KR20150103362A - 방법 - Google Patents
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Abstract
pH 3 내지 7.5에서 완충된 물에 아줄렌-함유 정유를 첨가하는 단계, 및 후속적으로, 라카아제 효소-매개물질 시스템으로 처리하는 단계를 포함하는, 상기 정유로부터 청색을 제거하는 방법이되, 상기 라카아제는, 매개물질의 존재 하에서 트라메테스 종 및 마이셀리오프토라 터모필라로부터 유도된 것 으로부터 선택된, 방법에 관한 것이다. 탈색된 오일은, 이의 색채가 이전에 주요 단점이던 향수에 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 정유(essential oil)의 탈색에 관한 것이다.
특정 정유, 특히 카모밀라(Chamomilla), 마트리카리아(Matricaria), 안테미스(Anthemis)(카모마일) 속, 아르테미시아(Artemisia)(압생트, 머거워트(mugwort), 웜우드(wormwood), 웜씨드(wormseed) 등) 속, 및 아칠리아(Achillea)(서양톱풀) 속은, 청녹색에서 매우 진한 청색까지 범위의 청색이다. 이는, 그 안에 다양한 아줄렌(azulene), 특히 아줄렌, 카마줄렌, 다이하이드로카마줄렌 및 구이아줄렌의 존재의 결과이다. (본원에서, 용어 "아줄렌"은 이러한 특징적인 색채를 가지는 모든 아줄렌을 아우르는데 사용된다). 이러한 색채는, 이 색채가 아니라면 향수 제조에서 바람직한 오일의 유용성을 제약하기 때문에 바람직하지 않지만, 종래에는 이를 제거하기가 어렵거나 실용적이지 않았다.
이러한 오일은 간단한 기술의 적용에 의해 본질적으로 완전히 탈색될 수 있다는 것이 본 발명에 의해 발견되었다. 그러므로, pH 3 내지 7.5에서 완충된 물에 아줄렌-함유 정유를 첨가하는 단계 및, 후속적으로, 라카아제 효소-매개물질(mediator) 시스템으로 처리하는 단계를 포함하는, 상기 정유로부터 청색을 제거하는 방법이되, 상기 라카아제는, 트라메테스 종(Trametes sp .) 및 마이셀리오프토라 터모필라(Myceliophthora thermophila)로부터 유도된 것으로부터 선택된, 방법을 개시한다.
다수의 라카아제 효소가 공지되어 있고, 이는 다양한 목적, 예컨대 향수 및 착향 분야에서 바람직한 분자의 합성에 사용되어 왔다. 그러나, 트라메테스 종 또는 마이셀리오프토라 터모필라로부터 유도된 것이 정유를 탈색하는데 사용될 수 있다는 것은 이전에 알려지지 않았다.
본 방법에 유용한 상업적으로 입수가능한 라카아제 효소의 예는, 비제한적으로, 라카아제 C(아사 스페지알렌자임 게엠베하(ASA Spezialenzyme GmbH)) 및 라카아제 NS 42035(노보자임즈(Novozymes A/S))를 포함한다.
매개물질의 존재는 본 방법에 필수적이다. "매개물질"은 라카아제 효소에 대한 기질이고 라카아제와 아줄렌의 반응을 매개하는 저분자량의 유기 화합물을 의미한다. "반응을 매개한다"는 것은, (a) 효소에 의해 산화되고, (b) 아줄렌을 산화시키고, (c) 추가적인 반응을 위해 효소에 의해 재활성화된다는 것을 의미한다. 라카아제 시스템에서의 매개물질의 용도는 당업계에 널리 알려져 있고, 다수의 이러한 매개물질이 알려져 있다. 그 예는, 예를 들어, 문헌[Camarero et al., Appl Env Microbiol 71, 1775-1784, 2005], [Fabbrini et al., J Mol Cat B: Enz 16, 231-240, 2002], 및 [Gonzalez Arzola et al., Electrochemica Acta 54, 2621-2629, 2009]에 기술되어 있다.
