KR20150090278A - 암 또는 고등급 과형성증 세포의 자동화된 스크리닝 방법 - Google Patents
암 또는 고등급 과형성증 세포의 자동화된 스크리닝 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 생물학적 샘플 중에서 암 및 관련된 과형성증을 검출하기 위한 자동화된 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명의 배경
본 출원은 2006년 10월 25일자로 출원된 미국 가출원 제 60/862,974호의 우선권의 이익을 주장한다. 이 참조문헌 및 본 명세서에 인용된 모든 부가적인 참조문헌, 및 이들의 참조문헌은, 부가적인 또는 대안적인 상세내용, 특징 및/또는 기술적인 배경을 교시하기 위해 적절한 경우 본 명세서에 참조 병합된다.
본 발명의 분야
본 발명은 일반적으로, 개체에서 암, 및 이형성증(dysplasia), 특히 고등급 이형성증을 검출하기 위한 자동화된 방법에 관한 것이다. 한 측면에서, 하나 이상의 암의 치료시 치료 프로토콜의 유효성을 모니터링하는 방법이 제공된다.
많은 방법이 샘플의 현미경 분석(microscopic analysis)에 도움이 되는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 제한 없이, 특정 염료는 세포 또는 세포이하(subcellular) 구조에 대한 친화도를 갖는 것으로 알려져 있다. 따라서, 이러한 염료는, 이러한 구조를 추가로 밝히도록 도와줌으로써, 분석에 도움이 되도록 사용될 수 있다. 이러한 구조에 대한 염료의 결합은, 다양한 현미경 검출 기술을 사용하여 확인 및 분석될 수 있다.
세포 및 조직의 형광 현미경법(fluorescence microscopy)은 이 기술분야에서 주지되어 있다. 현미경 내에서 형광 세포를 이미징하고 그리고 이러한 세포에서 일어나는 일시적 변화 및 공간적 분포에 대한 정보를 추출하기 위한 방법이 개발되었다. 이러한 방법 및 이들의 적용예 중 일부가 논문(article by Taylor, et al. in American Scientist 80 (1992), p. 322 - 335)에 기재되어 있다. 이러한 방법은, 세포 내 형광 리포터 분자(fluorescent reporter molecule)의 분포, 양 및 생화학적 환경의 고도의 공간 및 시간 해상도 영상 측정(high spatial and temporal resolution imaging measurement)을 위한 몇 개의 표본을 제조하기 위해 설계 및 최적화되었다. 형광 신호의 검출은, 이미지를 형성하기 위해 방출된 형광(fluorescent light)을 사용하는 형광 현미경(epifluorescence microscope)에 의해 가능하다(반면에 통상적인 반사 현미경은, 이미지를 형성하기 위해 산란된 조명광을 사용한다). 형광 현미경의 여기광(excitation light)은 샘플 내 형광 태그를 여기시켜, 형광 태그가 형광을 발하도록 하기 위해 사용된다. 형광 현미경의 이점은, 형광 분자가 관심 대상의 생물학적 구조에 우선적으로 부착되고 이로써 관심 대상의 이러한 생물학적 구조의 확인을 허용하도록 샘플이 제조될 수 있다는 것이다.
생물학적 샘플의 현미경 분석을 실시하는 자동화된 방법은 진단 절차를 강화하고 그리고 현미경에 기초한 진단 설비(microscope-based diagnostic facility) 내에서 샘플의 스루풋을 최적화한다. 이하에서 보다 충분히 기재되는, 다양한 공동-소유 미국 특허 출원은, 자동화된 현미경 분석을 위한 장치의 측면 및 실시형태 그리고 방법을 개시하였다. 여기에는, 집적화된 로봇 현미경 시스템(integrated robotic microscope system), 동적 자동화된 현미경 작업 및 슬라이드 스캐닝 시스템, 자동화된 현미경 시스템에 사용하기 위한 다양한 교환가능한 대물 렌즈, 필터 및 유사한 요소들, 자동화된 현미경 시스템에 사용하기 위한 자동화된 현미경 스테이지, 자동화된 현미경 시스템에 사용하기 위한 자동화된 현미경 슬라이드 카세트(cassette) 및 슬라이드 취급(handling) 시스템, 자동화된 현미경 시스템에 사용하기 위한 자동화된 현미경 슬라이드 로딩(loading) 및 언로딩(unloading) 메커니즘, 자동화된 현미경 시스템을 구동하기(drive) 위해 사용가능한, 생물학적 샘플로부터의 형광 신호의 현미경 검출을 구동하는 컴퓨터-상주 프로그램(computer-resident programs)을 사용하는 자동화된 방법, 이미지 처리를 위한 FISH 어세이 실시에 현미경을 구동하기 위해 컴퓨터-상주 프로그램을 사용하는 현미경의 자동 작동이 포함된다.
두문자어 "FISH"(형광 동소 보합결합(fluorescence in situ hybridization))는, 염색체 구조를 검출하기 위해, 자외선 또는 가시광 광원과 같은 광원에 의해 조명될 때 특징적인 빛 또는 색상을 방출하는 형광 태그 또는 표지를 사용하는 기술을 참조한다. FISH는, 이들이 고도의 서열 유사성을 보이는 염색체의 부분에만 결합하는 형광 탐침(probe)을 사용한다. 이러한 탐침은 특이적 염색체 및 특이적 염색체 영역에 유도될 수 있다. 탐침은 이의 표적에 (그리고 게놈 내 유사한 서열에는 아님) 특이적으로 보합결합하기 충분하게 길어야 하지만, 너무 커서 보합결합 처리를 방해하지 말아야 하고, 그리고 형광단(fluorophore)에 직접 태깅되어야(tagged) 한다. 이는 다양한 방법, 예를 들어 태깅된 뉴클레오티드를 사용한 PCR 및 닉 트랜슬레이션(nick translation)으로 실시될 수 있다. 신호 증폭이 현미경의 검출 임계값(detection threshold)을 초과할 필요가 있다면(이는 탐침 표지화 효율, 탐침의 종류 및 형광 염료와 같은 많은 인자에 따라 좌우됨), 비오틴 또는 디곡시제닌(digoxygenin)과 같은 합텐(hapten)으로 표지된 탐침이 사용되고, 그리고 특이적 형광 태깅된 항체 또는 스트렙타비딘(streptavidin)이 합텐 분자에 속박되고(bound), 이에 따라 형광을 증폭시킨다. FISH 기술은 염색체 비정상(abnormality) 및 유전자 매핑(mapping)을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
암 세포 내 유전자 과발현에 대한 공통적으로 연구된 메커니즘은 일반적으로 유전자 증폭으로 언급된다. 이는, 유전자가 조상(ancestral) 세포의 염색체 내에서 다수의 카피로 복제되는(duplicated) 과정이다. 이 과정은 유전자를 포함하는 염색체의 영역의 계획되지 않은 복제(replication)에 이어, 복제된 분절(segment)을 염색체 내로 다시 재조합하는 것을 포함한다(Alitalo K. et al. (1986), Adv. Cancer Res. 47:235-281). 그 결과, 유전자의 50 또는 그 이상의 카피(copy)가 생산될 수 있다. 복제된 영역은 때때로 "앰플리콘(amplicon)"이라 언급된다. 유전자의 발현 수준(즉, 생산된 메신저 RNA의 양)은 만들어지는 유전자의 카피의 수와 동일한 비율로 형질전환된(transformed) 세포 내에서 확대된다(Alitalo et al).
다른 종양유전자(oncogene), 특히 신경아세포종(neuroblastoma)에 대해 기재된 것의 연구를 통해, 원-종양 유전자(proto-oncogene)의 유전자 복제는 암의 보다 악성인 형태와 관련된 사건(event)이고, 그리고 임상적 결과의 예견인자(predictor)로서 작용할 수 있는 것으로 제시된다(Schwab M. et al. (1990), Genes Chromosomes Cancer 1: 181-193; 및 Alitalo et al. 검토). 유방암에서, erbB2 유전자의 복제는 질환의 재발 및 생존 기간 감소 모두와 상관관계가 있는 것으로 보고되었다(Slamon D. J. et al. (1987), Science 235: 178-182.). erbB2가 사이클로포스파미드, 독소루비신, 및 플루오로우라실을 사용한 아주반트 화학요법에 반응하는 종양을 확인하도록 돕는다는 일부 증거가 있다(Muss et al. N Engl J Med. 1994 330(18): 1260-6).
유방암에서 유전자 복제될 수 있는 일부분의 유전자만이 확인되었다. 먼저, 이중 미세(double minute)(DM) 염색체 및 균질하게 염색된 영역(homogeneously stained regions)(HSRs)과 같은 염색체 비정상은 암 세포 내에서 풍부하다. HSR은, 핵형 분석에서, 교대되는 어두운 밴드 그리고 밝은 밴드의 정상 패턴으로보다는, 이의 길이 전반에 걸친 중간 밀도 김자 염색(intermediate density Giemsa staining)으로 나타나는 염색체 영역이다. 이들은 다수의 유전자 반복에 대응한다. HSR는 특히 유방암에서 풍부하고, 조사된 종양의 60-65%에서 나타난다(Dutrillaux B. et al. (1990), Cancer Genet Cytogenet 49:203-217.; Zafrani B. et al. (1992), Hum Pathol 23:542-547). 이러한 영역이 16개의 공지된 인간 종양유전자(oncogene) 중 어떤 것, erbB2 및 myc를 포함, 에 대한 탐침으로 동소 보합결합에 의해 조사될 때, 종양의 일부분만이 HSR 영역에 대한 어떤 보합결합을 보인다. 또한, 각 핵형 내 HSR의 일부분만이 연관된다(implicated).
