KR20150085700A - Composition for detecting biomarker comprising target-specific probe and detectable labeling agent-antibody composite and using method of the same - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a composition comprising: a target-specific probe comprising a ferritin protein, a superparamagnetic nanoparticle combined with the ferritin protein, and a targeting antibody combined on the surface of the superparamagnetic nanoparticle; and a labeling agent-antibody composite comprising a detecting antibody combined on the target-specific probe and a detectable labeling agent for detecting a biomarker, and to a method for detecting a biomarker using the same or a detecting kit.

Description

표적-특이적 프로브와 표지물질-항체 복합체를 포함하는 바이오마커 탐지용 조성물 및 이의 이용방법 {COMPOSITION FOR DETECTING BIOMARKER COMPRISING TARGET-SPECIFIC PROBE AND DETECTABLE LABELING AGENT-ANTIBODY COMPOSITE AND USING METHOD OF THE SAME} TECHNICAL FIELD [0001] The present invention relates to a composition for detecting a biomarker including a target-specific probe and a labeling substance-antibody complex, and a method of using the same. More particularly, the present invention relates to a composition for detecting a biomarker,

본 발명은 페리틴 단백질과 상기 페리틴 단백질에 결합된 초상자성 나노입자와 상기 초상자성 나노입자의 표면에 결합된 표적화 항체(targeting antibody)을 포함하는 표적-특이적 프로브, 상기 표적-특이적 프로브와 탐지 가능한 표지물질(detectable labeling agent)에 결합된 탐지 항체(detecting antibody)를 포함하는 표지물질-항체 복합체를 포함하는 바이오마커 탐지용 조성물 및 이를 이용한 바이오마커의 탐지방법 또는 탐지키트에 관한 것이다.The present invention relates to a target-specific probe comprising a ferritin protein, a super-magnetic nanoparticle bound to the ferritin protein and a targeting antibody bound to the surface of the super-magnetic nanoparticle, a target-specific probe and detection An antibody complex containing a detection antibody bound to a detectable labeling agent, and a method or kit for detecting a biomarker using the composition.

바이오마커(biomarker)는 생물학적 또는 의학적 검체내에 존재하는 일종의 생체분자로서, 이들의 구조나 농도의 변화를 정성적 및/또는 정량적으로 탐지함으로써 질병의 상태를 진단하고, 약물의 치료효과 및 다른 질병과의 연관성을 종합적으로 판단하게 해주는 표식자 역할을 수행한다. 질병의 조기진단을 위해서는 발병 초기단계에서 나타나는 바이오마커를 정량적으로 분석하는 기술이 필수적이다. 이는, 질병의 모니터링을 위해 현재 사용되는 기술은 민감도, 검역속도, 및 비용 등의 한계성 때문에 질병의 조기진단에 대한 기술적 요구에 적절히 대응하지 못하고 있기 때문이다. A biomarker is a type of biomolecule present in biological or medical specimens that can be used to diagnose the condition of a disease by qualitatively and / or quantitatively detecting changes in structure or concentration thereof, And to make a comprehensive judgment of the relevance of the relationship. For the early diagnosis of diseases, it is essential to quantitatively analyze the biomarkers that appear at the early stages of the disease. This is because the technologies currently used for disease monitoring are not adequately addressing the technical requirements for early diagnosis of the disease due to limitations such as sensitivity, quarantine rate, and cost.

바이오마커를 정량적으로 분석하기 위해서, 효소면역항체법 (ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)법, 및 웨스턴 블랏팅법 및 질량분석기(Mass spectrometry)를 이용한 방법이 보편적으로 사용된다. ELISA의 경우 검정시료에 존재하는 다당류 혹은 페놀화합물들에 의해 반응이 저해되거나 조직 내에 존재하는 박테리오파지의 농도가 낮아, 정확히 탐지하기 어렵다. 질량분석기를 이용한 방법은 민감도가 매우 좋아서 미량의 바이오마커 분석에 적용 가능하나 주로 크로마토그래피법과 연계되어 분석되는 실험방법으로 인하여 재현성 확보가 곤란하고, 기기오차로 인하여 분석 데이터의 편차가 심한 단점이 있다. 또한 이들 방법은 과도한 노동력과 많은 시간이 소요된다.Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and Western blotting and mass spectrometry are commonly used to quantitatively analyze biomarkers. In the case of ELISA, the reaction is inhibited by the polysaccharide or phenol compounds present in the test sample, or the concentration of bacteriophage present in the tissue is low, which is difficult to detect accurately. The method using mass spectrometer is very sensitive and can be applied to trace amount of biomarker analysis. However, it is difficult to obtain reproducibility due to the experimental method that is mainly analyzed by chromatography method, and there is a disadvantage in that there is a large deviation of analysis data due to device error . Also, these methods are labor-intensive and time-consuming.

또한, 다양한 암 및 전염성 질환 등의 질병 진단을 위한 바이오마커의 검지가능 농도는 매우 불규칙하다. 현재 많이 사용되는 진단방법들은 바이오마커의 농도가 특정 임계값 이상이 되어야만 검출이 가능하고, 바이오마커가 검지될 수 있을 정도의 농도에서는 일반적으로 이미 질병이 심각하게 진전 또는 전파된 경우가 많기 때문에, 임계치 이하의 바이오마커 농도 즉, 조기에 질병 바이오마커를 검출하여 환자의 생존율을 높이고 전염성 질환의 전파를 예방할 수 있는 고감도의 검출기술이 필요하다.In addition, the detectable concentration of the biomarker for diagnosis of various diseases such as cancer and infectious diseases is very irregular. Currently, diagnostic methods that are widely used are capable of detection only when the concentration of the biomarker is above a certain threshold value. In many cases, the disease has generally progressed or propagated seriously at a concentration at which the biomarker can be detected, There is a need for a technique for detecting a biomarker concentration below a critical value, that is, detecting a disease biomarker at an early stage to increase the survival rate of the patient and to prevent the spread of infectious diseases.

저 농도의 바이오마커를 검출할 수 있는 시스템을 구축하기 위해서는 질환 특이적 마커 단백질을 효과적으로 검출할 수 있는 초고감도 검출 프로브의 개발과 미량의 바이오마커 검출을 통해 생성된 검출 신호를 증폭할 수 있는 기술개발이 필수적이다.In order to construct a system capable of detecting a low-concentration biomarker, development of an ultra-high-sensitivity detection probe capable of effectively detecting a disease-specific marker protein and technology capable of amplifying a detection signal generated through a trace amount of biomarker detection Development is essential.

이와 관련된 선행 특허로, 페리틴의 표면에 항체의 Fab만을 여러 개 발현시켜 바이오마커를 검지할 수 있는 프로브(WO 2008-053229)기술은 바이오마커를 탐지해야 하는 다양한 조건에 맞게 페리틴 표면에 결합한 항체의 개수를 용이하게 조절할 수 없는 문제점이 있을 수 있으며, 자성 나노입자에 PEG를 이용하여 코팅한 프로브를 제조하여 이를 이용한 바이오마커의 검출(WO 2012-105794)기술이 있으나, PEG는 폴리에틸글리콜로 크기가 균일하게 형성되지 않아 정밀한 검출이 필요한 경우 문제가 있다.In the related patent, a probe (WO 2008-053229) capable of detecting a biomarker by expressing only a plurality of Fabs of an antibody on the surface of ferritin (WO 2008-053229) is an antibody that binds to ferritin surface in various conditions to detect a biomarker There is a problem that the number can not be easily controlled, and there is a technology of detecting a biomarker using the magnetic nanoparticle coated with PEG (WO 2012-105794), but PEG is a polyethyl glycol There is a problem in that accurate detection is required.

본 발명의 목적은 페리틴 단백질, 상기 페리틴 단백질에 결합된 초상자성 나노입자, 및 상기 초상자성 나노입자의 표면에 결합된 표적화 항체를 포함하는, 표적-특이적 초상자성 프로브를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a target-specific superparamagnetic probe comprising a ferritin protein, a superparamagnetic nanoparticle bound to the ferritin protein, and a targeting antibody bound to the surface of the superparamagnetic nanoparticle.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 표적-특이적 초상자성 프로브 및 탐지 가능한 표지물질에 결합된 탐지 항체를 포함하는 표지물질-항체 복합체를 포함하는, 바이오마커 탐지용 조성물을 제공하는 것이다.It is yet another object of the present invention to provide a composition for detecting biomarkers, comprising a target substance-antibody complex comprising the target-specific superparamagnetic probe and the detection antibody bound to the detectable label substance.

본 발명의 또 다른 목적은 바이오마커를 함유하는 시료에, 상기 바이오마커 탐지용 조성물을 혼합하는 단계, 상기 혼합물에 자기장을 걸어 초상자성 프로브가 결합된 바이오마커를 수집하는 단계, 및 상기 바이오마커에 표적화된 상기 표지물질-항체 복합체의 표지물질을 검출하는 단계를 포함하는, 바이오마커의 탐지방법을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a method for detecting a biomarker, which comprises mixing a sample containing a biomarker with a composition for detecting the biomarker, collecting a biomarker to which a superparamagnetic probe is bound by applying a magnetic field to the mixture, And detecting the target labeled substance of the labeled substance-antibody complex.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명자들은 페리틴 단백질과 상기 페리틴 단백질에 결합된 초상자성 나노입자와 상기 초상자성 나노입자의 표면에 결합된 표적화 항체를 포함하는 표적-특이적 프로브 및 탐지 가능한 표지물질에 결합된 탐지 항체를 포함하는 표지물질-항체 복합체를 이용하는 경우, 분산용액에서 서로 뭉침현상 없이 목적하는 오직 바이오마커와만 결합하고, 결합된 나노프로브는 자력을 이용하여 완벽하게 분리함으로써 검출 효율을 극대화 할 수 있으며, 바이오마커의 절대 정량화가 가능함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
To achieve the above object, the present inventors have found that binding of a ferritin protein to a target-specific probe comprising a superparamagnetic nanoparticle bonded to the ferritin protein and a targeting antibody bound to the surface of the superparamagnetic nanoparticle and a detectable labeling substance In the case of using the labeling substance-antibody complex containing the detection antibody, the binding solution is bound only to the desired biomarker without aggregation in the dispersion solution, and the bound nanoprobe is completely separated using the magnetic force to maximize the detection efficiency And that the absolute quantification of the biomarker is possible, thus completing the present invention.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명은 페리틴 단백질, 상기 페리틴 단백질에 결합된 초상자성 나노입자, 및 상기 초상자성 나노입자의 표면에 결합된 표적화 항체를 포함하는, 표적-특이적 프로브에 관한 것이다.The present invention relates to a target-specific probe comprising a ferritin protein, a superparamagnetic nanoparticle bound to the ferritin protein, and a targeting antibody bound to the surface of the superparamagnetic nanoparticle.

본 발명에 따른 표적-특이적 프로브는 페리틴에 결합된 초상자성 나노입자의 표면에 항체를 고정화시켜 바이오마커를 표적하고 자력분리를 이용하여 쉽게 수집 및 분리할 수 있다. 또한, 잔류자화가 없는 초상자성 나노입자를 이용함으로써, 질환 바이오마커 검지 시, 나노프로브끼리 뭉치지 않고 오직 표적 바이오마커와만 결합되고, 자력분리를 이용하여 쉽게 수집할 수 있기 때문에 비 특이적인 반응을 줄이고, 검지효율을 극대화 할 수 있다.The target-specific probe according to the present invention can be easily collected and separated using magnetic separation by immobilizing the antibody on the surface of the ferritin-bound superparamagnetic nanoparticle to target the biomarker. In addition, by using superparamagnetic nanoparticles without residual magnetization, nano-probes can be bound only to the target biomarker without being clustered at the time of disease biomarker detection, and can be easily collected using magnetic separation, And the detection efficiency can be maximized.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 페리틴 단백질과 상기 페리틴 단백질에 결합된 초상자성 나노입자와 상기 초상자성 나노입자의 표면에 결합된 표적화 항체를 포함하는 표적-특이적 프로브를 제조하고 탐지 가능한 표지물질에 결합된 탐지 항체를 포함하는 표지물질-항체 복합체를 제조하여 바이오마커 탐지용 조성물을 제조하였다.상기 제조한 바이오마커 탐지용 조성물을 이용하여 바이오마커의 농도별로 탐지 및 검출할 수 있음을 확인하였는데, 그 결과 바이오마커의 농도가 높아질수록 형광의 강도 또한 강해지는 것을 확인하였다(실시예 3). 또한, 바이오마커를 샌드위치로 표적화 한 표적-특이적 프로브와 표지물질-항체 복합체를 자석을 이용하여 분리한 후, 자외선을 조사하여 형광의 강도를 측정하였다. 그 결과, 형광의 강도가 더욱 선명하게 구별되는 밴드형태로 나타나 바이오마커의 검출결과가 더욱 효과적임을 확인하였다(실시예 4).In a specific embodiment of the present invention, a target-specific probe comprising a ferritin protein, a superparamagnetic nanoparticle bound to the ferritin protein and a targeting antibody bound to the surface of the superparamagnetic nanoparticle is prepared and bound to a detectable labeling substance Antibody complex containing the detection antibody was prepared to prepare a composition for detecting a biomarker. It was confirmed that the composition for detecting a biomarker can be detected and detected by the concentration of the biomarker using the prepared composition for detecting a biomarker, As a result, it was confirmed that the higher the concentration of the biomarker, the stronger the fluorescence intensity (Example 3). In addition, a target-specific probe and a labeling substance-antibody complex in which a biomarker was targeted with a sandwich were separated using a magnet, and then the intensity of fluorescence was measured by irradiating ultraviolet light. As a result, it was confirmed that the detection result of the biomarker is more effective because the intensity of the fluorescence becomes more clearly distinguishable as a band form (Example 4).