일부 비제한적인 특정 실시예는, 시나핀산, 메틸 시린게이트, 알부틴, 1-하이드록시벤조트라이아졸, 템포(TEMPO), 페노타이아진, 페놀 레드, 4-하이드록시벤조산, 티로솔, 에틸 바닐린 및 메시톨을 포함한다. 추가적으로, 상업적으로 입수가능한 라카아제-매개물질 시스템, 예컨대 데닐라이트(Denilite, 상표) II S인 시스템이 있는데, 이 경우에, 매개물질은 메틸 시린게이트이다.
마이셀리오프토라 터모필라-유도 라카아제 효소의 사용은 보통 효과적인 탈색을 위해 매개물질의 첨가를 요구하는데 반해, 트라메테스 종의 특정 라카아제 효소는 매개물질의 첨가 없이 특정 오일을 탈색시킬 수 있다. 이러한 오일의 예는, 오스트랄리안 블루 시프레스(Australian blue Cypress) 오일(칼리트리스 인트라트로피카(Callitris intratropica)), 웜우드 오일(아르테미시아 앱신텀(Artemisia absinthum)), 블루 카모마일(Blue Chamomile) 오일(마트리카리아 카모밀라(Matricaria chamomilla)), 및 치바(Chiba) 오일(아르테미시아 아보레센스(Artemisia arborescens))을 포함한다. 어떠한 방식으로든 본 개시내용을 제한함 없이, 매개물질로서 작용할 수 있는 화합물이 이러한 오일에, 예를 들어, 티몰(thymol)이 아르테미시아 오일에 존재한다고 믿어진다. 그러나, 본 개시내용에 있어서, 트라메테스 종-유도 라카아제 효소 단독의 사용은, 상기 정의된 "라카아제 효소-매개물질 시스템"의 영역 내에 속하는 것으로 간주된다.
임의의 경우에서, 매개물질의 첨가는 트라메테스 종-유도 라카아제 효소의 탈색 성능을 현저히 강화시킨다는 것이 관찰된다. 일부의 경우, 예를 들어 케이프(Cape) 카모마일 오일(에리오세팔러스 펑투라투스(Eriocephalus punctulatus)) 및 로만(Roman) 카모마일 오일(안테미스 노빌리스(Anthemis nobilis))에서, 허용가능한 탈색을 위해 매개물질이 요구된다. 적절한 매개물질/효소/오일 조합은 통상적이고 비발명적인 실험에 의해 발견될 수도 있다. 특정 라카아제-매개물질 시스템은 트라메테스 종-1-하이드록시벤조트라이아졸이다.
상업적으로 입수가능한 라카아제 제제는 일반적으로, 특정 활성을 지닌 건조 분말로서 제공된다. 이러한 활성은 시간 경과에 따라 감소되고, 때때로, 상당히 (10 초과의 인자가 통상적임) 감소된다고 알려져 있기 때문에, 적절한 양이 사용될 수 있도록, 사용 이전에 얼마의 활성 라카아제가 라카아제 제제에 남아 있는지 측정하는 것이 필수적이다. 이는 효소를 다루는 업자들에게 표준 관행이다.
특정 탈색에 요구되는 효소의 양은 라카아제의 고유 활성에 의존할 것이다. "라카아제의 고유 활성"이란 라카아제 제제의 mg 당 활성 라카아제 유닛(unit)의 수를 의미한다. 라카아제 제제에서의 고유 활성의 측정(단위: 라카아제 유닛)은 널리 알려지고 널리 사용되는 생화학 절차, 라카아제 제제의 무작위적으로 선택된 양으로 시작한 시행착오의 반복 순환에 따라 수행된다.
전형적인 실시예는 하기 단락에 기술된다. 이 경우에, 기질로서의 시린갈다진(syringaldazine), 및 기술된 모든 활성은 상기 표준을 기준으로 한 것이다.
MES 완충액(40 mM, pH 5.3) 중의 반응물(1 ml)에, 정확하게 제조된 라카아제 제제의 수성 용액의 부분 표본(aliquot)을 첨가하였다. 시린갈다진(시그마(Sigma) S7896)을 에탄올 중 제조된 스톡(stock) 용액으로부터의 최종 농도 33 μM에 첨가함으로써 반응을 시작하였다. 흡광도의 증가(분홍색 형성)를 캐리(Cary) 1 UV-VIS 분광광도계(배리언(Varian))에서 525 nm, 22 ℃에서 10 분 동안 기록하였다. MES 완충액으로 구성된 블랭크(blank)에 대해 측정하였다. 고유 활성은 유닛으로 측정되는데, 1 유닛은, 상기 조건 하에서 분당 1 나노몰의 시린갈다진의 산화를 촉진하는 라카아제 제제의 양으로서 정의된다.
