KR20150084852A

KR20150084852A - 펩타이드

Info

Publication number: KR20150084852A
Application number: KR1020157012787A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 레이트; 헤더 스트리터
Original assignee: 아피토프 인터내셔날 엔브이
Priority date: 2012-11-12
Filing date: 2013-11-11
Publication date: 2015-07-22
Also published as: CY1119164T1; KR102165486B1; DK2917232T3; ES2626881T3; CN104903347B; CA2890835A1; IL238627A0; RS56069B1; JP6247696B2; WO2014072958A8; PL2917232T3; HK1209138A1; MY176708A; CA2890835C; NZ708812A; SI2917232T1; EP2917232A1; PH12015501033A1; SG11201503657UA; US20150306192A1

Abstract

본 발명은 추가적 항원 처리 없이 MHC 클래스 Ⅱ 분자와 결합할 수 있고 인자 Ⅷ 특이적 T 세포에 의해 인식 가능한 FⅧ로부터 부분적으로 유래된 펩타이드를 제공하는 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 DNIMVTFRNQASRPY 또는 PRCLTRYYSSFVNME 서열과 N- 말단 및 C- 말단의 추가 서열을 포함하는 펩타이드를 제공하는 것이다. 또한 본 발명은 혈우병 A 및/또는 후천성 혈우병 내에서 저해 항체 형성을 방지하거나 억제하기 위한 펩타이드의 용도를 제공하는 것이다.

Description

펩타이드 {Peptides}

본 발명은 인자(factor) Ⅷ로부터 적어도 부분적으로 유래된 펩타이드에 관한 것이다. 펩타이드는 예를 들면 A형 혈우병 처치 및 후천척 혈우병의 인자 Ⅷ 저해 항체 생성을 감소시키거나 예방하는데 사용할 수 있는 펩타이드에 관한 것이다.

혈우병

혈우병은 혈우병 A, 혈우병 B(크리스마스병) 및 폰 빌레브란드 병(Von Willebrand's disease)을 포함하는 유전성 혈액 장애군에 속한다.

혈우병에서 필수적인 응고 인자가 부분적 또는 완전하게 소실되기 때문에 혈액의 혈액 응고 능력이 현격히 감소되어 출혈 시간의 증가를 야기한다.

혈우병 A는 응고 인자 Ⅷ의 결손인 반면 혈우병 B는 응고 인자 Ⅸ의 결손이다. 양 질병 모두에서 결함 유전자는 X 염색체 상에서 발견되므로 이러한 장애는 X-염색체 연관이다. 혈우병 A는 혈우병 B보다 5배 이상 흔하다.

혈우병은 평생 지속되는 유전자 이상이고, 이는 여성을 보인자로 하여 남성에게 이러한 이상을 유전시키도록 작용한다. 새로운 진단의 약 1/3은 종전 가족력이 없는 경우이다. 이는 전 세계적으로 모든 인종군에서 발생한다. 약 6.000명의 인구가 영국에서 혈우병을 앓고 있다.

혈우병은 손상 후 연장된 시기 동안 출혈된다. 절단 및 찰과상과 같은 외부 손상은 일반적으로 심각한 문제를 야기하지 않는다: 어느 정도의 압력을 가하고 영향 받은 부위를 감싸는 것(예를 들어 플라스터)에 의해 출혈을 중단시키는 것이 가능하다.

주요한 문제점은 관절, 근육 및 연조직 내의 내출혈이고, 이는 동시에 발생 가능하다. 뇌출혈과 같은 내출혈은 관리하기 매우 어렵고 치명적일 수 있다. 관절 내 반복된 출혈은 급성 통증을 유발하고 관절염 및/또는 장애를 유발하는 장기간 관절 손상을 유발할 수 있다.

혈우병 치료는 일반적으로 소실된 응고 인자의 대체에 의한 것이다. 약하거나 중간 정도의 혈우병의 경우 주사는 출혈 발생시 제공된다(필요시 치료법). 그러나 중증 혈우병의 경우 혈액 응고를 돕고 장기간 관절 손상의 가능성을 최소화하기 위해 정기적인 예방 주사가 제공된다.

혈우병 A에 대한 응고 인자 대체 요법의 가능한 중증 합병증은 인자 Ⅷ의 응고촉진 기능을 중화시키는 항체의 발달이다. 인자 Ⅷ 저해제는 중증 혈우병 A 환자의 약 25%에서 발생한다. 선천성 혈우병 A 환자는 FⅧ의 유전적 결함을 지닐 수 있기 때문에 저해제 합성은 출혈 에피소드를 예방하거나 치료하기 위해 투여된 외부 단백질에 대한 동종면역 반응이다.

CD4+ T 세포는 FⅧ에 대한 면역 반응에 중추 역할을 한다. 항원-제시 세포(APC)에 의한 처리 후 FⅧ은 펩타이드 단편으로의 단백질 분해성 분해가 수행된다(Reding et al (2006) Haemophilia 12(supp 6) 30-36). 이후 이들 펩타이드는 MHC 클래스 Ⅱ 분자와 결합하여 APC의 표면 상에 제시된다. 이후 이들 복합체는 FⅧ에 특이적인 CD4+ 세포의 T 세포 수용체에 의해 인식된다. 적당한 동시자극 신호의 존재시 이러한 인식은 결국 CD4+ 세포가 B 세포에 의해 항체 합성을 지시하도록 한다.

저해제가 형성되는 빈도는 초기에는 인자 Ⅷ 처리 수에 따라 증가되나 50∼100일 노출 후 안정 상태를 유지하는 것으로 판단된다. 저해제 형성은 중간 정도 또는 경미한 상태보다 중증 혈우병에서 더욱 더 흔하고, 인자 Ⅷ 라이트체인 내의 가장 명백한 큰 결실 및 넌센스 변이로서 일부 분자의 결함 때문에 저해제 형성 성향을 나타내는 것으로 판단된다. 대체 인자의 농도, 형태(정제 또는 재조합) 및 치료 내력과 같은 파라미터도 항체 생성의 가능성에 영향을 미친다.

혈우병 환자에게 저해제를 통한 관리는 도전적으로 진행되고 있다. 탈감작(desensitization) 기술을 이용한 면역 내성 유도(ITI)는 인자 Ⅷ에 대한 동종항체를 지닌 일부 환자에서 성공적이다. 이러한 치료법은 인자 대체 요법으로의 지속적인 노출을 요구하는 장기 전략이다.

ITI는 성공적일 수 있으나 상당한 환자 비율(약 30%)이 ITI에 반응하지 않는다. 높은 저해제 역가를 지닌 환자는 치료에 덜 반응한다. 또다른 유의적인 기여 요인은 ITI를 시작하는 연령으로 환자가 20세 이상인 경우 성공률이 크게 감소된다(Hay et at (2005) Seminars in Thrombosis and Hemostasis 32:15-21).

ITI 요법이 성공적이지 않은 경우, 저해제는 일반적으로 평생동안 지속되고 이는 이러한 환자들이 일반적으로 높은 반응성을 지닌 사람들이기 때문이다. 예를 들면 활성화 프로트롬빈 복합 농축액(FEIBA^TM)과 같은 FⅧ 바이패스 제품과 재조합-활성화 FⅦ을 통해 출혈 에피소드를 처치하는 것이 필요하다. 그러나 이러한 약의 사용은 파종성(disseminated) 혈관 내 응고, 급성 심근경색, 폐색전 및 혈전 등과 같은 부작용에 관련되어 있다(Acharya and DiMichele (2006) Best Practice & Research Clinical Haematology 19:51-66).

면역억제(immunosuppressive) 치료법은 종종 ITI에 반응하지 못하는 환자에 이용된다. 치료는 면역 체계를 비-특이적으로 타겟하는 사이클로포스파마이드, 프레드니손, 아자티오프린 및 사이클로스포린과 같은 면역억제제의 투여를 포함한다. 이들 치료는 일반적인 면역억제와 관련된 부작용을 지닐 수 있다.

B 세포 CD20 항원에 대한 인간화 단일클론 항체인 Rituximab^TM을 이용한 선택적 B 세포 결핍 상에 재개된 관심이 존재한다. 그러나 주입(infusion) 반응, 혈청병 및 기회 감염이 이러한 약물로 치료된 일부 소아에서 발생하였다(DiMichele (2007) J Thromb Haemost 5:143-50).

후천성 혈우병

후천성 혈우병은 100만 명 중 1 내지 4명의 빈도를 지닌 매우 드문 자가면역 질환이다. 이러한 질환에서 선천적으로 혈우병을 지니지 않고 태어난 피험자는 인자 Ⅷ와 같은 응고 인자 중 하나에 대한 항체를 발달시킨다. 임신, 류마티스 관절염과 같은 자가면역 질환 또는 암이 후천성 혈우병 발달 위험성을 증가시키는 것으로 판단된다. 그의 생성을 유발하는 근원적인 면역 메커니즘 상에는 차이가 있으나 FⅧ 저해제의 임상 소견은 응고 인자 대체 요법에 반응하여 생성되었고 후천성 혈우병에서 생성된 것들은 유사하다.

후천성 혈우병 환자는 부분적으로 획득 저해제와 중증 출혈 합병증과의 관련으로 인해 25%에 근접하는 사망률을 지닌다. 획득 자가항체 저해제 요법은 주로 급성 출혈 합병증의 조절 또는 예방의 필요성에 기반하고, 이는 종종 생명 및 사지에 위협적이고 이차적으로 정상 응고를 복구시키기 위해 자가항체를 제거시킨다.