본 명세서에서, 페리틴 단백질이라 함은 페리틴 단백질 자체, 페리틴의 중쇄, 페리틴의 경쇄, 이들의 동족체(analogue), 및 아포페리틴(apoferritin)를 포함한다. 페리틴(Ferritin) 은 세포외 기질 (extracellular matrix)에 광범위하게 존재하는 단백질 집합체로 24개의 단일 서브유닛으로 이루어져 있고, 외경이 12 nm, 내경이 8nm인 케이지 형태의 구조(cage-line nanostructure)을 형성한다. ferritin cage 는 약 8 nm 크기의 내부 빈 공간을 지니고 있으며, 내부에는 약 4500 개의 철 (Fe) 원자를 산화철 (ferric oxide) 상태로 담지하며, 이러한 철 원자를 대사과정 중에 공급하는 역할을 하고 있다.As used herein, the ferritin protein includes the ferritin protein itself, the heavy chain of ferritin, the light chain of ferritin, analogues thereof, and apoferritin. Ferritin is a protein aggregate that exists extensively in the extracellular matrix. It consists of 24 single subunits and forms a cage-line nanostructure with an outer diameter of 12 nm and an inner diameter of 8 nm. do. The ferritin cage has an internal void size of about 8 nm and contains about 4,500 Fe atoms in the form of ferric oxide and serves to supply these iron atoms during the metabolic process.

본 명세서에서 용어 "초상자성 나노입자는"는 외부에서 자기장을 가하는 경우 강한 자성을 띄는 물질을 의미한다. 구체적으로 Fe(III), Mg, Mn, Ni, Zn 및 Co로 이루어진 군으로부터 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 초상자성 나노입자는 평균 입경이 3 내지 100 nm일 수 있고, 4 내지 30 nm을 갖는 입자일 수 있다. 또한, 초상자성 나노입자는 평균자화력이 60 emu/g ~ 150 emu/g일 수 있고, 80 emu/g ~ 130 emu/g 일 수 있다.As used herein, the term "superpowder nanoparticle" means a material having strong magnetism when a magnetic field is externally applied. Specifically, it may include at least one kind selected from the group consisting of Fe (III), Mg, Mn, Ni, Zn, and Co. The super-magnetic nanoparticles according to the present invention may have an average particle size of 3 to 100 nm and may be particles having 4 to 30 nm. In addition, the super magnet nanoparticles may have an average magnetizing power of 60 emu / g to 150 emu / g, and 80 emu / g to 130 emu / g.

초상자성 나노입자를 합성하는 방법은 플라스크안에 Fe(III), Mg, Mn, Ni, Zn 및 Co로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 물질을 포함하는 상온의 원료 용액을 190~195℃까지 가온 한 다음 입자가 핵이 생성되도록 30분 동안 유지한다. 상기 핵생성 단계에서 얻어진 원료 용액을 용매의 끓는점까지 가온한 다음 동일 온도에서 30 ~ 50분 유지시켜 입자를 성장시키는 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. A method for synthesizing a superpowder magnetic nanoparticle is a method of heating a raw material solution containing a substance selected from the group consisting of Fe (III), Mg, Mn, Ni, Zn, and Co in a flask at 190 ° C to 195 ° C The particles are held for 30 minutes to produce nuclei. The raw material solution obtained in the nucleation step may be heated to the boiling point of the solvent and then kept at the same temperature for 30 to 50 minutes to grow the particles, but the present invention is not limited thereto.

본 발명에 따르면, 페리틴의 표면에 링커를 발현시켜 초상자성을 나타내는 다량의 자성 나노입자를 결합시킴으로써, 뭉침현상 없이 표면적을 극대화하여 극미량의 질환 바이오마커 검출을 용이하게 한다. 구체적으로 페리틴의 표면에 결합되는 초상자성 나노입자의 비는 몰비를 기준으로 페리틴 : 초상자성 나노입자 = 1:1 내지 1:6일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이와 같이, 페리틴의 표면에 초상자성 나노입자를 다량 결합시켜 표면적을 극대화시킴으로써 표적하는 바이오마커와의 반응의 최대화를 추구할 수 있다.According to the present invention, a linker is expressed on the surface of ferritin to bind a large amount of magnetic nanoparticles showing superparamagnetism, thereby maximizing the surface area without aggregation and facilitating the detection of a trace amount of disease biomarkers. Specifically, the ratio of the super-magnetic nanoparticles bonded to the surface of ferritin may be ferritin: super magnetic nanoparticles = 1: 1 to 1: 6 based on the molar ratio, but is not limited thereto. Thus, by maximizing the surface area by binding a large amount of the superparamagnetic nanoparticles to the surface of the ferritin, it is possible to maximize the reaction with the target biomarker.

상기 초상자성 나노입자는 친수성기와 소수성기를 갖는 양친성 물질을 포함하는 표면층을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 양친성 물질은 1-마이리스토일-2-하이드록시-에스엔-글리세로-3-포스포콜린(1-Myristoyl-2-Hydroxy-sn-Glycero-3-hosphocholine)(MHPC), 1,2-디스티어로일-에스엔-글라이세로-3-포스포에탄올아민-엔-메톡시 폴리에틸렌 글리콜-2000(1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-(Methoxy Polyethylene glycol)-2000(DPPE-PEG2000), 1,2-디오레일-에스엔-글리세로-3-엔-{5-아미노-1-복실펜틸}이미노디아세틱 에시드 석시닐 니켈쏠트(1,2-dioleoyl-snglycero-3-N-{5-amino-1-carboxypentyl} iminodiacetic acid succinyl nickel salt)(Ni-NTA)일 수 있으나, 친수성기와 소수성기를 갖는 양친성 물질로 초상자성 나노입자의 표면을 친수성으로 기능화할 수 있는 물질에 해당하면 제한없이 본 발명의 범위에 해당한다.The super-magnetic nanoparticle may include, but is not limited to, a surface layer comprising an amphiphilic substance having a hydrophilic group and a hydrophobic group. For example, the amphiphilic substance may be 1-Myristoyl-2-Hydroxy-sn-Glycero-3-phosphocholine (MHPC) , 1,2-distyroyl-ene-glycero-3-phosphoethanolamine-ene-methoxypolyethylene glycol-2000 (1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine- N- glycol-2000 (DPPE-PEG2000), 1,2-diorail-ene-glycero-3-ene-5-amino-1-phenylpentyliminodiacetic acid succinylmethoxide (Ni-NTA), but an amphiphilic substance having a hydrophilic group and a hydrophobic group, the surface of the super-magnetic nanoparticle is hydrophilic The scope of the present invention is not limited as long as it is a functional material.

본 명세서에서, 표적화 항체는 탐지 또는 정량대상 바이오마커에 특이적인 표적화 능력을 갖는 항체로서, 구체적인 예를 들면 단클론 또는 다클론 항체, 면역학적으로 활성인 단편(예를 들어, Fab 또는 (Fab)2 단편), 항체 중쇄, 항체 경쇄, 유전자 조작된 단일쇄 분자, 키메릭 항체, 또는 인간화 항체 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 탐지 또는 정량대상 바이오마커에 특이적인 표적화 능력을 갖는 앱타머, 앱타이드 또는 펩타이드일 수 있다.As used herein, a targeting antibody is an antibody having a targeting ability specific for a biomarker to be detected or quantified, and specifically includes, for example, a monoclonal or polyclonal antibody, an immunologically active fragment (for example, Fab or (Fab) 2 But are not limited to, aptamers, aptamers, and the like, which have a targeting ability specific for a biomarker to be detected or quantified, such as, for example, a fragment of an antibody, an antibody heavy chain, an antibody light chain, a genetically engineered single chain molecule, a chimeric antibody, Or a peptide.

본 발명의 일예에서, 상기 페리틴 단백질과 초상자성 나노입자 사이에는 제1 링커를 추가로 포함할 수 있고, 상기 제1 링커는 상기 페리틴 단백질의 C-말단 또는 N-말단에 연결되며 페리틴 단백질의 페리틴 구조 형성을 저해하지 않는 단백질 또는 펩타이드일 수 있다. 상기 페리틴 단백질과 초상자성 나노입자는 직접 연결되거나, 30 개 이내의 아미노산을 포함하는, 바람직하게는 15 내지 25개 아미노산으로 구성된 링커를 사용하여 연결될 수 있다.In one embodiment of the present invention, a first linker may be further included between the ferritin protein and the superparamagnetic nanoparticles, wherein the first linker is linked to the C-terminus or N-terminus of the ferritin protein, Or a protein or peptide that does not inhibit the formation of the structure. The ferritin protein and the superparamagnetic nanoparticles can be directly linked or linked using a linker consisting of preferably 15 to 25 amino acids, including up to 30 amino acids.

본 발명의 또 다른 일예에서, 상기 상기 페리틴 단백질과 제1 링커는 하나의 융합 단백질로 구성되는 것일 수 있다. 예를 들어, 페리틴 단백질의 표면에 제1 링커를 발현시킨 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the ferritin protein and the first linker may be composed of one fusion protein. For example, the first linker may be expressed on the surface of the ferritin protein.

페리틴 단백질과 초상자성 나노입자를 결합시키는 방법은, i) 중쇄(heavy chain)와 경쇄(lightchain)로 구성된 24개의 동일한 단백질 서브유닛(subunit)의 페리틴 단백질 표면에 헥사히스티딘 시퀀스(Hexahistidine sequence)를 포함하는 단백질 G, 단백질 A, 단백질 A/G 및 Fc 리셉터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 링커 단백질을 발현시키는 단계, ii) MHPC, DPPE-PEG2000 및 Ni-NTA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 지질을 이용하여 초상자성 나노입자의 표면을 친수성으로 변환하여 기능화 시키는 단계, iii) 초상자성 나노입자의 표면에 헥사히스티딘 시퀀스를 포함하는 링커 단백질을 니켈-히스티딘 결합반응을 이용하여 고정하는 단계를 포함하는 방법으로 이루어질 수 있다.Methods for binding ferritin protein to superparamagnetic nanoparticles include: i) incorporating a hexahistidine sequence on the surface of the ferritin protein of 24 identical protein subunits consisting of a heavy chain and a lightchain; Expressing at least one linker protein selected from the group consisting of a protein G, a protein A, a protein A / G and an Fc receptor which is selected from the group consisting of MHPC, DPPE-PEG2000 and Ni-NTA Converting the surface of the superpowder magnetic nanoparticles to hydrophilicity to function; and iii) fixing the linker protein comprising the hexa-histidine sequence on the surface of the superpowder nanoparticles using a nickel-histidine binding reaction. .