요구되는 매개물질의 비율은 오일 및 매개물질의 성질에 의존하고, 이는 넓은 범위가 가능하다. 전형적으로, 매개물질의 농도는 0.05 내지 100 mM이나, 허용가능한 결과를 나타내는 이러한 범위 밖의 농도의 예가 있을 수 있다.
상기 방법은, 전형적으로, 연속적인 교반 하에서, 오일을 pH 3 내지 7.5(특히, 4.5 내지 5.5)까지 완충시킨 물에 첨가함으로써 수행된다. 가능한 한 많은 양의 오일이 첨가될 수 있다(전형적으로, 최대 50 중량%; 일부 경우, 더 많은 양이 가능함). 이어서, 라카아제-매개물질 시스템은 액체 또는 분말 형태로 첨가된다. 상기 반응은, 20 ℃ 내지 80 ℃, 특히 약 35 ℃ 내지 45 ℃에서 수행된다. 사용된 오일 및 라카아제-매개물질 시스템에 의존하여, 탈색은 보통 3.5 내지 7 시간 내에 완료되지만, 일부 오일은 최대 24 시간이 요구되기도 한다. 일부 경우에서는, 더 많은 양의 라카아제-매개물질 시스템의 첨가가 더 빠른 속도의 탈색을 생성할 것이다. 그러나, 이는 항상 모든 경우에 그러하지는 않고, 통상적인 실험에서 이것이 작용하는지 그러하지 아니한지 쉽게 구별할 수 있다.
탈색된 오일은 표준 기술, 예컨대 디켄팅(decanting) 및 용매 추출에 의해 회수될 수 있다.
상기 결과물은 향수에 유용한 무색의 오일이다. 그러므로, 본원에서 상기 언급된 방법에 의해 제조될 수 있는, 탈색된 아줄렌-함유 정유를 개시한다.
또한, 본 개시는 하기 비제한적인 실시예를 참조로 기술된다.
실시예
1
반응물(500 ㎕ 최종 부피)을 하기와 같이 세팅하였다: 트윈(Tween, 상표) 80 계면활성제(0.25 %)로 보충되고 트라메테스 종 라카아제 C(2.2 mg)(171 유닛에 상응함, 유닛은 상기 기술한 바와 같음)를 함유한 0.1 M 시트르산-인산 나트륨 완충액(pH 5.0, 430 ㎕)을 유리 바이알(3 ml)에 두었다. 이어서, 짙은 청색 카모마일 매우 중질의 블루 오일(50 ㎕)(프리쓰 팜, Frith Farm)을 첨가하였다. 에탄올 중의 스톡 용액(50 mM)으로 제조된 매개물질 1-하이드록시벤조트라이아졸(20 ㎕)을 첨가함으로써 반응을 시작하였다. 상기 유리 바이알을 캐핑하고(capping) 오비탈(orbital) 쉐이커 상에서 250 rpm으로 지속적으로 교반하면서 40 ℃에서 배양시켰다. 배양한지 3.5 및 7 시간 후에 반응을 중지시키고 이소프로판올로 추출함으로써, 본래의 색채와 비교하여 탈색도를 평가하였다. 미립자의 침전된 물질을 분석 이전에 원심분리시킴으로써 제거하였다. 반응한지 7 시간 후에, 청색은 완전히 사라지고, 향수에 사용하기 적절한 옅은 황색 내지 옅은 갈색빛의 오일이 남아서, 24 시간 후의 제안된 추가적인 평가가 불필요하였다. 흡광도 측정(실시예 5) 및 기체 크로마토그래피 분석(GC-FlD)(실시예 6)으로 탈색을 평가하였다. 블랭크 반응물을 제조하여, 라카아제가 첨가되지 않거나, 매개물질이 첨가되지 않거나, 또는 라카아제 및 매개물질이 첨가되지 않는다는 것을 제외하고 동일한 방식으로 진행하였다.