낮은 역가 자가항체 저해제(< 5 Bethesda 단위)와 관련된 일부 출혈은 고용량으로 투여된 FⅧ 농축물로 효과적으로 치료된다. 돼지 FⅧ 농축물은 실험실에서 주입-후 FⅧ 응고 활성 수치를 실질적으로 측정하는 기회를 제공하는 유일한 대체 요법이기 때문에 후천성 혈우병-관련 출혈에 대한 중요한 첫번째 치료법으로 이전부터 간주되어 왔다. 이러한 제품은 돼지 파보바이러스에 의한 돼지 혈장 저장고의 오염으로 인해 2004년 시장에서 퇴출되었다. 현재 "바이패싱(bypassing)" 약제는 가장 일반적으로 사용되나 잠재적인 혈전형성 위험률이 존재하고 각각의 제품의 경우 약 80% 만의 효능이 존재한다. 혈장분리반출술 및 체외 면역흡착을 통한 혈장 교환은 적당한 지혈을 제공하기 위해 바이패싱 약제 또는 FⅧ 대체에 충분한 저해제 역가를 일시적으로 감소시키는데 필요하다.

자가항체 저해제의 제거는 (1) 3∼6주 내 30%∼50% 효능을 지닌 코르티코스테로이드의 투여; (2) 예를 들어 사이클로포스파마이드, 사이클로스포린, 2-사이클로데옥시아데노신과 같은 세포독성 및 골수억제성 화학요법제의 이용; (3) 정맥내 면역글로불린으로의 면역제어; 및 (4) rituximab으로의 선택적 B-림프구 결핍과 같은 면역억제 측정에 따라 달라진다. Rituximab^TM 반응제는 스테로이드의 동시 이용을 필요로 하고 재발은 재치료가 요구된다.

따라서 현재 이용 가능한 모든 혈우병 A 치료 및 후천성 혈우병의 자가항체 생성과 관련된 동종항체 생성을 감소시키는 방법은 문제점을 지닌다. 따라서 혈우병 A 및 후천성 혈우병 내 항-FⅧ 항체의 문제점을 해결할 수 있는 개선된 방법이 요구되어 왔다.

본 발명자들은 FⅧ-유래 펩타이드로 환자를 예비-내성화함으로써 FⅧ 저해제 항체 형성을 방지하는 것과 혈우병과 같은 상태를 FⅧ 저해제 항체를 감소시키기 위한 FⅧ-유래 펩타이드의 투여로 치료 가능함을 발견하였다.

따라서 본 발명의 첫 번째 측면은 FⅧ에 대한 내성을 유도하거나 복구시키는 것이 가능한 FⅧ에서 유래 가능한 서열의 적어도 일부인 펩타이드에 관한 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면에서 첫 번째 실시형태는 다음의 서열 중 하나인 FⅧ-유래된 DNIMVTFRNQASRPY 서열을 포함하는 펩타이드를 제공하는 것이다:

Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Lys-Lys (서열번호: 17)

Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Lys-Glu (서열번호: 18)

Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Glu-Lys (서열번호: 19)

Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Lys-Lys (서열번호: 25)

Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Lys-Glu (서열번호: 26)

Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Glu-Lys (서열번호: 27)

Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Lys-Lys (서열번호: 29)

Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Lys-Glu (서열번호: 30) 및

Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Glu-Lys (서열번호: 31).

본 발명의 두 번째 실시형태에서 펩타이드는 다음의 서열 중 하나인 FⅧ-유래된 PRCLTRYYSSFVNME 서열을 포함하는 펩타이드를 제공하는 것이다:

Lys-Lys-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Lys-Lys (서열번호: 1)

Lys-Lys-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Lys-Glu (서열번호: 2)

Lys-Lys-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Glu-Lys (서열번호: 3)

Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Lys-Lys (서열번호: 5)

Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Glu-Lys (서열번호: 7)

Lys-Glu-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Lys-Lys (서열번호: 9)

Lys-Glu-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Lys-Glu (서열번호: 10)

Lys-Glu-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Glu-Lys (서열번호: 11) 및

Glu-Lys-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Lys-Lys (서열번호: 13).

두 번째 측면에서, 본 발명은 본 발명의 첫 번째 측면에 따른 하나 또는 그 이상의 펩타이드를 포함하는 다수의 펩타이드를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

조성물은 첫 번째 실시형태에 따른 적어도 하나의 펩타이드를 포함 할 수 있으며 본 발명의 첫 번째 측면의 두 번째 실시형태에 따른 적어도 하나의 펩타이드를 포함 할 수 있다.

조성물은 서열번호: 1의 펩타이드와 서열번호: 17의 펩타이드를 포함할 수 있다.

조성물은 다수의 펩타이드를 개별적으로 별도, 후속(subsequent), 연속 또는 동시에 투여할 수 있는 키트 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 펩타이드 또는 조성물은 인자 Ⅷ 저해제 항체 발달을 억제 감소 또는 방지하는데 이용될 수 있다.

또한 본 발명은 인자 Ⅷ 저해제 항체의 발달을 억제 감소 또는 방지하기 위한 약물을 제조하는데 사용되는 펩타이드 또는 조성물의 용도를 제공한다.

본 발명은 피험자에 펩타이드 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 피험자 내에서 인자 Ⅷ 저해제 항체의 발달을 억제 감소 또는 방지하는 방법을 제공한다.

피험자는 FⅧ 결핍이다. 더욱 상세하게는 피험자는 혈우병 A를 지니고, 인자 Ⅷ 대체 요법을 진행 중이거나 수행할 예정이다.

또한 피험자는 후천성 혈우병을 지니거나 이에 걸릴 위험이 있다.

인자 Ⅷ 저해제는 HLA-DR2를 발현하는 개체에서 더욱 빈번하게 발견된다. 따라서 본 발명의 방법으로 치료받는 피험자는 HLA-DR2 양성이다.

도 1: 변형된 FⅧ 펩타이드의 용해도.
총 32개의 펩타이드를 시험하였다: 16개는 FⅧ 펩타이드 PRCLTRYYSSFVNME('PRCLT')(서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13)에 기반하여 준비되었으며 16개는 FⅧ 펩타이드 DNIMVTFRNQASRPY('DNIMV')(서열번호: 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32)에 기반하여 준비되었다. 이들의 용해도는 내성화 항원과 같이 적용시 충분히 용해되는 것으로 알려진 대조군 펩타이드(4Y)에 대비하여 시험하였다. 다이어그램 내에서 녹색은 적어도 4Y 만큼 용해되는 펩타이드를 나타내고, 주황색은 4Y 정도로 용해되지 않지만 상당히 근접한 펩타이드를 나타내고, 적색은 4Y 만큼 용해되지 않은 펩타이드를 나타낸다. 녹색으로 나타난 펩타이드는 대조군 펩타이드 4Y와 비슷하게 용해되었으며 적색으로 나타난 펩타이드는 낮은 용해도를 나타내었으며 주황색으로 나타난 펩타이드는 중간 정도의 용해도를 나타내었다.
도 2: 수용액 내의 태그 펩타이드의 용해도.
용액 내의 펩타이드 농도와 연이어 DMSO(대조군) 또는 PBS 내에서 용출되는 펩타이드의 농도를 분광광도계를 사용하여 측정하고 예상치인 4mg/mL과 비교하였다. 실측치와 예상 농도간의 차이는 더 낮은 상대 용해도와 상응한다.
도 3: 태그 펩타이드는 아피토프로 작용한다.
태그 펩타이드가 PRCLT 및 DNIMV인 모펩타이드와 같이 MHC 분자에 결합 가능한지 항원 처리 없이 T 세포를 제시할 수 있는지 여부를 조사하기 위해 신선하고 고정화된 항원 제시 세포로 항원 제시 에세이를 수행하였다. (a) PRCLT 펩타이드; (b) DNIMV 펩타이드.
도 4: 서열번호 1 및 서열번호 2를 지닌 펩타이드가 PRCLT에 대한 T 세포 응답을 조절한다.
본 도면은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 대조군(PBS)으로 처리하고 PRCLT로 전처리(primed)시킨 HLA-DR2 형질전환 마우스로부터 회상 반응을 나타낸 것이다. T 세포 자극 지수를 FⅧ과 대조군 PPD에 대해 모든 펩타이드 농도 영역에서 나타낸다.
도 5: 서열번호 17 및 서열번호 18을 지닌 펩타이드가 DNIMV에 대한 T 세포 응답을 조절한다.
본 도면은 서열번호: 17, 서열번호: 18 또는 대조군(PBS)으로 처리하고 DNIMV로 전처리시킨 HLA-DR2 형질전환 마우스로부터 회상 반응을 나타낸 것이다. T 세포 자극 지수를 FⅧ과 대조군 PPD에 대해 모든 펩타이드 농도 영역에서 나타낸다.
도 6: 서열번호 1 및 서열번호 17을 지닌 펩타이드가 그들의 모펩타이드에 대한 T 세포 응답을 조절한다.
본 도면은 서열번호: 1 또는 서열번호: 17 또는 대조군(PBS)으로 처리하고 PRCLT 및 DNIMV로 전처리시킨 HLA-DR2 형질전환 마우스로부터 회상 반응을 나타낸 것이며 시험관 내에서 PRCLT, DNIMV 또는 FⅧ와 함께 회상되었다. T 세포 자극 지수를 FⅧ에 대해 모든 펩타이드 농도 영역에서 나타낸다. 모펩타이드에 대한 T 세포 응답의 상당한 저해가 존재한다.
도 7: 서열번호 1을 지닌 펩타이드와 서열번호 17을 지닌 펩타이드의 조합은 생체 내에서 항-FⅧ 항체 생성을 저해한다.
본 도면은 8주간 FⅧ 면역화시키고 서열번호 1의 펩타이드와 서열번호 17의 펩타이드 조합(또는 PBS 대조군)으로 처리시킨 마우스의 항-FⅧ 항체 역가 종말점을 나타낸 것이다.
도 7a : 28일째의 결과, 도 7b : 56일째의 결과
도 8 : 서열번호 1을 지닌 펩타이드와 서열번호 17을 지닌 펩타이드의 조합은 생체 내에서 FⅧ 노출시 항-FⅧ 항체 생성 중화를 방지한다.
본 도면은 8주간 FⅧ 면역화시키고 서열번호 1의 펩타이드와 서열번호 17의 펩타이드 조합(또는 PBS 대조군)으로 처리시킨 마우스의 항-FⅧ 항체 중화 수준을 나타낸 것이다. 56일째에 펩타이드로 처리된 마우스에 있어서 중화 항체의 현격한 저하가 있다.
도 9 : 서열번호 1을 지닌 펩타이드와 서열번호 17을 지닌 펩타이드의 조합은 FⅧ의 T 세포 응답을 저해한다.
본 도면은 서열번호: 1 및 서열번호: 17의 조합 또는 대조군(PBS)으로 처리하고 PRCLT 및 DNIMV와 함께 전처리시킨 HLA-DR2 형질전환 마우스로부터 회상 반응을 나타낸 것이다. T 세포 자극 지수를 모든 FⅧ 농도 영역에서 나타낸다.
도 10 : 서열번호 1을 지닌 펩타이드와 서열번호 17을 지닌 펩타이드의 조합은 치료 동물 모델 내에서 진행중인 FⅧ 면역 응답을 통해 항-FⅧ 항체 생성을 중화시키는 것을 억제한다.
본 도면은 FⅧ 면역 응답 및 항-FⅧ 항체 생성이 유도된 연후에 서열번호 1의 펩타이드 및 서열번호 17의 펩타이드의 조합 또는 프로스타트산 포스파타제(PAP) 133-152의 대조 펩타이드(PCT/US2006/031961호에 서열번호 15로 개시된 서열)로 처리한 마우스 내의 항-FⅧ 항체 중화 수준을 나타낸다. 마우스는 rFⅧ 면역 3주 후 rFⅧ 추가 면역 전에 펩타이드 처리를 하였다. FⅧ 추가 면역 2주 후(7주)에 펩타이드 처리 마우스 내에서 항-FⅧ 항체 중화의 현격한 감소가 존재하고 시험기간인 최대 13주까지 지속된다.

