KR20150098893A - 염증신호 인식 GSK3β 억제 펩타이드 및 이를 포함하는 염증 질환 치료용 조성물 - Google Patents
염증신호 인식 GSK3β 억제 펩타이드 및 이를 포함하는 염증 질환 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 염증신호 인식 GSK3β 억제 펩타이드 및 이를 포함하는 염증 질환 치료용 조성물에 관한 것으로서, 억제 κB 키나제(inhibitory κB kinase; IKK)-활성화된 GSK3β를 억제하는 폴리펩타이드, 이를 코딩하는 유전자 및 상기 폴리펩타이드와 세포 전달 펩타이드를 결합시켜 제조되는 융합단백질을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 폴리펩타이드, 상기 유전자 또는 상기 융합단백질을 포함하는 염증 질환 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 염증 질환 치료용 조성물은 세포 투과성 펩타이드를 이용하여 조직 내로의 투과성을 높이고, 결장표적성 약물 전달(colon specific drug delivery) 기술을 도입하여 경구투여 가능하게 함으로써 염증성 장질환(inflammatory bowel disease; IBD) 치료에 효과적으로 사용할 수 있을 것으로 예상된다.
Description
본 발명은 염증성 세포에서 활성화되는 염증신호인 억제 κB 키나제(inhibitory κB kinase; IKK) 경로에 의하여 활성화되는 GSK3β 억제 펩타이드 및 이를 포함하는 염증 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.
글리코겐 합성 키나제-3(Glycogen synthase kinase-3; GSK-3)은 GSK3α 및 GSK3β의 2개 아이소형(isoforms)을 가진 구성적 활성 세린/트레오닌 단백질 키나제(serine/threonine protein kinase)로서, 이는 여러 유전자들에 의해 코딩되어 있고, 높은 상동성(homologous)을 가진다. GSK-3은 글리코겐 대사, 세포막에서 핵으로의 신호전달, 유전자 전사 및 생존을 포함하는 많은 세포 과정에 있어 중요한 역할을 할 것으로 보인다. 최근에, GSK3β는 염증 반응을 조절하는 다중 톨-유사 수용체(toll-like receptor; TLR) 신호 전달 경로의 중요한 조절자로 밝혀졌다. 작용제(agonist)로 인한 TLRs 촉진은 전-염증(pro-inflammatory) 사이토카인의 발현을 포함하는 전-염증반응을 유도하는데, 이는 주로 NFκB 경로를 통해 일어난다. 동시에, TLR 촉진은 PI-3K 경로를 활성화시키고, Akt 활성화를 이끌며, GSK3β를 억제하는 결과를 나타내는데, 이는 CREB를 유리화시키고, NFκB 활성을 효과적으로 억제시킨다. 또한 항염증 사이토카인 IL-10의 CREB-의존적 생산을 촉진시킨다.
박테리아성 요인에 대한 전-염증 반응의 선택적 활성화로 인한 TLR 신호 전달의 조절 방해는 만성 장염을 지속시킬 수 있다는 증거가 증가하고 있다. 만성 장염의 병리학적 특성에 기초하여, GSK3β의 억제는 항염증 사이토카인 생산을 증가시키는 반면, 동시에 전-염증 사이토카인 생산을 억제하는데, 이는 염증성 장질환(inflammatory bowel disease)에 대한 실현 가능한 치료 방법으로서 여겨지고 있다. 사실상, GSK3β 억제제는 실험적 대장염에서 유익한 효과를 가지는 것으로 나타났다.
비록 SB216763 및 SB415286을 포함하는 많은 저분자 GSK3β 억제제가 이미 밝혀졌으나, 임상적 용도로 승인된 것은 없다. 이는 만약 상기 억제제들이 다기능 키나제인 GSK3β의 정상적인 기능을 방해하고 표적이 아닌 곳에 작용한다면, 아마도 부작용을 나타낼 수 있기 때문으로 보인다. 따라서, 본 발명자들은 표적 뿐만 아니라 병리학적 조건에도 특이적인 새로운 GSK3β 억제제를 개발하고자 하였는데, 표적-선택적 및 병리학적-표적화된 치료에 사용될 수 있고, 결과적으로 표적이 아닌 곳에서의 상호작용 뿐만 아니라 정상 조건에서 표적 상의 상호작용으로 인한 부작용도 최소화할 수 있을 것으로 기대된다. 장내 염증 상태에서 특이적으로 활성화되는 GSK3β 억제 펩타이드, 즉 IKK 활성화된 GSK3β 억제 펩타이드(IKK activated GSK3β inhibitory peptide; IAGIP)가 디자인되었고, TNBS-유도된 랫트 대장염 모델에서 이의 치료 활성도 평가되었다. 경구적으로 활성화된 IAGIP를 제조하기 위해서, 세포 투과성 펩타이드 및 결장-표적성 약물 전달 기술을 병리학적으로 활성화된 펩타이드에 적용하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 억제 κB 키나제(inhibitory κB kinase; IKK)-활성화된 GSK3β를 억제하는 폴리펩타이드, 이를 코딩하는 유전자 및 상기 폴리펩타이드와 세포 전달 펩타이드를 결합시켜 제조되는 융합단백질을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드, 상기 유전자 또는 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 염증 질환 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 및 이를 코딩하는 유전자를 제공한다.
상기 서열번호 1은 "EPVPPPPTPRSSRHDSGLDSMKD"로서, 억제 κB 키나제(inhibitory κB kinase; IKK) 활성화된 GSK3β 억제 펩타이드(IKK activated GSK3β inhibitory peptide; IAGIP)이다.
본 발명의 한 구체예에서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 외에도 상기 서열들의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 본다. 변이체는 염기서열 또는 아미노산 서열은 변화되지만, 서열번호 1의 아미노산 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기서열로 이루어진 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드와 세포 전달 펩타이드를 결합시켜 제조되는 융합단백질을 제공한다. 바람직하게는 상기 융합단백질은 서열번호 2의 아미노산 사열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 서열번호 2는 "YGRRARRRARR-EPVPPPPTPRSSRHDSGLDSMKD"로서, 세포 전달 펩타이드(Cytoplasmic transduction peptide; CTP)와 억제 κB 키나제(inhibitory κB kinase; IKK) 활성화된 GSK3β 억제 펩타이드(IKK activated GSK3β inhibitory peptide; IAGIP)를 결합시킨 융합단백질이다. 본 명세서에서는 세포 투과성 IAGIP 또는 CTP-IAGIP로 기재하였다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드, 이를 코딩하는 유전자 또는 상기 폴리펩타이드와 세포 전달 펩타이드를 결합시켜 제조되는 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 염증 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.
따라서 본 발명의 한 구체예에서, 상기 조성물은 억제 κB 키나제(inhibitory κB kinase; IKK)-활성화된 GSK3β를 억제할 수 있다.
본 발명에 따른 염증 질환은 염증성 장질환(inflammatory bowel disease; IBD)을 치료할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 염증성 장질환은 일반적으로 궤양성 대장염, 크론병, 배체트병을 포함하여 사용된다.
본 발명에 따른 염증 질환 치료용 약학 조성물을 질환 치료 또는 예방 조성물로 사용하는 경우에는 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.
상기 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다.
또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 조성물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 1 내지 10 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.
또한, 이러한 조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular)주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 염증성 세포에서 활성화되는 염증신호인 억제 κB 키나제(inhibitory κB kinase; IKK) 경로에 의하여 활성화되는 GSK3β 억제 펩타이드 및 이를 포함하는 염증 질환 치료용 조성물에 관한 것으로서, 가장 일반적인 염증신호인 NFκB 활성화 경로 IKK에 의하여 인산화되면 GSK3β 억제제로 작용할 수 있는 펩타이드를 설계하였다. 상기 펩타이드는 NFκB 활성이 비정상적으로 높아진 염증상태의 조직세포에서만 GSK3β 저해제로 작용하여 선택적 항염작용 나타낼 수 있다. 또한, 세포 투과성 펩타이드를 이용하여 조직 내로의 투과성을 높이고, 결장표적성 약물 전달(colon specific drug delivery) 기술을 도입하여 경구투여 가능하게 함으로써 염증성 장질환 치료에 효과적으로 사용할 수 있을 것으로 예상된다.
