KR20150073711A

KR20150073711A - Composition for Anti-imflammation Using an Extract of Immature Fruits of Litsea japonica or Compounds Isolated Therefrom

Info

Publication number: KR20150073711A
Application number: KR1020130161707A
Authority: KR
Inventors: 윤원종; 정용환; 박수영; 함영민; 오대주; 윤선아; 송상목
Original assignee: 재단법인 제주테크노파크
Priority date: 2013-12-23
Filing date: 2013-12-23
Publication date: 2015-07-01
Also published as: KR101616011B1

Abstract

The present invention relates to an anti-inflammatory composition using an extract of an immature fruit of Litsea japonica or a compound separated therefrom and, specifically, to an anti-inflammatory composition using an extract of an immature fruit of Litsea japonica having inhibiting activation of NO generation, inhibiting activation of PGE2 generation, and inhibiting activation of generation of inflammatory cytokines, and a compound separated therefrom such as Litsenolide B2 and Litsenolide C2.

Description

TECHNICAL FIELD The present invention relates to an anti-inflammatory composition using an extract or a compound isolated therefrom. More particularly, the present invention relates to an anti-

본 발명은 까마귀쪽나무(Litsea japonica) 미성숙과 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 이용한 항염증용 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for the production of < RTI ID = 0.0 & japonica ) immature and an extract or a compound isolated therefrom.

염증은 외부의 물리·화학적 자극, 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염에 대한 생체의 방어 반응이다. Inflammation is the defensive response of a living body to external infectious agents such as external physical and chemical stimuli, bacteria, fungi, viruses and allergens.

염증 반응은 선천성 면역 반응의 일부이며, 다른 동물에서처럼 인간의 선천성 면역 반응은 대식세포가 병원체에 특이적으로 존재하는 세포 표면의 패턴을 통해 비자기(non-self)로 인식하고 공격함으로써 시작된다. 염증 반응 시에는 염증 부위에 혈장이 축적되어 세균이 분비한 독성을 희석시키며, 혈류가 증가하고, 홍반, 통증, 부종, 발열 등의 증상이 수반되게 된다.The inflammatory response is part of the innate immune response, and as in other animals, the innate immune response of humans begins by recognizing and attacking macrophages as non-self through a pattern of cell surfaces that are specific to the pathogen. During the inflammation reaction, plasma accumulates on the inflamed area, diluting the toxicities secreted by the bacteria, increasing the blood flow, and accompanied by symptoms such as erythema, pain, edema, and fever.

이러한 염증 반응에는 다양한 생화학적 현상이 관여하는데, 특히 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase, NOS)와 다양한 프로스타글란딘(prostaglandins)의 생합성과 관련되는 사이클로옥시제나제(cyclooxygenase, COX)가 염증 반응의 중요한 매개체로 알려져 있다. These inflammatory reactions involve a variety of biochemical events, in particular, cyclooxygenase (COX), which is associated with the nitric oxide synthase (NOS) and the biosynthesis of various prostaglandins, .

NOS는 세 가지 이성질체가 존재하는데, 칼슘이나 카모듈린 의존성인 eNOS(내피성 NOS)와 nNOS(신경성 NOS), 그리고 LPS(lipopolysaccharide)와 같은 세균의 내독소나 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-12과 같은 여러 염증성 사이토카인에 의해 유도되는 iNOS(유도성 NOS)가 있으며, L-아르기닌(L-arginine)으로부터 산화질소(NO)를 생성한다. There are three isomers of NOS: endotoxin of bacteria such as calcium or camodanol-dependent eNOS (endothelial NOS), nNOS (neurotic NOS), and lipopolysaccharide (IL-1β, TNF-α, IL There are iNOS (inducible NOS) induced by various inflammatory cytokines such as IL-6, IL-8 and IL-12 and produce NO from L-arginine.

eNOS나 nNOS에 의해 생성되는 NO는 혈압 조절 작용, 신경 전달 작용, 학습, 기억 등과 관련된 다양한 생리 반응을 수행함으로써 인체의 항상성 유지에 중요한 역할을 하지만, iNOS에 의해 생성되는 NO는 관절염, 패혈증, 조직이식거부반응, 자가면역질환, 신경세포의 사멸 등 다양한 염증성 질환에 관여하는 것으로 알려져 있다(Moncade S. et al, Pharmacol. Rev., 1991, 43, 109; Nature Medicine, 2001, 7, 1138; Mu, M. M., J. Endotoxic Res. 7, p341, 2001).NO produced by eNOS or nNOS plays an important role in maintenance of homeostasis by performing various physiological responses related to blood pressure control, neurotransmission, learning, memory, etc. However, NO produced by iNOS is associated with arthritis, sepsis, (Moncade S. et al, Pharmacol. Rev., 1991, 43, 109, Nature Medicine, 2001, 7, 1138; Mu, S., et al., Immunoprecipitation, , MM, J. Endotoxic Res. 7, p341, 2001).

COX 효소는 COX의 기능과 함께 하이드로퍼옥시다제(hydroperoxidase, HOX) 활성을 가지고 아라키돈산으로부터 중간체인 PGG₂와 PGH₂를 합성하며, 이들 화합물로 PGE₂, PGF₂, PGD₂, 프로스타시클린 및 트롬복신A₂(thromboxane A2, TxA2)를 만든다. COX의 기능 중 PGH 합성효소의 기능은 PGE₂의 합성을 통해 통증과 염증 반응에 관여한다. The COX enzyme synthesizes PGG ₂ and PGH ₂ from arachidonic acid with hydroperoxidase (HOX) activity together with the function of COX. These compounds include PGE ₂ , PGF ₂ , PGD ₂ , prostacyclin and create a duplex thromboxane _{a 2 (thromboxane A2, TxA2)} . Among the functions of COX, the function of PGH synthase is involved in the pain and inflammation reaction through synthesis of PGE ₂ .

COX에는 두 가지 아형이 있고 COX-1은 대부분의 조직에 항시 발현되는데 비해, COX-2는 염증성 사이토카인에 의해 신속히 발현이 유도되어 염증 반응에서 중요한 역할을 한다. There are two subtypes of COX and COX-1 is always expressed in most tissues, whereas COX-2 is rapidly induced by inflammatory cytokines and plays an important role in the inflammatory response.

따라서 NO, PGE₂,염증성 사이토카인 등의 억제제나 iNOS 억제제 그리고 COX-2 억제제는 염증질환 치료제로서 활용될 수 있다.Therefore, NO, PGE ₂ , Inhibitors such as inflammatory cytokines, iNOS inhibitors and COX-2 inhibitors may be used as therapeutic agents for inflammatory diseases.

본 발명은 NO 생성 억제 활성, PGE₂의 생성 억제 활성 및 염증성 사이토카인의 생성 억제 활성을 가지는 까마귀쪽나무 미성숙과 추출물 및 이로부터 분리된 화합물인 리트세놀라이드 B2(Litsenolide B2) 및 리트세놀라이드 C2(Litsenolide C2)을 개시한다.
The present invention relates to a method for inhibiting the production of NO, a compound for inhibiting the production of PGE ₂ , and a method for inhibiting the production of inflammatory cytokines, Id C2 (Litsenolide C2).

