KR20150098539A

KR20150098539A - Composition for forming hydrogel based on Pluronic having improved stabillity

Info

Publication number: KR20150098539A
Application number: KR1020140064945A
Authority: KR
Inventors: 태기융; 원다애
Original assignee: 광주과학기술원
Priority date: 2014-02-20
Filing date: 2014-05-29
Publication date: 2015-08-28
Also published as: KR101610027B1

Abstract

The present invention relates to a composition for forming hydrogel and, more specifically, to a composition for forming hydrogel including 1 wt% or less of graphene oxide and 5 wt% or more of a triblock copolymer represented by chemical formula 1. In the formula, n is an integer number of 8 to 540, and m is an integer number of 16 to 70. According to the present invention, provided is a composition for forming hydrogel, which can be manufactured by a simple mixing process, while improving in vitro and in vivo stability problems pointed out in an existing hydrogel composition, and not only has excellent mechanical properties such as storage modulus, also has excellent biocompatibility.

Description

TECHNICAL FIELD [0001] The present invention relates to a composition for hydrogel formation,

본 발명은 주사가능한 수화겔 형성용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to an injectable hydrogel forming composition.

수화겔 (hydrogels)은 3차원적 친수성 폴리머 물질로서, 생체 적합성, 물을 흡수할 수 있는 능력 및 저염증성 반응 등과 같은 다양한 장점들을 보유하고 있다. 또한, 수화겔은 약물 또는 단백질의 서방출을 위한 저장고로서 사용될 수 있다. 특히, 주사가능한 수화겔은 약물/단백질 전달 및 조직 공학에 적합하다. 주사가능한 수화겔은 온도 또는 pH와 같은 환경 자극에 대한 반응들을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 이러한 물질들은 투여 이전에는 유동성을 나타내지만, 일단 주사되면, 생리학적 조건 하에서 신속하게 겔 상태로 변환된다. 이러한 시스템들은 최소침습적인 방식에 의해서 대량 전달을 가능하게 하고, 원하는 조직 부위에서 겔화를 야기하며, 흉터 생성을 최소화함으로써, 감염의 위험성을 감소시킨다. 더 나아가, 생활성 분자들 또는 세포들이 주사 이전에 간단한 혼합에 의해서 겔 내부로 통합될 수 있다.Hydrogels are three-dimensional hydrophilic polymeric materials and possess a variety of advantages such as biocompatibility, ability to absorb water and hypoinflammatory responses. In addition, the hydrogel can be used as a reservoir for the sustained release of the drug or protein. In particular, injectable hydrogels are suitable for drug / protein delivery and tissue engineering. The injectable hydrogel can be prepared using reactions to environmental stimuli such as temperature or pH. For example, these materials exhibit fluidity prior to administration, but once injected, they are rapidly converted to a gel state under physiological conditions. These systems enable mass delivery by minimally invasive methods, cause gelation at the desired tissue site, and minimize scar formation, thereby reducing the risk of infection. Furthermore, bioactive molecules or cells can be incorporated into the gel by simple mixing prior to injection.

저임계 용액 온도 (lower critical solution temperature, LCST) 특성을 나타내는 폴리머들은 LCST 미만에서는 가용성이지만, LCST 이상에서는 불용성이 됨으로써, 겔을 형성하게 된다. 따라서, 이는 열민감성의 주사가능한 수화겔로서 활용될 수 있다. 그러나, 이러한 폴리머들의 적용분야는 제한적인데, 이는 주로 주사와 함께 매우 빠른 용해 현상이 발생되기 때문이고, 그 이유는 인체의 주사 부위가 밀폐된 상태가 아니고 과다한 수성 환경에 노출되어 있기 때문이다. 주사된 겔 상태의 안정성을 향상시키기 위해서, 추가적인 공유 가교결합이, 주로 광중합에 의해서 도입된 연구들이 존재한다 (T. Vermonden, N. E. Fedorovich, D. vanGeemen, J. Alblas, C. F. van Nostrum, W. J. A. Dhert, W. E. Hennink, Photopolymerized Thermosensitive Hydrogels: Synthesis, Degradation, and Cytocompatibility, Biomacromolecules, 2008, 919-926.; K. J. Jeong, A. Panitch, Interplay between covalent and physical interactions within environment sensitive hydrogels, Biomacromolecules, 2009, 10, 1090-1099.).Polymers exhibiting lower critical solution temperature (LCST) characteristics are soluble below the LCST but insoluble above the LCST, thereby forming a gel. Thus, it can be utilized as a heat-sensitive, injectable hydrogel. However, the applications of these polymers are limited because they are very fast dissolution with injection, primarily because the injection site of the human body is not in a hermetic state but exposed to an excess of aqueous environment. In order to improve the stability of the injected gel state, there are studies in which additional covalent crosslinks are introduced mainly by photopolymerization (T. Vermonden, NE Fedorovich, D. van Geemen, J. Alblas, CF van Nostrum, WJ Dhert, WE Hennink, Photopolymerized Thermosensitive Hydrogels: Synthesis, Degradation, and Cytocompatibility, Biomacromolecules, 2008, 919-926 .; KJ Jeong, A. Panitch, Interplay between covalent and physical interactions within environmental sensitive hydrogels, Biomacromolecules, 2009, 10, 1090-1099 .).

플루로닉은, 소수성 프로필렌 옥사이드 및 친수성 에틸렌 옥사이드로 이루어진 삼중블록 공중합체로서, 주사가능한 수화겔 시스템으로서 널리 적용되는 물질이다 (K. Mortensen, J. S. Pedersen, Structural study on the Micelle Formation of Poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-poly(ethylene oxide) Triblock Copolymer in Aqueous solution. Macromolecules, 1993, 26, 805-812.). 플루로닉은 임계 미셀 농도 (critical micelle concentration, CMC) 및 임계 미셀 온도 (critical micelle temperature, CMT) 이상에서는 수성 용액 중에서 미셀들로 자가조립하며, 온도 응답성 졸-겔 전이 특성을 나타낸다. CMT 이상의 온도 및 고농도의 플루로닉 조건 하에서는, 미셀 팩킹으로 인해서 겔화가 진행되며, 이는 그 유동학적 특성에 급격한 변화를 야기한다. 이러한 열-가역성 겔화를 이용하여, Pluronic F 127 (PF127)이 광범위하게 연구된 바 있으며, 특히 국부적 약물 전달을 위한 주사가능 시스템으로 널리 연구된 바 있다 (M. Morishita, J. M. Barichello, K. Takayama, Y. Chiba, S. Tokiwa, T. Nagai, Pluronic F127 gels Incorporating Highly Purified Unsaturated Fatty acids for Buccal delivery of Insulin, Int. J. Pharm., 2001, 212, 289-293.). 그러나, 다른 물리적 겔화 시스템과 유사하게, PF127 수화겔은 매우 빠른 용해로 인해서 그 적용에 제한이 있어 왔으며, 따라서 약물이 매우 빠르게 방출될 뿐만 아니라 인 비보에서 기계적 특성이 매우 열악하였다.Pluronic is a triblock copolymer composed of hydrophobic propylene oxide and hydrophilic ethylene oxide and is widely applied as an injectable hydrogel system (K. Mortensen, JS Pedersen, Structural study on Micelle Formation of Poly (ethylene oxide) -poly (propylene oxide) -poly (ethylene oxide) Triblock Copolymer in Aqueous solution, Macromolecules, 1993, 26, 805-812.). Pluronic self-assemble into micelles in aqueous solution above the critical micelle concentration (CMC) and critical micelle temperature (CMT) and exhibit temperature responsive sol-gel transition characteristics. Under the conditions of CMT and higher fluoranic conditions, gelation proceeds due to micelle packing, which causes a sudden change in the rheological properties. Using this heat-reversible gelation, Pluronic F 127 (PF127) has been extensively studied, and in particular has been extensively studied as an injectable system for local drug delivery (M. Morishita, JM Barichello, K. Takayama, Y. Chiba, S. Tokiwa, T. Nagai, Pluronic F127 gels Incorporating Highly Purified Unsaturated Fatty Acids for Buccal Delivery of Insulin, Int. J. Pharm., 2001, 212, 289-293.). However, similar to other physical gelling systems, PF127 hydrogels have been limited in their application due to very fast dissolution, and thus not only the drug is released very quickly, but also the mechanical properties in InVivo are very poor.

최근에, 그래핀의 생물학적 응용이 두드러진 주목을 받고 있는 바, 예를 들어 바이오센서, 약물전달용 나노캐리어 및 세포 및 생물학적 영상화를 위한 프로브가 그 분야들이다. 그래핀은 허니콤 2차원 결정 격자 내에 sp²-혼성화 탄소 원자들의 단일층이 배열된 구조를 갖는다. π-컨주게이션을 갖는 층 구조로 인하여, 그래핀은 평면형 방향족 거대분자로 간주된다. 이러한 평면형 구조는 초고도 표면적을 제공하며, 금속, 약물, 생분자 및 세포들을 포함하는 다양한 물질들과 반응할 수 있는 능력을 부여한다. 그러나, 그래핀은 매우 소수성이며 물에 잘 분산되지 않으므로, 생물학적 응용을 위해서는 계면활성제 또는 표면 개질을 필요로 한다. 이와는 대조적으로, 그래핀 산화물 (GO)은 그래핀의 산화 유도체로서, 탄소, 산소 및 수소가 다양한 비율로 된 화합물이다. GO는 카르복실기, 히드록실기 및 에폭시기와 같은 친수성기들을 가지며, 이들은 물에 대한 분산성을 부여한다. 비록 GO가 그래핀에 비해서 상대적으로 친수성이지만, 현재까지 GO의 생체적합성 및 독성에 대해서는 명확하게 밝혀진 바가 없다. 대부분의 연구들은 GO가 인 비트로 및 인 비보에서 독성을 나타내지 않는다고 보고하고 있으나, 일부 연구자들은 GO의 독성에 대해서 보고하고 있기도 하다 (K. H. Liao, Y. S. Lin, C. W. Macosko, C. L. Haynes, Cytotoxicity of graphene oxide and graphene in human erythrocytes and skin fibroblasts, ACS Appl. Mater. Interfaces, 2011, 3, 2607-2615.). 따라서, 비독성 폴리머로 개질된 GO 시트들이 개발되어 생체적용을 위해서 연구되어 왔다.Recently, biologic applications of graphene have received considerable attention such as biosensors, nanocarriers for drug delivery, and probes for cellular and biological imaging. Graphene has a structure in which a single layer of sp ² -hybridized carbon atoms is arranged in the honeycomb two-dimensional crystal lattice. Due to the layered structure with pi -conjugation, graphene is regarded as a planar aromatic macromolecule. These planar structures provide super high surface area and give the ability to react with a variety of materials including metals, drugs, biomolecules and cells. However, since graphene is very hydrophobic and is not well dispersed in water, it requires surfactant or surface modification for biological applications. In contrast, graphene oxide (GO) is an oxidized derivative of graphene, a compound of varying proportions of carbon, oxygen and hydrogen. The GO has hydrophilic groups such as carboxyl groups, hydroxyl groups and epoxy groups, which impart dispersibility to water. Although GO is relatively hydrophilic compared to graphene, the biocompatibility and toxicity of GO have not been clarified to date. Most studies report that GO is not toxic in vitro and in vivo, but some researchers have reported on the toxicity of GO (KH Liao, YS Lin, CW Macosko, CL Haynes, Cytotoxicity of graphene oxide and graphene in human erythrocytes and skin fibroblasts, ACS Appl. Mater. Interfaces, 2011, 3, 2607-2615.). Thus, GO sheets modified with non-toxic polymers have been developed and studied for in vivo applications.

