-4/PTTG1에 대하여 일어날 수 있는 체액성 반응을 측정하기 위해, 본 발명자들은 간접 ELISA를 이용하여 NSCLC 환자의 혈청 내에 순환하는 CTA-특이적 IgG 자가항체의 수준과 건강한 대상체에서의 이들의 수준을 비교하였다. ELISA 신호가 건강한 대상체에서 나타나는 평균 신호보다 3 표준편차 이상 높은 경우, 대상체는 양성으로 간주된다 (20). RT-PCR, 유세포분석 및 면역형광의 발현 데이터와 동일하게, 도 4a 내지 4c는 대부분의 NSCLC 환자가 CTA 특이적 순환 자가항체를 제시하고 있음을 보여준다.
환자의 PBMC로부터 CTA-특이적 CTL의 생성
본 발명자들은 5명의 환자의 자가 종양 세포를 효율적으로 사멸시킬 수 있는 CTL을 성공적으로 제조하였다 (도 5a 내지 f, 왼쪽). 이 분석을 위해, 본 발명자들은 종양 세포에서 단백질 수준으로 특정 CTA 발현을 나타내는 환자를 선택하였다. 세포독성 효과의 특이성은 자가 종양 세포 및 NSCLC-유래의 세포주의 높은 용해도 백분율 (40% 내지 80% 이상)에 의해 뒷받침되는 반면, 종양이 없는 세포 (DC, 관련이 없는 HPV-E7 항원으로 감작된 DC 및 정상 기관지 유래의 세포주인 CRL-2503)는 <10%에서 용해되었다 (도 5a 내지 f, 오른쪽). HLA 클래스 I 제한은 HLA 클래스 II 분자가 아니라 단일 형태의 HLA 클래스 I 분자에 대한 항체에 의한 용해 억제로 나타나 있다 (도 5a 내지 f, 오른쪽). Th1 효과기 표현형에 대한 T 세포 활성화 및 분극은 사이토카인 발현의 ELISA 기반 측정에 의해 확인할 수 있었다: CTA-감작된 DC를 사용한 자극 및 종양 세포와의 공동배양 후, IFN-γ및 TNF-α의 수준은 50배 이상 증가되었던 반면, IL-4, IL-5 및 IL-10은 실질적으로 변화하지 않았다 (도 6a 내지 f, 왼쪽). IFN-γ에 대한 ELISPOT 결과로, 자가 종양 세포로 공동배양된 로포린-제시 DC를 사용하여 활성화된 PBMC 중에서 IFN-γ를 생성하는 세포의 발생 빈도가 높게 증가함이 추가로 확인되었다 (도 6a 내지 f, 오른쪽).
NSCLC는 종양 내로 침윤하는 T 세포의 빈도수가 낮기 때문에 조직학적으로 약한 면역원성을 띄는 것으로 생각되어 왔으나 (21), 뮤린 NSCLC 모델을 사용한 연구들은 DC 기반의 접근법을 사용하여 유효한 면역 반응을 활성화시키는 것이 가능함을 보여주었다 (22, 23). 또한, 종양 항원 특이적 T 세포 반응이 NSCLC를 갖는 환자에게서 감지되었는데 (23), 이는 특정 NSCLC-관련 항원들을 동정하여 이들을 최적의 형태로 면역계에 제시하는 것이 통상 이러한 질환에서는 부재하거나 불활성인 종양 특이적인 효과기 T 세포를 생성할 수 있음을 의미한다 (24). 표준 치료법과 관련된 환자의 생존율을 향상시키고 치사율을 감소시키는데 있어서 면역요법의 잠재적 역할은 최근에 NSCLC를 갖는 환자에서 임상 백신 시험의 메타-분석을 통해 입증된 바 있다 (25). 면역요법 기반의 항암 전략을 연구할 때, 백신의 표적이 될 항원을 선택하는 것은 중요한 단계이다 (5). 이상적인 표적은 정상 세포에서는 발현하지 않지만 암세포에서는 선택적으로 발현되는 높은 면역원성을 갖는 단백질이어야 한다 (5, 10). CTA는 이들의 종양에 고도로 한정적인 발현 패턴과 면역원성 때문에 종양 면역요법에 특히 적합한 종양 관련 항원이다 (7, 9).