도 1은 IKK-활성화된 GSK3β 억제 펩타이드의 활성화에 대한 예상 경로를 나타낸다. 1: LRP 6/5 GSK3β 억제 모티프, 2: 삽입 세린, 3: IKK 인식 모티프. IAGIP 내의 IKK 인식 모티프는 IKK 활성이 증가되는 염증 상태에서 인산화된다. 이후, 삽입된 세린은 GSK3β에 의해 인산화되는데, 이는 LRP 6/5 모티프에 대한 IKK 반응을 전달한다. 다음으로, LRP 6/5 모티프 내의 트레오닌 및 세린 잔기는 GSK3β 및 CK1에 의해 인산화되고, 이는 활성 GSK3β 억제 펩타이드로 전환된다.
도 2는 CTP-IAGIP가 글리코겐 합성효소의 인산화를 감소시키는 결과를 나타낸다. (A) HCT116 세포는 CTP-IAGIP (100uM), CTP-mIAGIP (100uM) 또는 SB216763 (10uM)로 1시간 동안 전처리한 후, TNF-α(10 ng/mL)로 1시간 동안 촉진시켰다. p-GS의 수준은 전체 세포 용해물에서 모니터링되었다. α-튜불린(tubulin)은 로딩 대조군으로서 블랏되었다. (B) RAW 264.7 세포는 CTP-IAGIP (100uM), CTP-mIAGIP (100uM) 또는 SB216763 (10uM) 화합물로 1시간 동안 전처리한 후, LPS로 1시간 동안 촉진시켰다. p-GS의 수준은 전체 세포 용해물에서 모니터링되었다. α-튜불린(tubulin)은 로딩 대조군으로서 블랏되었다.
도 3은 RAW 264.7 세포에서 IL-10을 유도하는 CTP-IAGIP에 대한 결과를 나타낸다. RAW 264.7 세포는 CTP-IAGIP (100uM), CTP-mIAGIP (100uM) 또는 SB216763 (10uM)로 1시간 동안 전처리한 후, LPS로 8시간 동안 촉진시켰다. IL-10의 수준은 IL-10 ELISA kit을 이용하여 세포 배양 상등액에서 측정하였다. *p < 0.05 vs LPS 단독 처리군.
도 4는 CTP-mIAGIP와는 다르지만 CTP-IAGIP가 LPS-유도된 NFκB 활성을 감소시키는 결과를 나타낸다. (A) RAW 264.7 세포는 NFκB-의존성 루시퍼라아제 플라스미드(0.4㎍) 및 CMV 레닐라 루시퍼라아제(CMV Renilla luciferase) (4 ng)으로 동시형질감염되었고, 그 후 LPS(1μg/mL) 첨가하여 CTP-IAGIP (50, 100, 200 μM), CTP-mIAGIP (200 μM) 또는 SB216763 (10 uM)를 6시간 동안 처리하였다. 리포터 활성을 측정하였고, CMV 레닐라 루시퍼라아제(CMV Renilla luciferase)에 대해 표준화하였다. **p < 0.005 vs LPS 단독 처리군, *p < 0.05 vs LPS 단독 처리군. (B) RAW 264.7 세포는 CTP-IAGIP (100 μM), CTP-mIAGIP (100 μM) 및 SB216763 (10 μM)로 1시간 동안 전처리하였고, 그 후 LPS로 8시간 동안 촉진시켰다. IL-6의 수준은 IL-6 ELISA kit을 이용하여 세포 배양 상등액에서 측정하였다. *p < 0.05 vs LPS 단독 처리군. (C) RAW 264.7 세포는 CTP-IAGIP, CTP-mIAGIP 및 SB216763로 1시간 동안 전처리되었고, 그 후 LPS로 4시간 동안 촉진시켰다. iNOS 및 COX-2 단백질 수준은 전체 세포 용해물에서 모니터링되었다.
도 5는 CTP-IAGIP가 TNF-매개 NFκB 활성화를 감소시킨다는 결과를 나타낸다. (A) 결장암세포 HCT116는 NFκB-의존성 루시퍼라아제 플라스미드(0.4㎍) 및 CMV 레닐라 루시퍼라아제(CMV Renilla luciferase) (4 ng)으로 동시형질감염되었고, 그 후 TNF-α(10 ng/mL) 첨가하여 CTP-IAGIP (50, 100, 200 μM), CTP-mIAGIP (200 μM) 또는 SB216763 (10 uM)를 6시간 동안 처리하였다. 리포터 활성을 측정하였고, CMV 레닐라 루시퍼라아제(CMV Renilla luciferase)에 대해 표준화하였다. *p < 0.05 vs TNF-α 단독 처리군, **p < 0.005 vs TNF-α 단독 처리군. (B) HCT116 세포는 CTP-IAGIP (100 μM), CTP-mIAGIP (100 μM) 및 SB216763 (10 μM)로 1시간 동안 전처리하였고, 그 후 LPS로 8시간 동안 촉진시켰다. IL-8의 수준은 IL-8 ELISA kit을 이용하여 세포 배양 상등액에서 측정하였다. *p < 0.05 vs TNF-α 단독 처리군.
도 6은 결장-표적 CTP-IAGIP가 TNBS 유도된 랫트 대장염에서 결장 손상을 약화시킨다는 결과를 나타낸다. 정상 랫트, 또는 CTP-IAGIP 또는 CTP-mIAGIP를 경구 투여하거나 투여하지 않은 대장염 랫트로부터 얻은 결장 말단의 내강(luminal) 및 장막(serosal) 부분의 사진이다. 결장 표적 CTP-IAGIP (CIG, 2.5 mg/kg 및 1.5 mg/kg), 결장 표적 CTP-mIAGIP (mCIG, 2.5 mg/kg)를 TNBS-유도된 대장염 랫트에 대장염 유도 72시간 후부터, 6일 동안 하루에 한 번 경구 투여하였다.
도 7은 결장-표적 CTP-IAGIP가 염증 조직의 CDS 및 MPO 활성을 낮춘다는 결과를 나타낸다. 결장-표적 CTP-IAGIP (CIG, 2.5 mg/kg 및 1.5 mg/kg) 또는 결장 표적 CTP-mIAGIP (mCIG, 2.5 mg/kg)를 TNBS-유도된 대장염 랫트에 대장염 유도 72시간 후부터, 6일 동안 하루에 한 번 경구 투여하였다. (A) 실험 조건을 알지 못하는 독립적인 관찰자에 의해 개량된 CDS 점수 시스템에 따라 각각의 랫트에게 CDS를 부여하였다. **p < 0.005 vs TNBS 대조군. *p < 0.05 vs TNBS 대조군. (B) 다양한 처리를 한 랫트 시험군의 결장 부분에 헤마톡실린 및 에오신(Hematoxlyin and Eosin; H & E) 염색을 수행하였다. H & E-염색된 랫트 결장 부분의 대표 이미지(100X 배율)를 나타낸다. (C) 랫트의 결장 말단 부위(4 cm)에서 MPO 활성을 측정하였다. **p < 0.005 vs TNBS 대조군. *p < 0.05 vs TNBS 대조군.