본 발명자들 역시 저농도 플루로닉 용액 중에서, 플루로닉의 물리적 가교결합에 의해서 매개된, 자가조립된 산화그래핀 나노시트로 구성된 자극 민감성 주사가능 수화겔 시스템에 대해서 보고한 바가 있다 (대한민국 공개특허공보 제10-2013-0115459호). 이러한 수화겔은 다양한 자극들에 반응하여 졸-겔 전이 반응을 나타내며, 인 비보에서 피하주사하는 경우 주목할만한 면역 반응을 야기함이 없이 안정한 겔 형성을 나타내는 것으로 보고된 바 있다. 본 발명자들은 또한 플루로닉이 코팅된 나노 산화그래핀이, 광열 (photothermal) 물질 및 광증감제 (photosensitizer)용 전달제로 기능함으로써, 광치료법에서 상승효과를 발휘한다는 사실을 보고한 바도 있다 (A. Sahu, W. I. Choi, J. H. Lee, G. Tae, Graphene oxide mediated delivery of methylene blue for combined photodynamic and photothermal therapy, Biomaterials, 2013, 34, 6239-6248.). 상기 두 가지 문헌들은 산화그래핀과 플루로닉 사이의 강한 친화도, 및 GO-플루로닉 복합체 시스템이 허용가능한 생체적합성을 갖는다는 사실을 보여주는 것이다.The present inventors have also reported on a stimuli-sensitive injectable hydrogel system composed of self-assembled oxidative graphene nanosheets mediated by physical crosslinking of pluronic in a low-concentration pluronic solution (Korean Patent Laid- 10-2013-0115459). Such hydrogels exhibit a sol-gel transfer reaction in response to various stimuli and have been reported to exhibit stable gel formation without sub- stantial immune response when injected subcutaneously in vivo. The present inventors have also reported that pluronic coated nano-oxidized graphene acts as a photothermal material and a transfer agent for photosensitizers, thereby exhibiting a synergistic effect in phototherapy (A Wu Choi, JH Lee, G. Tae, Graphene oxide mediated delivery of methylene blue for photodynamic and photothermal therapy, Biomaterials, 2013, 34, 6239-6248. Both of these documents demonstrate the strong affinity between oxidized graphene and pluronic, and that the GO-pluronic complex system has acceptable biocompatibility.

몇몇 연구진들이 GO를 도입함으로써 호스트 폴리머의 기계적 및 열적 특성들을 현저하게 증가시켰다는 사실을 보고한 바 있다 (J. Shen, B. Yan, T. Li, Y. Long, N. Li, M. Ye, Mechanical, thermal and swelling properties of poly (acrylic acid)-graphene oxide composite hydrogels, Soft Matter, 2012, 8, 1831-1836.). Li 등은 선형 소듐 알지네이트 및 GO-교차결합된 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPAM)를 사용하여 pH- 및 온도-반응성 수화겔을 제조하였으며, GO가 없는 수화겔에 비해서 GO 복합체 수화겔이 훨씬 강한 기계적 특성들을 갖는다는 점을 보고한 바 있다 (Z. Li, J. Shen, H. Ma, X. Lu, M. Shi, N. Li, M. Ye, Preparation and characterization of Ph- and temperature-responsive hydrogels with surface-functionalized graphene oxide as the crosslinker, Soft Matter, 2012, 8, 3139-3145.). Zhang 등은 폴리비닐알콜 (PVA) 기질 내로 GO를 나노-필러로서 첨가하였으며, GO를 첨가함으로써 인장강도, 파단신장 및 압축강도가 향상되었다는 사실을 보고하였다 (L. Zhang, Z. Wang, C. Xu, Y. Li, J. Gao, W. Wang, Y. Liu, High strength graphene oxide/polyvinyl alcohol composite hydrogels, J. Mater. Chem., 2011, 21, 10399-10406.). 그러나, 인 비보에서 물리적 겔 시스템의 안정성을 향상시키기 위해서 GO를 사용한 예는 보고된 바가 없다.Several researchers have reported that the introduction of GO significantly increased the mechanical and thermal properties of the host polymer (J. Shen, B. Yan, T. Li, Y. Long, N. Li, M. Ye, Mechanical, thermal and swelling properties of poly (acrylic acid) -graphene oxide composite hydrogels, Soft Matter, 2012, 8, 1831-1836. Li et al. Prepared pH- and temperature-reactive hydrogels using linear sodium alginate and GO-crosslinked poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) and found that the GO complex hydrogel is much stronger (J. Li, J. Shen, H. Ma, X. Lu, M. Shi, N. Li, M. Ye, Preparation and characterization of Ph- and temperature-responsive hydrogels with surface-functionalized graphene oxide as the crosslinker, Soft Matter, 2012, 8, 3139-3145.). Zhang et al. Have reported that GO is added as a nano-filler in a polyvinyl alcohol (PVA) substrate and the addition of GO improves tensile strength, elongation at break and compressive strength (L. Zhang, Z. Wang, C. Xu, Y. Li, J. Gao, W. Wang, Y. Liu, High strength graphene oxide / polyvinyl alcohol composite hydrogels, J. Mater. Chem., 2011, 21, 10399-10406. However, there has been no report on the use of GO to improve the stability of physical gel systems in in vivo.

따라서, 본 발명은 인 비트로 및 인 비보에서 우수한 안정성을 갖고, 생체 적합성이 우수한, 비독성의 주사가능한 수화겔 형성용 조성물을 제공하고자 한다.Accordingly, the present invention aims to provide a non-toxic, injectable hydrogel-forming composition having excellent stability in in vitro and in vivo, and excellent biocompatibility.

본 발명은 상기 과제를 달성하기 위한 일 구현예에서,In one embodiment of the present invention,

1 중량% 이하의 산화그래핀 및 5 중량% 이상의 하기 화학식 1로 표시되는 트리블록 공중합체를 포함하는 수화겔 형성용 조성물을 제공한다:1% by weight or less of oxidized graphene and 5% by weight or more of a triblock copolymer represented by the following formula (1):

상기 식에서, n은 8 내지 540의 정수이고, m은 16 내지 70의 정수이다.In the above formula, n is an integer of 8 to 540 and m is an integer of 16 to 70. [

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 산화그래핀의 히드록실기는 카르복실기로 치환된 것일 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the hydroxyl group of the oxidized graphene may be substituted with a carboxyl group.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 트리블록 공중합체는 하기 화학식 2로 표시되는 트리블록 공중합체일 수 있다:According to another embodiment of the present invention, the triblock copolymer may be a triblock copolymer represented by the following formula (2)

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 트리블록 공중합체는 하기 화학식 3으로 표시되는 디아크릴화 트리블록 공중합체일 수 있다:According to another embodiment of the present invention, the triblock copolymer may be a diacrylated triblock copolymer represented by the following formula 3:

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 화학식 3으로 표시되는 디아크릴화 트리블록 공중합체는 나노겔 상의 트리블록 공중합체일 수 있다.According to another embodiment of the present invention, the diacrylated triblock copolymer represented by Formula 3 may be a nano-gel triblock copolymer.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 수화겔 형성용 조성물은 용매로서 증류수, 완충용액 및 생리 식염수로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매를 포함할 수 있다.According to another embodiment of the present invention, the composition for forming a hydrogel may include at least one solvent selected from the group consisting of distilled water, a buffer solution and physiological saline as a solvent.

본 발명에 따르면, 간단한 혼합 공정에 의해서 제조가능하면서도, 종래 수화겔 조성물에서 지적되던 인 비트로 및 인 비보 안정성 문제가 현저히 개선되고, 저장탄성률과 같은 기계적 물성이 우수할 뿐만 아니라, 생체적합성도 우수한 수화겔 형성용 조성물을 제공할 수 있다.According to the present invention, it is possible to manufacture by a simple mixing process, but also significantly improve the problems of in-vitro and in-vivo stability, which have been pointed out in conventional hydrogel compositions, and have excellent mechanical properties such as storage elasticity, And the like.

