KR20150108841A - 순환하는 생물활성 가용성 tnf의 선택적 감소를 위한 조성물 및 tnf-매개 질환의 치료 방법 - Google Patents

순환하는 생물활성 가용성 tnf의 선택적 감소를 위한 조성물 및 tnf-매개 질환의 치료 방법 Download PDF

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Abstract

인간 종양 괴사 인자(TNF)의 해리된 단량체의 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 또는 합성 항체 또는 리간드가 제공된다. 이러한 결합은 생물활성 삼량체 인간 가용성 TNF(sTNF)로의 단량체의 조립을 방해한다. 하나 이상의 분리된 항체 또는 리간드를 함유하는 약제학적 조성물이 추가로 제공된다. 인간 TNF에 의해 매개되는 질환(예를 들어, 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 소아 류마티스 관절염, 건선 관절염, 죽상동맥경화증, 대사 증후군, 알츠하이머병, HIV, II형 당뇨병)을 갖는 대상체를 치료하기 위한 항체의 조합의 사용 방법이 추가로 개시된다.

Description

순환하는 생물활성 가용성 TNF의 선택적 감소를 위한 조성물 및 TNF-매개 질환의 치료 방법{COMPOSITIONS FOR SELECTIVE REDUCTION OF CIRCULATING BIOACTIVE SOLUBLE TNF AND METHODS FOR TREATING TNF-MEDIATED DISEASE}
전자 양식으로 제출된 자료의 참조에 의한 포함
본 출원인은 본원에 전자 양식으로 제출된 서열 목록 자료를 본원에 참조로 포함한다. 이러한 파일은 GGP11PCT_ST25.txt"로 표지되어 있으며, 2014년 1월 23일에 생성하였고, 2 KB 크기이다.
종양 괴사 인자(TNF; 이전에는 종양 괴사 인자-α로 지칭)는 류마티스 관절염 및 관련 염증 질환, 예를 들어, 강직성 척추염, 소아 류마티스 관절염 및 건선 관절염의 발병에서 중요한 역할을 수행하는 염증유발(proinflamatory) 사이토카인이다. 인간 전구형태(proform), 막횡단-결합 TNF(transmembrane-bound TNF, tmTNF)는 3개의 비공유적으로 회합된 단량체를 포함하는 26-kDa 동종삼량체(homotrimer)이며, 각 단량체는 N-말단 서열이 세포막에 매립되어 있다. tmTNF의 각 단량체는 233개 아미노산 서열을 갖는다(UniProtKB/Swiss-Prot 등록 수탁 번호 P01375). 가용성 TNF(sTNF)는 그의 전구-형태 tmTNF로부터 효소에 의한 절단에 의해 형성되는 동종삼량체이다. sTNF 삼량체의 각 단량체는 157개 아미노산 서열(SEQ ID NO: 1)을 가지며, 이는 공개된 수탁 번호 P01374의 아미노산 77 내지 233과 동일한 서열이다.
둘 모두의 활성 TNF의 형태(tmTNF 및 sTNF)는 동종삼량체로서 존재하며10-13, 조립된 동종삼량체에서 TNF 단량체 간의 홈(groove) 내의 수용체-결합 부위를 인식하는 삼량체 수용체에 결합한다. 단량체 사이의 홈은 2개의 인접 단량체로부터의 아미노산 서열을 포함한다14,15. TNF의 둘 모두의 형태의 수용체 결합 영역은 동일하다.
삼량체 무결성(integrity)은 생물학적 기능에 필수적이다. tmTNF에 있어서, 삼량체 구조는 세포막으로의 tmTNF 삽입 전에 세포내에서 확립되며16, 막을 통과하는 단백질 스템(stem)의 부착에 더하여, 막 경계에서의 팔미토일화 아미노산 측쇄에 의한 추가의 지질 부착에 의해 tmTNF로 유지된다17. 대조적으로, sTNF 활성 삼량체는 비활성 단량체 SEQ ID NO: 1 및 이량체로 해리되며, 이는 3가지 형태 간의 정상 상태 평형에서 활성 sTNF 동종삼량체로 재형성된다18.
항-TNF 생물제제(biologics)는 항-TNF 모노클로널 항체 레미케이드(REMICADE)(인플릭시맙(Infliximab); 얀센 바이오테크, 인코포레이티드(Janssen Biotech, Inc.)) 및 휴미라(HUMIRA)(아달리무맙(Adalimumab), 애보트 래보러터리즈(Abbott Laboratories)), 및 Fc에 융합된 키메라 가용화 TNF 수용체, 즉, 널리 사용되는 엔브렐(ENBREL)(엔타너셉트(Entanercept), 바이오겐, 인코포레이티드(Biogen, Inc))을 사용하여 상기 언급된 염증 질환의 관리에 중요한 진전을 제공하였다1,2. 이러한 치료적 및 마케팅 성공은 심각한 감염 및 악성종양의 드물지만 통계적으로 유의미한 발생에 의해 반감되며3,4, 이는 아마도 면역 방어를 손상시키는 tmTNF5,6 기능의 동시의 차단과 관련이 있을 것이다. 이들 불리한 발생에는 결핵, 전신 진균 감염 및 주로 세포내 병원체, 예를 들어, 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 및 히스토플라스마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum)에 주로 기인하는 기타 세포내 감염, 및 특정 형태의 암이 포함된다. 이들 작용제가 염증유발 sTNF를 차단할 뿐 아니라, 이러한 세포내 감염 및 악성종양의 근접분비(juxtacrine) 세포 조절에 필수적인 tmTNF를 차단하기 때문에, 이들 결과는 놀라운 것이 아니다3,7,9.
둘 모두의 형태의 TNF의 수용체 결합 영역이 동일하기 때문에, 다른 형태에 대하여 하나의 형태의 수용체 결합을 선택적으로 차단하는 신규 모노클로널 항체의 개발에 대한 희망이 거의 없다. TNF의 짧은 서열에 대한 항체는 유용한 치료제를 야기하지 않는다. 예를 들어, 1987년도에, 소처(Socher) 등26은 TNF의 전체 또는 부분 합성 서열에 대한 항체의 분석에서, TNF의 생물활성 및 수용체 결합을 차단하는 것으로 보이는 TNF 단편 1 내지 15에 대한 높은 폴리클로널 항체 반응을 관찰하였다. 그러나, 이러한 16년의 관찰은 추가의 치료 시약의 개발로 이어지지 않았는데, 이는 아마도 TNF 수용체가 TNF 아미노산 1 내지 15와 관련되지 않은 불연속 표면 영역이기 때문일 것이다. 2001년도에 이후의 연구자들은 파필로마바이러스-유사 입자에 컨쥬게이트된 TNF 아미노산 4 내지 23을 결합시키고, 폴리클로널 항체의 유도 및 실험적 관절염의 약화를 관찰하였다27. 2007년도에 다른 연구자들은 바이러스-유사 입자-기반의 조성물에 결합된 동일한 단편 TNF 아미노산 4 내지 23을 사용하고, 실험적 관절염을 약화시키는 항체를 유도하였다. 전장 TNF 면역화와 대조적으로, 감염에 대한 저항성의 억제가 발생하지 않았다28. 이들 TNF 단편이 TNF의 수용체 결합 영역에 지향되지 않았기 때문에, 이들 간행물은 얻어진 폴리클로널 항체의 치료적 용도의 추가의 교시 또는 제안을 나타내지 않았고; 그때부터 추가의 연구가 공개된 적이 없다.
sTNF의 염증유발 활성을 선택적으로 억제하는 한편 선천 면역에 필요한 tmTNF 기능을 보존하려는 하나 이상의 최근의 시도는 합성 우성-음성 TNF 단량체 변이체의 설계를 수반하였으며, 이는 비활성이었던 삼량체를 형성한다19. 이들은 감염에 대한 선천 면역을 억제하지 않고, 실험적 관절염을 약화시키는 것으로 보이며20, 이는 관절염의 발병에서 sTNF의 중요한 역할을 강조한다. 다른 방법은 단량체간 접촉 영역과 상호작용하는 소분자 약물에 대한 검색이었다. 하나의 분자, SP304가 μM의 친화성으로 이러한 접촉 영역에 결합하여, 시험관내에서 삼량체 파괴를 시행하였다21,22.
다양한 염증 장애를 위한 항-TNF 치료의 분야에서의 많은 문헌에도 불구하고, 세포 면역의 억제로 인한 불리한 부작용을 야기하지 않는 이들 질환을 위한, 신규하고 유용한 조성물 및 치료적 또는 예방적 면역원성 조성물의 생성 방법이 당업계에 여전히 필요하다.
발명의 요약
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명자는 tmTNF의 구조 또는 생물활성에 영향을 미치지 않거나, 세포내 병원체에 의한 감염에 대한 치료되는 대상체의 감수성을 증가시키지 않는 선택적 항-TNF 단량체-특이적 생물학적 조성물 및 그의 다양한 사용 방법을 제공한다.
일 양태에서, 인간 TNF의 해리된 단량체의 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 또는 합성 항체 또는 리간드가 제공된다. 단량체로의 항체 또는 리간드의 결합은 생물활성 삼량체 인간 sTNF로의 단량체의 조립을 방해하거나 방지한다. 일 구현예에서, 항체 또는 리간드는 서열 PSDKPVAH, SEQ ID NO: 1의 아미노산 8 내지 15, 또는 PSDKPVAHV, SEQ ID NO: 1의 아미노산 8 내지 16의 단량체-특이적 에피토프 A2에 특이적으로 결합한다. 또 다른 구현예에서, 항체 또는 리간드는 서열 EPIYLGGVF, SEQ ID NO: 1의 아미노산 116 내지 124의 단량체-특이적 에피토프 F에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, 항체는 에피토프 A2 및 F에 대해 유도된 이중-특이적 항체이다.