두번째로, 비교 게놈 보합결합(comparative genomic hybridization)(CGH)를 통해, 종양에서, 심지어 HSRs 외부의 염색체 영역에서, 카피 수 증가가 존재하는 것으로 밝혀졌다. CGH는, 전체 염색체 분포(spread)가 두가지 상이한 형광색소(fluorochrome)를 사용하여, 정상 세포로부터의 그리고 암 세포로부터의 DNA 단편과 동시에 염색되는 새로운 방법이다. 이미지는, 형광 비율에 대해 컴퓨터-처리되고, 암 세포 내 증폭 또는 결실(deletion)된 염색체 영역을 밝힌다(Kallioniemi A. et al. (1992), Science 258:818-821.). 이 방법은 최근에 15 유방암 세포주(cell line)에 적용되었다(Kallioniemi A. et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sd. USA 91:2156-2160.). DNA 서열 카피수 증가가 모든 23 염색체 쌍에서 검출되었다.
So, C-K 등(So, C-K, et al.)(Clinical Cancer Research 10: 19-27, 2004)은, Linzhou(Linxian)(중국)으로부터의 식도 편평 세포 암(esophageal squamous cell carcinoma) 샘플에서, 사이클릭 AMP 반응 요소 결합 단백질(cyclic AMP response element binding protein(CBP)), 핵 전사 보조활성인자 단백질(nuclear transcriptional coactivator protein)의 내부 연계 복제(internal tandem duplication)를 발견하였다. So 등(So et al)은 CBP 유전자의 내부 연계 복제가 인간 편평 세포 암에서 빈번한 유전적 사건임을 보여준다.
인간 내피 성장 인자 수용체 2 (HER-2)/neu (c-erbB-2) 유전자는, 염색체 17q에 위치화되고, 그리고 내피 성장 인자 수용체(EGFR) 또는 HER 부류의 멤버인 트랜스멤브레인 티로신 키나아제 수용체 단백질(transmembrane tyrosine kinase receptor protein)을 암호화한다(Ross, JS, et al., The Oncologist. Vol. 8, No. 4, 307-325, August 2003). HER-2 유전자는 인간 유방암의 아마도 25%, 단편에서 증폭된다.
형광 동소 보합결합(FISH)은, 종양유전자에서 발견된 단일 뉴클레오티드 다형(polymorphism) 또는 돌연변이와 같은 서열 변형(alteration)을 포함하는 염색체 비정상의 검출을 위해 일반적으로 사용된다.
암 및 이형성증, 이를테면 고등급 이형성증의 스크리닝을 위한 다수의 방법 및 키트가 개시되었다.
예를 들어, 애보트 모리큘러(Abbott Molecular)에 의해 제조된 프로비전 멀티-칼라 탐침 세트(ProVysion Multi-color Probe Set)가 염색체 8, 8p22에 위치된 리포단백질 리파아제(LPL) 유전자, 및 8q24 영역에 위치된 C-MYC 유전자를 검출 및 정량하기 위해 설계된다. 8q24 및 8p21-22(LPL)의 획득(gain) 및 이형접합성(heterozygosity)의 소실(loss)이 비정상 샘플에서 관찰된 두가지 유전적 변형이다. 프로비전(ProVysion) 멀티-칼라 탐침 세트는 세개의 개별 형광단 표지(fluorophore label)를 갖는 세 탐침으로 구성된다. 멀티칼라 탐침 세트 디자인은 단일 세포 내 세 게놈 마커, SpectrumAqua로 표지된 CEP® 8 탐침, SpectrumOrange로 표지된 LSI LPL, 및 SpectrumGreen으로 표지된 LSI C-MYC의 동시 분석을 허용하는 것으로 언급된다. CEP 8 알파 세털라이트 DNA 탐침(CEP 8 alpha satellite DNA 탐침)은, 염색체 8 (8p11.1-q11.1)의 동원체(centromere) 영역에 보합결합되고 그리고 염색체 8의 카피 수의 확인을 위한 메커니즘을 제공한다. LSI LPL은 8p22의 LPL 유전자에 보합결합되고 그리고 크기가 약 170 kb이다. LSI C-MYC 탐침(약 750 kb 탐침)은 8q24에 위치된 C-MYC 유전자에 보합결합된다. 제조업자에 따르면, 프로비전 멀티-칼라 탐침 세트로 보합결합된 정상 세포에서, 기대되는 패턴은 두개의 오렌지, 두개의 그린 및 두개의 아쿠아(2O2G2A) 신호 패턴이고, 반면에 비정상 세포에서는, 세 탐침 신호의 카피의 조합이 관찰될 수 있다. 시험 키트는, 어떤 탐침의 둘보다 많거나 또는 적은 카피 수는, 염색체 또는 유전자의 획득 또는 소실을 각각 나타낸다는 것을 지시한다. CEP 8 카피 수에 대해 LSI LPL의 둘 미만의 카피 또는 LSI C-MYC 탐침의 다수의 카피는, 염색체 8 카피 수에 대해, LPL 영역의 소실 및 C-MYC 영역의 획득을 각각 지시한다.
미국 특허 공개 제 2004/028107호 및 제 2005/0026190호(Vysis, Inc.)는, 자궁경부 세포(cervical cell) 내 고등급 이형성증 및 암종의 검출을 위해 탐침 및 탐침 세트를 사용하는 방법을 주장한다. 이 방법은 하나 이상의 염색체 탐침을 생물학적 샘플에 보합결합하고, 그리고 염색체 탐침의 보합결합 패턴을 검출하여 대상이 고등급 이형성증 또는 암종을 갖는지를 결정하는 것을 수반한다. 이 방법은 약 60 미만의 벡터값을 나타내는(demonstrating) 하나 이상의 탐침의 세트를 사용하는 것을 포함하며, 여기서 벡터값은 벡터 = [(100-특이성)2 + (100-민감성(sensitivity))2]1 /2로 계산된다. 염색체 탐침은 특이적인 유전자좌, 이를테면8q24, 3q36, Xp22, 및 CEP 15에 대한 탐침, 또는 예를 들어, HPV-16, HPV-18, HPV-30, HPV-45, HPV-51, 및 HPV-58의 각각에 대한 전체 암호화 서열(full coding sequence)에 실질적으로 상보적인 탐침을 포함할 수 있다. 스크리닝된 생물학적 샘플은, 세포 사이클 단백질, 이를테면 p16 또는 사이클린 E(Cyclin E), 또는 세포 증폭 마커, 이를테면 단백질 Ki67 또는 PCNA의 존재에 대해 예비-스크리닝될(pre-screened) 수 있다.
미국 특허 공개 제 2006/0063194호(Abbott Molecular)는 또한, 암, 특히 폐암의 검출을 위한 탐침 및 탐침 세트의 사용 방법 및 탐침 세트를 개시한다. 유전자좌 특이적인 탐침 및 염색체 열거(enumeration) 탐침은 결합하여(in conjunction) 사용되고, 그리고 동일물의 보합결합 패턴이 대상이 폐암인지를 결정하기 위해 사용된다. 염색체 조성은 특이화된다, 예를 들어 폐암을 결정하기 위한 탐침 세트는 5pl5 유전자좌 특이적인 탐침, a 8q24 유전자좌 특이적인 탐침, 염색체 6 열거 탐침 및 7pl2 유전자좌 특이적인 탐침을 포함할 수 있다.
진단 FISH 광 도트 계수(Diagnostic FISH light dot counting)는 통상적으로 현미경 사용 숙련자에 의해 수동으로 수행되어 왔다. 도트 및 이의 색상을 바르게 확인하는 것에 추가로, 다른 크기 및 형태 특성이 염색체 상태를 바르게 확인하기 위해 카테고리화되어야 한다. 분석은, 현상에 의해 부과되는 시간 제약(time constraint)에 의해 보다 어렵게 된다. 따라서, 현미경 사용자는 조사를 수행하기 위해 훈련받아야 한다. 가장 좋은 상태 하에서도, 처리는 지루하고, 오래 걸리고, 그리고 인간의 실수에 영향받는 것으로 판명되었다.
자동화된 현미경의 적용은 수동 접근법의 많은 단점을 극복할 잠재력을 갖는다. 자동화된 현미경은, 샘플 내 형광 도트를 신뢰성 있게 확인하고, 이의 색상을 정확하게 결정하고, 형태 및 크기에 기초하여 이들을 카테고리화하고, 그리고 시기 적절한 방식으로 인간 작업자 모두에 의해 도입되는 필연적인 개인적 요소(inevitable subjective factor) 없이 표적화된 상태의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 필요한 개략적 분석(summary analysis)을 수행할 수 있다.
암의 검출을 위한 키트는 전형적으로 긍정적 또는 부정적 답 - 사람이 특정 암을 갖는다 또는 아니다 - 만을 제공하도록 설계된다는 것을 유념해야 한다. 이러한 테스트는 중재 요법, 이를테면 화학요법의 필요성을 지시할 수 있지만, 이들은 가장 적당한 중재 요법의 방향으로 이끌도록 설계되지 않는다. 오히려, 암 환자는 많은 경우에 다수의 치료를 받고, 그리고 치료 효과는 치료의 시작 후 적절한 시점에 암 상태의 스냅-샷(snap-shot)에 의해 결정된다. 이러한 스냅-샷은, 예를 들어 종양의 성장 또는 축소를 결정하기 위해 신체의 MRI 및 CAT 스캔을 수반할 수 있다. 이러한 스냅-샷 방법은 상당한 경제적 비용과, 그 자체로서의 위험(예를 들어, 방사선 노출)을 수반할 수 있으므로, 이러한 스냅-샷은, 질환 상태를 해결하고자 신속한 개입의 필요성이 주어지면 요구될 수 있는 것보다 상당히 더 긴 간격으로 취해질 수 있다. 이하에 설명되는 바와 같이, 본 발명자들은 또한, 자동화된 현미경의 사용이, 사람이 특정 암/과형성증에 걸렸는지를 결정하기 위해서 뿐 아니라, 암/고등급 과형성증의 치료에 대한 상이한 중재 요법 접근법(interventional therapeutic approach)의 효능의 결정을 위한 모니터링 툴(tool)로서 유리하게 사용될 수도 있다는 것을 인식하였다. 일 실시형태에서, 치료 효능의 모니터링은 전신 순환(맥관구조(vasculature) 및 림프계 포함)에서 암/과형성증 세포를 모니터링하는 것에 의해 이루어지며, 암/과형성증과 관련된 비정상 세포 수의 감소가 치료 성공의 지시로서 취해지고, 그리고 이러한 세포의 감소도(degree of reduction)가 한 치료법의 다른 치료법에 대한 효능의 척도(guage)로서 사용된다.
