KR20150086443A

KR20150086443A - 스트렙토코커스 파라우베러스 세포벽 단백질을 이용한 백신 조성물

Info

Publication number: KR20150086443A
Application number: KR1020150005888A
Authority: KR
Inventors: 안정오; 윤남경; 이홍원; 유성식; 윤인중; 홍민희
Original assignee: 한국생명공학연구원; 주식회사 중앙백신연구소
Priority date: 2014-01-17
Filing date: 2015-01-13
Publication date: 2015-07-28
Also published as: KR101689512B1

Abstract

본 발명은 어류의 연쇄상구균의 원인균인 스트렙토코커스 파라우베러스(Streptococcus parauberis)세포벽 단백질을 이용한 백신 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 어류의 연쇄상구균의 원인균인 스트렙토코커스 파라우베러스(Streptococcus parauberis)에 대하여 항원성을 가지는 단백질을 선발하였으며 이를 이용하면 연쇄상구균의 예방 및 치료용 백신 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

스트렙토코커스 파라우베러스 세포벽 단백질을 이용한 백신 조성물{Vaccine composition using Streptococcus parauberis cell wall protein in fishes}

본 발명은 어류의 연쇄상구균의 원인균인 스트렙토코커스 파라우베러스(Streptococcus parauberis) 세포벽 단백질을 이용한 백신 조성물에 관한 것이다.

스트렙토코커스 파라우베러스(Streptococcus parauberis)은 국내 넙치 양식장에서 높은 분리율을 보이며 연쇄상구균 감염증의 주요 원인체로 떠오르고 있다. S. parauberis에 감염된 넙치는 체색흑화, 무안측출혈, 비정상적인 유영과 섭식이 불량해지며 만성소모성(cachexia)으로 폐사가 발생한다.

넙치는 국내 해양 양식어의 많은 부분을 차지하는 어종이다. 국내 넙치양식장은 제주도, 남해안 및 서해안에서 오래전부터 육상수조의 형태로 대부분 위치하고, 연쇄상구균 감염증으로 인한 피해가 빈번하게 나타나 경제적 피해도 막대하였지만, 역학조사(epidemiological studies)가 미비하여 주요 원인체에 대한 대응보다 항생제 치료에 급급하였다.

하지만, 본 발명자들은 최근 역학 연구결과로 S. parauberis가 넙치의 연쇄상구균 감염증의 주요한 병인체임을 보여주었다(Nho SW, Shin GW, Park SB, Jang HB, Cha IS, Ha MA, Kim YR, Park YK, Dalvi RS, Kang BJ, Joh SJ, Jung TS. FEMS Microbiol Lett. 2009 Apr; 293(1):20-7; Shin GW. Palaksha KJ. Yang HH. Shin YS. Kim YR. Lee EY. Kim HY. Kim YJ. Oh MJ. Yoshida T. Jung TS. Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol.(2006) 26;2).

현재, S. parauberis에 대해서는 원인체의 규명만 되었을 뿐 그에 대한 예방이나 치료에 관한 것은 연구가 미비한 실정이다. 또한, S. parauberis에서 에리트로마이신(erythromycin)과 테트라사이클린(tetracycline)에 대한 항생제 내성 유전자가 발견되어 항생제를 이용한 치료에도 한계가 있는 것으로 나타났다(Park YK, Nho SW,Shin GW, Park SB, Jang HB, Cha IS, Ha MA, Kim YR, Dalvi RS, Kang BJ, Jung TS. Vet Microbiol. 2009 Apr 14;136(1-2):76-81. Epub 2008 Oct 14.). 따라서 보다 근본적인 예방 대책으로서 백신의 개발이 시급한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 효과적으로 연쇄상구균의 예방 방법을 연구한 결과, 스트렙토코커스 파라우베러스(Streptococcus parauberis)에 대하여 항원성을 가지는 단백질을 선발하였으며 이를 이용하여 제브라피쉬에 접종한 결과 우수한 백신 효능을 확인하였으므로 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 어류의 연쇄상구균 감염의 치료 또는 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 백신조성물을 포함하는 어류의 연쇄상구균 감염증의 치료 또는 예방을 위한 사료조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 백신조성물을 어류에 투여함으로써 어류의 연쇄상구균 감염증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 어류의 연쇄상구균 감염의 치료 또는 예방용 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 백신조성물을 포함하는 어류의 연쇄상구균 감염증의 치료 또는 예방을 위한 사료조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 백신조성물을 어류에 투여함으로써 어류의 연쇄상구균 감염증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 연쇄상구균의 원인균인 스트렙토코커스 파라우베러스에 대하여 우수한 항원성을 가지는 단백질을 이용하면 연쇄상구균의 예방 및 치료용 백신 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 스트렙토코커스 파라우베러스(Streptococcus parauberis)에서 얻은 항원 후보 유전자의 DNA 전기 영동 결과이다.
도 2는 서열번호 1의 항원 후보 단백질 15(STP_1665/SPB_1407, membrane anchored protein)에 대한 전기영동 및 His 프로브 항체를 이용한 단백질 확인 웨스턴 블랏 결과를 나타낸 도이다 (화살표는 발현된 항원후보단백질들을 가리킴).
도 3은 도 2에서 단백질 발현이 성공한 항원후보단백질들의 마우스에서 생산된 연쇄상구균 항혈청을 이용한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸 도이다(M: 표준 마커, 2, 3 4, 6, 7, 10, 12, 14, 15, 20, 24, 25, 26, 27: 표 1에 나타낸 항원후보단백질들의 번호).
도 4는 서열번호 1의 항원 후보 단백질 15(STP_1665/SPB_1407, membrane anchored protein) 접종 후 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 항원 단백질인 15(STP_1665/SPB_1407, membrane anchored protein)가넙치 연쇄상구균 감염증의 주된 원인균인 S. parauberis serotype I형, S. parauberis serotype II형, S. iniae에 대해 모두 항원성이 있음을 확인한 도이다.
도 6은 제브라피쉬 사육환경 조성 및 실험 준비하는 과정을 나타낸 도이다.
도 7은 서열번호 1의 항원 후보 단백질 15(STP_1665/SPB_1407, membrane anchored protein)의 아미노산 서열을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 어류의 연쇄상구균 감염의 치료 또는 예방용 백신 조성물을 제공한다.