다른 양태에서, 약제학적 조성물은 인간 TNF의 해리된 단량체의 에피토프에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 분리된 또는 합성 항체 또는 리간드, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하며, 상기 결합은 생물활성 삼량체 인간 sTNF로의 단량체의 조립을 방해하거나 방지한다. 특정 구현예에서, 조성물은 상기 기술된 항체 중 1개 또는 2개를 함유한다.
추가의 양태에서, 인간 TNF의 해리된 단량체의 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 또는 합성 항체 또는 리간드의 제조 또는 생성 방법이 제공된다.
또 다른 양태에서, 가용성 인간 TNF(sTNF)에 의해 매개되는 질환을 갖는 대상체의 치료 방법은 tmTNF의 양, 농도 또는 생물활성에 영향을 미치지 않고, 질환을 갖는 대상체의 혈액 중 sTNF의 양, 농도 또는 생물활성을 감소시키는 단계를 포함한다. 이는 tmTNF의 양, 농도 또는 생물활성에 영향을 미치지 않고, 생물활성 삼량체 인간 sTNF로의 TNF의 해리된 단량체의 생체내 조립 또는 재조립을 방해, 방지 또는 감소시킴으로써 달성된다. 특정 구현예에서, 이러한 방법은 상기 및 본원에 기술된 단량체-특이적 항체, 이중-특이적 항체, 리간드 및 조성물을 사용한다. 일 구현예에서, 질환은 류마티스 관절염(RA), 소아 류마티스 관절염, 강직성 척추염(AS), 건선 관절염 또는 건선이다.
또 다른 양태에서, sTNF 상승은 또한 초기 HIV 감염, 및 잠복 HIV 감염의 재발 및 II형 당뇨병에 연루된다. 따라서, 또 다른 양태에서, HIV-1으로 감염되고 항-레트로바이러스 약물로 치료된 대상체의, 신규 감염(또는 잠복 HIV로 인한 재결합 감염) 발생의 방지 방법은 항-레트로바이러스 치료법(ART)으로 치료된 대상체에게, ART를 중단한 후에, 본원에 기술된 바와 같은 분리된 또는 합성의 선택적 항-TNF 단량체-특이적 항체 또는 리간드, 또는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, II형 당뇨병이 있는 대상체의 치료 방법은 선택적으로, 공지되어 있는 항-당뇨병 치료법과 병용하여, 상기 기술된 바와 같은 분리된 또는 합성의 선택적 항-TNF 단량체-특이적 항체 또는 리간드, 또는 약제학적 조성물을 II형 당뇨병의 치료를 필요로 하는 대상체에게 주기적으로 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본원에 기술된 TNF 단량체-특이적 항체, 리간드, 이중-특이적 항체 또는 조성물은 본원에 확인된 임의의 질환을 포함하는, 가용성 인간 TNF에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위해 제공된다. 다른 양태에서, 본원에 확인된 임의의 질환을 포함하는 가용성 인간 TNF에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 치료용 약제의 제조에서의 본원에 기술된 항체, 리간드 또는 조성물의 용도가 제공된다.
이들 방법 및 조성물의 다른 양태 및 이점은 하기의 상세한 설명에 추가로 기술된다.
도 1은 TNF 경계면 A 및 TNF 경계면 F에 대한 면역원 및 에피토프 검출 서열을 예시한 것이며, 이를 사용하여, 본원에 기술된 3개 단량체-특이적 TNF 에피토프 A1, A2 및 F의 서열 및 가장자리(margin)뿐 아니라, 이에 대해 생성된 항-TNF 단량체-특이적 항체의 결합 활성을 확인하였다. 이들 서열은 하기 실시예 1에 논의되어 있다.
도 2a는 sTNF 아미노산 1 내지 23으로 랫트(rat)를 면역화시킴에 의한 TNF 단량체-특이적 에피토프를 예시하는 막대 그래프이다. 항체 결합 반응을 재조합 TNF(rTNF), 단량체, 이량체 및 삼량체의 혼합물, 및 표기된 말단 절단(truncated) TNF 펩티드를 사용하는 합성 펩티드 상에서 측정하였다. 합성 검출 펩티드에는 다음이 포함된다: SEQ ID NO: 1의 TNF 아미노산 1 내지 10, 전혀 결합을 나타내지 않음; SEQ ID NO: 1의 TNF 아미노산 5 내지 12, 최소의 결합 내지 결합 부재; A1 에피토프 SSRTPSDKP, SEQ ID NO: 1의 TNF 아미노산 4 내지 12; SEQ ID NO: 1의 TNF 아미노산 4 내지 11, SSRTPSDK; SEQ ID NO: 1의 TNF 아미노산 9 내지 15, SDKPVAH; SEQ ID NO: 1의 아미노산 8 내지 15의 A2 에피토프 서열; SEQ ID NO: 1의 TNF 아미노산 8 내지 14, PSDKPVA; 및 SEQ ID NO: 1의 TNF 아미노산 16 내지 23, VVANPQAE, 결합을 나타내지 않음. 명백하게 오직 2개의 중첩 에피토프만이 TNF 아미노산 1 내지 23에 대하여 랫트 항혈청에 의해 검출되었으며, 이는 에피토프 A1, TNF 아미노산 4 내지 12 및 A2, TNF 아미노산 8 내지 15였다.
도 2b는 합성 펩티드와 함께, 도 2a에 기술된 동일한 절차를 사용하여 마우스 혈청에서 검출되는 A2 에피토프 PSDKPVAHV의 가장자리를 예시하는 막대 그래프이다. 합성 검출 펩티드에는 다음이 포함된다: SEQ ID NO: 1의 TNF 아미노산 10 내지 17, DKPVAHVV, 최소의 결합을 나타냄; TNF 아미노산 9 내지 16, 최소의 결합; A2 에피토프 PSDKPVAHV, SEQ ID NO: 1의 TNF 아미노산 8 내지 16; SEQ ID NO: 1의 TNF 아미노산 8 내지 15, PSDKPVAH; 및 SEQ ID NO: 1의 TNF 아미노산 8 내지 14, PSDKPVA, 결합 부재. 랫트 및 토끼 혈청을 사용하는 경우, 에피토프 A2의 경계는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 8 내지 15이다. 마우스의 면역계는 그래프에 나타낸 바와 같이, 오직 TNF 아미노산 8 내지 16만을 알아내며, TNF 아미노산 8 내지 15에는 결합하지 않는다.
도 2c는 SEQ ID NO: 1의 sTNF 아미노산 112 내지 128, KPWY EPIYLGGVF QLEK로 랫트 또는 마우스를 면역화시킴에 의한 단량체-특이적 TNF 에피토프의 가장자리를 확인한 결과를 예시한 막대 그래프이다(경계면 영역은 밑줄 표시; F 에피토프는 볼드체). 항체 결합 반응을 재조합 TNF(rTNF), 단량체, 이량체 및 삼량체의 혼합물, 및 표기된 4개의 말단 절단 TNF 펩티드를 사용하는 합성 펩티드 상에서 측정하였다. 합성 펩티드는 IYLGGVF, SEQ ID NO: 1의 아미노산 118 내지 124; PIYLGGVF, SEQ ID NO: 1의 아미노산 117 내지 124, EPIYLGGVF, SEQ ID NO: 1의 아미노산 116 내지 124(에피토프 F) 및 EPIYLGGV, SEQ ID NO: 1의 아미노산 116 내지 123이었다. 아미노산 116 내지 124 펩티드에 대하여 결합이 가장 컸으며, 이에 의해, 에피토프의 가장자리가 나타났다(에피토프 F로 지칭).
도 3a는 하기 실시예 2에 기술된 바와 같은, 200 ng/㎖ sTNF, 비오틴-표지 항체 및 비-비오틴 표지 항체를 사용하는 샌드위치 검정으로부터의 데이터를 예시한 것이다. 결합 곡선은 상용의 레미케이드 항-TNF 항체가 비오틴으로 표지되고, sTNF(삼량체, 이량체 및 단량체)와 혼합되는 경우, 다량체 형태의 TNF에 결합하는 것을 보여준다. 혼합물 중 비오티닐화 항체-TNF는 여전히, 플레이팅된 비표지 레미케이드 항체(●)와 결합하고 그와 샌드위치를 형성할 수 있는 이용가능한 TNF 삼량체 에피토프를 갖는다. 대조적으로, 단백질 A/단백질 G 정제된 IgG(○)를 SEQ ID NO: 1의 TNF 아미노산 1 내지 23으로 면역화된 랫트로부터 수득하였다. 이러한 정제된 IgG는 에피토프 A1에 선택적으로 결합하는 단량체-특이적 항-TNF 및 에피토프 A2에 선택적으로 결합하는 단량체-특이적 항-TNF의 혼합물을 함유한다. 정제된 IgG(○)는 검정에서 샌드위치가를 형성하지 않았는데, 그 이유는 이들 항체가 한번 TNF 혼합물 중 TNF 단량체와 결합하면, 표지된 단량체-특이적 항체-TNF 복합체가 플레이트 상의 플레이팅된 비표지 단량체-특이적 항체에 결합하는데 이용가능한 단량체-특이적 에피토프를 갖지 않기 때문이다. 표지된 TNF 단량체-특이적 항체-단량체 복합체는 결합 없이 플레이트로부터 간단히 세척된다. 삼량체 TNF에 결합하는 레미케이드 항체를 이러한 검정에서 양성 대조군으로 사용하였다. 따라서, 항-A1 또는 항-A2 항체 중 어느 것도 sTNF의 삼량체 형태에 결합하지 않는다.