도 8은 결장-표적 CTP-IAGIP가 대장염에 의한 몸무게 손실 및 결장 무게 증가를 약화시킨다는 결과를 나타낸다. 결장-표적 CTP-IAGIP (CIG, 2.5 mg/kg 및 1.5 mg/kg) 또는 결장 표적 CTP-mIAGIP (mCIG, 2.5 mg/kg)를 TNBS-유도된 대장염 랫트에 대장염 유도 72시간 후부터, 6일 동안 하루에 한 번 경구 투여하였다. (A) 랫트 몸무게는 하루에 한 번 측정하였고, 몸무게 변화는 최초 무게에 대한 백분율로 표시하였다. (B) 결장 말단은 희생된 랫트로부터 수집되었다. 다양한 처리군으로부터 얻은 결장 말단의 대표 사진들이다. (C) 다양한 처리군으로부터 얻은 대장의 길이를 측정하였다. *p < 0.05 vs TNBS 대조군. (D) 결장 무게 비율(결장 말단의 습윤 중량(mg)/ 결장 말단의 길이(cm))를 측정하였다. **p < 0.005 vs TNBS 대조군. *p < 0.05 vs TNBS 대조군.
도 9는 결장-표적 CTP-IAGIP가 염증 결장 조직에서 염증 매개체의 수준을 감소시킨다는 결과를 나타낸다. 결장-표적 CTP-IAGIP (CIG, 2.5 mg/kg 및 1.5 mg/kg) 또는 결장 표적 CTP-mIAGIP (mCIG, 2.5 mg/kg)를 TNBS-유도된 대장염 랫트에 대장염 유도 72시간 후부터, 6일 동안 하루에 한 번 경구 투여하였다. 결장 말단의 균질물에서 염증 매개체의 수준을 측정하였다. IL-6 (A), CINC-3 (B) 및 IL-10 (D)의 수준을 각각의 ELISA kit를 이용하여 측정하였고, COX-2 및 iNOS 단백질 수준 (C)을 웨스턴 블랏 분석을 통해 측정하였다. α-튜불린은 로딩 대조군으로 사용하였다. **p < 0.005 vs TNBS 대조군. *p < 0.05 vs TNBS 대조군.
도 10은 염증 결장에서 CTP-IAGIP이 IL-10을 더 유도한다는 결과를 나타낸다. CTP-IAGIP (200μM, 500μL), CTP-mIAGIP (200μM, 500μL) 또는 SB2106781 (20μM, 500μL)를 TNBS-유도 대장염 랫트 직장으로 대장염 유도 72시간 후에 투여하였다. 랫트는 8시간 및 12시간 후에 희생시켰고, 결장 말단을 수집하였다. (A) 염증 결장의 균질물에서 IL-10의 수준을 측정하였다. *p < 0.05. (B) 동일한 실험을 정상 랫트에서 수행하였다. IL-10의 수준은 IL-10 ELISA kit를 이용하여 측정하였다. *p < 0.05 vs 미처리군.
도 11은 결장 조직에서 IL-10 유도에 대한 CTP-IAGIP의 억제 효과가 IKK 활성에 의존적이라는 결과를 나타낸다. (A) 결장-표적 CTP-IAGIP (CIG, 2.5 mg/kg 및 1.5 mg/kg) 또는 결장 표적 CTP-mIAGIP (mCIG, 2.5 mg/kg)를 TNBS-유도된 대장염 랫트에 대장염 유도 72시간 후부터, 6일 동안 하루에 한 번 경구 투여하였다. 포스포-IKK(phospho-IKK)의 수준을 결장 말단에서 측정하였다. (B) CTP-IAGIP (200μM, 500μL) 또는 CTP-mIAGIP (200μM, 500μL)를 TNBS-유도 대장염 랫트 직장으로 대장염 유도 72시간 후에 투여하였다. 렛트는 12시간 후에 희생시켰고, 결장 말단을 수집하였다. 포스포-IKK(phospho-IKK)의 수준을 염증 결장에서 측정하였다.
도 12는 CTP-IAGIP의 직장 투여가 TNBS-유도 랫트 대장염을 감소시킨다는 결과를 나타낸다. CTP-IAGIP (200μM, 500μL), CTP-mIAGIP (200μM, 500μL)를 TNBS-유도된 대장염 랫트에 대장염 유도 72시간 후부터, 6일 동안 하루에 한 번 직장 투여하였다. CTP-IAGIP 또는 CTP-mIAGIP를 투여하거나 투여하지 않은 대장염 랫트로부터 얻은 결장 말단의 내강(luminal) 및 장막(serosal) 부분의 사진이다.
도 13은 CTP-IAGIP의 직장 투여가 염증 조직의 CDS 및 MPO 활성을 낮춘다는 결과를 나타낸다. CTP-IAGIP (200μM, 500μL) 또는 CTP-mIAGIP (200μM, 500μL)를 TNBS-유도된 대장염 랫트에 대장염 유도 72시간 후부터, 6일 동안 하루에 한 번 직장 투여하였다. (A) 실험 조건을 알지 못하는 독립적인 관찰자에 의해 개량된 CDS 점수 시스템에 따라 각각의 랫트에게 CDS를 부여하였다. *p < 0.05 vs TNBS 대조군. (B) 랫트의 결장 말단 부위(4 cm)에서 MPO 활성을 측정하였다. *p < 0.05 vs TNBS 대조군.
도 14는 CTP-IAGIP의 직장 투여가 염증 결장 조직에서 염증 매개체 및 IL-10의 수준을 감소시킨다는 결과이다. CTP-IAGIP (200μM, 500μL) 또는 CTP-mIAGIP (200μM, 500μL)를 TNBS-유도된 대장염 랫트에 대장염 유도 72시간 후부터, 6일 동안 하루에 한 번 직장 투여하였다. 염증 매개체의 수준을 결장 말단 부위의 균질물에서 측정하였다. IL-6 (A) 및 CINC-3 (B)의 수준을 각각의 ELISA kit를 이용하여 측정하였고, COX-2 및 iNOS 단백질 수준 (C)을 웨스턴 블랏 분석을 통해 측정하였다. α-튜불린은 로딩 대조군으로 사용하였다. (D) IL-10의 수준은 IL-10 ELISA kit를 이용하여 측정하였다. *p < 0.05 vs TNBS 대조군(for A,B and D).
도 2는 CTP-IAGIP가 글리코겐 합성효소의 인산화를 감소시키는 결과를 나타낸다. (A) HCT116 세포는 CTP-IAGIP (100uM), CTP-mIAGIP (100uM) 또는 SB216763 (10uM)로 1시간 동안 전처리한 후, TNF-α(10 ng/mL)로 1시간 동안 촉진시켰다. p-GS의 수준은 전체 세포 용해물에서 모니터링되었다. α-튜불린(tubulin)은 로딩 대조군으로서 블랏되었다. (B) RAW 264.7 세포는 CTP-IAGIP (100uM), CTP-mIAGIP (100uM) 또는 SB216763 (10uM) 화합물로 1시간 동안 전처리한 후, LPS로 1시간 동안 촉진시켰다. p-GS의 수준은 전체 세포 용해물에서 모니터링되었다. α-튜불린(tubulin)은 로딩 대조군으로서 블랏되었다.
도 3은 RAW 264.7 세포에서 IL-10을 유도하는 CTP-IAGIP에 대한 결과를 나타낸다. RAW 264.7 세포는 CTP-IAGIP (100uM), CTP-mIAGIP (100uM) 또는 SB216763 (10uM)로 1시간 동안 전처리한 후, LPS로 8시간 동안 촉진시켰다. IL-10의 수준은 IL-10 ELISA kit을 이용하여 세포 배양 상등액에서 측정하였다. *p < 0.05 vs LPS 단독 처리군.