본 발명의 목적은 까마귀쪽나무 미성숙과 추출물 또는 그로부터 분리된 화합물을 이용한 항염증용 조성물을 제공하는 데 있다.It is an object of the present invention to provide a composition for anti-inflammation using a crude immature mouse and an extract or a compound isolated therefrom.

본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.
Other and further objects of the present invention will be described below.

본 발명자들은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 까마귀쪽나무 미성숙과 70% 에탄올 추출물이 성숙과 70% 에탄올 추출물에 비하여 NO 생성 억제 활성, PGE₂, 생성 억제 활성, 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β 및 IL-6) 생성 억제 활성, iNOS 및 COX-2 생성 억제 활성에 있어서 뚜렷하게 높음을 확인하였으며, 까마귀쪽나무 미성숙과 70% 에탄올 추출물로부터 분리된 화합물인 리트세놀라이드 B2(Litsenolide B2) 및 리트세놀라이드 C2(Litsenolide C2)가 또한 항염증 활성을 가짐을 확인하였다.As shown in the following examples and experimental examples, the inventors of the present invention found that the immature and 70% ethanol extracts of crows were maturing and inhibiting NO production, PGE ₂ production inhibitory activity, and inflammatory cytokines TNF-α, IL-1β, and IL-6), iNOS and COX-2 production inhibitory activity were significantly higher than that of the wild-type mice B2 (Litsenolide B2) and Ritenolide C2 (Litsenolide C2) also have anti-inflammatory activity.

본 발명은 이러한 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로, 본 발명의 항염증용 조성물은 까마귀쪽나무 미성숙과 추출물, 아래의 [화학식 1]의 리트세놀라이드 B2 또는 아래의 [화학식 2]의 리트세놀라이드 C2를 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.The present invention provides a composition for anti-inflammation of the present invention, which is provided on the basis of these experimental results, wherein the composition for preventing inflammation according to the present invention is an extract of Roche tree, a rithenolide B2 of the following formula 1, And an onionide C2 as an active ingredient.

[화학식 1][Chemical Formula 1]

[화학식 2](2)

본 명세서에서, "추출물"이란 추출 대상을 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 메틸렌클로라이드, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 조추출물과 그 조추출물을 상기 열거한 용매 중 하나 이상으로 분획하여 얻어진 분획물을 의미하며, 이산화탄소, 펜탄 등의 초임계 유체를 사용하여 얻어진 추출물을 포함하는 의미이다. 추출 방법은 활성물질의 추출 정도, 보존 정도를 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사, 초임계 추출 등 임의의 방식을 적용할 수 있다. 분획된 추출물의 경우 상기 조추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합·정치시켜 얻은 분획물과, 상기 용매들을 극성이 증가 또는 감소하는 순으로 사용하여 상기 조추출물을 순차적으로 분획하여 얻어진 분획물을 포함한다. 또한 상기 추출물의 의미에는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 추출 용매가 제거된 농축된 액상 또는 고형상의 추출물이 포함된다. 바람직하게는 추출용매로서 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물, 더 바람직하게는 추출용매로서 물과 에탄올의 혼합 용매(특히 70% 에탄올)를 사용하여 얻어진 추출물과, 그 추출물에서 추출용매를 제거하여 얻은 고형상의 추출물을 물에 현탁하고 이를 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하였을 때 얻어지는 각층의 분획물을 의미한다. 특히 그 분획물 중에서도 아래의 실시예가 보여주듯이 상기 [화학식 1]의 리트세놀라이드 B2 또는 상기 [화학식 2]의 리트세놀라이드 C2가 분리된 디클로로메탄 분획물을 의미한다. 여기서 '순차적으로 분획한다'는 의미는 분획 후의 잔여 물층을 계속적으로 사용하여 상기 열거된 순서대로의 분획 용매로 분획한다는 의미이다.As used herein, the term "extract" refers to a substance which is extracted with water, a lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms such as methanol, ethanol, and butanol, methylene chloride, ethylene, acetone, hexane, ether, chloroform, ethyl acetate, butyl acetate, The crude extract obtained by using dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (DMSO), 1,3-butylene glycol, propylene glycol or a mixed solvent thereof and the crude extract thereof are fractionated into one or more of the above-listed solvents And means an extract obtained by using a supercritical fluid such as carbon dioxide, pentane, or the like. For the extraction method, any method such as cold-rolling, refluxing, heating, ultrasonic irradiation, supercritical extraction, etc. can be applied in consideration of the degree of extraction and the degree of preservation of the active substance. In the case of the fractionated extract, fractions obtained by suspending the crude extract in a specific solvent and mixing and leaving with a solvent having a different polarity, and fractions obtained by successively fractionating the crude extract using the solvents in the order of increasing or decreasing polarity Fractions. Also, the meaning of the extract includes concentrated liquid or solid extract from which the extraction solvent has been removed by freeze drying, vacuum drying, hot air drying, spray drying and the like. Preferably, an extract obtained by using water, ethanol or a mixed solvent thereof as an extraction solvent, more preferably an extract obtained by using a mixed solvent of water and ethanol (in particular, 70% ethanol) as an extraction solvent, Means a fraction of each layer obtained by suspending the solid form of the extract obtained by removing the solvent and then sequentially fractionating it with hexane, dichloromethane, ethyl acetate and butanol. Particularly, among the fractions, the dichloromethane fraction in which Rietecanolide B2 of the above formula (1) or Rietecanolide C2 of the above formula (2) is isolated as shown in the following examples. Here, 'sequential fractionation' means that the residue layer after fractionation is continuously used to fractionate into fraction solvents in the order listed above.

또 본 명세서에서, "까마귀쪽나무 미성숙과"란 그 열매 표면 전체가 초록색 상태의 열매를 의미한다. 참고로 "까마귀쪽나무 성숙과"란 그 열매 표면 전체가 자주색 또는 짙은 자주색 상태의 열매를 의미한다.In the present specification, the term " rice immature tree " means fruit having a green color in its entire surface. For reference, "the maturation of the tree in the crow" means that the whole surface of the fruit is purple or dark purple.

또 본 명세서에서, 상기 "유효성분"의 의미는 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.In the present specification, the above-mentioned "active ingredient" means an ingredient that exhibits the desired activity alone or can exhibit activity together with a carrier that is itself inactive.

또 본 명세서에서, "항염증"은 아래에서 정의되는 염증성 질환의 개선, 치료, 그러한 질환의 발병 억제 또는 지연을 포함하는 의미이다.As used herein, "anti-inflammatory" is meant to include the improvement, treatment, inhibition or delay of the onset of an inflammatory disease as defined below.