도 3b는 시약으로서 다음을 사용하는 도 3a의 검정과 유사한 샌드위치 검정으로부터의 데이터를 예시한 것이다: 상용의 레미케이드 항-TNF 항체(●); 오직 에피토프 F: EPIYLGGVF에만 선택적으로 결합하는 TNF 에피토프 F에 대한 단량체-특이적 항혈청으로부터 친화성 정제된 IgG(X) 및 오직 에피토프 F: EPIYLGGVF에만 선택적으로 결합하는 TNF 에피토프 F에 대한 단량체-특이적 항혈청으로부터 단백질 A/G 정제된 IgG(□). 따라서, 상용의 레미케이드 항-TNF 항체와 대조적으로, 항-F 항체는 sTNF의 삼량체 형태에 결합하지 않는다.
도 4a는 단량체 특이적 에피토프 PSDKPVAH 및 SSRTPSDKP(각각 에피토프 A2 및 A1)에 선택적으로 결합하는 항체를 함유하는 TNF 아미노산 1 내지 23에 대하여 생성된 항혈청을 사용하는, 표적 세포 내의 sTNF-유도 세포독성의 항체 저해의 검정 결과를 예시한 것이다. 모든 웰에서 200 pg/㎖ TNF를 사용한 항혈청의 역가는 막대 아래에 1×106, 2.5×105, 1×105, 2.5×104, 1×104 및 2.5×103으로 나타나 있다. 마지막 막대는 50% NRS에서의 sTNF이다.
도 4b는 TNF 에피토프 F에 대한 항혈청에 의한, 실시예 2에 기술된 검정에서의 악티노마이신-처리된 WEHI 세포 내의 sTNF 세포독성의 기능적 차단을 예시한 것이다. 랫트에서, 면역원 KPWYEPIYLGGVFQLEK, SEQ ID NO: 1의 아미노산 112 내지 128(TNF의 F 베타 시트(beta sheet) 경계면 서열)에 대하여 생성된 단량체-특이적 항혈청의 표시된 희석액(50%, 16.7%, 5.6%, 1.85%, 0.48%)을 sTNF 생물활성을 저해하는 그들의 능력에 대하여 200 pg/㎖ TNF 및 50% NRS(정상 랫트 혈청)와 비교하였다. 이러한 도면에 나타낸 바와 같이, TNF 세포독성의 저해를 0.48% 내지 50% 희석한 항혈청을 사용하여 나타내었다. 따라서, 에피토프 F에 대한 단량체-특이적 항혈청은 항혈청의 존재 하에 세포의 복제를 증가시킴으로써 입증된 바와 같이, 세포에 대한 sTNF의 세포독성 효과를 저해하는 능력을 보였다. 통계적 유의성을 일원분산분석 및 던넷(Dunnett) 검정을 사용하는 사후 검정에 의해 결정하였다. 삼량체 TNF에 결합하는 레미케이드 항체를 이러한 검정에서 양성 대조군으로 사용하였다.
도 5는 TNF 에피토프 A1 또는 A2에 대하여 생성된 모노클로널 항체에 의한 WEHI 세포 내의 sTNF 세포독성의 저해를 보여주는 막대 그래프이다. 세포 복제(OD)를 TNF의 부재 하에 성장한 WEHI 세포에서 측정하였으며, 세포는 우수한 복제를 보였다. SEQ ID NO: 1의 전장 TNF 1 내지 157, 0.2 ng/㎖의 존재 하에 성장한 WEHI 세포에 의해, TNF가 복제를 저해하는 것으로 나타났다. TNF에 더하여 1 ㎍/㎖의 상용의 레미케이드 항-TNF 항체에서 성장시킨 세포는, 항체가 TNF의 부재 하에 나타난 것과 동일한 수준으로 복제를 복구시키는 것을 보여주었다. TNF에 더하여 TNF 에피토프 A1(SEQ ID NO: 1의 아미노산 4 내지 12)에 대한 본 발명자의 단량체-특이적 모노클로널 항체 A1-4H6, 10 ㎍/㎖은 WEHI 세포 복제를 저해하지 못했으며, 이는 단독의 TNF에 노출된 세포의 수준으로 유지되었다. WEHI 세포를 TNF에 더하여 TNF 에피토프 A2(SEQ ID NO: 1의 아미노산 8 내지 16)에 대한 본 발명자의 단량체-특이적 모노클로널 항체 A2-8D12, 10 ㎍/㎖; 및 TNF에 더하여 TNF 에피토프 A2(SEQ ID NO: 1의 아미노산 8 내지 16)에 대한 본 발명자의 단량체-특이적 모노클로널 항체 A2-10H10, 0.25 ㎍/㎖의 존재 하에 배양하였다. 이들 후자의 2개의 단량체-특이적 모노클로널 항체로부터의 데이터는 통계적으로 매우 유의적인 sTNF 세포독성의 저해(즉, 세포 사멸의 감소)를 보여주었다. 제2 단량체-특이적 모노클로널 항체 A2-10H10은 높은 민감성, 이러한 검정에서 다른 단량체-특이적 항-A2 항체 A2-8D12에 비하여, 효능의 40배의 증가를 보였다. 이들 결과는 단량체-특이적 항-A2 모노클로널 항체가 sTNF를 저해하며, 40배 더 낮은 용량에 의해 입증되는 경우, 그러한 항체 A2-10H10이 다른 것들보다 더 높은 친화성을 나타내는 것을 보여준다. 심지어 높은 용량에서도 단량체-특이적 항-A1 모노클로널 항체에 의하여 저해가 입증되지 않았다. 이들 데이터는 TNF 아미노산 1 내지 23 폴리클로널 항혈청의 효과가 오직 단량체-특이적 항-A2 항체 때문이었음을 입증한다.
상세한 설명
본 발명자는 선택적 항-TNF 단량체-특이적 생물학적 조성물, 및 부분적으로 또는 완전히 TNF 유리 단량체의 내부 경계면 접촉 영역 내의 선택된 에피토프에 대해 유도된 항체 및/또는 다른 리간드가 다른 단량체와의 그들의 회합을 차단하고, 생물활성 sTNF 삼량체 형성의 점진적인 방해를 야기한다는 결정에 기초한 다양한 사용 방법을 제공한다. 류마티스 관절염(RA), 소아 류마티스 관절염, 강직성 척추염(AS) 및 건선 관절염(PA), 건선 및 다른 염증 질환의 치료를 위하여, sTNF의 활성을 선택적으로 차단하나 tmTNF의 활성을 차단하지 않는 항체 또는 리간드, 예를 들어, 모노클로널 항체 또는 이중-특이적 항체를 갖는 것이 유리하다.
I. 항체/리간드
따라서, 본 발명은 인간 TNF의 해리된 단량체의 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 또는 합성 항체 또는 리간드를 제공하며, 상기 결합은 생물활성 삼량체 인간 sTNF로의 단량체의 조립을 방해하거나 방지한다.
본 발명자는 부분적으로 또는 완전히 유리 TNF 단량체의 내부 경계면 접촉 영역 내의 특정 에피토프에 대해 유도된 항체가 다른 단량체와의 그들의 회합을 차단하고, 삼량체 형성의 점진적인 방해를 야기할 것을 알아냈다. TNF에 대한 공지되어 있는 간행물과 대조적으로, 본 발명자는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 15의 TNF 서열 내에 2개의 중첩 에피토프가 존재하는 것을 알아냈다. SEQ ID NO: 1의 아미노산 4 내지 12에 걸쳐 있는 하나의 에피토프 A1은 단량체-특이적이었으나, 삼량체 형성을 방해하지 않았다. SEQ ID NO: 1의 아미노산 8 내지 15 또는 8 내지 16에 걸쳐 있는 다른 에피토프 A2는 단량체-특이적이며, 삼량체 형성을 방해하였다. 또한, 본 발명자는 신규한 인식되지 않은 에피토프 F, TNF의 F β 시트 내의 SEQ ID NO: 1의 아미노산 116 내지 124를 확인하였으며, 이는 단량체-특이적이었으며, 삼량체 형성을 방해하였다. 이들 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 리간드의 발견 및 그의 신규한 용도는 하기 및 실시예에 상세히 논의되어 있다.
조기 x-선 결정학 연구에 의해, 157개 아미노산(SEQ ID NO: 1) sTNF 단량체가 ""젤리-롤(jelly-roll)" 토폴로지가 있는 연장된, 역평행 β 플리티드 시트(pleated sheet) 샌드위치"를 형성하는 것으로 확립되었다. 밀접하나 비공유적으로 회합된 3개의 단량체는 활성 삼량체를 구성한다11. 5개 스트레치의 아미노산 서열이 경계면 β 시트 접촉 표면을 형성하였다: A, 아미노산 11 내지 18; A', 아미노산 35 내지 39; C, 아미노산 54 내지 67; F, 아미노산 114 내지 126 및 H, 아미노산 149 내지 157, 전부 SEQ ID NO: 1의 아미노산, A, A', C, F 및 H는 β 시트 명명 규칙을 지칭한다11. 본 발명자는 잠재적인 B 세포 에피토프에 대한 모든 5개의 영역을 분석하고, 부분적으로 경계면 영역 내의 2개의 에피토프(A β 시트) 및 완전히 경계면 영역 내의 1개의 에피토프(F β 시트)에 대한 항체를 검출하고 맵핑하였으며, 모두는 공지되어 있는 TNF의 수용체 결합 부위의 영역 외측에 존재한다12,13,15. 하기 실시예 1을 참조한다.