또한, 상기 초상자성 나노입자와 표적화 항체 사이에는 제2 링커를 추가로 포함하며, 상기 제2 링커는 상기 초상자성 나노입자의 표면 중 상기 페리틴 단백질과 연결되지 않은 부분에 결합된 것일 수 있다. 상기 초상자성 나노입자와 표적화 항체는 직접 연결되거나, 30 개 이내의 아미노산을 포함하는, 바람직하게는 15 내지 25개 아미노산으로 구성된 링커를 사용하여 연결될 수 있다.Further, a second linker may be further included between the supernatant magnetic nanoparticle and the targeting antibody, and the second linker may be bound to a portion of the surface of the super-magnetic nanoparticle not connected to the ferritin protein. The superpowder nanoparticles and the targeting antibody can be linked directly or linked using a linker consisting of preferably 15 to 25 amino acids, including up to 30 amino acids.

상기 초상자성 나노입자와 표적화 항체는 직접 결합되거나 제2 링커를 통하여 결합된 것일 수 있는데, 구체적으로, i) 친수성으로 변환 시킨 초상자성 나노입자 표면 중 페리틴과 결합되지 않은 부분에 제2 링커를 니켈-히스티딘 결합반응을 이용하여 결합시키는 단계, ii) 표적화 항체를 페리틴의 표면에 결합된 초상자성 나노입자의 표면에 고정시켜서 표적화 항체의 Fab를 활성화 시키는 단계를 포함하는 방법으로 수행될 수 있다.The superparamagnetic nanoparticles and the targeting antibody may be directly bound or bound to each other through a second linker. Specifically, i) the second linker may be a nickel -Histidine binding reaction, and ii) immobilizing the targeting antibody on the surface of the superparamagnetic nanoparticles bound to the surface of the ferritin to activate the Fab of the targeting antibody.

본 발명에서 "링커"란, 페리틴 단백질과 초상자성 나노입자의 연결, 초상자성 나노입자와 표적화 항체의 연결 또는 하기 탐지 가능한 표지물질과 탐지 항체의 연결에 사용되는 것으로, 예를 들어, 단백질 G, 단백질 A, 단백질 A/G, Fc 수용체, 바이오틴, 아비딘, 히스티딘, Ni-NTA, 또는 스트랩트아비딘으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The term "linker" used in the present invention refers to a link between a ferritin protein and a superparamagnetic nanoparticle, a link between a superpowder nanoparticle and a targeting antibody, or a link between a detectable labeling substance and a detectable antibody. But are not limited to, protein A, protein A / G, Fc receptor, biotin, avidin, histidine, Ni-NTA, or streptavidin.

본 발명의 일실시예에 따른 표적-특이적 프로브의 구조는 페리틴 단백질을 심으로 초상자성 나노입자가 페리틴 단백질을 둘러쌓고 있고, 상기 초상자성 나노입자의 외부로 표적화 항체가 고정화되어 있을 수 있다. 이는 페리틴 단백질을 코어라고 할 때, 초상자성 나노입자 및 표적화 항체를 표면으로 볼 수 있어, 코어-표면층 구조를 갖는다고 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The structure of the target-specific probe according to an embodiment of the present invention may include a ferritin protein core, superparamagnetic nanoparticles surrounding the ferritin protein, and a targeting antibody immobilized outside the superparamagnetic nanoparticle. When the ferritin protein is referred to as a core, the superpowder nanoparticle and the target antibody can be seen as the surface, and the core-surface layer structure is not limited thereto.

또한, 상기 표적-특이적 프로브에서 페리틴 단백질, 초상자성 나노입자 및 표적화 항체의 비율은 몰비를 기준으로 1: 1: 1 내지 1: 6: 6일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In addition, the ratio of the ferritin protein, the superpowder nanoparticle, and the targeting antibody in the target-specific probe may be 1: 1: 1 to 1: 6: 6 based on the molar ratio, but is not limited thereto.

본 발명은 일 구현예로, 본 발명의 표적-특이적 프로브 및 탐지 가능한 표지물질에 결합된 탐지 항체를 포함하는 표지물질-항체 복합체를 포함하는, 바이오마커 탐지용 조성물을 제공한다.In one embodiment, the present invention provides a composition for detecting biomarkers, comprising a target substance-antibody complex comprising a target-specific probe of the present invention and a detection antibody bound to a detectable label substance.

본 발명에 따른 바이오마커 탐지용 조성물은 페리틴에 결합된 초상자성 나노입자의 표면에 항체를 고정화시켜 바이오마커를 표적하고 자력분리를 이용하여 쉽게 수집 및 분리할 수 있다. 표지물질-항체 복합체를 이용함으로써, 양자점 및 형광을 이용하여 특이적인 항원을 샌드위치 방법으로 검출할 수 있다. 또한 표지물질-항체 복합체에 결합된 다량의 양자점을 통해서 증폭된 검지 신호를 얻을 수 있어 극미량의 바이오마커 검지시의 오차를 최소화 할 수 있으며, 농도에 따른 선형적인 검출신호를 통하여 질환 바이오마커를 절대 정량화 할 수 있다.The composition for detecting biomarkers according to the present invention can easily collect and isolate biomarkers by immobilizing antibodies on the surfaces of ferritin-bound superparamagnetic nanoparticles using magnetic separation. By using a labeling substance-antibody complex, specific antigens can be detected by a sandwich method using quantum dots and fluorescence. In addition, it is possible to obtain the amplified detection signal through a large quantum dot bound to the labeling substance-antibody complex, thereby minimizing the error in detecting a very small amount of biomarker. Can be quantified.

상기 표적-특이적 초상자성 프로브의 표적화 항체와 표지물질-항체 복합체의 탐지 항체는 동일하거나 상이할 수 있으며, 탐지대상 바이오마커에 따라 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 구체적으로 표적화 항체와 탐지 항체는 단일클론 항체 또는 다클론항체(polyclonal antibody)일 수 있다. 일예로, 표적화 항체는 단일클론 항체이고 탐지 항체는 바이오 마커에 결합하는 부분이 표적화 항체와 다른 단일클론 항체를 사용하거나, 다클론항체일 수 있다.The target antibody of the target-specific superparamagnetic probe and the detection antibody of the labeling substance-antibody complex may be the same or different, and may be appropriately selected depending on the biomarker to be detected. Specifically, the targeting antibody and the detection antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. For example, the targeting antibody may be a monoclonal antibody, and the detection antibody may be a polyclonal antibody, or a portion that binds to the biomarker may be a monoclonal antibody different from the targeting antibody.

상기 탐지 항체는 표적-특이적 프로브에 포함된 표적화 항체와 동일한 바이오마커의 상이한 부분을 표적화할 수 있다. 구체적으로 탐지 항체가 표적화 하는 바이오마커의 부분과 표적화 항체가 표적화 하는 바이오마커의 부분은 바이오마커와의 결합에 방해가 되지 않을 만큼 충분히 떨어져 있는 부분일 수 있다.The detection antibody can target different portions of the same biomarker as the targeting antibody contained in the target-specific probe. Specifically, the portion of the biomarker targeted by the detection antibody and the portion of the biomarker targeted by the targeting antibody may be a portion sufficiently distant from the binding with the biomarker.

또한, 본 발명은 상기 탐지 가능한 표지물질과 탐지 항체의 사이에 제3 링커를 추가로 포함할 수 있다.In addition, the present invention may further comprise a third linker between the detectable labeling substance and the detection antibody.

본 발명의 일 실시예로, 상기 탐지 가능한 표지물질은 양자점, 자성비드 나노입자, 금 나노입자, 형광염료, 형광단백질, 나노인광체 또는 실리콘 나노입자일 수 있다. 상기 표지물질은 그 자체로 단백질 G, 단백질 A, 단백질 A/G, Fc 수용체, 바이오틴, 아비딘, 히스티딘, Ni-NTA, 또는 스트랩트아비딘에 결합시킬 수 있고 상기 링커에 대한 결합능을 높이고자 표지물질에 화학적 처리를 가한 후에 링커에 결합시킬 수도 있다. 구체적으로, 상기 양자점은 양친성 물질을 포함하는 물질을 이용하여 표면을 친수성으로 변화시킨 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 양친성 물질은 MHPC, DPPE-PEG2000, Ni-NTA 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the detectable labeling material may be a quantum dot, a magnetic bead nanoparticle, a gold nanoparticle, a fluorescent dye, a fluorescent protein, a nanophosphor, or a silicon nanoparticle. The labeling substance itself can bind to protein G, protein A, protein A / G, Fc receptor, biotin, avidin, histidine, Ni-NTA or streptavidin, To the linker after chemical treatment. Specifically, the quantum dot may have a hydrophilic surface by using a substance containing an amphipatic substance. For example, the amphipatic material may be at least one selected from the group consisting of MHPC, DPPE-PEG2000, Ni-NTA, and mixtures thereof.

구체적으로 상기 양자점과 탐지 항체는 직접 결합되거나 제3 링커를 통하여 결합된 것일 수 있다. 예를 들어, ⅰ) MHPC, DPPE-PEG2000, Ni-NTA 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 이용하여 양자점들의 표면을 친수성으로 변환시키는 단계, ii) 양자점의 표면에 헥사히스티딘 시퀀스를 포함하는 제3 링커를 니켈-히스티딘 결합반응을 이용하여 고정하는 단계, 및 iii) 제3 링커 위에 탐지 항체를 고정시키는 단계를 포함하는 방법으로 수행될 수 있다. 제3 링커에 의해 탐지 항체의 Fab가 항상 활성화될 수 있다.Specifically, the quantum dot and the detection antibody may be directly bound or bound through a third linker. For example, i) converting the surface of the quantum dots into hydrophilicity using at least one selected from the group consisting of MHPC, DPPE-PEG2000, Ni-NTA and mixtures thereof, ii) introducing a hexa histidine sequence into the surface of the quantum dots Immobilized using a nickel-histidine binding reaction, and iii) immobilizing the detection antibody on the third linker. Fab of the detection antibody can always be activated by the third linker.

상기 초상자성 나노입자 및 양자점의 표면은 MHPC, DPPE-PEG2000, Ni-NTA 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 이루어질 수 있는데, 예를 들어, 일정량의 MHPC, DPPE-PEG2000 및 Ni-NTA를 순서대로 나노입자와 같이 혼합하여 에멀젼 상태로 만들고, 초음파로 처리해서 나노입자 표면에 기능성 지질층을 형성할 수 있다. 이 경우, 소수결합에 의해 나노입자 표면에 지질의 소수성 부분이 결합되어 지질의 친수성 부분이 외측을 향한 채 나노입자 표면에 코팅되므로 나노입자 표면을 친수성으로 기능화 시킬 수 있다.The superpowder nanoparticles and the surfaces of the quantum dots may be made of at least one selected from the group consisting of MHPC, DPPE-PEG2000, Ni-NTA, and mixtures thereof. For example, a certain amount of MHPC, DPPE-PEG2000 and Ni- Can be mixed with the nanoparticles in order to form an emulsion state, and treated with ultrasonic waves to form a functional lipid layer on the surface of the nanoparticles. In this case, hydrophobic binding of the lipid on the surface of the nanoparticles by the hydrophobic bonding allows the hydrophilic portion of the lipid to be coated on the nanoparticle surface while facing the hydrophilic portion of the lipid, so that the surface of the nanoparticle can be hydrophilized.

MHPC는 단일 아실(acyl)기 사슬 지질이므로, 초상자성 나노입자 및 양자점의 구형 표면에 조밀하게 코팅할 수 있다. 또한, DPPE-PEG2000은 지질이 코팅된 나노입자에 분산 안정성을 부여할 수 있다. 그리고 Ni-NTA는 단백질 G에 있는 히스티딘과 결합하여 친수성의 초상자성 나노입자 및 양자점과 단백질 G를 결합시키고, 초상자성 나노입자 및 양자점의 분리를 위해 후속 공정에서 이미다졸이 첨가된 경우, 선택적으로 분리하는 역할을 할 수 있다.Since MHPC is a single acyl chain lipid, it can be densely coated on the spherical surface of the supernatant nanoparticles and quantum dots. DPPE-PEG2000 can also impart dispersion stability to lipid-coated nanoparticles. And Ni-NTA binds histidine in protein G to bind hydrophilic superparamagnetic nanoparticles and quantum dots to protein G, and when imidazole is added in subsequent steps for the separation of superpowder nanoparticles and quantum dots, It can play a role of separating.