도 1은 본 발명에 따른 주사가능한 수화겔 시스템 (a) 및 그 제조과정의 일예 (b)에 대한 개략도이다.
도 2는 17 중량%의 PF 및 GO-COOH로 구성된 수화겔의 37℃에서 겔화 동역학을 도시한 그래프로서, (A)는 다른 GO 농도에서 단일 주파수 그래프를, (B)는 17 중량% PF 및 0.1 중량% GO-COOH로 구성된 PF&GO-COOH 수화겔의 주파수 스윕 그래프를 도시한 것이다.
도 3은 17 중량%의 DAPF 및 GO-COOH로 구성된 수화겔의 37℃에서 겔화 동역학을 도시한 그래프로서, (A)는 다른 GO 농도에서 단일 주파수 그래프를, (B)는 17 중량% DAPF 및 0.1 중량% GO-COOH로 구성된 DAPF&GO-COOH 수화겔의 주파수 스윕 그래프를 도시한 것이다.
도 4는 11 중량%의 NG 및 GO-COOH로 구성된 수화겔의 37℃에서 겔화 동역학을 도시한 그래프로서, (A)는 다른 GO 농도에서 단일 주파수 그래프를, (B)는 11 중량% NG 및 0.1 중량% GO-COOH로 구성된 NG&GO-COOH 수화겔의 주파수 스윕 그래프를 도시한 것이다.
도 5는 PBS 중 PF 및 PF-GO-COOH 수화겔의 졸-겔 전이 곡선들을 도시한 것이다 (GO 0.1 중량%, n=3).
도 6은 PBS 중 DAPF 및 DAPF-GO-COOH 수화겔의 졸-겔 전이 곡선들을 도시한 것이다 (GO 0.1 중량%, n=3).
도 7은 PBS 중 NG 및 NG-GO-COOH 수화겔의 졸-겔 전이 곡선들을 도시한 것이다 (GO 0.1 중량%, n=3).
도 8은 2 mM 소듐 아자이드를 포함하는 PBS 중, 17 중량%의 PF 및 카르복실화 GO로 구성된 수화겔과, 17 중량%의 PF 및 GO를 포함하는 수화겔의 37℃, 100 rpm의 교반 배양기 중 분해를 도시한 그래프이다 (n=3).
도 9는 2 mM 소듐 아자이드를 포함하는 PBS 중, 17 중량%의 PF 및 카르복실화 GO로 구성된 수화겔의 GO 함량에 따른 37℃, 100 rpm의 교반 배양기 중 분해를 도시한 그래프이다 (n=3).
도 10은 2 mM 소듐 아자이드를 포함하는 PBS 중, 17 중량%의 DAPF 및 카르복실화 GO로 구성된 수화겔의 GO 함량에 따른 37℃, 100 rpm의 교반 배양기 중 분해를 도시한 그래프이다 (n=3).
도 11은 2 mM 소듐 아자이드를 포함하는 PBS 중, 11 중량%의 NG 및 카르복실화 GO로 구성된 수화겔의 GO 함량에 따른 37℃, 100 rpm의 교반 배양기 중 분해를 도시한 그래프이다 (n=3).
도 12는 2 mM 소듐 아자이드를 포함하는 PBS 중, 17 중량%의 PF로 구성된 수화겔 (◆)과, PF 및 0.1 중량%의 GO-COOH로 구성된 수화겔 (■)의, 37℃, 100 rpm의 교반 배양기 중 VEGF 방출 프로파일을 도시한 그래프이다.
도 13은 2 mM 소듐 아자이드를 포함하는 PBS 중, 17 중량%의 DAPF로 구성된 수화겔 (◆)과, DAPF 및 0.1 중량%의 GO-COOH로 구성된 수화겔 (■)의, 37℃, 100 rpm의 교반 배양기 중 VEGF 방출 프로파일을 도시한 그래프이다.
도 14는 2 mM 소듐 아자이드를 포함하는 PBS 중, 11 중량%의 NG로 구성된 수화겔 (◆)과, NG 및 0.1 중량%의 GO-COOH로 구성된 수화겔 (■)의, 37℃, 100 rpm의 교반 배양기 중 VEGF 방출 프로파일을 도시한 그래프이다.
도 15는 17 중량%의 PF와 0.1 중량%의 GO-COOH로 구성된 수화겔의 인 비보 분해를 도시한 그래프이다 (n=3).
도 16은 17 중량%의 DAPF와 0.1 중량%의 GO-COOH로 구성된 수화겔의 인 비보 분해를 도시한 그래프이다 (n=3).
도 17은 11 중량%의 NG와 0.1 중량%의 GO-COOH로 구성된 수화겔의 인 비보 분해를 도시한 그래프이다 (n=3).
도 18은 (a) PF, (b) PFGO, (c) DAPF, (d) DAPFGO, (e) NG 및 (f) NGGO로 주사된 마우스로부터 3주 후 얻어진 H&E 염색된 피부의 사진들이다.1 is a schematic view of an injectable hydrogel system (a) according to the present invention and an example (b) of its manufacturing process.
2 is a graph showing the gelation kinetics at 37 DEG C of a hydrogel formed of 17 wt% PF and GO-COOH, wherein (A) shows a single frequency graph at different GO concentrations, (B) And a frequency sweep graph of the PF & GO-COOH hydrogel composed of the weight% GO-COOH.
Fig. 3 is a graph showing gelation kinetics at 37 캜 of a hydrogel gel composed of 17 wt% DAPF and GO-COOH, wherein (A) is a single frequency graph at different GO concentrations, (B) And a frequency sweep graph of a DAPF & GO-COOH hydrogel composed of% by weight GO-COOH.
Fig. 4 is a graph showing the gelation kinetics at 37 DEG C of hydrogels consisting of 11 wt% of NG and GO-COOH, (A) showing a single frequency graph at different GO concentrations, (B) GO-COOH hydrogels constituted by weight% GO-COOH.
Figure 5 shows the sol-gel transition curves of PF and PF-GO-COOH hydrogels in PBS (GO 0.1 wt%, n = 3).
Figure 6 shows the sol-gel transition curves of DAPF and DAPF-GO-COOH hydrogels in PBS (GO 0.1 wt%, n = 3).
Figure 7 shows the sol-gel transition curves of NG and NG-GO-COOH hydrogels in PBS (GO 0.1 wt%, n = 3).
FIG. 8 shows the results of measurement of the activity of a hydrogel containing 17% by weight of PF and a carboxylated GO in PBS containing 2 mM sodium azide and a hydrogel containing 17% by weight of PF and GO in a 37 [deg.] C, (N = 3). &Lt; / RTI >
Figure 9 is a graph showing the degradation in PBS containing 2 mM sodium azide in a stirred vessel at 37 [deg.] C, 100 rpm according to GO content of 17% by weight PF and carboxylated GO hydrogels (n = 3).
10 is a graph depicting degradation in a stirred incubator at 37 [deg.] C, 100 rpm according to the GO content of hydrogels consisting of 17% by weight DAPF and carboxylated GO in 2 mM sodium azide in PBS (n = 3).
11 is a graph depicting degradation in a stirred incubator at 37 [deg.] C, 100 rpm according to the GO content of hydrogels consisting of 11% by weight NG and carboxylated GO in 2 mM sodium azide in PBS (n = 3).
12 is a graph showing the results of measurement of the activity of a hydrogel (?) Composed of 17% by weight of PF and PF and 0.1% by weight of GO-COOH in PBS containing 2 mM sodium azide at 37 占 폚, 100 rpm Lt; RTI ID = 0.0 > VEGF < / RTI >
13 is a graph showing the results of measurement of the activity of a hydrogel (?) Composed of 17% by weight of DAPF (占) and DAPF and 0.1% by weight of GO-COOH in PBS containing 2 mM sodium azide at 37 占 폚, 100 rpm Lt; RTI ID = 0.0 > VEGF < / RTI >
Fig. 14 is a graph showing the results of measurement of the activity of a hydrogel ()) composed of 11% by weight of NG and a NG (0.1% by weight) GO-COOH (2) in PBS containing 2 mM sodium azide at 37 캜, 100 rpm Lt; RTI ID = 0.0 > VEGF < / RTI >
15 is a graph (n = 3) showing the in vivo decomposition of a hydrogel composed of 17% by weight of PF and 0.1% by weight of GO-COOH.
16 is a graph (n = 3) showing the in vivo decomposition of a hydrogel comprising 17% by weight of DAPF and 0.1% by weight of GO-COOH.
17 is a graph (n = 3) showing in vivo decomposition of a hydrogel composed of 11 wt% NG and 0.1 wt% GO-COOH.
18 are photographs of H & E stained skin obtained after 3 weeks from mice injected with (a) PF, (b) PFGO, (c) DAPF, (d) DAPFGO, (e) NG and (f) NGGO.

본 발명에 따른 수화겔 형성용 조성물은, 1 중량% 이하의 산화그래핀 및 5 중량% 이상의 하기 화학식 1로 표시되는 트리블록 공중합체를 포함한다:The composition for forming a hydrogel according to the present invention comprises 1 wt% or less of graphene oxide and 5 wt% or more of a triblock copolymer represented by the following formula (1)

<화학식 1>&Lt; Formula 1 >

상기 화학식 1의 화합물은 1973년에 어빙 쉬몰카에 의해서 개발된 폴록사머 (poloxamer)로 불리는 화합물로서, 이는 중앙의 소수성 폴리옥시프로필렌 블록과 그 양쪽의 친수성 폴리옥시에틸렌 블록으로 구성된 트리블록 공중합체이다. 이러한 폴록사머는 상품명 "플루로닉 (Pluronic; BASF사)"으로 널리 알려져 있기도 하다. 플루로닉 등을 기반으로 하는 수화겔 형성용 조성물은, 저온에서는 졸 상태를 유지하지만, 온도가 체온 부근까지 상승하면 자가 조립에 의해서 수화겔 상태를 형성한다. 따라서, 단순하게 저온에서 산화그래핀 및 플루로닉을 소정 농도로 교반 혼합시킴으로써 생성될 수 있으며, 겔화는 온도를 체온 부근까지 상승시킴으로써 수행될 수 있다. 그러나, 전술한 바와 같이, 종래 플루로닉 등을 기반으로 한 수화겔 시스템은, 인체의 주사 부위가 밀폐 상태가 아닌 수성 환경에 노출되는 관계로, 주사와 함께 매우 빠른 용해 현상이 발생되는 불안정성의 문제점이 있고, 따라서 빠른 약물 방출 및 열악한 기계적 특성과 같은 문제점들을 안고 있었다.The compound of Formula 1 is a compound called poloxamer developed by Irving Schmalka in 1973, which is a triblock copolymer composed of a hydrophobic polyoxypropylene block at the center and hydrophilic polyoxyethylene blocks at both sides . These poloxamers are also widely known as the trade name "Pluronic (BASF) ". A composition for hydrogel formation based on pluronic, etc., maintains a sol state at low temperatures, but forms a hydrogel state by self-assembly when the temperature rises to near the body temperature. Therefore, it can be produced simply by stirring and mixing oxidized graphene and pluronic at a predetermined concentration at a low temperature, and gelation can be performed by raising the temperature to around the body temperature. However, as described above, the hydrogel system based on the conventional Pluronic and the like has a problem of instability in which the injection region of the human body is exposed to the aqueous environment, And thus had problems such as rapid drug release and poor mechanical properties.

이에, 본 발명에서는, 이와 같은 플루로닉 등을 기반으로 한 수화겔 시스템에 소량의 산화그래핀을 첨가해 줄 경우, 기존 수화겔 시스템에 비해서 인 비트로 및 인 비보 안정성이 현저히 개선된다는 점에 착안하여 본 발명을 완성하게 되었다.Therefore, in the present invention, attention has been paid to the fact that, when a small amount of graphene oxide is added to a hydrogel system based on pluronic or the like, the stability of in vitro and in vivo stability is remarkably improved as compared with a conventional hydrogel system Thereby completing the invention.

본 발명에 있어서, 전체 조성물 중 플루로닉과 산화그래핀의 함량은 각각 전체 조성물 중 5 중량% 이상 및 1 중량% 이하이다. 이는, 본 발명에 따른 조성물이 수화겔을 형성할 수 있는 조성 범위 내에서 안정성 향상이라는 효과를 달성하기 위한 조성 범위로서, 조성물 중 플루로닉의 함량이 5 중량% 미만이거나, 산화그래핀의 함량이 1 중량%를 초과하는 경우에는 원하는 물리적 특성을 갖는 수화겔을 형성할 수 없다는 문제점이 있다.In the present invention, the content of pluronic and oxidized graphene in the total composition is 5 wt% or more and 1 wt% or less, respectively, in the total composition. This is a composition range in which the composition according to the present invention achieves the effect of improving the stability within the composition range capable of forming a hydrogel, wherein the content of the pluronic in the composition is less than 5% by weight or the content of the graphene oxide And if it exceeds 1% by weight, a hydrogel having desired physical properties can not be formed.

본 발명의 조성물에서 첨가되는 산화그래핀의 히드록실기는 카르복실기로 치환될 수 있는데, 하기 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, GO 대신 GO-COOH를 첨가함으로써, 제조되는 수화겔들의 저장탄성률을 개선시킬 수 있다. 이는 GO-COOH의 카르복실기가 수소 결합을 증가시킴으로써 플루로닉과 그래핀 사이의 상호작용을 더욱 촉진시키고, 따라서 GO보다 플루로닉 기반 수화겔의 안정성을 증가시킬 수 있기 때문이다.The hydroxyl group of the oxidized graphene added in the composition of the present invention may be substituted with a carboxyl group. As can be seen from the following examples, the addition of GO-COOH instead of GO improves the storage elastic modulus of the prepared hydrogels . This is because the carboxyl group of GO-COOH promotes the interaction between the pluronic and the graphene by increasing the hydrogen bonding, and thus the stability of the pluronic-based hydrogel than the GO.