형광 표지된 탐침을 포함하는, 검출가능하게 표지된 탐침으로 처리된 암 조직 샘플로부터 유래하는 이미지의 자동화 이미징 및 분석을 위한 필드(field)의 필요성이 존재한다. 부가적으로, 이러한 표지된 샘플의 편리하고, 신속하고, 손이 필요없는(hands-free) 자동화된 형광 현미경법의 필요성이 존재한다.
본 발명의 요약
다양한 실시형태가 본 명세서에 개시된다.
일 실시형태에서, 이하의 단계를 포함하는, 대상의 병변의 존재 및/또는 정도(extent)에 대한 자동화된 스크리닝 방법, 상기 병변은 대상의 세포 내 비정상적인 염색체 성분을 특징으로 함,
a) 상기 대상으로부터의 세포핵을 포함하는 생물학적 샘플을, 비정상의 특성을 나타내는 적어도 하나의 염색체 서열에 대한 하나 이상의 구별가능한 표지된 탐침과 적어도 하나의 서열에 대한 하나 이상의 탐침의 보합결합을 촉진하는 조건 하에, 접촉시키는 단계;
b) 자동적으로 염색체 서열에 보합결합된 하나 이상의 구별가능한 표지의 표현(representation)을 얻는 단계;
c) 상기 표현의 하나 이상의 표지의 결합 세기 및 분포를 자동적으로 분석하여, 비정상적인 염색체 성분의 존재 및/또는 정도를 결정하는 단계; 및
d) 단계 c)의 분석 결과를 자동적으로 보고하는 단계;
여기서, 단계 b) 내지 d)는 인간에 의한 개입 없이 실시됨.
스크리닝의 방법의 다양한 추가적인 실시형태에서, 자동화된 현미경 시스템은, 자동적으로 표현을 얻는 단계, 자동적으로 결합을 분석하는 단계, 그리고 자동적으로 결과를 보고하는 단계 중 하나, 및 일반적으로 모두를 실시한다. 이 방법에서, 표현을 얻고 그리고 자동화된 이미지 분석을 실시하는 것은, 병변의 핵산 성질 특성을 확인한다. 다양한 표적화된 염색체 비정상에는 단일 뉴클레오티드 다형(SNP), 돌연변이된 서열, 또는 복제된 유전자 또는 이의 일부가 포함될 수 있다. 탐침에 대한 염색체 표적에는 동원체, 또는 인간 염색체 3 또는 인간 염색체 7의 표적 서열, 및 TERC 유전자의 모두 또는 일부가 포함될 수 있다. 부가적인 실시형태에서, 비정상적이지 않은 것으로 알려진 염색체좌(chromosomal locus)에 대한 다양한 기준 탐침(reference probe) 또는 기준 염색(stain)이 사용되어, 표현(representing) 및 분석 단계가 기준 탐침 또는 염색을 참조하도록 할 수 있다.
부가적인 실시형태에서, 다음의 단계를 포함하는, 대상의 암, 고등급 과형성증 또는 고등급 이형성증과 관련된 비정상에 대한 자동화된 스크리닝 방법:
a) 대상으로부터 핵을 포함하는 생물학적 샘플을 얻는 단계;
b) 상기 샘플 내 핵을, 비정상과 관련된 염색체 서열에 대한 제 1 검출가능한 표지를 갖는 제 1 탐침과 표적화된 염색체좌에 대한 탐침의 보합결합을 촉진하는 조건 하에서, 접촉시키는 단계;
c) 보합결합 조건 하에서 샘플을, 비정상적이지 않은 것으로 알려진 염색체좌에 대한 검출가능하게 표지된 기준 탐침 및 기준 염색 중 적어도 하나와 접촉시키는 단계;
d) 자동적으로 염색체 서열에 속박된 표지를 이미징하고, 그리고 사용되는 경우에 염색을 이미징하는 단계;
e) 자동적으로 보합결합된 표지 및 사용되는 경우에 염색의 세기 및 분포에 대한 이미지를 분석하는 단계; 및
f) 자동적으로 단계 e)의 분석 결과를 보고하는 단계;
여기서, 단계 d) 내지 f)는 인간에 의한 개입 없이 수행되며;
이를 통해 대상의 비정상의 평가를 제공함.
이러한 스크리닝 방법의 일 실시형태에서, 핵이 샘플로부터 분리되고, 그리고 핵이 접촉 단계 전에 핵의 층을 형성하기 위해 배치된다(deposited). 추가적인 실시형태에서, 자동화된 현미경은 자동 이미징 단계, 자동 분석 단계, 및 결과의 자동 보고 단계 중 적어도 하나, 및 일반적으로 모두를 수행한다. 단일 층 핵 제조는, 이 기술분야에서 공지된 다수의 방법에 의해, 예를 들어, 파라핀-포매된 종양 조직 샘플로부터의 얇은 절편을 적당히 처리함으로써 가능하다. 이 방법에서, 대상으로부터 얻어진 샘플의 매우 다양한 기원이 생각될 수 있다. 이러한 스크리닝의 방법의 부가적인 실시형태에서, 자동화된 현미경이, 자동적으로 이미지를 제공하고, 이미지가 발생하는 필드를 현미경이 자동적으로 최적화하는 이미지를 얻고, 그리고 이미지의 자동 분석을 수행하기 위해 샘플의 필드에서 둘 이상의 면들로부터 이미지를 얻는 것을 포함하는, 방법의 다양한 스테이지에서 사용된다. 다양한 실시형태에서, 비정상은, 암, 고등급 과형성증 또는 고등급 이형성증이 될 수 있다. 탐침에 의해 표적화된 다양한 비정상에는 단일 뉴클레오티드 다형, 돌연변이된 서열, 또는 복제된 유전자 또는 이의 일부가 포함될 수 있다. 부가적으로, 특정 실시형태에서, 탐침은 염색체 3의 동원체, 염색체 7의 동원체, 또는 TERC 유전자 또는 이의 일부를 포함하는 서열을 표적화한다.
또다른 실시형태에서, 환자의 암 또는 고등급 과형성증의 치료에서 치료 과정의 시간에 걸친 효능을 모니터링하기 위한 자동화된 방법이 개시된다. 이 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 환자로부터 암 또는 고등급 과형성증과 관련된 세포가 발견된 유체 생물학적 샘플을 얻는 단계;
(b) 상기 유체 생물학적 샘플 또는 이의 일부를, 상기 암 또는 고등급 과형성증과 관련되거나, 또는 그 증폭이 암 또는 고등급 과형성증과 관련되는, 하나 이상의 염색체좌에 대해 고도의 서열 유사성을 가지는 하나 이상의 검출가능하게 표지된 염색체 탐침으로 처리하는 단계, 여기서 처리는 샘플 내 염색체에 대한 상기 탐침의 보합결합을 가능하게 하기에 충분한 조건 하에서 실시됨;
(c) 자동적으로 상기 처리된 유체 생물학적 샘플을 스캐닝하고 그리고 샘플 내 어떤 염색체에 보합결합되는 하나 이상의 염색체 탐침에 속박된 상기 하나 이상의 표지를 검출하는 단계;
(d) 자동적으로 상기 염색체 탐침에 보합결합된 상기 염색체와 관련된 세포의 수를 검출하는 단계;
(e) 자동적으로 치료 처리(therapeutic treatment) 과정의 상이한 시기에 단계 (c) 및 (d)에서 제공된 세포수 및 표지 결과의 보합결합 패턴을 비교하고, 이에 의해 암 또는 고등급 과형성증의 치료에서 치료의 효능을 평가하는 단계.
일 실시형태에서, 모니터링은 1일 이상의 간격으로 수행된다. 효능을 모니터링하기 위한 이 방법의 다양한 실시형태에서, 유체 생물학적 샘플은 혈액, 림프, 소변, 삼출 유체, 상피 스크레이핑(epithelial scraping), 세척 유체(lavage fluid), 흡인 유체, 및 가래(sputum) 중 하나 이상을 포함한다. 효능을 모니터링하기 위한 이 방법의 추가적인 실시형태에서, 자동화된 현미경 시스템은 적어도 하나의 자동 스캐닝을 수행하고 그리고 자동 검출은 자동화된 현미경 시스템을 사용하고, 샘플을 스케닝하는 필드를 자동적으로 최적화하고, 그리고 추가로 샘플의 필드에서 둘 이상의 면을 스캐닝한다. 다양한 실시형태에서, 자동화된 현미경 시스템은 인간에 의한 개입 없이 작동한다. 또다른 부가적인 실시형태에서, 탐침은 단일 뉴클레오티드 다형(SNP), 돌연변이된 서열, 복제된 또는 증폭된 유전자 또는 이의 일부, 염색체 3의 동원체, 염색체 7의 동원체, 및 TERC 유전자 또는 이의 일부를 포함하는 서열 중 하나 이상을 표적화한다.
