KR20150118991A

KR20150118991A - 골 손실률을 측정하는 방법

Info

Publication number: KR20150118991A
Application number: KR1020157024374A
Authority: KR
Inventors: 얀 홀
Original assignee: 노벨 바이오케어 서비시스 아게
Priority date: 2013-02-08
Filing date: 2014-02-07
Publication date: 2015-10-23
Also published as: JP2016507236A; GB201302257D0; AU2014213958B2; WO2014122279A1; CN105008549A; US20150368716A1; ZA201504764B; BR112015018886A2; CA2896980A1; EP2954067A1; AU2014213958A1; US9988682B2

Abstract

본 발명은 특히 골 고정 임플란트의 분야에서 골 손실률을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 a) 생체외 샘플에서 파골세포 및/또는 조골세포의 활성에 관한 1 이상의 표지들 또는 이들의 비의 발현 수준을 정량화하는 단계; 및 b) 1 이상의 캘리브레이션 곡선에서, a) 단계에서 얻어진 값을 보간함으로써 변연골 수준의 진행중인 손실의 함수로서 골 손실률을 결정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 방법을 수행하는 키트에 관한 것이다.

Description

골 손실률을 측정하는 방법{METHOD FOR MEASURING BONE LOSS RATE}

본 발명은, 특히 골 고정 임플란트(bone anchored implant)의 분야에서, 골 손실률(bone loss rate)을 진단하는 방법에 관한 것이다.

매년 다수의 치과 임플란트 재건 절차들이 수행된다. 임플란트 치료가 성공적인 대부분의 경우와 대조적으로, 소정 환자들은 임플란트 주위 질환(peri-implant disease: PI)을 발전시킨다. 몇몇 경우, 기계적 변연절제술을 이용한 비-수술적 치료 및 3 % 과산화수소로의 플러싱이 충분히 효과적인 치료일 수 있다. 임플란트 주위 질환이 지속되는 경우에는, 흔히 표면 변연절제술과 조합한 절제 수술이 수행된다. 질환이 있는 임플란트 부위에서의 골 결손[예를 들어, 골 피크(bone peaks)]의 수술 교정에 의해, 포켓 깊이(pocket depth)가 감소될 수 있고, 구강 위생을 촉진하는 연조직 형태학을 제공할 수 있다. 하지만, 소정 환자들은 치료에 충분히 잘 반응하지 않으며, 임플란트 주위 점막의 우수한 플라크 제어 및 최소 염증에도 불구하고, 화농 및 점진적 골 손실을 포함한 증상들이 몇몇 경우에 재발할 수 있다. 이러한 재발의 이유들은 알려지지 않는다. 임플란트 주위 질환의 병인의 개선된 이해, 및 조기 검출 및 개입을 허용하는 더 민감한 진단 도구의 개발에 대한 요구가 있으며; 이에 따라, 예민한 환자들의 임플란트 치료의 예측가능성이 증가한다. 또한, 골 손실의 징후를 나타내는 임플란트들의 생존률을 증가시키기 위해서는, 질환 진행의 초기 단계에서의 임상적 개입이 바람직하다. 이는 가능한 지속적 골 흡수의 초기 확립을 필요로 하고, 그러므로 더 민감한 기술들이 요구된다.

골 흡수는 골 흡수 세포들, 파골세포들에 의해 이루어지며, 이들은 단핵식세포들에 의해 형성된다. 손실된 뼈를 교체하는 새로운 뼈는 골-형성 세포들, 조골세포들에 의해 쌓이게 되고, 이들은 간엽 기질 세포(mesenchymal stromal cell)들에 의해 형성된다. 리모델링 공정에 관여하는 다양한 다른 세포 타입들이 전신 인자들(예를 들어, 호르몬, 림포카인, 성장 인자, 및 비타민) 및 국소 인자들(예를 들어, 사이토카인, 부착 분자, 림포카인, 및 성장 인자)에 의해 엄밀히 제어된다(WO2012/061907).

임플란트 주위 질환의 진단은 일반적으로 골 손실의 방사선사진 증거와 조합되는 임상적 측정들에 기초한다. 임플란트 주위염은 흔히 임상적으로 포켓들의 형성 및 심화(deepening), 임플란트 주위 상피 폐쇄의 파괴, 탐침시 출혈(BoP), 화농, 및 점진적 골 손실로 전환된다. 이 진단 방법들은 흔히, 임플란트 지지 조직에서의 광범위한 병리학적 변화들의 지표들로서 임플란트 주위 질환의 진단을 위해 조합하여 사용된다. 이러한 진단 방법들의 제한된 민감도 및/또는 특이도는 병리학적 변화들의 초기 검출을 어렵게 만든다.

임플란트 주위 질환을 위한 잠재적 예상 및 진단 도구로서 플라크 샘플들에서의 잇몸 열구액에서의 유전자 표지들의 분석을 이용하는 실행가능성(viability)이 가변적 결과들로 많은 입안자에 의해 연구되었다.

흔히 연구되는 표지는 인터류킨 - 1β(IL-1β)이며, 이는 면역 조절, 염증 및 결합조직 물질대사를 포함한 수 개의 생물학적 과정들에 관련되는 염증-전 사이토카인이다. IL-1β는 골 흡수를 자극하고, 골 형성을 억제한다(Panagakos 외, int J Oral Maxillofac implants 1996, 11:794-799). IL-1β은 주로 대식세포들에 의해 생성되지만, 호중구성 과립구를 포함한 다른 세포들에 의해서도 생성된다. 수 개의 연구들이 임플란트 주위 질환의 징후를 나타내는 임플란트들 주위의 열구액에서 IL-1β의 존재를 나타내었다. 건강한 부위들에 비해(Panagakos 외, int J Oral Maxillofac implants 1996, 11:794-799; Kao 외, int J Oral Maxillofac implants 1995, 10:696-701; Murata 외, Clin Oral Impl Res 2002, 13:637-643) 및 임플란트 주위 점막염 부위들에 비해(Murata 외, Clin Oral Impl Res 2002, 13:637-643), 및 대상(subject)들을 임플란트 주위염의 초기 및 후기 징후들과 비교하는 경우, 상당히 높은 수준들이 임플란트 주위염에 대해 보고되었다. 하지만, Hultin 외(Clin Oral Impl Res 2002, 13:349-358)는 임플란트 주위염과 건강한 부위들 사이에서의 IL-1β 발현의 차이가 없는 모순되는 결과들을 나타내었다.

인터류킨 -8(IL-8)은 염증전 표지(proinflammatory marker)이고, 호중구에 대한 주화성 인자이다. 이는 치주염(Nassar 외, Infection and Immunity 2002, 268-276; Goutoudi 외, Int J Dent 2012; 2012:362905) 및 임플란트 주위염(Petkovic 외, Int J Oral Maxillofac Surg 2010, 39(5):478-85)에서의 세균 침입에 대한 내재 면역 반응의 조절에 관여한다. Nowzari 외(Clin Implant Dent Relat Res 2008, 10(3):166-173)는 건강한 대상들에서의 치아 및 임플란트 주위의 사이토카인 존재를 연구하였고, 치아에 비해 임플란트 주위에서 IL-8의 2 배 증가를 발견하였다.

인터류킨 -6(IL-6)은 조혈, 염증, 면역 반응, 및 골 항상성을 조절하는 다양한 세포들에 의해 생성되는 다기능 사이토카인이다(Yoshitake 외, J Biol Chem 2008, 283:11535-11540). Liskmann 외(Int J Oral Maxillofac Implants 2006, 21(4):543-50)에 의한 연구에서, 임플란트 주위 질환을 갖는 대상들로부터의 타액 샘플들에서의 IL-6의 수준은 건강한 대상들로부터의 타액 샘플들에 비해 상당히 높았다. Konttinen 외(Int J Periodontics restorative Dent 2006, 26:135-141)는 건강한 임플란트 부위들에 비해 임플란트 주위염을 갖는 실패한 임플란트들에서 통계적으로 더 높은 수준의 IL-6을 측정하였다.