일 구현예에서, 선택적 항-TNF 단량체-특이적 항체 또는 리간드는 서열 PSDKPVAH, SEQ ID NO: 1의 아미노산 8 내지 15 또는 서열 PSDKPVAHV, SEQ ID NO: 1의 아미노산 8 내지 16의 에피토프 A2에 결합한다. 다른 구현예에서, 선택적 항-TNF 단량체-특이적 항체 또는 리간드는 서열 SSRTPSDKP, SEQ ID NO: 1의 아미노산 4 내지 12의 A1 에피토프에 결합한다. 다른 구현예에서, TNF 단량체-특이적 항체 또는 리간드는 서열 EPIYLGGVF, SEQ ID NO: 1의 아미노산 116 내지 124의 F 에피토프에 결합한다.
하기 기술된 바와 같이, A1 에피토프에 대한 항체는 TNF 단량체-특이적인 한편, 단독으로 사용되는 경우 TNF 기능을 차단하는데 비활성인 것으로 관찰되었다. 이들 A2 및 F 에피토프에 대한 항체는 TNF 단량체에 특이적으로 결합하나 삼량체에는 결합하지 않으며, sTNF 삼량체의 조립을 방해하고, 시험관내에서 sTNF 기능을 저해한다. 이들 단량체-특이적 항-A2 및 항-F 에피토프 항체 또는 리간드는 막횡단 TNF(tmTNF)에 결합하지 않으며, tmTNF의 구조 또는 생물활성에 영향을 미치지 않는다. 또한, 이들 항체 또는 리간드는 무손상 생물활성 삼량체 인간 sTNF에 결합하지 않는다. A2 및 F 에피토프에 대한 모노클로널 항체는 류마티스 관절염 및 sTNF-관련 병증이 있는 관련 염증 질환을 위한 보다 안전한 sTNF-선택적 항-TNF 생물제제로서의 치료적 용도에 유용하다.
본원에 사용되는 용어 "항체"는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 무손상 면역글로불린을 지칭한다. 용어 "항체 단편"은 제한 없이, 분리된 단일 항체 쇄, sc-Fv 작제물, Fab 작제물, Fab2 작제물 또는 경쇄 가변 또는 상보성 결정 영역(CDR) 서열 등을 포함하는 무손상 항체 구조보다 더 적은 것을 지칭한다. 용어 "이중-특이적" 항체는 하나의 에피토프, 예를 들어, A2 에피토프에 결합하는 1개의 중쇄 및/또는 1개의 경쇄, 및 제2 에피토프, 예를 들어, F 에피토프에 결합하는 1개의 중쇄 및/또는 1개의 경쇄를 함유하는 합성에 의해 또는 재조합에 의해 생성된 항체를 지칭한다. 용어 "리간드"는 표기된 에피토프에 결합하도록 설계될 수 있는 다른 합성 분자 또는 서열을 지칭하기 위해 사용된다.
"고 친화성"은 TNF 단량체-특이적 에피토프 A2 또는 F로의 문제의 항체 또는 리간드의 결합의 세기이다. 일 구현예에서, A2 또는 F에 대한 항체/리간드는 10 나노몰(nM) 미만의 친화성으로 결합한다. 다른 구현예에서, A2 또는 F에 대한 항체/리간드는 1 나노몰(nM) 미만의 친화성으로 결합한다. 다른 구현예에서, A2 또는 F에 대한 항체/리간드는 100 피코몰(pM) 미만의 친화성으로 결합한다. 다른 구현예에서, A2 또는 F에 대한 항체/리간드는 10 pM 미만의 친화성으로 결합한다.
따라서, 일 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 리간드는 폴리클로널, 친화성-정제 또는 고 친화성 항체 또는 그의 단편일 수 있다. 일 구현예에서, 항체 또는 리간드는 모노클로널 항체 또는 그의 단편이다. 다른 구현예에서, 항체 또는 리간드는 항체의 분리된 단쇄이다. 또 다른 형태의 항체, 예를 들어, 합성 항체, 재조합 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 또는 그의 단편은 상기 기술된 에피토프 중 하나에 대해 유도된 리간드 또는 항체로 사용될 수 있다. 이러한 항체의 적절한 단편도 또한 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 항체 또는 리간드 또는 그의 단편은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자를 더 포함한다. 항체 또는 리간드 또는 단편은 공지되어 있는 통상의 방법에 의해 PEG와 회합되거나 그와 융합될 수 있다30,31.
선택된 에피토프 중 하나에 특이적으로 결합하는 항체 또는 리간드의 생성은 통상의 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, 폴리클로널 항체 조성물은 전형적으로, 선택된 포유류, 예를 들어, 영장류, 설치류 또는 인간을 특정 에피토프를 함유하는 펩티드/폴리펩티드 조성물로 면역화시킴으로써 생성된다. 예를 들어, 도 2a 내지 도 2c에 기술된 항혈청의 설명을 참조한다. 고 역가, 고 친화성 폴리클로널 항체의 선택은 표준 기술에 의해, 예를 들어, 효소-결합 면역흡착 검정 및 표면 플라스마 공명으로 모니터링될 수 있다. 필요에 따라, 폴리클로널 항체 분자는 포유류로부터, 예를 들어, 전혈, 혈장 또는 혈청으로부터 분리될 수 있으며, 추가로 통상의 기술에 의하여 면역화된 포유류의 혈장 또는 혈청으로부터 정제될 수 있다. 통상의 수집 기술은 다른 것들 중 특히, 혈장분리교환법(plasmapheresis), 단백질 A/G 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 이러한 폴리클로널 항체 조성물은 그들 자체가 본 발명의 약제학적 조성물로서 사용될 수 있다.
대안적으로, 모노클로널 항체는 면역화된 포유류로부터 수득되고, 비-IgG-생성 골수종 세포에 융합되어, 하이브리도마를 형성하는 항체 생성 세포를 사용하여, 또는 공지되어 있는 분자 생물학 기술에 의한 추출을 사용하여 활성화된 면역 B 세포로부터의 선택으로부터, 현재 통상적인 기술에 의해 에피토프 중 임의의 것에 대하여 생성될 수 있다. 이들 모노클로널 항체는 추가로 다른 형태의 항체 및 리간드, 예를 들어, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 다른 항체 단편 또는 리간드는 파지 디스플레이 라이브러리, 항체 단편 및 그들의 혼합물을 스크리닝함으로써 생성될 수 있다. 이들 유형의 항체 및 리간드를 생성하는 기술은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 리간드 그들 자체는 상기 확인된 에피토프의 개시된 아미노산 서열을 사용하여 생성될 수 있다32,35-39.
키메라 항체는 공지되어 있는 기술을 사용하여 유사하게 발생될 수 있다. 키메라 항체는 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래된 분자이다. 단쇄 항체는 또한 본 발명에 따라 생성된 폴리클로널 또는 모노클로널 항체의 가변 부분을 사용하여 미국 특허 제4,946,778호 및 제4,704,692호에 기술된 바와 같은 통상의 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 항체 단편, 예를 들어, Fab, F(ab)2 및 scFv 단편 및 그의 라이브러리가 본원에 기술된 바와 같은 선택적 항-TNF 단량체-특이적 항체 또는 리간드의 생성에 사용될 수 있다.
선택된 에피토프 중 2개 이상에 특이적으로 결합하는 이중-특이적 항체 또는 리간드의 생성은 통상의 기술을 사용할 수 있다. 다중의 에피토프에 결합하는 이중-특이적 항체를 개발하는 것은 해당 분야의 기술 내에 있다. 예를 들어, 문헌[Hornig N, Farber-Schwarz A., "Production of bispecific antibodies: diabodies and tandem scFv.", 2012, Methods Mol Biol., 907:713-27]; 문헌[Speiss, C. et al, "Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies, Jul 7, 2013, Nature Biotechnology, 31:753-758]; 및 문헌[Jonathan S Martin and Zhenping Zhu, "Recombinant approaches to IgG-like bispecific antibodies", 2005 Acta Pharmacologica Sinica, 26: 649-658]을 참조한다. 일 구현예에서, 에피토프 A2 및 에피토프 F에 결합하거나 이와 반응할 수 있는 이중특이적 항체가 발생된다. 이러한 이중특이적 항체, 예를 들어, A2 및 F와 반응성인 항체는 단일의 항-A2 또는 항-F 항체 또는 단독의 리간드보다 결합활성을 향상시키고, 더 큰 효능을 생성할 것으로 예상된다.
상기 확인된 TNF 단량체-특이적 에피토프 중 하나를 사용하여 재조합 복합 면역글로불린 scFv 라이브러리(예를 들어, 파지 디스플레이)를 스크리닝하여 TNF 단량체에 결합하는 면역글로불린 라이브러리 구성원을 분리함으로써 다른 선택적 항-TNF 단량체-특이적 항체 또는 리간드가 발생될 수 있다. 예를 들어, 당업계에 널리 공지되어 있는 다른 문헌들 중 특히, 문헌[Phage Display of Peptides and Proteins, A Laboratory Manual., eds. Kay, BK et al, Elsevier Inc. (1996)]을 참조한다. 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하기 위한 키트는 상업적으로 입수가능하며, 예를 들어, 파마시아(Pharmacia) 재조합 파지 항체 시스템, 카탈로그 번호 27-9400-01; 스트라타진(Stratagene) 파지 디스플레이 키트 등이 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,223,409호, 국제 공개 제WO92/09690호, 제WO90/02809호 등을 참조한다.
II. 약제학적 조성물
다른 양태에서, 약제학적 조성물은 인간 TNF의 해리된 단량체의 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 또는 합성 항체 또는 리간드를 포함하며, 상기 결합은 생물활성 삼량체 인간 sTNF로의 단량체의 조립을 방해하거나 방지한다.