또 본 명세서에서, 상기 "염증성 질환"이란 외부의 물리·화학적 자극 또는 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염에 대한 국부적 또는 전신적 생체 방어 반응으로 특정되는 어떠한 상태로서 정의될 있다. 이러한 반응은 각종 염증 매개 인자와 면역세포와 관련된 효소(예컨대 iNOS, COX-2 등)의 활성화, 염증 매개 물질의 분비(예컨대, NO, TNF-α, IL-6, IL-1β, PGE₂의 분비), 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등의 일련의 복합적인 생리적 반응을 수반하며, 홍반, 통증, 부종, 발열, 신체의 특정 기능의 저하 또는 상실 등의 증상에 의해 외적으로 나타난다. 상기 염증성 질환은 급성, 만성, 궤양성, 알레르기성 또는 괴사성을 띨 수 있으므로, 어떠한 질환이 상기와 같은 염증성 질환의 정의에 포함되는 한 그것이 급성이든지, 만성이든지, 궤양성이든지, 알레르기성이든지 또는 괴사성이든지를 불문한다. 구체적으로 상기 염증성 질환에는 천식, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두퐁, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염(예컨대, C형 감염), 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 관절염, 류머티스성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 피부염(아토피성 피부염 포함), 습진, 다발성 경화증 등이 포함될 것이다. In the present specification, the above-mentioned "inflammatory disease" is defined as any state specified by a local or systemic bio-defense reaction against external physical or chemical stimulation or infection of an external infectious agent such as bacteria, fungi, viruses, . This response is secretion of activated, inflammatory mediators of the enzyme (for example, iNOS, COX-2, and so on) associated with various inflammatory mediators and the immune cells (e. G., NO, of TNF-α, IL-6, IL-1β, PGE 2 Secretion), body fluid infiltration, cell migration, tissue destruction, and is externally manifested by symptoms such as erythema, pain, edema, fever, loss or loss of specific function of the body. The inflammatory disease may be acute, chronic, ulcerative, allergic or necrotic, so long as it is included in the definition of inflammatory diseases as above, it may be acute, chronic, ulcerative, allergic, Whether it is necrotic or not. Specifically, the inflammatory diseases include asthma, allergic and non-allergic rhinitis, chronic and acute rhinitis, chronic and acute gastritis or enteritis, ulcerative gastritis, acute and chronic nephritis, acute and chronic hepatitis, chronic obstructive pulmonary disease, Inflammatory bowel syndrome, inflammatory pain, migraine headache, headache, back pain, fibromyalgia, fascia disease, viral infection (e.g., C type infection), bacterial infection, fungal infection, burn, wound due to surgical or dental surgery, Rheumatoid arthritis, ankylosing spondylitis, Hodgkin's disease, pancreatitis, conjunctivitis, iritis, scleritis, uveitis, dermatitis (including atopic dermatitis), eczema, multiple sclerosis, etc. Will be included.

본 발명의 조성물은 그 유효성분을 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 치료를 의도하는 염증성 질환의 개선 활성을 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게서, 염증성 질환의 개선, 치료, 또는 이러한 병리적 증상의 발병 억제/지연을 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.The composition of the present invention may be contained in any amount (effective amount) as long as it can exhibit the improving activity of an inflammatory disease intended for treatment depending on the purpose of use, formulation, blending purpose and the like. By weight based on the total weight of the composition. The term "effective amount" as used herein refers to the amount of active ingredient capable of inducing the improvement, treatment, or inhibition / delay of the onset of such pathological conditions in a mammal, preferably a human, to which it is applied. Such effective amounts can be determined experimentally within the ordinary skill of those skilled in the art.

본 발명의 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다.The subject to which the composition of the present invention can be applied (prescription) is preferably a mammal and a person, particularly a human.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.The composition of the present invention can be used as a pharmaceutical composition in a specific embodiment.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 유효성분을 포함하는 이외에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등을 포함하여, 경구용 제형(정제, 현탁액, 과립, 에멀젼, 캡슐, 시럽 등), 비경구형 제형(멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액), 국소형 제형(용액, 크림, 연고, 겔, 로션, 패치) 등으로 제조될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be in the form of oral dosage forms (tablets, suspensions, granules, emulsions, capsules, syrups, etc.), parenteral formulations (including sterile injectable preparations (E.g., aqueous or oily suspensions in the form of injectable solutions), and small formulations (solutions, creams, ointments, gels, lotions, patches).

상기에서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응가능한 이상의 독성(충분히 낮은 독성)을 지니지 않는다 의미이다.The term "pharmaceutically acceptable" as used herein means that the application (prescribing) subject does not have the above-mentioned toxicity (sufficiently low toxicity) without inhibiting the activity of the active ingredient.

약제학적으로 허용되는 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 전분(예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 등), 셀룰로오스, 그것의 유도체(예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 등) 맥아, 젤라틴, 탈크, 고체 윤활제(예컨대 스테아르산, 스테아르산 마그네슘 등), 황산 칼슘, 식물성 기름(예컨대 땅콩 기름, 면실유, 참기름, 올리브유 등), 폴리올(예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린 등), 알긴산, 유화제(예컨대 TWEENS), 습윤제(예컨대 라우릴 황산 나트륨), 착색제, 풍미제, 정제화제, 안정화제, 항산화제, 보존제, 물, 식염수, 인산염 완충 용액 등을 들 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적당한 것을 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다.Examples of pharmaceutically acceptable carriers include lactose, glucose, sucrose, starch (e.g. corn starch, potato starch, etc.), cellulose, derivatives thereof (e.g. sodium carboxymethylcellulose, ethylcellulose, etc.) malt, gelatin, talc, (E.g., peanut oil, cottonseed oil, sesame oil, olive oil, etc.), polyol (e.g., propylene glycol, glycerin and the like), alginic acid, emulsifiers (e.g., TWEENS), humectants Such as sodium lauryl sulfate, a coloring agent, a flavoring agent, a tableting agent, a stabilizer, an antioxidant, a preservative, water, a saline solution, and a phosphate buffer solution. The carrier may be selected from one or more of suitable pharmaceutical formulations according to the formulation of the pharmaceutical composition of the present invention.

부형제도 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적합한 것을 선택하여 사용할 수 있는데, 예컨대 본 발명의 약제학적 조성물이 수성 현탁제로 제조될 경우에 적합한 부형제로서는 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 히드로프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제나 분산제 등을 들 수 있다. 주사액으로 제조되는 경우 적합한 부형제로서는 링거액, 등장 염화나트륨 등을 들 수 있다.The excipient may be selected according to the formulation of the pharmaceutical composition of the present invention. For example, when the pharmaceutical composition of the present invention is prepared by an aqueous suspension, suitable excipients include sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydropropylmethylcellulose , Sodium alginate, polyvinylpyrrolidone, and the like. Suitable excipients when prepared from injection solutions include Ringer's solution, isotonic sodium chloride, and the like.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있고, 아토피성 피부염 조성물처럼 경우에 따라서는 국소적으로 투여될 수 있다.The pharmaceutical compositions of the present invention may be administered orally or parenterally and may be administered topically, as the case may be, such as an atopic dermatitis composition.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 1일 투여량이 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다. The daily dose of the pharmaceutical composition of the present invention is usually 0.001 to 150 mg / kg body weight, and may be administered once or several times. However, since the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is determined in view of various related factors such as route of administration, age, sex, weight, and patient's severity of the patient, the dose is limited in any aspect to the scope of the present invention Should not be understood to be.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로 파악할 수 있다. In a specific embodiment, the composition of the present invention can be identified as a food composition.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등이 포함될 수 있다.The food composition of the present invention may contain sweetening agents, flavoring agents, physiologically active ingredients, minerals and the like in addition to the active ingredients thereof.

감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다. Sweetening agents may be used in an amount that sweetens the food in a suitable manner, and may be natural or synthetic. Preferably, natural sweeteners are used. Examples of natural sweeteners include sugar sweeteners such as corn syrup solids, honey, sucrose, fructose, lactose and maltose.

풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다. Flavors may be used to enhance taste or flavor, both natural and synthetic. Preferably, a natural one is used. When using natural ones, the purpose of nutritional fortification can be performed in addition to the flavor. Examples of natural flavoring agents include those obtained from apples, lemons, citrus fruits, grapes, strawberries, peaches, and the like, or those obtained from green tea leaves, Asiatica, Daegu, Cinnamon, Chrysanthemum leaves and Jasmine. Also, those obtained from ginseng (red ginseng), bamboo shoots, aloe vera, banks and the like can be used. The natural flavoring agent may be a liquid concentrate or a solid form of extract. Synthetic flavors may be used depending on the case, and synthetic flavors such as esters, alcohols, aldehydes, terpenes and the like may be used.

생리 활성 물질로서는 카테킨, 에피카테킨, 갈로가테킨, 에피갈로카테킨 등의 카테킨류나, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤, 칼시페롤, 티아민, 리보플라빈 등의 비타민류 등이 사용될 수 있다.Examples of the physiologically active substance include catechins such as catechin, epicatechin, gallocatechin and epigallocatechin, and vitamins such as retinol, ascorbic acid, tocopherol, calciferol, thiamine and riboflavin.

미네랄로서는 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물, 게르마늄, 요오드, 철, 리튬, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 인, 칼륨, 셀레늄, 규소, 나트륨, 황, 바나듐, 아연 등이 사용될 수 있다.As the mineral, calcium, magnesium, chromium, cobalt, copper, fluoride, germanium, iodine, iron, lithium, magnesium, manganese, molybdenum, phosphorus, potassium, selenium, silicon, sodium, sulfur, vanadium and zinc can be used.

또한 본 발명의 식품 조성물은 상기 감미제 등 이외에도 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다. In addition, the food composition of the present invention may contain preservatives, emulsifiers, acidifiers, thickeners and the like as needed in addition to the above sweeteners.

이러한 보존제, 유화제 등은 그것이 첨가되는 용도를 달성할 수 있는 한 극미량으로 첨가되어 사용되는 것이 바람직하다. 극미량이란 수치적으로 표현할 때 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0005중량％ 내지 약 0.5중량％ 범위를 의미한다.Such preservatives, emulsifiers and the like are preferably added in a very small amount as long as they can attain an application to which they are added. The term " trace amount " means, when expressed numerically, in the range of 0.0005% by weight to about 0.5% by weight based on the total weight of the food composition.

사용될 수 있는 보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등을 들 수 있다. Examples of the preservative which can be used include calcium sodium sorbate, sodium sorbate, potassium sorbate, calcium benzoate, sodium benzoate, potassium benzoate and EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid).

사용될 수 있는 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있다.Examples of the emulsifier which can be used include acacia gum, carboxymethyl cellulose, xanthan gum, pectin and the like.

사용될 수 있는 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등을 들 수 있다. 이러한 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.Examples of the acidulant that can be used include acid, malic acid, fumaric acid, adipic acid, phosphoric acid, gluconic acid, tartaric acid, ascorbic acid, acetic acid, and phosphoric acid. Such an acidulant may be added so that the food composition has a proper acidity for the purpose of inhibiting the growth of microorganisms other than the purpose of enhancing the taste.

사용될 수 있는 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등을 들 수 있다. Agents that may be used include suspending agents, sedimentation agents, gel formers, bulking agents and the like.

또한 향미나 기호성을 향상시키고 다른 기능성을 추가하기 위하여 한약재가 추가될 수 있는데, 추가될 수 있는 한약재로서는 두충 추출물, 속단 추출물, 녹용 추출물, 홍화인 추출물, 토사자 추출물, 숙지황 추출물, 별갑 추출물, 산수유 추출물, 구기자 추출물, 감초 추출물, 당귀 추출물, 갈근 추출물, 강진향 추출물, 합환피 추출물, 산두근 추출물, 괴화 추출물, 고삼 추출물 등이 예시될 수 있다.In addition, herbal medicines may be added to improve flavor and palatability and to add other functionalities. Examples of medicinal herbs that can be added include mulberry extract, early-stage extract, antler extract, safflower extract, tosaja extract, , Gugija extract, licorice extract, Angelica gigantosa extract, Puerariae Radix extract, Gangjin extract, Manganese extract, Mountain beet root extract, Bulgogi extract, Radix extract.

본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 화장품 조성물로 파악할 수 있다.In another aspect, the present invention can be identified as a cosmetic composition.

본 발명의 조성물이 화장품 조성물로서 파악될 경우, 그 화장품 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩 또는 분말 등의 제형으로 제조될 수 있다.When the composition of the present invention is recognized as a cosmetic composition, the cosmetic composition may be prepared in various forms, for example, as a solution, suspension, emulsion, paste, gel, cream, lotion, powder, soap, , Oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation, spray, and the like, but is not limited thereto. It is preferably formulated into emulsions, lotions, creams (water-in-oil type, water-in-water type, multiphase), solutions, suspensions (anhydrous and aquatic), anhydrous products (oil and glycol), gels, masks, packs or powders .

본 발명의 조성물은 그 유효성분 이외에 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. The composition of the present invention may contain an acceptable carrier in cosmetic preparations in addition to its active ingredients.

여기서 "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 독성 이상의 독성이 없는 것을 말한다.As used herein, the term " acceptable carrier for a cosmetic preparation "refers to a compound or composition which is already known and used in the cosmetic preparation, or which is a compound or composition to be developed in the future, and which is not toxic to the human body.

상기 담체는 본 발명의 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 50 중량% 내지 약 99 중량 %로 포함될 수 있다. The carrier may be included in the composition of the present invention in an amount of from about 1% by weight to about 99.99% by weight, preferably from about 50% by weight to about 99% by weight of the composition, based on the total weight thereof.

그러나 상기 비율은 화장품의 전술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴이나 손)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다. However, since the ratio depends on the above-mentioned formulation of the cosmetic product and its specific application site (face or hands) or the desired amount of application thereof, the ratio is to limit the scope of the present invention in any aspect It should not be.

한편, 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. Examples of the carrier include alcohols, oils, surfactants, fatty acids, silicone oils, humectants, moisturizers, viscosifiers, emulsifiers, stabilizers, sunscreens, coloring agents and perfumes.

상기 담체로서 사용될 수 있는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.
The compounds / compositions which can be used as the carrier and which can be used as alcohols, oils, surfactants, fatty acids, silicone oils, wetting agents, moisturizers, viscosifiers, emulsions, stabilizers, sunscreens, A person skilled in the art can select and use appropriate substances / compositions.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 까마귀쪽나무 미성숙과 추출물을 이용한 항염증용 조성물을 제공할 수 있다.As described above, according to the present invention, it is possible to provide a composition for anti-inflammation using an immature tree and an extract of crows.

본 발명의 항염증용 조성물은 약품이나 식품 또는 화장품으로 제품화될 수 있다.
The anti-inflammatory composition of the present invention can be commercialized as a medicine, a food or a cosmetic.