파골세포들은 단핵구/대식세포 계보의 간세포(progenitor cell)들로부터 유래하는 골 흡수 세포들이다. 파골세포 형성의 과정은 RANKL (receptor activator of NF - κB ligand ) 및 OPG(osteoprotegerin)에 의해 조율되며, 이들은 종양 괴사 인자 상과(super family)의 멤버들이다. RANKL이 파골세포 형성을 유도하는 동안, 그 대항물질인 OPG는 파골세포의 형성을 억제한다(Boyle 외, Nature 2003, 423:337-342; Leibbrandt 외, Ann NY Acad Sci 2008, 1143:123-150). 또한, OPG는 파골세포 세포자살을 감소시키는 것으로 알려졌다(Chamoux 외, J Cell Physiol. 2008, 216(2):536-42). RANKL 및 OPG는 조골세포, 섬유아세포, 내피 세포에 의해 분비된다(Corralini 외, J Cell Physiol. 2011, 226(9):2279-2286). 또한, RANKL은 활성화 T 세포들에 의해 발현된다(Saidenberg-Kermanac'h 외, Eur Cytokine Netw. 2002, 13(2):144-53). OPG 와 RANKL 간의 평형에서의 불균형이 치주염과 같은 골 파괴를 수반하는 질환들과 관련될 수 있다는 것이 제안되었다. 예를 들어, Bostanci 외(J Clin Periodontol 2007, 34:370-376)는 잇몸 열구액에서의 RANKL 및 OPG 수준들이 치은염에서가 아닌 치주염에서 반대로 조절되었다고 나타내었다; 이에 따라, 다양한 치주 질환을 나타내는 치아에 비해 건강한 치아 주위의 잇몸 열구액에서 상당히 더 낮은 RANKL/OPG 비가 기록되었다. 그럼에도불구하고, 임플란트 주위의 열구액에서의 OPG 및 가용성 RANKL의 두 연구는 임상적 파라미터들과의 통계적으로 유의한 상관관계를 나타내지 못 했다(Arikan 외, Clin Oral Impl Res 2008, 19:283-288; Monov 외, Clin Implant Dent Relat Res 2006, 8(3):135-141). 하지만, 두 연구들 모두에서 다수 샘플들은 어세이(assay)의 검출 한계 밖에 있었고, 둘 중 하나는 0으로 간주되거나 통계적 계산으로부터 제외되었다. 이에 따라, 입안자들은 제시된 데이터가 이 한계들에 관하여 해석되어야 한다고 결론지었다. 또한, 관절염의 발병에 대한 OPG의 역할이 연구되었다. 예를 들어, Liu 외(Chin Med J(Engl). 2010, 123(11):1407-12)는 순환 OPG의 수준이 초기 류마티스 관절염을 갖는 대상들에서 높았다고 보고하였다. Wnt 단백질들이 줄기 세포들의 유지 및 증식을 촉진할 수 있고(Willert 외, Nature 2003, 423(6938):448-52), Wnt 신호가 조골세포 형성에 대해 우세한 역할을 한다(검토를 위해, Yavropoulou 외, Hormones, 2007, 6(4):279-294 참조)는 것이 나타내어졌다.

카텝신 K( CatK )는 골 흡수 표지이며, 이는 활성 파골세포에서 고도로 발현된다. 건강한 부위에 비해 임플란트 주위염 부위에서 더 높은 CatK 발현이 입증되었다(Strbac 외, J Clin Periodontol 2006; 33:302-308).

오스테오칼신(OC)은 골 광화 및 칼슘 항상성에 관련되는 뼈의 칼슘-결합 단백질이다. Murata 외(Clin Oral Impl Res 2002, 13:637-643)는 건강한 부위에 비해 점막염 부위로부터의 임플란트 주위 열구액(PICF)에서 OC 발현의 증가를 나타내었으며, 한편 임플란트 주위염 부위와 점막염 또는 건강한 임플란트 부위 사이에서는 OC 수준의 차이가 보이지 않았다.

MMPs (Matrix metalloproteinases )는 손상된 조직으로부터의 콜라겐의 분해 및 제거에 관련되는 단백질분해 효소들이다. MMP들은 지질다당류 및 사이토카인과 같은 자극에 반응하여 염증 부위에 있는 세포들에 의해 분비된다(Aboyoussef 외, Int J Oral Maxillofac Implants 1998, 13:689-696). 콜라게나아제 및 겔라티나아제는 MMP 상과의 2 개의 아과(sub-family)이다. Kivelae-Rajamaeki 외(Clin Oral Impl Res 2003, 14:158-165)에 의한 발견은 증가된 수준의 MMP - 8(콜라게나아제-2)이 염증을 일으키는 임플란트 주위 질환의 활성 단계와 연계될 수 있다는 것을 나타내었다. 또한, MMP -9(겔라티나아제 B)의 발현은 연구되었다; Ma 외(Clin Oral Impl Res 2003, 14:709-713)는 MMP-9와 골 수준들 간의 연계를 나타내었지만, Aboyoussef 외(Int J Oral Maxillofac Implants 1998, 13:689-696)는 건강한 부위와 임플란트 주위염 부위 간의 어떠한 중요한 차이도 나타내지 못 했다.

MMPs와 TIMPs (tissue inhibitors of matrix metalloproteinases ) 간의 불균형은 세포외 기질, 기저막, 및 치조골의 분해를 촉발시키고, 이에 따라 치주 질환을 개시되게 하는 것으로 간주된다(Sorsa 외, Oral Diseases 2004, 10:311-318). 타액의 MMP-8, TIMP -1 및 특히 이들의 비가 진행된 치주염을 검출할 잠재적 가능성이 크다고 제안되었다(Gursoy 외, Clin Periodontol 2010, 37:487-493).

플라스미노겐 시스템은 생리학적 및 병리학적 조직 리모델링에서의 세포외 단백질분해에 있어서 가장 중요하다(Collen, Thromb Haemost 1999, 82:259-270에 의해 검토됨). 플라스민은 많은 세포외 단백질을 분해시키고 잠복해 있는 콜라게나아제 및 다른 금속단백질분해효소를 활성화시킬 수 있는 폭넓은 활성 프로테아제(broadly active protease)이다(Werb 외, New Eng J Med 1977, 296:1017-1023; Matrisian, Bioessays 1992, 14:455-463). 플라스민은 비-콜라겐성 ECM 단백질을 분할함으로써 직접적으로 세포외 기질(ECM)에 작용하고, 또한 전체 범위의 다른 효소들, 이들 중 상이한 결합 조직 단백질들에 대해 특이성을 갖는 MMPs(Matrix metalloproteinases)의 프로폼(proform)들을 활성화시킴으로써 간접적으로 작용한다. 플라스미노겐 시스템과 다른 조직 분해 시스템들 간의 상호작용을 통해, 플라스미노겐은 중요한 휴면 단백질분해 퍼텐셜을 나타내고, 그 활성의 엄격한 제어가 조직들의 온전함을 유지하는 데 중요하다. 플라스민은 그 불활성 전구체 플라스미노겐으로부터 플라스미노겐 활성화인자들(이 두 형태의 세린 프로타아제가 식별되었음: 우로키나아제 타입, u-PA, 및 조직 타입, t-PA)에 의해 형성되며, 이들은 구체적으로 이분자 1:1 공유결합 착물들의 형성을 통해 플라스미노겐 활성화인자 억제제들(PAI-1 및 PAI - 2)에 의해 억제된다. tPA 및 PAI-2의 수준들은 건강한 부위보다는 염증이 생긴 부위로부터의 잇몸 열구액(GCF)에서 더 높은 것으로 나타내어졌다(Kinnby, Biol Chem 2002, 383:85-92). 비교적 증가된 수준의 PAI-2가 치주염뿐 아니라 임신중 조직-보호 기능들과 연계되었다(Kinnby 외, J Periodont Res 1996, 31:271-277; Olofsson 외, J Periodont Res 2002, 37:60-65).

임플란트 주위 질환에 대한 상이한 치료 대안이 제시되었다. 비-수술적 요법[예를 들어, 접근 수술(access surgery)을 이용하지 않는 표면 변연절제술]은 임플란트 주위 점막염의 경우에 성공적일 수 있지만, 임플란트 주위염을 나타내는 부위들에 대해서는 덜 효과적인 것으로 나타난다고 제안되었다(Renvert 외, J Clin Periodontol 2008, 35(Suppl 8):305-315). 임상적 데이터는 수술적 치료 - 예를 들어, 전신 항생제와 조합한 표면 오염제거를 포함하는 개방 변연절제술 - 가 임플란트 주위염 병변에 대한 실행가능한 치료 선택사항일 수 있다고 제안한다(Claffey 외, J Clin Periodontol 2008, 35(Suppl 8):316-332). 하지만, 지금까지 공통 요법은 존재하지 않고, 진행된 임플란트 주위염은 치료하기 어려운 채로 유지된다. 임플란트 치조정 구역(crestal region) 주위의 변연골은 일반적으로 임플란트 건강의 중요한 지표이다. 치조정 골의 수준은 초기 임플란트 수술에서의 임플란트의 치조정 위치로부터 측정될 수 있다. 골 손실을 재는 가장 통상적인 방법은 방사선사진 평가에 의한 것이다. 따라서, 골 수준이 방사선사진 상에서 측정될 수 있고, 고정체 및 그 지대주 간의 접합으로부터 임플란트들에 대한 근심 및 원심에서(mesially and distally) 변연골의 치조정까지의 거리로서 정의될 수 있다(Ahlqvist 외, Int J Oral Maxillofac Implants 1990, 5(2):155-163). 물론, 종래의 방사선사진은 임플란트 몸체 주위의 골 손실의 근심 및 원심 측면만을 모니터링한다(Misch 외, Implant Dentistry 2008, 17(1):5-15). 진행중인 골 손실에 대한 모호하지 않은 정보의 부족이 임플란트 주위 질환의 불필요하거나 심지어 부정확한 치료를 유도할 수 있다. 임플란트 주위 골 수준은 일반적으로 진단 시간에 찍히는 방사선사진으로부터 결정된다. 골 수준은 정상으로 간주되는 것과 비교되고, 골 손실을 평가하기 위해 조기 시점에 찍힌 1 이상의 방사선사진이 사용된다. 하지만, 방사선사진은 골 상황의 정지 이미지를 제공한다; 이에 따라, 골 탈회의 증거가 반드시 진행중인 질환 활성을 의미하는 것은 아니다. 또한, 이는 치주골 수준들에 대해 진실이며, 치주염의 진행에 대한 데이터가 연속적인 과정을 입증하는 것이 아니라, 그 대신 한차례 활성(악화), 차도 및 비활성의 주기를 입증한다(Hall 외, Eur J oral Implantol 2011, 4(4):371-382). 또한, 방사선사진의 제한된 감도가 여러 질환들에 관련된 병리학적 골 분해 과정들의 매우 초기 단계들의 검출을 거의 허용하지 않는다. 또한, 모든 방사선사진 검사가 적절하고 재생가능한 투영 기술들을 이용하여 수행된다는 것이 중요하다. 방사선사진 상에서 수행되는 측정들의 정밀도는 특히 작은 평균 골 손실에 관한 경우에 낮으며, 이는 이들의 해석에 관련된 어려움들을 나타낸다. 또한, 골 손실률은 긴 시간 주기, 통상적으로 1 년 내에서만 측정될 수 있으며(Ahlqvist 외, Int J Oral Maxillofac Implants 1990, 5(2):155-163), 빈번한 방사선에 환자들을 노출시키는 것을 수반한다. 그러므로, 임플란트 주위염 및 치주염 환자들에서의 진행중인 골 분해의 확립이 개별화된 환자 치료의 증가된 정확성을 위한 전제 조건인 것으로 보인다.