펩타이드

본 발명은 펩타이드에 관한 것이다.

용어 "펩타이드"는 일반적으로 α-아미노와 인접 아미노산의 카르복실기 사이의 펩타이드 결합에 의해 서로 연결되는 일반적으로 L-아미노산인 잔기 시리즈를 의미하는 일반적인 의미로 사용된다. 상기 용어는 변형된 펩타이드 및 합성 펩타이드 유사체를 포함한다.

본 발명의 펩타이드는 화학 방법(Peptide Chemistry, A practical Textbook. Mikos Bodansky, Springer- Verlag, Berlin.)을 이용하여 제조된다. 예를 들어 펩타이드는 고형상 기술(Roberge JY et al (1995) Science 269: 202-204)에 의해 합성되고 수지에서 절단되고 고성능 액체 크로마토그래피(예를 들어 Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co, New York NY)에 의해 정제될 수 있다. 자동화 합성은 예를 들어 제조사에 의해 제공되는 지침에 따라 ABI 43 1 A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer)를 이용하여 달성된다.

또한 펩타이드는 재조합 수단에 의해 제조되거나 인자 Ⅷ로부터의 펩타이드의 절단과 함께 하나 또는 양쪽 말단의 변형에 의해 제조된다. 펩타이드 조성물은 아미노산 분석 또는 서열분석(예를 들어 Edman 분해 절차)에 의해 확인된다.

실용적인 목적을 위해 펩타이드가 나타내는 다른 다양한 특성이 존재한다. 예를 들어 펩타이드는 생체 내에서 치료 목적으로 이용 가능하도록 충분히 안정함이 중요하다. 생체 내 펩타이드의 반감기는 적어도 10분, 30분, 4시간 또는 24시간이다.

또한 펩타이드는 생체 내에서 우수한 생체이용률을 나타낸다. 펩타이드는 간섭 없이 세포 표면에서 MHC 분자에 이를 결합시킬 수 있는 생체 내 입체형태를 유지한다.

아피토프( Apitope )

적응성 면역 반응시 T 림프구는 단백질 항원의 내부 에피토프를 인식할 수 있다. 항원 제시 세포(APC)는 단백질 항원을 포획하여 짧은 펩타이드 단편으로 분해시킨다. 펩타이드는 세포 내부에서 주조직 적합 복합체(MHC) 클래스 Ⅰ 또는 Ⅱ 분자에 결합되고 세포 표면으로 운반된다. MHC 분자와 함께 세포 표면에 제시되면 펩타이드는 펩타이드가 T 세포 에피토프인 경우 T 세포(T 세포 수용체(TCR)를 통해)에 의해 인식된다.

따라서 에피토프는 MHC 클래스 I 또는 Ⅱ 분자의 펩타이드-결합 홈(groove)에 결합하고 T 세포에 의해 인식 가능한 항원에서 유래된 펩타이드이다.

최소 에피토프는 MHC 클래스 I 또는 Ⅱ 분자의 펩타이드-결합 홈에 결합 가능하고 T 세포에 의해 인식 가능한 에피토프에서 유래된 최소 단편이다. 주어진 면역 영역을 위해 최소 에피토프 모두를 포함하나 그의 주변(franking) 영역과는 상이한 에피토프로 작용하는 중복 펩타이드의 "네스티드 세트(nested set)"를 생성하는 것이 일반적으로 가능하다.

동일한 토큰 방법으로 트렁크화된(truncated) 펩타이드에 대한 반응을 측정함으로서 특정 MHC 분자:T 세포 결합에 대한 최소 에피토프를 확인하는 것이 가능하다. 예를 들어 반응이 중복 라이브러리 내 1∼15개 잔기를 포함한 펩타이드에 대해 수득되는 경우 양 말단에서 트렁크화된 세트(즉 1∼14, 1∼13, 1∼12 등 및 2∼15, 3∼15, 4∼15 등)는 최소 에피토프를 확인하는데 이용될 수 있다.

본 발명자들은 MHC 클래스 I 또는 Ⅱ 분자에 결합되고 추가 항원 처리 없이 T 세포에 제시될 수 있는 펩타이드의 능력과 생체 내 내성을 유도할 수 있는 펩타이드의 능력 사이에 연계가 존재함을 종전 개시한 바 있다(WO 02/16410). 펩타이드가 너무 길어서 추가 처리(예를 들어 트리밍(trimming)) 없이 MHC 분자의 펩타이드 결합 홈에 결합할 수 없거나 부적당한 입체형태로 결합되는 경우 생체 내 내성생성이 되지 않을 것이다. 한편 펩타이드가 MHC 펩타이드 결합 홈에 직접 결합하기에 적당한 크기 및 입체형태를 지닌 경우 이러한 펩타이드는 내성 유도에 유용할 것으로 예측될 수 있다.

따라서 시험관 내에서 MHC 클래스 I 또는 Ⅱ 분자에 결합되고 추가 항원 처리 없이 T 세포에 제시될 수 있는지 여부를 조사함으로서 펩타이드의 내성생성 능력을 조사하는 것이 가능하다.

본 발명의 펩타이드는 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합되고 추가 항원 처리 없이 인자 Ⅷ 특이적 T 세포로부터 반응을 자극시킬 수 있다는 점에서 아피토프(Antigen Processing-Indepent epiTOPES)이다. 이러한 아피토프는 WO 02/16410에 기재된 규칙-기반 방법에 따라 FⅧ에 대한 내성을 유발할 것으로 예측될 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 추가 처리 없이 MHC 클래스 I 또는 Ⅱ 분자에 결합 가능한 어떠한 길이도 된다. 일반적으로 본 발명의 펩타이드는 MHC 클래스 Ⅱ에 결합 가능하다.

MHC 클래스 I 분자에 결합하는 펩타이드는 일반적으로 7 내지 13개, 더욱 바람직하게는 8 내지 10개 아미노산 길이이다. 펩타이드의 결합은 펩타이드의 주요 사슬 내의 원자와 모든 MHC 클래스 I 분자의 펩타이드-결합 홈 내 불변 사이트간에 접촉하는 두 개의 말단에서 안정화된다. 펩타이드의 아미노 및 카복시 말단에 결합하는 홈의 양 말단에 불변 사이트가 존재한다. 변이는 주로 필요한 유연성을 허용하는 프롤린 및 글리신 잔기에서의 펩타이드 골격 내 비틀림에 의해 조절되는 펩타이드 길이이다.

MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합하는 펩타이드는 일반적으로 8 내지 20개 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 10 내지 17개 아미노산 길이이고, 더 길어도 된다(예를 들어 40개 아미노산까지). 이들 펩타이드는 양 말단에서 개방된 MHC Ⅱ 펩타이드-결합 홈(MHC 클래스 I 펩타이드-결합 홈과 달리)을 따라 확장된 입체형태를 지닐 수 있다. 펩타이드는 주로 펩타이드-결합 홈을 정렬시키는 보존적 잔기와 결합하는 주-사슬 원자에 의해 적절하게 유지된다.

펩타이드 서열

본 발명의 첫 번째 실시형태는 FⅧ-유래 서열을 포함하는 펩타이드에 관한 것이다. 실시예에서 조사된 FⅧ-유래 서열은 다음 서열을 지닌다.