실시예
2
반응물(500 ㎕ 최종 부피)을 하기와 같이 세팅하였다: 트윈(상표) 80 계면활성제(0.25 %)로 보충되고 NS42035 라카아제(4.4 ㎕)(2 유닛에 상응함, 유닛은 상기 기술한 바와 같음)를 함유한 0.1 M 시트르산-인산 나트륨 완충액(pH 5.0, 430 ㎕)을 유리 바이알(3 ml)에 두었다. 이어서, 짙은 청색 오스트랄리언 블루 시프레스 오일(칼리트리스 인트라트로피카)(50 ㎕)를 첨가하였다. 에탄올 중의 스톡 용액(50 mM)에서 제조된 매개물질 메틸 시린게이트(20 ㎕)를 첨가함으로써 반응을 시작하였다. 상기 유리 바이알을 캐핑하고 오비탈 쉐이커 상에서 250 rpm으로 지속적으로 교반하면서 40 ℃에서 배양시켰다. 배양한지 3.5, 7 및 24 시간 후에 반응을 중지시키고 이소프로판올로 추출함으로써, 본래의 색채와 비교하여 탈색도를 평가하였다. 미립자의 침전된 물질을 분석 이전에 원심분리시킴으로써 제거하였다. 반응한지 24 시간 후에, 청색은 완전히 사라지고, 향수에 사용하기 적절한 옅은 황색 내지 옅은 갈색빛의 오일이 남았다. 흡광도 측정(실시예 5) 및 기체 크로마토그래피 분석(GC-FlD)(실시예 6)으로 탈색을 평가하였다. 블랭크 반응물을 제조하여 라카아제가 첨가되지 않거나, 매개물질이 첨가되지 않거나, 또는 라카아제 및 매개물질이 첨가되지 않는다는 것을 제외하고 동일한 방식으로 진행하였다.
실시예
3
하기 6 개의 정유를 실시예 1 및 실시예 2에 기술된 절차에 따라 라카아제-매개물질 시스템으로 처리하였다: 오스트랄리안 블루 시프레스(칼리트리스 인트라트로피카), 에리오세팔러스 펑투라투스(남아프리카), 웜우드 에센스, 카모마일 매우 중질의 블루(프리쓰 팜), 카모마일 네팔(Nepal), 및 치바 오일 모로코(아르테미시아 종). 유일한 변경은, 상기 반응물에 2 %의 오일만 부하하고 24 시간 동안 반응을 진행한다는 것이었다. 육안으로 관찰되는 오일의 탈색을, 4 가지의 화합물, 즉 아줄렌, 카마줄렌, 구아이아줄렌 및 다이하이드로카마줄렌의 표적 검출을 사용한 GC-MS 분석에 의해 확인하였다. 최종적으로, 상기 반응물을 MTBE(1 ml)로 추출하였다. 상층액을 증발시켰다. 잔사를 에탄올(90 ㎕)에 현탁시키고, GC-MS 분석을 위해 100 배 희석시켰다. 1 ㎕를 30 m x 0.25 mm x 0.25 ㎛ VF-왁스 컬럼(배리안)에 분리되지 않게 주입하였고, HP5890 GC 기구에서 하기 온도 구배를 사용하여 전개하였다: 35 ℃에서 2 분, 10 ℃/분 → 50 ℃, 2.5 ℃/분 → 240 ℃, 240 ℃에서 5 분. MS 장치 SSQ7000는 터모 피니간(Thermo Finnigan)으로부터 구입하였다. GC-MS 분석으로, 카마줄렌, 구아이아줄렌 및/또는 다이하이드로카마줄렌이 사라지기 때문에 탈색되었음을 확인하였다.