약제학적 조성물은 상기 기술된 선택적 항-TNF 단량체-특이적 항체 또는 리간드 중 하나 이상을 적절한 담체 또는 희석제와 함께 함유한다. 따라서, 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 서열 PSDKPVAH, SEQ ID NO: 1의 아미노산 8 내지 15 또는 PSDKPVAHV, SEQ ID NO: 1의 아미노산 8 내지 16을 갖는 A2 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-TNF 단량체-특이적 항체 또는 리간드를 함유한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 서열 EPIYLGGVF, SEQ ID NO: 1의 아미노산 116 내지 124를 갖는 F 에피토프에 특이적으로 결합하는 선택적 항-TNF 단량체-특이적 항체 또는 리간드를 함유한다.
다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 2개의 항-TNF 단량체-특이적 항체 또는 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 조성물은 A2 에피토프 PSDKPVAH, SEQ ID NO: 1의 아미노산 8 내지 15 또는 PSDKVPAHV, SEQ ID NO: 1의 아미노산 8 내지 16에 특이적으로 결합하는 항체 또는 리간드, 및 서열 EPIYLGGVF를 갖는 F 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 리간드를 포함한다.
추가의 구현예에서, A2 에피토프 및 F 에피토프와 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체를 함유하는 약제학적 조성물은 또한, 가용성 TNF 삼량체 형성을 간섭하는데 유용하다. 당업계에 공지되어 있는 다른 형태의 멀티-리간드 작제물은 또한, A2 및/또는 F 에피토프로의 결합을 이용하여, 삼량체 방해를 제공할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 항-TNF 단량체-특이적 조성물은 sTNF에 의해 매개되는 다양한 질환을 치료하는데 통상적으로 사용되는 다른 치료법 또는 약제학적 양생법과 함께 또는 그와 순차적으로 사용될 수 있다.
본원에 기술된 이들 약제학적 조성물은 또한, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 함유한다. 본원에 정의된 바와 같이, 본 발명의 면역원성 단백질성 조성물에 사용하기에 적절한 약제학적으로 허용되는 담체는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 담체는 제한 없이, 물, 염수, 완충 염수, 인산염 완충제, 알코올/수용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 통상적으로 사용되는 다른 희석제, 애쥬번트 및 부형제가 통상의 기술에 따라 첨가될 수 있다. 이러한 담체는 에탄올, 폴리올 및 그들의 적절한 혼합물, 식물성 오일 및 주사가능한 유기 에스테르를 포함할 수 있다. 완충제 및 pH 조절제도 또한 사용될 수 있다. 완충제는 제한 없이, 유기 산 또는 염기로부터 제조된 염을 포함한다. 대표적인 완충제는 제한 없이, 유기산 염, 예를 들어, 시트르산의 염, 예를 들어, 시트르산염, 아스코르브산, 글루콘산, 탄산, 타르타르산, 석신산, 아세트산 또는 프탈산, 트리스(Tris), 트리메탄민 하이드로클로라이드 또는 인산염 완충제를 포함한다. 비경구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이티드 링거 또는 고정유를 포함할 수 있다. 정맥내 담체는 유체 및 영양소 보충제, 전해질 보충제, 예컨대 링거 덱스트로스에 기반한 것 등을 포함할 수 있다. 예를 들어 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제 및 비활성 기체 등과 같은 보존제 및 기타 첨가제가 또한 약제학적 담체에 제공될 수 있다. 본 발명은 담체의 선택에 의해 제한되지 않는다. 상기 기술된 성분으로부터, 적절한 pH 등장성, 안정성 및 다른 통상적인 특성들을 갖는 이들 약제학적으로 허용되는 조성물의 제조는 당업계의 기술 내에 있다. 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd ed, Lippincott Williams & Wilkins, publ., 2012]; 및 문헌[The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 7th edit., eds. R. C. Rowe et al, Pharmaceutical Press, 2012]과 같은 문헌을 참조한다.
III. 사용 방법
A. 특정 염증 증상의 치료
포유류, 바람직하게는 인간, 가용성 인간 TNF(sTNF)에 의해 매개되는 질환을 갖는 대상체의 치료 방법은 tmTNF의 양, 농도 또는 생물활성에 영향을 미치지 않고, 질환을 갖는 대상체의 혈액 내의 sTNF의 양, 농도 또는 생물활성을 감소시키는 단계를 포함한다. 이러한 감소는 생물활성 삼량체 인간 sTNF로의 TNF의 해리된 단량체의 생체내 조립 또는 재조립을 방해하거나, 방지하거나, 감소시킴으로써 발생한다. 따라서, 일 구현예에서, 이러한 방법은 TNF의 해리된 단량체의 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 또는 합성 항-TNF 단량체-특이적 항체 또는 리간드를 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 선택된 항체 또는 리간드는 무손상 생물활성 sTNF 삼량체에 결합하지 않는다. 선택된 항체 또는 리간드는 막횡단 TNF(tmTNF)에 결합하지 않으며, tmTNF의 구조 또는 생물활성에 영향을 미치지 않는다.
일 구현예에서, 상기 방법은 류마티스 관절염의 치료에 유용하다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 강직성 척추염의 치료에 유용하다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 소아 류마티스 관절염의 치료에 유용하다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 건선 관절염의 치료에 유용하다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 건선의 치료에 유용하다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 염증 동안 또는 염증 장애의 경과 동안 생성되는 생물활성 삼량체 sTNF의 병원성 영향의 치료에 치료에 유용하다. 본 발명의 방법의 추가의 구현예는 sTNF 및/또는 염증이 낮은 또는 만성의 수준에서 역할을 수행하는 다른 질환의 치료를 포함한다. 일 구현예에서, 이러한 질환은 HIV-1이다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 2형 당뇨병을 치료하는데 유용하다. 또 다른 구현예에서, 치료적 선택적 항-TNF 단량체-특이적 항체 또는 리간드는 비만의 병리에서 염증의 치료 방법에 유용하다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 대사 증후군의 치료에 유용하다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 죽상동맥경화증 및 관련 심혈관 질환의 치료에 유용하다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 알츠하이머병의 병리에 수반되는 염증의 치료에 유용하다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 신경변성 질환의 병리에 수반되는 염증의 치료에 유용하다. 또 다른 염증 질환40은 본원에 기술된 조성물 및 방법으로 치료될 수 있다. 이러한 치료는 면역 억제 및 비-선택적 작용제와 관련된 이환율 및 사망률의 위험이 없다.
따라서, 일 구현예에서, 상기 방법에 유용한 항체/리간드는 A2 에피토프 서열 PSDKPVAH 또는 PSDKPVAHV에 결합한다. 상기 방법의 다른 구현예에서, 상기 방법에 유용한 항체/리간드는 F 에피토프 EPIYLGGVF에 결합한다. 이들 선택된 에피토프로의 항체/리간드의 결합은 생물활성 삼량체 인간 sTNF로의 단량체의 조립을 방해하거나 방지한다. 이러한 방법의 추가의 구현예에서, 대상체에는 이들 선택적 항-TNF 단량체-특이적 항체/리간드 중 2개가 투여된다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 상기 논의된 이중특이적 항체를 포함할 수 있다.
이러한 방법의 다른 양태는 시간이 지남에 따라, 대상체의 혈류 내의 생물활성 삼량체 sTNF의 감소된 양 또는 농도를 유지하는 단계를 포함한다. 이러한 유지는 상기 언급된 선택적 항-TNF 단량체-특이적 항체, 리간드, 모노클로널 항체, 이중특이적 항체 또는 이를 함유하는 약제학적 조성물 중 하나 이상의 반복 투여를 수반할 수 있다. 이들 방법의 사용에 의하여, 세포내 병원체에 의한 감염, 예를 들어, 결핵, 세균성 패혈증, 침습성 진균 감염 또는 히스토플라스마증에 대한, 또는 악성종양, 예를 들어, 림프종 또는 간비장 T-세포 림프종에 대한 대상체의 감수성은 치료에 의해 증가되지 않는다.
이들 치료 방법에 따르면, 선택적 항-TNF 단량체-특이적 항체 또는 리간드는 약제학적 조성물에서, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제 중에 존재한다. 예를 들어, 비-sTNF 면역원에 대해 유도된 항체/리간드 중 1개 또는 2개 및 가능하게는 항체를 함유하는 상기 기술된 약제학적 조성물 중 임의의 것이 사용될 수 있다.
상기 기술된 각각의 방법에서, 본 발명의 이들 조성물은 적절한 경로에 의해, 예를 들어, 피하, 점막, 정맥내, 복강내, 근육내, 비강 또는 흡입 경로에 의해 투여된다. 본원에 바람직한 투여 경로는 피하, 정맥내 또는 근육내이다.
각 용량에 존재하는, 상기 기술된 선택적 항-TNF 단량체-특이적 항체, 리간드, 모노클로널 또는 이중특이적 항체 또는 작제물의 양은 다른 면역원에 대한 다른 항체 또는 리간드와 함께 또는 이것 없이, 환자의 연령, 체중, 성별, 일반적 신체 조건 및 치료되는 특정 질환을 고려하여 선택된다. 상당한 유해한 부작용 없이 환자에서 외인적 영향을 야기하는데 필요한 항체의 양은 사용되는 약제학적 조성물에 따라 달라진다. sTNF에 의해 매개되는 질환이 있는 환자에서, 일반적으로, 각 용량은 멸균 용액 중 약 5 내지 400 ㎎/㎖의 선택적 항-TNF 단량체-특이적 항체의 주사를 포함할 것이다. 다른 투여량은 약 200 ㎎/㎖의 항체이다. 또 다른 투여량은 약 100 ㎎/㎖의 항체이다. 또 다른 구현예는 약 50 ㎎/㎖의 항체의 투여량이다. 추가의 구현예는 약 10 ㎎/㎖의 항체의 투여량이다. 함께 사용되는 경우, 2개의 단량체-특이적 TNF 에피토프 중 상이한 것에 대한 각각의 항-TNF 단량체-특이적 항체의 투여량은 동일할 수 있다. 다른 구현예에서, 2개의 병용되는 선택된 항-TNF 단량체-특이적 항체 간의 상승작용으로 인하여, 병용 투여량은 단독의 각 항체의 단일의 상가적 투여량보다 더 낮다. 예를 들어, A2 및 F에 대해 유도된 이중-특이적 항체의 투여량은 단독의 이들 에피토프 중 하나에 대한 항체의 투여량보다 더 낮을 수 있다. sTNF 에피토프 이외의 것에 대해 유도된 항체와의 추가의 병용은 항-TNF 단량체-특이적 항체의 투여량을 변경시킬 수 있다.