임플란트 성공은 임플란트 로딩(implant loading)의 첫 해 1.5 mm 및 그 후 0.2 mm/해(year)를 초과하지 않는 골 손실률을 허용한다. 더 높은 점진적 골 손실은 임플란트 주위염, 임플란트 과부하 또는 임플란트 부위에서의 치유력을 방해하는 차선의 임플란트 배치를 나타낸다. 임플란트 주위염 및 치주염은 2-상 방식으로 진행하며, 이때 골 손실을 갖는 능동 단계 후 골 손실이 전혀 없거나 사소한 수동 단계 등이 이어진다(Hall 외, Eur J oral Implantol 2011. 4(4):371-382). 그러므로, 골 손실률이 소정 수준에서 일정하게 유지되어야 하는 경우, 임플란트 또는 치아가 고정 뼈에 의해 더 이상 지지되지 않기 전에 소정 시간이 걸릴 것이며, 이는 임플란트 또는 치아의 길이 및 남은 주위 뼈의 부하 지지력에 의존한다.

진행중인 골 손실에 대한 모호하지 않은 정보의 부족이 뼈에 영향을 주는 상태들의 불필요하거나 심지어 부정확한 치료를 유도할 수 있기 때문에, 개별화된 환자 치료 및 질환 예후의 증가된 정확성을 위해 골 손실률을 빠르고 정밀하게 확립하는 것이 매우 바람직하다. 본 발명의 맥락에서, 골 손실률은 진행중인 골 분해의 측정으로서 정의될 수 있다. 다시 말하면, 골 손실률은 본 발명을 이용하여 시간에 따른 골 수준의 변동으로서 정의될 수 있다. 더 바람직하게는, 본 발명은 발현 수준을 구강에서의 변연골 수준의 변동에 관련시키도록 관리하고, 이는 관련 치료를 계획하고 제공함에 있어서 임상의를 안내하는 데 크게 조력한다. 방사선사진의 제한된 감도는 이 질환들에 관련된 병리학적 골 분해 과정들의 매우 초기 단계들의 검출을 거의 허용하지 않는다. 획득된 방사선사진들은 검사 시간의 변연골 수준들에 대한 정보를 제공하지만, 이들은 진행중인 골 분해의 모호하지 않은 확립을 제공하지는 않는다. 또한, 종래의 그래프사진들을 이용한 변연골 수준 변화의 측정들에 대한 정량화의 한계는 앞서 0.47 mm로 추산되었다(Ahlqvist 외, Int J Oral Maxillofac Implants 1990, 5(2):155-163). 그러므로, 뼈에 영향을 주는 상태를 겪는 환자들에게서의 진행중인 골 분해의 빠른 확립이 환자 진단 및 치료의 증가된 정확성을 위한 전제조건인 것으로 보인다. 또한, 이는 빈번한 방사선에 대한 환자들의 노출을 회피한다.

따라서, 본 발명은 골 손실률을 측정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은:

a) 생체외(ex vivo) 샘플에서 파골세포 및/또는 조골세포의 활성에 관한 1 이상의 표지들 또는 이들의 비의 발현 수준을 정량화하는 단계; 및

b) 1 이상의 캘리브레이션 곡선(calibration curve)에서, a) 단계에서 얻어진 값을 보간함으로써 변연골 수준의 진행중인 손실의 함수로서 골 손실률을 결정하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 방법들을 수행하는 키트(kit)를 제공한다. 본 발명은 임상의가 진행중인 분해의 잠재적 확립의 모호하지 않은 데이터를 더 빠르고 정확하게 제공할 수 있게 하는 방법 및 키트를 제공한다. 이는 방사선사진 디바이스들에 대한 더 적은 노출을 의미하며, 테스트 결과를 골 수준의 변동에 관련시키도록 관리한다.

용어 및 약어

CatK 카텝신 K

cDNA 상보적 DNA

Cq 정량화 사이클(Quantification cycle)

DKK-1 딕코프(Dickkopf)-관련 단백질-1

DNA 데옥시리보핵산

ECM 세포외 기질

ELISA 효소 면역 측정법

GAPDH 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소

GCF 잇몸 열구액

HPRT1 히포크산틴-구아닌 포스포리보실전달효소

IL 인터류킨

MC 점막염

MMPs 매트릭스 메탈로프로테이나제

mRNA 전령 RNA

OC 오스테오칼신

OPG 오스테오프로테게린

PAI-2 플라스미노겐 활성화인자 억제제 타입 2(세르핀B2)

PI 임플란트 주위염

PICF 임플란트 주위 열구액

qPCR 정량적 중합효소 연쇄 반응

RANKL NF-κB 리간드의 수용체 활성화인자(receptor activator)

RNA 리보핵산

SEQ 서열

TIMPs 매트릭스 메탈로프로테이나제의 조직 억제제

tPA 조직 플라스미노겐 활성화인자

TRAP 주석산염-저항성 산성 인산효소

UBC 유비퀴틴 C

uPA 우로키나아제 플라스미노겐 활성화인자

YWHAZ 티로신 3/트립토판 5-모노옥시게나아제 활성화 단백질, 제타 폴리펩티드

도 1: TRAP와 골 손실률 간의 상관관계. 골 분해율(degradation rate)은 X-축(mm/해)에서 나타내어진다. Y-축은 TRAP(정규화된 발현)의 수준을 나타낸다.
도 2: TRAP/OC와 골 손실률 간의 상관관계. 골 분해율은 X-축(mm/해)에서 나타내어진다. Y-축은 TRAP/OC(정규화된 발현)의 수준을 나타낸다.
도 3: CatK/OC와 골 손실률 간의 상관관계. 골 분해율은 X-축(mm/해)에서 나타내어진다. Y-축은 CatK/OC(정규화된 발현)의 수준을 나타낸다.
도 4: OPG와 골 손실률 간의 상관관계. 골 분해율은 X-축(mm/해)에서 나타내어진다. Y-축은 OPG(정규화된 발현)의 수준을 나타낸다.

상세한 설명은 본 발명의 개별적인 특징들의 특정한 및/또는 바람직한 변형예(variant)들을 기재한다. 또한, 본 발명은 그 실시예들을 특히 바람직한 실시예들로서 고려하며, 이들은 본 발명의 특징들의 2 이상에 대해 설명되는 특정한 및/또는 바람직한 변형예들 중 2 이상을 조합함으로써 생성된다.

본 발명은 골 손실률을 측정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (ⅰ) 생체외 샘플에서 파골세포 및/또는 조골세포의 활성에 관한 1 이상의 표지들 또는 이들의 비의 발현 수준을 정량화하는 단계, 및 (ⅱ) 1 이상의 캘리브레이션 곡선에서, (ⅰ) 단계에서 얻어진 값을 보간함으로써 골 손실률을 결정하는 단계를 포함한다. 발명자들은 파골세포 및/또는 조골세포의 활성에 관한 1 이상의 표지들 또는 이들 중 2 이상 간의 비의 수준이 골 손실률에 관련된다고 나타내었다. 이는 본 발명 이전에는 수행할 수 없었던 골 손실률의 빠르고 민감한 결정을 허용한다. 골 손실률은 뼈에 영향을 주는 상태의 존재 또는 부재를 나타낼 수 있다. 또한, 골 손실률은 환자가 소정 치료를 받아야 한다는 것을 나타낼 수 있다.

본 명세서에서, "1 이상의 캘리브레이션 곡선에서의 보간"이라는 용어는 이미 알려지거나 결정된 값들 사이에서 값을 추산하는 의미로 사용된다.

임플란트는 단지 관찰의 연속(continuum)의 맥락에서 골유착되는 것으로 판단될 수 있는데, 이는 기반을 약화시키는 계면 변화(undermining interfacial change)들이 점진적일 수 있고, 적어도 단기간에 방사선사진 해상도에서 분명히 나타나지 않기 때문이다(Albrektsson 외, JOMI 1986, 1(1):11-25). 본 발명은 골 손실률의 빠른 검출을 위한 방법을 제공하여, 환자가 불필요한 방사선 노출을 거치는 것을 방지하고, 진단, 적절한 요법의 선택 및/또는 임플란트의 예후 추정을 위해 임상의에게 가치있는 정보를 제공한다.