또다른 실시형태에서, 염색체 비정상의 자동화된 고도 스루풋(throughput) 특징화 방법이 개시된다. 이 방법은 다음의 단계를 포함한다:
a) 상부에 생물학적 샘플을 포함하는 적어도 하나의 현미경 슬라이드를 제공하는 단계, 여기서 샘플은 염색체 비정상을 갖는 것으로 의심되고, 그리고 샘플은 비정상의 검출에 특이적인 적어도 하나의 검출가능하게 표지된 탐침에 보합결합되었음;
b) 적어도 하나의 샘플을 갖는(sample-bearing) 슬라이드를, 자동화된 현미경의 스테이지 상에 있는 슬라이드의 자동화된, 가역적 배치를 위한 수단 내에 설치하는(installing) 단계;
c) 배치 수단이, 자동적으로 그리고 가역적으로 샘플을 갖는 슬라이드를 위치시켜, 현미경 스테이지 상에 가역적으로 위치되도록 하는 단계;
d) 현미경이 자동적으로 표본의 적어도 하나의 이미지를 얻도록 하는 단계, 여기서 상기 이미지는 염색체에 보합결합된 표지된 탐침의 표현을 포함함;
e) 현미경이, 자동적으로 이미지를 분석하여 비정상을 특징화하도록 하는 단계;
f) 자동적으로 단계 (e)의 분석 결과를 보고하는 단계; 및
g) 자동적으로 단계 (c)-(f)를 반복하는 단계.
다양한 실시형태에서, 자동화된 현미경은 인간에 의한 개입 없이 작동한다. 이러한 고도 스루풋 방법의 부가적인 실시형태에서, 자동 현미경은 이미지가 발생하는 필드를 최적화함으로써 자동적으로 이미지를 얻고, 그리고 핵의 필드 내 둘 이상의 면으로부터 이미지를 얻는다. 생물학적 샘플은 어떤 다양한 조직 및 생물학적 유체에서 유래할 수 있다. 또한, 비정상은 암, 고등급 과형성증 또는 고등급 이형성증일 수 있다. 고도 스루풋 방법에 사용된 탐침에 의해 표적화된 다양한 비정상에는, 단일 뉴클레오티드 다형(SNP), 돌연변이된 서열, 복제된 또는 증폭된 유전자 또는 이의 일부, 염색체 3의 동원체, 염색체 7의 동원체, 및 TERC 유전자 또는 이의 일부를 포함하는 서열 중 하나 이상이 포함될 수 있다.
추가의 실시형태는 순서대로 다음을 포함하는 방법을 개시한다: (a) 염색체 물질의 하나 이상의 일부에 대해 고도의 서열 유사성을 갖는 하나 이상의 염색체 탐침을, (만일 있다면) 샘플 내 염색체에 대한 탐침의 보합결합을 가능하게 하기에 충분한 조건 하에서, 생물학적 샘플에 보합결합하는 단계, 상기 탐침은 검출기에 의해 검출가능한 하나 이상의 태그로 태깅되는 것을 특징으로 함; (b) 생물학적 샘플을 자동적으로 스캐닝하고 그리고 샘플 내 어떤 염색체에 보합결합되는 하나 이상의 염색체 탐침과 관련된 하나 이상의 태그(들)를 검출기로 검출하는 단계; 및 (c) 만일 있다면 보합결합된 탐침으로 태깅되는 샘플 내에 있는 염색체 및 상기 염색체와 관련된 특정 탐침을 자동적으로 보고하는 단계.
본 명세서에 개시된 방법의 다양한 실시형태에서, 동원체 탐침은, 복제 또는 존재가 특정 암 상태와 관련되는 유전자좌(loci)를 하우징하는(house) 것으로 알려진 염색체에 유도될 수 있다. 예를 들어, 동원체 탐침은 염색체 3 및/또는 염색체 7에 유도될 수 있다. 염색체좌 특이적인 탐침은, 단일 카피 서열(single copy sequence)에 대한 것일 수 있고, 마찬가지로 암과 관련된 유전자좌(loci), 이를테면 염색체 3의 q 아암 상의 유전자좌와 보합결합될 수 있다. 탐침 자체는 유리하게는, 샘플 내 염색체에 대한 탐침의 보합결합을 가능하게 하기에 충분한 조건 하에서, 특정 암(들)/과형성증과 관련되거나, 또는 그 증폭이 특정 암(들)/과형성증과 관련되는, 유전자좌와 관련된 염색체 물질의 하나 이상의 일부에 대한 고도의 서열 유사성을 가질 수 있다. 탐침은 예를 들어, 염색체 위치 3q26의 TERC 유전자를 함유하는 네개의 오버래핑 BAC 클론으로 구성되는 콘티그(contig)가 될 수 있다. 부가적인 동원체 또는 유전자좌 특이적인 탐침이 탐침 혼합물에 첨가될 수 있다. 핵 염색은 대조염색(counterstain) 과정에 의해 가능하다. 핵 염료는, 예를 들어 DAPI가 될 수 있다. 샘플을 자동적으로 스캐닝할 때, 샘플은 한 시야 필드(field of view)로부터 다른 시야 필드로 자동적으로 움직이는 자동화된 현미경 상에 로딩될 수 있다. 현미경은, 다수의 신호 채널의 모니터링을 허용하도록 프로그래밍될 수 있거나 또는 이와 달리 작동가능하게 배치될 수 있다. 예를 들어, 자동화된 현미경은, DAPI 및 다른 형광 채널 내에서 (예를 들어, 염색체 3, 3q 상의 유전자좌에 대한 신호, 및 다른 동원체 또는 유전자좌 특이적 신호를 열거하기 위해(enumerate)) 스캐닝할 수 있다. 스캐닝된 핵은 자동화된 현미경에 의해 자동적으로 기록될 수 있고, 및/또는 세포유전학자(cytogeneticist) 및/또는 병리학자, 또는 다른 건강 관리자에게 보고될(present) 수 있다. 보고(presentation)는 다수의 방식으로, 이를테면 먼저 보고된 비정상 카운트(count)(예를 들어, 먼저 보고된 3q의 2와 같지 않은 카운트)를 갖는 것과 소팅된 방식으로 이루어질 수 있다. 자궁경부암(cervical cancer)과 같은 상이한 암이 검출될 수 있다(예를 들어, 염색체 3 및/또는 염색체 7에 대한 동원체 탐침 및 염색체 위치 3q26의 TERC 유전자를 함유하는 네개의 오버래핑 BAC 클론으로 구성되는 콘티그 또는 이의 일부를 포함하는 염색체 3의 q 아암 상의 단일 카피 서열에 대한 유전자좌 특이적 탐침 사용, DAPI 핵 대조염색, 및 이어서 염색체 3, 3q 상의 유전자좌에 대한 신호 열거(enumerating), 그리고 3q 관련된 신호의 2와 같지 않은 비정상 계수를 조사(finding)를 이용).
이러한 실시형태에서의 자동 스캐닝은, 예를 들어 생물학적 표본이 현미경 스테이지 상에 수동적으로 또는 자동적으로 로딩된 슬라이드 상에 위치되고 그리고 슬라이드가 자동적으로 스캐닝되는 자동화된 현미경에 의해 수행될 수 있다. 이러한 시스템에 사용될 수 있는 자동화된 현미경은 본 출원인의 다른 특허 출원에 기재된 것과 같다(이하 참조). 스캐닝은 생물학적 샘플이 위치되는 다른 기판 상에서/내에서 될 수도 있다. 스캐닝은 생물학적 샘플을 한 면에서, 또는 하나 이상의 면에서, 이를테면 예를 들어 2, 3 또는 그 이상의 면에서 스캐닝하는 것을 포함할 수 있다. 다수의 면들에서 스캐닝함으로써, 샘플 내 세포들의 총수의 관점에서 드물 수 있는 비정상 세포의 검출이 상당히 개선될 수 있다. 탐침은, 형광 신호가 검출기에 의해 검출되는(picked up) FISH 탐침을 사용할 수 있다. 탐침은 다른 입력 신호가 있거나 또는 없이 신호를 생산할 수 있다, 예를 들어 이들은 활성화 신호(이를테면 적당한 파장의 광 또는 전자기 방사선)에 의해 영향받을 때 방사성이 되거나, 또는 형광을 낼 수 있다. 탐침은 상이한 복제 관련된 암 유전자좌에 유도될 수 있고, 그리고 상이한 형광 태그를 포함하여 상이한 신호를 생산할 수 있다. 검출기는 태그에 의해 생산될 수 있는 신호(들)에 따라 선택될 수 있으며, 예를 들어 형광 검출기는 형광 태그를 검출하기 위한 것이고, 검출기는 형광 태그에 의해 생산된 특정 형광 신호의 검출을 허용하도록 작동가능하게 배치된다. 보고(reporting)에는, 특정 염색체와 관련된 특정 태그의 단순한 보고가 포함될 수 있고, 및/또는 자동 진단(염색체의 특정 보합결합 패턴과 관련된 암의 타입을 지시함)이 포함될 수 있다. 벡터값은 정상 표본과 비교될 때 특정 임계값 미만, 이를테면 약 60 미만, 약 40 미만, 약 30 미만, 약 20 미만, 약 10 미만 또는 약 0.500 미만이 되도록 선택될 수 있다. 유용한 시스템은 다수의 신호 채널에서 한 번에, 또는 서로 비교적 짧은 기간(예를 들어 1 분 미만) 내에 자동 스캐닝 및 검출하는 것을 포함할 수 있다. 시스템은 실시간으로, 동시에 또는 동시발생적으로(concurrently) 다수의 신호들의 각각(또는 동일한 것들의 혼합)을 처리하도록 작동가능하게 배치되어, 염색체 영역, 및/또는 국부적 복제의 신속한 검출을 허용하고, 이는 하나 이상의 특정 암/과형성증을 지시한다.