도 4는 CTP-mIAGIP와는 다르지만 CTP-IAGIP가 LPS-유도된 NFκB 활성을 감소시키는 결과를 나타낸다. (A) RAW 264.7 세포는 NFκB-의존성 루시퍼라아제 플라스미드(0.4㎍) 및 CMV 레닐라 루시퍼라아제(CMV Renilla luciferase) (4 ng)으로 동시형질감염되었고, 그 후 LPS(1μg/mL) 첨가하여 CTP-IAGIP (50, 100, 200 μM), CTP-mIAGIP (200 μM) 또는 SB216763 (10 uM)를 6시간 동안 처리하였다. 리포터 활성을 측정하였고, CMV 레닐라 루시퍼라아제(CMV Renilla luciferase)에 대해 표준화하였다. **p < 0.005 vs LPS 단독 처리군, *p < 0.05 vs LPS 단독 처리군. (B) RAW 264.7 세포는 CTP-IAGIP (100 μM), CTP-mIAGIP (100 μM) 및 SB216763 (10 μM)로 1시간 동안 전처리하였고, 그 후 LPS로 8시간 동안 촉진시켰다. IL-6의 수준은 IL-6 ELISA kit을 이용하여 세포 배양 상등액에서 측정하였다. *p < 0.05 vs LPS 단독 처리군. (C) RAW 264.7 세포는 CTP-IAGIP, CTP-mIAGIP 및 SB216763로 1시간 동안 전처리되었고, 그 후 LPS로 4시간 동안 촉진시켰다. iNOS 및 COX-2 단백질 수준은 전체 세포 용해물에서 모니터링되었다.
도 5는 CTP-IAGIP가 TNF-매개 NFκB 활성화를 감소시킨다는 결과를 나타낸다. (A) 결장암세포 HCT116는 NFκB-의존성 루시퍼라아제 플라스미드(0.4㎍) 및 CMV 레닐라 루시퍼라아제(CMV Renilla luciferase) (4 ng)으로 동시형질감염되었고, 그 후 TNF-α(10 ng/mL) 첨가하여 CTP-IAGIP (50, 100, 200 μM), CTP-mIAGIP (200 μM) 또는 SB216763 (10 uM)를 6시간 동안 처리하였다. 리포터 활성을 측정하였고, CMV 레닐라 루시퍼라아제(CMV Renilla luciferase)에 대해 표준화하였다. *p < 0.05 vs TNF-α 단독 처리군, **p < 0.005 vs TNF-α 단독 처리군. (B) HCT116 세포는 CTP-IAGIP (100 μM), CTP-mIAGIP (100 μM) 및 SB216763 (10 μM)로 1시간 동안 전처리하였고, 그 후 LPS로 8시간 동안 촉진시켰다. IL-8의 수준은 IL-8 ELISA kit을 이용하여 세포 배양 상등액에서 측정하였다. *p < 0.05 vs TNF-α 단독 처리군.
도 6은 결장-표적 CTP-IAGIP가 TNBS 유도된 랫트 대장염에서 결장 손상을 약화시킨다는 결과를 나타낸다. 정상 랫트, 또는 CTP-IAGIP 또는 CTP-mIAGIP를 경구 투여하거나 투여하지 않은 대장염 랫트로부터 얻은 결장 말단의 내강(luminal) 및 장막(serosal) 부분의 사진이다. 결장 표적 CTP-IAGIP (CIG, 2.5 mg/kg 및 1.5 mg/kg), 결장 표적 CTP-mIAGIP (mCIG, 2.5 mg/kg)를 TNBS-유도된 대장염 랫트에 대장염 유도 72시간 후부터, 6일 동안 하루에 한 번 경구 투여하였다.
도 7은 결장-표적 CTP-IAGIP가 염증 조직의 CDS 및 MPO 활성을 낮춘다는 결과를 나타낸다. 결장-표적 CTP-IAGIP (CIG, 2.5 mg/kg 및 1.5 mg/kg) 또는 결장 표적 CTP-mIAGIP (mCIG, 2.5 mg/kg)를 TNBS-유도된 대장염 랫트에 대장염 유도 72시간 후부터, 6일 동안 하루에 한 번 경구 투여하였다. (A) 실험 조건을 알지 못하는 독립적인 관찰자에 의해 개량된 CDS 점수 시스템에 따라 각각의 랫트에게 CDS를 부여하였다. **p < 0.005 vs TNBS 대조군. *p < 0.05 vs TNBS 대조군. (B) 다양한 처리를 한 랫트 시험군의 결장 부분에 헤마톡실린 및 에오신(Hematoxlyin and Eosin; H & E) 염색을 수행하였다. H & E-염색된 랫트 결장 부분의 대표 이미지(100X 배율)를 나타낸다. (C) 랫트의 결장 말단 부위(4 cm)에서 MPO 활성을 측정하였다. **p < 0.005 vs TNBS 대조군. *p < 0.05 vs TNBS 대조군.
도 8은 결장-표적 CTP-IAGIP가 대장염에 의한 몸무게 손실 및 결장 무게 증가를 약화시킨다는 결과를 나타낸다. 결장-표적 CTP-IAGIP (CIG, 2.5 mg/kg 및 1.5 mg/kg) 또는 결장 표적 CTP-mIAGIP (mCIG, 2.5 mg/kg)를 TNBS-유도된 대장염 랫트에 대장염 유도 72시간 후부터, 6일 동안 하루에 한 번 경구 투여하였다. (A) 랫트 몸무게는 하루에 한 번 측정하였고, 몸무게 변화는 최초 무게에 대한 백분율로 표시하였다. (B) 결장 말단은 희생된 랫트로부터 수집되었다. 다양한 처리군으로부터 얻은 결장 말단의 대표 사진들이다. (C) 다양한 처리군으로부터 얻은 대장의 길이를 측정하였다. *p < 0.05 vs TNBS 대조군. (D) 결장 무게 비율(결장 말단의 습윤 중량(mg)/ 결장 말단의 길이(cm))를 측정하였다. **p < 0.005 vs TNBS 대조군. *p < 0.05 vs TNBS 대조군.
도 9는 결장-표적 CTP-IAGIP가 염증 결장 조직에서 염증 매개체의 수준을 감소시킨다는 결과를 나타낸다. 결장-표적 CTP-IAGIP (CIG, 2.5 mg/kg 및 1.5 mg/kg) 또는 결장 표적 CTP-mIAGIP (mCIG, 2.5 mg/kg)를 TNBS-유도된 대장염 랫트에 대장염 유도 72시간 후부터, 6일 동안 하루에 한 번 경구 투여하였다. 결장 말단의 균질물에서 염증 매개체의 수준을 측정하였다. IL-6 (A), CINC-3 (B) 및 IL-10 (D)의 수준을 각각의 ELISA kit를 이용하여 측정하였고, COX-2 및 iNOS 단백질 수준 (C)을 웨스턴 블랏 분석을 통해 측정하였다. α-튜불린은 로딩 대조군으로 사용하였다. **p < 0.005 vs TNBS 대조군. *p < 0.05 vs TNBS 대조군.
도 10은 염증 결장에서 CTP-IAGIP이 IL-10을 더 유도한다는 결과를 나타낸다. CTP-IAGIP (200μM, 500μL), CTP-mIAGIP (200μM, 500μL) 또는 SB2106781 (20μM, 500μL)를 TNBS-유도 대장염 랫트 직장으로 대장염 유도 72시간 후에 투여하였다. 랫트는 8시간 및 12시간 후에 희생시켰고, 결장 말단을 수집하였다. (A) 염증 결장의 균질물에서 IL-10의 수준을 측정하였다. *p < 0.05. (B) 동일한 실험을 정상 랫트에서 수행하였다. IL-10의 수준은 IL-10 ELISA kit를 이용하여 측정하였다. *p < 0.05 vs 미처리군.
도 11은 결장 조직에서 IL-10 유도에 대한 CTP-IAGIP의 억제 효과가 IKK 활성에 의존적이라는 결과를 나타낸다. (A) 결장-표적 CTP-IAGIP (CIG, 2.5 mg/kg 및 1.5 mg/kg) 또는 결장 표적 CTP-mIAGIP (mCIG, 2.5 mg/kg)를 TNBS-유도된 대장염 랫트에 대장염 유도 72시간 후부터, 6일 동안 하루에 한 번 경구 투여하였다. 포스포-IKK(phospho-IKK)의 수준을 결장 말단에서 측정하였다. (B) CTP-IAGIP (200μM, 500μL) 또는 CTP-mIAGIP (200μM, 500μL)를 TNBS-유도 대장염 랫트 직장으로 대장염 유도 72시간 후에 투여하였다. 렛트는 12시간 후에 희생시켰고, 결장 말단을 수집하였다. 포스포-IKK(phospho-IKK)의 수준을 염증 결장에서 측정하였다.