본 발명의 맥락에서, 골 손실률은 진행중인 골 분해의 측정으로서 정의될 수 있다. 다시 말하면, 골 손실률은 시간에 따른 골 수준의 변동으로서 정의될 수 있다. 시간 간격들은, 치유 단계, 로딩 단계(loading phase), 수술 후 단계와 같은 개입 후 특정 단계들, 수술의 효과, 및/또는 질환과 조합한 개입의 효과를 검출하도록 적절히 선택된다. 예를 들어, 골 손실의 위험에 대한 노출을 갖는 범주에서 다른 방식으로, 또는 흡연가이거나 당뇨병이 있는 환자들을 추적관찰(follow up)하는 것에 관심이 있을 수 있다. 골유착된 치과 임플란트들의 특별한 경우에, 골 수준은 고정체 및 그 지대주 간의 접합으로부터 임플란트들에 대한 근심 및 원심에서 변연골의 치조정까지의 거리로서 정의될 수 있다.

생체외 샘플은 바람직하게는 체액 또는 조직이다. 체액은 구강액(oral fluid), 및/또는 혈청(serum), 및/또는 혈장(plasma), 및/또는 뇌척수액, 및/또는 활액, 및/또는 복막액, 및/또는 혈액, 및/또는 타액, 바람직하게는 잇몸 열구액 및 더 바람직하게는 임플란트 주위 열구액일 수 있다.

조직은 뼈, 및/또는 뼈에 인접한 조직, 및/또는 결합 조직, 및/또는 골수(medulla), 및/또는 연골, 및/또는 잇몸, 및/또는 점막, 및/또는 임플란트-지지 조직, 및/또는 임플란트에 인접한 뼈, 및/또는 치아에 인접한 뼈일 수 있다.

골 손실률이 측정되는 생체외 샘플은 대상의 조직 또는 체액으로부터 얻어질 수 있다. 바람직하게는, 생체외 샘플은 무균 페이퍼 포인트(sterile paper point)들과 같은 1 이상의 무균 흡수체를 임플란트 주위 열구(sulcus)/포켓의 기부에 삽입하고, 적어도 60 초 동안 그대로 남겨둠으로써 얻어진다. 바람직하게는, 3 이상의 무균 페이퍼 포인트들이 열구/포켓 내에 삽입된다.

생체표지(biomarker)(이후 표지)는 정상적인 생물학적 과정, 병리적 과정(pathogenic process), 및 치료적 개입에 대한 약물 반응의 지표로서 객관적으로 측정되고 평가되는 물질로서 정의될 수 있다. 생체표지들은 건강 상태, 질환 발병, 치료 반응 및 결과를 모니터링하는 데 사용될 수 있는 분자들이다(Zia 외, Biology and medicine 2011, 3(2):45-52).

파골세포 및/또는 조골세포의 활성에 관한 표지들은 골 물질대사(골 전환 및/또는 골 형성 및/또는 골 흡수 및/또는 골 리모델링)에 관한 표지들이며, 당업계에 잘 알려져 있다(즉, Hall 외, Eur J Oral Implantol 2011, 4(4):371-382; Seibel, Clin Biochem Rev 2005, 26:97-122; Watts, Clin Chem 1999, 45(8) B:1359-1368; Christenson, Clin Biochem 1997, 30(8):573-593).

파골세포 및/또는 조골세포의 활성에 관한 표지 또는 그 조합, 또는 그 비는 특별히 제한되지 않으며, TRAP, 및/또는 OPG, 및/또는 CatK, 및/또는 RANK, 및/또는 RANKL, 및/또는 오스테오칼신, 및/또는 IL-6, 및/또는 DKK-1, 및/또는 MMP-8, 및/또는 MMP-2, 및/또는 TIMP-1, 및/또는 tPA, 및/또는 PAI-2, 및/또는 카텝신 과(family)로부터의 다른 표지들, 및/또는 골 시알로단백질(bone sialoprotein: BSP), 및/또는 알칼리 포스파타제(ALP), 및/또는 골 형태형성 단백질(BMP)들과 같은 TGF-β 상과로부터의 표지들, 및/또는 대식세포 증식 자극 인자(M-CSF), 및/또는 스클레로스틴(sclerostin)[Sost(스클레로스테오시스 유전자)로부터의 단백질 생성물], 및/또는 노긴 또는 그 조합들 중 1 이상일 수 있다. TRAP, 및/또는 OPG, 및/또는 CatK, 및/또는 오스테오칼신, 및/또는 TRAP/OC, 및/또는 CatK/OC와 같이, 그 표지들 또는 표지들의 비의 발현 수준들과 골 손실률 사이의 선형 관계를 제공하는 그 표지들 또는 표지들의 비가 바람직하다. 대안적으로, 그 표지들 또는 표지들의 비의 발현 수준들과 골 손실률 사이의 2차, 및/또는 3차 관계, 및/또는 4차 관계, 및/또는 동차(quantic) 관계, 및/또는 지수 관계, 및/또는 로그 관계를 제공하는 그 표지들 또는 표지들의 비가 바람직하다.

본 발명의 표지들은 다음 등록 번호(accession number)들에 의해 식별될 수 있다.

인터류킨-1 베타(IL-1b): NM_000576.2

인터류킨-6(IL-6): NM_000600.3

매트릭스 메탈로프로테이나제-8(MMP-8): NM_002424.2

주석산염 저항성 산성 인산효소(TRAP): NM_001611.3

카텝신 K: NM_000396

오스테오프로테게린(OPG): NM_002546

NF-κB 리간드의 수용체 활성화인자(RANKL): NM_003701.3

인터류킨-8(IL-8): NM_000584.3

호모사피엔스 딕코프 1 동족체(제노푸스)(DKK1): NM_012242.2

매트릭스 메탈로프로테이나제의 조직 억제제(TIMP-1): NM_003254.2

조직 플라스미노겐 활성화인자(TPA): NM_000930.3

플라스미노겐 활성화인자 억제제 타입 2(세르핀B2)(PAI-2): NM_001143818.1

오스테오칼신(PMF1 또는 OC): NM_001199654.1

바람직하게는, 골 손실률에 대한 더 정확한 정보를 얻기 위해, 2, 3, 4, 5, 6 이상의 표지 또는 그 비의 발현 수준이 측정된다.

딕코프 -관련 단백질-1( DKK - 1)은 Wnt 신호전달 대항물질이며, 이는 조골세포 분화를 감소시킨다. DKK-1의 높은 전신 수준들이 류마티스 관절염(Liu 외, Chin Med J(Engl). 2010, 123(11):1407-12) 및 건선 관절염(Dalbeth 외, Arthritis Res Ther. 2010, 12(4):R164)을 갖는 대상들에서 측정되었다.

주석산염 저항성 산성 인산효소(TRAP)는 파골세포 주름변연(ruffled border)으로부터 분비되고, 탈인산화 전에 파골세포에 대한 앵커(anchor)로서 작용하는 오스테오폰틴을 탈인산화하며, 파골세포 이동 및 추가 골 흡수를 허용한다(Minkin, Calcif Tissue Int, 1982, 34:285-290).

생체외 샘플에서 파골세포 및/또는 조골세포의 활성에 관한 1 이상의 표지 또는 그 비의 발현 수준을 정량화하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, mRNA와 같은 핵산을 정량화하는 방법 및/또는 이후 qPCR이라 칭하는 RT-qPCR과 같은 단백질을 정량화하는 방법, 및/또는 노던 블롯(Northern Blot), 및/또는 면역측정법, 및/또는 ELISA, 및/또는 방사면역측정법, 및/또는 자기적 면역측정법, 및/또는 형광 면역측정법, 및/또는 면역침강법, 및/또는 표면 플라스몬 공명, 및/또는 웨스턴 블롯(Western Blot), 및/또는 면역조직화학 또는 여하한의 그 조합으로부터 선택될 수 있다. 정량화를 위한 바람직한 방법은 qPCR이다. 실험 절차들은 통상적으로 샘플-처리 단계들(즉, 추출)을 포함한다.

1 이상의 표지들 또는 이들의 비의 발현 수준의 정량화는 1 이상의 기준 유전자(reference gene)들에 의해 정규화될 수 있다. 정규화는 기준 유전자들의 발현 수준에 대한 관심 유전자들의 발현 수준의 비들의 보고를 수반한다. 기준 유전자들은 자유롭게 이용가능한 NormFinder17 프로그램을 이용하여 선택될 수 있다. 바람직하게는, 기준 유전자들은 안정적으로 표현되는 것들이며, 그 존재비(abundance)들은 샘플의 총량과의(qPCR의 경우, mRNA의 총량과의) 강한 상관관계를 나타낸다. 더 바람직하게는, 기준 유전자들은 GAPDH, YWHAZ, UBC 및/또는 HPRT-1로부터 선택되며, 이 중에서 YWHAZ 및 UBC가 바람직하다.

본 발명의 기준 유전자들은 다음 등록 번호들에 의해 식별될 수 있다.

YWHAZ(기준 유전자): NM_001135702.1

UBC(기준 유전자): NM_001135702.1

본 출원의 맥락에서, 표지의 발현 수준은 (ⅰ) 농도, 또는 (ⅱ) 표지에 특정한 검출 신호, 또는 (ⅲ) 수학적 변환에 의한 (ⅰ) 및/또는 (ⅱ)에 관한 값을 의미할 수 있다.

qPCR의 경우, 관련 유전자 발현 수준들은 바람직하게는 기준 유전자들에 의해 각각의 유전자의 유전자 발현을 정규화함으로써, 및 각각의 어세이에 대해 ΔΔCq 방법(Livak 외, Methods 2001, 25:402-408)을 이용하여 계산된다. 기준 유전자들은 예를 들어 자유롭게 이용가능한 NormFinder 프로그램을 이용하여 선택될 수 있다(www.mdl.dk/publicationsnormfinder.htm. October 2010). 그 후, 정규화된 유전자 발현은 로그 변환 후 다음 표현: 즉 유전자의 정규화된 발현 g=(Cq(n)-Cq(g))을 이용하여 각각의 대상에 대해 계산될 수 있으며, 이때 Cq(g)는 유전자 g에 대한 증폭 사이클(amplification cycle)들의 수이고, Cq(n)은 대상으로부터 취해진 샘플에 대한 정규화 인자(선택된 기준 유전자 또는 유전자들에 대한 증폭 사이클들의 평균 수)이다.