서열번호 1: Lys-Lys-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe- Val-Asn-Met-Glu-Gly-Lys-Lys

서열번호 2: Lys-Lys-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe- Val-Asn-Met-Glu-Gly-Lys-Glu

서열번호 3: Lys-Lys-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe- Val-Asn-Met-Glu-Gly-Glu-Lys

서열번호 4: Lys-Lys-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe- Val-Asn-Met-Glu-Gly-Glu-Glu

서열번호 5: Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe- Val-Asn-Met-Glu-Gly-Lys-Lys

서열번호 6: Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe- Val-Asn-Met-Glu-Gly-Lys-Glu

서열번호 7: Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe- Val-Asn-Met-Glu-Gly-Glu-Lys

서열번호 8: Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe- Val-Asn-Met-Glu-Gly-Glu-Glu

서열번호 9: Lys-Glu-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe- Val-Asn-Met-Glu-Gly-Lys-Lys

서열번호 10: Lys-Glu-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe- Val-Asn-Met-Glu-Gly-Lys-Glu

서열번호 11: Lys-Glu-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe- Val-Asn-Met-Glu-Gly-Glu-Lys

서열번호 12: Lys-Glu-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe- Val-Asn-Met-Glu-Gly-Glu-Glu

서열번호 13: Glu-Lys-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe- Val-Asn-Met-Glu-Gly-Lys-Lys

서열번호 14: Glu-Lys-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe- Val-Asn-Met-Glu-Gly-Lys-Glu

서열번호 15: Glu-Lys-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe- Val-Asn-Met-Glu-Gly-Glu-Lys

서열번호 16: Glu-Lys-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe- Val-Asn-Met-Glu-Gly-Glu-Glu

서열번호 17: Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala- Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Lys-Lys

서열번호 18: Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala- Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Lys-Glu

서열번호 19: Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala- Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Glu-Lys

서열번호 20: Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala- Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Glu-Glu

서열번호 21: Glu-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala- Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Lys-Lys

서열번호 22: Glu-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala- Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Lys-Glu

서열번호 23: Glu-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala- Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Glu-Lys

서열번호 24: Glu-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala- Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Glu-Glu

서열번호 25: Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala- Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Lys-Lys

서열번호 26: Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala- Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Lys-Glu

서열번호 27: Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala- Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Glu-Lys

서열번호 28: Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala- Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Glu-Glu

서열번호 29: Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala- Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Lys-Lys

서열번호 30: Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala- Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Lys-Glu

서열번호 31: Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala- Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Glu-Lys.

서열번호 32: Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala- Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Glu-Glu.

'지닌다(has)' 또는 '지니는(having)'이라는 용어는 펩타이드가 중저?? 아미노산 서열만으로 구성된 것을 의미한다.

본 발명은 DNIMVTFRNQASRPY 서열을 포함하는 펩타이드를 제공하는 것이다. 이는 서열번호 17, 18, 19, 25, 26, 27, 29, 30 또는 31의 아미노산 서열 중 하나를 지닌다.

펩타이드는 서열번호 17, 18, 25 또는 26의 아미노산 서열 중 하나를 지닐 수 있다.

펩타이드는 서열번호 17 또는 18을 지닐 수 있다.

펩타이드는 서열번호 17을 지닐 수 있다.

본 발명은 PRCLTRYYSSFVNME 서열을 포함하는 펩타이드를 제공하는 것이다. 이는 서열번호 1, 2, 3, 5, 7, 9, 10, 11 또는 13의 아미노산 서열 중 하나를 지닌다.

펩타이드는 서열번호 1, 2, 9 또는 10의 아미노산 서열 중 하나를 지닐 수 있다.

펩타이드는 서열번호 1 또는 2을 지닐 수 있다.

펩타이드는 서열번호 1을 지닐 수 있다.

인자 Ⅷ

서열 DNIMVTFRNQASRPY 및 서열 PRCLTRYYSSFVNME은 본 발명의 펩타이드의 중심 부분을 형성하는 것으로 이들 모두는 인자 Ⅷ로부터 유래한 것이다.

인자 Ⅷ는 혈액 응고의 내인성 경로에 관여한다; 인자 Ⅷ는 Ca+2 및 인지질 존재시 인자 X를 활성화 형태 Xa로 전환시키는 인자 Ⅸa에 대한 보조인자이다.

인자 Ⅷ 유전자는 2개의 선택적인 스플라이스 전사체를 생성한다. 전사체 변이체 1은 혈장 내에서 순환되고 비공유결합 복합체 내에서 폰 빌레브란드 인자와 결합되는 거대 당단백질인 이소폼 a를 암호화한다. 이러한 단백질은 다수의 분열 이벤트를 수행한다. 전사체 변이체 2는 주로 인자 Ⅷc의 인지질 결합 도메인으로 구성되는 추정 소단백질인 이소폼 b를 암호화한다. 이 결합 도메인은 응고 활성에 필수적이다.

인간 인자 Ⅷ 유전자의 완전한 186,000개 염기쌍 서열은 1980년대 중반에 규명되었다(Gitschier et al (1984) Nature 312 326-330). 동시에 완전한 2351개 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 클론이 배양된 포유류 세포 내에서 생물학적으로 활성인 인자 Ⅷ를 생성하는데 이용되었다(Wood et al (1984) Nature 312:330-337). 인간 인자 Ⅷ에 대한 완전한 2,351개 아미노산 서열은 서열번호: 33에 제공된다.

용해도

본 발명의 첫 번째 실시형태의 펩타이드는 하기의 펩타이드 중 하나의 변형된 형태이다:

이들 펩타이드가 아피토프로 작용한다는 것과 생체 내에서 내성을 유발한다는 것은 이미 개시되었다(국제 특허출원 번호 PCT/GB2008/003996의 실시예 참고).

용해도가 펩타이드-매개 내성 유도시 중요한 고려사항이라는 것이 밝혀졌다.

본 발명자들은 용해도가 펩타이드 양 말단 모두에서 글리신 스페이서와의 통합에 의해 개선됨을 발견하였고 N 및 C 말단 모두에서 라이신(K) 및/또는 글루탐산(E)등의 2개의 추가적 아미노산 결합에 의해 용해도가 더욱 개선됨을 발견하였다. 주어진 펩타이드 말단에서 가능한 조합은 KK, KE, EK 또는 EE이다.

본 발명의 변형된 펩타이드는 모펩타이드인 DNIVM 및 PRCLT 펩타이드보다 6개의 추가 아미노산(각 말단에 3개) 서열을 지닌다.

본 발명의 펩타이드는 다음 일반식을 지닌다:

XXGDNIMVTFRNQASRPYGXX 또는

XXGPRCLTRYYSSFVNMEGXX

상기 식에서 X는 라이신 또는 글루탐산이다.

변형된 펩타이드는 모체(변형되지 않은) 펩타이드보다 높은 용해성을 지닌다. 변형된 펩타이드는 모체 펩타이드보다 2, 3, 4 또는 5배 정도 더 큰 용해성을 가진다. 상기 펩타이드는 0.5mg/ml, 1mg/ml 또는 5mg/ml까지의 농도에서 용해된다.

내성

T 세포 에피토프는 자가 또는 외부의 어떠한 항원에 대해서도 적응성 면역 반응에 중추 역할을 한다. 과민 질환(알레르기, 자가면역 질환 및 이식 거부를 포함) 내 T 세포 에피토프에 의한 중추 역할은 실험 모델의 이용을 통해 입증되었다. 애쥬번트와 함께 합성 펩타이드(T 세포 에피토프의 구조를 기반으로 한)의 주입에 의해 염증 또는 알레르기 질환의 유도가 가능하다.

이와 대조적으로 용해성 형태의 펩타이드 에피토프의 투여에 의해 특정 항원에 대한 면역 내성을 유도하는 것이 가능한 것으로 나타났다. 용해성 펩타이드 항원의 투여는 실험 자가면역 뇌척수염(EAE - a model for multiple sclerosis (MS)) (Metzler and Wraith (1993) Int. Immunol. 5:1159- 1165; Liu and Wraith (1995) Int. Immunol. 7:1255-1263; Anderton and Wraith (1998) Eur. J. Immunol. 28:1251-1261); 및 관절염, 당뇨병 및 포도막망막염(상기 Anderton and Wraith (1998)에서 관찰됨)의 실험 모델 내 질환을 억제하는 효과적인 방법으로 입증되었다. 또한 이는 EAE(상기 Anderton and Wraith (1998)) 내 진행성 질환의 치료 방법으로서 입증되었다.

내성은 항원에 반응하지 않는 것이다. 자가 항원에 대한 내성은 면역 체계의 필수적인 특징이고, 이것이 소실되면 자가면역 질환이 유발될 수 있다. 적응성 면역 체계는 다양한 막대한 감염성 작용제에 반응할 수 있는 능력을 유지하면서 그 자신의 조직 내에 포함된 자가 항원의 자가면역 공격을 방지해야 한다. 이는 대부분 흉선(중추 내성) 내 아폽토시스성 세포사멸에 대한 미성숙 T 림프구의 민감성에 의해 제어된다. 그러나 모든 자가 항원이 흉선 내에서 탐지되지 않고, 따라서 자가-반응성 흉선세포의 사멸이 불완전하게 유지된다. 따라서 말초 조직(말초 내성) 내 숙성 자가-반응성 T 림프구에 의해 내성이 수득되는 메커니즘이 존재한다. 중추 및 말초 내성의 메커니즘 고찰은 Anderton et al (1999)(Immunological Reviews 169:123-137)에 제공되어 있다.

혈우병 A에서 환자는 인자 Ⅷ 유전자의 결함을 지닌다. 이는 인자 Ⅷ가 면역 체계에 의해 "자가" 항원으로 인식되지 않음을 의미한다. 인자 Ⅷ이 응고 인자 대체 요법 동안 투여되면 이에 따라 동종면역 반응이 외부 단백질에 대해 생성되어 FⅧ 저해제 항체의 생성을 유발한다.

본 발명의 펩타이드는 FⅧ이 예방적으로 투여되는 경우 인자 Ⅷ에 대한 내성을 유도하는 것이 가능하며 면역 반응을 유도하지 않고 FⅧ 저해제를 생성하지 않는다. 또한 치료적으로 투여되는 경우 존재하는 FⅧ 저해제 생성은 감소되거나 저해되는 것이다.

후천성 혈우병은 인자 Ⅷ에 대한 내성이 붕괴된 자가면역 질환이다. 이러한 경우 이러한 자가 단백질에 대한 내성을 복구시키고 병원성 면역 반응을 축소시키기 위해 본 발명의 펩타이드가 투여된다.