상기 연쇄상구균은 스트렙토코커스 파라우베러스(Streptococcus parauberis)인 것이 바람직하다.

상기 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드는 본 발명의 구체적인 실시예에서 스트렙토코커스 파라우베러스(Streptococcus parauberis)의 세포벽에 존재하는 항원 후보 단백질 15(STP_1665/SPB_1407, membrane anchored protein)이다.

상기 어류는 넙치, 농어, 송어, 우럭 및 돔류로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 종인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

상기 발현 벡터는 pET-30a인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

또한, 상기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 2의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, 상기 서열은 서열번호 2의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 흔히 "재조합 벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "재조합 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

상기 서열번호 2의 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

상기 연쇄상구균은 스트렙토코커스 파라우베러스(Streptococcus parauberis)인 것이 바람직하다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 연쇄상구균의 인- 실리코(in-silico)를 통한 항원 후보 단백질 선발

스트렙토코커스 파라우베러스(Streptococcus parauberis) KCTC 11537와 S. parauberis NCFD 2020 균주의 게놈 분석을 이용하여 인-실리코를 통한 컴퓨터 시뮬레이션으로 항원 후보 단백질을 선별하였다. 이때 단백질의 막 횡단 나선 수(transmembrane helix number), 세포 내 위치(subcellular localization) 및 접착(Adhesion) 등을 고려하였다. S. parauberis KCTC 11537의 전체 1868개의 단백질 중에서 세포 밖(extracellular, EC), 세포벽(cell wall, CW) 7 orfs, 세포질 막(cytoplasmic membrane, CM) 16 orfs를 선별하였고, S. parauberis NCFD 2020 균주의 전체 2146개 단백질 중에서 세포 밖 4 orfs, 세포벽 8 orfs, 세포질 막 14 orfs를 선별하였다. 이 중에 겹치는 것을 제외하고 최종 40개의 단백질을 스트렙토코커스 파라우베러스 균주의 항원 후보 단백질로 선별하였으며 하기 표 1에 나타내었다.

번호	Locus tag	위치	유전자
1	STP_0018	세포 밖	amidase
2	STP_0130	세포 밖	Xaa-Pro dipeptidyl-peptidase
3	STP_0197	세포 밖	N-acetyl-muramidase
4	STP_0342	세포 밖	alpha-amylase
5	STP_1253/SPB_1157	세포 밖	penicillin-bindingprotein1A
6	STP_1551/SPB_1829	세포 밖	Alkalinephosphatase
7	STP_1590	세포 밖	prophage LambdaSa1, N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase, family 4
8	SPB_2015	세포 밖	CHAP domain protein
9	STP_0140	세포 벽	signal peptidase I
10	STP_0535/SPB_0281	세포 벽	N-acetylmuramoyl-L-alanineamidase
11	STP_1223	세포 벽	zinc carboxypeptidase
12	STP_1405/SPB_1598	세포 벽	secretionproteinBug4
13	STP_1447/SPB_1652	세포 벽	lpxtg-motifcellwallanchordomainprotein
14	STP_1567	세포 벽	SiM protein
15	STP _1665/ SPB _1407	세포 벽	membrane anchored protein
16	SPB_0377	세포 벽	CHAP domain protein
17	SPB_0381	세포 벽	LPXTG-motif cell wall anchor domain protein
18	SPB_0674	세포 벽	phage minor structural protein, N-terminal domain protein
19	SPB_1927	세포 벽	pilin isopeptide linkage domain protein
20	STP_0225/SPB_1215	세포질 막	LytRfamilyregulatoryprotein
21	STP_0274/SPB_1171	세포질 막	penicillinbindingprotein2x
22	STP_0438/SPB_0179	세포질 막	zinc-bindingproteinAdcAprecursor
23	STP_0503/SPB_0252	세포질 막	competenceassociatedendonuclease
24	STP_0539/SPB_0285	세포질 막	membrane protein
25	STP_0689/SPB_0517	세포질 막	pneumococcal vaccine antigen A-like protein
26	STP_0697	세포질 막	laminin binding protein
27	STP_0700	세포질 막	hypothetical protein
28	STP_0801/SPB_0626	세포질 막	phosphateABCtransporter,extracellularphosphate-binding lipoprotein
29	STP_0845	세포질 막	putative truncated prophage LambdaSa1, minor structural protein
30	STP_0956/SPB_0817	세포질 막	protease
31	STP_1063/SPB_0928	세포질 막	foldaseproteinPrsA1precursor
32	STP_1610	세포질 막	sporulation protein
33	STP_1616	세포질 막	penicillin-binding protein 1B
34	STP_1749	세포질 막	penicillin-binding protein 2a
35	STP_1850/SPB_2075	세포질 막	transglycosylaseprotein
36	SPB_0398	세포질 막	hypothetical protein
37	SPB_1817	세포질 막	BAAT/acyl-CoA thioester hydrolase C-terminal domain protein
38	SPB_1837	세포질 막	ABC transporter, solute-binding protein
39	SPB_1884	세포질 막	transglycosylase
40	STP_0585/SPB_0333	세포질 막	mannosyl-glycoprotein endo-beta-N-acetylglucosaminidase family protein/gametolysin

< 실시예 2> 항원 후보 단백질의 클로닝 및 발현

상기 <실시예 1>에서 단백질의 항원 후보 유전자를 얻기 위해서 연쇄상구균 균주의 gDNA(genomic DNA)를 DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen, Cat No. 69506)을 이용하여 분리하고 유전자를 획득하였다.