또한, qPCR의 경우, 파골세포 및/또는 조골세포의 활성에 관한 1 이상의 표지들 또는 이들의 비의 발현 수준은 대응하는 앰플리콘(amplicon)의 정량화에 의해 정량화될 수 있다. 앰플리콘은 자연적 또는 인공적 증폭 또는 복제 사건들의 소스 및/또는 생성물인 DNA 또는 RNA의 조각에 의해 정의될 수 있다. 본 발명의 경우, 기준 유전자들 또는 파골세포 및/또는 조골세포의 활성에 관한 1 이상의 표지들 또는 이들의 비의 발현 수준의 정량화를 위한 바람직한 앰플리콘들은 다음과 같다:

인터류킨-1 베타(IL-1b): SEQ ID NO 1

인터류킨-6(IL-6): SEQ ID NO 2

매트릭스 메탈로프로테이나제-8(MMP-8): SEQ ID NO 3

주석산염 저항성 산성 인산효소(TRAP): SEQ ID NO 4

카텝신 K: SEQ ID NO 5

오스테오프로테게린(OPG): SEQ ID NO 6

NF-κB 리간드의 수용체 활성화인자(RANKL): SEQ ID NO 7

인터류킨-8(IL-8): SEQ ID NO 8

호모사피엔스 딕코프 1 동족체(제노푸스)(DKK1): SEQ ID NO 9

매트릭스 메탈로프로테이나제의 조직 억제제(TIMP-1): SEQ ID NO 10

조직 플라스미노겐 활성화인자(TPA): SEQ ID NO 11

플라스미노겐 활성화인자 억제제 타입 2(세르핀B2)(PAI-2): SEQ ID NO 12

오스테오칼신(PMF1 또는 OC): SEQ ID NO 13

YWHAZ(기준 유전자): SEQ ID NO 14

UBC(기준 유전자): SEQ ID NO 15

본 발명의 방법들에서, 1 이상의 캘리브레이션 곡선은 표지 또는 표지들의 비의 발현 수준들과 골 손실률 사이의 선형 관계 및/또는 3차 관계, 및/또는 2차 관계, 및/또는 4차 관계, 및/또는 동차 관계, 및/또는 지수 관계, 및/또는 로그 관계를 제공할 수 있다. 바람직하게는, 캘리브레이션 곡선은 표지/표지들의 비의 발현 수준들과 골 손실률 사이의 선형 관계를 제공할 수 있다. 캘리브레이션 곡선은 그 안에 보간되기 위해 동일한 1 이상의 표지들 및/또는 이들의 비 및 생체외 샘플에 사용되는 것과 동일한 정량화 기술을 이용하여 확립되어야 한다.

본 발명의 방법들은 뼈에 영향을 주는 상태, 바람직하게는 치아 및/또는 임플란트 주위의 뼈에 영향을 주는 상태의 존재 또는 부재를 나타내기 위해 사용될 수 있다. 더 바람직하게는, 상기 상태는 임플란트 주위 질환, 및/또는 치주 질환, 및/또는 관절염, 및/또는 류마티스 관절염, 및/또는 건선 관절염, 및/또는 골다공증 및/또는 그 조합이며, 이들 중에서 임플란트 주위 질환이 바람직하다.

임플란트 주위 질환(골 분해의 존재 시 임플란트 주위염이라고도 함)은 지지 골의 손실을 유도하였던 작용에서 임플란트 주위의 조직에 영향을 주는 염증 과정으로서 정의된다(Becker 외, Int J Oral Maxillofac Implants 1990, 5:31-38). 점막염은 흔히 연조직 염증, 종창, 탐침시 출혈 및 몇몇 경우에는, 골 손실의 흔적이 없는 화농으로서 언급된다.

또한, 본 발명의 방법들은 임플란트의 예후의 평가에 사용될 수 있다.

본 발명자들은 뼈에 영향을 주는 상태들에 대한 진단 인자로서의 사용을 가능하게 하는 골 손실률과 파골세포 및/또는 조골세포의 활성에 관한 소정 표지들 또는 2 이상의 표지들 사이의 비 또는 그 조합의 발현 수준 간의 연계를 연구하였다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 개별 환자가 뼈에 영향을 주는 상태, 바람직하게는 치아 및/또는 임플란트 주위의 뼈에 영향을 주는 상태를 앓거나 앓고 있지 않다고 진단될 수 있다.

발명자들은 임플란트 치료를 받았던 환자들로부터 얻어진 임플란트 주위 열구액에서의 파골세포 및/또는 조골세포의 활성에 관한 소정 표지들 또는 2 이상의 표지들 사이의 비의 발현 수준이 골 손실률과 관련된다고 나타내었다. 이 방법은 골 손실률의 신속한 결정을 제공하며, 이는 임플란트 주위 질환을 진단하고 적절한 치료를 선택하기 위해 필요하다.

본 발명의 방법을 이용하면, 열악한 보철 구조로부터 발생한 과부하로 인한 골 손실률, 좁은 치조제에서의 너무 큰 임플란트들의 배치로 인한 골 손실률, 및 임플란트 배치가 너무 얇은 뼈 부분(bone section)을 유도하였던 다른 경우들을 검출하는 것이 가능하다. 이에 따라, 임상의는 적절한 치료를 제공할 것이다. 따라서, 대상들을 방사선에 노출시킬 필요가 없고, 임상의는 치료를 선택하고 환자의 예후를 확립하기 위해 골 분해가 방사선사진에 의해 평가되는 측정가능한 수준까지 진행될 때까지 기다리지 않아도 된다.

골 손실률이 측정되는 생체외 샘플은 뼈에 영향을 주는 상태, 바람직하게는 치아 및/또는 임플란트 주위의 뼈에 영향을 주는 상태를 겪을 수 있거나 겪지 않을 수 있는 환자로부터 얻어질 수 있다. 바람직한 환자는 1 이상의 임플란트, 더 바람직하게는 골 고정 임플란트를 갖는 환자이다. 임플란트는 치과 임플란트, 및/또는 엉덩이 임플란트(hip implant), 및/또는 무릎 임플란트일 수 있다.

바람직하게는, 환자는 임플란트 지지 조직에 영향을 주는 상태, 및/또는 골 지지 임플란트들에 영향을 주는 상태, 및/또는 치아 주위의 조직들에 영향을 주는 상태, 예컨대 임플란트 주위염, 및/또는 점막염, 및/또는 치주염, 및/또는 치은염 또는 그 조합을 겪을 가능성이 있다. 더 바람직하게는, 상기 환자는 임플란트 주위 질환을 겪는다, 및/또는 겪을 가능성이 있다. 대안적으로, 환자는 관절염, 류마티스 관절염, 건선 관절염, 골다공증 등과 같은 뼈에 영향을 주는 상태를 겪는다, 및/또는 겪을 가능성이 있다.

환자의 생체외 샘플에서의 TRAP, TRAP/OC, CatK/OC 및 OPG의 1, 2, 3, 4, 또는 5 또는 6의 발현 수준들은 qPCR에 의해 정량화될 수 있다. 골 손실률의 결정은 캘리브레이션 곡선에서, 정량화 단계에서 얻어진 1 이상의 값들을 보간함으로써 수행될 수 있다. 바람직하게는, 이 정보는 적절한 치료 및/또는 질환 예후를 나타낸다.

0.2 mm/해의, 또는 이보다 낮은 골 손실률이 케어 표준(standard of care) 구강 위생 진료 및 유지보수 프로그램을 포함한 치료를 나타낼 수 있다.

1 내지 1.5 mm/해의 범위 내의 골 손실률이 케어 표준 구강 위생 진료 및 유지보수 프로그램을 포함한 치료, 및 수 개월 내의 후속 방문을 나타낼 수 있다.

2.0 mm/해의, 또는 이보다 높은 골 손실률이 수술적 치료의 필요성을 나타낼 수 있다.

식립(implantation) 후 첫 해 동안 1.5 mm/해를 초과하지 않거나 그 후에 0.2 mm/해보다 작은 골 손실률은 구강 위생을 위한 표준 프로그램을 나타낼 수 있다.

임플란트 삽입의 첫 해 후 0.2 내지 2.0 mm/해의 골 손실률은 구강 위생을 위한 표준 프로그램 및 수 개월 내의 후속 방문을 나타낼 수 있다. 골 손실률이 1.5 내지 2.0 mm/해로 유지되는 경우, 임상의는 부위의 수술적 치료를 수행할 수 있다.

임플란트 삽입 후 첫 해 동안 1.5 mm/해보다 큰 골 손실률은 부정확한 임플란트 위치 또는 비효율적인 임플란트 로딩을 나타낼 수 있으며, 수술적 치료를 나타낼 수 있다. 임플란트 삽입의 첫 해 후 2.0 mm/해보다 큰 높은 골 손실률은 수술적 치료를 나타낼 수 있다.

"인간 대상", "대상" 및 "환자"라는 용어들은 본 출원에서 상호교환가능하게 사용된다. "상태" 및 "질환"이라는 용어들은 본 출원에서 상호교환가능하게 사용된다.