한편, 본 발명에서 사용된 플루로닉계 공중합체는, BASF사로부터 플루로닉이라는 상품명으로 판매되는 다양한 공중합체들이 사용될 수 있으며, F127, P105 등과 같은 다양한 공중합체들을 그 예로 들 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 플루로닉 F127은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물이다:On the other hand, the pluronic copolymers used in the present invention may be various copolymers sold by BASF under the trade name of pluronic, and examples thereof include various copolymers such as F127, P105 and the like, It is not. For example, Pluronic F127 is a compound represented by the following formula:

<화학식 2>(2)

한편, 상기 트리블록 공중합체는 하기 화학식 3으로 표시되는 디아크릴화 트리블록 공중합체일 수 있는데:On the other hand, the triblock copolymer may be a diacrylated triblock copolymer represented by the following formula (3)

<화학식 3>(3)

상기 디아크릴화 플루로닉 (DAPF)의 경우 플루로닉 (PF)에 비해서 더욱 소수성을 갖는 관계로, 수화겔의 저장탄성률을 높일 수 있고, 인 비보 및 인 비보 안정성을 더욱 향상시킬 수 있다는 효과가 있다.In the case of the above diacrylated pluronic (DAPF), since the hydrophobicity is more hydrophilic than that of pluronic (PF), the storage elastic modulus of the hydrogel can be increased and the stability of in vivo and in vivo can be further improved .

또 다른 한편으로, 상기 화학식 3으로 표시되는 디아크릴화 트리블록 공중합체는 나노겔 상의 트리블록 공중합체일 수도 있는데, 나노겔 상의 트리블록 공중합체와 관련해서는, 종래 본 발명자들에 의해서 간단한 광-가교결합에 의해서 나노겔 상의 트리블록 공중합체를 제조할 수 있음을 보고한 바 있고 (W. I. Choi, G. Tae, Y. H. Kim, One pot, single phase synthesis of thermo-sensitive nano-carriers by photo-crosslinking of a diacrylated pluronic, J. Mater. Chem., 2008, 18, 2769-2774.), 해당 내용은 전체로서 본 명세서에 통합된다.On the other hand, the diacrylated triblock copolymer represented by the above formula (3) may be a triblock copolymer on the nano gel. With respect to the triblock copolymer on the nano gel, (WI Choi, G. Tae, YH Kim, One pot, single-phase synthesis of thermo-sensitive nano-carriers by photo-crosslinking of a diacrylated pluronic, J. Mater. Chem., 2008, 18, 2769-2774), the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.

특히, 나노겔 상의 트리블록 공중합체 (NG)를 사용하는 경우, NG가 PF 또는 DAPF에 비해서 더 낮은 농도 및 온도에서 겔화가 발생되고, 높은 온도에서도 졸 상태로 변화하지 않는 특성을 갖는데, 이는 나노겔이 화학적으로 가교결합되기 때문으로 판단된다. 또한, 인 비트로 및 인 비보 환경 하에서 더욱 안정성을 나타내는 바, 이러한 NG가 약물 전달체로 사용될 경우, 더욱 우수한 서방형 약물전달체로서 기능할 수 있게 된다.Particularly, when a nano-gel-type triblock copolymer (NG) is used, NG has a characteristic that gelation occurs at a lower concentration and temperature than PF or DAPF and does not change into a sol state at high temperatures, This is because the gel is chemically crosslinked. In addition, it is more stable under in vitro and in vivo conditions, and when such NG is used as a drug delivery system, it can function as a better sustained drug delivery system.

본 발명에 따른 조성물의 제조에 있어서, 산화그래핀 및 플루로닉을 용해시키기 위한 용매로는, 상기 물질들이 용해될 수 있는 용매라면 제한없이 사용가능하며, 예를 들어, 다양한 수용액 즉, 증류수, 완충용액 및 생리 식염수로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매를 사용할 수 있다.In the preparation of the composition according to the present invention, the solvent for dissolving the oxidized graphene and the pluronic may be any solvent which can dissolve the above materials, and may be used, for example, in various aqueous solutions, At least one solvent selected from the group consisting of buffer solutions and physiological saline can be used.

한편, 본 발명에 따른 수화겔 형성용 조성물은 간단한 혼합 공정 및 후속 배양에 의해서 제조될 수 있는 바, 도 1(b)에는 본 발명에 따른 조성물의 제조방법을 개략적으로 도시하였다. 본 발명에 따른 수화겔 형성용 조성물은 다양한 외부 자극에 의해서 용이하게 졸 상태에서 겔 상태로 상 변이를 일으킬 수 있으며, 예를 들어, 이러한 외부 자극으로는 승온, pH 감소 또는 근적외선 조사일 수 있다. 상기 외부 자극에 대한 상세한 서술은 본 발명자들에 의한 관련 특허출원인 대한민국 공개특허공보 제10-2013-0115459호에도 그 내용이 상세히 서술되어 있으며, 해당 내용은 전체로서 본 명세서에 통합된다.Meanwhile, the composition for forming a hydrogel according to the present invention can be prepared by a simple mixing process and a subsequent culture. FIG. 1 (b) schematically shows a process for producing the composition according to the present invention. The composition for forming a hydrogel according to the present invention may easily cause a phase transition from a sol state to a gel state by various external stimuli. For example, the external stimuli may be a temperature increase, a pH decrease or a near infrared ray irradiation. A detailed description of the external stimulus is described in detail in Korean Patent Application No. 10-2013-0115459, which is a related patent application by the inventors of the present invention, the contents of which are incorporated herein by reference in its entirety.

이하, 실시예를 통해서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are intended to assist the understanding of the present invention and should not be construed as limiting the scope of the present invention.

실험재료Experimental material

플루로닉 F127 (PEO100 PPO65 PEO100, MW 12.6kDa)은 바스프사 (Seoul, Korea)로부터 기증받았다. 아크릴로일 클로라이드, 트리에틸에민, 무수 톨루엔, 단염기성 포타슘 포스페이트, 이염기성 소듐 포스페이트, 포타슘 클로라이드, 소듐 클로라이드, 및 소듐 아자이드는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 무수 디에틸 에테르는 Fisher Scientific Inc. (Pittsburgh, PA, USA)으로부터 구입하였다. 4-(2-히드록시에톡시) 페닐-(2-히드록실-2-프로필) 케톤 (Irgaure 2959)은 Ciba Specialty Chemicals Inc. (Basel, Switzerland)으로부터 구입하였다. 단일층 산화그래핀 (X, Y dimension < 500nm)은 Angstrom Materials Inc. (OH, USA)으로부터, 0.5% (w/v) 용액으로 구입하였다. 클로로아세트산 및 소듐 하이드록사이드는 Aldrich (WI, USA)로부터 구입하였다. 투석막 [MWCO 50,000 & 3,500]은 Spectrum Laboratories, Inc. (Houston, TX, USA) 제품을 사용하였다. 0.2 ㎛ 셀룰로오스 멸균 주사기 필터 및 0.8 ㎛ 셀룰로오스 멸균 주사기 필터는 Toyo Roshi Kaisha. Ltd. (Tokyo, Japan)로부터 구입하였다. 0.2 ㎛ 나일론 주사기 필터는 Whatman (Florham Park, New Jersey, USA)으로부터 구입하였다. 인간 혈관 내피 성장 인자 (hVEGF) 및 전개 ELISA 키트는 Pepro Tech (Rocky Hill, NJ, USA)로부터 구입하였다.Pluronic F127 (PEO100 PPO65 PEO100, MW 12.6 kDa) was donated from BASF (Seoul, Korea). Acryloyl chloride, triethylamine, anhydrous toluene, monobasic potassium phosphate, dibasic sodium phosphate, potassium chloride, sodium chloride, and sodium azide were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Anhydrous diethyl ether was purchased from Fisher Scientific Inc. (Pittsburgh, Pa., USA). 4- (2-hydroxyethoxy) phenyl- (2-hydroxyl-2-propyl) ketone (Irgaure 2959) was purchased from Ciba Specialty Chemicals Inc. (Basel, Switzerland). Single layer oxide graphene (X, Y dimension < 500nm) was purchased from Angstrom Materials Inc. (OH, USA) in 0.5% (w / v) solution. Chloroacetic acid and sodium hydroxide were purchased from Aldrich (WI, USA). The dialysis membrane [MWCO 50,000 & 3,500] was purchased from Spectrum Laboratories, Inc. (Houston, TX, USA). A 0.2 占 퐉 cellulose sterilized syringe filter and a 0.8 占 퐉 cellulose sterilized syringe filter were purchased from Toyo Roshi Kaisha. Ltd. (Tokyo, Japan). A 0.2 μm nylon syringe filter was purchased from Whatman (Florham Park, New Jersey, USA). Human vascular endothelial growth factor (hVEGF) and expanded ELISA kits were purchased from Pepro Tech (Rocky Hill, NJ, USA).

디아크릴화Diacrylate 플루로닉의Pluronic 합성 synthesis

디아크릴화 플루로닉 F127 (DA-PF 127)을 종래 보고된 바에 따라서 합성하였다 (W. I. Choi, G. Tae, Y. H. Kim, One pot, single phase synthesis of thermo-sensitive nano-carriers by photo-crosslinking of a diacrylated pluronic, J. Mater. Chem., 2008, 18, 2769-2774.). 요약하면, 5g의 건조 플루로닉 F127을, 100 mL 무수 톨루엔 중에서 10 몰 과량의 트리에틸아민 및 아크릴로일 클로라이드와, 아르곤 분위기 하에서 교반하며 17시간 이상 반응시켰다. 얻어진 산물을 얼음물 중탕 중에서 무수 디에틸 에테르로 침전시켰으며, 여과하고, 수일 동안 진공 하에서 건조하였다. 프로필렌 옥사이드 유닛 중의 아크릴 양성자 (=CH₂, 5.7-6.4 ppm)와 메틸 양성자 (-CH₃, 1.1ppm)를, 40MHz ¹H-NMR 스펙트로스코피 (D₂O, JNM-ECX-400P, JEOL, Japan)에서 비교함으로써 결정된 플루로닉의 아크릴화 정도는 98% 이상이었다.(DA-PF 127) was synthesized as previously reported (WI Choi, G. Tae, YH Kim, One Pot, Synthesis of Thermo-Sensitive Nano-Carriers by Photo-crosslinking of a diacrylated pluronic, J. Mater. Chem., 2008, 18, 2769-2774.). Briefly, 5 g of dried pluronic F127 was reacted with 10 molar excess of triethylamine and acryloyl chloride in 100 mL of anhydrous toluene for at least 17 hours with stirring under an argon atmosphere. The resulting product was precipitated with anhydrous diethyl ether in an ice water bath, filtered and dried under vacuum for several days. Acryl protons (= CH ₂ , 5.7-6.4 ppm) and methyl protons (-CH ₃ , 1.1 ppm) in the propylene oxide unit were analyzed by 40 MHz ¹ H-NMR spectroscopy (D ₂ O, JNM-ECX-400P, JEOL, Japan ), The degree of acrylation of the pluronic was more than 98%.