게놈 DNA 분리에 사용된 균주는 S. parauberis Serotype I(서울대학교 수의과대학 수생동물질병학교실, S. parauberis P2 균주) 및 S. parauberis Serotype II (전남대학교 수산행양대, S. parauberis YSFST02-111 균주)이다.

구체적으로, 분리된 gDNA는 항원유전자를 증폭할 수 있는 프라이머로 획득하고, 발현벡터로의 도입은 In-fusion^TM Advantage PCR cloning kit(Clontech, USA) 방법으로 진행하였다. 항원 유전자 획득에 사용된 프라이머와 증폭된 유전자는 하기 표 2 및 도 1에 나타내었다. 획득된 항원유전자는 In-Fusion HD Enzyme Premix (Clontech, Cat No. ST0345)를 이용하여 NdeI와 XhoI으로 선형화(linearization)된 pET-30a 발현벡터로 클로닝하였다. 제조된 발현벡터의 플라스미드는 대장균(E. coli BL21(DE3)에 형질전환 하였다. 상기 형질전환체를 50 ug/ml의 항생제를 함유하는 LB배지, 37℃에서 배양하였다. OD=600에서 0.5에 도달했을 때, 0.5 mM IPTG(isopropyl-β-thio-D-galactopyranoside)를 첨가하고, 배양물은 37℃에서 3시간 추가 배양하였다. 추가 분석을 위해 세포는 원심분리하여 모으고 펠렛은 소니케이션으로 파쇄하였다. 이후 상층액을 회수하여 재조합 융합 단백질을 SDS-PAGE로 분석하였다.

그 결과, 표 1의 항원 후보 유전자들 중에서, 2, 3, 4, 6, 10, 12, 14, 15, 24, 26, 27, 28, 29에 해당하는 단백질들의 발현에 성공하였으며, 각각은 예상되는 단백질 크기에서 발현됨을 확인할 수 있었다(도 2, 표 3).

유전자	이름	서열(5'-3')
1	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG AAAAAGAGAATTTTATCAG
1	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG GTTTGGTAAGATGTATAC
2	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG AAGTATAATCAATTTTCTTATATAC
2	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG TTTCGGTATCTTTAGTTTAG
3	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG AGATCACGTTTAAAATTAA
3	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG ATCATATTTTGTTAAATC
4	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG ACAAATGATTTAATTATG
4	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG TTTTATTTTGTTCTTAGG
5	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG ATTAAAATCAAAAATCCAAC
5	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG TTGACCAGCTGTTCCATTAC
6	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG GCAGTAACTACACATTCG
6	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG ATTAATTTTCTTTGGTGC
7	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG CAAAGAGTTTTAGATAGTGAC
7	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG ACTATTTTTGATTGATCTGATG
8	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG AAAAAGAGAATTTTATCAG
8	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG GTTTGGTAAGATGTATAC
9	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG AAAAATTTTATTAAAGAATG
9	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG TTTTAAAAGATCAATGCG
10	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG CTTTTTGTACAAAAGAATG
10	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG AATTGTGTAAGTCTTATAGTACC
11	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG ACTAATGTAAAAACTGGTC
11	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG ATTTTCTTTACGACGTTTTAC
12	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG AAAAATGGGAAATGGTTAGC
12	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG TTTTTCAATATGCTTTTCTAATG
13	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG TATCATACTAAAGATAGG
13	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG TTCATGTTTATACTTTTTTG
14	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG GCAAAGCGTGAAGCTAAAC
14	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG AGCTTCTTTACGTTTACG
15	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG GAATTGGAAAACGGGAAAAC-서열번호 3
15	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG TTTTTTGCCTTGTTTTCTGAG-서열번호 4
16	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG TTGTCTAAACAAACAAGACAAG
16	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG TTTTGGTGGTATTGCAAACG
17	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG AAAAAATCATTATTAATTAG
17	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG TTTTAGTTCTTTTTTACTT
18	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG CTTTATTATTATGGAGCAAAAACC
18	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG AAAAACCTAAATCTTGGAAG
19	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG AGAAATTTTTATAAACTATTTG
19	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG CTTATTCTTTCTTTGTCTCC
20	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG AAAATCGGAAAAAAAATACTCC
20	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG TTGTACAGGCGCAACTGGAG
21	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG AATAAGTTTATTAAAGGTTTTA
21	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG TTTTTTAATTTTATGAAGTGC
22	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG AAAAAGAAAGTTCTATTGC
22	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG ATGTGCATTTTATTTCTTGTGC
23	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG AGAGGTCAAATGTCAAATC
23	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG GCGTTCTATATCGACCTGACC
24	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG GCTAAAGAACCATGGG
24	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG CTTGATAATAACTGCATC
25	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG TTGAAATTTTTCAAACGTG
25	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG AAATAAAGACATGAATTC
26	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG TTACCGATTTGCTTAATAC
26	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG TTTTAATTCTTGATATAAAAT
27	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG AAACAAATTCGCAACCGTC
27	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG GTTTTTCTTGTCTTTAAAA
28	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG AATATTAAAAAGAAATTC
28	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG TTTCTTTGAAACTTTTCCATC
29	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG GGAACATCAAATTTTAGTGGC
29	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG CGCTGTTCTCAACCACATATAAG
30	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG AAGCTGTTGAATGGCTTTTTC
30	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG GTTTCCTTGATATAGCTC
31	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG AAAAAATCTAATAAGTTAATTAC
31	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG TTTATCAACTGATGTTTTC
32	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG AAAAATAAATTTTATATTGTC
32	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG TTTTGATAACATAAAAATA
33	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG CAAGCTTTATCAAAGTTTGG
33	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG TTTTTTTCTAATATTGAAAC
34	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG GTTAAAAAAATAGAAGCTA
34	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG TCTGAAGTAGTCTATAACACC
35	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG TATAGAATTAAAAATTTG
35	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG ATAACCCCAAGCAGACATC
36	역방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG AAAACAATTGGAAAATCAG
36	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG TTTTTTATCTATATTGAC
37	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG AAAAATTTTATTAAAATAA
37	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG TTTACCATGTTTTTCCTTATG
38	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG AAAAAAAATTGGTTAGCAC
38	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG TTTTTCTAAAGCTTTATC
39	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG AACCAATTAAAGAAGAAAAAAAC
39	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG TTTTTTTCTAATATTGAAAC
40	정방향 프라이머	TAAGAAGGAGATATACATATG ACGCTTCAGAAAGGTAAG
40	역방향 프라이머	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG TTGATTATTTTTATAATCAC