내성은 CD4+ T 세포의 일부에서 아네르기(anergy)의 유도에 의해 유발되는 것이다. T 세포를 활성화시키기 위해 펩타이드는 T 세포에 2개의 신호를 전달하는 것이 가능한 "전문적인" APC와 결합되어야 한다. 첫 번째 신호(신호 1)는 MHC-펩타이드 복합체에 의해 APC의 세포 표면상에 전달되고 TCR을 통해 T 세포에 의해 수신된다. 두 번째 신호(신호 2)는 CD80 및 CD86과 같은 동시자극 분자에 의해 APC의 표면상에 전달되고 CD28에 의해 T 세포의 표면상에서 수신된다. T 세포가 신호 2의 부재 하에 신호 1을 수신하는 경우 불활성화되는 것으로 판단되고, 실제로 아네르기가 된다. 아네르기성 T 세포는 후속 항원 유발에 불응성이고, 다른 면역 반응을 억제하는 것이 가능하다. 아네르기성 T 세포는 T 세포 내성을 매개하는데 관련된 것으로 판단된다.

이론에 속박되지 않고 본 발명자들은 펩타이드가 숙성 항원 제시 세포에 의해 조절되어야 하기 때문에 MHC 분자와 함께 제시될 수 있기 전에 처리를 필요로 하는 펩타이드는 내성을 유도하지 않음을 예측하였다. 숙성 항원 제시 세포(대식세포, B 세포 및 수지상 세포와 같은)는 항원을 처리할 뿐만 아니라 신호 1 및 2 모두를 T 세포로 전달하여 T 세포 활성화를 유발하는 것이 가능하다. 한편 아피토프는 미숙성 APC 상에서 클래스 Ⅱ MHC에 결합할 수 있을 것이다. 따라서 이들은 동시자극 없이 T 세포에 제시되어 T 세포 아네르기 및 내성을 유발할 수 있을 것이다.

물론 아피토프도 숙성 APC의 세포 표면에서 MHC 분자에 결합 가능하다. 그러나 면역 체계는 숙성보다는 더 많은 미숙성 APC를 포함한다(10% 이하의 수지상 세포가 활성화됨이 제안되었음, Summers et al. (2001) Am. J. Pathol. 159: 285-295). 따라서 아피토프에 대한 디폴트 위치는 활성화보다는 아네르기/내성이 될 것이다.

FⅧ에 대한 내성 유도는 당분야의 기술자에 의해:

(ⅰ) FⅧ 저해 항체:

(ⅱ) FⅧ에 특이적인 CD4+ T 세포

(ⅲ) FⅧ 저해 항체를 분비하는 것이 가능한 B 세포

의 수치 감소를 관찰함으로서 생체 내에서 모니터링 될 수 있다.

따라서 내성 유도는

(a) CD4+ T 세포 내 아네르기의 유도(시험관 내 FⅧ와의 후속 유발에 의해 검출될 수 있음);

(b) (ⅰ) 증식 감소;

(ⅱ) IL-2, IFN-γ 및 IL-4 생성의 하향-조절; 및

(ⅲ) IL-10 생성의 증가를 포함한

CD4+ T 세포군의 변화

를 포함한 다양한 기술에 의해 모니터될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "내성유발(tolerogenic)"은 내성을 유도하는 것이 가능함을 의미한다.

조성물

또한 본 발명은 본 발명에 따른 하나 또는 그 이상의 펩타이드를 포함한 약제학적 조성물과 같은 조성물에 관한 것이다.

본 조성물은 펩타이드 DNIMVTFRNQASRPY의 변형된 형태와 펩타이드 PRCLTRYYSSFVNME의 변형된 형태를 포함한다.

상기 펩타이드는 예를 들어 2, 3, 4, 5 또는 6개의 본 발명의 펩타이드와 같은 다수의 펩타이드를 포함한다.

본 발명의 조성물은 예방 또는 치료 용도이다.

예방 용도로 투여되는 경우 상기 조성물은 FⅧ에 대한 면역 반응의 생성을 감소시키거나 방지한다. 면역 반응 수준은 상기 조성물로 치료되지 않은 환자에서 얻어지는 것 보다 작다. "감소시킨다"라는 용어는 상기 조성물로 치료되지 않은 환자에서 관찰되는 반응(또는 동일한 시간-프레임에 대한 비치료 환자에서 관찰되는 반응)의 50%, 70%, 80% 또는 90% 감소와 같은 면역 반응의 부분적 감소가 관찰됨을 나타낸다. "방지한다"라는 용어는 FⅧ에 대한 감지 가능한 면역 반응에서 관찰되지 않음을 나타낸다.

치료 용도로 투여되는 경우 상기 조성물은 FⅧ에 대한 이미 진행중인 면역 반응을 억제한다. "억제한다"라는 용어는 펩타이드 치료 전 수준과 비교시 진행중인 면역 반응의 수준 또는 치료가 제공되지 않은 동일 시점에서 관찰되는 수준의 감소를 나타낸다.

본 발명의 조성물로의 치료는 하기의 어느 하나 또는 전부의 수준 감소를 유발한다:

(ⅰ) FⅧ 저해 항체:

(ⅱ) FⅧ에 특이적인 CD4+ T 세포

(ⅲ) FⅧ 저해 항체를 분비하는 것이 가능한 B 세포.

이들 인자 모두의 검출은 ELISA, 유동 세포 계측법, 발색 응고 분석법 등과 같은 당분야에 알려진 기술에 의해 수행될 수 있다.

또한 본 발명의 조성물로의 치료는 FⅧ에 특이적인 CD4+ T 세포에서 아네르기를 선택적으로 유발한다. 아네르기는 예를 들어 시험관 내에서 FⅧ와 함께 연속적 시험을 통해 검출될 수 있다.

FⅧ에 대한 모든 면역 반응은 병원성이 아님을 명심하는 것이 중요하다. 비-저해 항-FⅧ 항체가 저해제 없는 혈우병 환자(Moreau et al (2000) Blood 95:3435-41) 및 건강한 혈액 공여자의 약 15%에서 발견된다(Algiman et al (1992) 89:3795-9).

FⅧ 저해제는 정상 혈장 내 FⅧ를 불활성화시키는 환자 혈장의 능력을 시험하는 응고 Bethesda 분석의 Nijmegen 변형에 의해 검출된다. Bethesda 유니트는 혈장 FⅧ 활성의 50%를 중화시키는 항체 함량으로 정의되고, 0.6 BU 이상의 역가는 항체의 존재를 나타낸다.

저해제는 일반적으로 수치가 <5 BU인 경우 낮은 역가로 분류되고 ≥5 BU인 경우 높은 역가로 분류된다

순환 FⅧ 저해 항체의 수치는 치료받지 않은 환자에서 관찰되는 항체 수치의 90%, 75%, 50%, 20%, 10%, 5%로 감소된다.

순환 FⅧ 저해 항체의 수치는 5, 4, 3, 2, 1 또는 0.5 BU로 감소된다.

본 발명의 펩타이드 및 조성물은 환자의 응고를 돕는데 이용 가능한 치료상 투여된 FⅧ의 함량 또는 비율을 증가시킨다. 이는 치료 기능 수행시 FⅧ 부분을 효과적으로 제거하는 FⅧ 저해제의 감소에 기인한다. 본 발명의 펩타이드 또는 조성물은 예를 들어 10%, 25%, 50% 75% 또는 100%까지 이용 가능한 FⅧ의 함량을 증가시킨다.

따라서 본 발명의 펩타이드 및 조성물은 환자의 응고를 돕기 위해 투여될 필요가 있는 FⅧ의 함량을 감소시킨다.

제형

조성물은 액체 용액 또는 현탁액과 같은 주사제로 제조되고; 주입 전 액체 내 용액 또는 현탁액에 적당한 고형 형태도 제조된다. 또한 제제는 유화되거나 펩타이드는 리포솜 내에 캡슐화된다. 활성 성분은 약제학적으로 허용 가능하고 활성 성분과 양립 가능한 부형제와 혼합된다. 적당한 부형제는 예를 들어 물, 식염수(예를 들어 인산염-완충 식염수), 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 및 그의 조합이다.

더욱이 바람직한 경우 조성물은 습윤제 또는 유화제 및/또는 pH 조절제와 같은 최소 함량의 보조 물질을 포함한다. 완충염은 인산염, 구연산염, 아세트산염을 포함한다. 염산 및/또는 수산화나트륨은 pH 조절제로 사용된다. 안정화를 위해 슈크로스 또는 트레할로스와 같은 이당류가 사용된다.

상기 조성물이 다수의 펩타이드를 포함하는 경우 펩타이드의 상대 비율은 거의 동일하다. 또한 각각의 펩타이드의 상대 비율은 예를 들어 자가반응 T-세포의 특정 서브-세트 상에 내성 유발 반응을 집중시키기 위해 또는 하나의 펩타이드가 특정 HLA 형태의 다른 것 보다 더 우수하게 작용하는 경우 변경된다.

제형화 후 조성물은 멸균 용기 내에 통합된 후 밀봉되고 저온 예를 들어 4℃에서 보관되거나 동결-건조된다.

통상적으로 상기 조성물은 동결건조된 분말로 제조된다. 동결건조는 안정화된 형태로 장기가-보관을 가능하게 한다. 동결건조 절차는 당분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 http://www.devicelink.com/ivdt/archive/97/01/006.html 참조. 만니톨, 덱스트란 또는 글리세린과 같은 충전제는 일반적으로 동결-건조 전에 사용된다.

조성물은 경구, 정맥내(수용성인 경우), 근육내, 피하, 설하, 비강내, 피내, 좌약 경로 또는 이식(예를 들어 서방성 분자를 이용)과 같은 통상적인 방식으로 투여된다.

조성물은 비강내, 피하 또는 피내 경로를 통해 바람직하게 투여된다.