플루로닉계Pluronic system 나노겔의Nano-gel 제조 Produce

플루로닉계 나노겔의 제조는 종래 본 발명자들에 의해서 보고된 바와 같이 간단한 광-가교결합에 의해서 수행하였다 (W. I. Choi, G. Tae, Y. H. Kim, One pot, single phase synthesis of thermo-sensitive nano-carriers by photo-crosslinking of a diacrylated pluronic, J. Mater. Chem., 2008, 18, 2769-2774.). 요약하면, 디아크릴화 플루로닉 (DA-PF127)을 10 중량%로 DIW에 용해시키고, 0.2 ㎛ 셀룰로오스 아세테이트 멸균 주사기 필터를 통해서 여과시켰다. 상기 용액을 DIW로 희석하여 0.77 중량%의 디아크릴화 플루로닉을 제조하였다. 광개시제 Irgacure 2959는 70%(v/v) 에탄올 및 DIW에 용해시킨 후, 얻어진 용액을 0.2 ㎛ 나일론 필터를 통하여 여과시키고, 이어서 희석된 DA-PF127 용액에 첨가하여 0.05 중량% 광개시제 농도를 얻었다. 다음으로, 상기 용액을 미여과 UV 램프를 사용하여, 15분 동안 1.3mWcm^-2의 강도로 UV-조사하였다 (VL-4.LC, 8W, Vilber Lourmat, France). 마지막으로, 미반응된 전구체를 투석 백 (MWCO 50,000)을 사용하여 하루 동안 투석시킴으로써 제거하였다 (MWCO 50,000).The preparation of pluronic based nanogels was performed by simple photo-crosslinking as reported by the present inventors (WI Choi, G. Tae, YH Kim, One pot, single phase synthesis of thermo-sensitive nano- photo-crosslinking of a diacrylated pluronic, J. Mater. Chem., 2008, 18, 2769-2774.). Briefly, diacrylated pluronic (DA-PF127) was dissolved in DIW at 10% by weight and filtered through a 0.2 [mu] m cellulose acetate sterile syringe filter. The solution was diluted with DIW to produce 0.77 wt% diacrylated pluronic. The photoinitiator Irgacure 2959 was dissolved in 70% (v / v) ethanol and DIW and the resulting solution was then filtered through a 0.2 탆 nylon filter and then added to the diluted DA-PF127 solution to obtain a 0.05 wt% photoinitiator concentration. Next, the solution was UV-irradiated (UV-4. LC, 8 W, Vilber Lourmat, France) at an intensity of 1.3 mW cm ^-2 for 15 minutes using an unfilter UV lamp. Finally, unreacted precursors were removed by dialysis overnight (MWCO 50,000) using a dialysis bag (MWCO 50,000).

카르복실화된Carboxylated 그래핀Grapina 옥사이드의Oxide 제조 ( Produce ( GOGO -- COOHCOOH ))

카르복실화된 GO 시트의 현탁액을, 종래 Zhang 등에 의해서 보고된 방법 (W. Zhang, Z. Guo, D. Huang, Z. Liu, X. Guo, H. Zhong, Synergistic effect of chemo-photothermal therapy using PEGlyated graphene oxide, Biomaterials, 2011, 32, 8555-8561.)으로 화학적 처리 및 초음파 처리를 통하여 제조하였다. GO (0.5 w/v%)를 DIW 중에 분산시켜서 0.1w/v%로 만들고, 클로로아세트산 (150mg) 및 소듐 하이드록사이드 (200mg)를 GO 용액에 첨가하였다. 용액을 밤새도록 45℃에서 교반하였다. 이어서, 750W, 30% 강도의 초음파 프로브 (Vibra-cell VCX 500, Sonics & Materials Inc., Newtown, CT, USA)를 사용하여 2시간 동안 초음파 처리하였다. 용액을 증류수에 대해서 수일 동안 투석 (투석 백 MWCO 3,500)시킴으로써 중화시켰다. 투석 이후에, 현탁액을 30분 동안 초음파처리하고, 0.8 ㎛ 셀룰로오스 아세테이트화 필터를 통하여 여과시켰다. 카르복실화된 GO의 크기는 전기영동 광산란 스펙트로미터를 사용하여 분석하였다 (632.8 nm, ELS-8000, Otsuka Electronics Co., Japan).A suspension of the carboxylated GO sheet was prepared by the method reported by Zhang et al. (W. Zhang, Z. Guo, D. Huang, Z. Liu, X. Guo, H. Zhong, Synergistic effect of chemo-photothermal therapy using PEGylated graphene oxide, Biomaterials, 2011, 32, 8555-8561.) Were prepared by chemical treatment and ultrasonic treatment. GO (0.5 w / v%) was dispersed in DIW to 0.1 w / v%, and chloroacetic acid (150 mg) and sodium hydroxide (200 mg) were added to the GO solution. The solution was stirred overnight at 45 < 0 > C. Then, ultrasonic treatment was performed for 2 hours using a 750 W, 30% strength ultrasonic probe (Vibra-cell VCX 500, Sonics & Materials Inc., Newtown, CT, USA). The solution was neutralized by dialysis against distilled water for several days (dialysis bag MWCO 3,500). After dialysis, the suspension was sonicated for 30 minutes and filtered through a 0.8 [mu] m cellulose acetate filtration. The size of the carboxylated GO was analyzed using an electrophoretic light scattering spectrometer (632.8 nm, ELS-8000, Otsuka Electronics Co., Japan).

주사가능한 Injectable 수화겔의Hydrated 졸 상태 제조 Sol state manufacturing

PF 127, DA-PF, 또는 나노겔을, 교반 후 4℃에서 48시간 동안 회전 교반기를 사용하여 GO-COOH 용액 중에서 용해시킴으로써 3가지 종류의 수화겔들을 제조하였다. PF 127 또는 DA-PF의 최종 농도는 17 중량%였으며, 나노겔의 최종 농도는 11 중량%였다. 3가지 다른 종류의 GO-COOH 농도들을 사용하였다: 0.04, 0.08, 및 0.1 중량%.Three types of hydrogels were prepared by dissolving PF 127, DA-PF, or nanogel in GO-COOH solution using a rotating stirrer at 4 캜 for 48 hours after stirring. The final concentration of PF 127 or DA-PF was 17 wt% and the final concentration of the nanogel was 11 wt%. Three different types of GO-COOH concentrations were used: 0.04, 0.08, and 0.1 wt%.

유동학적Rheology 특성의 측정 Measurement of characteristics

다양한 수화겔들의 유동학적 특성들을, 15 mm 직경의 평행판 기하학 및 조처리면 (roughened surface)을 갖는 유동계 (rheometer)를 사용하여 측정하였다 (Gemini, Malvern Instruments, Malvern, Worcestershire, UK). 간격 크기는 0.45 ㎛에 셋팅되었으며, 샘플 부피는 100 ㎕였다. 플레이트의 온도를 4℃로 낮추고, 이어서 겔화 동역학을 37℃에서 측정하였다. 겔화 동역학을 얻기 위해서, 다른 GO 농도들로, 36분 동안 단일 주파수 1 rad/s를 사용하였으며, 다음으로 37℃에서 일정한 전단 변형율 (shear strain) 0.1%로 0.1 내지 100 rad/s의 주파수 스윕을 수행하였다.The rheological properties of the various hydrogels were determined using a rheometer with a parallel plate geometry of 15 mm diameter and a roughened surface (Gemini, Malvern Instruments, Malvern, Worcestershire, UK). The gap size was set to 0.45 mu m and the sample volume was 100 mu l. The temperature of the plate was lowered to 4 ° C, and then the gelation kinetics were measured at 37 ° C. To obtain the gelation kinetics, a single frequency of 1 rad / s was used for 36 minutes at different GO concentrations followed by a frequency sweep of 0.1-100 rad / s at a constant shear strain of 0.1% at 37 ° C Respectively.

졸-겔 전이 상 다이어그램Sol-gel transition diagram

바이알-기울임 방법에 의해서 다양한 GO-COOH 함유 수화겔들의 졸-겔 전이 상 다이어그램을 작성하였다. PBS 용액 중의 각 샘플들을 1.5 mL 튜브에서 제조하였으며, 샘플들을 물 중탕에 넣었다. 온도는 4℃에서 시작하여 점차적으로 3℃씩 증가시켰다. 겔 포인트의 온도는, 테스트 튜브를 1분 동안 뒤집어서 유동성이 관찰되지 않는 시점으로 결정하였다. GO의 농도는 0.1 중량%로 셋팅하였다. (n=3)A sol-gel transition diagram of various GO-COOH-containing hydrogels was prepared by vial-tilt method. Each sample in the PBS solution was prepared in a 1.5 mL tube, and the samples were placed in a water bath. The temperature started at 4 ° C and gradually increased by 3 ° C. The gel point temperature was determined by reversing the test tube for one minute to a point where no flowability was observed. The concentration of GO was set to 0.1% by weight. (n = 3)

수화겔의Hydrated 인 비트로 분해율 In bit degradation rate

다양한 수화겔들의 안정성을 분석하기 위해서, 수화겔들의 분해율을 측정하였다. 플루로닉 (PF) 자체, PF-GO, PF-GO-COOH, DA-PF 자체, DAPF-GO-COOH, 나노겔 (NG) 자체, 또는 NG-GO-COOH 수화겔을 15 ml 튜브의 바닥에 위치시켰다. 각 ㅅ수화겔의 부피는 200 ㎕였다. 겔화 이후에, 5ml의 방출 완충용액 (release buffer) (2 mM% 소듐 아자이드를 포함하는 PBS)을 15ml 튜브에 첨가하였다. 샘플들을 37 ℃, 1000 rpm의 교반 배양기 내에 보관하였다 (SI-600R, Lab. Companion, JEIO TECH, city, Korea). 전체 방출 완충용액을 매회 신선한 것으로 대체하였으며, 매회 수화겔의 잔류 부피를 측정하였다 (n=3).To analyze the stability of various hydrogels, hydrolysis rates of hydrogels were measured. PF-GO, PF-GO-COOH, DA-PF itself, DAPF-GO-COOH, Nanogel (NG) itself or NG-GO-COOH hydrogel are placed on the bottom of a 15 ml tube Respectively. The volume of each hydrogel was 200 μl. After gelation, 5 ml of release buffer (PBS containing 2 mM% sodium azide) was added to the 15 ml tube. The samples were stored in a stirred incubator (SI-600R, Lab. Companion, JEIO TECH, city, Korea) at 37 ° C and 1000 rpm. The total release buffer solution was replaced with fresh one time each time, and the residual volume of the hydrogel was measured (n = 3).