번호*	유전자명	예상 단백질 사이즈 (kDa)
2	Xaa-Pro dipeptidyl-peptidase	83.4
3	N-acetyl-muramidase	21.5
4	alpha-amylase	53.8
6	Alkalinephosphatase	63
10	N-acetylmuramoyl-L-alanineamidase	82.3
12	secretionproteinBug4	72.6
14	SiM protein	44.4
15	membrane anchored protein	102
24	membrane protein	18.5
26	laminin binding protein	32.6
27	hypothetical protein	25.6
28	phosphateABCtransporter extracellularphosphate-binding lipoprotein	31
29	putative truncated prophage LambdaSa1 minor structural protein	68.1

*표 1에 표시된 항원후보유전자 번호

< 실시예 3> 동정된 단백질의 항원성 분석

상기 <실시예 2>에서 형질전환한 재조합 융합 단백질을 발현시켜 웨스턴 블럿 어세이를 진행하여 항원성을 확인하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 2>에서 형질전환한 재조합 융합 단백질을 SDS-PAGE을 수행한 후 얻어진 겔(gel)을 니트로셀룰로오스 멤브레인(Nitrocellulose(NC) membrane)에 옮겼다. 니트로셀룰로오스 멤브레인을 PBS에 용해된 5% 스킴 밀크(skim milk)를 이용하여 1시간 동안 상온에서 블로킹시켜 비특이적 반응을 없애고, PBST(PBS, 0.05% Tween 20)로 15분간 3번 세척하였다. 그런 다음, 0.5% 스킴 밀크가 녹여진 PBST에 마우스에서 생산된 His-프로브 항체(H8 ; Santa Cruz Biotechnology, Cat SC-57598)와 마우스에서 생산된 연쇄상구균 항혈청을 각각 첨가하여 상온에서 1시간 동안 1차 반응을 하였다. 니트로셀룰로오스 멤브레인을 PBST로 15분씩 3회 세척한 후, goat Anti-mouse IgG 및 Alkaline-phosphatase-linked 항체(sigma)로 상온에서 1시간 동안 2차 반응을 하였다. 니트로셀룰로오스 멤브레인을 PBST로 15분씩 3회 세척하고, AP conjugate substrate kit(Bio-rad; Cat 170-6432)을 사용하여 항원 단백질을 확인하였다.

그 결과, 단백질 발현에 성공한 항원 후보 단백질들 중에서, 15(STP_1665/SPB_1407, membrane anchored protein)만 마우스에서 생산된 연쇄상구균 항혈청과 반응성을 보임을 확인하였다(도 3).

< 실시예 4> 제브라피쉬 ( Zebrafish )를 이용한 membrane anchored protein의 백신 효능 분석

제브라피쉬는 스트렙토코커스류(연쇄상구균)의 감염에 대하여 복강접종과 근육접종 두 경로 모두 감수성이 있어, 스트렙토코커스류에 대한 LD50과 폐사까지 일반적으로 48~72시간이 걸린다는 것이 이미 연구결과로 밝혀져 있다(Streptococcus-zebrafish model of bacterial pathogenesis/Neely MN, Pfeifer JD, Caparon M. /Infect Immun. 2002 Jul;70(7):3904-14). 또한, 다양한 연구들에 의해서 제브라피쉬가 연쇄상구균 감염의 어류모델로써 적합하다고 밝혀졌기 때문에(Neely MN, Pfeifer JD, Caparon M. Streptococcus-zebrafish modelof bacterial pathogenesis. Infect Immun 2002;70:3904-14. , Van der Sar AM, Appelmelk BJ, Vandenbroucke-Grauls CM, Bitte W. A start with striped: zebrafish as an infection model. TRENDS Microbiol 2004;12:451-7.), 이를 이용한 동물실험을 통해 항원성 단백질의 면역학적 특성을 분석하였다.