도 1은 까마귀쪽나무 미성숙과 추출물로부터 Litsenolide B2 및 Litsenolide C2를 분리하는 과정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 2는 Litsenolide B2의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 3은 Litsenolide B2의 13C-NMR 스펙트럼이다.
도 4는 Litsenolide C2의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 5는 Litsenolide C2의 13C-NMR 스펙트럼이다.
도 6 및 7은 까마귀쪽나무 미성숙과 추출물과 성숙과 추출물 그리고 Litsenolide B2 및 Litsenolide C2의 NO 생성 억제 활성에 대한 결과이다.
도 8 및 9는 까마귀쪽나무 미성숙과 추출물과 성숙과 추출물 그리고 Litsenolide B2 및 Litsenolide C2의 PGE₂ 생성 억제 활성에 대한 결과이다.
도 10 내지 15는 까마귀쪽나무 미성숙과 추출물과 성숙과 추출물 그리고 Litsenolide B2 및 Litsenolide C2의 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β 및 IL-6) 생성 억제 활성에 대한 결과이다.
도 16은 까마귀쪽나무 미성숙과 추출물과 성숙과 추출물의 iNOS 및 COX-2의 발현 억제 활성에 대한 결과이다.FIG. 1 is a schematic diagram showing the process of separating Litsenolide B2 and Litsenolide C2 from the immature and extracellular tree of crows.
2 is a 1 H-NMR spectrum of Litsenolide B2.
3 is a 13 C-NMR spectrum of Litsenolide B2.
4 is a 1 H-NMR spectrum of Litsenolide C2.
5 is a 13 C-NMR spectrum of Litsenolide C2.
Figs. 6 and 7 show the results of inhibiting the NO production of L. chinensis, extracts, maturation and extract, and Litsenolide B2 and Litsenolide C2.
FIGS. 8 and 9 show the results of inhibiting the PGE ₂ production of Litsenolide B2 and Litsenolide C2 in extracts, matured and extracts, and in the immature tree of crows.
FIGS. 10 to 15 are the results of inhibiting the activity of raptor-seeded woody mildew, extracts, maturation and extracts, and inflammatory cytokines (TNF-α, IL-1β and IL-6) production of Litsenolide B2 and Litsenolide C2.
FIG. 16 shows the results of inhibiting the expression of iNOS and COX-2 in extracts and mature extracts from the immature tree of the crows.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described with reference to Examples and Experimental Examples. However, the scope of the present invention is not limited to these examples and experimental examples.

<< 실시예Example > > 까마귀쪽나무 미성숙과 추출물의 제조 및 그로부터 Production of rice immature and extracts from crows LitsenolideLitsenolide B2 및 B2 and LitsenolideLitsenolide C2C2 의 분리 및 동정Isolation and identification

<실시예 1> 까마귀쪽나무 미성숙과 및 성숙과 추출물의 제조 <Example 1> Preparation of immature and maturity extracts from the crows

제주도 일대의 국내산 까마귀쪽나무 미성숙과(열매 전체의 표면색이 초록색임)를 입수하여 건조시키고, 그 건조된 까마귀쪽 미성숙과 1 kg을 에탄올 70% 10 ~ 20L로 실온에서 2~5회 반복 추출하고 여과한 후 그 여과액을 감압농축하고 동결건조하여 고형상의 미성숙과 추출물을 얻었다.It was dried and obtained 1 kg of the dry crows were extracted with 10 ~ 20L of ethanol at 2 ~ 5 times repeatedly at room temperature. After filtration, the filtrate was concentrated under reduced pressure and lyophilized to obtain a solid immature and extrudate.

까마귀쪽나무 성숙과(열매 전체의 표면색이 짙은 자주색임) 추출물도 상기와 동일한 방식으로 제조하여 아래의 실험에 사용하였다.The ripening of the crow tree and the purple color of the whole fruit were also prepared in the same manner as described above and used in the following experiments.

<실시예 2> 까마귀쪽나무 미성숙과 추출물로부터의 Litsenolide B2 및 Litsenolide C2 의 분리 및 동정 Example 2 Isolation and Identification of Litsenolide B2 and Litsenolide C2 from Immature and Extracted Tree of Crows

상기 <실시예 1>에서 얻어진 미성숙과 고형상의 추출물 50g을 증류수 2L에 현탁한 후, 각각 동량의 노르말 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 노르말 부탄올로 순차적으로 분획한 다음, 감압 농축하여 디클로로메탄 분획물을 얻었다. 디클로로메탄 분획물에 대하여, 셀라이트(Celite545)가 충진된 Glass Column(5 × 50 cm)에서 컬럼 크로마토그래피(이동상: 노르말 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 메탄올)를 수행하여 4개의 분획으로 나누었다. 다음 각각의 얻어진 분획 중 항염 활성이 우수한 노르말 헥산 분획을 농축하여 완전 건조 후 실리카겔(silica gel)이 충진된 Glass Column(10 ×3 cm)에서 VLC(Vacuum liquid chromatography)(이동상: 노르말 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 메탄올; 이동상 이동속도 = 60mL/min)를 실시하여 총 18개의 분획으로 나누었다. 그 중 항염 활성이 우수한 14번에 대하여 역상실리카겔크로마토그래피(40×2.5cm, 20~40um, 이동상 속도 = 3ml/min)를 실시하여 20%~100 MeOH 농도 구배에 의하여 9개의 분획을 얻어 화합물 1(5번 분획)과 화합물 2(7번 분획)를 분리하였으며(도 1 참조), NMR을 이용하여 구조를 동정하였다.50 g of the immature and solid form of the extract obtained in Example 1 was suspended in 2 L of distilled water and sequentially fractionated with an equal amount of normal hexane, dichloromethane, ethyl acetate and normal butanol, and then concentrated under reduced pressure to give a dichloromethane fraction &Lt; / RTI > The dichloromethane fractions were separated into four fractions by column chromatography (mobile phase: n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate, methanol) on a glass column (5 x 50 cm) packed with Celite 545. Next, the normal hexane fraction having excellent anti-inflammatory activity was concentrated and dried in a glass column (10 x 3 cm) packed with silica gel and vacuum liquid chromatography (mobile phase: n-hexane, dichloromethane , Ethyl acetate, methanol; mobile phase transfer rate = 60 mL / min) to obtain a total of 18 fractions. 9 fractions were obtained by reverse phase silica gel chromatography (40 × 2.5 cm, 20 to 40 μm, mobile phase velocity = 3 ml / min) with a gradient of 20% to 100 MeOH to obtain compound No. 1 (Fraction 5) and compound 2 (fraction 7) were separated (see FIG. 1), and the structure was identified using NMR.