발명의 상세한 설명
본 명세서에서 사용될 때, "태그" 및 "표지"는 동의어로 특정 검출 방법 및 양상에 의해 검출가능한 탐침을 만들기 위해 탐침에 접합된 잔기에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용될 때 "탐침"은 일반적으로 세포 표적에 결합하도록, 그리고 표적으로 의도되지 않는 세포 잔기 또는 구조에 유의성 있게 결합하지 않도록 특이적으로 설계된 물질에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에서, 탐침은, 그 서열이 세포 염색체 또는 다른 핵산 내 표적 서열에 충분히 상보적인 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드, 또는 적당한 조건 하에 후자의 구조에 보합결합하기 위한 다른 핵산이 될 수 있다. 다양한 부가적인 실시형태에서, 탐침은 세포 구조를 특이적으로 표적화하는 특이성 결정 결합 부위(specificity determining binding site)를 갖는 항체 또는 이의 일부가 될 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, "표현(representation)"은 일반적으로 생물학적 샘플을 조사하기 위한 특정 검출 방법을 사용하여 얻어진 결과를 특징화하는 정보의 어떤 시각적, 그래픽적, 수치적 또는 유사한 어셈블리에 관한 것이다. 비제한적 예로서, 표현에는 생물학적 샘플의 적어도 일부를 포함하는 현미경 필드의 이미지, 예를 들어 필드 내 특정 특징들(features)에 색상값들을 부여함으로써 정보를 전달하기 위한 컴퓨터 구동 수단에 의해 추가로 변형된 이미지, 샘플의 이미지로부터 유래된 특정 특징들을 특징화하는 그래픽 표현, 및 이미지로부터 유래된 특징들을 특징화하는 언어 엔트리들(verbal entries) 또는 값들의 표가 포함된다.
본 명세서에서 사용될 때, "표적", "표적화된", "표적화" 및 유사한 단어들 또는 어구들은 일반적으로, 탐침이 특이적으로 유도되는 세포 구조에 관한 것이다. 표적은, 탐침 및 표적으로 구성된 특이적 결합 쌍의 멤버인 어떤 구조 또는 성분이다. 탐침 및 표적은 서로 결합하기 위해 고도의 특이성 및 친화도를 가지고, 그리고 인식이 의도되지 않는 탐침에 대해, 또는 표적에 대해 각각 낮은 특이성 및 낮은 친화도를 갖는다. 핵산 또는 적어도 염기의 특이적 서열을 포함하는 탐침에 대해, 표적은 세포의 염색체 또는 핵산 성분에서 발견되는 상보적인 서열이다. 항체 또는 이의 특이적 결합 단편인 탐침에 대해, 표적은 세포에서 발견되는 항원 또는 합텐(hapten) 구조가 될 수 있다. 이러한 골격에서, 탐침은 "표적화" 잔기이고, 그리고 표적 구조는 탐침에 의해 "표적화" 된다.
본 명세서에서는, 신호의 자동화된 검출을 이용하는, 암 및 과형성증, 특히 고등급(high grade) 과형성증을 검출 및 모니터링하기 위한 시스템 및 방법이 제공된다.
대표적인 실시형태에서, 생물학적 샘플은 검출가능한 태그를 갖는 하나 이상의 염색체 탐침으로 조사된다(interrogated). 염색체 탐침은 과형성증 또는 암, 이를테면 고등급 과형성증과 관련된 요소를 지시하는 염색체 물질의 하나 이상의 부분에 대해 고도의 서열 유사성을 갖도록 선택 및/또는 구성될 수 있다. 탐침은, 이들이, 암/과형성증을 지시하거나, 또는 그 증폭이 암/과형성증과 관련되는 염색체 상의 영역과 관련되도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 염색체 상의 특정 유전자좌의 복수의 복제는 암/과형성증을 지시될 수 있다. 탐침 상의 태그는 유리하게는 직접적으로 또는 간접적으로 (예를 들어, 태그의 일부분에 대한 또다른 검출가능한 분자의 결합에 의해) 검출가능하다. 한 경우에, 태그는 FISH(형광 동소 보합결합)에서와 같이 형광이다. 태깅된 탐침 및 관심 대상인 유전자좌 간의 보합결합을 촉진하기 위해, 보합결합은 보합결합하기에 충분한 조건 하에서 실시되어야 한다. 이러한 실시형태에서, 샘플은 태그를 검출할 수 있는 검출기를 사용하여 자동적으로 스캐닝된다. 자동 스캐닝은 인간 개입의 필요성 없이 다수의 시야 필드를 통해 샘플을 조사하도록 작동가능하게 배치되는 자동화된 현미경에 의해 가능하다. 태그를 특정 염색체와 관련시키는 능력은, 보합결합 프로파일이 과형성증 또는 암, 이를테면 고등급 과형성증을 지시하는지를 결정할 수 있도록 한다. 이러한 관련은, 암/과형성증이 거기에 있는지 여부의 결정을 허용한다. 선택적으로, 이러한 실시형태의 시스템은, 염색체와 관련되는 특정 탐침 및 보합결합된 탐침으로 태깅되는 샘플 내 염색체를 자동적으로 보고하기 위한 수단, 예를 들어 소프트웨어, 하드웨어, 또는 소프트웨어/하드웨어 조합을 포함할 수 있다. 보합결합에 기초한 자동 진단은 또한 자동화된 현미경 시스템의 일부로서 제공될 수 있다.
또다른 대표적인 실시형태에서, 암 또는 과형성증, 이를테면 고등급 과형성증을 치료하기 위한 치료의 효능을 모니터링하기 위한 방법 및 시스템이 제공된다. 모니터링은, 환자가 치료되고 있음에 따라 치료 방법의 효능을 알아보기 위해 시간에 걸쳐 실시될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 혈액, 림프, 및 삼출 유체, 세척 유체, 또는 흡인 유체와 같은 쉽게 이용가능한 유체 샘플이, 암 및/또는 과형성증을 치료하기 위한 치료 하에 환자로부터 취해진다. 이렇게 얻어진 어떤 샘플은 그 안에, 암 또는 고등급 과형성증의 검출가능한 염색체 비정상 특성을 갖는(harboring) 것으로 의심되는 세포를 포함하는 유핵 세포(nucleated cell)를 갖는다. 이어서, 샘플은, 예를 들어 유체 샘플에 포함된, 비정상 샘플과 관련된 증폭을 검출하기 위해, 염색체 물질 내 특이적 유전자좌 또는 영역과 보합결합되는 염색체 탐침으로 처리된다. 선택적으로, 상이한 유전자좌에 대한 다수의 탐침이, 이의 둘 이상이 특정 암/과형성증과 관련됨, 사용될 수 있다. 이러한 조합의 사용은 암/과형성증의 검출 효율을 개선할 수 있다. 이러한 다수의 탐침은 유리하게는 상이한 형광 태그와 같은 상이한 태그들로 태깅된다. 태그는 자동화된 스캐닝 장치, 이를테면 자동화된 현미경과 관련된 검출기에 의해 판독가능하도록 선택되며, 이는 인간 개입 없이 샘플의 이산 영역(discrete area)을 반복적으로 조사하도록 작동가능하게 배치된다. 샘플내 염색체에 보합결합되는 하나 이상의 염색체 탐침과 관련된 태그를 검출함으로써, 암/과형성증을 나타내는 보합결합 패턴이 보이는지를 결정할 수 있다. 염색체 탐침에 의해 보합결합된 염색체와 관련된 세포의 수를 자동적으로 검출함으로써 개선이 이루어질 수 있다. 즉, 비정상적인 염색체 보체를 지시하는 유체 내 세포의 수가 보다 앞선 시기에 관찰된 세포의 수보다 적거나 또는 많은지를 판단함으로써, 사용되는 치료가 치료되는 암/과형성증의 치료에 효과적인지를 결정할 수 있다. 이와 같이, 특정 암에 대한 특정 정의된 치료의 효능은 시간에 걸친 생물학적 샘플 내에서 검출된 세포의 수의 변화에 기초한다. 예를 들어, 치료 전보다 치료 후에 더 적은 세포가 관찰된다면, 치료가 되고 있는 것으로 결정될 수 있다. 상이한 치료가 또한 이러한 순환하는 비정상적인 세포에서 관찰되는 감소도에 의해 비교될 수 있다.
암 또는 과형성증을 치료하기 위한 치료의 효능을 모니터링하기 위한 방법 및 시스템을 제공하는 방법의 변형법에서, 환자는 의료 또는 병원 시설에 가는 것과 별도로 샘플을 제공할 수 있다. 예를 들어, 환자는 본 명세서에 기재된 방법에 의한 연이은 분석용 혈액 샘플을 얻기 위한 키트, 시스템, 또는 유사한 장비가 제공될 수 있다. 이러한 비제한적 예에서, 한 방울 또는 몇 방울과 같은 적은 부피의 샘플 혈액이 채취되고, 선택적으로 응고를 막기 위해 처리되고, 선택적으로 슬라이드 상에 배치되고, 또는 이와 달리 연이은 분석에 적합한 상태에서 유지된다. 이러한 샘플을 축적하는(accumulating) 일정계획(scheduling)에는, 매일 샘플링, 또는 2일에 1회, 또는 1주에 2회, 또는 매주마다, 또는 2주마다 또는 달마다, 또는 보다 넓은 간격으로 샘플링하는 것이 포함될 수 있다. 샘플은 건조된(dessicated) 챔버 내에 저장될 수 있고, 그리고 선적 또는 수송, 및 연이은 분석을 기다리면서 냉장 또는 냉동될 수 있다.