도 12는 CTP-IAGIP의 직장 투여가 TNBS-유도 랫트 대장염을 감소시킨다는 결과를 나타낸다. CTP-IAGIP (200μM, 500μL), CTP-mIAGIP (200μM, 500μL)를 TNBS-유도된 대장염 랫트에 대장염 유도 72시간 후부터, 6일 동안 하루에 한 번 직장 투여하였다. CTP-IAGIP 또는 CTP-mIAGIP를 투여하거나 투여하지 않은 대장염 랫트로부터 얻은 결장 말단의 내강(luminal) 및 장막(serosal) 부분의 사진이다.
도 13은 CTP-IAGIP의 직장 투여가 염증 조직의 CDS 및 MPO 활성을 낮춘다는 결과를 나타낸다. CTP-IAGIP (200μM, 500μL) 또는 CTP-mIAGIP (200μM, 500μL)를 TNBS-유도된 대장염 랫트에 대장염 유도 72시간 후부터, 6일 동안 하루에 한 번 직장 투여하였다. (A) 실험 조건을 알지 못하는 독립적인 관찰자에 의해 개량된 CDS 점수 시스템에 따라 각각의 랫트에게 CDS를 부여하였다. *p < 0.05 vs TNBS 대조군. (B) 랫트의 결장 말단 부위(4 cm)에서 MPO 활성을 측정하였다. *p < 0.05 vs TNBS 대조군.
도 14는 CTP-IAGIP의 직장 투여가 염증 결장 조직에서 염증 매개체 및 IL-10의 수준을 감소시킨다는 결과이다. CTP-IAGIP (200μM, 500μL) 또는 CTP-mIAGIP (200μM, 500μL)를 TNBS-유도된 대장염 랫트에 대장염 유도 72시간 후부터, 6일 동안 하루에 한 번 직장 투여하였다. 염증 매개체의 수준을 결장 말단 부위의 균질물에서 측정하였다. IL-6 (A) 및 CINC-3 (B)의 수준을 각각의 ELISA kit를 이용하여 측정하였고, COX-2 및 iNOS 단백질 수준 (C)을 웨스턴 블랏 분석을 통해 측정하였다. α-튜불린은 로딩 대조군으로 사용하였다. (D) IL-10의 수준은 IL-10 ELISA kit를 이용하여 측정하였다. *p < 0.05 vs TNBS 대조군(for A,B and D).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
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실험예
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하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 세포 및 시약
인간 결장암 세포주 HCT116 및 마우스 대식세포(macrophage) RAW 264.7 (ATCC, Manassas, VA) 세포는 10% 우태아혈청(fetal bovine serum; Hyclone, Logan, Utah) 및 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 지질다당체(Lipopolysaccharide; LPS)는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)로부터 구매하였다. 재조합 인간 TNF-α는 R & D systems (Minneapolis, MN)으로부터 구했다. 항체는 Cell Signaling (Beverly, MA) 및 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)로부터 구매하였다. 모든 ELISA 분석 키트는 R & D systems으로부터 구했다. 모든 다른 화합물은 시약-등급이고, 상업적으로 구할 수 있는 품목이다.
2. 펩타이드
펩타이드(95% 순도)는 Peptron, Inc. (Daejeon, Republic of Korea)로부터 구입하였다. 세포 투과성 펩타이드인 세포 전달 펩타이드(Cytoplasmic transduction peptide; CTP, YGRRARRRARR)는 IKK 활성화된 GSK3β 억제 펩타이드(IKK activated GSK3β inhibitory peptide; IAGIP, EPVPPPPTPRSSRHDSGLDSMKD; 서열번호 1) 및 IKK 매개 활성화에 대항하는 돌연변이 펩타이드(mIAGIP, EPVPPPPTPRSSRHDAGLDSMKD)에 결합시켜, 세포 투과성 IAGIP(CTP-IAGIP, YGRRARRRARR-EPVPPPPTPRSSRHDSGLDSMKD; 서열번호 2) 및 세포 투과성 mIAGIP(CTP-mIAGIP, YGRRARRRARR-EPVPPPPTPRSSRHDAGLDSMKD; 서열번호 3)을 만들었다.
3. 웨스턴 블랏(Western blot)
세포 용해물은 방사성면역침전법(radioimmunoprecipitation assay; RIPA) 완충액(50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM EDTA, 0.7% Na-deoxycholate, 1% NP-40, 150 mM NaCl, 0.3 uM aprotinin, 1 uM pepstatin 및 1 mM PMSF)을 이용하여 제조하였고, 얼음에서 30분 동안 두었다. 부유물은 4℃에서 10분 동안 10,000g로 원심분리하여 모았다. 핵 추출물을 얻기 위해셔, 세포를 모았고, 씻어냈으며, 저삼투압 완충액(10 mM Hepes (pH 7.9), 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT)에 부유시켰다. 0.64% NP40를 첨가한 후, 핵 펠렛(pellets)을 만들기 위해 부푼 세포를 30초 동안 섞고, 4℃에서 3분 동안 10,000g로 원심분리하였다. 핵 펠렛은 고염도 완충액(20 mM Hepes (pH 7.9), 0.4 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT)에 재현탁하였고, 얼음에서 30분 동안 반응시킨 후, 4℃에서 10분 동안 10,000g로 원심분리하였다. 조직 용해물을 제조하기 위해서, 염증 결장 말단을 제거하였고, 조직 1g 당 얼음으로 차갑게 해 둔 RIPA 완충액 3mL을 혼합하였다. 조직은 더 부수고, 균질기로 균질화시켰으며, 얼음에서 30분 동안 반응시킨 후, 4℃에서 10분 동안 10,000g로 원심분리하였다. 상등액은 원심분리하였다. 상등액의 단백질 농도는 BCA 방법에 의해 측정하였다. 세포 또는 조직 추출물은 7.5 또는 10% SDS-PAGE 젤을 사용하여 전기영동을 통해 분리하였다. 단백질은 니트로셀룰로스 막(Protran, Schleicher & Schuell, Keene, NH)으로 옮겼다. 포스포-글리코겐 합성효소는 단일클론 항-포스포-글리코겐 합성효소 항체(Cell Signaling)를 이용하여 전체 세포 추출물에서 검출하였다. 세포 용해물 및 조직 균질물 내의 COX-2, iNOS, phospho-CREB, p65 및 CBP 단백질은 단일클론 anti-COX-2, iNOS (NOS-2), p-CREB, p65, CBP 항체(Santa Cruz Biotechnology)를 이용하여 검출하였다. 신호는 Supersignal chemiluminescence substrate (Pierce, Rockford, IL)를 이용하여 가시화되었다. 실험은 2번 반복하여 수행하였고, 토포이소머라제 II(topoisomerase II) 또는 α-튜불린(α-tubulin)(Santa Cruz Biotechnology)에 대한 항체로 표준화하였다.
(4) 루시퍼라아제(luciferase) 분석
세포들은 50-60% 컨플루언트(confluent)하게 될 때까지 12-웰 플레이트에 배양하고, NFκB 의존성 루시퍼라아제(luciferase) 플라스미드(0.5 ug) 및 4 ng CMV 레닐라 루시퍼라아제(Renilla luciferase) 플라스미드(Promega, Madison, WI)로 형질감염하였다. 퓨젠(Fugene; Roche, South San Francisco, CA)은 형질감염 시약으로 사용되었다. 형질감염 24시간 후에, 세포들은 도면에 표시된 농도의 시약을 첨가하여 TNF-α 또는 LPS로 처리하였다. 세포들은 6시간 후에 용해하였고, 루시퍼라아제 활성을 측정하였으며, Dual Luciferase reporter assay system (Promega)을 사용하여 CMV 레닐라 루시퍼라아제(Renilla luciferase) 활성으로 표준화하였다.