이 연구에서, 본 발명자들은 NSCLC의 면역요법에서 3개의 CTA, 즉 SP17, AKAP-4 및 PTTG1의 용도를 보여준다. 본 발명자들은 정상 조직, 3개의 NSCLC 세포주, 하나의 정상 기관지 세포주, 17명의 NSCLC 환자의 1차 종양 세포 및 8명의 건강한 시험 대상자의 기관지 상피 세포의 패널에서 3개의 CTA, 즉 SP17, AKAP-4 및 PTTG1의 차등 발현을 처음으로 분석하였다. 예상했던 바와 같이, 고환을 제외하고는, 종양이 아닌 어떤 조직들도 선택된 CTA에 대해 RNA 수준으로 발현하지 못하였다 (7, 10). NSCLC 세포주는 SP17/AKAP-4/PTTG1 전사체 및 단백질을 발현하였던 반면, 정상 기관지 상피 세포주는 약한 SP17 RNA 발현만을 나타내었다. 이는 SP17이 섬모 체세포 상피(기도의 상피 포함)에서 발현됨을 보여주는 우리의 이전 보고서의 내용과 일치한다 (26). 흥미롭게도, 독자적인 전임상 시험들은 SP17-유도된 면역요법이 섬모 세포에서 SP17 발현과 관련된 어떤 독성도 유발하지 않고 있음을 강하게 시사하고 있다 (16, 27, 28). 환자들에서 유래한 모든 폐암 조직은 전사 및 번역 수준에서 SP17 발현을 나타내었던 반면, 대부분의 시험 샘플은 또한 AKAP-4 및 PTTG1 발현을 나타내었다. 단백질 발현에 대한 결과들에 대해서는 유세포 분석법 및 면역형광법에 의해서 일관된 결과를 가짐을 독립적으로 확인하였다. 17명의 NSCLC 대상체 중에서 16명의 종양은 연구된 3개의 CTA 중 2개 이상에서 발현을 나타내었는데, 이는 이 질환에 있어서의 이들의 잠재적 중요성을 시사하는 것이다. 면역요법을 위한 표적으로서 기능하기 위한 단백질은, 면역원성으로 알려진 특징인 강하고 측정가능한 면역 반응을 유발할 수 있어야 한다. 본 발명자들은 대부분의 NSCLC 환자들의 혈청이 2개 이상의 CTA-특이적 항체에 대해 양성임을 발견하였으며, 5번 환자만이 항-AKAP-4 또는 항-PTTG1 IgG가 아닌 항-SP17을 나타내었다. 종양 조직에서는 mRNA와 단백질 발현 데이터 간에는 완벽하게 일치하였던 반면, 혈청에서 항-CTA 항체로서 측정되는 체액성 항-종양 반응은 더 이질적인 결과를 초래하였다. 예를 들어, 3명의 NSCLC 환자 (#2, 13, 14)들은 항-SP17 음성으로 분류되었음에도 불구하고, 이들의 종양은 SP17을 발현하였다. 흥미롭게도, 모든 AKAP-4- 또는 PTTG1-양성 환자들도 그들의 혈청에서 상응하는 특이적 자가항체를 나타내었다. 샨 (Shan Q.) 등에 의한 최근의 연구 (29)에서는 72개의 CTA를 포함하는 저밀도 단백질 마이크로어레이를 제조하고 이를 NSCLC 환자 및 건강한 시험 대상체의 혈청으로 탐침시켰다. 이 연구원들은 NSCLC 환자의 혈청에서 NYESO-1, XAGE-1, ADAM29 및 MAGEC1 Ab가 검출되었음을 보고하였다. 이러한 발견은 항-CTA 항체가 NSCLC에서 진단 도구로서 사용될 수 있음을 의미한다.