구체적으로 본 실험에서는 제브라피쉬를 대상으로 스트렙토코커스 파라우베러스에 대한 감수성 테스트와 LD50을 확인하였고 이를 바탕으로 상기에서 스크리닝된 항원단백질 #15(STP_1665/SPB_1407, membrane anchored protein)의 어류 연쇄상구균 질병에 대한 면역학적 효능을 검정하였다.

<4-1> 제브라피쉬 사육환경 조성 및 실험 준비

도 6에 나타난 바와 같이 큰 수조에 제브라피쉬를 대량으로 사육하였고, 작은 수조에 옮겨 실험 그룹으로 분리하였다.

<4-2> 공격 접종 균주 내역

접종한 균주는 균주명이 S. parauberis P2이고, 분양기관은 서울대학교 수의과대학 수생동물질병학교실이며, serotype I 이다.

<4-3> 제브라피쉬 모델을 이용한 스트렙토코커스 파라우베러스 백신 효능 평가 확인 시험

① 실험방법

상기 3개의 그룹의 제브라피쉬를 Tris-buffered tricaine(3-aminobenzoic acid ethylester, pH 7.0; Sigma)로 마취시키고, 15(STP_1665/SPB_1407, membrane anchored protein)를 각 개체당 접종량을 100 ug/ml, 스트렙토코커스 파라우베러스(S. parauberis S1 whole bacterin) 5 mg/ml의 농도를 10 ul씩으로 하여 복강으로 접종하여 면역화시켰다. 면역화 3주 후에 공격 접종용 스트렙토코커스 파라우베러스 혈청형 1 생균수를 10일 간격으로 2차례에 걸쳐 10 ul씩 복강 접종하여 공격접종유발시험을 수행하였다(첫번째 공격접종된 균체수: 4.3 X 10⁹ CFU/ml 두 번째 공격 접종된 균체수 1.4 X 10¹⁰ CFU/ml). 하기 표 4에 기재된 바와 같이 항원 후보 단백질 대신 PBS를 접종시키고 공격접종 유발시험을 진행한 군을 대조군으로 사용하였다.

그룹	challenge	접종수
Sp1(항원 단백질 #15)	1.4 10¹⁰CFU/ml	8
Sp3(S. parauberis S1 whole bacterin)		5
Sp4(PBS)		10

② 실험 판정

매일 관찰하여 폐사여부를 기록하고, 대조군의 누적폐사율이 60% 이상일 때 아래의 수식에 따라 백신군의 상대생존율이 50% 이상이어야 한다. 상대생존율(Relative percent survival, RPS) 산출식은 하기 수학식 1에 나타내었다.

③ 실험 결과

하기 표 5에 나타난 바와 같이 제브라피쉬를 이용한 항원 후보 단백질의 백신 효능 분석결과를 정리한 것이다. #15(STP_1665/SPB_1407, membrane anchored protein) 항원 단백질을 접종하고 S. parauberis 1형 생균수를 공격 접종한 Sp1 그룹에서 접종사로 접종 당일에 2마리, 공격 접종 1일 후 2마리가 폐사하였으나, 4마리가 최종적으로 생존하여 100%의 생존율을 나타내었다. S. parauberis 1형의 whole bacterin을 접종하고 생균수를 공격 접종한 Sp3 그룹에서는 5마리 중 3마리가 폐사되고 2마리가 생존하여 40%의 생존율을 나타내었다. 대조군 PBS를 접종하고 생균수를 공격 접종한 Sp4 그룹에서는 접종사로 1마리가 폐사되었고, 9마리 중 8마리가 폐사되어 11%의 생존율을 보였다.

결론적으로, 대조군으로 PBS를 접종한 zebra fish 그룹은 89%의 폐사율을 보여 공격접종균수는 충분한 것으로 사료되며, 스트렙토코커스 파라우베러스의 whole cell 접종 그룹은 33%의 상대생존율을 보인 반면에, 15(STP_1665/SPB_1407, membraneanchoredprotein)을 접종한 그룹에서는 100%의 생존률을 보였다. 즉, 15(STP_1665/SPB_1407, membraneanchoredprotein) 항원단백질의 경우 부스팅 접종을 통해 공격접종 실험시 100% 방어가 가능함을 확인하였다.

	접종수	No. of daily dead fish of Challenge							생존율(%)	상대생존율(%)
	접종수	0	1	2	3	4	5	6	생존율(%)	상대생존율(%)
Sp1(항원 단백질 15)	8	2*	2**	-	-	-	-	-	4/4(100%)	100%
Sp3(S. parauberis S1 whole bacterin)	5	-	0	1	1	1	-	-	2/5(40%)	33%
Sp4(PBS)	10	-	1**	2	3	3		-	1/9(11%)	-