인 비트로 In bito VEGFVEGF 방출 실험 Emission experiment

다양한 수화겔들로부터의 VEGF 방출 속도를 측정하기 위해서, VEGF 용액을 제조하였다. VEGF가 로딩된 다양한 수화겔들을 제조하기 위해서, 동결건조된 플루로닉, 디아크릴화된 플루로닉, 또는 플루로닉계 나노겔을 VEGF 용액에 첨가하고, 회전 교반기를 사용하여 4 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 이어서, 산화그래핀 (GO)을 첨가하였고, 4 ℃ 교반 하에서 24 시간 동안 배양하였다. 플루로닉 또는 디아크릴화된 플루로닉의 최종 농도는 17 중량%, 나노겔은 11 중량%, 첨가된 GO는 0.1 중량%였다. VEGF가 로딩된 수화겔들은 15ml 튜브의 바닥에서 제조되었으며, 2 mM 소듐 아자이드를 포함하는 5ml의 PBS 및 BSA를 첨가하고, 37℃, 100 rpm에서 교반 배양기 중에 넣어 두었다. 전체 방출 배지는 매회 시점 마다 신선한 것으로 대체하였다. 방출된 VEGF의 양은 전개 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다.To determine the rate of VEGF release from various hydrogels, a VEGF solution was prepared. To prepare the various hydrogels loaded with VEGF, lyophilized pluronic, diacrylated pluronic, or pluronic based nanogels were added to the VEGF solution and cultured for 24 hours at 4 DEG C using a rotating stirrer Respectively. Then, graphene oxide (GO) was added and incubated for 24 hours under stirring at 4 캜. The final concentration of pluronic or diacrylated pluronic was 17 wt%, the nanogels 11 wt%, and the GO added 0.1 wt%. VEGF loaded hydrogels were prepared at the bottom of a 15 ml tube and 5 ml of PBS and BSA containing 2 mM sodium azide was added and placed in a stirred incubator at 37 ° C and 100 rpm. The total release medium was replaced with fresh one at each time point. The amount of released VEGF was measured using an expanded ELISA kit.

인 비보 동물 실험In vivo animal experiments

수컷 BALB/c 마우스 (8 주령)를 사용하여 다양한 수화겔들의 인 비보 안정성 및 생체 적합성을 조사하였다. 모든 동물들은 Orient Bio Inc. (Seoul, Korea)으로부터 구입하였고, 광주과학기술원 (GIST)의 동물 보호 및 사용 위원회의 지침에 따라서 취급하였다. 수화겔들은 온도를 4 ℃로 낮춤으로써 졸 상태에서 제조되었으며, 22G 바늘을 구비한 주사기를 사용하여 마우스의 등에 피하주사하였다. 주사된 수화겔들의 인 비보 안정성을 조사하기 위해서, 주사된 수화겔들의 크기를 미리 정해진 시간대에서 모니터링하였다: 1일, 1주, 2주, 4주 및 8주.Male BALB / c mice (8 weeks old) were used to investigate in vivo stability and biocompatibility of various hydrogels. All animals were purchased from Orient Bio Inc. (Seoul, Korea) and were handled according to the guidelines of the Animal Care and Use Committee of GIST (GIST). The hydrogels were prepared in a sol state by lowering the temperature to 4 ° C and injected subcutaneously into the mice using a syringe with a 22G needle. To investigate the in vivo stability of the injected hydrogels, the size of the injected hydrogels was monitored at predetermined time points: 1 day, 1 week, 2 weeks, 4 weeks and 8 weeks.

생체 적합성을 분석하기 위해서, 조직면역학적 염색을 수행하였다. 동물들을 희생시킨 후, 주사된 겔들을 포함하는 피부 부위를 절개하였다. 상기 피부들을 10% 포르말린 중에서 고정시키고, 알콜 중에서 탈수시킨 다음, 파라핀에 침지시켰다. 상기 파라핀을 박편제작기를 사용하여 5 ㎛ 두께로 단편화하였고, 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색을 수행하였다. 염색된 단편들의 사진을 광학 현미경을 사용하여 관찰하였다.To analyze biocompatibility, tissue immunological staining was performed. After animals were sacrificed, the skin area containing the injected gels was incised. The skin was fixed in 10% formalin, dehydrated in alcohol, and then immersed in paraffin. The paraffin was fragmented to a thickness of 5 [mu] m using a flake-making machine and hematoxylin and eosin (H & E) staining was performed. Photographs of the stained fragments were observed using an optical microscope.

실험 결과Experiment result

1. 수화겔의 기계적 특성들에 대한 GO의 효과1. Effect of GO on mechanical properties of hydrogels

수화겔들은 PBS 중에서 17 중량% 플루로닉 (PF), 디아크릴화된 플루로닉 (DAPF) 및 11 중량% 플루로닉계 나노겔 (NG)로 제조되었다. 수화겔들의 겔화 동역학 및 저장탄성률 (storage moduli)은 유동계를 사용하여 얻었다. 졸 상태로서의 수화겔들을 4 ℃에서 평행판 기하 홀더 상에 로딩하였다. 이어서, 온도를 37 ℃로 증가시킴으로써 즉각적인 겔화를 달성하였다. 플루로닉 분자들은 CMT 및 CMC 이상에서는 미셀로 존재하며, 높은 농도에서는 미셀 팩킹에 의해서 물리적인 겔 상태를 형성할 수 있다. DAPF의 경우에는, 겔화 과정이 PF의 경우와 유사하여야 한다. 그러나, DAPF의 저장탄성률은 PF보다 약간 높았는데, 이는 아마도 PF에 비해서 DAPF가 더욱 소수성이기 때문일 것이다 (도 3). NG의 경우에는 (도 4), PF 또는 DAPF (17 중량%)보다 낮은 농도 (11 중량%)에서, 저장율이 DAPF 수화겔과 유사하였다. NG의 화학적으로 가교결합된 염기성 구조 유닛의 크기는 37 ℃에서 ~ 60nm였으며, 이는 PF의 미셀 크기 (~20nm)보다 더 큰 것이며, NG는 PF 미셀보다 훨씬 더 낮은 농도에서 졸-겔 전이를 나타내었고, 이는 하기에서 더욱 상세하게 서술하기로 한다.Hydrogels were prepared with 17 wt% pluronic (PF), diacrylated pluronic (DAPF) and 11 wt% pluronic system nano gel (NG) in PBS. The gelation kinetics and storage moduli of hydrogels were obtained using a flow meter. Hydrogels as sol states were loaded onto a parallel plate geometry holder at 4 < 0 > C. Subsequently, immediate gelation was achieved by increasing the temperature to < RTI ID = 0.0 > 37 C. < / RTI > Pluronic molecules are present as micelles in CMT and CMC and can form a physical gel state by micellar packing at high concentration. In the case of DAPF, the gelation process should be similar to that of PF. However, the storage modulus of DAPF was slightly higher than PF, probably because DAPF is more hydrophobic than PF (FIG. 3). In the case of NG (FIG. 4), the storage rate was similar to the DAPF hydrogel at a lower concentration (11% by weight) than PF or DAPF (17% by weight). The size of the chemically cross-linked basic structural unit of NG was ~ 60 nm at 37 ° C, which is larger than the micelle size (~ 20 nm) of PF and NG shows sol-gel transition at a much lower concentration than PF micelle , Which will be described in more detail below.

GO-COOH를 첨가함으로써, 모든 수화겔들의 저장탄성률은 개선되었다. 또한, 동일한 폴리머 농도에서, 수화겔들의 저장탄성률은 GO-COOH의 농도를 0.04 중량%로부터 0.1 중량% (도 2, 3, 4)로 증가시킴에 따라서 증가하였다. 따라서, GO-COOH의 첨가는 모든 수화겔들의 기계적 특성들을 향상시키는데 효과적이었으며, 이는 아마도 첨가된 GO-COOH에 의해서 효과적인 물리적 가교결합들이 생성됨에 기인한 것으로 보인다. 전술한 바와 같이, 나노 GO 시트들은 플루로닉과 강하게 상호작용하는데, 이는 소수성 상호작용 및 수소 결합에 의해서 달성된다. 소수성 상호작용의 기여도는 상대적으로 더욱 소수성인 플루로닉 P105 또는 F127은 GO와 강한 상호작용을 하는데 반해서, 상대적으로 덜 소수성인 플루로닉 PF68은 GO와 강한 상호작용을 하지 않는다는 사실로부터 뒷받침될 수 있다. 수소 결합의 기여도는 이러한 상호작용이 pH 및 GO의 산소화도에 의존한다는 사실로부터 확인할 수 있다. 따라서, GO-COOH의 카르복실기는 수소 결합을 증가시킴으로써 플루로닉과 그래핀 사이의 상호작용을 더욱 촉진할 수 있다. 실제로, 도 8에 도시된 바와 같이, GO-COOH는 GO보다 PF 수화겔의 안정성을 현저하게 증가시킬 수 있다. 그러므로, 다른 모든 실험들에서는 GO 대신에 GO-COOH가 사용되었다.By adding GO-COOH, the storage elastic modulus of all hydrogels was improved. Also, at the same polymer concentration, the storage modulus of the hydrogels increased as the concentration of GO-COOH was increased from 0.04 wt% to 0.1 wt% (Figs. 2, 3, 4). Thus, the addition of GO-COOH was effective in improving the mechanical properties of all hydrogels, probably due to the formation of effective physical crosslinks by the added GO-COOH. As described above, nano GO sheets strongly interact with the pluronic, which is achieved by hydrophobic interaction and hydrogen bonding. The contribution of the hydrophobic interaction may be supported by the fact that relatively more hydrophobic pluronic P105 or F127 strongly interacts with the GO whereas the relatively less hydrophobic pluronic PF68 does not interact strongly with the GO have. The contribution of hydrogen bonds can be seen from the fact that this interaction depends on the pH and degree of oxygenation of the GO. Therefore, the carboxyl group of GO-COOH can further promote the interaction between pluronic and graphene by increasing hydrogen bonding. In fact, as shown in FIG. 8, GO-COOH can significantly increase the stability of PF hydrogels over GO. Therefore, GO-COOH was used instead of GO in all other experiments.

다양한 수화겔들이 거의 주파수에 무관한 저장탄성률을 나타낸다는 사실로부터도 안정한 겔이 형성되었음을 확인할 수 있다. 모든 주파수들에서, 복합체 수화겔의 저장탄성률은 GO-COOH를 갖지 않는 플루로닉계 수화겔들의 저장탄성률보다 더 높았다.The fact that various hydrogels exhibit almost frequency-independent storage moduli shows that a stable gel is formed. At all frequencies, the storage modulus of the conjugate hydrogel was higher than the storage modulus of the pluronic hydrogel without GO-COOH.