본 발명에 있어서, 상기 페리틴 단백질과 초상자성 나노입자 사이에 위치한 제1 링커, 상기 초상자성 나노입자와 표적화 항체 사이에 위치한 제2 링커 및 상기 표지물질과 탐지 항체 사이에 위치한 제3 링커는 동일하거나 상이할 수 있다.In the present invention, the first linker positioned between the ferritin protein and the superparamagnetic nanoparticles, the second linker positioned between the superpowder nanoparticle and the targeting antibody, and the third linker positioned between the labeling substance and the detection antibody are the same Can be different.

본 발명의 일 양태로, 본 발명은 바이오마커를 함유하는 시료에, 본 발명의 바이오마커 탐지용 조성물을 혼합하는 단계, 및 상기 바이오마커에 표적화된 상기 표지물질-항체 복합체의 표지물질을 검출하는 단계를 포함하는, 바이오마커의 탐지방법일 수 있다. 예를 들어, 상기 검출하는 단계는 양자점에서 방출되는 형광강도를 측정하여 이루어질 수 있다. 본 발명에서 형광강도(Fluorescence intensity) 값은 상대적인 수치이고, Arbitrary unit(a.u.)이다.In one aspect of the present invention, the present invention provides a method for detecting a biomarker comprising the steps of mixing a sample containing a biomarker with a composition for detecting a biomarker of the present invention, and detecting the labeled substance of the labeled substance- And detecting the biomarker. For example, the detecting step may be performed by measuring fluorescence intensity emitted from the quantum dot. In the present invention, the fluorescence intensity value is a relative value and is Arbitrary unit (au).

일예로, 상기 바이오마커 탐지용 조성물을 혼합하는 단계는, 상기 표적-특이적 프로브를 용기에 첨가하는 단계, 바이오마커를 함유하는 시료를 표적-특이적 프로브가 첨가된 용기에 혼합하는 단계, 상기 용기에 표지물질-항체 복합체를 혼합하는 단계, 및 용기 외부에서 자기장을 인가하여 초상자성 나노입자가 결합된 바이오마커를 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, 표적-특이적 프로브와 표지물질-항체 복합체의 농도의 비는 몰비를 기준으로 표적-특이적 프로브 : 표지물질-항체 복합체의 농도 = 1: 1 내지 1 : 5일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.For example, mixing the biomarker detection composition may include adding the target-specific probe to the vessel, mixing the sample containing the biomarker into a vessel to which the target-specific probe has been added, Mixing the labeling substance-antibody complex into the container, and separating the biomarker bound with the supernatant magnetic nanoparticles by applying a magnetic field outside the container. Specifically, the ratio of the concentration of the target-specific probe and the labeling substance-antibody complex may be 1: 1 to 1: 5 the concentration of the target-specific probe: labeling substance-antibody complex on the basis of the molar ratio, It does not.

또한, 상기 자기장을 인가하는 방법은 자석을 이용하여 간단히 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 초상자성 나노입자에 인력을 나타낼 수 있는 방법이면 모두 본 발명의 범위에 포함된다.In addition, the method of applying the magnetic field can be simply performed using a magnet, but not limited thereto, and any method capable of exhibiting attracting force to superparamagnetic nanoparticles is included in the scope of the present invention.

상기 바이오마커의 탐지방법의 일 구현예로, 상기 표지물질이 검출되는 경우 바이오마커가 상기 시료에 존재하는 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.In one embodiment of the method for detecting a biomarker, it may further include determining that a biomarker is present in the sample when the labeling substance is detected.

보다 상세하게, 본 발명의 바이오마커의 탐지방법은 ⅰ) 본 발명의 표적-특이적 프로브를 제공하는 단계, ⅱ) 본 발명의 표지물질-항체 복합체를 제공하는 단계, ⅲ) 상기 표적-특이적 프로브와 상기 표지물질-항체 복합체에 의해 바이오마커를 샌드위치 표적시키는 단계, ⅳ) 양자점들의 흡광도 또는 형광의 세기를 측정하여 바이오마커의 농도를 정량화하는 단계를 포함할 수 있다.More specifically, the method for detecting a biomarker of the present invention comprises the steps of: i) providing a target-specific probe of the present invention; ii) providing a labeling substance-antibody complex of the present invention; iii) Subjecting the biomarker to a sandwich target by the probe and the labeling substance-antibody complex, and iv) measuring the absorbance or fluorescence intensity of the quantum dots to quantify the concentration of the biomarker.

일예로, 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 페리틴을 함유하는 페리틴 용액에 초상자성 나노입자와 표적용 항체(표적화 항체)를 혼합하여 본 발명에 따른 표적-탐지용 프로브(페리틴에 초상자성 나노입자와 항체가 결합된 프로브)를 제조하고, 상기 제조한 표적-탐지용 프로브와 표지물질-항체 복합체(양자점이 결합된 탐지용 항체)를 바이오마커가 포함된 용기에 혼합한다. 이 과정에서 표적-탐지용 프로브와 표지물질-항체 복합체는 바이오마커를 샌드위치 표적화 할 수 있다. 이 후, 자석을 이용하여 샌드위치 표적화된 바이오마커를 쉽게 분리하고 바이오마커의 양을 정량분석 할 수 있다.For example, as can be seen from FIG. 3, the ferritin solution containing ferritin is mixed with the tabular antibody (target antibody) and the target nanoparticle is mixed with the target-detecting probe according to the present invention And an antibody-bound probe) is prepared, and the prepared target-detection probe and labeling substance-antibody complex (detection antibody combined with quantum dots) are mixed in a container containing a biomarker. In this process, the target-detection probe and the labeling material-antibody complex can be used to sandwich the biomarker. Thereafter, the sandwich-targeted biomarker can be easily separated using a magnet, and the amount of the biomarker can be quantitatively analyzed.

상기 샌드위치 표적화된 바이오마커는 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 바이오마커의 한 부분이 페리틴 단백질에 초상자성 나노입자의 표면에 결합된 표적화 항체에 결합되고, 표적화 항체가 결합된 부분과 다른 부분이 표지물질-항체 복합체의 탐지용 항체에 의해 결합됨으로써, 바이오마커의 서로 다른 부분이 표적-탐지용 프로브와 표지물질-항체 복합체에 의해 탐지 및 검출되는 것일 수 있다.As shown in FIG. 1, the sandwich-targeted biomarker has a structure in which a part of the biomarker is bound to a targeting antibody bound to the surface of the superparamagnetic nanoparticle to ferritin protein, and a part other than the part to which the targeting antibody binds Antibody complexes so that different portions of the biomarker can be detected and detected by the target-detection probe and the labeling material-antibody complex.

또한, 본 발명은 표지물질을 다양한 농도에서 흡광도 또는 형광의 세기를 측정하여 제작한 표준 곡선과 상기 본 발명의 바이오마커의 탐지방법을 통해 검출한 바이오마커에 표적화된 표지물질-항체 복합체에 포함된 표지물질의 흡광도 또는 형광의 세기를 비교하여 시료 내 바이오마커를 정량할 수 있다.In addition, the present invention relates to a method for detecting the presence of a labeled substance contained in a labeled substance-antibody complex targeted to a biomarker detected through a detection method of the biomarker of the present invention and a standard curve prepared by measuring the absorbance or fluorescence intensity at various concentrations of the labeled substance The biomarker in the sample can be quantified by comparing the absorbance of the labeled substance or the intensity of fluorescence.

구체적으로 바이오마커를 정량화하는 방법은 i) 농도가 서로 상이한 또 다른 양자점들을 포함하는 복수의 용액들을 제공하는 단계, ii) 복수의 용액들의 350 nm 파장에서의 흡광도 또는 형광의 세기를 측정하는 단계, iii) 또다른 양자점들의 농도와 흡광도 또는 형광의 세기를 비교하여 표준 곡선을 제공하는 단계, iv) 분리된 양자점의 350 nm 파장에서의 흡광도 또는 형광의 세기를 측정하는 단계, v) 분리된 양자점의 350 nm 파장에서의 흡광도 또는 형광의 세기를 표준 곡선과 비교하여 분리된 양자점의 농도를 계산하는 단계, 및 vi) 분리된 양자점의 농도와 비례하는 바이오마커의 농도를 정량화하는 단계를 포함하는 방법으로 수행될 수 있다.Specifically, a method for quantifying a biomarker comprises the steps of: i) providing a plurality of solutions comprising different quantum dots having different concentrations, ii) measuring the absorbance or fluorescence intensity of the plurality of solutions at a wavelength of 350 nm, iii) comparing the concentration of the other quantum dots with the intensity of the absorbance or fluorescence to provide a standard curve, iv) measuring the intensity of the absorbance or fluorescence at the 350 nm wavelength of the separated quantum dot, v) Comparing the absorbance or fluorescence intensity at a wavelength of 350 nm with a standard curve to calculate the concentration of the separated quantum dots, and vi) quantifying the concentration of the biomarker proportional to the concentration of the separated quantum dots .

본 발명의 또 다른 양태로, 본 발명은 본 발명의 바이오마커 탐지용 조성물의 표지물질을 검출하는 검출기를 포함하는, 바이오마커의 진단키트에 관한 것이다. 구체적으로 상기 검출기는 자외선 방출기, 자외선 램프, 형광검출기 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 사용하는 탐지 물질을 검출할 수 있는 것에 해당하면 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 일예로, 도 8에서 보는 바와 같이, 본 발명의 바이오마커의 진단키트는 표적-특이적 프로브 용액(도 8의 A), 표지물질-항체 복합체 용액(도 8의 B), 반응용기(도 8의 C), 분리용 자석(도 8의 D)를 포함할 수 있다.In another aspect of the present invention, the present invention relates to a diagnostic kit for a biomarker comprising a detector for detecting a labeling substance of a composition for detecting biomarkers of the present invention. Specifically, the detector may be an ultraviolet ray emitter, an ultraviolet lamp, a fluorescence detector, or the like. However, the present invention is not limited thereto. For example, as shown in FIG. 8, the diagnostic kit of the biomarker of the present invention comprises a target-specific probe solution (FIG. 8A), a labeling substance- antibody complex solution (FIG. 8B) C), and a separating magnet (D in Fig. 8).

본 발명은 페리틴 단백질 입자의 표면에 초상자성 자성 나노입자와 제 1 표적용 항체를 결합시켜 극대화 된 표면적을 이용하여 저농도의 바이오마커를 초고감도로 검출할 수 있다. 또한, 본 발명에서 초상자성 나노입자를 이용함으로써 뭉침현상 없이 외부 자장인가를 통해서 손쉽게 나노프로브를 수집하여 효율적으로 바이오마커를 탐지할 수 있다.The present invention can detect a low concentration of biomarkers with ultrahigh sensitivity using a maximized surface area by combining the super magnetic magnetic nanoparticles and the first tabular antibody on the surface of ferritin protein particles. Also, in the present invention, by using the super-magnetic nanoparticles, it is possible to easily collect nanoprobe through application of an external magnetic field without aggregation and efficiently detect the biomarker.

본 발명은 페리틴과 결합된 초상자성 나노입자에 부착된 바이오마커 검출용 항체를 집약시켜서 감도를 높이고, 초상자성 나노입자가 외부 자장에 반응하는 성질을 이용하여 효울적으로 자력분리를 하고, 다량의 양자점의 형광 및 흡광도를 이용하여 검지 된 바이러스의 신호 증폭 및 절대 정량화까지 가능한 신개념의 바이오마커 탐지용 조성물에 관한 것으로, 이를 이용하면, 조기에 다양한 전염성 질병 및 질환을 검지하여 질환의 전파 방지 및 진단/치료비의 획기적인 절감에 기여를 할 수 있다.Disclosure of the Invention The present invention relates to a magnetic nanoparticle comprising ferrite nanoparticles bound to ferritin, an antibody for detecting a biomarker attached to the nanoparticle is concentrated to increase the sensitivity, the superpowder nanoparticles are magnetically separated using the property of reacting with external magnetic field, The present invention relates to a novel biomarker detection composition capable of up to signal amplification and absolute quantification of detected viruses using fluorescence and absorbance of quantum dots. By using this composition, it is possible to detect various infectious diseases and diseases early, It can contribute to the dramatic reduction of treatment costs.