SP17/AKAP-4/PTTG1 면역원성이 CTA/종양-특이적 CTL 반응을 생성하는지를 알아보기 위해, 본 발명자들은 CTA-로딩된 수지상 세포 (DC)에 대한 T 세포 반응을 검사하였다. DC의 사용은 종양 항원-특이적 T 세포 반응의 자극을 위해 널리 알려진 방법이며, 본 발명자들도 이전에 이 기법을 MM, 자궁암 및 전립선암에서 사용한 바 있다 (6, 15, 30, 31). PBMC로부터 CTA-특이적 CTL을 생성할 수 있는지의 가능성을 연구하기 위해, 본 발명자들은 종양 세포에서 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 단백질 발현에 대해 양성으로 검증된 5명의 환자를 선별하였다. 예상했던 바와 같이, CTA를 제시하는 DC로 자극된 환자들의 PBMC는 자가 폐암 세포 및 NSCLC 유래의 세포주에 대하여 유의미한 용해 활성을 나타내었다. 관찰된 세포독성 효과는 HLA 클래스 I 양성 표적에만 제한적이었는데, 이는 항-HLA 클래스 II 항체가 아닌 항-HLA 클래스 I 항체에 의해 그 효과가 차단되었기 때문이다. CTL 용해 활성에 대한 항원 특이성은 CTA-음성 CRL-2503 세포에 대해, 또는 감작되지 않은 DC 또는 HPV E7 항원이 로딩된 DC에 대한 차후 노출에 대해 세포독성 반응을 생성할 수 없다는 사실로서 확인되었다. 사이토카인 발현 분석을 통해, 증가된 IFN-γ 및 TNF-α와 감소된 IL-4, IL-5 및 IL-10 수준으로 확인할 수 있는 바와 같이, 우리의 DC 기반의 CTL 생성 프로토콜이 자극된 PBMC에서 강한 Th-1 분극을 유도함을 알 수 있었다 (6, 16, 19, 31-33). NSCLC 환자가 면역요법에 대한 유의미한 반응에 부정적인 영향을 주는 (35) 비정상적인 Th-2 유형의 사이토카인 패턴을 나타내었기 때문에 (34), CTA 로딩된 DC가 T-헬퍼 Th-1 프로파일을 자극하는 능력을 가질 수 있다 (그러나 본 발명을 제한하는 것은 아님). 효과기 T 림프구의 활성화는 ELISPOT 분석에 의해 추가로 입증되었는데, 이는 CTA가 로딩된 DC로 프라이밍되고 자가 종양 세포에 노출된 PBMC에서 IFN-γ를 발현하는 세포의 빈도수가 높음을 밝혀낸 것이다. 이는 IFN-γ가 NSCLC 성장에 현저한 억제 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌기 때문에, 유의미한 발견이다 (37).
시험관내 활성 CTA-특이적인 면역 반응을 이끌어 낼 수 있다는 것은, NSCLC 세포에 의한 CTA의 발현이 치료 적합성을 가져 이러한 질병에 대한 신규한 면역요법 전략을 고안하기 위한 근간이 될 수 있음을 의미한다. 더욱이, 효과기 T 세포에 효과적으로 CTA를 제시하기 위해 시험관내 조작된 DC는 NSCLC 종양의 미세환경에서 보이는 면역억제 현상을 극복할 수 있기 때문에, 이러한 질병에 대하여 효과적인 백신접종 전략의 개발을 수행할 수 있게 해준다 (38-40). CTA-의존적 면역요법은, CTA-특이적 CTL 반응이 생체 내에서 생성되어 이러한 질병에서 관찰되는 면역 관용(immune tolerance)을 극복할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해 NSCLC에 대해 개발될 수 있다 (41-44). 결론적으로, 이러한 결과들은 CTA인 SP17, AKAP-4 및 PTTG1이 NSCLC에서 선택적으로 발현됨과, 이들의 발현이 특정 CTL-매개된 항종양 반응을 생성하는데 사용될 수 있다는 점을 입증하고 있다. 본 발명자들이 앞서 다발성 골수종, 난소암 및 전립선암에서 SP17, AKAP-4 및 PTTG1의 발현과 면역원성 (6, 16, 17, 19, 31, 32), 그리고 이제 NSCLC에서의 이들의 발현과 면역원성을 확인하였다는 사실은, CTA-주도의 백신접종 전략을 가지고 CTA 발현 종양을 표적화할 수 있음을 의미한다.
본원 명세서에서 거론된 임의의 양태는 본 발명의 임의의 방법, 키트, 시약 또는 조성물과 관련하여 수행될 수 있으며, 반대의 경우도 성립된다. 또한, 본 발명의 조성물은 본 발명의 방법을 달성하는데 사용될 수 있다.
본원에 기술된 특정 양태들을 예시로서 나타냈지만, 이들로서 본 발명을 제한하려는 것이 아님은 이해할 수 있을 것이다. 본 발명의 주요한 특징은 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 양태들에서 사용될 수 있을 것이다. 해당 업계의 숙련자라면 본원에 기술된 특정 절차들에 대해 단지 통상적인 실험을 이용하고, 다양한 균등물을 사용함을 인식할 것이고, 또한 이해할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 본 발명의 범위 내인 것으로 간주되며, 청구범위에 포함된다.