졸-겔 전이 상 다이어그램Sol-gel transition diagram

미셀 또는 나노겔 팩킹에 의해서, PF, DAPF 및 NG는 열-가역성 졸-겔 상 전이 현상을 나타낸다. 이러한 졸-겔 전이의 상 경계에 GO-COOH의 첨가가 미치는 영향을 분석하였다. 수화겔들의 졸 상태는 0.1 중량%의 GO-COOH를 포함하는 PBS 완충용액 중에서 제조되었다. 졸-겔 전이는 3 ℃ 간격의 온도 증가로, 바이알 경사 방법 (vial tilting method)에 의해서 모니터링하였다. PF 및 DAPF의 경우, 고정된 농도의 플루로닉에서, 온도를 증가시킴으로써 졸-to-겔 전이를 나타내는 상 경계가 GO-COOH를 첨가하더라도 유의미하게 변화하지 않았다. 반면에, 온도를 더욱 증가시킴으로써 겔-to-졸 전이를 나타내는 상 경계는 GO-COOH를 첨가함으로써 사라졌다 (도 4, 5). GO-COOH의 효과는 유동계 결과에서 관찰되었지만, GO-COOH로 인한 PF 및 DAPF의 더 낮은 상 경계는 유의미한 차이를 나타내지 않았다. 그러나, GO-COOH를 첨가함으로써, 겔이 더 낮은 농도에서 형성되었으며 (13 중량%), GO-COOH를 포함하지 않는 겔은 동일한 농도에서 형성되지 않았다. 또한, 가장 큰 차이점은, GO-COOH 포함 수화겔들에서는 상단 상 경계가 관찰되지 않는다는 점이었다. 겔-to-졸 전이는 온도가 증가함에 따라서 PEO 사슬을 단축시켜 야기되는 것이며, 이어서 미셀 팩킹이 느슨해진다. GO-COOH는 수화겔 네트워크 중에서 미셀 분자들과 강하게 상호작용할 수 있으며, 따라서 GO-COOH가 미셀 팩킹의 분해를 방지할 수 있다. 미셀 팩킹이 고온에서 유지되며, 수화겔은 졸 상태가 되지 않는다.By micellar or nano gel packing, PF, DAPF and NG show thermo-reversible sol-gel phase transition phenomena. The effect of addition of GO-COOH on the phase boundary of sol-gel transition was analyzed. The sol state of the hydrogels was prepared in PBS buffer containing 0.1% by weight GO-COOH. The sol-gel transition was monitored by a vial tilting method at a temperature increase of 3 DEG C intervals. In the case of PF and DAPF, the phase boundary showing the sol-to-gel transition by increasing the temperature at a fixed concentration of pluronic did not change significantly even when GO-COOH was added. On the other hand, by further increasing the temperature, the phase boundary showing the gel-to-sol transition disappeared by the addition of GO-COOH (Figs. 4 and 5). The effect of GO-COOH was observed in the flow system, but the lower phase boundaries of PF and DAPF due to GO-COOH did not show a significant difference. However, by adding GO-COOH, the gel was formed at a lower concentration (13 wt%) and no gel containing GO-COOH was formed at the same concentration. In addition, the major difference was that the upper phase boundary was not observed in GO-COOH-containing hydrogels. The gel-to-sol transition is caused by shortening the PEO chain as the temperature increases, and then micelle packing is loosened. GO-COOH can strongly interact with the micellar molecules in the hydrogel network, thus GO-COOH can prevent degradation of micellar packing. The micelle packing is maintained at a high temperature, and the hydrogel does not become a sol state.

그러나, 나노겔의 경우에는, PF 또는 DAPF에 비해서 더 낮은 농도 및 온도에서 겔화가 발생되었다. 게다가, NG 수화겔은 심지어 높은 온도에서도 졸 상태로 변화하지 않았는데, 이는 나노겔이 화학적으로 가교결합되기 때문이다. 나노겔은 서로 상호작용하며, 따라서 팩킹이 느슨해지지 않는다. GO-COOH를 첨가함으로써, 고정된 농도에서 하부 상 경계가 GO-COOH를 포함하지 않는 경우에 비해서 더 낮아졌으며, 졸 상태가 더 낮은 농도에서 겔 상태로 변화되었다 (도 7). 실험 결과로부터, GO-COOH를 첨가함으로써, GO-COOH와 나노겔 사이의 상호작용으로 인하여 겔화가 더 가속되었다. GO-COOH는 미셀 팩킹의 안정화에 관여하고, 이어서 네트워크의 상호작용이 증가하였다. 따라서, 구조적 안정화가 임계 겔화 농도 및 온도를 낮춘 것으로 판단된다.However, in the case of nanogels, gelation occurred at lower concentrations and temperatures than PF or DAPF. In addition, the NG hydrogel did not change to a sol state even at high temperatures, because the nanogels are chemically cross-linked. The nanogels interact with each other, and therefore the packing is not loosened. By adding GO-COOH, the lower phase boundary at the fixed concentration was lower than when the GO-COOH was not contained, and the sol state was changed from a lower concentration to a gel state (Fig. 7). From the experimental results, the addition of GO-COOH further accelerated the gelation due to the interaction between GO-COOH and the nanogel. GO-COOH was involved in the stabilization of micellar packing, followed by an increase in network interaction. Thus, it is judged that the structural stabilization has lowered the critical gelling concentration and temperature.

다양한 variety 수화겔들의Hydrogels 인 비트로 분해율 In bit degradation rate

플루로닉계 수화겔들의 안정성에 대한 GO-COOH 첨가가 미치는 영향을 분석하기 위해서, 37 ℃ 교반 조건 하에서 수화겔들의 인 비트로 분해율을 분석하였다. 과량 완충용액 중의 수화겔의 잔류 부피를 확인하였으며, 매일 완충용액을 신선한 완충용액으로 교환하였다. 예상한 바와 같이, GO가 없는 경우, 모든 물리적 겔들이 과량의 물 환경 중에서 빠르게 분해되었다; PF 및 DAPF 겔들은 하루 이내에 분해되었으며, NG 겔은 7일 이내에 분해되었다. NG는 화학적으로 가교결합된 상태로 존재하기 때문에, 응집된 NG 겔은 PF 또는 DAPF에 비해서 더 느린 분해 속도를 나타내었다.In order to analyze the effect of GO-COOH addition on the stability of pluronic hydrogels, the degradation rate of hydrogels in vitro was analyzed under agitation conditions at 37 ° C. The residual volume of the hydrogels in the excess buffer solution was determined and the buffer solution was replaced with fresh buffer solution daily. As expected, in the absence of GO, all physical gels were rapidly degraded in excess of the water environment; PF and DAPF gels were degraded within one day and NG gels were degraded within 7 days. Since NG was present in a chemically crosslinked state, the coagulated NG gel showed a slower degradation rate than PF or DAPF.

GO-COOH를 첨가함으로써, 수화겔들의 안정성이 모든 경우에서 현저하게 향상되었다. 먼저, 0.1 중량%의 GO 또는 GO-COOH를 포함하는 17 중량%의 PF 수화겔의 분해 속도를 개선시키는 면에서, 카르복실화된 GO (GO-COOH) 및 보통의 GO 사이의 차이점을 분석하였다 (도 8). GO-COOH는 염기성 조건 하에서 클로로아세트산 (ClCH₂COOH)과 반응시킴으로써 제조하였으며, 이는 GO (-OH)의 히드록실기를 카르복실기 (-COOH)로 변화시킨다. PF 수화겔의 안정성 향상 면에서, GO-COOH와 GO의 차이는 상당하였다; GO의 경우 거의 모든 겔들이 5일 내에 분해되었지만, GO-COOH의 경우 동일한 시간 동안 40% 이상의 수화겔이 유지되었다. 이러한 큰 차이는 GO-COOH가 제공할 수 있는 더욱 증가된 수소 결합과, 음전하의 증가로 인해서 생리적 완충용액 중에서 GO-COOH가 더욱 우수한 분산성을 나타낸다는 점에 기인하는 것이며, 따라서 GO에 비해서 수화겔 중에서 더욱 균일한 분포를 제공하는 것이다. 따라서, 모든 다른 실험들에서는 GO 대신에 GO-COOH를 사용하였다.By adding GO-COOH, the stability of the hydrogels improved significantly in all cases. First, the difference between the carboxylated GO (GO-COOH) and the normal GO was analyzed in terms of improving the rate of degradation of the 17 wt% PF hydrogel containing 0.1 wt% GO or GO-COOH 8). GO-COOH is prepared by reacting with chloroacetic acid (ClCH ₂ COOH) under basic conditions, which changes the hydroxyl group of GO (-OH) to the carboxyl group (-COOH). In terms of improving the stability of PF hydrogels, the difference between GO-COOH and GO was significant; In the case of GO, almost all the gels were degraded within 5 days, but in case of GO-COOH, more than 40% of hydrogels were retained for the same time. This large difference is due to the fact that GO-COOH shows even better dispersibility in physiological buffer solutions due to the increased hydrogen bonding that can be provided by GO-COOH and the increase in negative charge. Therefore, To provide a more uniform distribution. Therefore, GO-COOH was used instead of GO in all other experiments.

GO-COOH를 함유하는 수화겔들의 안정성을, GO-COOH의 농도를 증가시킴으로써 평가하였다. PF 수화겔의 경우, 분해 속도는 심지어 0.04 중량%의 GO-COOH 농도에서도 현저하게 감소하였으며, 이를 0.08 중량%로 증가시킴으로써 더욱 현저한 감소가 관찰되었다. 0.08 중량% GO-COOH에서 분해 속도는 3일째까지는 0.1 중량%의 분해 속도와 유사하였지만, 4일 이후에는 뚜렷한 차이가 관찰되었다 (도 9). 그러므로, 0.1 중량%의 GO-COOH를 포함하는 PF 겔의 경우 완전 분해에 15일 이상이 소요되었지만, PF 겔 자체는 1일 이내에 완전히 분해되었다. 유사하게, DAPF 겔 및 NG 겔의 분해 속도는 농도 의존적 방식으로 GO-COOH를 첨가함으로써 크게 감소하였다 (도 10, 11). DAPF 겔은, DAPF 겔이 약간 높은 탄성 저장률을 가짐에 따라서, PF 겔보다 약간 더 느리게 분해되었다 (도 2, 3). 전반적으로, 플루로닉계 수화겔들의 분해 속도는 GO-COOH의 함량에 의해서 증가된 탄성저장률에 따라서, GO-COOH의 함량에 의해서 체계적으로 조절될 수 있다 (도 2, 3, 4).The stability of hydrogels containing GO-COOH was evaluated by increasing the concentration of GO-COOH. In the case of PF hydrogels, the rate of degradation was significantly reduced even at a GO-COOH concentration of 0.04% by weight, and a further significant reduction was observed by increasing it to 0.08% by weight. The degradation rate at 0.08 wt.% GO-COOH was similar to the degradation rate at 0.1 wt.% Up to the third day, but a distinct difference was observed after 4 days (FIG. 9). Therefore, the PF gel containing 0.1 wt% GO-COOH took more than 15 days to complete decomposition, but the PF gel itself was completely decomposed within one day. Similarly, the rates of degradation of DAPF gels and NG gels were greatly reduced by the addition of GO-COOH in a concentration dependent manner (FIGS. 10, 11). The DAPF gels were degraded slightly more slowly than the PF gels as the DAPF gels had slightly higher elasticity retention (FIGS. 2 and 3). Overall, the rate of degradation of pluronic hydrogels can be systematically controlled by the content of GO-COOH, depending on the elasticity storage rate increased by the content of GO-COOH (Figures 2, 3 and 4).