일 구현예에서, 선택적 항-TNF 단량체-특이적 항체/리간드의 투여는 질환의 경과 동안 주기적으로 반복된다. 선택적 항-TNF 단량체-특이적 항체 중 2개가 치료의 과정에 투여되는 다양한 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 담체 중의 각각의 항체/리간드는 따로, 병용하여 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여된다.
투여의 빈도의 범위는 주마다 내지 개월마다 또는 2개월마다, 그리고 그보다 덜 빈번할 수 있으며, 항체의 반감기 및 특정 질환의 경과에 따라 달라질 수 있다. 일 구현예에서, 투여량은 주 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 투여량은 2주마다 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 투여량은 1개월마다 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 투여량 투여의 빈도는 2개월 또는 3개월마다 1회이다. 또한, 특히, 항체 조성물의 투여가 질환에 대한 다른 치료와 함께 이루어지거나 그와 순차적으로 이루어지는 경우에, 다른 투여량 범위가 당업자에 의해 고려될 수 있다.
B. HIV-1 감염의 치료
또 다른 양태에서, 항-레트로바이러스 약물로 치료된 대상체에서 잠복성 HIV-1으로의 재감염 또는 재결합 감염을 감소시키거나 또는 방지하기 위한 대상체의 치료 방법이 제공된다. 이러한 방법에 따르면, ART를 제공받은 대상체에는 분리된 또는 합성의 선택적 항-TNF 단량체-특이적 항체 또는 리간드, 에피토프 A2 또는 F에 대한 모노클로널 항체 또는 이중특이적 항체 또는 이를 함유하는 약제학적 조성물이 투여된다. 일 구현예에서, A2 또는 F 에피토프에 결합하는 항-TNF 단량체-특이적 항체는 항-레트로바이러스 치료법을 제공받은 대상체에게 투여된다. 다른 구현예에서, A2 또는 F 에피토프에 결합하는 항-TNF 단량체-특이적 항체 또는 리간드 또는 조성물은 ART를 중단한 직후에 시작하여 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 항-TNF 단량체-특이적 항체/리간드/조성물은 ART 치료를 중단하기 전에, 그리고 ART 치료를 중단한 후에, 대상체에게 만성적으로 투여된다. 이러한 치료 방법의 목적은 ART가 초기 HIV 감염을 성공적으로 조절한 후에, 상이한 잠복성 HIV의 균주 또는 변이체로의 대상체의 재감염 또는 재결합 감염을 방지하기 위한 것이다.
또 다른 구현예에서, 선택적 항-TNF 단량체-특이적 항체/리간드는 다른 항-HIV 조성물과 함께 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제7,943,140호 참조).
상기 방법 중 임의의 것에 따르면, 선택적 항-TNF 단량체-특이적 항체/리간드는 따로, 병용하여, 또는 임의의 순서로 순차적으로 약제학적으로 허용되는 담체 중에 투여된다. 조성물, 투여량, 투여 경로 및 투여 빈도는 기술된 바와 같은 것으로 예상된다. 그러나, 당업자는 본 출원의 교시를 고려하여, 다른 적절한 투여량 및 투여 경로를 사용할 수 있다. 특히, HIV에 있어서, 선택적 항-TNF 단량체-특이적 항체/리간드/조성물의 투여는 무기한 동안 주기적으로 반복될 것으로 예상된다.
C. 당뇨병의 치료
또 다른 양태에서, sTNF 상승은 또한 II형 당뇨병에 연루된다. 본 발명의 추가의 구현예는 본원에 기술된 선택적 항-TNF 단량체-특이적 항체 및 약제학적 조성물을 사용하여 실시될 수 있는 당뇨병의 치료 방법을 수반한다. 일 구현예에서, II형 당뇨병이 있는 인간 대상체의 이러한 치료 방법은 II형 당뇨병의 치료를 필요로 하는 대상체에게 분리된 또는 합성의 선택적 항-TNF 단량체-특이적 항체 또는 리간드, 또는 약제학적 조성물을 주기적으로 투여하는 단계를 포함한다. 항체, 리간드 또는 약제학적 조성물은 구체적으로 상기 기술된 것들 중 임의의 것일 수 있다. 일 구현예에서, 대상체는 동시에 다른 당뇨병 약제를 사용하여 치료된다. 또 다른 구현예에서, 선택적 항-TNF 단량체-특이적 항체/리간드 또는 조성물의 투여는 대상체가 다른 당뇨병 약제, 예를 들어, 인슐린 또는 경구 약물, 예를 들어, 메트포르민으로의 치료를 중단한 후에 주기적으로 반복된다.
IV. 실시예
하기의 실시예는 상기 논의된 조성물 및 방법의 특정 구현예를 예시한 것이다. 이들 실시예는 청구범위 및 상세한 설명의 개시내용을 제한하지 않는다.
실시예 1 - TNF 에피토프 맵핑
157개 아미노산 TNF 단량체 SEQ ID NO: 1은 연장된, 역평행 β 플리티드 시트 구조를 갖는다. 3개의 단량체가 비-공유적 삼량체로 회합되는 경우, 생물활성 sTNF가 형성된다. 5개 스트레치의 아미노산 서열은 경계면 β 시트 접촉 표면을 형성한다:
A - KPVAHVVA, SEQ ID NO: 1의 아미노산 11 내지 18;
A' - ALLAN, SEQ ID NO: 1의 아미노산 35 내지 39;
C - GLYLIYSQVLFKGQ, SEQ ID NO: 1의 아미노산 54 내지 67;
F - WYEPIYLGGVFQL, SEQ ID NO: 1의 아미노산 114 내지 126; 및
H - QVYFGIIAL, SEQ ID NO: 1의 아미노산 149 내지 157,
여기서, A, A', C, F 및 H는 β 시트 명명 규칙을 지칭한다11.
면역학적으로 삼량체 방해를 이루기 위하여, 본 발명자는 전체가 또는 일부가 인접 단량체 사이의 접촉 영역(소위 내부 또는 경계면 영역) 내에 있는 에피토프 서열에 결합하는 항체가 sTNF 또는 tmTNF의 무손상 삼량체에 결합하지 않고, 오직 TNF의 유리 단량체에만 결합할 것이라는 이론을 제시하였다. 오직 유리 단량체로의 결합에서, 이들 항체는 재회합하여, 활성 삼량체를 형성하는 단량체의 능력을 방해하거나 방지할 것이다.
따라서, 본 발명자는 잠재적인 B 세포 에피토프에 대한 모든 5개의 영역을 분석하고, 부분적으로 경계면 영역 내의 2개의 에피토프(A 경계면 β 시트 접촉 표면) 및 완전히 경계면 영역 내의 1개의 에피토프(F 경계면 β 시트 접촉 표면)에 대한 항체를 검출하고, 맵핑하였다. 랫트 또는 마우스를 상기 확인된 TNF의 5개의 공지되어 있는 경계면 영역으로부터의 선형 서열로부터 유래된 합성 펩티드로 면역화시켰다5. 이들 합성 펩티드 서열을 KLH와 컨쥬게이트시키고, 애쥬번트, 예를 들어, 프레운트 완전 또는 불완전 애쥬번트를 사용하였다. 대안적으로, 합성 펩티드 서열을 자가 보조 작제물, 예를 들어, HIV Tat 작제물에 대하여 기술된 것들에 혼입시킨다.33 각각의 합성 펩티드 서열로 면역화된 랫트로부터 분리된 폴리클로널 항체를 통상의 ELISA를 사용하여 rTNF에서, 그리고, 합성 TNF 펩티드에서도 평가하였다. 예를 들어, 항-인간 TNF/TNFSF1A 항체에 대하여 알앤디 시스템즈(R&D Systems), 카탈로그 번호 MAB610, 클론 28401, 페이지 1 및 2(2005년 7월 17일)에 의해 설명된 프로토콜을 참조한다.
보다 큰 펩티드 면역원으로부터 절단된 서열로의 결합을 사용하여 에피토프 가장자리를 설명하였다. TNF의 영역에 대하여 항체가 검출되는 경우, 절단된 펩티드 서열을 사용하여 상기 정의된 에피토프의 가장자리를 밝혀냈다. 각각의 특정 에피토프 서열 중 하나에 배타적으로 결합하는 항체는 본 발명의 선택적 항-TNF 단량체-특이적 항체로 지칭하였다. 예를 들어, 도 1을 참조한다.
표 1에는 경계면 영역, 시험된 면역원 및 에피토프 검색으로부터 검출된 에피토프가 기술되어 있다:
[표 1]
Figure pct00001
도 2a, 도 2b 및 도 2c는 에피토프의 가장자리 확인을 예시한 것이다.
모든 3개의 에피토프 서열은 TNF의 수용체 결합 부위의 공지되어 있는 영역의 외측에 존재한다12,13,15. 합성 펩티드 서열 중첩 경계면 접촉 영역 A에서 검출된 2개의 중첩 B 세포 에피토프는 다음과 같다:
PSDKPVA H , SEQ ID NO: 1의 아미노산 8 내지 15 및 PSDKPVA H V, SEQ ID NO: 1의 아미노산 8 내지 16; 및
SSRTPSDKP, SEQ ID NO: 1의 아미노산 4 내지 12.