본원 명세서에 언급된 모든 간행물 및 특허 출원들은 본 발명이 속하는 분야에서 숙련자들의 기술 수준을 나타낸다. 모든 간행물 및 특허 출원들은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함될 것이라고 나타난 바와 동일하게 본원에 참조로 포함된다.
단수를 나타내는 "하나"(a 및 an)라는 단어의 사용은 청구범위 및/또는 명세서에서 용어 "...을 포함하는"과 함께 사용되는 경우에는 "하나"를 의미할 수 있지만, 이는 또한 "하나 또는 그 이상", "적어도 하나", 및 "하나 또는 하나 이상"의 의미와 일치한다. 청구범위에서 용어 "또는"의 사용은, 발명에 개시된 내용에서 단지 선택성 및 "및/또는"을 가리킨다고 하는 정의를 뒷받침하고 있다고 해도, 명세서에서 그 용어가 선택만을 의미하거나, 이러한 선택이 상호 배타적임을 의미한다고 명백히 언급하지 않는 한, "및/또는"을 의미하기 위해 사용된다. 이 출원 전반에 걸쳐, 용어 "약"은 어떠한 수치가, 그 수치를 측정하는데 사용되는 장치, 방법에 있어서의 고유한 오차 변수를 포함하거나, 또는 해당 연구 대상체들 간에 존재하는 변수를 포함하는 것을 의미하기 위해 사용된다.
본원 명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같이, "...을 포함하는(comprising)" (및 "...을 포함하는"의 임의의 형태, 예컨대 "포함하다" 및 "포함하고"), "가지는(having)" (및 "가지는"의 임의의 형태, 예컨대 "가지고" 및 "가지며"), "...을 망라(포함)하는(including)" (및 "...을 망라하는"의 임의의 형태, 예컨대 "망라하다" 및 "망라하고") 또는 "...을 함유하는(containing)" (및 "...을 함유하는"의 임의의 형태, 예컨대 "함유하다" 및 "함유하고")이라는 어구들은 포괄적이거나 개방적인 어구로서, 추가의 언급되지 않은 구성요소 또는 방법 단계들을 배제하는 것이 아니다.
본원에 사용된 용어 "또는 이들의 조합"은 이 용어에 선행하여 열거된 목록들의 모든 순열 및 조합을 지칭한다. 예를 들어, "A, B, C, 또는 이들의 조합"은 A, B, C, AB, AC, BC, 또는 ABC, 그리고 만일 순서가 특정 문맥에서 중요하다면, 또한 BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC, 또는 CAB 중의 하나 이상을 포함하는 것을 의도한다. 상기 실례를 가지고 계속 살펴보면, 하나 이상의 항목 또는 용어의 반복을 포함하는 조합들, 예컨대 BB, AAA, AB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB 등도 명백히 포함된다. 해당 업계 종사자라면, 문맥상 달리 명시하지 않는 한, 임의의 조합을 갖는 항목들 또는 용어들의 수에 있어서는 통상적으로 제한이 없음을 이해할 것이다.
본원에 개시되고 청구된 모든 조성물 및/또는 방법은 본 발명에 개시된 내용을 고려하여 과도한 실험을 거치지 않고도 제조하고 실행할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법을 바람직한 양태에 관하여 기술되었지만, 해당 업계 종사자라면 본 발명의 개념, 의미 및 범위를 벗어나지 않으면서 본원에 기술된 조성물 및/또는 방법 및 방법의 단계 또는 단계의 순서에 변형을 가할 수 있음은 명백할 것이다. 해당 업계 종사자에 명백한 이러한 유사한 치환 및 변형은 첨부되는 청구범위에 의해 규정되는 바와 같은 본 발명의 의미, 범위 및 개념 내에 속하는 것으로 간주된다.
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<150> US 14/178,407
<151> 2014-02-12
<160> 8
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic primer
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ctcgttaatg tcacgcac 18
Claims (20)
- SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 종양 관련 항원 중 하나 이상을 제시하기 위해 로딩되어, 하나 이상의 폐암 세포에 의해 발현되는 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 중 하나 이상에 대하여 각각 세포독성 T 림프구 특이적 면역 반응을 발생시키는 분리된 항원 제시 세포를 포함하는, 폐암 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 항원 제시 세포가 수지상 세포인, 폐암 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 항원 제시 세포가 자가(autologous) 수지상 세포인, 폐암 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물이 상기 항원 제시 세포 내에 로딩되는 NYESO-1, XAGE-1, ADAM29 및 MAGEC1 항원 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 폐암 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물이 재조합 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 종양 관련 항원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 재조합 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1이 상기 항원 제시 세포 내에서 발현되는, 폐암 치료용 조성물.