본 발명의 펩타이드 및 조성물은 인간 피험자를 치료하는데 이용된다. 상기 피험자는 혈우병 A 특히 중증 혈우병 A를 지닌다. 상기 피험자는 FⅧ에 유전적으로 결함을 지닌다. 상기 피험자는 후천성 혈우병을 지닌다. 상기 피험자는 저해 항-FⅧ 항체를 지닌다.

피험자는 FⅧ으로의 응고 대체 요법을 수행하거나 수행 예정이다.

피험자는 FⅧ으로의 응고 대체 요법을 수행하거나 수행함이 없이 바이패싱 치료를 수행하거나 수행 예정이다.

피험자는 FⅧ 유전자로의 유전자 요법을 수행하거나 수행 예정이다.

피험자는 저해 항-FⅧ 동종항체 또는 자가항체를 발달시키기 위한 유전적 소인과 관련된 HLA-일배체(haplotype)이다. 피험자는 HLA-DR2를 발현시킨다. 개체의 HLA 일배체를 측정하는 방법은 당분야에 알려져 있다.

일반적으로 의사는 개별적인 피험자에 가장 적당한 실질적인 용량을 결정할 것이고 이는 특정 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 변동될 것이다.

바람직한 실시태양에서 다수의 용량이 상승 농도로 환자에 제공되는 "용량 단계적 확대" 프로토콜이 수행된다. 이러한 방법은 예를 들어 봉독 알레르기에 대한 면역치료 적용시 포스포리파제 A2 펩타이드에 사용되었다(Muller et al (1998) J. Allergy Clin Immunol. 101:747-754 and Akdis et al (1998) J. Clin. Invest. 102:98-106).

키트

편리하게는 조성물은 다수의 펩타이드를 포함하는 경우 혼합 조성물 또는 칵테일의 형태로 함께 투여된다. 그러나 동시, 개별적, 연속적 또는 혼합 투여를 위해 별도의 키트 형태로 펩타이드를 제공하는 것이 바람직한 경우도 존재한다.

또한 키트는 혼합 및/또는 투여 수단(예를 들어 비강내 투여를 위한 분사기; 또는 피하/피내 투약을 위한 주사기 및 바늘)을 포함한다. 또한 키트는 사용 설명서를 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물 또는 키트는 질병을 치료하고/또는 예방하는데 사용된다.

더욱 상세하게는 조성물/키트는 혈우병 A 또는 후천성 혈우병 환자에게 항-FⅧ 저해제 형성을 치료하거나 예방하기 위해 사용된다. 조성물/키트는 FⅧ 항체를 중화시킴으로써 혈우병을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

혈우병 A

혈우병 A(전형적인 혈우병)는 인자 Ⅷ의 결함에 의해 유발된다.

혈우병 A는 남성 10,000명 중 1명의 추정 발병률을 지니는 반면 혈우병 B는 남성 40,000명 중 1명으로 발생하는 것으로 추정된다. 여성 5,000명 중 약 1명이 혈우병 A의 보인자이고, 20,000명 중 1명이 혈우병 B의 보인자이다.

혈우병은 일반적으로 3가지 종류로 분류된다: 혈액 내 응고 인자 수치를 기반으로 한 중증, 중등도 및 경증이다. 중증 혈우병의 경우 정상 응고 인자의 1 퍼센트 이하가 존재한다. 중증도의 정도는 세대에서 세대로 일관되게 유지된다.

통상의 믿음과는 반대로 작은 절개 및 상처는 일반적으로 혈우병 환자에 위협을 제공하지 않는다. 오히려 가장 큰 위험은 관절 및 근육에서 발생하는 자연 출혈에서 기인한다. 이는 일반적으로 5 내지 15세의 연령의 빠른 성장기 동안 발생하는 경향이 있다.

관절 내 반복된 자연 출혈은 관절염을 유발하고, 인접한 근육은 연약해진다. 혈액 축적에 의해 유발된 신경 상의 압력은 통증, 저림 및 영향 받은 부위를 일시적으로 움직일 수 없게 한다.

혈우병 A는 일반적으로 응고 효과를 측정하고 응고 인자 수치가 비정상인지 여부를 조사하는 혈액 검사로 진단된다.

공여자 혈액에서 분리되고 1970년대에 정제된 응고 인자의 개발은 혈우병에 대한 장기간 전망을 유의적으로 개선시켰다. 경증 내지 중등도 혈우병은 ad hoc 기준 상에서 FⅧ로의 치료를 이용할 수 있는 반면 중증 혈우병은 규칙적이고 기한 없는 치료를 필요로 한다.

종전 환자들은 수천의 기증된 혈장으로부터 추출된 인자 Ⅷ 농축물이 제공되었다. 이는 바이러스성 병원균 특히 인간 면역결핍 바이러스 및 간염 바이러스로의 오염의 상당한 문제점을 유발한다. 단일클론 항체 정제 기술, 열 불활성화 및 바이러스 사멸 세정제 처리는 혈장-유래 농축물을 비교적 안전하게 한다.

현재 재조합 DNA 기술은 Recombinate^TM 및 Kogenate^TM과 같은 합성 제품을 연속적으로 제공하였다. Kogenate는 인간 인자 Ⅷ를 발현하는 미숙 햄스터 신장 세포를 이용하여 제조된다. 수득된 인자는 높게 정제되고 혈장으로부터 바이러스의 전달의 어떠한 가능성도 배제시킨다.

본 발명의 펩타이드 또는 조성물은 인자 Ⅷ 대체 요법 이전 및/또는 동안 투여된다.

혈우병 A는 ⅰ) 단일 확인 유전자 내 돌연변이에 의해 유발되고, ⅱ) 생체 내 응고 인자 수준의 경미한 증가가 중증 혈우병에서 경증 질병으로 전환시킬 수 있고, ⅲ) 현재 대체 요법은 차선책으로 간주되기 때문에 유전자 요법에 대한 이상적인 타겟 질병이다. 또한 응고 활성의 바람직한 수준의 "과대증"이 존재하는 경우 안전성이 광범위하게 존재한다.

불행하게도 현재 응고 인자의 장기간 발현을 가능하게 하기 위해 충분히 비-면역원성인 유전자 전달 시스템을 발견하는데 어려움이 있기 때문에 혈우병에 대한 치료법으로서 유전자 요법의 전망은 실현되지 않고 있다.

본 발명의 펩타이드는 인자 Ⅷ로의 유전자 요법 이전에 피험자를 내성화하고 유전자 요법 후 환자에서 FⅧ 저해제 형성을 조절하는데 적당할 것이다.

후천성 혈우병

후천성 혈우병은 종전 정상 응고를 지닌 개체 내에서 FⅧ에 대한 자가항체 저해제 존재를 특징으로 한다. 연간 100만명의 개체군 당 1∼3의 추정 발병률을 지닌 드문 질환이다. 후천성 자가항체 저해제와 관련된 사망률은 동종항체를 지닌 개체의 실질적으로 낮은 사망 위험률과 대비하여 25%에 근접한다.

동종항체 저해제 환자와 비교시 후천성 혈우병은 (1) 더욱 심한 출혈 패턴; (2) 고령 개체군에서의 높은 발병률; (3) 약 50%의 환자에게서 자가면역 질환, 림프세포증식성 또는 악성 고형 종양, 임신, 페니실린 및 설폰아마이드와 같은 특정 항생제를 사용하는 것으로 확인된 관련 발생률; 및 (4) 일반적으로 환자 혈장 내 2%∼18% 범위의 잔여 인자 Ⅷ 수치를 유발하는 자가항체에 의한 목표하는 응고 인자 활성의 불완전한 중화를 지닌 타입 Ⅱ 약물 동역학적 패턴을 따르는 시험관 내 저해제 활성;을 지님을 특징으로 한다.

본 발명의 펩타이드 또는 조성물은 예를 들어:

ⅰ) 예를 들어 페니실린 또는 설폰아마이드 투여로의 긴급한 치료

ⅱ) 종양 또는 다른 악성의 진행

ⅲ) 긴급한 또는 초기 임신

으로 인한 후천성 혈우병 환자 또는 후천성 혈우병 발병 위험이 있는 것으로 판단되는 환자에게 투여된다.

본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 실시예는 당업자가 본 발명을 실시하기 위해 보조적인 것으로 판단되며 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예

(실시예 1) FⅧ-유래 펩타이드의 용해도 조사

총 32개의 펩타이드를 시험하였다: 16개는 FⅧ 펩타이드 PRCLTRYYSSFVNME('PRCLT')에 기반하여 준비되었으며 16개는 FⅧ 펩타이드 DNIMVTFRNQASRPY('DNIMV')에 기반하여 준비되었다. 하기 표 1 및 2에 펩타이드를 요약한다.

PRCLT-유래 펩타이드

펩타이드 번호	서열	서열번호
1	Lys-Lys-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Lys-Lys	1
2	Lys-Lys-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Lys-Glu	2
3	Lys-Lys-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Glu-Lys	3
4	Lys-Lys-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Glu-Glu	4
5	Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Lys-Lys	5
6	Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Lys-Glu	6
7	Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Glu-Lys	7
8	Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Glu-Glu	8
9	Lys-Glu-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Lys-Lys	9
10	Lys-Glu-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Lys-Glu	10
11	Lys-Glu-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Glu-Lys	11
12	Lys-Glu-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Glu-Glu	12
13	Glu-Lys-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Lys-Lys	13
14	Glu-Lys-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Lys-Glu	14
15	Glu-Lys-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Glu-Lys	15
16	Glu-Lys-Gly-Pro-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-Glu-Gly-Glu-Glu	16

DNIMV-유래 펩타이드

펩타이드 번호	서열	서열번호
17	Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Lys-Lys	17
18	Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Lys-Glu	18
19	Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Glu-Lys	19
20	Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Glu-Glu	20
21	Glu-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Lys-Lys	21
22	Glu-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Lys-Glu	22
23	Glu-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Glu-Lys	23
24	Glu-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Glu-Glu	24
25	Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Lys-Lys	25
26	Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Lys-Glu	26
27	Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Glu-Lys	27
28	Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Glu-Glu	28
29	Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Lys-Lys	29
30	Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Lys-Glu	30
31	Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Glu-Lys	31
32	Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pro-Tyr-Gly-Glu-Glu	32

20mg/mL의 각각의 시험 펩타이드 원액을 DMSO에 녹여 준비한다. 대조군 펩타이드의 원액, 4Y로 알려진 MBP-유래 펩타이드의 원액 역시 DMSO에 녹여 준비한다. 펩타이드 4Y는 Ac-ASQYRPSQR의 서열을 지닌다. 이는 구조적으로 시험 펩타이드와 상이하나 내성화 항원과 같이 적용시 용해되는 것으로 알려진 것이다.

