KR20150090295A

KR20150090295A - 칠해목 추출물을 유효성분으로 하는 항염증 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20150090295A
Application number: KR1020140009338A
Authority: KR
Inventors: 전훈; 남정일
Original assignee: 우석대학교 산학협력단
Priority date: 2014-01-27
Filing date: 2014-01-27
Publication date: 2015-08-06

Abstract

본 발명에 따른 치료용 조성물은 칠해목으로부터 추출되는 에틸 아세테이트를 유효성분으로 함으로써, iNOS의 발현을 억제하고 COX-2의 발현을 억제시킴으로써, 항염증 효과를 발휘하는 효과를 가진다.

Description

칠해목 추출물을 유효성분으로 하는 항염증 치료용 조성물{COMPOSITION WITH FRACTION OF RIBES FASCICULATUM AS AN AVAILABLE INGREDIENT HAVING EFFECT ON THE ANTI-INFLAMMATORY}

본 발명은 항염증 효과를 갖는 치료용 조성물에 관한 것이며, 특히 칠해목 추출물을 그 유효성분으로 하는 치료용 조성물에 관한 것이다.

염증이란 외적 자극이나 내상에 대한 생체 조직의 반응이다. 염증 반응은 많은 질병의 원인이 되는 감염이나 염증을 최소화시키기 위한 인체의 기작에 해당한다.

대식세포(Macrophage)는 선천적 또는 후천적인 면역에 중요한 역할을 하고 염증반응에 대한 매개체이다. 즉, 대식세포는 주요 면역세포로서 염증에 중심 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 대식세포는 산화질소(NO)나 프로스타글라딘(prostagladins, PGs)과 같은 염증 유발체를 생산하는 염증성 사이토킨(inflammatory cytokins)과 bacterial endotoxic lipopolysaccharide(LPS)와 같은 염증 자극이 있을 때 활성화된다.

산화질소는 혈관확장, 신경전달이나 염증과 같은 다양한 생리적 기능에 관여한다. 산화질소(NO)는 neuronal NOS(nNOS), endothelial NOS(eNOS)와 inducible NOS(iNOS)의 세 종류의 다른 NO 합성효소(NOS) 중 하나로서 합성된다.

이 중 iNOS는 다양한 염증 매개체에 대해 반응하여 많은 양의 산화질소를 생ㅇ산함으로써, 염증 반응시 조직 손상을 초래한다.

NOS와 유사하게, 또 다른 염증 매개체인 시클로옥시게나아제(cyclooxigenase, COX)는 두 가지 동형단백질인 COX-1과 COX-2를 가지고 있다.

COX-1은 평상시에 발현되어 평상시 생리기작에 관여하는 반면, 유도성 COX-2는 염증성 프로스타글란딘(PGs)을 생산하는 역할을 한다.

게다가, iNOS나 COX-2와 같은 염증 매개체의 발현은 대부분 염증 반응에 관계된 유전자의 발현을 담당하는 NF-κB(neclear factor kappa B)에 의해 조절되는 것으로 잘 알려져 있다.

한편, 까마귀밥여름나무 또는 가마귀밥나무라고도 불리는 칠해목은 옻이 오른 부위에 달인 물로 씻어주거나 마사지하듯 두드려주면 효과가 있는 것으로 잘 알려져 있지만 약재로는 아직 사용이 잘 되지 않고 여전히 그 연구가 부족한 실정이다.

본 발명은 칠해목의 유효성분이 항염증에 효과가 있을 것으로 예측하여 항염증 효과가 있는 치료용 조성물을 제공하는 데 그 목적이 있다.

이러한 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 항염증 치료용 조성물은 칠해목 추출물 중 에틸 아세테이트 성분을 유효성분으로 하는 것을 특징으로 함으로써, 상기 추출물에 의해 iNOS 단백질의 발현이 억제되고 COX-2의 발현을 억제시킴으로써 항염증 효과를 발휘한다.

본 발명에 따른 치료용 조성물은,

칠해목 추출물 중 에틸 아세트를 유효성분으로 하여 iNOS의 발현을 억제하고 COX-2의 발현을 억제시킴으로써, 항염증 효과를 발휘한다.

도 1 및 도 2는 본 발명에 따른 아질산염 농도를 관찰하기 위한 실험 결과이다.
도 3 및 도 4는 본 발명에 따른 iNOS 효소 활성화를 측정하기 위한 실험 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 트립신에 의한 발 부종에 대한 영향에 대한 실험 결과이다.

이하, 본 발명을 실시 예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 칠해목으로부터 추출되는 에틸 아세테이트 추출물을 그 유효성분으로 한다.

본 발명인들은 칠해목으로부터 추출되는 에틸 아세테이트 추출물(ethyl acetate fraction of R. fasciculatum, ERF)이 항염증에 효과가 있다는 가정 하에, 염증 유발에 관여하는 NO 및 COX-2의 생성 변화를 통해 이를 검증하기로 하였다.