(5) 직장 내 투여(Rectal administration)
수컷 스프래그-다우리(Sprague-Dawley) 랫트(16주령)을 물만 주고 24시간 동안 굶겼다. 랫트는 디에틸 에테르(diethyl ether)로 마취시켰다. 고무 캐뉼라(rubber cannula; o.d., 2 mm)를 결장 내로 삽입하였는데, 그 끝은 항문(anus)에서 8 cm 정도 떨어진 부위로서 대략 비장굴곡부(splenic flexture) 근처였다. PBS(600 μL)에 녹인 CTP-IAGIP(200 μM) 또는 CTP-mIAGIP(200 μM)을 포함한 주사기를 고무 캐뉼라에 연결하였고, 대장염 유도 72시간 후에 용액을 랫트의 결장 내로 하루에 한 번 주입하였다. 6일 동안 투약 후, 랫트를 희생시켰다.
(6) 결장-표적 CTP-IAGIP의 제조 및 경구 투여
결장 표적 폴리머를 준비하였다. Rodent capsules(Φ2.65×4.3mm, Qualicaps, Nara, Japan)을 1/2 크기로 자르고, 펩타이드 및 락토스(lactose)로 채웠다. 펩타이드에 결장 표적성을 적용하기 위해서, 담금(dipping) 방법에 의해 아세톤/에탄올에 녹인 결장 표적 폴리머로 캡슐을 코팅하였는데, 이는 기계적 강도를 위해 udragit-S 100 (Rohm Pharma, Darmstadt, Germany)로 덮어 씌웠다. 수컷 스프래그-다우리(Sprague-Dawley) 랫트는 물만 주고 24시간 동안 굶겼고, 디에틸 에테르(diethyl ether)로 마취시켰다. 대장염 유도 72시간 후, CTP-IAGIP (1.5 mg and 2.5 mg/kg) 또는 CTP-mIAGIP (2.5 mg/kg)로 채워진 하나의 결장-표적화된 캡슐을 경구 캡슐 주입기(Jungdo-BNP, Seoul, South Korea)를 이용하여 랫트에게 하루에 한 번 경구 투여하였다. 6일 동안 투약 후, 랫트를 희생시켰다.
(7) TNBS-유도 염증
염증은 Morris et al의 방법에 의해 유도되었다. 간략히 말하면, 대장염 유도 전에 랫트는 24시간 동안 굶겼으나 물은 자유롭게 줬다. 랫트는 에테르로 가볍게 마취시켰다. 고무 캐뉼라(rubber cannula; o.d., 2 mm)를 결장 내로 삽입하였는데, 그 끝은 항문(anus)에서 8 cm 정도 떨어진 부위로서 대략 비장굴곡부(splenic flexture) 근처였다. 50% (v/v) 에탄올 수용액에 녹인 TNBS를 고무 캐뉼라(15 mg/0.3 mL/rat)를 통해 결장 내로 주입하였다.
(8) 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin) 염색
결장 조직은 대조군 및 처리군 랫트로부터 수집되었는데, 이는 10% 중성 완충된 포르말린(formalin, Sigma-Aldrich)으로 밤새도록 고정시켰고, 파라핀에 박아 넣었으며, 5μm 두께로 잘라냈다. 단편들은 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin; H & E) 염색에 사용되었다.
(9) 결장 손상 점수
개량된 결장 손상 점수(Colonic damage score) 시스템에 따라, 실험 조건을 알지 못하는 4명의 독립적인 관찰자에 의해 각각의 랫트에게 CDS를 부여하였다. 개량된 점수 시스템은 다음과 같다: 정상 모습, 0; 국소 충혈은 있으나 궤양 없음, 1; 심각한 염증은 없는 선상 궤양, 2; 2-4 cm 부위의 염증 및 딱지(scab)가 있는 궤양화, 3; 다른 기관으로의 장막 유착(serosal adhesion), 4; 여러 장 고리(bowel loops)를 수반하는 협착 및 장막 유착, <4 cm 부위의 염증 및 딱지(scab)가 있는 궤양화, 5.
(10) 미엘로페르옥시다아제(Myeloperoxidase) 활성
1mL의 0.5% HTAB(pH 6.0)이 포함된 바이알(vial)에 -80℃에서 유지된 결장 말단 부분을 잘게 썰었고, 폴리트론 균질기(Polytron homogenizer)를 이용하여 얼음에서 균질화하였다. 균질화 후, 균질기는 HTAB 용액으로 씻어냈다. 수집된 균질물을 mL 당 100mg 조직으로 조절하기 위해서 HTAB를 첨가하였고, 10초 동안 초음파처리하였으며, 3 번 얼리고 녹이기를 반복하고, 4℃에서 10,000g로 원심분리하였다. 상등액(0.1 mL)을 0.167 mg/mL o-디아니시딘 하이드로클로라이드(o-dianisidine hydrochroride) 및 0.0005% 과산화수소(hydrogen peroxide)가 함유된 2.9 mL의 0.050 M 포스페이트 완충 용액(pH 6.0)에 혼합하였다. 460 nm에서의 흡광도 변화는 UV spectrophotometer (Shimadzu)를 이용하여 25℃에서 5분 동안 측정하였다. 1U의 미엘로페르옥시다아제(myeloperoxidase; MPO) 활성은 25℃에서 1분당 1umol의 과산화물(peroxide)이 분해되는 것으로 정의하였다.
(11) 염증 매개자(mediators)의 ELISA 분석
결장 조직에서 랫트 인터루킨-6(interleukin-6; IL-6), 사이토카인-유도 호중구 주화인자-3(cytokine-induced neutrophil chemoattractant; CINC-3), 랫트 인터루킨-10(interleukin-10; IL-10) 수치를 측정하기 위해서, 염증이 일어난 결장 말단을 제거하였고, pH 6 포타슘 포스페이트(potassium phosphate) 완충액과 혼합한 후, 균질화시켰다. 균질물은 4℃에서 3분 동안 2,500g로 원심분리하였다. 상등액(100uL)을 깨끗한 마이크로튜브에 옮긴 후, 4℃에서 10분 동안 10,000g로 원심분리하였다. ELISA kits (R & D systems)을 이용하여 상등액 적정 볼륨을 IL-10, IL-6 및 CINC-3 ELISA에 적용하였다. 세포 배양 상등액 내의 IL-8 및 IL-10는 각각의 ELISA kit (R & D systems)을 이용하여 검출하였다.
(12) 통계 분석
결과는 평균±S.E.M (n =5~7)으로 나타냈다. Tukey HSD test에 따른 One-way ANOVA를 데이터 간의 차이를 시험하기 위해 사용하였다. p < 0.05 차이를 유의성 있는 것으로 판단하였다. Sigmastat (SPSS Inc, Chicago, IL, USA)가 통계학적 분석에 사용되었다.