펩타이드 용액 40μL의 계대희석을 물을 첨가하여 수행하였고 96-웰 플레이트에 10, 5, 2.5 및 1.25 mg/mL 농도로 분주하였다.

플레이트를 실온에서 한시간 방치하여 침전물이 형성되게 하였으며 14,800rpm으로 10분간 원심분리시켜 용해된 용출물로부터 침전/콜로이드 펩타이드를 분리하였다.

각각의 튜브의 최상부로부터 2μL 시료를 채취하여 분석하였다. 흡광도를 280nm 파장에서 측정하고 농도(mg/mL)를 계산하였다.

그 결과를 도 1에 나타내었다. 몇 개의 태그 펩타이드는 높은 농도에도 불구하고 4Y와 동등한 용해도를 나타내었다. 녹색으로 표시된 펩타이드는 대조군의 펩타이드 4Y와 동일한 용해성을 지닌 것이고 적색으로 표시된 펩타이드는 낮은 용해도를 지닌 것이며 주황색으로 표시된 펩타이드는 중간 정도의 용해도를 나타내었다.

(실시예 2) 임상 관련 농도에서 수용매 내 태그 펩타이드의 직접 용출

각각의 시험 펩타이드와 모펩타이드(PRCLT 및 DNIMV)에 대해 각각 DMSO(대조군) 또는 PBS에 용해시킨 4mg/mL의 두 개의 튜브를 준비하였다.

각각의 튜브를 소형 원심분리기에서 최고속도로 5분간 회전시킨다. 10μL 새료를 각각의 용액 상부로부터 채취하고 각각의 펩타이드에 대해 분자량과 흡광 계수를 기록하였다.

상등액의 흡광도는 NanoDrop을 사용하여 측정하였으며 농도를 계산하였다. 실측 농도를 4mg/mL의 예측치와 비교하였고 그 결과를 도 2에 나타내었다. 실측치와 예측 농도간의 큰 차이는 더 낮은 상대 용해도에 상응한다.

도 2에 나타난 바와 같이, 서열번호 1, 2, 9, 10, 17, 18, 25 및 26의 태그 펩타이드는 모두 모 펩타이드에 비해 향상된 PBS 용해도를 나타내었다.

(실시예 3) 태그 펩타이드는 아피토프로 작용한다.

HLA-DR2 형질전환 마우스를 모 펩타이드 PRCLT 또는 DNIMV로 전처리시킨다. 비장과 림프절을 채취한 후 CD4 정제 후에 세포를 1ug/ml 인간 재조합 FⅧ로 재자극시켰다. BW5147 세포에 융합시킨 후 얻어진 클론을 증식시키고 DNIMV 또는 PRCLT에 특이성을 지닌 것을 '스크리닝'하였다. 이 공정은 하이브리도마 세포와 5×10⁴ DR2-양성 항원 제시 세포(MGAR 세포주) 및 10ug/ml PRCLT/DNIMV 또는 배지를 48시간 동안 인큐베이션 시킴으로써 수행된다. 상등액에서 IL-2 생성을 ELISA를 통해 분석하였다.

IL-2를 특이하게 생성하는 클론은 펩타이드와 함께 인큐베이션시 팽창 증식되었으며 FⅧ(1ug/mL)를 통해 스크리닝 하였다.

FⅧ 및 펩타이드 모두에 대해 응답하여 IL-2를 생성하는 클론이 변형된 DNIMV 및 PRCLT 펩타이드가 아피토프인지 아닌지를 평가하기 위해 사용되었으며 이들 클론이 MHC 분자에 결합할 수 있는지와 고정화된 APC 및 신선한 APC 모두에 T 세포 제시가 가능한지를 평가하였다.

5×10⁴ 하이브리도마 세포를 5×10⁴ 신선한 또는 고정된 MGAR 세포 및 10ug/ml의 펩타이드, 1ug/ml의 FⅧ 또는 배지와 함께 48시간 인큐베이션시켰다. 상등액에서 IL-2 생성을 ELISA를 통해 분석하였다. PRCLT에 대한 결과는 도 3a에, DNIMV에 대한 결과는 도 3b에 나타내었다.

모든 태그 펩타이드가 고정화된 항원 제시 세포에 의해 제시될 수 있었으며 이는 이들 모두가 모펩타이드 PRCLT 및 DNIMV와 같이 아피토프로 작용함을 나타내는 것이다.

(실시예 4) 생체외 T 세포 내성

변형된 아피토프가 모펩타이드에 대한 T 세포 응답을 조절할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 웅성 HLA-DR2 형질전환 마우스를 3×100μg 펩타이드(펩타이드 서열번호 1, 2, 17 또는 18) 또는 대조군으로서 PBS로 처리하였다. 그 후 완전한 Freund 애쥬번트를 지닌 모펩타이드(PRCLT 및 DNIMV) 각각 100μg으로 면역화시켰다. 10일 후에 림프절과 비장을 채취하고 PRCLT 또는 DNIMV로 시험관 내에서 자극시켰다. 그 결과는 도 4(PRCLT) 및 도 5(DNIMV)에 나타내었다. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 변형된 펩타이드로의 처치는 PRCLT에 대한 T 세포 응답을 감소시켰으며 서열번호 17 또는 서열번호 18의 변형된 펩타이드로의 처치는 DNIMV에 대한 T 세포 응답을 감소시켰다. 따라서 변형된 펩타이드는 모펩타이드로 면역화시킨 마우스로부터 면역 응답을 감소시킬 수 있는 것이다.

(실시예 5) 생체외 T 세포 내성

변형된 아피토프가 모펩타이드에 대한 T 세포 응답을 조절하는 효과가 FⅧ 응답 조절에 연장될 수 있는지 여부를 결정하기 위해 자성 HLA-DR2 형질전환 마우스를 3×100μg 펩타이드(펩타이드 서열번호 1 또는 서열번호 17)로 처리하고 100μg의 완전한 Freund 애쥬번트를 지닌 각각의 모펩타이드(PRCLT 및 DNIMV)로 전처리시켰다. 10일 후에 림프절과 비장을 채취하고 PRCLT, DNIMV 또는 재조합 FⅧ로 시험관 내에서 자극시켰다. 그 결과는 도 6에 나타내었다. 서열번호 1의 펩타이드로의 처치는 PRCLT 펩타이드에 대한 T 세포 응답을 현격히 감소시켰으며(p<0.01) 서열번호 17 펩타이드로의 처치는 DNIMV에 대한 T 세포 응답을 현격히 감소시켰다(p<0.02).

서열번호 1의 펩타이드는 PRCLT 응답을 조절하였고 서열번호 17의 펩타이드는 DNIMV 응답을 조절하였다. 또한 FⅧ 응답의 미비한 감소가 관찰되었다. FⅧ 면역 응답에 대한 펩타이드의 효능을 향상시키기 위해서 변형된 DNIMV와 변형된 PRCLT의 조합이 다음 시험에 사용되었다.

(실시예 6) PRCLT 및 DNIMV 변형된 펩타이드의 조합의 용량 상승을 방지하기 위한 항체 생성

웅성 HLA-DR2 형질전환 마우스를 용량 상승 프로토콜에 의해 서열번호 1의 펩타이드와 서열번호 17의 펩타이드의 조합으로 처리하였다. 6개의 조합의 주입이 0.1, 1.0, 10 및 3×100μg 용량(조합 내의 각각의 펩타이드 양)으로 주입되었다.

시험동물은 1μg의 재조합 인간 FⅧ과 서열번호 1/서열번호 17 펩타이드(각각 (100μg) 조합으로 인한 동시 처리(rFⅧ 면역 후 3일째)하여 항-FⅧ 항체 생성을 FⅧ 면역 4주 및 8주(도 7a의 28일째, 도 7b의 56일째) 후에 혈액 시료로부터 분석하였다. 혈청을 직접 ELISA를 통해 적정하고 분석하였다. 면역화되지 않은 마우스의 항체 역가는 모든 경우에 음성이었으며 면역 처리된 마우스의 혈청에는 항-FⅧ 항체가 존재하는 것으로 판단되었다. 결합 비율은 1.9보다 컸으며 비율은 음성 혈청을 사용하여 계산하였다. 실험 28일째 결과를 도 7a에 나타내었으며 56일째 결과를 도 7b에 각각 나타내었다.

또한 중화 FⅧ 항체를 56일째에 측정하였다. FⅧ 중화 항체가 비색법으로 측정되었다. 즉 시료를 1 IU/ml FⅧ와 함께 혼합시킨 후 FIX, FX, 트롬빈, CaCl₂ 및 인지질의 첨가에 의해 시작되는 응고를 측정한 것이다. 인큐베이션 후에 FXa 생성량을 비색 기질 S-2760을 첨가하여 측정하였으며 OD 신호를 측정하였다. OD 신호는 시료 내의 FⅧ 활성에 비례하는 것이다. 또한 알려진 함량의 FⅧ를 지니는 시료와 중화 항체를 지니지 않은 시료를 통해 비교하였다. 시료의 % 잔여 활성을 측정하고 관련 샘플과 비교하였으며 Bethesda 유사 단위로 표시하였으며 그 결과를 도 8에 나타내었다. 서열번호 1의 펩타이드 및 서열번호 17의 펩타이드로 처리한 마우스는 PBS로 처리한 마우스보다 중화 항-FⅧ 항체의 유의적으로 매우 낮은 수준을 나타내었다.