화합물 1에 대한 NMR 구조 동정 결과는 다음과 같다: 무색, 오일상; ₁H-NMR (500MHz, CDCl₃) : 4.49 (1H, br m, H-3), 4.48 (1H, qd, J =2.6, 8.3 Hz, H-4), 1.31 (3H, d, J =8.3 Hz, H-5), 6.95 (1H, td, J =2.0, 10.3Hz H-6), 2.40 (2H, m, H-7), 1.50(2H, m, H-8), 1.26 (10H, br s, H-9-13), 1.51 (2H, m, H-14), 2.16 (2H, td, J =3.1, 8.8 Hz, H-15), 1.91 (1H, t, J =3.1 Hz H-17), ₁₃C-NMR (125 MHz, CDCl₃) 170.0 (C-1), 129.4 (C-2), 72.3 (C-3), 82.9 (C-4), 19.8 (C-5), 148.9 (C-6), 29.8 (C-7), 28.6 (C-8), 29.5 (C-9-14), 29.4 (C-9-14)), 29.2 (C-9-14), 28.8 (C-9-14), 18.5 (C-15), 84.9 (C-16), 68.3 (C-17)The NMR structure identification results for Compound 1 are as follows: colorless, oily phase; _{1 H-NMR (500MHz, CDCl} 3): 4.49 (1H, br m, H-3), 4.48 (1H, qd, J = 2.6, 8.3 Hz, H-4), 1.31 (3H, d, J = 8.3 Hz, H -5), 6.95 (1H, td, J = 2.0, 10.3Hz H-6), 2.40 (2H, m, H-7), 1.50 (2H, m, H-8) , 1.26 (1H, br s, H-9-13), 1.51 (2H, m, H-14), 2.16 (2H, td, J = 3.1, 8.8 Hz, H- J = 3.1 Hz H-17), ₁₃ C-NMR (125 MHz, CDCl ₃ ) 170.0 (C-1), 129.4 (C-2), 72.3 C-5), 148.9 (C-6), 29.8 (C-7), 28.6 (C-8), 29.5 -14), 28.8 (C-9-14), 18.5 (C-15), 84.9 (C-16), 68.3

화합물 2에 대한 NMR 구조 동정 결과는 다음과 같다: 무색, 오일상; 1H-NMR (500MHz, CDCl₃) : 4.49 (1H, br s, H-3), 4.48 (1H, qd, J =2.6, 8.3 Hz, H-4), 1.35 (3H, d, J =8.3 Hz, H-5), 7.00 (1H, td, J =2.0, 10.6Hz H-6), 2.40 (2H, m, H-7), 1.52(2H, m, H-8), 1.25 (20H, br s, H-9-18), 0.87 (3H, t, J =8.6Hz, H-19), 1.97 (1H, m, OH) 13C-NMR (125 MHz, CDCl₃) 170.1 (C-1), 129.4 (C-2), 72.4 (C-3), 82.9 (C-4), 19.8 (C-5), 149.0 (C-6), 29.9 (C-7), 28.6 (C-8), 29.8 (C-9-16), 29.7 (C-9-16)), 29.65 (C-9-16), 29.61 (C-9-16), 29.5 (C-9-16), 32.1 (C-17), 22.8 (C-18), 14.3 (C-19)The NMR structure identification results for Compound 2 are as follows: colorless, oily phase; _{1H-NMR (500MHz, CDCl 3} ): 4.49 (1H, br s, H-3), 4.48 (1H, qd, J = 2.6, 8.3 Hz, H-4), 1.35 (3H, d, J = 8.3 Hz, H -5), 7.00 (1H, td, J = 2.0, 10.6Hz H-6), 2.40 (2H, m, H-7), 1.52 (2H, m, H-8) , 1.25 (20H, br s, H-9-18), 0.87 (3H, t, J = 8.6Hz, H-19), 1.97 (1H, m, OH) 13C-NMR (125 MHz, CDCl 3) 170.1 (C-1), 129.4 (C-2), 72.4 (C-3), 82.9 (C-4), 19.8 9-16), 29.61 (C-9-16), 29.5 (C-9-16), 29.65 , 32.1 (C-17), 22.8 (C-18), 14.3 (C-19)

상기 NMR 데이타와 문헌[IH-SHENG CHEN, I-LUN LAI-YAUN, CHANG-YIH DUH and IAN-LIH TSAI, Cytotoxic Butanolides from Litsea Akoensis, Phytpchemistry , Vol 49, NO.3, 745-750, 1998]을 비교 검토 결과, 까마귀쪽나무 미성숙과의 유효 분획인 디클로로메탄 분획물의 compound 1은 상기 [화학식 1]의 Litsenolide B2로 확인되었고, compound 2는 상기 [화학식 2]의 Litsenolide C2로 확인되었다.
IH-SHENG CHEN, I-LUN LAI-YAUN, CHANG-YIH DUH and IAN-LIH TSAI, Cytotoxic Butanolides from Litsea Akoensis, Phytpchemistry, Vol 49, NO.3, 745-750, 1998] compared to the results, Raven compound 1 on the side of the effective fraction of immature trees dichloromethane fraction was identified as Litsenolide B2 of the Formula 1, compound 2 was identified as Litsenolide C2 of the above formula (2).

<< 실험예Experimental Example > > 항염증 활성 실험Anti-inflammatory activity experiment

<실험예 1> 세포 배양 &Lt; Experimental Example 1 > Cell culture

American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)으로부터 생쥐(murine) 대식세포주인 RAW 264.7을 구입하여, 10% fetal bovine serum (FBS), penicillin (100 units/mL), 및 streptomycin (100 g/mL)을 첨가하여 Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM; GIBCO Inc.)에서 보관하였다. 이들 세포들은 37℃ 에서 95% air, 5% CO₂ 가습 공기 조건 하 포화 상태(subconfluence)에서 배양하였으며, 3일마다 계대배양하였다. RAW 264.7 was purchased from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Md., USA), and 10% fetal bovine serum (FBS), penicillin (100 units / mL), and streptomycin (100 g / mL) was added and stored in Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM; GIBCO Inc.). These cells were cultured at 37 ° C in a subconfluence condition of 95% air, 5% CO ₂ humidified air, and subcultured every 3 days.

<실험예 2> NO ( Nitric oxide ) 생성 억제 효능 평가 <Experimental Example 2> NO ( Nitric oxide production inhibition

RAW 264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.5×10⁵cells/mL로 조절한 후 24 well plate에 접종하고, 실시예의 시료와 LPS (1 ㎍/mL)를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 Griess 시약 [1% (w/v) sulfanilamide, 0.1% (w/v) naphylethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid]을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO² ^-의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100 L와 Griess 시약 100 L를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO의 양은 sodium nitrite (NaNO₂)를 standard로 비교하였다.RAW 264.7 cells were adjusted to 1.5 × 10 ⁵ cells / mL using DMEM supplemented with 10% FBS, and then inoculated into a 24-well plate. LPS (1 μg / mL) Lt; / RTI > The amount of produced NO Griess reagent [1% (w / v) sulfanilamide, 0.1% (w / v) naphylethylenediamine in 2.5% (v / v) phosphoric acid] by using the NO ² present in the cell culture ^- in the form of Respectively. 100 L of cell culture supernatant and 100 L of Griess reagent were mixed and reacted on 96-well plates for 10 minutes, and the absorbance was measured at 540 nm. The amount of NO produced was compared with sodium nitrite (NaNO ₂ ) as standard.

결과를 [도 6] 및 [도 7]에 나타내었다.The results are shown in Fig. 6 and Fig. 7.

[도 6]은 상기 실시예의 70% 에탄올 성숙과 추출물과 70% 에탄올 미성숙과 추출물을 각각 5, 10 및 20 ㎍/㎖로 처리하였을 때의 결과이고, [도 2]는 상기 화합물 1과 2(즉 Litsenolide B2 및 Litsenolide C2) 각각 2.5, 5 및 10 ㎍/㎖로 처리하였을 때의 결과이다(*P<0.05;**,P<0.01). FIG. 6 shows the results of 70% ethanol maturation and extract and 70% ethanol immature and extract extracts treated with 5, 10 and 20 μg / ml, respectively, (* P <0.05; **, P <0.01 ) when treated with Litsenolide B2 and Litsenolide C2 at 2.5, 5 and 10 ㎍ / ㎖, respectively.