또한, 본 발명은 본 발명의 방법들을 수행하는 키트를 제공한다. 소정 치료를 나타내는 골 손실률 값에 키트가 제공될 수 있다. 키트의 도움으로, 환자의 골 손실률이 계산될 수 있다. 본 발명의 키트는 샘플 수집 디바이스를 포함할 수 있으며, 이는 제한적이지 않고 체액 또는 조직과 같은 샘플들을 취하는 디바이스이다. 바람직하게는, 샘플 수집 디바이스는 임플란트 주위 열구액의 샘플들을 취하기 위해 사용된다. 샘플 수집 디바이스는 무균 페이퍼 포인트와 같은 흡수체 및/또는 주사기 및/또는 생검 디바이스일 수 있다. 바람직하게는, 샘플 수집 디바이스들은 무균 흡수체이며, 더 바람직하게는 무균 페이퍼 포인트이다.

본 발명의 키트는 샘플을 보존하는 보존 배지를 더 포함할 수 있다. 보존 배지의 목적은 생물학적 샘플들을 보존하는 것이며, 다운스트림 분석(downstream analysis)을 위한 샘플들의 생존도(viability) 및 온전함(integrity)을 유지하도록 만들어지는 여하한의 배지일 수 있다. 바람직하게는, 보존 배지는 RN아제(RNases)의 억제제를 포함할 수 있다. 더 바람직하게는, 보존 배지는 RNALater 보존 배지이다(Qiagen, Hilden, Germany).

또한, 본 발명의 키트는 본 발명의 방법을 수행하는 방식에 대한 지시(instructions)를 포함할 수 있다.

본 발명의 키트는 중앙 실험실에 샘플을 보내도록 박스를 더 포함할 수 있으며, 여기에서 파골세포 및/또는 조골세포의 활성에 관한 1 이상의 표지들 또는 그 조합의 발현 수준들이 정량화된다. 1 이상의 캘리브레이션 곡선에서의 발현 수준 값의 보간은 중앙 실험실에서 수행될 수 있다. 대안적으로, 키트는 발현 수준 값이 보간되고 골 손실률에 상관될 수 있는 1 이상의 캘리브레이션 곡선을 포함할 수 있다.

대안적으로, 본 발명의 키트는 파골세포 및/또는 조골세포의 활성에 관한 1 이상의 표지들 또는 그 조합의 발현 수준들을 정량화하기 위해 필요한 요소들을 포함할 수 있다. 이 경우, 키트는 파골세포 및/또는 조골세포의 활성에 관한 1 이상의 표지들 또는 그 조합을 명확하게 인지하는 적어도 하나의 검출가능한 라벨 및 적어도 하나의 기질(substrate)을 포함할 수 있다.

또한, 정량화가 mRNA 정량화에 의해 수행되는 경우, 상기 키트는 파골세포 및/또는 조골세포의 활성에 관한 표지들을 검출하고 정량화하기 위해 1 이상의 프라이머 서열(primer sequence)을 포함할 수 있다.

또한, 정량화가 단백질 정량화에 의해 수행되는 경우, 상기 키트는 파골세포 및/또는 조골세포의 활성에 관한 표지들을 검출하고 정량화하기 위해 1 이상의 기질을 포함할 수 있다. 바람직한 기질은 항체이며, 단일클론, 다중클론 또는 그 분절(fragment)들이다. 키트는 일차 및 이차 항체, 및 표지 항체(labeled antibody)를 더 포함할 수 있다.

또한, 이 경우들에, 키트는 발현 수준 값을 보간하고 골 손실률을 결정하기 위해 1 이상의 캘리브레이션 곡선을 포함할 수 있다.

키트가 사용될 수 있고, 그 용도는 특별히 제한되지 않지만, 그 실시예들 중 어느 하나에서의 본 발명의 방법의 사용이 바람직하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "1 이상"은 하나 및 2, 3, 4, 5, 6 등과 같은 1보다 큰 여하한의 수의 개별화된 명시(specification)를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "1보다 큰" 또는 "수 개의"는 2, 3, 4, 5, 6 등과 같은 1보다 큰 여하한의 수의 개별화된 명시를 포함한다.

달리 명백히 명시되지 않는 한, "포함하는"이라는 용어는 본 명세서와 관련하여 "포함하는"에 의해 도입된 리스트의 부재들 이외에 추가 부재들이 선택적으로 존재할 수 있음을 나타내도록 사용된다. 하지만, 본 발명의 특정 실시예로서 "포함하는"이라는 용어는 추가 부재들이 존재하지 않을 가능성을 포괄한다는 것이 고려되며, 즉 이 실시예의 목적을 위해 "포함하는"은 "로 구성되는"의 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다.

예시들

예시 1: 캘리브레이션 곡선

대상들

이는 지역 윤리 위원회, University of Goeteborg, Sweden(Dnr: 652-10)에 의해 승인된 비-임의적, 단일-맹검(샘플 분석가) 제어 임상 탐험적 연구였다. 연구는 건강한 임플란트 부위들을 갖는 25 명의 대상들, 임플란트 주위 점막염을 갖는 25 명의 대상들, 및 임플란트 주위염의 명백한 임상적 증상들을 갖는 25 명의 대상들을 포함하였다. 연구는 단일 평가 시점으로 제한되었다. 연구 참여자들은 Branemark Clinic, Goeteborg, Sweden에서 예정된 임플란트 유지보수 세션에 참석한 치과 임플란트들로 앞서 수복된 대상들로부터 선택되었다. 각각의 대상은 사전 동의 과정에 참여했고, 여하한의 연구 관련 절차들이 수행되기 전에 사전 동의서(ICF)에 서명 및 날짜기입하였다. 대상마다 하나의 임플란트 부위가 평가되었고, 선택된 부위는 아래에 설명되는 기준에 기초하여 건강(HI), 점막염(MC) 또는 임플란트 주위염(PI) 부위로 분류되었다. 부위마다 3 개의 모아진(pooled) 페이퍼 포인트를 이용하여 임플란트 부위들로부터 임플란트 주위 열구액(PICF)이 수집되었다. 샘플 분석 및 통계에 관련된 모든 사람들이 대상 신원을 알 수 없게 하였고, 또한 샘플 분석에 관련된 사람들이 샘플 타입(HI, MC 또는 PI)을 알 수 없게 하였다. 유전자 표지들의 발현의 분석은 독립적인 테스트 실험실(Tataa Biocenter, Goeteborg, Sweden)에 의해 수행되었다.

포함/제외 기준

본 연구에 참여하기 위해, 각각의 대상은 표 1에 제공된 일반적인 기준 1-5 각각을 충족하였다. HI, MC 또는 PI 그룹에 포함되기 위해, 대상들은 각각 표 2, 3, 및 4에 제공된 포함 기준을 충족하여야 했다. 세 그룹 모두에 대한 제외 기준은 표 5에 제공된다. 항염증 치료, 골다공증, 당뇨병, 제어되지 않는 부갑상선 기능 항진증, 코르티코스테로이드 및 골 동화작용(bone anabolic) 요법, 악성 종양(malignancy)의 이력, 담배 및/또는 다른 니코틴 함유 생성물의 사용과 같은 대상의 건강 상태들 및 치료들은 제외 기준이 아니지만, 이러한 상태들, 치료들 및 사용이 Case Report Forms(CRFs)에 기록되었다. 항생제 치료를 제외한 대상 등록 전 30 일 내에 수용된 모든 통상적인 처방 약제 및/또는 다른 통상적인 치료가 용인되었고 CRFs에 기록되었다. 연구 등록 전 3 달 내의 항생제 치료는 금지되었다.

또한, 대상의 나이, 성별, 구강 건강, Mombelli 수정 출혈 지수(modified Bleeding Index: mBI), 수정 플라크 지수(mPI), 임플란트 주위 포켓 깊이(PIPD), 부착된 점막의 높이 및 화농의 존재가 모든 대상들에 대해 CRFs에 기록되었고 정량화되었다.

자격 기준이 충족되는 대상들이 제공되는 연속 방식으로 두 그룹들에서의 대상 등록이 수행되었다. 포함 기간은 약 1 년이었고, 이때 세 그룹 모두의 대상들이 전체 기간 동안 등록되었다.

무작위 추출은 적용가능하지 않았다. 임상 실험 및 PICF 샘플링을 수행하는 임상 조사자는 연구 파라미터들을 알 수 있었다(not blinded to). 샘플 분석에 관련된 모든 다른 사람들은 대상 신원을 알 수 없었다. PICF 샘플들의 qPCR 분석을 수행하는 데 관련된 사람들은 샘플의 타입(HI, MC 또는 PI)을 알 수 없었다. 통계 분석을 수행하는 데 관련된 사람들은 연구 집단(study populations)을 알 수 있었다.

샘플들의 수집

PICF 샘플링은 다음과 같이 수행되었다: 3 개의 무균 페이퍼 포인트(Roeke, Coltene, Germany)가 임플란트 주위 열구/포켓의 기부에 삽입되고, 선택된 임플란트 부위에서 적어도 60 초 동안 그대로 남겨졌다. 3 개의 페이퍼 포인트는 RNALater 보존 배지(Qiagen, Hilden, Germany)를 포함한 하나의 (1) 2 ml 플라스틱 튜브(Microtube, 2 ml, Sarstedt, Numbrecht, Germany)로 즉시 옮겨졌다; 즉, 3 개의 샘플들이 모아졌다. 튜브들을 취급하는 경우, 항상 깨끗한 장갑들이 사용되었다. 페이퍼 포인트는 보존 배지에서 완전히 침지되었다. 모아진 샘플은 유전자 표지의 분석을 위해 주위 온도에서 샘플링 날에 Branemark Clinic으로부터 지역 연구실로 옮겨졌다.