(실시예 7) PRCLT 및 DNIMV 변형된 펩타이드의 조합의 용량 상승을 통한 생체외 T 세포 내성

웅성/자성 DR2 마우스를 서열번호 1/서열번호 17의 펩타이드 조합으로 실시예 6에 나타난 용량 상승 프로토콜 방법을 통해 처리하였다.

시험동물을 CFA에서 100μg의 PRCLT 및 100μg의 DNIMV로 전처리시켰다. 10일 후 림프절과 비장을 채취하고 재조합 인간 FⅧ로 시험관 내에서 재자극시켰다.

T 세포 응답을 증식 에세이를 통해 판단하였다(도 9). FⅧ에 대한 T 세포 응답의 현격한 저하가 FⅧ 시험의 모든 농도에서 관찰되었으며 이때 마우스는 서열번호 1 및 서열번호 17의 펩타이드의 조합으로 처리된 것이다.

(실시예 8) 치료 시험동물 모델 내에서 PRCLT 및 DNIMV 변형 펩타이드 조합의 용량 상승에 따른 중화 항체 생성 억제

HLA-DR2 형질전환 마우스를 CFA 내에서 3μg의 rFⅧ로 전처리시키고 3주 후에 서열번호 1의 펩타이드 및 서열번호 17의 펩타이드 조합으로 용량 상승 프로토콜에 의해 면역화 시켰다. 6개의 조합의 주입이 0.1, 1.0, 10 및 3×100μg 용량(조합 내의 각각의 펩타이드 양)으로 주입되었다. 대조 동물을 FⅧ DR2와 관련없는 프로스타트산 포스파타제(PAP) 133-152 펩타이드(PCT/US2006/031961호에 서열번호 15로 개시된 서열)로 동일한 용량 상승 프로토콜에 의해 처리하였다. 모든 동물은 rFⅧ 면역 5주 후 IFA에서 3μg rFⅧ로 추가 면역시키고 펩타이드 처리 마지막 라운드 4일 후에 추가면역시켰다. 중화 항체 생성을 첫 번째 FⅧ 면역 후 3주 후 펩타이드 처리 전 혈장 샘플을 통해 분석하였다. 5주 후에 FⅧ 추가면역 전 펩타이드 처리 후에도 분석하였고 이어 7주, 9주 및 13주에도 진행하였다. 혈장 샘플 내의 중화 FⅧ 항체 수준을 실시예 6에 개시된 방법으로 측정하였다.

도 10의 결과는 서열번호 1 및 서열번호 17의 펩타이드로 처리한 결과이다. FⅧ 면역화시킨 3주 후(3주)에 대조군 펩타이드 처리에 비해 현격한 중화 항-FⅧ 항체의 생성 억제가 추가 면역 후(5주)에 나타났다.

상기 명세서 내에 언급된 모든 문헌은 본원에 참고문헌으로 포함된다. 본 발명의 기재된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변동은 본 발명의 범위 및 정신에 위배됨 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정한 바람직한 실시태양과 관련하여 기재되었으나 청구된 본 발명은 이러한 특정 실시태양에 부당하게 한정되지 않아야 함이 이해되어야 한다. 실제로 분자 면역학 또는 관련 분야의 업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위해 기재된 방법의 다양한 변형은 하기 청구항의 범위 내에 존재한다.

서열번호 33

1 mqielstcff lcllrfcfsa trryylgave lswdymqsdl gelpvdarfp prvpksfpfn

61 tsvvykktlf veftdhlfni akprppwmgl lgptiqaevy dtvvitlknm ashpvslhav

121 gvsywkaseg aeyddqtsqr ekeddkvfpg gshtyvwqvl kengpmasdp lcltysylsh

181 vdlvkdlnsg ligallvcre gslakektqt lhkfillfav fdegkswhse tknslmqdrd

241 aasarawpkm htvngyvnrs lpgligchrk svywhvigmg ttpevhsifl eghtflvrnh

301 rqasleispi tfltaqtllm dlgqfllfch isshqhdgme ayvkvdscpe epqlrmknne

361 eaedydddlt dsemdvvrfd ddnspsfiqi rsvakkhpkt wvhyiaaeee dwdyaplvla

421 pddrsyksqy lnngpqrigr kykkvrfmay tdetfktrea iqhesgilgp llygevgdtl

481 liifknqasr pyniyphgit dvrplysrrl pkgvkhlkdf pilpgeifky kwtvtvedgp

541 tksdprcltr yyssfvnmer dlasgligpl licykesvdq rgnqimsdkr nvilfsvfde

601 nrswylteni qrflpnpagv qledpefqas nimhsingyv fdslqlsvcl hevaywyils

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Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser 2035 2040 2045 Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln 2050 2055 2060 Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala 2065 2070 2075 2080 Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala 2085 2090 2095 Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe 2100 2105 2110 Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly 2115 2120 2125 Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val 2130 2135 2140 Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn 2145 2150 2155 2160 Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser 2165 2170 2175 Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Trp Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser 2180 2185 2190 Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln 2195 2200 2205 Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro 2210 2215 2220 Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro 2225 2230 2235 2240 Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr 2245 2250 2255 Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr 2260 2265 2270 Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His 2275 2280 2285 Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly 2290 2295 2300 Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu 2305 2310 2315 2320 Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile 2325 2330 2335 Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr 2340 2345 2350 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr 1 5 10 15 <210> 35 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu 1 5 10 15 <210> 36 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 36 Pro Arg Cys Leu Thr 1 5 <210> 37 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 37 Asp Asn Ile Met Val 1 5 <210> 38 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified FVIII-derived peptide general formula <400> 38 Xaa Xaa Gly Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg 1 5 10 15 Pro Tyr Gly Xaa Xaa 20 <210> 39 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified FVIII-derived peptide general formula <400> 39 Xaa Xaa Gly Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn 1 5 10 15 Met Glu Gly Xaa Xaa 20 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Control peptide 4Y <400> 40 Ala Ser Gln Tyr Arg Pro Ser Gln Arg 1 5

Claims

FⅧ-유래 서열 DNIMVTFRNQASRPY를 포함하는 펩타이드에 있어서,
상기 서열은
(a) XXGDNIMVTFRNQASRPYGXX
상기 식에서 X는 라이신 또는 글루탐산; 이고
(b) 하기 서열 중 하나;
임을 특징으로 하는 펩타이드.
KKGDNIMVTFRNQASRPYGKK (서열번호 17)
KKGDNIMVTFRNQASRPYGKE (서열번호 18)
KKGDNIMVTFRNQASRPYGEK (서열번호 19)
KEGDNIMVTFRNQASRPYGKK (서열번호 25)
KEGDNIMVTFRNQASRPYGKE (서열번호 26)
KEGDNIMVTFRNQASRPYGEK (서열번호 27)
EKGDNIMVTFRNQASRPYGKK (서열번호 29)
EKGDNIMVTFRNQASRPYGKE (서열번호 30) 및
EKGDNIMVTFRNQASRPYGEK (서열번호 31).
FⅧ-유래 서열 PRCLTRYYSSFVNME를 포함하는 펩타이드에 있어서,
상기 서열은
(a) XXGPRCLTRYYSSFVNMEGXX
상기 식에서 X는 라이신 또는 글루탐산; 이고
(b) 하기 서열 중 하나;
임을 특징으로 하는 펩타이드.
KKGPRCLTRYYSSFVNMEGKK (서열번호 1)
KKGPRCLTRYYSSFVNMEGKE (서열번호 2)
KKGPRCLTRYYSSFVNMEGEK (서열번호 3)
EEGPRCLTRYYSSFVNMEGKK (서열번호 5)
EEGPRCLTRYYSSFVNMEGEK (서열번호 7)
KEGPRCLTRYYSSFVNMEGKK (서열번호 9)
KEGPRCLTRYYSSFVNMEGKE (서열번호 10)
KEGPRCLTRYYSSFVNMEGEK (서열번호 11) 및
EKGPRCLTRYYSSFVNMEGKK (서열번호 13).
제 1항 또는 제 2항의 하나 또는 그 이상의 펩타이드를 포함하는 다수의 펩타이드로 이루어진 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 조성물은 제 1항의 펩타이드 중 적어도 하나와 제 2항의 펩타이드 중 적어도 하나를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 1의 펩타이드와 서열번호 17의 펩타이드를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
생체 내에서 인자 Ⅷ 저해 항체 생성을 억제하거나 방지하기 위한 용도로서 제 1항 또는 제 2항의 펩타이드 또는 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 조성물.
생체 내에서 인자 Ⅷ 저해 항체 생성을 억제하거나 방지하기 위한 의약품 제조를 위한 제 1항 또는 제 2항의 펩타이드 또는 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 조성물.
피험자에게 인자 Ⅷ 저해 항체 생성을 억제하거나 방지하기 위한 방법에 있어서, 제 1항 또는 제 2항의 펩타이드 또는 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 조성물의 투여 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
피험자에게 혈우병을 치료하기 위한 방법에 있어서, 제 1항 또는 제 2항의 펩타이드 또는 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 조성물의 투여 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 8항 또는 제 9항에 있어서, 상기 피험자는 혈우병 A를 지니고 인자 Ⅷ 대체 요법 및/또는 FⅧ 바이패싱 요법을 진행하거나 진행 예정임을 특징으로 하는 방법.
제 8항 또는 제 9항에 있어서, 피험자는 후천성 혈우병을 지니거나 발병 위험이 있음을 특징으로 하는 방법.
제 8항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 피험자는 HLA-DR2임을 특징으로 하는 방법.