< 실시예 5> 넙치 연쇄상구균증을 유발하는 원인균에 대한 교차 항원 반응

상기 <실시예 4>에서 항원성을 보인 형질전환한 재조합 항원단백질의 S. iniae (전남대학교 수산해양대학 분양, YSFST01-82), S. parauberis Serotype I(서울대학교 수의과대학 수생동물질병학교실, S. parauberis P2 균주), S. parauberis Serotype II (전남대학교 수산해양대, S. parauberis YSFST02-111 균주) 균주에 대한 교차 항원 반응을 확인하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 3>에서 항원성을 보인 항원단백질 membrane anchored protein 2ug을 SDS-PAGE를 수행한 후 얻어진 겔을 니트로셀룰로오스 멤브레인에 옮겼다. 니트로셀룰로오스 멤브레인을 PBS에 용해된 5% 스킴 밀크를 이용하여 1시간 동안 상온에서 블로킹시켜 비특이 반응을 없애고, PBST로 15분간 3번 세척하였다. 그런 다음, 0.5% 스킴 밀크가 녹여진 PBST에 토끼에서 생산된 S. iniae(SI)가 감염된 연쇄상구균항혈청, 마우스에서 생산된 S. parauberis serotype I(SP1)과 S. parauberis serotype II(SP2)가 각각 감염된 연쇄상구균항혈청을 첨가하여 상온에서 1시간 동안 1차 반응을 하였다. 니트로셀룰로오스 멤브렌인을 PBST로 15분씩 3회 세척한 후, Anti-mouse IgG 및 HRP-linked 항체(KOMABiotech)로 상온에서 1시간 동안 2차 반응을 하였다. 니트로셀룰로오스 멤브레인을 PBST로 15분씩 3회 세척하고, Western bright^TM Quantum Western blotting detection kit(Advansta)을 사용하여 항원 단백질을 확인하였다.

그 결과, 상기 <실시예 3>에서 선별된 항원 단백질인 15(STP_1665/SPB_1407, membrane anchored protein)는 넙치 연쇄상구균 감염증의 주된 원인균인 S. parauberis serotype I형, S. parauberis serotype II형, S. iniae에 대해 모두 항원성이 나타남을 확인하였다(도 5).