대표적인 실시형태에서, 염색체 3q의 증폭과 관련되는 암/과형성증, 이를테면 고도 과형성증의 검출에 사용될 수 있는 시스템/방법이 또한 기재되어 있다. 일실시형태 방법에서, 간기(interphase) FISH 보합결합을 위한 핵의 단일 층 제조가 이루어진다. 예를 들어, 핵의 층은, 핵 스미어(nuclear smear)를 제공하기 위해 파라핀-포매된(paraffin-embedded) 종양 조직 샘플로부터의 얇은 절편(thin section)을 적당히 처리한 후에 얻어질 수 있다. 이어서, 핵 스미어가 염색체 3 또는 염색체 7에 대한 동원체 탐침을 사용하여 염색된다. 연이어, 앞서, 또는 동시발생적으로, 핵 스미어는 관심 대상인 암/과형성증 상태를 지시하는 염색체 3의 q 아암 상의 단일 카피 서열에 대한 유전자좌 특이적 탐침으로 염색된다. 예를 들어, 탐침은 염색체 위치 3q26의 TERC 유전자를 함유하는 네개의 오버래핑 BAC 클론으로 구성되는 콘티그 또는 이의 일부가 될 수 있다. 다른 동원체 또는 유전자좌 특이적 탐침이 탐침 혼합물에 첨가될 수 있다. 한 유리한 측면에서, 각 탐침은 개별 신호의 보다 용이한 검출을 허용하기 위해 상이한 형광색소(fluorochrome)로 표지된다. 선택적으로, 스미어는 DAPI와 같은 핵 염료로 대조염색될 수 있다. 이어서, 염색된 스미어가, 자동화된 현미경과 같은 자동화된 스캐닝 장치에 적용되고, 그리고 염색체 3, 3q 상의 유전자좌에 대한 신호 및 어떤 다른 동원체 또는 유전자좌 특이적 신호를 열거하기 위해 요구되는 만큼 많은 형광 채널 및 DAPI에서 자동적으로 스캐닝된다. 스캐닝된 핵은, 이를 검토하기 위한 세포유전학자 또는 병리학자와 같은 건강 관리 전문가에게 보고될 수 있다. 건강 관리 전문가에게의 보고는, 예를 들어 먼저 보고된 3q 관련된 신호의 비정상적인 계수(예를 들어 2와 같지 않음)를 갖는 핵과 같이 소팅된 방식이 될 수 있다. 대안적으로, 또는 결합하여, 시스템은 예비-프로그래밍된 알고리즘(예를 들어)에 기초한 스캐닝된 핵을 분석하도록 그리고 건강 관리자에게 자동화된 진단 표시를 제공하도록 (예를 들어 프로그램에 의해) 작동가능하게 배치될 수 있다. 이러한 테스트는 자궁경부암을 포함하는 다수의 암을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
생물학적 샘플의 현미경 분석을 실시하기 위한 자동화된 장치 및 방법은 진단 절차를 강화시키고 그리고 현미경에 기초한 진단 시설 내 샘플의 스루풋을 최적화한다. 로봇 현미경 시스템은 공동-소유되고 2007년 8월 2일자로 출원된 미국 특허 출원 제 11833203호에 기재되어 있다. 이의 개시내용 가운데, 제 2 표면을 따라 교환가능한 집적화된 현미경 시스템이 제공된다. 집적화된 현미경 시스템에는 완전 차광 인클로저(light-tight enclosure) 내에 하우징된 자동화된 로봇 현미경 시스템이 포함된다. 이 시스템에서, 자동화된 로봇 현미경 시스템에는 (i) 스테이지를 갖는 현미경; (ii) 스테이지 상에 위치가능한(positionable) 적어도 하나의 표본 슬라이드; (iii) 슬라이드를 조명하는 광원; (iv) 표본의 이미지를 캡처하는 이미지 캡처 장치; 및 (v) 상기 표본 슬라이드, 상기 광원, 및 상기 이미지 캡처 장치와 연통하고 그리고 이의 위치화(positioning)를 제어하는 전기, 전자 및/또는 컴퓨터-구동 수단이 포함된다. 또한,이 시스템에서, 완전 차광 인클로저(light-tight enclosure)에는 상기 인클로저 내부의 적어도 하나의 선반, 여기서 상기 자동화된 로봇 현미경 시스템은 선반 상에 위치됨; 및 인클로저 외부의 위치로부터 관찰가능한 상기 인클로저의 표면에 배치되는, 관찰되거나 또는 분석되는 현미경 필드의 표현 또는 이미지를 디스플레이할 수 있는 뷰(viewing) 모니터가 포함된다.
동적 자동화된 현미경 작동 및 슬라이딩 스캐닝 시스템이 공동-소유되고 2007년 8월 3일자로 출원된 미국 특허 출원 제 11833594 호에 기재되어 있다. 개시된 실시형태에는, 현미경 슬라이드 스테이지, 조명 에너지의 적어도 하나의 소스, 적어도 하나의 전자 이미징 장치, 적어도 하나의 교환가능한 성분 캐러셀(carousel) 및 동기화 제어기(synchronization controller)를 포함하는 동적 스캐닝 현미경을 사용하여 현미경 슬라이드 상에 장착된 표본을 동적으로 스캐닝하기 위한 방법 및 자동화된 현미경이 포함된다. 예시적인 자동화된 현미경은, 조사를 실시하기 위해 요구되는 시간을 상당히 감소시키고, 시스템에 도달하는 진동을 감소시키고, 그리고 진단 결과를 제공하는 능력을 갖는다. 이미징 처리동안, 스테이지 및 칼라 필터 휠은 이전의 접근법에서와 같은 정지상(stationary)이라기보다는 일정한 움직임이 있다. 각각의 움직이는 하부-시스템(sub-system) 상의 실시간 위치 센서는 스테이지 장착된 슬라이드 및 칼라 필터 휠의 즉각적인 위치를 정확히 원격 계측한다(telemeter). 칼라 필터 휠은, 각각의 필터 파장에서, 각 이미징 위치 및 초점 면에서, 이미지의 캡처를 허용하기에 충분한 속도로 회전한다.
자동화된 현미경 시스템에서 사용하기 위한 교환가능한 대물 렌즈, 필터, 및 유사한 요소가 공동-소유되고 2007년 8월 2일자로 출원된 미국 특허 출원 제 11833154호에 기재되어 있다. 이 출원은 일반적으로 원격 작동되거나 또는 로봇식으로 제어된 현미경, 및 특히 대물 렌즈 어셈블리, 필터 및/또는 다른 광학 성분을 자동적으로 교환하기 위한 수단의 기계화(mechanization)에 관한 것이다. 광학 경로 내 광학 성분을 교환하기 위한 장치가 개시되며, 이는 회전가능한 모터 샤프트(shaft)를 갖는 제어 모터; 제어 모터를 지지하는 지지 구조; 평면 베이스(planar base) 상의 중앙점(central point)에 대해 일반적으로 대칭인 외면에 의해 정의된 평면 베이스, 평면 베이스는 베이스 중앙으로부터 동일한 거리에 등각으로 위치된 복수의 광학 성분을 하우징하는 복수의 장착 설치물(mounting fixture), 그리고 일반적으로 이의 중앙에 대해 평면 베이스의 대칭 회전을 유발하여, 선택되는 특정 광학 성분이 광학 빔 내에 위치되는 메커니즘을 포함한다.
자동화된 현미경 시스템에 사용하기 위한 자동화된 현미경 스테이지는, 공동-소유되고 2007년 8월 2일자로 출원된 미국 특허 출원 제 11833183호에 기재된다. 이 출원은 일반적으로 현미경의 광학축을 따라 조정가능하게 이동가능한 현미경 스테이지에 관한 것이다. 예를 들어, 베이스 플레이트; 광학 축의 방향을 따라 어셈블리의 대체(displacement)를 허용하도록 작동가능하게 배치된 상기 베이스 플레이트 상에 이동가능하게 장착된 현미경 스테이지 어셈블리; 및 상기 현미경 스테이지 어셈블리에 고정된 현미경 슬라이드 홀딩(holding) 수단을 포함하는, 현미경의 광학 축의 방향을 따라 조정가능한 현미경 슬라이드 마운트가 개시된다.
자동화된 현미경 시스템에 사용하기 위한 자동화된 현미경 슬라이드 카세트 및 슬라이드 취급(handling) 시스템이 공동-소유되고 2007년 8월 3일자로 출원된 미국 특허 출원 제 11833517호에 개시되어 있다. 이 출원은, 이격된(spaced) 평행한 배치로 슬라이드를 홀딩하기 위해 배치된 복수의 슬롯들을 정의하는 카세트 내에 하우징된 슬라이드를 제거 및 대체하기 위한 메커니즘을 개시한다.
자동화된 현미경 시스템 내에 사용하기 위한 자동화된 현미경 슬라이드 로딩 및 언로딩 메커니즘이 공동-소유되고 2007년 8월 3일자로 출원된 미국 특허 출원 제 11833428호에 기재된다. 예시적인 실시형태는 현미경 슬라이드 조작(manipulation) 장치를 개시하며, 이는 베이스 구조; 스루-보이드(through-void)를 정의하는 슬리브, 상기 슬리브는 제 1 단부(end) 및 제 2 단부를 가지고, 상기 제 2 단부는 상기 베이스에 고정되고, 그리고 상기 슬리브는 상기 베이스에 수직으로 배향됨; 슬리브 스루-보이드 내 길이방향 샤프트의 축(axial) 및 길이방향 움직임을 허용하는 방식으로 슬리브 스루-보이드 내에 부분적으로 위치된 가공의(imaginary) 길이방향 축(axis)에 대해 대칭인 길이방향 샤프트, 상기 길이방향 샤프트는 샤프트 제 1 단부 및 샤프트 제 2 단부를 가지고, 상기 샤프트 제 2 단부는 슬리브 스루-보이드 내에 위치되고 그리고 상기 샤프트 제 1 단부는 슬리브 제 1 단부를 넘어 돌출되고 그리고 슬리브 가공의 길이방향 축으로의 한 면에 평행 트랙 구조(parallel track structure)를 포함함; 상기 슬리브 제 1 단부 상의 평행한 트랙 구조들 사이에 슬라이드가능하게 위치된 플레이트, 상기 플레이트는 제 1 플레이트 단부 및 제 2 플레이트 단부를 가지고, 상기 제 1 플레이트 단부 또는 제 2 플레이트 단부 중 하나는, 현미경 슬라이드의 폭에 대응하는 각 갈라진 가닥(prong) 사이의 보이드 영역을 정의하는 둘로 갈라진 포크(two-pronged forked) 구조를 가지고, 그리고 여기서 상기 포크는 이의 에지를 따라 현미경 슬라이드의 그립핑(gripping)을 허용하도록 작동가능하게 배치된 그립핑 구조(gripping structure)를 가짐, 을 포함한다.