<
실시예
1>
IKK
-활성화된
GSK3
β 억제 펩타이드(
IKK
activated
GSK3
β inhibitory
peptide
;
IAGIP
)
염증상태에서 활성 형태로 전환되는 염증-반응성 GSK3β 억제 펩타이드를 개발하기 위해서, 억제 κB 키나제(inhibitory κB kinase; IKK)-활성화된 GSK3β 억제 펩타이드를 디자인하였다. IBD 환자의 염증 결장 조직에서 NFκB 활성은 상향조절되고, IKK는 IκBα의 인산화 및 분해, 결과적 방출 및 핵 내로의 NFκB 이동을 이끄는 주요 키나제로서, NFκB의 활성화를 일으킨다. NFκB는 염증 및 면역과 관련된 많은 유전자를 상호활성화시킨다.
akt-활성화된 GSK3β 억제 펩타이드 디자인에 관한 이전의 보고를 기초로 하여, Wnt co-receptor LRP6의 세포질 도메인인 PPPSPxS를 IKK-인식 모티프인 RHDSGLDSMKD에 결합시켰고, IKK-활성화된 GSK3β 억제 펩타이드(IKK activated GSK3β inhibitory peptide; IAGIP)인 EPVPPPPTPRS-S-RHDSGLDSMKD를 제조하기 위해서, 세린 잔기를 두 개의 모티프 사이에 넣었다. IKK-인식 모티프는 IκB 단백질 아이소형(isoforms)의 서열분석을 통해 결정하였다. IKK 인식 모티프 내의 2개의 세린 잔기가 염증 상태에서 활성화되는 IKK에 의해 인산화될 때, 단지 LRP6 모티프 내의 2개의 세린 잔기만이 인산화될 것으로 예상된다. 2개의 세린 잔기가 인산화되는 LRP6 모티프는 GSK3β의 강력한 억제자인 반면, 비-인산화된 LRP6 모티프는 GSK3β에 대하여 전혀 활성화되지 않는다.
대조군으로서, IKK-인식 모티프의 첫번째 세린을 알라닌으로 변경한 IKK-매개 활성화에 대응하는 돌연변이 펩타이드인, EPVPPPPTPRS-S-RHDAGLDSMKD (mIAGIP)도 또한 제조하였다. IAGIP의 IKK-매개 활성화에 대한 예상 경로는 도 1에 나타냈다.
<
실시예
2> 전-염증 매개체에 대한 반응에서
GSK3
β를 억제하는
IAGIP
IAGIP가 세포 내에서 염증-반응성 특성을 나타내는지 시험하기 위해서, 세포 투과성 펩타이드인 CTP를 IAGIP 및 mIAGIP에 접합시켜 세포 투과성 IAGIP (CTP-IAGIP) 및 세포 투과성 mIAGIP (CTP-mIAGIP)를 제조하였다. TNF-α (for human colon carcinoma cell HCT116) 또는 LPS (for murine macrophage RAW264.7) 존재하에서 세포 내에 상기 펩타이드들을 처리하였고, GSK3β의 기질인 글리코겐 합성효소(glycogen synthase; GS)의 인산화를 모니터링하였다. 대조군으로서 GSK3β의 억제제인 SB216763를 사용하였다.
도 2A (RAW264.7 cells) 및 도 2B (HCT116 cells)에 나타낸 바와 같이, 미처리된 세포와 비교시, 각 염증 매개체 단독 처리에 따른 포스포-GS(phospho-GS)의 수준에 큰 차이는 관찰되지 않았는데, 이는 인간 단핵구(monocytes) 내 경로에서 효과를 나타내는 LPS와는 다르게, RAW264.7 cells에서 GSK3β의 억제를 이끄는 PI-3K-Akt 경로를 LPS가 크게 활성화하지 않는다는 것을 나타낸다. CTP-mIAGIP가 포스포-GS(phospho-GS)의 수준에 영향을 미치지 않는 반면, CTP-IAGIP 및 SB216763는 포스포-GA(phospho-GS)의 수준을 상당히 감소시켰다. 더구나, 염증 매개체로의 촉진과 관계없이 GS의 인산화를 약하게 하는 SB216763와는 반대로, CTP-IAGIP는 오직 염증 매개체로 촉진한 세포에서만 GS 인산화를 억제하였다.
GSK3β의 억제는 LPS로 촉진된 단핵구(monocytes)에서 항-염증 사이토카인 IL-10의 유도를 증가시키므로, CTP-IAGIP가 LPS로 촉진된 RAW264.7 세포에서도 IL-10을 유도할 수 있는지 시험하였다. 도 3에서 나타낸 바와 같이, LPS는 IL-10을 유도하였고, CTP-IAGIP는 IL-10의 수준을 증가시켰는데, 이는 SB216763로 처리한 것과 비슷한 정도였다. 반대로, CTP-mIAGIP로 처리한 IL-10 수준은 아무런 변화도 관찰되지 않았다. 포스포-GA(phospho-GS)에 대한 상기의 결과에 따르면, CTP-IAGIP와는 다르지만, SB216763는 LPS의 촉진 없이도 IL-10 수준을 증가시킨 반면, SB216763-유도된 IL-10은 LPS-유도된 IL-10 보다 낮았다.
<
실시예
3> 전-염증 매개체에 의해 활성화되는
NF
κB를 억제하는
IAGIP
GSK3β 억제는 핵 보조인자인 cAMP 반응 원소 결합 단백질(cAMP response element-binding protein; CREB)-결합 단백질과 p65의 결합을 약화시킴으로써 NFκB 활성화를 방해한다. CTP-IAGIP가 전-염증 매개체에 대응하여 NFκB 활성화를 억제할 수 있는지 시험하기 위해서, 세포들에 약물을 첨가하여 TNF-α (for HCT116 cells) 또는 LPS (RAW264.7 cells)로 촉진하였고, NFκB 의존성 루시퍼라아제 활성 및 염증 과정에 연관된 NFκB 표적 유전자 산물의 발현을 모니터링하였다. RAW264.7 세포에서는, CTP-mIAGIP와는 다르게 CTP-IAGIP는 NFκB 의존성 루시퍼라아제 활성에 대한 LPS-매개 유도를 감소시켰다(도 4A). 상기와 일관성 있게, CTP-mIAGIP와는 다르게 CTP-IAGIP는 IL-6의 분비를 감소시켰고(도 4B), COX-2 및 iNOS의 유도를 감소시켰다(도 4C). 또한, HCT116 세포에서 CTP-IAGIP는 NFκB 의존성 루시퍼라아제에 대한 TNF-매개 유도(도 5A) 및 IL-8의 분비를 약화시켰다(도 5B). 반대로, CTP-mIAGIP에 대한 효과는 확인할 수 없었다.
<
실시예
4>
TNBS
-유도 대장염
랫트의
CTP
-
IAGIP
의 경구 투여 효과
GSK3β 억제제는 소화관 염증에 항-염증 효과를 나타내므로, CTP-IAGIP는 결장염에 유익한 효과를 도출할 수 있을 것으로 예상되었다. 이를 시험하기 위해서, TNBS-유도 랫트 대장염 모델에서 CTP-IAGIP의 항-장염 활성을 측정하였다. 경구 투여된 펩타이드의 치료 효과를 최대화하기 위해서, 결장 표적 약물 전달 시스템을 적용하였다. 이는 내장 상부에서 단백질 분해 대사작용을 억제하고, 펩타이드 약물의 거대 단편을 병리학적 손상이 존재하는 대장으로 전달한다. CTP-IAGIP로 채워진 결장 표적 캡슐을 TNBS에 의해 유도된 대장염을 가진 랫트에게 경구 투여하였고, 펩타이드의 항-장염 효과를 측정하였다. 동일한 실험을 CTP-mIAGIP로도 수행하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 정상 결장은 손상을 입지 않은 것으로 나타났으나, 대조군 결장으로 미투약 염증 결장은 심각한 손상을 입은 것으로 나타났는데, 이는 점막의 출혈성 괴사로 인한 딱지(scab), 협착(stricture) 및 다른 기관으로의 광범위한 장막 유착을 나타내고 있다. 도 7A, B 및 C에서는, 결장-표적 CTP-IAGIP의 경구 투여가 손상된 결장을 치유하는 반면, 결장-표적 돌연변이 펩타이드는 결장 손상을 완화시키지 못하는 것으로 나타났다(도 7A). CDS 결과는 조직의 H & E 염색에 의해 확인되었다. CTP-mIAGIP 보다 CTP-IAGIP가 결장 점막층을 더 크게 회복시키는 것으로 관측되었다(도 7B). 도 7C는 CTP-mIAGIP가 아닌 CTP-IAGIP가 MPO 활성 수준을 대조군(미투약 그룹)의 40% 이상 크게 낮추는 것으로 나타냈는데, 이는 결장 손상의 회복에 따른 것이다.