<110> Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology (KRIBB) <120> Vaccine composition using Streptococcus parauberis cell wall protein in fishes <130> P130873 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 926 <212> PRT <213> Streptococcus parauberis <400> 1 Met Glu Leu Glu Asn Gly Lys Thr Asn His Ile Lys Thr Thr Ile Ala 1 5 10 15 Leu Thr Ser Thr Ile Ala Leu Leu Gly Thr Gly Val Gly Val Ser His 20 25 30 Gln Val Gln Ala Asp Asp Leu Ser Pro Thr Gly Ala Glu Asn Ser Asn 35 40 45 Asn Glu Ser Pro Leu Leu Pro Thr Thr Ala Thr Val Ala Asp Ala Thr 50 55 60 Ala Ala Val Lys Thr Ala Glu Thr Gln Leu Ala Ser Gln Gln Asn Glu 65 70 75 80 Leu Ile Ala Val Asn Lys Asp Ile Lys Asn Ser Ser Leu Glu Val Ser 85 90 95 Asp Leu Lys Thr Glu Ile Val Ala Gln Glu Lys Ala Val Glu Ala Ala 100 105 110 Gln Glu Thr Leu Thr Thr Val Ser Thr Ser Asn Asp Ala Glu Phe Glu 115 120 125 Lys Leu Val Thr Glu Asn Gln Val Lys Leu Ala Glu Thr Asn Lys Ala 130 135 140 Leu Ser Gln Ala Gln Thr Ser Ala Gln Thr Val Ser Ser Asp Val Gln 145 150 155 160 Lys Gln Thr Gln Val Val Ala Thr Gln Ser Glu Ala Ala Lys Thr Leu 165 170 175 Val Lys Glu Ala Glu Ser Ala Asp Lys Ala Val Ala Asp Leu Thr Lys 180 185 190 Val Val Asn Gln Pro Glu Met Ile Ala Ser Gln Val Lys Asp Ala Gln 195 200 205 Asn Thr Val Lys Ile Ala Ala Ser Asp Leu Thr Lys Ala Gln Thr Asn 210 215 220 Leu Ala Thr Val Lys Gln Glu Thr Lys Thr Ala Leu Thr Thr Ser Leu 225 230 235 240 Ala Ser Asn Lys Thr Ala Leu Thr Ala Lys Gln Ala Glu Leu Asn Ala 245 250 255 Ala Gln Ser Gln Thr Ser Thr Lys Thr Val Asn Ile Ala Gly Glu Asn 260 265 270 Thr Phe Val Leu Pro Ser Asn Tyr Pro Phe Ala Glu Leu Lys Arg Leu 275 280 285 Ala Asp Ser Gly Tyr Ile Gly Ser Trp Ser Tyr Ile Ser Ala Phe Asn 290 295 300 Lys Leu Glu Ser Ala Ile Ser Ser Lys Ala Arg Ala Gly Met Thr Leu 305 310 315 320 Asn Ser Tyr Lys Asn Ile Ala Lys Asp Leu Asn Arg Gln Val Asp Leu 325 330 335 Asp Asn Leu Ser Leu Asp Val Gln Asn Glu Leu Ala Leu Phe Thr Ala 340 345 350 Gln Met Leu Asn Ser Val Arg Ser Gln Leu Asn Leu Ser Lys Ile Glu 355 360 365 Val Thr Glu Gly Ser Gln Gln Phe Ala Arg Leu Val Thr Thr Gln Tyr 370 375 380 Lys Ala Thr His Gly Ser Ala Ile Pro Tyr Phe Ser Tyr Gly Gln Val 385 390 395 400 Gly Ala Gly Gly His Thr Gly Ile Gly Pro His Asp Arg Thr Ile Ile 405 410 415 Glu Ser Ser Ala Thr Arg Val Gly Leu Lys Ala Asn Asp Asp Asn Met 420 425 430 Tyr Glu Asn Phe Gly Met Phe Asp Asp Leu Pro Thr Val Asn Gly Ile 435 440 445 Lys Arg Ser Ile Tyr Asn Thr Leu Lys Tyr Met Leu Phe Thr Asp Asp 450 455 460 Leu His Gly Asn Thr Trp Gly His Ala Val Asn Phe Leu Arg Thr Asp 465 470 475 480 Lys Ala Asn Ala Ser Asn Pro Ile Tyr Leu Gly Phe Ser Thr Glu Ser 485 490 495 Val Gly Gly Leu Asp Thr His Phe Leu Leu Ile Pro Lys Ser Asn Ile 500 505 510 Gln Asn Lys Thr Leu Phe Ser Thr Lys Ala Val Ser Ala Gly Lys Thr 515 520 525 Thr Ile Asn Asn Ser Ala Lys Ile Gln Ser Leu Lys Ser Gly Ile Ser 530 535 540 Ser Ile Lys Gly Asn Ile Thr Thr Ile Glu Lys Arg Leu Asn Asn Leu 545 550 555 560 Ser Ala Glu Glu Ala Val Lys Thr Ala Gln Ala Gln Val Ile Lys Phe 565 570 575 Asn Thr Lys Leu Ser Ala Ala Lys Gln Ser Leu Ala Lys Leu Glu Ala 580 585 590 Gln Ala Ile Gln Ala Lys Lys Ser Lys Asp Gly Phe Gln Ile Gln Leu 595 600 605 Ala Leu Ala Lys Thr Ile Gln Ala Asp Val Lys Ala Lys Leu Asp Glu 610 615 620 Thr Leu Val Ser Leu Asn Ser Ala Lys Arg Ser Leu Lys Thr Leu Glu 625 630 635 640 Thr Lys Leu Val Gln Ala Ala Ala Gln Val Thr Ser Leu Val Asp Lys 645 650 655 Lys Val Asn Leu Ala Lys Met Leu Glu Leu Lys Gln Asn Pro Lys Arg 660 665 670 Val Glu Leu Ala Lys Glu Ala Leu Ala Gln Ala Lys Lys Asp Leu Ala 675 680 685 Glu Thr Asn Ala Lys Leu Ile Val Ser Asn Lys Val Leu Val Asp Leu 690 695 700 Phe Asp Thr Arg Thr Gln Leu Gln Asp Ala Ile Lys Leu Ser Glu Lys 705 710 715 720 Gln Ile Ser Leu Leu Lys Ala Ile Val Asn Thr Lys Gly Asp Glu Ser 725 730 735 Lys Val Gln Lys Pro Thr Lys Val Gln Thr Pro Val Val His Gly Gly 740 745 750 Glu Ser Val Ser Ser Ile Ala Ala Lys Pro Ile Glu Tyr Asn Glu Lys 755 760 765 Asp Ser Ser Val Leu Thr Ser Ala Asp Ile Thr Lys Glu Lys Ile Ser 770 775 780 Asp Thr Ser Glu Lys Asp Gln Ile Asn Ser Glu Thr Glu Arg Met Ser 785 790 795 800 Ala Ser Thr Ser Leu Ile Ala Gln Lys Thr Glu Gln Glu Ile Ala Glu 805 810 815 Ile Lys Ala Val Ile Thr Glu Lys Ile Ala Thr Ala Thr Ser Thr Val 820 825 830 Ile Ala Glu Thr Asn Lys Val Leu Thr Asn Glu Ala Asn Lys Ile Ala 835 840 845 Gln Gly Val Val Glu Val Val Pro Glu Thr Met Pro Ala Gln Ser Ile 850 855 860 Leu Asn Lys Val Ala Lys Ser Val Ser Glu Asn Asn Asn Ser Glu Ser 865 870 875 880 Ser Asn Tyr Gly Ser Thr Thr Val Ser Lys Val Thr Ala Ala Ser Asp 885 890 895 Glu Ser Thr Lys Arg Ala Val Lys Ala Gly Ile Val Met Leu Thr Ala 900 905 910 Val Gly Leu Thr Gly Phe Lys Leu Arg Lys Gln Gly Lys Lys 915 920 925 <210> 2 <211> 2778 <212> DNA <213> Streptococcus parauberis <400> 2 atggaattgg aaaacgggaa aacaaaccac attaaaacca caattgcttt aacatcaaca 60 attgcattgc tagggactgg tgttggggtt tcacatcaag tacaggctga tgacttatca 120 ccaaccggag ctgaaaactc aaataatgaa tcccctttat taccaactac tgcaacggtt 180 gctgatgcca cagcagcagt gaaaactgcg gagacacaat tagctagtca acaaaatgaa 240 cttattgcag ttaataaaga tatcaaaaat tcaagccttg aagtttcaga tttgaaaaca 300 gaaattgtag ctcaagaaaa agctgtagaa gctgctcaag aaactttaac tacagtctct 360 acttcaaatg atgcagaatt tgaaaaactt gtaactgaaa accaagttaa actagctgaa 420 actaataaag ctctaagtca agcacaaaca agtgcacaaa cagtaagctc tgacgttcaa 480 aagcaaactc aagttgttgc gactcaaagt gaagcagcta aaacgctcgt taaagaagca 540 gaatctgctg ataaagctgt agcagatttg acgaaagttg ttaatcaacc tgaaatgatt 600 gcatcacaag ttaaagatgc tcaaaacaca gttaaaattg cagcatcaga cttaacaaaa 660 gcacagacta atttagcaac agttaagcaa gaaactaaga ctgcattaac aacaagtctc 720 gcttctaaca agacagctct tactgcaaaa caagcagaac taaatgctgc tcaatcacaa 780 acttctacaa agacagttaa tattgctggt gaaaatacat ttgtattgcc atcaaactac 840 ccatttgcag aattaaaacg tttagcggat agtggatata ttggttcatg gagctatatt 900 tcagctttta ataaacttga aagtgctatc agttcaaaag ctcgcgctgg aatgactcta 960 aatagctata aaaatattgc taaagattta aatcgccaag ttgatttaga caacttatct 1020 ctagatgtcc aaaatgagtt agctttattt acagctcaaa tgttaaattc tgttcgttcg 1080 caattgaact tgtctaaaat tgaagtaact gaaggatcac aacaatttgc tcgtctagtt 1140 acaactcaat ataaagcaac tcacggttca gcaattccat acttttctta tggtcaagtt 1200 ggtgctggag gacacaccgg aattggccca catgaccgca caatcattga aagctcggca 1260 actcgtgttg gtttgaaagc taatgatgat aacatgtatg aaaattttgg tatgtttgat 1320 gatcttccta ctgttaatgg tattaagaga agtatttaca acactcttaa gtatatgttg 1380 ttcaccgatg acttacatgg caatacttgg ggacatgcgg ttaactttct acgtactgac 1440 aaagcgaatg caagtaatcc tatttatctt ggtttctcaa cagaatctgt tggtggctta 1500 gatacgcatt tcctattaat tccaaaatca aatattcaaa ataaaacttt atttagtacc 1560 aaagctgttt ctgctggtaa gacaacaatt aataattcag caaaaattca aagtttgaaa 1620 tcgggtattt cttctattaa ggggaatatt actactattg aaaaacgttt gaataatctt 1680 tcggctgaag aagctgttaa aacagctcaa gcacaggtaa ttaaatttaa tactaaacta 1740 tctgcagcaa aacaaagtct tgctaaactt gaagcgcaag caatccaagc caagaaatct 1800 aaagatggct tccaaattca actagcgtta gctaagacta ttcaagcaga tgtaaaagca 1860 aaacttgacg aaactcttgt tagtttaaat agcgctaagc gttcacttaa aacacttgaa 1920 acaaaacttg tgcaagcagc agcacaagtt acaagtttag ttgataaaaa agtaaacttg 1980 gcaaaaatgc ttgaattaaa acaaaatcca aagcgtgttg agttagcaaa agaagcactt 2040 gctcaagcca agaaggattt agctgaaaca aatgccaagt taattgtaag taacaaagta 2100 ctagttgatt tgttcgatac tagaactcag cttcaagatg caattaagtt atctgaaaaa 2160 caaatttctc ttctgaaagc aattgttaat acaaaaggtg acgaaagtaa agtacagaaa 2220 cctactaaag tacaaacacc agtagttcac ggtggagaat cagtttcatc tattgctgct 2280 aaaccaatcg agtacaatga gaaagattcg tcagttctta catcagctga tattactaaa 2340 gaaaaaatca gtgatacaag tgagaaagac caaattaatt ctgaaactga acgtatgtca 2400 gcaagtacaa gtttaattgc acaaaaaacg gaacaagaaa ttgctgaaat taaggcagtt 2460 attactgaaa aaattgctac tgcaacatca actgttattg cggaaactaa caaagtttta 2520 acaaatgaag ctaataagat tgctcaaggg gttgttgaag ttgttccgga aacaatgcca 2580 gctcaaagta tcttaaacaa agttgctaag agtgttagcg aaaataataa ttcagagtct 2640 tctaactatg gttcaactac tgtaagtaaa gtgacggcag caagtgatga aagcacaaaa 2700 cgagctgtca aagctggtat cgttatgctt acggcagtcg gtttaactgg atttaaactc 2760 agaaaacaag gcaaaaaa 2778 <210> 3 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptococcus parauberis membrane anchored protein forward primer <400> 3 taagaaggag atatacatat ggaattggaa aacgggaaaa c 41 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptococcus parauberis membrane anchored protein reverse primer <400> 4 gtggtggtgg tggtgctcga gttttttgcc ttgttttctg ag 42