GO-COOH를 플루로닉계 수화겔에 첨가함으로써, 기계적 특성들이 개선되고, 더 낮은 농도에서 졸-to-겔 전이가 발생되었으며, 고정된 농도에서 온도를 증가시킴으로써 발생되는 겔-to-졸 전이가 발생되지 않았다. 그러나, 이러한 변화들은 그다지 두드러진 정도는 아니었다. 이와는 대조적으로, 소량의 GO-COOH를 첨가함으로써, 개방 환경 중에서 물리적 수화겔들의 안정성이 현저하게 향상되었는 바, 이는 본 발명의 주사가능한 수화겔 시스템을 인 비보와 같은 개방 환경에서, 주사 부위에서 실용적으로 유용한 잔류 시간을 갖도록 적용할 수 있는 가능성을 암시한다.The addition of GO-COOH to the pluronic hydrogel improves mechanical properties, generates sol-to-gel transition at lower concentrations, and causes gel-to-sol transition generated by increasing temperature at a fixed concentration It was not. However, these changes were not so prominent. In contrast, the addition of small amounts of GO-COOH significantly improves the stability of the physical hydrogels in an open environment, which makes the injectable hydrogel systems of the present invention more useful in an open environment, such as in vivo, Suggesting the possibility of applying it to have a residual time.

다양한 variety 수화겔들로부터From hydrogels 인 비트로 In bito VEGFVEGF 방출 Release

다양한 수화겔들로부터의 VEGF 방출 프로파일을 도 12, 13, 14에 도시하였다. 도 12는 GO-COOH를 함유하는 PF 수화겔들이 PF 수화겔들에 비해서 더욱 느리게 VEGF를 방출하는 것을 보여주는 도면이다. PF로부터의 VEGF는 하루 내에 거의 방출되었다. VEGF의 분해 속도 및 방출 속도는 PF에 대해서 거의 동일하였다; PF 수화겔은 하루 이내에 분해된 반면에, GO-COOH를 함유하는 PF는 매우 느리게 분해되었다. DAPF의 경우에는, 그 결과가 PF의 결과와 유사하였다. 하루 이내에 DAPF 수화겔로부터 VEGF의 완전한 방출이 이루어진 반면에, GO-COOH를 함유하는 DAPF로부터의 VEGF는 DAPF 수화겔에 비해서 더욱 지속적인 방출을 나타내었다. NG의 경우, NG로부터 VEGF의 방출은 PF 또는 DAPF로부터의 방출에 비해서 더욱 지속적이었는데, 이는 NG가 화학적인 가교결합을 보유하기 때문이다. 이러한 결과는 수화겔의 분해 속도와 부합하는 것이다. 도 14에 도시된 바와 같이, GO-COOH를 함유하는 NG의 경우에는 NG보다 더욱 지속적인 VEGF 방출을 보여준다. GO를 첨가함으로써 플루로닉계 수화겔 및 GO 사이의 상호작용이 지속적 방출에 기여하였는 바, GO 함유 수화겔로부터의 VEGF 방출이 순수 수화겔로부터의 방출보다 더욱 느렸다.The VEGF release profiles from the various hydrogels are shown in Figures 12, 13 and 14. Figure 12 is a plot showing that PF hydrogels containing GO-COOH release VEGF more slowly than PF hydrogels. VEGF from PF was almost released within one day. The degradation rate and release rate of VEGF were approximately the same for PF; PF hydrogels were degraded within one day, whereas PF containing GO-COOH was degraded very slowly. In the case of DAPF, the result was similar to that of PF. VEGF from DAPF containing GO-COOH showed more sustained release compared to DAPF hydrogel, while complete release of VEGF from DAPF hydrogel was achieved within one day. In the case of NG, the release of VEGF from NG was more persistent than the release from PF or DAPF, since NG possesses chemical cross-linking. These results are consistent with the hydrolysis rate of hydrogels. As shown in Fig. 14, NG with GO-COOH shows more sustained release of VEGF than NG. VEGF release from the GO-containing hydrogel was slower than release from the pure hydrogel as the interaction between the pluronic hydrogel and the GO contributed to sustained release by the addition of GO.

이러한 결과들은 수화겔로부터의 지속적 방출에 GO가 미치는 효과를 나타낸다. 모든 경우에서, GO 함유 수화겔로부터의 VEGF의 더 느린 방출 속도는, 이러한 신규 겔 시스템이 성장 인자 전달 시스템으로서 매우 유망한 후보임을 의미한다.These results indicate the effect of GO on sustained release from the hydrogel. In all cases, the slower release rate of VEGF from the GO-containing hydrogel means that this novel gel system is a very promising candidate as a growth factor delivery system.

수화겔의Hydrated 인 비보 안정성 In-Bo Bo stability

인 비보에서의 GO 함유 플루로닉 수화겔의 향상된 안정성을 입증하기 위해서, GO-COOH 함유 또는 미함유 PF, DAPF, 또는 NG 수화겔을 마우스 등에 피하주사하였다. 이러한 수화겔들이 열-민감성 특성들을 나타내기 때문에, 상기 수화겔들을 저온에서 졸 상태로 주사하였다. 졸 상태는 마우스에 주사한 후 3분 이내에 겔 상태로 변환되었다. 인 비보에서 수화겔들의 안정성을 모니터링하기 위해서, 주사된 마우스의 피부를 여러 시간대 별로 절단함으로써 수화겔의 크기를 모니터링하였다: 1일, 1주, 2주 및 4주.In order to demonstrate the improved stability of GO-containing pluronic hydrogel in in vivo, GO-COOH-containing or non-containing PF, DAPF, or NG hydrogels were injected subcutaneously into mice and the like. Because these hydrogels exhibited heat-sensitive properties, the hydrogels were injected in the sol state at low temperatures. The sol state was converted to a gel state within 3 minutes after injection into the mouse. To monitor the stability of hydrogels in in vivo, the size of the hydrogels was monitored by cutting the skin of the injected mice over several time periods: 1 day, 1 week, 2 weeks and 4 weeks.

순수 PF 또는 DAPF 수화겔은, 인 비트로 분해 속도에 따라서 1일 이내에 분해되었다. 그러나, GO-COOH 함유 PF 겔은 매우 느리게 분해되었고; 84%의 주사된 수화겔이 7일 이후에도 잔류하였으며, 심지어 28일 이후에도 62%의 수화겔이 존재하였다 (도 12). DAPF 겔은 PF 겔에 비해서 더욱 느리게 분해되었으며, 인 비트로 분해 속도와 유사하였고; 71%의 주사된 수화겔이 28일 이후에 잔류하였다 (도 13). NG의 경우에는 (도 14), 순수 NG가 7일 이내에 분해되었지만, GO-COOH 함유 겔은 매우 느리게 분해되었고; 92%의 주사된 수화겔이 7일 이후에 잔류하였고, 28일 이후에 NG-GO-COOH 수화겔이 안정적으로 존재하였다. 모든 경우에서, 인 비보에서 수화겔들의 분해 속도는 인 비트로에서보다 더 느렸는 바, 이는 아마도 교반이 부족하고, 인 비트로 실험 조건에 비해서 인 비보에서의 생리적 유체 공급이 제한적이기 때문인 것으로 판단된다.Pure PF or DAPF hydrogels degraded within 1 day, depending on the rate of degradation to phosphorous. However, the GO-COOH-containing PF gel degraded very slowly; 84% of the injected hydrogels remained after 7 days, and even after 28 days there was 62% hydrogels (FIG. 12). DAPF gels were degraded more slowly than PF gels and were similar to in vitro degradation rates; 71% of injected hydrogels remained after 28 days (Figure 13). In the case of NG (Fig. 14), the pure NG was degraded within 7 days, but the GO-COOH-containing gel decomposed very slowly; 92% of injected hydrogels remained after 7 days, and NG-GO-COOH hydrogel stably existed after 28 days. In all cases, the decomposition rate of hydrogels in in vivo was slower than in in vitro, presumably because of the lack of agitation and limited supply of physiological fluid in vivo compared to experimental conditions.

결론적으로, 플루로닉 수화겔들의 실제 생의학적 응용을 방해하였던, 플루로닉계 물리적 수화겔의 불안정성은, 인 비트로 및 인 비보 모두에서 소량의 GO-COOH를 첨가함으로써 효과적으로 극복될 수 있었다.In conclusion, the instability of the pluronic physical hydrogel, which hindered the actual biomedical application of pluronic hydrogels, could be effectively overcome by adding small amounts of GO-COOH in both in vitro and in vivo.

인 비보 생체 적합성In Vivo bio compatibility

향상된 인 비보 안정성에 더해서, 생의학적 적용을 위해서는 이러한 수화겔들의 생체 적합성을 특성화할 필요성이 있다. 그래핀계 물질들의 안전성 및 독성은 완전히 해결되지 않았다. 그러나, 본 발명에서는 매우 소량의 GO-COOH를 첨가함으로써 조성물의 안정성을 향상시켰다. 순수 수화겔 및 GO-COOH 함유 겔들에 대한 주사 부위들에서의 조직 면역학적 이미지들을 3주 후에 얻었다 (도 15). PF, DAPF, 및 NG 수화겔들은 이미 완전히 분해되었으며, 폴리머들의 어떠한 흔적도 발견되지 않았다. GO-COOH 함유 겔들의 경우, GO-COOH의 존재로 인해서 흑색 반점들이 관찰되었다. 그러나, 모든 GO-COOH 함유 수화겔들에 있어서 어떠한 집중적인 대식세포들의 국부화도 관찰되지 않았다. 또한, H&E 염색 결과, 어떠한 주목할만한 염증 반응 징후도 관찰되지 않았다. 따라서, GO-COOH 함유 겔들은 인 비보에서 어떠한 심각한 생체 적합성 문제도 보이지 않았는 바, 본 발명에 따른 조성물은 비독성이고 생체적합성을 갖는다.In addition to improved in vivo stability, there is a need to characterize the biocompatibility of these hydrogels for biomedical applications. The safety and toxicity of graphene materials have not been completely solved. However, in the present invention, the stability of the composition is improved by adding a very small amount of GO-COOH. Tissue immunological images at injection sites for pure hydrogel and GO-COOH-containing gels were obtained after 3 weeks (Figure 15). PF, DAPF, and NG hydrogels were already completely degraded, and no trace of the polymers was found. In the case of GO-COOH-containing gels, black spots were observed due to the presence of GO-COOH. However, no localization of any intensive macrophages was observed in all GO-COOH-containing hydrogels. In addition, no significant signs of inflammatory response were observed after H & E staining. Therefore, GO-COOH-containing gels No serious biocompatibility problems have been observed in Bibo, so the composition according to the invention is non-toxic and biocompatible.

Claims

1 wt% or less of graphene oxide and 5 wt% or more of a triblock copolymer represented by the following formula (1):
&Lt; Formula 1 >

In the above formula, n is an integer of 8 to 540 and m is an integer of 16 to 70. [

The composition for forming a hydrogel according to claim 1, wherein the hydroxyl group of the oxidized graphene is substituted with a carboxyl group.

2. The composition for forming a hydrogel according to claim 1, wherein the triblock copolymer is a triblock copolymer represented by the following formula (2): < EMI ID =
(2)

.

The composition for forming a hydrogel according to claim 1, wherein the triblock copolymer is a diacrylated triblock copolymer represented by the following formula (3):
(3)

.

The composition for forming a hydrogel according to claim 4, wherein the diacrylated triblock copolymer represented by Formula 3 is a triblock copolymer on a nano gel.

The composition for forming a hydrogel according to claim 1, wherein the composition for forming a hydrogel comprises at least one solvent selected from the group consisting of distilled water, a buffer solution and physiological saline as a solvent.