쥣과 재조합형 IFN-γ는 독일의 Pharmingen 사로부터 구매하였다.

LPS, 아질산 나트륨 및 니트로-L 아르기닌 메틸 에스테르(L-NAME)은 미국 시그마 사로부터 구매한 것을 사용하였다.

타이오글리콜레이트(thioglycollate, TG), PBS(Phosphate buffered saline)과 BSA(Bovine serum albumin)은 미국의 Gibco 연구소로부터 구입한 것을 사용하였다.

0.4μm 실린지 필터(syringe filter)와 조직 배양용 96-well 플레이트, 24-well과 60-mm, 100-mm 직경의 접시는 미국의 Nunc 사로부터 구입한 것을 사용하였다.

L-아르기닌(84 mg/l)을 포함하는 DMEM, FBS(fetal bovine serum)과 다른 조직 배양용 시약은 미국 Life Technologies 사로부터 구매하였다.

실험대상인 수컷 C57BL/6(6주)와 ICR(6주) 쥐는 한국의 Damul Science 사로부터 구매하였고, 모든 실험대상은 22±1℃이고 습도 50%를 유지하며 주야가 12시간단위로 바뀌는 환경 하에서 표준 펠렛 음식을 수돗물과 함께 자유식으로 제공하였다.

칠해목 재료는 2012년 한국 하인약업사로부터 구매한 것을 사용하였다.

칠해목 추출물은 건조 샘플 3kg으로부터 MeOH 12,000mL와 함께 2시간 동안 초음파파쇄하여 두 번에 걸쳐 추출하였다. 얻어진 메탄올 추출물은 증류농축장치에 의해 100.64g, 3.021%의 수득률로 농축시켰다.

결국, 이 샘플로부터 연속적으로 용해성 분할되어 n-hexane(10.4g), CH₂Cl₂(8.5g), EtOAc(5.4g) 및 용해추출물을 얻을 수 있다.

각각의 추출물은 감압하에 동결건조되어 사용 전까지 -20℃에서 저장된다.

예비실험을 통해, 4 종의 추출물 중 EtOAc 추출물(ERF)이 가장 약학적인 효능이 있음을 알 수 있었고, 그래서 ERF를 사용하여 연구를 수행하였다.

TG가 가미된 대식세포는 쥐에 2.5mL의 TG 복강 주사 후 취득하여 격리시켰다.

10U/mL 헤파린이 함유된 PBS 8mL를 사용하여 복막 세척을 수행하였다.

다음으로, 대식세포는 37℃, 5% Co₂ 환경에서 3시간 배양된 24-well 조직 배양 플레이트(3×10₅ cell/well) 상의 열비활성화된 10%의 FBS가 처리된 DMEM으로 옮겨지고, PBS로 세번에 걸쳐 세척하여 떨어진 세포들을 제거시키는 것에 의해서 처치 전에 10% FBS가 포함된 DMEM과 평형을 유지하게 하였다.

세포 호흡, 세포생존 지표는 MTT(mitochondrial dependent reduction of 3-(3,4-dimethylthiazol-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)를 수행하여 얻을 수 있었고, 세포 내에서 MTT의 감소 정도는 마리크로플레이트리더를 사용하여 570nm에서 광학 밀도를 측정하였다.

전체 세포 용해물은 표본 완충 용액(62.5mM Tri-HCL pH 6.8, 2% sodium dodecyl sulfate(SDS), 20% glycerol and 10% 2-mercaptoethanol) 내에서 끓는 복막 대식세포에 의해 만들어진다.

세포 용해물의 단백질은 20% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리되어 나이트셀룰로스 종이로 옮겨진다.

막은 상온에서 3시간 동안 5% BSA 용액에 의해 분리시키고 anti-iNOS, COX-2와 함께 배양된다.

0.05% 트윈(tween) 20을 포함하는 PBS(phosphate buffered saline)로 세 차례 세척한 후, 반점이 2차 항체와 함께 1시간 동안 배양되고, 항체의 특정 단백질이 ECD 시스템(enhanced chemiluminesence system)에 의해 나타나게 된다.

모든 측정값은 평균±표준편차로 나타내었다.

그룹 간 데이터는 Student's t-test와 0.01보다 작은 p-value로 평가하였다.

웨스턴블로트법(Western blotting)으로 얻어지는 빛의 강도는 Image Quant TL에 의해 추산되었다.

실험예 1(아질산염 농도 분석)

복막 대식세포(3×10⁵ cells/well)는 ERF의 농도를 달리하여 배양시켰다.(0.1, 1, 10, 100μg/mL) 다음, 세포에 rIFN-γ(20U/mL)를 자극시켰다.