- 인간 대상체에서 샘플을 수득하는 단계; 및
항-SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 중 하나 이상에 대하여 특이적인 샘플 내의 특이적 면역글로불린의 존재 또는 부재를 결정하는 단계
를 포함하는, 폐암을 앓고 있는 것으로 의심되거나 적어도 폐암 발생의 위험이 있는 인간 대상체를 확인하는 방법으로서,
상기 샘플 내에서 항-SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 특이적 면역글로불린 중 하나 이상의 존재는 상기 대상체가 폐암을 앓고 있거나 적어도 폐암 발생의 위험이 있음을 지시하는 것인, 방법. - 개체의 체액 샘플을 수득하는 단계;
상기 개체의 체액 샘플을 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 종양 관련 항원 중 하나 이상과 접촉시키는 단계;
체액 샘플 내에 존재하는 하나 이상의 자가항체에 결합된 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 종양 관련 항원 중 하나 이상의 복합체의 존재 또는 부재를 측정하는 단계; 및
상기 개체에 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 중 하나 이상에 특이적인 항원 제시 세포 또는 세포독성 T 세포를 제공하는 단계
를 포함하는, 암을 앓고 있는 개체의 종양 마커 프로파일을 측정하는 방법으로서,
상기 하나 이상의 자가항체는 상기 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 종양 관련 항원 중 하나 이상에 대해 면역학적으로 특이적이고; 상기 복합체의 존재는 상기 개체의 종양 마커 프로파일을 제공하며; 상기 종양 마커 프로파일은 질환 진행의 징후로서 측정되는, 방법. - 제7항에 있어서, 상기 복합체의 존재가 암이 검출되었음을 나타내는, 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 암이 폐암인, 방법.
- 하나 이상의 폐암 세포에 특이적인, SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 특이적 세포독성 T 림프구를 생성할 수 있는 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 종양 관련 항원 중 하나 이상을 포함하는 암 치료용 면역요법 조성물.
- 제10항에 있어서, 하나 이상의 항원 제시 세포를 추가로 포함하는, 암 치료용 면역요법 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 항원 제시 세포가 수지상 세포인, 암 치료용 면역요법 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 하나 이상의 항원 제시 세포가 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 종양 관련 항원을 암호화하는 펩타이드 또는 발현 구축물로 감작(pulsed)되거나 로딩되는, 암 치료용 면역요법 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 종양 관련 항원 중 하나 이상이 비소세포 폐암종으로부터 분리되는, 암 치료용 면역요법 조성물.
- 대상체로부터 샘플을 수득하는 단계;
상기 샘플 내에 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1의 존재 또는 부재를 측정하는 단계; 및
상기 개체에 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 중 하나 이상에 특이적인 항원 제시 세포 또는 세포독성 T 세포를 제공하는 단계
를 포함하는, 대상체 내에서 폐암을 검출하는 방법으로서,
상기 샘플 내의 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1의 존재는 상기 대상체가 폐암을 앓고 있거나 적어도 폐암 발생의 위험이 있음을 지시하는 것인, 방법. - 제15항에 있어서, 상기 샘플이 혈액 샘플인, 방법.
- SP17, AKAP-4 또는 PTTG1 폐암 관련 항원 중 하나 이상을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 면역 자극 항원을 발현하는 핵산 벡터를 포함하는 조성물.
- 제17항에 있어서, 상기 항원은 펩타이드 항원인, 조성물.
- 암의 치료가 필요한 포유동물에게 희석제, 비히클, 부형제 또는 불활성 성분 중 하나 이상 이외에 상승적, 치료적 유효량의 폐암 항원을 투여하는 단계;
상기 폐암 항원으로부터 특이적 세포독성 T 림프구 (CTL)를 생성하는 단계; 및
상기 특이적 세포독성 T 림프구 (CTL)로 하나 이상의 종양 세포를 표적화하는 단계
를 포함하는, 암의 치료 방법. - 제19항에 있어서, 상기 폐암 항원이 SP17, AKAP-4 또는 PTTG1인, 방법.
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