[도 6]을 참조하여 보면, 미성숙과 70% 에탄올 추출물이 대략 성숙과 70% 에탄올 추출물에 비하여 뚜렷하게 활성이 높음을 알 수 있다. 6, it can be seen that the immature and 70% ethanol extracts are significantly more active than the mature and 70% ethanol extracts.

또 [도 7]을 참조하여 보면, Litsenolide B2 및 Litsenolide C2이 모두 활성을 보이지만 대체로 Litsenolide B2가 높은 활성을 보임을 보여준다. 7, both Litsenolide B2 and Litsenolide C2 are active, but Litsenolide B2 is generally highly active.

<실험예 3> 세포독성 평가 - LDH assay <Experimental Example 3> Cytotoxicity evaluation - LDH assay

RAW 264.7 세포 (1.5×10⁵cells/mL)를 DMEM 배지에 실시예의 시료와 LPS (1 ㎍/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양 한 후 배양 배지를 얻어 3,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. LDH (lactate dehydrogenase) assay는 non-radioactive cytotoxicity assay kit (Promega)를 이용하여 측정했으며, 96 well plate에 원심 분리하여 얻은 배양 배지 50 L와 reconstituted substrate mix를 50 L를 넣고, 실온에서 30분 반응시킨 후 50 L의 stop solution을 넣은 후 microplate reader (Bio-TEK Instruments Inc., Vermont, WI, USA)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군 (LDH control, 1:5000)의 흡광도 값과 비교하여 세포독성을 평가하였다.RAW 264.7 cells (1.5 × 10 ⁵ cells / mL) were co-treated with DMEM medium and LPS (1 μg / mL) in a DMEM medium for 24 hours, followed by culture at 3,000 rpm for 5 minutes. LDH (lactate dehydrogenase) assay was performed using a non-radioactive cytotoxicity assay kit (Promega). 50 L of the culture medium obtained by centrifugation on a 96-well plate and 50 L of the reconstituted substrate mix were added and reacted at room temperature for 30 minutes After the addition of 50 L stop solution, the absorbance was measured at 490 nm using a microplate reader (Bio-TEK Instruments Inc., Vermont, WI, USA). The average absorbance values for each sample group were determined and compared with the absorbance values of the control (LDH control, 1: 5000) to evaluate cytotoxicity.

결과를 [도 6] 및 [도 7]에 함께 나타내었는데, 실시예의 성숙과 70% 에탄올 추출물과 미성숙과 70% 에탄올 추출물 그리고 Litsenolide B2와 Litsenolide C2 모두 특별한 세포독성을 보이지 않음을 알 수 있다. The results are shown in both FIG. 6 and FIG. 7, which show that the maturation of the examples, 70% ethanol extract, immature and 70% ethanol extract, and Litsenolide B2 and Litsenolide C2 do not show any cytotoxicity.

<실험예 4> PGE ₂ ( Prostaglandin E ₂ )생성 억제 효능 평가 Experimental Example 4: Experimental Example 4 PGE ₂ ( Prostaglandin E ₂ ) Evaluation of production inhibition efficacy

RAW 264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1.5×10⁵cells/mL로 조절한 후 24 well plate 에 접종하고, 5% CO₂항온기에서 18시간 전 배양 하였다. 이후 배지를 제거하고 실시예의 시료와 LPS (1 ㎍/mL)를 동시 함유한 새로운 배지를 처리하여 전배양과 동일 조건에서 배양하였다. 24시간 후 PGE₂를 측정하기 위해 배양 배지를 원심분리 (12,000 rpm, 3 min)하여 상층액을 얻었다. PGE₂의 측정은 PGE₂ ELISA kit(R&D Systems Inc., Minneapolis,MN,USA)를 이용하여 정량하였으며 standard 에 대한 표준곡선의 r²값은 0.99 이상이었다.RAW 264.7 cells were adjusted to 1.5 × 10 ⁵ cells / mL using DMEM medium, inoculated into 24-well plates, and incubated 18 hours before in a 5% CO ₂ incubator. Then, the medium was removed and a new medium containing the sample of Example and LPS (1 / / mL) was treated and cultured under the same conditions as the pre-culture. After 24 hours, the supernatant was obtained by centrifuging the culture medium (12,000 rpm, 3 min) to measure PGE ₂ . PGE ₂ was quantitated using a PGE ₂ ELISA kit (R & D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA). The r ² value of the standard curve for the standard was 0.99 or more.

상기 실시예의 70% 에탄올 성숙과 추출물과 70% 에탄올 미성숙과 추출물을 각각 5, 10, 20 ㎍/㎖로 처리하였을 때의 결과를 [도 8]에 나타내었고, Litsenolide B2와 Litsenolide C2를 각각 2.5, 5 및 10 ㎍/㎖로 처리하였을 때의 결과를 [도 9]에 나타내었다(*P<0.05;**,P<0.01). FIG. 8 shows the results of 70% ethanol maturation, extract and 70% ethanol immature and extract extracts treated with 70% ethanol of the above example, respectively, and Litsenolide B2 and Litsenolide C2 were 2.5, (* P <0.05; **, P <0.01 ) when treated with 5 and 10 μg / ml, respectively.

[도 8]의 결과에 있어서도 70% 에탄올 미성숙과 추출물이 70% 에탄올 성숙과 추출물에 비하여 뚜렷하게 활성이 높음을 보여주며, [도 9]의 결과에 있어서도 Litsenolide B2가 Litsenolide C2에 비하여 활성이 높음을 보여준다. [Figure 8] also shows that the 70% ethanol immature and extracts exhibit markedly higher activity than the 70% ethanol maturation and extract, and the results of [Figure 9] show that Litsenolide B2 is more active than Litsenolide C2 Show.

<실험예 5> 염증성 사이토카인( TNF -α, IL -1β 및 IL -6) 생성 억제 효능 평가 <Experimental Example 5> Evaluation of inhibitory effect on the production of inflammatory cytokines ( TNF -a, IL- 1β and IL- 6)

RAW 264.7 세포 (1.5×10⁵cells/mL)를 DMEM 배지를 이용하여 24 well plate 에 접종하고, 5% CO₂ 항온기에서 18 시간 전 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 실시예 시료와 LPS (1 ㎍/mL)를 동시 함유한 새로운 배지를 처리하여 전 배양과 동일 조건에서 배양하였다. 24 시간 후 배양 배지를 원심분리 (12,000 rpm, 3 분)하여 얻어진 상층액의 pro-inflammatory cytokines 생성 함량을 측정하였다. 모든 시료는 정량 전까지 -20℃ 이하에 보관하였다. pro-inflammatory cytokines 정량은 mouse enzyme-linked immnunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 정량하였으며 standard 에 대한 표준곡선의 r2값은 0.99 이상이었다.RAW 264.7 cells (1.5 × 10 ⁵ cells / mL) were inoculated into 24-well plates using DMEM medium and cultured for 18 hours in a 5% CO ₂ incubator. Then, the medium was removed and a new medium containing both the sample and LPS (1 / / mL) was treated and cultured under the same conditions as the pre-culture. After 24 hours, the amount of pro-inflammatory cytokines produced in the supernatant obtained by centrifuging the culture medium (12,000 rpm, 3 minutes) was measured. All samples were stored at -20 ° C or lower before quantification. Quantification of pro-inflammatory cytokines was quantitated using a mouse enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (R & D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA).