실시예
4
치바 오일을, 1 %의 오일만 부하한다는 것을 제외하고 실시예 1에 기술된 바와 같이 반응에서 탈색시켰다. 하기 화합물을 매개물질로 사용하였다: 시나핀산, 티로솔, 에틸 바닐린, 메틸 시린게이트, 알부틴, 1-하이드록시벤조트라이아졸, 템포, 페노티아진, 페놀 레드, 4-하이드록시벤조산, 메시톨. 실시예 1에서 기술된 바와 같이, 에탄올 중의 50 mM 매개물질 스톡 용액(20 ㎕)을 첨가함으로써 반응을 시작하였다. 라카아제 매개물질 시스템이 없거나, 라카아제는 있지만 매개물질은 없는 대조 반응을 진행하였다. 블랭크 반응을 라카아제 및 매개물질을 함유하지 않은 반응에 둔 오일을 사용하여 진행하였다. 실시예 1에서 기술된 바와 같이 반응한지 0, 2 및 7 시간 후에, 이소프로판올로 추출함으로써 반응을 중지하고, 실시예 6에서 기술된 바와 같이 GC-FID로 분석하였다. 처리 후의 오일의 육안 검사는 청색이 사라졌다는 것으로 나타났고, 이는 하기 표에 요약되어 있는 GC-FID 분석으로부터 얻은 결과에 의해 확인되었다. 또한, 실시예 5에서 기술된 바와 같이 기록된 흡광 스펙트럼에서의 변화에 의해 청색의 사라짐을 확인하였다.
실시예
5
전체 반응 부피의 이소프로판올 추출로부터 생성된 상층액(1 ml)을, 캐리 1 UV-VIS 분광광도계(배리안)를 사용하여 흡광 스펙트럼(500 내지 800 nm)을 기록하는데 사용하였다. 반응 출발물질과 반응 최종물질의 기록된 흡광 스펙트럼의 변화에 의해, 육안 검사로 관찰된 탈색을 확인하였다.
실시예
6
기체 크로마토그래피 분석(GC-FID)을 위해 이소프로판올 추출액(0.2 ml)을 헥산(0.4 ml)으로 보충하였다. 상기 샘플을 5 미터 보호 컬럼을 장착한 제브론( Zebron) 모세관 컬럼 ZB-왁스플러스(30 m x 0.32 mm x 0.25 ㎛)에서 크로마토그래피하였다. 1 ㎕를 분리되지 않게 주입하였다: 상기 컬럼을 하기 온도 프로그램을 가진 포커스GC(FocusGC) 기구에서 전개하였다: 60 ℃에서 3 분, 8 ℃/분 → 240 ℃, 240 ℃ 에서 10 분. 인증된 물질로부터 제조된 카마줄렌 및 구이아줄렌 용액은, 크로마토그램에서 상응하는 피크의 국소화에 대한 참조로 작용하였다. 탈색된 오일의 샘플을 크로마토그래피하여 얻어진 크로마토그램으로부터의 이러한 피크의 사라짐은, 청색의 소실이 아줄렌의 제거에 기인한 것임을 확인시켜 주었다.
Claims (7)
- pH 3 내지 7.5에서 완충된 물에 아줄렌(azulene)-함유 정유를 첨가하는 단계, 및 후속적으로, 라카아제 효소-매개물질(mediator) 시스템으로 처리하는 단계를 포함하는, 상기 정유로부터 청색을 제거하는 방법이되, 상기 라카아제는, 매개물질의 존재 하에서 트라메테스 종(Trametes sp .) 및 마이셀리오프토라 터모필라(Myceliophthora thermophila)로부터 유도된 것으로부터 선택된, 방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 매개물질이, 시나핀산, 메틸 시린게이트, 알부틴, 1-하이드록시벤조트라이아졸, 템포(TEMPO), 페노타이아진, 페놀 레드, 4-하이드록시벤조산, 티로솔, 에틸 바닐린 및 메시톨로부터 선택된, 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 매개물질-라카아제 시스템이 트라메테스 종-1-하이드록시벤조트라이아졸인, 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 매개물질-라카아제 시스템이, 첨가된 매개물질 없는 트라메테스 종-유도 라카아제인, 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 매개물질-라카아제 시스템이 메틸 시린게이트의 존재 하의 마이셀리오프토라 터모필라-유도 라카아제인, 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 매개물질의 농도가 0.05 내지 100 mM인, 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 방법이 pH 4.5 내지 5.5에서 수행되는, 방법.
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