Claims

서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 어류의 연쇄상구균 감염의 치료 또는 예방용 백신 조성물.
제 1항이 있어서, 상기 어류는 넙치, 농어, 송어, 우럭 및 돔류로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 종인 것을 특징으로 하는 연쇄상구균 감염 예방용 백신 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 연쇄상구균은 스트렙토코커스 파라우베러스(Streptococcus parauberis)인 것을 특징으로 하는 연쇄상구균 감염 예방용 백신 조성물.
제 1항에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 발현벡터.
제 4항에 따른 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포.
제 5항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
제 1항에 따른 백신조성물을 포함하는 어류의 연쇄상구균 감염증의 치료 또는 예방을 위한 사료조성물.
제 7항에 있어서, 상기 연쇄상구균은 스트렙토코커스 파라우베러스(Streptococcus parauberis)인 것을 특징으로 하는 연쇄상구균 감염 예방용 사료조성물.
제 1항에 따른 백신조성물을 어류에 투여함으로써 어류의 연쇄상구균 감염증을 치료 또는 예방하는 방법.
제 9항에 있어서, 상기 연쇄상구균은 스트렙토코커스 파라우베러스(Streptococcus parauberis)인 것을 특징으로 하는 연쇄상구균 감염증을 치료 또는 예방하는 방법.