상기 실시예의 성숙과의 70% 에탄올 추출물과 미성숙과의 70% 에탄올 추출물을 5, 10 및 20 ㎍/㎖로 처리하였을 때의 결과를 [도 10] 내지 [도 12]에 나타내었고, Litsenolide B2와 Litsenolide C2를 각각 2.5, 5 및 10 ㎍/㎖로 처리하였을 때의 결과를 [도 13] 내지 [도 15]에 나타내었다(*P<0.05;**,P<0.01). 10 to 20 / / ml of the 70% ethanol extract of the above example and the 70% ethanol extract of the immature lot were shown in Figs. 10 to 12, and the results of the treatment with Litsenolide B2 (* P <0.05; **, P < 0.01 ) when Litsenolide C2 was treated at 2.5, 5 and 10 占 퐂 / ml, respectively.

이들 결과에 있어서도 앞에서의 결과들과 유사하게, 70% 에탄올 미성숙과 추출물이 70% 에탄올 성숙과 추출물에 비하여 활성이 뚜렷하게 높았으며, Litsenolide B2이 Litsenolide C2에 비하여 활성이 높았다. Similar to the results above, 70% ethanol immature and extracts showed higher activity than 70% ethanolic extract and extract, and Litsenolide B2 was more active than Litsenolide C2.

<실험예 6> iNOS 및 COX -2 발현 억제 효능 평가( western - blotting ) Experimental Example 6 Evaluation of iNOS and COX- 2 expression inhibition ( western - blotting )

배양이 끝난 세포를 수집하여 2~3회 phosphate buffered saline (PBS)로 세척 한 후 세포 용해 버퍼 [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 2 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaVO₃, 10 mM NaF, 1 mM dithiothreitol, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 25 ㎍/mL aprotinin, 25 ㎍/mL leupeptin]를 첨가하여 30분간 4℃에서 용해시킨 후 4, 15,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 단백질 농도는 bovine serum albumin (BSA)를 표준화하여 Bio-Rad Protein Assay Kit를 사용하여 정량하였다. 분리된 단백질 20~30 ㎍를 8~12% mini gel SDS-PAGE로 변성 분리하여, 이를 PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane (BIO-RAD, Richmond, CA, USA)에 200 mA로 2시간 동안 transfer하였다. 그리고 membrane의 blocking은 5% skim milk가 함유된 TTBS (0.1% Tween 20 + TBS) 용액에서 상온에서 2시간 동안 실시하였다. iNOS의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse iNOS (Calbiochem, La Jolla, CA, USA)를 COX-2의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse COX-2 (BD Biosciences Pharmingen, San Jose, CA, USA)를 TTBS 용액에서 1:1000으로 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 TTBS로 3회 세정하였다. 2차 항체로는 HRP (horse radish peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK)를 1:5000으로 희석하여 상온에서 30분 간 반응시킨 후, TTBS로 3회 세정하여 ECL 기질 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)과 1~3분 간 반응 후 X-ray 필름에 감광하였다.After incubation, cells were collected and washed twice with phosphate buffered saline (PBS). Cell lysis buffer [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% Nonidet P- _{1 mM EGTA, 1 mM NaVO 3} , 10 mM NaF, 1 mM dithiothreitol, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 25 ㎍ / mL aprotinin, 25 ㎍ / mL leupeptin] and then by dissolving in 4 ℃ 30 bungan added 4, at 15,000 rpm And the cell membrane components were removed by centrifugation for 15 minutes. Protein concentrations were quantified by standardizing bovine serum albumin (BSA) using the Bio-Rad Protein Assay Kit. 20 ~ 30 ㎍ of the separated proteins were denatured by 8-12% mini gel SDS-PAGE and transferred to PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane (BIO-RAD, Richmond, CA, USA) for 2 hours at 200 mA. Blocking of the membranes was performed in TTBS (0.1% Tween 20 + TBS) solution containing 5% skim milk at room temperature for 2 hours. (BD Biosciences Pharmingen, CA, USA) as an antibody to examine the expression level of iNOS, anti-mouse iNOS (Calbiochem, La Jolla, CA, USA) San Jose, CA, USA) was diluted 1: 1000 in TTBS solution, reacted at room temperature for 2 hours, and washed three times with TTBS. Anti-mouse IgG (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK) conjugated with HRP (horse radish peroxidase) was diluted 1: 5000 as the secondary antibody, reacted at room temperature for 30 minutes, washed three times with TTBS After exposure to ECL substrate (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) for 1 to 3 minutes, the plate was exposed to X-ray film.

상기 실시예의 70% 에탄올 성숙과 추출물과 70% 에탄올 미성숙과 추출물을 5, 10 및 20 ㎍/㎖로 처리하였을 때의 결과를 [도 16]에 나타내었다. The results obtained when the 70% ethanol maturation and the extract and 70% ethanol immature and extract of the above example were treated with 5, 10 and 20 / / ml, are shown in FIG.

[도 16]의 결과에 있어서도 70% 에탄올 미성숙과 추출물이 70% 에탄올 성숙과 추출물에 비하여 뚜렷하게 높은 활성을 보였다.The results of [Fig. 16] show that 70% ethanol immature and extracts showed markedly higher activity than 70% ethanol maturation and extract.

통계처리Statistical processing

실험결과는 3번 이상의 독립적인 실험의 데이터를 mean ± standard error 값으로 나타내었다. 실험군 사이의 통계적 유의성 검정은 student's t-test 분석방법을 사용하였다(* P<0.05, ** P<0.01).Experimental results were expressed as the mean ± standard error of three independent experiments. Student's t-test was used for statistical significance between the experimental groups (* P <0.05 , ** P <0.01 ).

Claims

A composition for antiinflammation comprising an immature and extract of a crow tree, a compound of the formula (1) or a compound of the formula (2) as an active ingredient.
[Chemical Formula 1]

(2)

The method according to claim 1,
The composition for anti-inflammation according to any one of claims 1 to 3, wherein the immature tree and the extract of the crow are obtained by extracting the immature part of the tree from the crows with water, ethanol or a mixed solvent thereof.

The method according to claim 1,
The anti-inflammatory means improvement, treatment, suppression of onset or delay of onset of inflammatory disease,
The inflammatory disease is selected from the group consisting of asthma, allergic and non-allergic rhinitis, chronic and acute rhinitis, chronic and acute gastritis or enteritis, ulcerative gastritis, acute and chronic nephritis, acute and chronic hepatitis, chronic obstructive pulmonary disease, Atherosclerotic disease, viral infection, bacterial infection, fungal infection, burn, wound due to surgical or dental surgery, prostaglandin E excess syndrome, atherosclerosis, Wherein the composition is one of atherosclerosis, gout, arthritis, rheumatoid arthritis, ankylosing spondylitis, hodgkin's disease, pancreatitis, conjunctivitis, iritis, scleritis, uveitis, dermatitis, atopic dermatitis, eczema and multiple sclerosis.

4. The method according to any one of claims 1 to 3,
Wherein the composition is a pharmaceutical composition.

4. The method according to any one of claims 1 to 3,
Wherein the composition is a food composition.

4. The method according to any one of claims 1 to 3,
Wherein the composition is a cosmetic composition.