도 1은 본 발명의 표적-특이적 프르브와 표지물질-항체 복합체가 표적하는 바이오마커를 샌드위치 표적시킨 개념도를 나타낸다.
도 2는 페리틴 단백질과 단백질 G의 융합 단백질의 유전자 지도를 나타낸다.
도 3은 페리틴 단백질 표면에 초상자성 나노입자를 결합하고, 그 표면에 제1 표적용 항체를 결합한 표적-특이적 프로브의 개발 과정 및, 제2 표적용 항체를 양자점에 결합시켜 표지물질-항체 복합체(바이오마커 정량분석용)를 제작한 뒤, 상기 두 가지를 이용하여 바이오마커를 샌드위치 표적하는 모식도를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 표적용 나노프로브를 제작할 때의 단계마다 크기를 측정한 DLS 결과를 나타낸다. 맨 위(녹색)는 페리틴 단백질과 단백질 G 융합 단백질의 크기, 가운데(주황색)는 초상자성 나노입자와 상기 융합 단백질이 결합한 복합체의 크기, 맨 아래(파란색)는 초상자성 나노입자의 표면에 표적화 항체를 고정화 시킨 표적-특이적 프로브의 크기를 나타낸다.
도 5는 바이오마커를 본 발명의 조성물을 이용하여 검출한 뒤, 절대 정량화를 위한 양자점의 광학적 특성을 보여준다.
도 6a는 본 발명의 표적-특이적 프로브의 전자현미경 사진을 나타낸다.
도 6b는 나노프로브의 자력분리효율을 나타낸다.
도 6c는 다양한 농도 (8.3 ng/ml, 33.3 ng/ml, 83.3 ng/ml, 166.7 ng/ml)의 바이오마커가 들어있는 시료를 본 발명의 바이오마커 탐지용 조성물을 이용하여 검출한 뒤(좌측 상단), 이를 자외선을 이용하여 확인하는 (우측 상단) 사진을 나타낸다. 또한, 시료에 자석을 이용하여 수집하여(좌측 하단) 이에, 자외선을 조사한 사진(우측 하단)을 나타낸다.
도 7 a는 다양한 농도(0.024, 0.048, 0.097, 0.195, 0.39, 0.78, 1.56, 3.13, 6.25, 12.5 nM)의 양자점 용액의 형광세기를 측정하여 표로 나타낸 표준곡선으로, 양자점 농도와 형광세기가 선형으로 비례하는 것을 보여주는 그래프이다. 도 7b는 다양한 농도(5.0, 8.3, 33.3, 83.3, 166.7 ng/mL)의 바이오마커가 들어있는 시료를 본 발명의 바이오마커 탐지용 조성물을 이용하여 검출 한 뒤, 도 7의 a의 표준곡선을 이용하여 검출된 바이오마커의 개수와 나노프로브의 양자점의 개수가 일치하여, 정량분석이 가능함을 보여준다.
도 8은 본 발명에서 개발된 나노프로브를 이용한 바이오마커 검출키트를 나타낸다. A는 본 발명의 표적-특이적 프로브 용액, B는 본 발명의표지물질-항체 복합체 용액, C는 반응용기, D는 분리용 자석을 나타낸다.
Brief Description of the Drawings Fig. 1 is a conceptual diagram showing a sandwich-targeted biomarker targeted by a target-specific probe and a labeling substance-antibody complex of the present invention.
Fig. 2 shows a gene map of a fusion protein of ferritin protein and protein G. Fig.
FIG. 3 is a schematic diagram showing the process of developing a target-specific probe in which superparamagnetic nanoparticles are bound to the surface of ferritin protein and a first labeled antibody is bound to the surface of the ferritin protein, and the labeled target- (For quantitative analysis of biomarkers), and then sandwiching the biomarkers using the above-mentioned two.
FIG. 4 shows DLS results obtained by measuring the size of each of the nanoprobes prepared in accordance with an embodiment of the present invention. In the middle (orange), the size of the complex in which the superficial magnetic nanoparticle and the fusion protein are bound, and the bottom (blue) indicates the size of the target antibody Lt; / RTI > probe-immobilized probe-specific probe.
Figure 5 shows the optical properties of quantum dots for absolute quantitation after detection of biomarkers using the composition of the present invention.
6A shows an electron micrograph of a target-specific probe of the present invention.
6B shows the magnetic force separation efficiency of the nano-probe.
FIG. 6C shows a sample containing biomarkers at various concentrations (8.3 ng / ml, 33.3 ng / ml, 83.3 ng / ml, and 166.7 ng / ml) using the composition for detecting biomarkers of the present invention Top), and the photo is confirmed using ultraviolet light (top right). The sample is collected using a magnet (lower left) and irradiated with ultraviolet light (lower right).
Figure 7a is a standard curve showing the fluorescence intensities of the quantum dots of various concentrations (0.024, 0.048, 0.097, 0.195, 0.39, 0.78, 1.56, 3.13, 6.25 and 12.5 nM) As shown in FIG. FIG. 7B shows a sample containing biomarkers of various concentrations (5.0, 8.3, 33.3, 83.3, 166.7 ng / mL) detected using the composition for detecting biomarkers of the present invention, And the number of biomarkers detected by the method is in agreement with the number of quantum dots of the nanoprobe, and quantitative analysis is possible.
8 shows a biomarker detection kit using the nanoprobe developed in the present invention. A is the target-specific probe solution of the present invention, B is the label substance-antibody complex solution of the present invention, C is the reaction container, and D is the magnet for separation.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.

실시예Example 1: 표적-특이적  1: target-specific 프로브의Of the probe 제조 Produce

1-1: 페리틴의 표면에 단백질 G를 발현시킨 융합 단백질의 제조1-1: Preparation of a fusion protein in which protein G is expressed on the surface of ferritin

페리틴 단백질과 Genescript 사에서 구입한 Protein G의 유전자를 연결하기 위해 5가지 프라이머로 구성된 총 3쌍의 프라이머(표 1)를 사용하여 PCR를 실시하였다. 상기 프라이머들은 코스모진텍(Cosmogenetech, Seoul, Korea)에서 구입하였다. 또한 제한효소 NdeⅠ, BamHⅠ, XhoⅠ은 뉴잉글랜드바이오랩스(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)로부터 구입했다.In order to link the ferritin protein and the gene of Protein G purchased from Genescript, PCR was carried out using a total of three primers (Table 1) consisting of five primers. The primers were purchased from Cosmogenetech (Seoul, Korea). Restriction enzymes Nde I, BamH I and Xho I were also purchased from New England Biolabs (Ipswich, Mass., USA).

명명denomination 서열 5'→3'Sequence 5 '→ 3' 서열번호SEQ ID NO: 정방향 프라이머 1Forward primer 1 CATATGACGACCGCGTCCACCTCGCATATGACGACCGCGTCCACCTCG 1One 역방향 프라이머 2Reverse primer 2 ACTGCCACCTCCAGTACCGCCTCCGCTTTCATTATCACTGTCACTGCCACCTCCAGTACCGCCTCCGCTTTCATTATCACTGTC 22 정방향 프라이머 1Forward primer 1 CATATGACGACCGCGTCCACCTCGCATATGACGACCGCGTCCACCTCG 1One 역방향 프라이머 3Reverse primer 3 GGATCCTCCACCGCTTCCACCGCCTGTTCCACCGCCACTGCCACCTCCAGTACCGGATCCTCCACCGCTTCCACCGCCTGTTCCACCGCCACTGCCACCTCCAGTACC 33 정방향 프라이머 4Forward primer 4 GGATCCACTTACAAATTAATCCTTGGATCCACTTACAAATTAATCCTT 44 역방향 프라이머 5Reverse primer 5 CTCGAGATTAGTGATGGTGATGGTGATGTTCAGTTACCGTAAAGGTCTCGAGATTAGTGATGGTGATGGTGATGTTCAGTTACCGTAAAGGT 55

페리틴과 단백질 G 사이는 54bp의 링커를 이용하여 연결하였으며, 링커를 2개로 나눠서 PCR을 실시하였다. 먼저 페리틴 부분은 프라이머① (SEQ ID NO:1) 과 프라이머② (SEQ ID NO:2)를 사용하여 NdeⅠ과 페리틴, 링커1을 연결하였다.Ferritin and protein G were ligated using a linker of 54 bp and PCR was performed by dividing the linker into two fragments. First, the ferritin moiety was linked to NdeI, ferritin, and linker 1 using primer 1 (SEQ ID NO: 1) and primer 2 (SEQ ID NO: 2).

다음으로 PCR 생성물 (NdeⅠ+페리틴+링커1)과 링커2+BamHⅠ을 연결하기 위해 프라이머①(SEQ ID NO:1) 과 프라이머③ (SEQ ID NO:3)을 사용하였다. Primer 1 (SEQ ID NO: 1) and primer 3 (SEQ ID NO: 3) were then used to link the PCR product (Nde I + ferritin + Linker 1) with Linker 2 + BamH I.

단백질 G 부분은 BamHⅠ과 단백질 G, XhoⅠ는 프라이머④(SEQ ID NO:4) 와 프라이머⑤(SEQ ID NO:5) 를 이용하여 연결하였다. PCR을 아래 표 2와 같은 조건으로 실시 하였으며, 각각의 PCR 생성물은 아가로즈 젤에 PCR 생성물을 넣고 전기영동을 실시하여 확인하였다.The protein G portion was ligated with BamHI and Protein G, and XhoI was primer ④ (SEQ ID NO: 4) and primer ⑤ (SEQ ID NO: 5). PCR was carried out under the conditions as shown in Table 2 below. Each of the PCR products was confirmed by electrophoresis of the PCR product in agarose gel.

segmentsegment 사이클수Number of cycles 온도Temperature 시간time 1One 3030 95 ℃95 4 min, 30 sec4 min, 30 sec 22 3030 55 ℃55 ° C 30 sec30 sec 33 3030 72 ℃72 ℃ 40 sec40 sec 44 1One 72 ℃72 ℃ 7 min7 min 55 1One 4 ℃4 ℃

PCR을 통해 만들어진 페리틴 부분과 단백질 G 부분을 제한효소인 BamHⅠ을 이용하여 각각 유전자의 말단 부분을 절단한다. 스티키 엔드로 절단된 두 유전자를 라이게이션 효소를 이용하여 페리틴과 단백질 G를 융합하였으며, 페리틴 단백질과 단백질 G의 융합 단백질의 유전자 지도를 도 2에 나타냈다.The end portion of each gene is cleaved by using BamHI, a restriction enzyme, in the ferritin portion and the protein G portion produced by PCR. Two genes cut with sticky ends were fused with ferritin and protein G using a ligation enzyme, and a gene map of the fusion protein of ferritin protein and protein G was shown in Fig.

페리틴과 단백질 G사이에 아미노산 링커를 이용하여 연결함으로써 페리틴과 단백질 G가 서로 영향을 주지 않고 독립적인 기능을 할 수 있도록 하였다.
Ferritin and protein G were linked by using an amino acid linker to allow ferritin and protein G to function independently without affecting each other.

1-2 1-2 초상자성Super magnetic 나노입자의 합성 Synthesis of nanoparticles

플라스크안에 Fe(III), Mg, Mn, Ni, Zn 및 Co로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 물질을 포함하는 상온의 원료 용액을 200℃까지 가온 한 다음 입자가 핵이 생성되도록 30분 동안 유지하였다. 그 다음 295℃로 가온 하여 원료 용액이 끓는점에 도달 하도록 한 뒤 45분 동안 동일한 온도로 유지시켜 입자가 성장하도록 하였다. 반응이 끝나면 용액의 온도가 50℃ 밑으로 내려갈 때까지 천천히 기다렸다. 무수 에틸 알코올(99.9%)을 사용하여 합성된 용액을 잘 세척하였다. 이 때 무수 에틸 알코올 30 ml와 헥산 용액 15 ml를 넣고 초음파처리(sonication)를 30분 한 뒤, 원심 분리기를 이용하여 7000rpm 으로 10분동안 실시하여 상등액을 버린다. 그 다음 무수 에틸 알코올을 넣고 샤레에 부어 완전히 말린 후 헥산에 분산하여 초상자성 나노입자를 합성하였다. A raw material solution containing a material selected from the group consisting of Fe (III), Mg, Mn, Ni, Zn, and Co was heated to 200 ° C in a flask, and the particles were maintained for 30 minutes to form nuclei . It was then heated to 295 ° C to allow the raw material solution to reach the boiling point and then kept at the same temperature for 45 minutes to allow the particles to grow. At the end of the reaction, slowly wait until the temperature of the solution has dropped below 50 ° C. The synthesized solution was washed well using anhydrous ethyl alcohol (99.9%). Add 30 ml of anhydrous ethyl alcohol and 15 ml of hexane solution, sonicate for 30 minutes, centrifuge at 7000 rpm for 10 minutes and discard the supernatant. Then, anhydrous ethyl alcohol was added, and the mixture was poured into a cherry, completely dried, and then dispersed in hexane to synthesize a supercritical nanoparticle.