따라서, SEQ ID NO: 1의 sTNF 아미노산 1 내지 23 서열은 오직 2개의 B 세포 에피토프만을 함유하며, 각 에피토프는 항체 결합에 필수적인 경계면 아미노산(들)을 함유할 뿐 아니라, 에피토프 A2는 삼량체 형성 및 생물학적 기능에 필수적인 아미노산을 함유한다.
제3 에피토프 EPI Y LG G VF(F 시트)의 전체 서열, SEQ ID NO: 1의 아미노산 116 내지 124는 경계면 접촉 영역 F 내에 존재하였다. 에피토프 아미노산 중 2개, Tyr119 및 Gly122는 삼량체 형성 및 생물학적 활성에 결정적이다13,24.
상기 나타낸 3개의 에피토프에서, 볼드체의 아미노산은 내부 경계면 영역 내에 존재한다. 이탤릭체 아미노산은 그 위치에서의 점 돌연변이가 삼량체 형성을 못하게 하고, 생물학적 활성의 소실을 유도하는 것들이다.
3개의 단량체-특이적 에피토프 A1: SSRTPSDKP, A2: PSDKPVAH/PSDKVPAHV 및 F: EPIYLGGVF의 각각에 대한 항체는 통상의 ELISA 검정에서 합성 rTNF(삼량체, 이량체 및 단량체 형태를 포함함)에 결합한다. 오직 2개의 경계면 아미노산(Lys11 및 Pro12)에 결합하는 A1 SSRTPSDKP에 대한 항체(폴리클로널 항체 및 모노클로널 항체 둘 모두)는 에피토프로의 항체 결합에 필수적이다. 이들 아미노산 중 어느 것도 삼량체 형성 및 sTNF의 생물활성에 결정적인 것으로 보이지 않았다. 또한, A2 PSDKPVAH 또는 PSDKPVAHV에 대한 항체(폴리클로널 항체 및 모노클로널 항체 둘 모두)는 삼량체 형성 및 sTNF 분자의 생물활성에 결정적인 His15를 차폐시켰다13,23.
F 단량체 경계면 영역 내에 오직 하나의 다른 단량체 특이적 항체만이 검출되었다. F 에피토프는 TNF 아미노산 116 내지 124에 걸쳐 있으며, 단량체-특이적인 폴리클로널 항체를 유도하였다. 이들 항체는 Tyr119 및 Gly122를 차폐시켰으며, 이들 둘 모두는 삼량체 형성 및 sTNF 분자의 생물활성에 결정적이다.
실시예 2 - 선택적 결합 활성
천연 또는 합성 sTNF는 비활성 TNF 단량체, 비활성 TNF 이량체 및 생물활성 TNF 삼량체의 혼합물로 이루어진다. 검정에 사용되는 각각의 항체 및 상업적으로 입수가능한 항-TNF 항체(예를 들어, 레미케이드) 또는 상업적으로 입수가능한 TNF 수용체 키메라(예를 들어, 엔브렐)는 실시예 1에서 수행된 통상의 ELISA에서와 같이 플레이트 상에 코팅된 합성 TNF에 결합한다. 그러나, sTNF의 단량체, 이량체 또는 삼량체 형태로의 항체/리간드의 특이적인 결합의 검출은 적절한 선택적 검정을 필요로 한다. 실시예 1에서 확인된 바와 같은 단량체 상의 3개의 에피토프에만 결합하는 항체 또는 리간드의 선택적 결합 활성을 입증하기 위하여, 하기의 검정을 수행한다:
A. 샌드위치 검정
일 구현예에서, 샌드위치 검정은 시료 내의 sTNF에 결합하는 비오티닐화 항-TNF 항체를 사용한 다음, 플레이트에 코팅된, 비-비오티닐화된 동일한 항체를 사용하여 검출한다25. 비표지 항체(예를 들어, 본 발명자의 에피토프-결합 항체 중 하나 또는 상용의 항체, 예를 들어, 레미케이드 항체)를 플레이팅한다. 비오티닐화된 동일한 항-TNF 항체와 혼합된 합성 sTNF를 함유하는 시료를 제조한 다음, 플레이트에 도입한다. 그 다음, 플레이트를 세척하고, 비표지된 결합 항체와 표지된 검출 항체 사이에 개재된 임의의 결합 sTNF를 적절한 검출 시스템, 예를 들어, 스트렙트아비딘/호스라디시 페록시다제(horseradish peroxidase)를 사용하여 측정하여 검출가능한 신호를 생성한다.
포획/검출 항체로 사용되는 항체가 sTNF 삼량체 형태에 결합하는 항체라면, 샌드위치 효과가 검출될 것이다. 플레이트-결합 항체 및 비오티닐화 항체 둘 모두에 동시에 결합하는 능력을 갖는 sTNF 삼량체만이 이러한 검정에서 결합을 나타낼 것이다. 이것은 혼합물에서, 삼량체 상의 모든 결합 부위가 결합되지 않아서, 여분의 결합 부위가 플레이트에 포획되도록 남겨둘 것이기 때문이다. 예를 들어, 상용의 레미케이드 항체는 이러한 검정에서 삼량체 결합을 나타낸다.
대조적으로, sTNF 단량체 상의 단일의 에피토프에 특이적으로 결합하는 본 발명자의 항체는 이러한 검정에서 결합을 나타내지 않는다. 각각의 단량체가 혼합물에서 표지된 항체에 의해 결합되면, 혼합물이 플레이트에 첨가되는 경우, 에피토프는 더 이상, 플레이트 상의 동일한 비표지 항체로의 결합에 이용가능하지 않다.
따라서, 이러한 검정을 사용하여 A2 또는 F에 선택적으로 결합하며, sTNF 단량체에만 결합하는 항-TNF 단량체-특이적 항체/리간드와 삼량체, tm-TNF 및 삼량체 sTNF 둘 모두에 결합하는 비-선택적 상용의 및 공지의 항-TNF 항체를 구별할 수 있다.
이들 검정에 사용되는 경우, 본 발명자는 에피토프 A1, A2 또는 F에 대한 항체(폴리클로널 또는 모노클로널 둘 모두)가 전부 오직 sTNF 단량체에만 결합할 수 있는 것을 확인하였다. 이러한 검정의 실행으로부터의 결과는 도 3a 및 도 3b에 나타나 있다.
B. 기능 검정
기능 검정은 TNF 결합 세포, 예를 들어, 액티노마이신 처리 WEHI 세포에 대한 항체의 영향을 입증하는 것이다. 예를 들어, 항-인간 TNF/TNFSF1A 항체에 대한 본원에 참조로 포함되는 알앤디 시스템즈, 카탈로그 번호 MAB610, 클론 28401, 페이지 1 및 2(2005년 7월 17일)에 의해 설명된 "인간 TNF 생물활성의 중화"에 대한 프로토콜을 참조한다. 도 4b 및 도 5의 데이터의 생성을 위하여, 세포 L929 대신에, WEHI 세포를 사용한다. 이러한 검정은 선택된 시험된 항체에 의한 TNF 활성의 저해를 보여주었다. 이러한 검정에서, 본원에 기술된 단량체 상의 3개의 에피토프 중 1개에 결합하는 항체를 평가하여, 그들이 sTNF의 생물활성 삼량체의 형성을 방해하고, 이에 따라, 용량 반응 곡선에서 sTNF 활성을 저해하는 능력을 갖는지를 확인한다. 이러한 기능적 검정의 실행 및 그의 결과는 도 4b 및 도 5에 나타나 있다.
C. 결과
상기 기술된 샌드위치 검정에서, sTNF 단량체 상의 3개의 에피토프: A1: SSRTPSDKP, A2: PSDKPVAH 또는 PSDKPVAHV 및 F: EPIYLGGVF 중 하나에 결합하는 선택적 항체는 sTNF의 단량체 형태에만 결합한다. 상기 기술된 바와 같이, 에피토프 A1, A2 또는 F 중 하나에 결합하는 비오티닐화된 선택적 항-TNF 항체는 sTNF와 샌드위치를 형성하지 않아서, 동일한 선택적 비-비오티닐화 항-TNF 단량체-특이적 항체 코팅 플레이트에 의한 결합을 야기할 것이다. 예를 들어, 도 3a 및 도 3b를 참조한다. 항-A2 및 항-F 항체/리간드에 대한 결과와 대조적으로, 상용의 항-TNF 레미케이드 항체는 샌드위치 검정에서 결합을 나타내었으며(예를 들어, 도 3 참조), 이는 삼량체 TNF로의 결합을 보여준다. 또한, 경계면 영역을 침범하는 TNF 펩티드에 대한 모든 폴리클로널 항체는 샌드위치 검정에서 음성이었으며, 이는 삼량체로의 결합의 결여를 보여주어, 결합이 단량체에 제한되었음을 입증한다.
그러나, 3개의 에피토프, A1: SSRTPSDKP, A2: PSDKPVAH 및 F: EPIYLGGVF 중 1개로의 선택적 결합을 나타내는 항체 중 오직 2개만이 기능 검정에서 TNF의 용량-반응성 저해, 액티노마이신 처리된 WEHI 세포에서의 TNF에 의한 세포 복제의 저해의 억제를 생성하였다. 예를 들어, 도 4a, 도 4b 및 도 5를 참조한다. A2 및 F에 대한 항체는 삼량체 형성을 방해할 수 있었고, 이는 TNF 수용체로의 sTNF 결합의 저해 및 액티노마이신 처리된 WEHI 세포에 대한 sTNF의 세포독성의 저해와 관련이 있었다. 이들 검정 결과는 에피토프 A2 및 F에 대한 단량체 특이적 항체가 단량체간 결합에 필수적인 특정 아미노산 측쇄를 블로킹함으로써 삼량체 조립을 방해하는 증거를 제공한다.