샘플들의 취급 및 분석

qPCR 샘플들의 분석은 표준 절차들에 따라 TATAA Biocenter AB(Goeteborg, Sweden)에 의해 수행되었고, 이는 앞서 Hall 외(Eur J Oral Implant 2011, 4(4):371-382)에서 설명되었다. 간략히, 페이퍼 포인트에 부착된 세포들로부터의 RNA가 TATAA Biocenter에서 추출되었다. 그 후, 세포들은 제조자들의 지시에 따라 Qiagen RNeasy Micro 키트(Qiagen AB, Solna, Sweden)를 이용하여 정제되었다. 추출 동안 RNA의 손실들을 최소화하기 위해 키트에 포함된 운반 RNA가 사용되었다. RNA는 5 ㎕의 RNA를 이용하여 제조자들의 지시에 따라 BioRad iScript cDNA 합성 키트(Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, California, USA)를 이용하여 cDNA로 전환되었다. cDNA는 UltraPure water(Invitrogen Corp., Carlsbad, California, USA)에서 50 ㎕로 희석되었다. 그 후, 샘플들의 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 어세이가 수행되었다. 분석된 생화학적 표지들은 표 6에 열거된다. Perfecta SYBR Green Supermix(Quanta BioSciences, Gaithersburg, Maryland, USA) 및 0.4 μM의 정방향 및 역방향 프라이머와 함께 2 ㎕의 cDNA 템플릿이 정량적 PCR에서 사용되었다. 각각의 cDNA 샘플은 두 번(in duplicate) 정량화되었다. 다음의 온도 프로토콜이 채택되었다: 98 ℃에서 효소 활성 3 분 후, 95 ℃에서 20 초, 60 ℃에서 20 초 및 72 ℃에서 20 초의 45 사이클. 마지막 온도 사이클 동안 FAM/SYBR 채널에서 형광 검출이 수행되었다. 실험들은 LightCycler 480 System(Roche, Penzberg, Germany)에서 수행되었다. 증폭 후, 특정 생성물이 발생되었음을 확인하기 위해 해리/용융 곡선이 발생되었다. 자유롭게 이용가능한 NormFinder17 프로그램을 이용하여 선택되었던 2 개의 기준 유전자(UBC 및 YWHAZ)에 의해 각각의 유전자의 유전자 발현을 정규화함으로써, 및 각각의 어세이에 대해 90 % 효율성을 이용한 ΔΔCq 방법(Livak 외, Methods 2001, 25:402-408)을 이용하여 상대적인 유전자 발현 수준들이 계산되었다. 2 개의 유전자는 프로그램에서 4 개의 유전자, GAPDH, YWHAZ; UBC, HPRT-1을 실행한 후 선택되었다. 4 개의 정규화 유전자의 선택은 앞선 타당성 조사(feasibility study)(Hall 외, Eur J oral Implantol 2011, 4(4):371-382)로부터의 결과들에 기초하였으며, 이때 9 개의 기준 유전자가 조사되었고, 또한 페이퍼 포인트를 이용한 PICF 샘플링이 사용되었다. 주된 기준은, 기준 유전자 발현의 변동이 HI, MC 및 PI 그룹들 내에서, 및 이들 사이에서 최소이어야 한다는 것이었다.

분광광도계에 의해 정량화되는 정제된 PCR 생성물에 기초하여 모든 유전자들에 대한 Cq에 대해 LOQ(Limit Of Quantification)가 결정되었다. 각 지점에서 4 개의 복제를 갖는 5-지점 표준 곡선이 모든 어세이들에 대해 발생되었고, 10 내지 10⁶ copies/㎕의 농도에서 10-배 희석 시리즈(ten-fold dilution series)로 실행되었다. 결정된 LOQ-값들을 넘는 모든 데이터는 분석으로부터 생략되었다. 절차는 데이터 분포들의 축소(narrowing) 및 데이터 산란의 감소를 유도하였고, 이는 3 개의 대상 그룹들 사이의 유전자 발현의 상당한 차이들의 관찰 가능성을 증가시켰다.

qPCR 분석이 샘플 매트릭스(sample matrix), 예를 들어 화농의 존재에 의해 억제되었는지를 조사하기 위해, PI 그룹으로부터의 샘플들 중 14 개에 알려진 농도의 RNA-스파이크(spike)(#RS12JG, TATAA Biocenter AB)가 첨가(spike)되었고, 동일한 농도가 첨가된 물 샘플들에 의해 비교되었다. PI 그룹 내의 14 대상들로부터 화농을 보이는 하나의 임플란트 부위로부터 무균 흡인 바늘로 하나의 샘플이 취해졌다. 흡인 바늘 샘플링 부위는 페이퍼 포인트 샘플링 부위와 동일하지는 않지만, 유사하였다. 흡인 바늘(Metal Suction Tip, 0.7 x 70 mm 22G, Mediplast, Malmoe, Sweden)은 선택된 부위에서 임플란트 주위 열구/포켓의 기부에 삽입되었다. 샘플을 포함한 바늘은 완만하게 구부러진 플라스틱 주사기(1 ml, BD Plastipak, Mediplast, Malmoe, Sweden)로부터 즉시 제거되고, 하나의 (1) 4.5 ml 플라스틱 동결 튜브(cryo tube)(Nunc Cryo Tube Vials, Fisher Scientific, Goeteborg, Sweden)에 투입되었다. 튜브의 뚜껑은 폐쇄되었고, 튜브는 보온병에 위치되어 액체 질소로 -196 ℃에서 냉동되었으며, 억제 분석을 위해 연구실(TATAA Biocenter)로 즉시 운송되었다. 흡인 바늘들 및 플라스틱 튜브들을 취급하는 경우, 항상 깨끗한 장갑들이 사용되었다.

통계적 방법들

3 개의 연구 그룹들 사이의 유전자 표지 발현의 차이들이 변량 분석(ANOVA)을 이용하여 추산되었다. 데이터의 분석에서, 로그 데이터 변환이 수행되었고, 독립적인 샘플들 간의 차이들에 대해 95 퍼센트(95 %) 신뢰 구간들이 사용되었다.

정규화된 유전자 발현은 로그 변환 후 다음 표현: 즉 유전자의 정규화된 발현 g=(Cq(n)-Cq(g))을 이용하여 각각의 대상에 대해 계산되었으며, 이때 Cq(g)는 유전자 g에 대한 증폭 사이클들의 수이고, Cq(n)은 대상으로부터 취해진 샘플에 대한 정규화 인자(선택된 기준 유전자들에 대한 증폭 사이클들의 평균 수)이다. 변량 분석은 HI, MC 및 PI 그룹들에서 유전자 g의 정규화된 발현을 이용하여 수행되었다.

HI, MC 및 PI 그룹들 사이의 가능한 차이들의 조사가 단지 2 개의 유전자 표지만을 포함하는 경우, 0.05보다 작은 p-값이 통계적으로 유의한 것으로 간주되었을 것이다. 하지만, 연구는 LOQ 분석 동안 일부가 제외된 후 8 개의 표지를 포함하였기 때문에, 대량 유의에 대한 본페로니 보정(Bonferroni correction)이 사용되었고, 0.0063보다 작은 p-값이 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

그 후, 각각의 대상에 대한 계산된 정규화된 유전자 발현은 동일한 시점에 동일한 대상의 방사선사진에 의해 제공된 골 손실에 대한 정보와 상관되었다. 방사선사진 검사 기술들은 당업계에 잘 알려져 있으며, Ahlqvist 외(Int J Oral Maxillofac Implants 1990, 5(2):155-163)에서 설명된 바와 같이 수행될 수 있다. 골 수준은 그래프사진들에서 측정될 수 있으며, 이는 고정체 및 그 지대주 간의 접합으로부터 임플란트들에 대한 근심 및 원심에서 변연골의 치조정까지의 거리로서 정의된다.

예시 2

임플란트 치료들을 받았던 환자로부터 얻어진 임플란트 주위 열구액에서 TRAP의 수준들이 정량화된다. TRAP의 발현 수준들은 예시 1에서 설명된 바와 같은 qPCR에 의해 정량화된다. 그 후, 얻어진 값은 캘리브레이션 곡선(즉, 도 1)에서 보간되고, 상기 환자의 골 손실률이 추산된다.

예시 3

임플란트 치료들을 받았던 환자로부터 얻어진 임플란트 주위 열구액에서 TRAP의 발현 수준들 및 OC의 발현 수준들이 정량화된다. TRAP 및 OC의 발현 수준들은 예시 1에서 설명된 바와 같은 qPCR에 의해 정량화된다. 그 후, 얻어진 값들의 비(TRAP/OC)는 캘리브레이션 곡선(즉, 도 2)에서 보간되고, 상기 환자의 골 손실률이 추산된다.

예시 4

임플란트 치료들을 받았던 환자로부터 얻어진 임플란트 주위 열구액에서 CatK 및 OC의 수준들이 정량화된다. CatK 및 OC의 발현 수준들은 예시 1에서 설명된 바와 같은 qPCR에 의해 정량화된다. 그 후, 얻어진 값들의 비(CatK/OC)는 캘리브레이션 곡선(즉, 도 3)에서 보간되고, 상기 환자의 골 손실률이 추산된다.