몸무게, 결장 조직의 무게 비율 및 결장 조직의 길이 비율 (결장 무게 비율)의 변화도 같이 모니터링되었다. CTP-mIAGIP가 아닌 CTP-IAGIP가 대장염에 의한 몸무게 손실을 약화시켰고(도 8A), 염증에 의해 짧아진 결장 길이는 정상 랫트 정도로 회복되었다(도 8B, C). 또한, 결장 무게 비율은 CTP-IAGIP (2.5 mg/kg)의 경구 투여시 정상 랫트와 비슷해졌다(도 8D).
염증 결장 조직에서의 결장-표적 CTP-IAGIP 치료 효과가 GSK3β 및 NFκB의 억제와 관련되어 있는지 시험하기 위해서, 염증 조직에서 NFκB 표적 유전자 산물인 IL-6, CINC-3, iNOS 및 COX-2 단백질과 항-염증 사이토카인 IL-10의 발현을 검출하였다. 도 9A(IL-6), 도 9B(CINC-3) 및 도 9C(iNOS 및 COX-2)에서 나타낸 바와 같이, 염증 매개체의 수준은 정상 결장 조직과 비교했을 때 염증 결장 조직에서 증가하였다. 세포 결과 및 CDS와 일관되게, CTP-mIAGIP와는 다르게 CTP-IAGIP는 염증 매개체의 수준을 감소시켰다. 도 9D에서 나타낸 바와 같이, IL-10 수준은 대장염 랫트의 미투약 (대조군) 염증 결장 조직에서 증가하였다. 흥미롭게도, IL-10 수준은 결장-표적 CTP-IAGIP를 투여시 정상 랫트 정도로 낮아진 반면, 결장-표적 CTP-mIAGIP는 사이토카인 수준이 전혀 낮아지지 않았다. 상기 결과는 CTP-IAGIP가 LPS-매개 IL-10 유도를 증가시키는 것으로 나타난 세포 결과와 일치하지 않는데, 이는 IKK-NFκB 포함 염증 신호가 감소되고, 염증이 진정되는 결장 조직에서는 CTP-IAGIP가 일부 활성화되지 않는 것으로 추정된다.
이를 확인하기 위해서, CTP-IAGIP, 이의 돌연변이 펩타이드 또는 SB216763를 대장염 랫트의 직장으로 투여하였고, 염증 반응이 여전히 한창 진행 중인, 첫 번째 투여 8시간 및 12시간 후에 염증 결장 조직에서 IL-10을 검출하였다. 도 10A 및 도 10B에 나타낸 바와 같이, CTP-IAGIP 및 SB216763은 TNBS 대조군과 비교시 IL-10를 더 유도시켰다. CTP-mIAGIP는 IL-10 수준을 변화시키지 않는 것으로 나타났다(도 10A). CTP-IAGIP가 병리학적으로 선택적인 GSK3β 억제제로서 작용하는지 확인하기 위해서, 동일한 실험을 정상 랫트에서 반복하였다. CTP-IAGIP 및 이의 돌연변이 펩타이드는 IL-10 수준에 영향을 미치지 않는 반면, SB216763은 사이토카인 수준을 증가시켰다(도 10B).
마지막으로, 염증이 만연한 염증 결장 조직 및 염증이 진정된 염증 결장 조직에서 포스포-IKK(phospho-IKK)의 수준을 비교하였다. 도 11A 및 도 11B에 나타낸 바와 같이, (6일 동안 하루에 한 번 CTP-IAGIP 처리한 대장염 랫트로부터 얻은) 염증이 진정된 결장 조직(도 11A)의 포스포-IKK(phospho-IKK) 수준은 (12시간 동안 CTP-IAGIP로 한 번 처리한 대장염 랫트로부터 얻은) 심각한 염증을 가진 결장 조직(도 11B) 보다 더 낮았다.
<
실시예
5>
TNBS
-유도
랫트
대장염을
완화시키는
CTP
-
IAGIP
의 직장 투여 효과
상기 결과는 대장으로 전달된 CTP-IAGIP가 국소 작용을 통해 항-염증반응을 일으킨다는 것을 강하게 보여준다. CTP-IAGIP의 국소 작용을 확인하기 위해서, 상기 펩타이드를 대장염 랫트의 직장을 통해 투여하였다. 처리 후 6일 동안, 경구 투여한 CTP-IAGIP를 평가하기 위해 사용했던 염증 인덱스를 결정하였다. 비교를 위해, CTP-mIAGIP로도 동일한 실험을 수행하였다. 도 12에서 나타낸 바와 같이, CTP-mIAGIP와는 다르게 CTP-IAGIP는 손상된 결장을 크게 치유시켰다. 도 13A 및 도 13B는 CTP-IAGIP가 CDS (도 13A) 및 MPO (도 13B) 활성을 대조군의 약 35% 정도로 낮추는 것으로 나타났다. NFκB 표적 유전자 산물인 IL-6, CINC-3, iNOS 및 COX-2 단백질의 발현을 염증 조직에서 측정하였다. 도 14A(IL-6), 도 14B(CINC-3) 및 도 14C(COX-2 및 iNOS)에서 나타낸 바와 같이, MPO 및 CDS 결과와 일관되게, CTP-mIAGIP와는 다르게 CTP-IAGIP는 염증 조직에서 염증 매개체의 수준을 감소시켰다. 반면에, 도 14D는 경구 투여 후 결과에서 나타낸 바와 같이, 결장 조직 내 IL-10 수준이 정상 수준으로 낮아진 것을 보여준다. 상기 결과는 대장으로 전달된 CTP-IAGIP가 랫트 대장염에 대응하여 항-염증 활성을 나타내어 국소적으로 작용했다는 것을 보여준다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation
<120> IKK-activated GSK3b inhibitory peptide and composition for
treating inflammatory diseases comprising the same
<130> ADP-2013-0574
<160> 3
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 1
Glu Pro Val Pro Pro Pro Pro Thr Pro Arg Ser Ser Arg His Asp Ser
1 5 10 15
Gly Leu Asp Ser Met Lys Asp
20
<210> 2
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 2
Tyr Gly Arg Arg Ala Arg Arg Arg Ala Arg Arg Glu Pro Val Pro Pro
1 5 10 15
Pro Pro Thr Pro Arg Ser Ser Arg His Asp Ser Gly Leu Asp Ser Met
20 25 30
Lys Asp
<210> 3
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 3
Tyr Gly Arg Arg Ala Arg Arg Arg Ala Arg Arg Glu Pro Val Pro Pro
1 5 10 15
Pro Pro Thr Pro Arg Ser Ser Arg His Asp Ala Gly Leu Asp Ser Met
20 25 30
Lys Asp
Claims (8)
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드.
- 제1항의 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자.
- 제1항에 따른 폴리펩타이드와 세포 전달 펩타이드를 결합시켜 제조되는 융합단백질.
- 제3항에 있어서,
상기 융합 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 융합단백질. - 제1항에 따른 폴리펩타이드, 제2항에 따른 유전자 또는 제3항에 따른 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 염증 질환 치료용 약학 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 조성물은 억제 κB 키나제(inhibitory κB kinase; IKK)-활성화된 GSK3β를 억제하는 것을 특징으로 하는 염증 질환 치료용 약학 조성물. - 제5항에 있어서,
상기 염증 질환은 염증성 장질환(inflammatory bowel disease; IBD)인 것을 특징으로 하는 염증 질환 치료용 약학 조성물. - 제5항에 있어서, 상기 조성물은 경구 투여 또는 직장 투여하는 것을 특징으로 하는 염증 질환 치료용 약학 조성물.
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| KR1020140020249A KR101562029B1 (ko) | 2014-02-21 | 2014-02-21 | 염증신호 인식 GSK3β 억제 펩타이드 및 이를 포함하는 염증 질환 치료용 조성물 |
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-
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