놀랍게도, A1 에피토프에 대한 항체는 단량체 특이적이지만, TNF 기능을 차단하는데 비활성이었다.
본 명세서에서, 용어 "포함한다" 및 "포함하는"은 배타적이기 보다는 포괄적인 것으로 해석되어야 한다. 용어 "구성한다", "구성하는" 및 그의 변이형은 포괄적이기 보다는 배타적인 것으로 해석되어야 한다. 명세서에서 다양한 구현예가 다양한 환경 하에 "포함한다"라는 표현을 사용하여 제시되지만, 관련 구현예가 또한 "구성된다" 또는 "본질적으로 구성된다"라는 표현을 사용하여 기술되는 것을 이해해야 한다. 단수의 용어("a" 또는 "an")가 하나 이상을 지칭하는 것을 주목해야 하며, 예를 들어, "하나의 항체"는 하나 이상의 항체를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 단수의 용어, "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
본 명세서에서 다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해, 그리고 당업자에게 본 출원서에 사용되는 많은 용어에 대한 일반적인 지침을 제공하는 공개 문서를 참조하여, 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 미국 가출원 제61/768044호 및 제61/756571호뿐 아니라, 첨부된 또는 전자 서열 목록을 포함하는 본원에 열거되거나 언급된 모든 문헌은 본원에 참조로 포함된다.
본 명세서에 제공된 교시를 고려하여, 당업자는 통상의 방법에 의해 에피토프 A2 또는 F 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 고 친화성 폴리클로널 항체, 친화성 정제 및 인간화 항체, 모노클로널 항체 및 이중특이적 항체를 포함하는 항체 및 기타 항체 단편을 생성할 수 있다. 이러한 항체 및 리간드는 용이하게 수득되며, 본원에 개시된 방법에 유용하다. 추가의 설명 없이, 당업자는 전술된 설명 및 하기의 예시적인 실시예를 사용하여 본 발명의 조성물을 제조하고 사용하며, 청구된 방법을 실시할 수 있는 것으로 여겨진다. 본 발명이 다양한 특정 재료, 절차 및 실시예를 참조하여 본원에 기술되고 예시되어 있지만, 본 발명이 그 목적을 위해 선택된 재료 및 절차의 특정 조합에 제한되지 않는 것이 이해된다. 상기 예시된 구현예의 수많은 변형 및 변이가 이러한 명세서에 포함되며, 이는 당업자에게 자명한 것으로 예상된다. 본원에 기술된 조성물 및 과정에 대한 이러한 변형 및 변경은 본원에 첨부된 청구범위의 범주에 포함되는 것으로 여겨진다.
참고문헌
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Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
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Claims (31)

  1. 인간 TNF의 해리된 단량체의 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 또는 합성 항체 또는 리간드로서, 상기 결합이 생물활성 삼량체 인간 sTNF로의 단량체의 조립(assembly)을 방해하는 분리된 또는 합성 항체 또는 리간드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 TNF 단량체-특이적 에피토프가 서열 PSDKPVAH, SEQ ID NO: 1의 아미노산 8 내지 15를 갖는 항체 또는 리간드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 TNF 단량체-특이적 에피토프가 서열 PSDKPVAHV, SEQ ID NO: 1의 아미노산 8 내지 16을 갖는 항체 또는 리간드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 TNF 단량체-특이적 에피토프가 서열 EPIYLGGVF, SEQ ID NO: 1의 아미노산 116 내지 124를 갖는 항체 또는 리간드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 막횡단 TNF(transmembrane TNF; tmTNF)에 결합하지 않으며, tmTNF의 구조 또는 생물활성에 영향을 미치지 않는 항체 또는 리간드.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 무손상(intact) 생물활성 삼량체 인간 sTNF에 결합하지 않는 항체 또는 리간드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리클로널, 친화성-정제 항체 또는 그의 단편, 모노클로널 항체 또는 그의 단편, 항체의 분리된 단쇄, 합성 항체, 재조합 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 이중-특이적 항체, 고 친화성 항체 또는 리간드 또는 그의 단편인 항체 또는 리간드.
  8. 제7항에 있어서, 서열 PSDKPVAH 또는 PSDKPVAHV, SEQ ID NO: 1의 아미노산 8 내지 15 또는 8 내지 16을 갖는 TNF 단량체-특이적 에피토프, 및 서열 EPIYLGGVF, SEQ ID NO: 1의 아미노산 116 내지 124를 갖는 TNF 단량체-특이적 에피토프와 반응성인 이중-특이적 항체인 항체 또는 리간드.
  9. 제7항에 있어서, 상기 항체 단편이 sc-Fv 작제물(construct), Fab 작제물, Fab2 작제물 또는 경쇄 가변 또는 상보성 결정 영역(CDR) 서열인 항체 또는 리간드.
  10. 제7항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 폴리에틸렌 글리콜 분자를 더 포함하는 항체 또는 리간드.
  11. 인간 TNF의 해리된 단량체의 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 또는 합성 항체 또는 리간드, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 결합이 생물활성 삼량체 인간 sTNF로의 단량체의 조립을 방해하는 약제학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 항체 또는 리간드가 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체 또는 리간드인 약제학적 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 하기로부터 선택되는 하나 이상의 항체 또는 리간드를 포함하는 약제학적 조성물:
    (a) 서열 PSDKPVAH, SEQ ID NO: 1의 아미노산 8 내지 15 또는 PSDKPVAHV, SEQ ID1 NO: 1의 아미노산 8 내지 16을 갖는 TNF 단량체-특이적 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 리간드; 및
    (b) 서열 EPIYLGGVF, SEQ ID NO: 1의 아미노산 116 내지 124를 갖는 TNF 단량체-특이적 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 리간드.
  14. 제11항에 있어서, 서열 PSDKPVAH 또는 PSDKPVAHV, SEQ ID NO: 1의 아미노산 8 내지 15 또는 8 내지 16을 갖는 TNF 단량체-특이적 에피토프, 및 서열 EPIYLGGVF, SEQ ID NO: 1의 아미노산 116 내지 124를 갖는 TNF 단량체-특이적 에피토프와 반응성인 이중-특이적 항체를 포함하는 약제학적 조성물.
  15. 생물활성 삼량체 인간 sTNF로의 sTNF의 해리된 단량체의 생체내 조립 또는 재조립을 방해하거나 감소시킴으로써, tmTNF의 양, 농도 또는 생물활성에 영향을 미치지 않고, 질환을 갖는 대상체의 혈액 내의 생물활성 삼량체 sTNF의 양 또는 농도를 감소시키는 단계를 포함하는 인간 TNF에 의해 매개되는 질환을 갖는 대상체의 치료 방법.
  16. 제15항에 있어서, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 분리된 또는 합성 항체 또는 리간드를 인간 TNF에 의해 매개되는 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 시간이 지남에 따라, 상기 대상체의 혈류에서 생물활성 삼량체 sTNF의 감소된 양 또는 농도를 유지하는 단계를 더 포함하는 방법.
  18. 제15항에 있어서, 세포내 병원체에 의한 감염 또는 악성종양에 대한 상기 대상체의 감수성이 치료에 의해 증가되지 않는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 감염이 결핵, 세균성 패혈증, 침습성 진균 감염 또는 히스토플라스마증이거나, 또는 상기 악성종양이 림프종 또는 간비장 T-세포 림프종인 방법.
  20. 제15항에 있어서, 상기 항체 또는 리간드가 약제학적 조성물에서, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제 중에 존재하는 방법.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 정맥내 또는 피하 투여되는 방법.
  22. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 주기적으로 반복되는 방법.
  23. 제15항에 있어서, 상기 질환이 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 소아 류마티스 관절염, 건선 관절염, 건선, 비만, 대사 증후군, 죽상동맥경화증, 관련 심혈관 질환, 알츠하이머병 또는 신경변성 질환인 방법.
  24. 제15항에 있어서, 상기 질환이 염증 동안 또는 염증 장애의 경과 동안 생성되는 생물활성 삼량체 sTNF의 병원성 영향인 방법.
  25. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 분리된 또는 합성 항체 또는 리간드, 또는 약제학적 조성물을 HIV-1의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 HIV-1으로 감염된 대상체의 치료 방법.
  26. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 분리된 또는 합성 항체 또는 리간드, 또는 약제학적 조성물을 II형 당뇨병의 치료를 필요로 하는 대상체에게 주기적으로 투여하는 단계를 포함하는 II형 당뇨병이 있는 대상체의 치료 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 대상체가 동시에 다른 당뇨병 약제를 사용하여 치료되는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 투여는 상기 대상체가 다른 당뇨병 약제를 사용한 치료를 중단한 후에 주기적으로 반복하여 이루어지는 방법.
  29. 인간 TNF에 의해 매개되는 질환을 갖는 대상체를 치료하기 위한, 생물활성 삼량체 인간 sTNF로의 sTNF의 해리된 단량체의 생체내 조립 또는 재조립을 방해하거나 감소시킴으로써, tmTNF의 양, 농도 또는 생물활성에 영향을 미치지 않고, 대상체의 혈액 중 생물활성 삼량체 sTNF의 양 또는 농도를 감소시키는 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 분리된 또는 합성 항체 또는 리간드를 포함하는 조성물.
  31. HIV-1으로 감염되거나 II형 당뇨병을 갖는 대상체를 치료하기 위한, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 분리된 또는 합성 항체 또는 리간드 또는 약제학적 조성물.
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