자동화된 현미경 시스템을 구동하기 위해 사용가능한, 생물학적 샘플로부터의 형광 신호의 현미경 검출을 구동하기 위한 컴퓨터-상주 프로그램을 사용하는 자동화된 방법이 공동-소유되고 2007년 8월 3일자로 출원된 미국 특허 출원 제 11833849호에 개시된다. 본 명세서에 개시된, 다수의 샘플의 고도 스루풋 분석을 위해 적합화될 수 있는(adaptable), 현미경 분석의 예시적인 방법에는, 슬라이드 스테이지, 적어도 하나의 대물 렌즈, 이미지 캡처링 수단, 프로토콜에 따라 현미경을 작동하기 위한 프로그래밍가능한 수단, 및 분석 결과를 제공하기 위한 프로그래밍가능한 수단을 포함하는 자동화된 현미경을 제공하는 단계; 샘플 및 상부에 문의성 데이터(interrogatable data)를 포함하는 현미경 슬라이드를 제공하는 단계, 여기서 문의성 데이터는 상기 샘플의 분석을 위한 프로토콜과 관련된 정보를 제공함; 데이터를 문의하는(interrogating) 단계; 슬라이드 스테이지 상에 슬라이드를 위치시키는 단계; 현미경이, 문의성 데이터 내에 암호화된 분석 프로토콜에 따라 샘플을 분석하도록 하는 단계; 및 현미경이 샘플을 표현하는(representing) 분석 결과를 제공하도록 하는 단계가 포함된다. 이미지 처리를 위한 FISH 어세이 실시에 현미경을 구동하기 위해 컴퓨터 상주 프로그램을 사용하여 현미경을 자동 작동하는 것은, 공동-소유되고 2007년 8월 2일자로 출원된 미국 특허 출원 제 11833204호에 기재된다. 자동화된 형광 동소 보합결합법을 실행하기 위해 사용될 수 있는 다양한 이미지 처리 기능을 수행하는 실시형태가 개시된다. 실시형태는, 디지털 전자 기기의 동적 범위를 초과하는 세기 범위에 걸쳐 샘플의 모든 영역을 허용가능하게 이미징하기 위한 자동-노출 방법(auto-exposure method); 샘플 내 표적을 알아내는 형광 동소 보합결합 관심-대상물(objects-of-interest)의 열거를 위한 방법; 열거된 관심-대상물을 분류하고 그리고 특징화하기 위한 방법인 핵 확인; 확인된 관심 대상물의 형태를 정의하기 위한 방법인 핵 분절화(segmenting nuclei)를 포함한다. 이 방법의 실시형태는 세포 핵을 특징화하거나, 또는 염색체를 열거하기에 유용하다.
앞선 문단에 기재된 자동화된 현미경 시스템은 컴퓨터-상주 및 컴퓨터-실행(computer-implemented) 지시의 제어 하에 작동한다. 따라서, 시스템은 인간 개입 없이 샘플의 자동화된 검출 및 분석을 허용한다. 자동화된 슬라이드 카세트 및 자동화된 슬라이드 로딩 및 언로딩 메커니즘은 복수의 샘플의 무인(unattended) 고도 스루풋 분석을 허용한다.
본 명세서에 개시된 방법은, 세포가 발암(carcinogenesis) 동안 체세포 유전자(somatic gene) 복제 또는 유전자 증폭을 겪은 유전자를 갖는 것으로 의심되는 조직 표본의 검출 및 분석을 자동화하는 것에 관한 것이다. 이 방법으로 컴퓨터 구동된 이미지 축적, 및 얻어진 이미지의 컴퓨터 구동된 분석과, 이러한 분석의 결과를 다양한 포맷으로, 이 방법을 인간 개입으로부터 상당한 범위까지 자유롭게 하는 자동화된 절차로 보고하는 것이 가능하다. 보고서는 비제한적인 예로서, 차트, 표, 슬라이드 상 필드의 표현의 이미지 등의 형태로 제공될 수 있다. 보고서는 파일 또는 레코드와 같은 디지털 포멧이고, 그리고 이처럼 검토를 위해 국부적인 또는 멀리 떨어진 위치에 편리하게 산재된다(disseminated). 본 명세서에 참조되는 성분 및 소프트웨어를 포함하는 시스템과 같은, 자동화된 형광 현미경을 사용하기 때문에, 조직 샘플의 신속하고, 편리하고, 그리고 정확한 스크리닝이 가능하다. 이러한 방법, 및 이의 실행에 사용된 자동화된 현미경 시스템은 복수의 조직 샘플의 고도 스루풋 분석에 사용하기에 특히 적합하다.
조직 샘플은, 비제한적 예로서 상피 표면으로부터의 스크레이핑(scraping), 상피 조직의 외과적 절제, 다양한 생검, 및 외과적으로 잘라내어진 조직 및 장기를 포함하는, 의심이 가는 조직 또는 장기로부터 표본을 얻는 의료적 또는 외과적 절차로부터 유래될 수 있다. 비제한적 실시형태에서, 이러한 샘플은 지지 물질(supporting material) 내에 고정 및 포매되고, 그리고 이의 조직 슬라이스가 마이크로톰(microtome) 또는 유사한 기구(instrument) 내에서 제조된다. 조직 슬라이스는 현미경 슬라이드 상에 장착된다. 부가적으로 분석용 샘플이 생검, 혈액, 림프, 소변, 삼출 유체, 생물학적 유체, 세척 유체(lavage fluid), 흡인 유체, 가래 및 조직으로부터 유래될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 슬라이드-장착된 조직 슬라이스는 이어서, 염색체 또는 핵산을 적합한 광학 필터에 의해 분리가능한 특정 방출 색상을 갖는 형광 탐침으로 염색하는 일반적인(generic) 형광 염료로 처리된다. 일반 염료의 비제한적 예는 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)이다. DAPI를 사용한 염색은, FISH 탐침으로부터의 이미지를 추가 캡처하기 위한 이미지 캡처의 컴퓨터 구동 처리를 위한, 핵의, 또는 염색체의 위치를 확인하는 수단을 제공한다.
조직 표본은, 뉴클레오티드 서열이, 표적화시키고자 하는 종양유전자에 대해 특이적인 유전자 서열, 또는 유전자 서열의 분절(segment) 또는 일부분을 특이적으로 표적화하도록 구성되는 형광 표지된 FISH 탐침에 보합결합된다. 탐침에 사용된 다양한 형광 표지는 적합한 필터 및 관련된 광학 성분의 사용에 의해 광학적으로 분리가능하다. 뉴클레오티드 서열의 특이성은, 표적 서열을 갖는 표본 내 모든 또는 대부분의 염색체가 사실상 탐침에 보합결합되는 것을 보장하고, 반면에 비-표적 서열은 보합결합되지 않고 유지된다. 보합결합은, 표적 서열을 변성하기 위해 충분히 가열하고, 이에 의해 탐침에 상보적인 단일 가닥 DNA를 노출시킴으로써 처리가 초래된다. 이어서, 처리는, 탐침을 노출된 단일 가닥에 어닐링하고(annealing), 이에 따라 서열을 형광 표지로 표지함으로써 계속된다. 본 발명의 분야의 숙련자는, 요구되는 보합결합을 달성하기 위한, 용액 이온 세기, 완충액 조성, 온도 등의 특정 조건을 알 것이다. 어닐링 후, 과량의 탐침이 세정된다.
보합결합된 표본을 갖는 슬라이드가 자동화된 현미경 시스템의 성분인 슬라이드-로딩 카세트 내에 삽입된다. 시스템은 작동으로 설정되고, 이 시점에서 슬라이드는 카세트로부터 수송되고 그리고 현미경의 스테이지 상에 위치되게 된다. 많은 실시형태에서, 각 슬라이드는, 자동화된 현미경에 의하여 표본 확인, 및 해당 표본에 사용된, 어떤 일반적인 염색체 염료의 본질(identity), 및 FISH 탐침 상의 다양한 형광 표지와 같은 정보를 포함할 수 있는 문의성(interrogatable) 코드를 가질 수 있다. 이러한 정보는 이미지 축적 처리전반에 걸쳐 사용하기 위한 적당한 광학 필터 및 관련된 광학 요소의 선택시 자동화된 현미경을 가이드한다.
자동화된 현미경과 같은 자동화된 스캐닝 장치는 생물학적 샘플을 한 면에서, 또는 하나 이상의 면에서, 예를 들어 2, 3 또는 그 이상의 면에서 스캐닝하도록 배치될 수 있다. 다수의 면에서 스캐닝함으로써, 비정상적인 세포의, 이는 샘플 내 세포의 총 수의 관점에서 드물 수 있음, 검출이 상당히 개선될 수 있다.
일 실시형태에서, 탐침은, 형광 신호가 검출기에 의해 검출되는 FISH 탐침을 사용할 수 있다. 탐침은, 다른 입력 신호가 있거나 또는 없이 신호를 만들 수 있는 것으로 이해되어야 하며, 예를 들어 이들은 활성화 신호(이를테면 적당한 파장의 빛 또는 다른 전자기 방사선)에 의해 자극될 때 방사성이거나 또는 형광을 낼 수 있다. 탐침은 상이한 복제 관련된 암/과형성증 유전자좌, 암/과형성증과 관련된 특이적 유전자좌에 유도될 수 있다. 상이한 형광 태그는 상이한 유전자좌에 대한 탐침과 관련되어, 상이한 신호를 생산할 수 있다.
검출기는 태그에 의해 생산될 수 있는 신호(들)에 따라 선택될 수 있으며, 예를 들어 형광 검출기는 형광 태그를 검출하기 위한 것이고, 상기 검출기는 형광 태그에 의해 생산된 특정 형광 신호의 검출을 허용하도록 작동가능하게 배치된다.