최종 결과물로 합성된 초상자성 나노입자의 크기는 투과전자현미경 (TEM: Transmission electron microscope)으로 관찰한 결과, 평균입경이 7 nm (5 ~ 13 nm)로 관찰되었고, VSM (vibrating sample magnetometer)로 측정한 결과, 평균 자화력이 71 emu/g을 나타내었다.The size of the superparamagnetic nanoparticles synthesized as the final product was observed with a transmission electron microscope (TEM), and the average particle diameter was observed to be 7 nm (5 to 13 nm) and measured with a VSM (vibrating sample magnetometer) As a result, the average magnetizing power was 71 emu / g.

따라서, 본 발명의 실시예 1-2에 따라 제조된 초상자성 나노입자는 일반적인 자석과 충분히 인력이 작용할 수 있는 평균 자화력을 나타내므로, 상기 초상자성 나노입자가 결합된 본 발명의 표적-특이적 프로브 또는 표적-특이적 프로브와 표지물질-항체 복합체에 샌드위치 표적화된 바이오마커를 자석을 이용하여 간단하게 분리할 수 있다.
Therefore, the super-magnetic nanoparticles produced according to the embodiment 1-2 of the present invention exhibit an average magnetizing force capable of sufficiently exerting attractive force with a general magnet, and thus the target nanoparticles of the present invention, to which the super- A biomarker that is sandwich-targeted to a probe or a target-specific probe and a labeling-antibody complex can be simply separated using a magnet.

1-3. 융합 페리틴 단백질에 1-3. Fused to ferritin protein 초상자성Super magnetic 나노입자의 결합 Combination of nanoparticles

실시예 1-2에서 합성된 초상자성 나노입자는 페리틴과의 결합을 위하여 다음과 같은 방법으로 표면을 코팅 하였다. 탈이온수(deionized water) 3.5 ml가 들어있는 비이커를 물의 온도를 85 로 만들어 놓은 sonicator 위에 띄워 놓는다. 지방질 조합 (MHPC 270μl, DPPE-PEG2000 151.2μl, Ni-NTA 47.7μl)을 1-2에서 합성된 초상자성 나노입자 (20mg/ml) 70μl 에 넣고 섞은 후 sonicator 안에 있는 비이커 위에 drop by drop으로 떨어뜨린다. 1시간 동안 초음파처리를 한 뒤, 원심 분리기를 이용하여 10,000 G로 10분 동안 실시하여 상등액만을 모아 0.2 μm 필터로 걸러준 후 PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4)로 버퍼를 바꾸었다.The superparamagnetic nanoparticles synthesized in Example 1-2 were coated on the surface in the following manner for bonding with ferritin. Place a beaker containing 3.5 ml of deionized water on a sonicator with a water temperature of 85. Add 150 μl of lipid combination (270 μl of MHPC, 151.2 μl of DPPE-PEG2000, 47.7 μl of Ni-NTA) into 70 μl of superparamagnetic nanoparticles (20 mg / ml) synthesized at 1-2 and mix and drop by drop on a beaker in the sonicator . After sonication for 1 hour, centrifugation was carried out at 10,000 G for 10 minutes. The supernatant was collected and filtered with a 0.2 μm filter, and the buffer was changed with PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4).

반응용기에 상기 실시예 1-1 에서 제조된 단백질 G가 표면에 발현된 페리틴을 함유하는 0.5 μM 페리틴 용액 30 μl 와 표면이 코팅 된 초상자성 나노입자 용액 10 μl를 섞은 후, 상온에서 1 시간 반응시켰다. 융합 페리틴 단백질 G의 표면에 있는 히스티딘과 초상자성 나노입자에 코팅된 Ni-NTA가 결합하여 초상자성 나노입자를 융합페리틴 표면에 결합시킴으로써 페리틴 단백질의 표면에 초상자성 나노입자를 결합시켰다.30 μl of a 0.5 μM ferritin solution containing ferritin expressed on the surface of the protein G prepared in Example 1-1 was mixed with 10 μl of the superficial magnetic nanoparticle solution coated on the surface of the reaction container and incubated at room temperature for 1 hour . Histidine on the surface of the fusion ferritin protein G and Ni-NTA coated on the superparamagnetic nanoparticles were bound to bind the superparamagnetic nanoparticles to the surface of the fused ferritin, thereby binding the superparamagnetic nanoparticles to the surface of the ferritin protein.

도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 상단 그래프(녹색)는 페리틴 단백질과 단백질 G 융합 단백질의 평균 입경 크기(13.43nm), 중단 그래프(주황색)는 초상자성 나노입자와 상기 융합 단백질이 결합한 복합체의 평균 입경 크기(17.16nm)를 나타내는데, 페리티니 단백질에 초상자성 나노입자가 결합함으로써 평균 입경 크기가 3.73nm 증가함을 확인할 수 있고, 이를 통하여 페리틴 단백질에 초상자성 나노입자가 결합한 것을 입증하였다.
As can be seen from FIG. 4, the upper graph (green) shows the average particle size (13.43 nm) of the ferritin protein and the protein G fusion protein, and the discontinuation graph (orange) shows the average of the complex of the superficial magnetic nanoparticles and the fusion protein The particle diameter (17.16 nm) is shown. The superparamagnetic nanoparticle binds to the ferritin protein, which indicates that the average particle size increases by 3.73 nm. This shows that the superparamagnetic nanoparticles bind to the ferritin protein.

1-4. 페리틴 단백질 표면에 1-4. On ferritin protein surface 결합된Combined 초상자성Super magnetic 나노입자에  On nanoparticles 표적화Targeting 항체의 결합 Binding of antibodies

상기 실시예 1-3 에서 제조된 페리틴에 결합된 초상자성 나노입자에, 100 μg/ml 농도의 단백질 G 용액 3 μl를 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시켜 단백질 G의 히스티딘 부분이 페리틴의 표면에 있는 초상자성 나노입자에 코팅된 Ni-NTA와 결합 시켰다. 여기에 1 mg/ml 농도의 B형간염 바이오마커인 비루스 겉질(HBs) 항체 용액 1.8 μl를 섞은 후 상온에서 1시간 동안 반응시켜서 단백질 G와 항체 표적항체의 Fc 부분을 결합 시킨다. 과량의 HBs 항체는 pH7.4의 인산버퍼용액으로 3번 세척하여, 초상자성 나노입자에 표적화 항체를 결합시켰다(도 4 및 도 6a).To the ferritin-bound superparamagnetic nanoparticles prepared in Example 1-3, 3 μl of a solution of protein G at a concentration of 100 μg / ml was added, and the mixture was allowed to react at room temperature for 1 hour, whereby the histidine portion of the protein G And bound to Ni-NTA coated on the superparamagnetic nanoparticles. To this, 1.8 μl of a 1 μg / ml hepatitis B biomarker (HBs) antibody solution was mixed and reacted at room temperature for 1 hour to bind the protein G and the Fc portion of the antibody-target antibody. Excess HBs antibody was washed three times with phosphate buffer solution at pH 7.4 to bind the targeted antibody to the superpowder nanoparticles (FIGS. 4 and 6A).

도 4에 나타낸 바와 같이, 표적용 나노프로브를 제작할 때의 단계마다 크기를 측정한 DLS 결과를 나타내는 것으로서, 상단 그래프(녹색)는 페리틴 단백질과 단백질 G 융합 단백질의 크기, 중단 그래프(주황색)는 초상자성 나노입자와 상기 융합 단백질이 결합한 복합체의 크기, 하단 그래프(파란색)는 초상자성 나노입자의 표면에 표적화 항체를 고정화 시킨 표적-특이적 프로브의 크기를 나타내었다. 도 6a는 본 발명의 표적-특이적 프로브의 전자현미경 사진을 나타냈다.As shown in Fig. 4, The top graph (green) shows the size of the ferritin protein and the protein G fusion protein, and the discontinuation graph (orange) shows the results of the DLS measurement of the sizes of the nanoprobes applied to the table. The size of the combined complexes and the bottom graph (blue) indicate the size of the target-specific probe immobilized on the surface of the supernatant nanoparticles. Figure 6a shows electron micrographs of the target-specific probe of the present invention.

이를 통하여 알 수 있는 바와 같이, 초상자성 나노입자와 상기 융합 단백질이 결합한 복합체의 평균 입경 크기 17.16nm이고, 초상자성 나노입자의 표면에 표적화 항체를 고정화 시킨 표적-특이적 프로브의 평균 입경 크기는 20.60nm이므로, 초상자성 나노입자와 상기 융합 단백질이 결합한 복합체에 항체가 고정화됨으로써 평균 입경 크기가 3.44nm 증가함을 확인할 수 있고, 이를 통하여 초상자성 나노입자와 상기 융합 단백질이 결합한 복합체에 항체가 고정화된 것을 입증하였다.
As can be seen from the figure, the mean particle size of the complex of the superparamagnetic nanoparticle and the fusion protein bound thereto was 17.16 nm, and the average particle size of the target-specific probe immobilized on the surface of the supernatant nanoparticles was 20.60 nm, it can be confirmed that the average particle size is increased by 3.44 nm due to immobilization of the antibody on the complex in which the superparamagnetic nanoparticles and the fusion protein are bound. As a result, it is confirmed that the antibody is immobilized on the complex comprising the superparamagnetic nanoparticle and the fusion protein .

실시예Example 2:  2: 바이오마커Biomarker 탐지용 조성물의 제조 Preparation of Detection Composition

2-1: 2-1: HBsHBs 탐지항체와 친수성  Detection antibody and hydrophilicity 양자점의Quantum dot 결합 Combination

바이오마커 탐지용 조성물을 제조하기 위해서 탐지가능한 표지물질로서 표면처리된 양자점을 사용하였다. 구체적으로 상기 실시예의 1-3과 마찬가지 방법으로 지방질 조합(MHPC 300ul + DPPE-PEG2000 170ul + Ni-NTA 53ul)으로 양자점(20 mg/ml, 70μl)을 코팅한다. 표면 코팅된 0.2421 μM 농도의 양자점 50 μl에 100 μl/ml의 단백질 G 용액 3 μl를 혼합한 후 상온에서 1 시간 동안 반응시켜 단백질 G의 표면에 있는 히스티딘과 양자점에 코팅된 Ni-NTA의 결합을 통해 양자점과 단백질 G를 결합시켰다. 여기에 1 mg/ml 농도의 HBs 항체 1.8 μl(표적화 항체)를 첨가한 후 상온에서 1 시간 동안 반응시켜서 단백질 G와 탐지항체의 Fc부분을 결합시켰다.To prepare a composition for detecting biomarkers, a surface-treated quantum dot was used as a detectable labeling substance. Specifically, quantum dots (20 mg / ml, 70 μl) were coated with lipid combination (MHPC 300ul + DPPE-PEG2000 170ul + Ni-NTA 53ul) in the same manner as 1-3 of the above Examples. After mixing 3 μl of 100 μl / ml protein G solution with 50 μl of surface-coated 0.2421 μM quantum dots and incubating at room temperature for 1 hour, the binding of histidine on the surface of protein G and Ni-NTA coated on the quantum dot To combine the quantum dots with protein G. After addition of 1.8 μl of HBs antibody (targeting antibody) at a concentration of 1 mg / ml, the protein G was bound to the Fc portion of the detection antibody by reacting at room temperature for 1 hour.

도 6c에서 HBs의 농도별로 형광이 다르게 나오는 것을 통하여, 탐지항체와 양자점이 잘 결합한 것을 확인하였다.
In FIG. 6C, fluorescence was different depending on the concentration of HBs, and it was confirmed that the detection antibody and the quantum dot were well coupled.