6시간 후, 세포는 LPS(10μg/mL)로 완전히 처치된다.

마이크로플레이트 평가방법에 의해 NO 합성을 측정하였다.

아질산을 측정하기 위해서, 100μL의 부분표본은 조정배지(conditioned medium)로부터 제거시키고, 동일한 양의 Griess 시약을 상온에서 10분 동안 배양시켰다.

540nm에서의 흡광은 마이크로플레이트리더로 측정하고, NO₂는 표준화된 아질산 나트륨을 사용하여 결정한다. 그리고, 니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르(L-NAME)는 표준화 약품을 사용한다.

도 1은 그 결과를 나타낸 것이다.

LPS에 의한 NO의 생성은 ERF 양에 따라 제한되었다.

즉, ERF가 고농도(100μg/mL)일 경우 대조군에 비해서 NO 생성이 완벽히 차단되었다. 또한, 도 2를 통해 알 수 있듯이, 어떤 세포 독성도 나타나지 않았다.

따라서, ERF가 NO 생성을 억제하는 것이 세포 독성에 기인하지 않는다는 결론을 내릴 수 있다.

실험예 2( iNOS 효소 및 COX -2 활성화 측정)

ERF가 iNOS 효소 활성화에 미치는 영향을 알아보기 위해서, iNOS 효소 활성화는 Israf 저 논문(Cardamonin inhibits COX and iNOS expression via inhibition of p65 NF-kappa B nuclear tranlocation and I-kappa B phosphorylation in RAW 264.7 macrophage cells. Mol. Immunol., 44(5), 673-679, 2006)에 기술된 내용을 일부 수정하여 수행한다.

대식세포는 rIFN-γ(20U/mL)와 LPS(10μ/mL)를 가하여 12시간 가하여 iNOS를 생산하도록 유도된다.

12시간 후, 중간체는 폐기되고 변화된다.

그런 후, 대식세포는 다양한 농도의 ERF로 처리되어 12시간 배양된다.

상청액은 제거되고, 아질산염 정도는 Griess 시약을 사용하여 결정된다.

도 3을 통해 확인되는 바와 같이, iNOS 효소의 활성은 L-NAME에 의해 제한됨을 알 수 있다.

즉, ERF가 그 농도에 비례해서 iNOS 효소의 활성을 상당히 경감시키는 것을 알 수 있다.

도 3에 나타난 바와 같이, iNOS 단백질의 발현은 자극에 의해서 증가되고, ERF에 노출되면 줄어든다는 것을 확인할 수 있다.

이와 같이, NO 라디칼의 제거 및 iNOS 발현 억제는 ERF에 의해 나타나는 효과임을 결론지을 수 있었다.

또한, ERF의 양에 따라 COX-2의 발현도 억제되는 것으로 조사되었지만, ERF가 COX-2의 억제자라는 것은 아직 단정지을 수 없다.(도 4)

실험예 3(트립신에 의한 발 부종)

부종은 오른 뒷 발에 30μl 의 트립신을 주입하고, 왼발은 30μL의 염분을 처리하여 대조군으로 사용하였다.

부종은 plethysmometer로 트립신 주입 한 시간 후에 측정한다.

부종은 오른 발과 왼 발에서 다르게 나타났다.

도 5에 도시된 바와 같이, ERF에 의해 발의 부종은 200mg/kg에서 20%, 400mg/kg에서 50%로 감소되는 것을 알 수 있었다.

이는 ERF가 COX-2의 발현을 억제함으로써 트립신에 의한 발 부종을 차단시키는 것이라 할 수 있다.

이상 살펴본 결과와 같이, 칠해목으로부터 추출되는 에틸 아세테이트 추출물(ethyl acetate fraction of R. fasciculatum, ERF)이 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제시켜 항염증 작용을 할 수 있음을 알 수 있다.

위에서 설명한 바와 같이 본 발명에 대한 구체적인 설명은 첨부된 도면을 참조한 실시예에 의해서 이루어졌지만, 상술한 실시예는 본 발명의 바람직한 예를 들어 설명하였을 뿐이므로, 본 발명이 상기 실시예에만 국한되는 것으로 이해돼서는 안 되며, 본 발명의 권리범위는 후술하는 청구범위 및 그 등가개념으로 이해되어야 할 것이다.

Claims

칠해목 추출물을 유효성분으로 하는 항염증 치료용 조성물.
제 1항의 칠해목 추출물은 에틸 아세테이트 성분인 것을 특징으로 하는 항염증 치료용 조성물.
제 2항에 의한 항염증 효과는 iNOS 단백질의 발현을 억제시킴으로써 가능한 것을 특징으로 하는 항염증 치료용 조성물.
제 3항에 의한 항염증 효과는 COX-2의 발현을 억제시킴으로써 가능한 것을 특징으로 하는 항염증 치료용 조성물.