예시 5

임플란트 치료들을 받았던 환자로부터 얻어진 임플란트 주위 열구액에서 OPG의 수준들이 정량화된다. OPG의 발현 수준들은 예시 1에서 설명된 바와 같은 qPCR에 의해 정량화된다. 그 후, 얻어진 값은 캘리브레이션 곡선(즉, 도 4)에서 보간되고, 상기 환자의 골 손실률이 추산된다.

예시 6

예시 2 내지 예시 5 중 1 이상에서, 환자가 연조직 염증 및 0.2 mm/해까지의 골 손실률을 나타낼 수 있다. 이 경우, 임상의는 대상에게 케어 표준 프로그램 구강 위생 진료를 제공할 수 있다. 수 개월 또는 일 년 이내 후속 방문이 예정될 수 있다.

예시 7

예시 2 내지 예시 5 중 1 이상에서, 임상의는 빠르고 광범위한 골 분해가 진행중(골 손실률 > 2 mm/해)인 가능성이 있다고 결론을 내리고, 대상에게 구강 위생 진료를 제공하고 수 개월 이내 후속 방문을 예정한다. 두번째 후속 방문에 골 손실률이 여전히 > 2 mm/해인 경우, 임상의는 부위의 수술적 치료를 수행할 것을 결정할 수 있다.

예시 8

예시 2 내지 예시 5 중 1 이상에서, 대상이 임플란트 주위염의 명백한 증상, 즉 임플란트 주위 염증, 종창, 발적, 화농 및 병리학적, 분화구(crater) 형상의 변연골 손실을 보인다. 하지만, 골 손실률은 < 0.2 mm/해였고, 임상의는 수술적 치료가 불필요하다고 결론을 내렸으며, 대상에게 구강 위생 진료, 유지보수 프로토콜을 제공하였고, 수 개월 이내 후속 방문을 예정하였다.

예시 9

또 다른 예시에서, 염증 및 탐침시 출혈을 보이는 대상으로부터 취해진 샘플은 TRAP/OC 비가 0.2 내지 0.5 mm/해의 골 손실률에 대응한다는 것을 나타낸다. 임상의는 골 분해가 매우 낮고 미미할 가능성이 있다고 결론을 내리고, 대상에게 케어 표준 구강 위생 프로그램을 제공한다. 수 개월 또는 일 년 이내 후속 방문이 예정된다.

예시 10

또 다른 예시에서, 점막염의 유사한 임상적 증상을 보이는 또 다른 대상으로부터 취해진 샘플은 2 mm/해를 초과하는 골 손실률에 대응하는 TRAP/OC 비를 갖는다. 임상의는 빠르고 광범위한 골 분해가 진행중인 가능성이 있다고 결론을 내리고, 대상에게 구강 위생 진료를 제공하고 수 개월 이내 후속 방문을 예정한다. 두번째 후속 방문에 TRAP/OC 비가 여전히 높은 경우, 임상의는 부위의 수술적 치료를 수행할 것을 결정한다.

예시 11

또 다른 예시에서, 대상이 임플란트 주위염의 명백한 증상, 즉 임플란트 주위 염증, 종창, 발적, 화농 및 병리학적, 분화구 형상의 변연골 손실을 보인다. 하지만, TRAP/OC 비는 0.5 mm/해보다 낮은 골 손실률에 대응하고, 임상의는 수술적 치료가 불필요하다고 결론을 내리며, 대상에게 구강 위생 진료 프로토콜을 제공하고, 수 개월 이내 후속 방문을 예정한다.

예시 9 내지 예시 11의 대상들을 방사선에 노출시킬 필요가 없었고, 임상의는 두 후자 예시들에서 골 분해가 방사선사진에 의해 평가되는 측정가능한 수준까지 진행될 때까지 기다리지 않아도 되었다.

Claims

골 손실률(bone loss rate)을 측정하는 방법에 있어서:
a) 생체외(ex vivo) 샘플에서 파골세포 및/또는 조골세포의 활성에 관한 1 이상의 표지(marker)들 또는 표지들의 비의 발현 수준을 정량화하는 단계; 및
b) 1 이상의 캘리브레이션 곡선(calibration curve)에서, a) 단계에서 얻어진 값을 보간함으로써 변연골 수준의 진행중인 손실의 함수로서 상기 골 손실률을 결정하는 단계를 포함하는 골 손실률 측정 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 생체외 샘플은 체액 또는 조직인 골 손실률 측정 방법.
제 2 항에 있어서,
상기 체액은 구강액(oral fluid), 및/또는 혈액, 및/또는 혈청(serum), 및/또는 혈장(plasma), 및/또는 뇌척수액, 및/또는 활액, 및/또는 복막액, 및/또는 타액인 골 손실률 측정 방법.
제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
상기 체액은 잇몸 열구액(gingival crevicular fluid)인 골 손실률 측정 방법.
제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 체액은 임플란트 주위 열구액(peri-implant crevicular fluid)인 골 손실률 측정 방법.
제 2 항에 있어서,
상기 조직은 뼈 및/또는 결합 조직, 및/또는 골수(medulla), 및/또는 연골, 및/또는 잇몸, 및/또는 점막인 골 손실률 측정 방법.
제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조직은 뼈, 및/또는 임플란트 지지 조직, 및/또는 임플란트에 인접한 뼈, 및/또는 치아에 인접한 뼈인 골 손실률 측정 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 표지는 TRAP, OPG, CatK, RANK, RANKL, 오스테오칼신, IL-6, DKK-1, MMP-8, TIMP-1, tPA, PAI-2, 카텝신 과(family)의 다른 요소(member)들, 골 시알로단백질(bone sialoprotein: BSP), 알칼리 포스파타제(ALP), TGF-β 상과(superfamily)로부터의 표지들, 골 형태형성 단백질(BMP)들, 대식세포 증식 자극 인자(M-CSF), 스클레로스틴(sclerostin), 노긴 또는 여하한의 그 조합으로부터 선택되는 골 손실률 측정 방법.
제 8 항에 있어서,
상기 표지는 TRAP, OPG, CatK, 오스테오칼신, 또는 여하한의 그 조합인 골 손실률 측정 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 정량화는 핵산 정량화에 의해 수행되는 골 손실률 측정 방법.
제 10 항에 있어서,
상기 정량화는 qPCR에 의해, 및/또는 노던 블롯(Northern Blot)에 의해 수행되는 골 손실률 측정 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 1 이상의 캘리브레이션 곡선은 상기 골 손실률과 표지/표지들의 비 또는 그 조합들의 발현 수준들 사이의 선형 관계, 및/또는 2차 관계, 및/또는 3차 관계, 및/또는 4차 관계, 및/또는 동차(quantic) 관계, 및/또는 지수 관계, 및/또는 로그 관계를 제공하는 골 손실률 측정 방법.
제 12 항에 있어서,
상기 1 이상의 캘리브레이션 곡선은 상기 골 손실률과 표지/표지들의 비 또는 그 조합들의 발현 수준들 사이의 선형 관계를 제공하는 골 손실률 측정 방법.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
결정된 골 손실률은 뼈에 영향을 주는 상태의 존재 또는 부재를 나타내는 골 손실률 측정 방법.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
결정된 골 손실률은 치아 및/또는 임플란트들을 지지하는 뼈에 영향을 주는 상태의 존재 또는 부재를 나타내는 골 손실률 측정 방법.
제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
상기 상태는 관절염, 및/또는 류마티스 관절염, 및/또는 건선 관절염, 및/또는 골다공증 또는 그 조합인 골 손실률 측정 방법.
제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
상기 상태는 임플란트 주위 질환인 골 손실률 측정 방법.
제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
상기 상태는 치주 질환인 골 손실률 측정 방법.
제 17 항에 있어서,
0.2 mm/해(year) 이하의 골 손실률이 케어 표준(standard of care) 구강 위생 진료 및 유지보수 프로그램을 포함한 치료를 나타내는 골 손실률 측정 방법.
제 17 항에 있어서,
1 내지 1.5 mm/해의 범위 내의 골 손실률이 케어 표준 구강 위생 진료 및 유지보수 프로그램을 포함한 치료, 및 수 개월 이내 후속 방문을 나타내는 골 손실률 측정 방법.
제 17 항에 있어서,
2.0 mm/해 이상의 골 손실률이 수술적 치료를 나타내는 골 손실률 측정 방법.
제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하는 키트(kit).
제 22 항에 있어서,
샘플 수집 디바이스를 더 포함하는 키트.
제 23 항에 있어서,
상기 샘플 수집 디바이스는 무균 페이퍼 포인트(sterile paper point) 및/또는 주사기 및/또는 생검 디바이스인 키트.
제 22 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
샘플을 보존하는 보존 배지를 더 포함하는 키트.
제 22 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법을 수행하는 방식에 대한 지시(instructions)를 더 포함하는 키트.
제 22 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
중앙 실험실에 샘플을 보내기 위한 컨테이너를 더 포함하는 키트.
제 22 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
파골세포 및/또는 조골세포의 활성에 관한 1 이상의 표지들 또는 그 조합의 발현 수준들을 정량화하기 위해 필요한 요소들을 더 포함하는 키트.
제 22 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
파골세포 및/또는 조골세포의 활성에 관한 1 이상의 표지들 또는 그 조합을 명확하게 인지하는 적어도 하나의 검출가능한 라벨 및 적어도 하나의 기질(substrate)을 포함하는 키트.