2-2: 2-2: HBsHBs 항원표적 Antigen target

상기 실시예 1-4 에서 제조된 표적-특이적 프로브를 함유한 용액에, 6 μg/ml 농도의 HBs 항원 27 μl와 pH 7.4의 인산버퍼용액을 넣어 최종 부피가 400 μl이 되게 만든 후 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 여기에 상기 실시예 2-1 에서 만든 양자점이 결합 된 HBs 탐지항체가 포함된 용액 55 μl를 넣어서 수집된 HBs 항원을 샌드위치 표적시켰다. 과량의 양자점이 결합된 HBs 탐지항체는 pH 7.4의 인산버퍼용액으로 5번 세척하여 완전히 제거하였다.
To the solution containing the target-specific probe prepared in Example 1-4, 27 μl of HBs antigen at a concentration of 6 μg / ml and a phosphate buffer solution at pH 7.4 were added to make a final volume of 400 μl, And reacted for 1 hour. To this was added 55 μl of a solution containing the quantum dot-bound HBs detection antibody prepared in Example 2-1, and the collected HBs antigen was sandwiched. HBs detection antibody bound to excess quantum dots was completely removed by washing 5 times with phosphate buffer solution of pH 7.4.

2-3: 정량분석2-3: Quantitative analysis

도 7a는 0.024, 0.048, 0.097, 0.195, 0.39, 0.78, 1.56, 3.13, 6.25, 12.5 nM 농도의 양자점 용액의 형광세기를 측정하여 표로 나타낸 표준곡선, 도 7b는 5.0, 8.3, 33.3, 83.3, and 166.7 ng/mL 농도의 양자점 용액의 형광세기를 측정하여 표준곡선을 만들었다. 도 7a 및 도 7b는 선형으로 비례하는 결과로, 이는 양자점 농도와 형광세기가 선형으로 비례하는 것을 보여주는 그래프이다. 이를 통하여, 표적된 HBs 항원의 수와 같은 수의 양자점의 농도를 통해 HBs의 개수를 정량적으로 구할 수 있음을 입증하였다.
FIG. 7A is a graph showing the fluorescence intensities of the quantum dot solutions at concentrations of 0.024, 0.048, 0.097, 0.195, 0.39, 0.78, 1.56, 3.13, 6.25 and 12.5 nM, The fluorescence intensity of the 166.7 ng / mL quantum dot solution was measured to make a standard curve. Figs. 7A and 7B are linearly proportional, which is a graph showing that the quantum dot concentration and the fluorescence intensity are linearly proportional. Through this, it was proved that the number of HBs can be quantitatively determined through the same number of quantum dots as the number of target HBs antigens.

2-4: 2-4: 바이오마커Biomarker 탐지용 조성물의 제조 Preparation of Detection Composition

실시예 1-4에서 얻은 표적-특이적 프로브와 실시예 2-2에서 얻은 HBs 탐지항체와 친수성 양자점이 결합된 표지물질-항체 복합체를 혼합하여 바이오마커 탐지용 조성물을 제조하였다. 몰농도를 기준으로 표적-특이적 프로브와 표지물질-항체 복합체를 1:1로 혼합하고 pH7.4의 인산버퍼용액을 첨가하여 최종 부피를 400 μl로 맞춘 후 상온에서 1시간 동안 반응시켜 제조하였다.
The target-specific probe obtained in Example 1-4 and the HBsAg-detecting antibody obtained in Example 2-2 and the labeling substance-antibody complex conjugated with the hydrophilic quantum dot were mixed to prepare a composition for detecting biomarkers. The target-specific probe and the labeling substance-antibody complex were mixed at a molar concentration of 1: 1, and a phosphate buffer solution of pH 7.4 was added to adjust the final volume to 400 μl, followed by reaction at room temperature for 1 hour .

2-5: 탐지 및 검출 효율 확인2-5: Confirm detection and detection efficiency

본원 발명에 따른 바이오마커 탐지용 조성물의 우수한 탐지 및 검출 효율이 우수함을 확인하기 위하여, 동일한 농도의 HBs에 대하여 본 발명의 바이오마커 탐지용 조성물을 이용하여 검출한 경우에 형광강도 값이 13810 인 것에 비하여, 나노입자만을 이용하였을 때는 형광광도 값이 801, 자성 비드를 이용했을 때는 형광강도 값이 2450으로 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 바이오마커 탐지용 프로브를 이용하여 정량분석을 하게 되면 나노입자만을 사용한 것 에 비해 약 17.4배, 자성비드에 비해 5.8배의 효율이 더 좋은 것을 알 수 있었다.
In order to confirm the excellent detection and detection efficiency of the composition for detecting biomarkers according to the present invention, it was confirmed that when the HBs were detected using the composition for detecting biomarkers of the present invention, the fluorescence intensity value was 13810 When the nanoparticles alone were used, the fluorescence intensity value was 801, and when the magnetic beads were used, the fluorescence intensity value was 2450. Therefore, it was found that the quantitative analysis using the probe for detecting a biomarker according to the present invention is about 17.4 times as efficient as that using only nanoparticles and 5.8 times as efficient as that of magnetic beads.

실시예Example 3:  3: 바이오마커Biomarker 탐지용 조성물을 이용한 탐지 Detection using detection composition

도 6c에서 알 수 있는 바와 같이, 다양한 농도의 바이오마커(HBs)를(8.3 ng/ml, 33.3 ng/ml, 83.3 ng/ml, 166.7 ng/ml) 포함한 용액에 실시예 2-3에서 얻은 바이오마커 탐지용 조성물을 주입하여 검출하고 이에 자외선을 조사하여 표적-특이적 프로브와 표지물질-항체 복합체가 바이오마커를 샌드위치로 검출한 표지물질의 형광을 관찰함으로써 바이오마커 검출을 확인하였다.As can be seen from Fig. 6C, a solution containing biomarkers (HBs) at various concentrations (8.3 ng / ml, 33.3 ng / ml, 83.3 ng / ml, 166.7 ng / ml) The detection of the biomarker was confirmed by detecting the fluorescence of the target substance-specific probe and the labeling substance in which the labeling substance-antibody complex detected the biomarker as a sandwich by irradiating ultraviolet rays.

구체적으로, 바이오마커 탐지용 조성물을 주입하여 HBs 바이오마커를 표적-특이적 프로브와 표지물질-항체 복합체를 이용하여 샌드위치 표적시킨 후, 1M 이미다졸 용액 200 μl 를 넣어 표적된 바이오마커와 같은 개수의 양자점만을 분리시켰다. 자석을 이용하여 양자점을 제외한 프로브를 한쪽으로 모으고 상청액에 부유하고 있는 양자점 용액을 96-well 에 넣어 micro plate reader(제조사:TECAN, 모델명:Infinite F200)로 형광강도를 측정하였다.Specifically, a composition for detecting a biomarker was injected to subject a HBs biomarker to a sandwich using a target-specific probe and a labeling substance-antibody complex, and then 200 μl of a 1 M imidazole solution was added thereto. Only the quantum dots were isolated. Using a magnet, the probe except for the quantum dots was collected on one side, and the quantum dot solution floating in the supernatant was placed in a 96-well and the fluorescence intensity was measured with a microplate reader (manufacturer: TECAN, model: Infinite F200).

그 결과 도 6c에서 알 수 있는 바와 같이, 바이오마커의 농도가 높아질수록 형광의 강도 또한 강해지고 자석에 의하여 용이하게 분리할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 바이오마커 탐지용 조성물은 농도에 따라 정밀하게 바이오마커를 탐지 및 검출할 수 있음을 입증하였다.
As a result, as shown in FIG. 6C, it was confirmed that the intensity of the fluorescence becomes stronger as the concentration of the biomarker becomes higher, and can be easily separated by the magnet. Therefore, the composition for detecting biomarkers of the present invention has proved that biomarkers can be detected and detected accurately according to their concentrations.

실시예Example 4:  4: 바이오마커Biomarker 탐지용 조성물을 이용한  Detection composition 바이오마커Biomarker 분리 detach

바이오마커를 검출한 용액에 자석을 이용하여 표적-특이적 프로브와 표지물질-항체 복합체가 샌드위치로 검출한 바이오마커를 수집한 뒤, 이에 자외선을 조사하여 형광의 강도를 측정하였다.A biomarker detected by a sandwich of a target-specific probe and a labeling substance-antibody complex was collected by using a magnet in a solution in which the biomarker was detected, and then the intensity of fluorescence was measured by irradiating it with ultraviolet light.

도 6c에서 확인할 수 있는 바와 같이, 자력에 의해서 표적-특이적 프로브와 표지물질-항체 복합체가 샌드위치로 검출한 바이오마커가 효과적으로 수집되어 형광의 강도가 더욱 선명하게 구별되는 밴드형태를 나타냄으로써, 바이오마커의 검출결과가 더욱 효과적임을 확인하였다.
As can be seen from FIG. 6C, the biomarkers detected by the sandwich of the target-specific probe and the labeling substance-antibody complex by the magnetic force are effectively collected to show a band shape in which the intensity of fluorescence is more clearly distinguished, It was confirmed that the marker detection result is more effective.

실시예Example 5:  5: 바이오마커Biomarker 진단키트를Diagnostic Kit 이용한 탐지 Detection using

본 발명에서는 페리틴과 초상자성 나노입자를 결합시킨 나노프로브와 양자점을 이용하여 바이오마커를 샌드위치 표적하고 양자점의 형광강도를 측정하여 바이오마커를 정량분석 할 수 있는 것을 확인하였고, 이를 이용하여 쉽게 이용할 수 있는 Prototype 정량분석 진단키트를 개발하였다. 도 8에서 보는 바와 같이, 본 발명의 진단키트는 본 발명의 표적-특이적 프로브를 용액(도 8의 A), 본 발명의 표지물질-항체 복합체를 포함하는 정량분석용 용액(도 8의 B), 반응용기(도 8의 C), 자성입자 분리용 자석(도 8의 D)을 포함하는 구성으로 개발하였다.In the present invention, it was confirmed that a biomarker can be quantitatively analyzed by measuring the fluorescence intensity of a quantum dot by sandwiching the biomarker using nanoprobes and quantum dots combined with ferritin and superparamagnetic nanoparticles, A prototype quantitative analysis kit was developed. As shown in FIG. 8, the diagnostic kit of the present invention is a kit for detecting the target-specific probe of the present invention in a solution (A of FIG. 8), a quantitative analysis solution containing the labeling substance- antibody complex of the present invention ), A reaction vessel (C in Fig. 8), and a magnet for magnetic particle separation (Fig. 8D).

바이오마커 진단키트는 다음과 같은 방법으로 사용하였다. 먼저 실시예 2-2에서 얻은 표적-특이적 프로브를 용액 100μl을 반응용기에 넣었다. 다음 정량 진단하고자 하는 바이오마커(HBs) 샘플 10 μl를 반응용기에 함께 넣고 1시간 반응시켰다. 그 다음 정량분석용 용액 100μl를 넣어서 상온에서 1시간 반응시켰다.  The biomarker diagnostic kit was used in the following manner. First, 100 μl of the target-specific probe obtained in Example 2-2 was placed in a reaction vessel. Next, 10 μl of a biomarker (HBs) sample to be quantitatively diagnosed was placed in a reaction vessel and reacted for 1 hour. Then, 100 μl of the solution for quantitative analysis was added, and the reaction was allowed to proceed at room temperature for 1 hour.

자성입자 분리용 자석을 반응용기에 가까이 하여 자력분리를 통해서 바이오마커를 샌드위치 표적화 한 표적-특이적 프로브와 표지물질-항체 복합체를 분리시킨 후 여분의 용액을 제거하였다. The magnet for magnetic particle separation was brought close to the reaction vessel, and the target-specific probe and the labeling material-antibody complex in which the biomarker was sandwicely targeted by magnetic separation were separated, and then the excess solution was removed.

형광 측정장비를 이용하여 형광 강도값을 측정하여 주어진 표준곡선과 비교함으로써 바이오마커를 정량적으로 분석하였다.
Biomarkers were quantitatively analyzed by measuring fluorescence intensity values using a fluorescence measurement device and comparing them with a given standard curve.