자동화된 분석은, 보다 고배율에서 이미징하기 위한 표본 내 영역을 확인하기 위해, 적어도 일반 염료, 및 아마도 탐침 표지를 사용하여, 현미경의 저배율의 사용을 유도함으로써 시작할 수 있다. 컴퓨터 소프트웨어가 저배율에서 관심 대상의 영역을 확인할 때, 자동화된 현미경이, 탐침 내에 사용된 형광 표지 중 하나 또는 다른 것으로부터 유래하는 방출 광에 기초하여 보다 고배율에서 확인된 유전자좌의 적합한 이미지 분석을 위해, 대물 렌즈 및/또는 필터, 그리고 어떤 다른 광학 성분을 교환하도록 유도할 수 있다. 이어서, 컴퓨터 소프트웨어는 이미지 내 특징, 비제한적인 예로서 FISH-표지된 스팟의 세기 및 수를 사용하여, 단일 핵 내에 생기는 이러한 스팟을 열거할 수 있다. 이러한 열거는 분석되는 표본 내 조직의 세포 내 유전자 증폭의 정도의 결과물인 표시를 제공할 수 있다.
보고는 특정 염색체와 관련된 특정 태그의 단순 보고를 포함할 수 있고 및/또는 자동 진단(염색체의 특정 보합결합 패턴과 관련된 암의 종류를 지시)을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 자동화된 현미경 시스템은 자동적으로, 작동하는 동안 얻어진 다양한 이미지, 필드 및 표현에서 얻어진 발견내용을 상술하는 보고서를 만든다. 이러한 보고서는, 자동화된 현미경과 관련된 메모리 장치에 미리 상주하는, 이력 정보(historical information), 또는 특허 정보를 사용할 수 있거나 또는 이를 참조할 수 있다.
유용한 시스템은 다수의 신호 채널에서 한 번에, 또는 서로 비교적 짧은 기간 내에(예를 들어, 1 분 미만) 자동 스캐닝 및 검출하는 것을 포함할 수 있다. 시스템은 실시간으로, 동시에 또는 동시발생적으로(concurrently) 다수의 신호들의 각각(또는 동일한 것들의 혼합)을 처리하도록 작동가능하게 배치되어, 염색체 영역, 및/또는 영역 복제의 신속한 검출을 허용하고, 이는 하나 이상의 특정 암을 지시한다.
정상적인 표본과 비교할 때 벡터 값은, 약 60 미만, 또는 약 40 미만, 또는 약 30 미만, 또는 약 20 미만, 또는 약 10 미만, 또는 약 3 미만, 또는 약 1 미만, 또는 약 0.500 미만과 같은, 특정 임계값 미만이 되도록 선택될 수 있다.
분석 절차의 비제한적 예에서, 자동화된 방법은 다음과 같은 단계를 포함할 수 있다:
1. 파라핀 포매된 조직으로부터의 얇은 절편을 슬라이드 상에 층화(layering)시킴으로써 현미경 표본을 위치시킨다.
2. 조직 절편을 표적화된 염색체 유전자좌 또는 서열에 대한 형광 동소 보합결합(FISH) 탐침을 사용하여 염색한다.
3. FISH 탐침 처리 후, 슬라이드를 인치당 100, 또는 200, 또는 300, 또는 400 도트 또는 그 이상으로 설정될 수 있는 해상도로 데스크탑 스케너를 사용하여 스캐닝하고, 그리고 스캐닝된 이미지를 처리하여, 주의하도록 병리학자가 표시했던 영역을 확인한다. 이 영역에 대한 디지털화된 정보를 Ikoniscope™ 현미경 시스템(Ikonisys, Inc., New Haven, CT)과 같은 자동화된 형광 현미경에 전달한다(pass).
4. 슬라이드를 자동화된 현미경 내에 로딩한다.
5. 자동화된 스캐닝을, DAPI 채널을 사용한 분석을 위해, 2X, 또는 4X , 또는 5X, 또는 1OX 배율과 같은 저배율, 또는 유사한 저배율을 사용함으로써 시작하고, 이에 의해 기구(instrument)는 핵을 포함하는 슬라이드의 영역을 검출한다. 전형적으로, 스캐닝은 단계 3에서 표시된 영역 내에서 실시된다.
6. 이어서, 10X, 또는 15X, 또는 2OX, 또는 4OX, 또는 보다 높은 배율과 같은 고배율을 사용하여, 현미경 시스템은 이전 단계에서 확인된 영역을 스캐닝한다. 스캐닝은 핵의 검출을 위한 DAPI 채널에서, 그리고 이어서, 탐침에 사용된 형광 표지에 의해 방출된 범위의 빛의 파장으로 유도된 채널에서, 이를테면 오렌지 채널에서, 예를 들어 오렌지 방사선을 방출하는 표지를 갖는 FISH 탐침으로부터의 오렌지 신호를 열거하기 위하여, 그리고 그린 방사선을 방출하는 표지를 갖는 FISH 탐침으로부터의 신호를 열거하기 위하여 그린 채널에서 수행된다. 이들은 추가 특징화를 위해, 핵과 같은 관심 대상의 특징을 제공한다.
7. 100X 배율과 같은 가장 높은 배율에서 연이은 스캐닝 및 신호 계수의 다양화(verification)를 위해 관심 대상의 특징의 위치가 기록된다.
8. 자동화된 현미경은, 검토를 위해 병리학자에게 20X 및 100X 스캐닝동안 수집된 모든 이미지를 보고하고 그리고 또한, 병리학자가 다른 슬라이드 영역의 고배율에서 검토를 필요로 한다면, 슬라이드의 연이은 재스캐닝을 위한 가능성을 제공한다.
바람직한 실시형태에 관한 진술
본 발명은 바람직한 실시형태와 관련하여 설명되었으며, 당업자는 특허청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 범위 또는 정신으로부터 벗어나지 않고 본 발명에 다양한 변화 및/또는 변경이 가능하다는 것을 쉽게 알 것이다. 본 명세서에 인용된 모든 문헌은, 부가적인 또는 대안적인 설명, 특징 및/또는 기술적인 배경을 교시하기에 적당한 경우 본 명세서에 참조 병합되어 있다.
Claims (3)
- 암 또는 고등급 과형성증 세포의 자동화된 스크리닝(screening) 방법에 있어서,
(a) 대상으로부터 분리된 핵을 포함하는 유체 생물학적 샘플을 수용한 슬라이드를 얻는 단계, - 여기서 상기 유체 생물학적 샘플은 염색체 3 또는 염색체 7에 유도된 제 1 검출 가능 라벨을 가지는 제 1 핵 동원체 탐침과, 그리고 염색체 3의 q 아암 상의 단일 카피 서열들에 유도된 제2 검출 가능 라벨을 가지는 제 2 핵 비-동원체 탐침과 접촉되고, 상기 단일 카피 서열들은 염색체 위치 3q26 의 TERC 유전자의 적어도 일 부분을 함유하는 네 개의 오버래핑 BAC 클론의 콘티그 서열 (contiguous sequence)로 구성되고, DAPI로 대조염색되고 (counterstained), 그리고 상기 제1 및 제2 탐침들은 상기 제1 및 제2 탐침들을 각각의 염색체 좌에 보합 결합을 촉진하는 조건하에서 접촉시킴;
(b) 상기 생물학적 샘플 내에서 DAPI 염색된 부위에 대한 상기 슬라이드를 검색하는 단계;
(c) 상기 제 1 핵 동원체 탐침 라벨과 상기 제 2 핵 비-동원체 탐침 라벨의 존재에 대한 상기 DAPI 염색된 부위를 검색하는 단계;
(d) 상기 제 1, 제 2 또는 제 3 탐침 중 적어도 하나를 가지는 세포들을 2X, 4X , 5X, 또는 1OX 배율의 저배율의 자동화된 전자 현미경에 위치시키는 단계;
(e) 10X, 15X, 2OX, 4OX, 또는 100X 배율의 고배율에서 제 4 탐침, 제 5 탐침, 및 제 6 탐침 중 적어도 하나의 결합을 검사하는 단계;
(f) 상기 생물학적 샘플내의 DAPI 염색된 각각의 부위 내의 상기 제1 핵 동원체 탐침 및 상기 제 2 핵 비-동원체 탐침의 핵 당 갯수를 정량적으로 검사하는 단계;
(g) 칼라 필터 휠을 적정한 이미징 위치 및 촛점 평면상에서 적정한 속도로 회전시킴으로써 상기 형광택들을 차별화하여 상기 다양한 탐침들의 다양한 이미지들을 캡쳐하는 단계; 및
(h) 만약 세포들이 하나 이상의 상기 제 1, 제 2 또는 제 3 탐침들, 그리고 하나 이상의 상기 제 4 탐침, 제 5 탐침 및 제 6 탐침들을 포함한 것으로 검사되는 경우, DAPI내에서의 상기 제1 탐침의 갯수가 핵 당 대략 2개 이고, DAPI 염색 부위내에서의 상기 제 2 핵 비-동원체 탐침의 갯수가 핵 당 4개 이상인 경우에는 고등급 과형성증 및 침윤성 자궁경부암으로 진행할 가능성이 있는 것으로 상기 생물학적 샘플을 지적하여, 암, 고등급 과형성증 또는 고등급 이형성증 세포들을 자동적으로 보고하는 단계를 포함하는 자동화된 스크리닝 방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 유체 생물학적 샘플이 혈액, 림프, 소변, 삼출 유체, 상피 스크레이핑, 자궁경(uterine cervix)으로부터의 도말(smear), 구강 도말, 세척 유체(lavage fluid), 타액, 흡인 유체 및 가래 중 하나 이상으로 부터 분리된 핵을 포함하는 것을 특징으로하는 자동화된 스크리닝 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 자동화된 현미경은 상기 샘플의 필드에서 2 이상의 면들을 스캐닝하는 것을 특징으로하는 자동화된 스크리닝 방법.
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