<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> COMPOSITION FOR DETECTING BIOMAKER COMPRISING TARGET-SPECIFIC PROBE AND DETECTABLE LABELING AGENT-ANTIBODY COMPOSITE AND USING METHOD OF THE SAME <130> DPP20135768KR <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer 1 for connecting protein G gene <400> 1 catatgacga ccgcgtccac ctcg 24 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer 2 for connecting protein G gene <400> 2 actgccacct ccagtaccgc ctccgctttc attatcactg tc 42 <210> 3 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer 3 for connecting protein G gene <400> 3 ggatcctcca ccgcttccac cgcctgttcc accgccactg ccacctccag tacc 54 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer 4 for connecting protein G gene <400> 4 ggatccactt acaaattaat cctt 24 <210> 5 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer 5 for connecting protein G gene <400> 5 ctcgagatta gtgatggtga tggtgatgtt cagttaccgt aaaggt 46 <110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> COMPOSITION FOR DETECTING BIOMAKER COMPRISING TARGET-SPECIFIC          PROBE AND DETECTABLE LABELING AGENT-ANTIBODY COMPOSITE AND USING          METHOD OF THE SAME <130> DPP20135768KR <160> 5 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer 1 for connecting protein G gene <400> 1 catatgacga ccgcgtccac ctcg 24 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer 2 for connecting protein G gene <400> 2 actgccacct ccagtaccgc ctccgctttc attatcactg tc 42 <210> 3 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer 3 for connecting protein G gene <400> 3 ggatcctcca ccgcttccac cgcctgttcc accgccactg ccacctccag tacc 54 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer 4 for connecting protein G gene <400> 4 ggatccactt acaaattaat cctt 24 <210> 5 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer 5 for connecting protein G gene <400> 5 ctcgagatta gtgatggtga tggtgatgtt cagttaccgt aaaggt 46

Claims (22)

페리틴 단백질,
상기 페리틴 단백질에 결합된 초상자성 나노입자, 및
상기 초상자성 나노입자의 표면에 결합된 표적화 항체(targeting antibody)을 포함하는, 표적-특이적 프로브.
Ferritin protein,
Superparamagnetic nanoparticles bound to the ferritin protein, and
And a targeting antibody bound to the surface of said superpowder nanoparticles.
제1항에 있어서, 상기 페리틴 단백질과 초상자성 나노입자 사이에 위치한 제1 링커를 추가로 포함하며,
상기 링커는 상기 페리틴 단백질의 C-말단 또는 N-말단에 연결되며 페리틴 단백질의 페리틴 구조 형성을 저해하지 않는 단백질 또는 펩타이드인, 표적-특이적 프로브.
The method according to claim 1, further comprising a first linker positioned between the ferritin protein and the superpowder nanoparticles,
Wherein the linker is a protein or peptide that is linked to the C-terminal or N-terminus of the ferritin protein and does not inhibit the ferritin structure formation of the ferritin protein.
제2항에 있어서, 상기 페리틴 단백질과 링커는 하나의 융합 단백질로 구성되는 것인, 표적-특이적 프로브.
3. The target-specific probe according to claim 2, wherein the ferritin protein and the linker are composed of one fusion protein.
제1항에 있어서, 상기 표적-특이적 프로브에서 상기 페리틴 단백질, 초상자성 나노입자 및 표적화 항체의 비율은 몰비를 기준으로 1:1:1 내지 1:6:6인, 표적-특이적 프로브
The method of claim 1, wherein the ratio of the ferritin protein, the supernatant nanoparticles, and the targeting antibody in the target-specific probe is from 1: 1: 1 to 1: 6: 6,
제1항에 있어서, 상기 초상자성 나노입자는 Fe(III), Mg, Mn, Ni, Zn 및 Co로 이루어진 군으로부터 1종 이상을 포함하는 것인, 표적-특이적 초상자성 프로브.
The target-specific superparamagnetic probe according to claim 1, wherein the super-magnetic nanoparticle comprises at least one selected from the group consisting of Fe (III), Mg, Mn, Ni, Zn and Co.
제1항에 있어서, 상기 초상자성 나노입자는 친수성기와 소수성기를 갖는 양친성 물질을 포함하는 표면층을 포함하는 것인, 표적-특이적 초상자성 프로브.
The target-specific superparamagnetic probe according to claim 1, wherein the super-magnetic nanoparticle comprises a surface layer comprising an amphiphilic substance having a hydrophilic group and a hydrophobic group.
제6항에 있어서, 상기 양친성 물질은 1-마이리스토일-2-하이드록시-에스엔-글리세로-3-포스포콜린(1-Myristoyl-2-Hydroxy-sn-Glycero-3-hosphocholine)(MHPC), 1,2-디스티어로일-에스엔-글라이세로-3-포스포에탄올아민-엔-메톡시 폴리에틸렌 글리콜-2000(1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-(Methoxy Polyethylene glycol)-2000(DPPE-PEG2000) 및 1,2-디오레일-에스엔-글리세로-3-엔-{5-아미노-1-복실펜틸}이미노디아세틱 에시드 석시닐 니켈쏠트(1,2-dioleoyl-snglycero-3-N-{5-amino-1-carboxypentyl} iminodiacetic acid succinyl nickel salt)(Ni-NTA)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 표적-특이적 초상자성 프로브.
7. The method of claim 6, wherein the amphiphile is selected from the group consisting of 1-Myristoyl-2-Hydroxy-sn-Glycero-3-phosphocholine ( MHPC), 1,2-distyroyl-ene-glycero-3-phosphoethanolamine-ene-methoxypolyethylene glycol-2000 (1,2-Distearoyl- sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine- Methoxy polyethylene glycol) -2000 (DPPE-PEG2000) and 1,2-dioleyl-ene-glycero-3-ene-5-amino-1-phenylpentyliminodiacetic acid succinyl- 2-dioleoyl-snglycero-3-N- {5-amino-1-carboxypentyl} iminodiacetic acid succinyl nickel salt (Ni-NTA).
제1항에 있어서, 상기 초상자성 나노입자와 표적화 항체 사이에 위치한 제2 링커를 추가로 포함하며, 상기 제2 링커는 상기 초상자성 나노입자의 표면 중 상기 페리틴 단백질과 연결되지 않은 부분에 결합된 것인, 표적-특이적 초상자성 프로브.
2. The method of claim 1, further comprising a second linker positioned between the superpowder nanoparticle and the targeting antibody, wherein the second linker binds to a portion of the surface of the superpowder nanoparticle not connected to the ferritin protein A target-specific superparamagnetic probe.
제2항, 제3항 및 제8항중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 단백질 G, 단백질 A, 단백질 A/G, Fc 수용체, 바이오틴, 아비딘, 히스티딘, Ni-NTA, 또는 스트랩트아비딘으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 표적-특이적 초상자성 프로브.
9. A composition according to any one of claims 2, 3 and 8, wherein the linker is selected from the group consisting of protein G, protein A, protein A / G, Fc receptor, biotin, avidin, histidine, Ni-NTA, or streptavidin / RTI &gt; probe selected from the group consisting of: &lt; RTI ID = 0.0 &gt;
제1항 내지 제8항중에 어느 한 항에 따른 표적-특이적 초상자성 프로브 및
탐지 가능한 표지물질(detectable labeling agent)에 결합된 탐지 항체(detecting antibody)를 포함하는 표지물질-항체 복합체를 포함하는,
바이오마커 탐지용 조성물.
A target-specific superparamagnetic probe according to any one of claims 1 to 8 and
Antibody complex comprising a detection antibody coupled to a detectable labeling agent. &Lt; RTI ID = 0.0 &gt;
Compositions for detecting biomarkers.
제10항에 있어서, 상기 표적화 항체와 상기 탐지 항체는 동일한 바이오마커의 상이한 부분에 결합하는 것인, 바이오마커 탐지용 조성물.
11. The composition of claim 10, wherein the targeting antibody and the detection antibody bind to different portions of the same biomarker.
제10항에 있어서, 상기 탐지 가능한 표지물질과 탐지 항체의 사이에 위치한 제3링커를 추가로 포함하며,
상기 링커는 단백질 G, 단백질 A, 단백질 A/G, Fc 수용체, 바이오틴, 아비딘, 히스티딘, Ni-NTA, 및 스트랩트아비딘으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 바이오마커 탐지용 조성물.
11. The method of claim 10, further comprising a third linker located between the detectable labeling substance and the detection antibody,
Wherein the linker is at least one selected from the group consisting of protein G, protein A, protein A / G, Fc receptor, biotin, avidin, histidine, Ni-NTA, and streptavidin.
제10항에 있어서, 상기 탐지 가능한 표지물질은 양자점, 자성비드 나노입자, 금 나노입자, 형광염료, 형광단백질, 나노인광체 또는 실리콘 나노입자인, 바이오마커 탐지용 조성물.
11. The composition of claim 10, wherein the detectable labeling material is a quantum dot, a magnetic bead nanoparticle, a gold nanoparticle, a fluorescent dye, a fluorescent protein, a nanophosphor, or a silicon nanoparticle.
제13항에 있어서, 상기 양자점은 친수성기과 소수성기를 갖는 양친성 물질을 함유하는 친수성 표면층을 포함하는 것인, 바이오마커 탐지용 조성물.
14. The composition for detecting biomarkers according to claim 13, wherein the quantum dots include a hydrophilic surface layer containing an amphiphilic substance having a hydrophilic group and a hydrophobic group.
제14항에 있어서, 상기 양친성 물질은 MHPC, DPPE-PEG2000, Ni-NTA 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 바이오마커 탐지용 조성물.
15. The composition according to claim 14, wherein the amphipat is at least one selected from the group consisting of MHPC, DPPE-PEG2000, Ni-NTA and mixtures thereof.
제10 항에 따른 바이오마커 탐지용 조성물을 혼합하는 단계, 및
상기 바이오마커에 표적화된 상기 표지물질-항체 복합체의 표지물질을 검출하는 단계를 포함하는, 바이오마커의 탐지방법.
Mixing the composition for detecting a biomarker according to claim 10, and
And detecting the labeling substance of the labeling substance-antibody complex targeted to the biomarker.
제16항에 있어서, 상기 탐지방법은
상기 표적-특이적 프로브와 바이오마커를 함유하는 시료를 혼합하는 단계,
상기 표지물질-항체 복합체를 첨가하는 단계, 및
상기 혼합물에 자기장을 걸어 바이오마커를 분리하는 단계를 포함하는, 바이오마커의 탐지방법.
17. The method of claim 16,
Mixing the target-specific probe with a sample containing a biomarker,
Adding the label substance-antibody complex, and
And applying a magnetic field to the mixture to separate the biomarker.
제16항에 있어서, 상기 표적-특이적 프로브 및 상기 표지물질-항체 복합체의 농도 비율은 1:1 내지 1:5인, 바이오마커의 탐지방법.
17. The method of claim 16, wherein the concentration ratio of the target-specific probe and the labeling material-antibody complex is from 1: 1 to 1: 5.
제16항에 있어서, 상기 표지물질이 검출되는 경우 바이오마커가 상기 시료에 존재하는 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 바이오마커의 탐지방법.
17. The method of claim 16, further comprising determining that a biomarker is present in the sample when the labeling material is detected.
제16항에 있어서, 상기 표지물질을 다양한 농도에서 흡광도 또는 형광의 세기를 측정하여 제작한 표준 곡선과 상기 바이오마커에 표적화된 표지물질-항체 복합체에 포함된 표지물질의 흡광도 또는 형광의 세기를 비교하여 시료 내 바이오마커를 정량하는 단계를 추가로 포함하는, 바이오마커의 탐지방법.
17. The method of claim 16, wherein the labeling substance is measured by comparing absorbance or fluorescence intensity of a labeled substance included in the labeled substance-antibody complex targeted to the biomarker by comparing the standard curve prepared by measuring the absorbance or fluorescence intensity at various concentrations Thereby quantifying the biomarker in the sample. &Lt; Desc / Clms Page number 19 &gt;
제16항에 있어서, 상기 검출하는 단계는 표지물질로서 양자점에서 방출되는 형광강도를 검출하는 것인, 바이오마커의 탐지방법.
17. The method of detecting a biomarker according to claim 16, wherein the detecting step detects fluorescence intensity emitted from quantum dots as a labeling substance.
제10항의 바이오마커 탐지용 조성물 및 상기 바이오마커 탐지용 조성물에 포함된 표지물질을 검출하는 검출기를 포함하는, 바이오마커의 진단키트.

A diagnostic kit for a biomarker comprising the composition for detecting a biomarker according to claim 10 and a detector for detecting a labeling substance contained in the biomarker detection composition.

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