KR20150068314A - 시료용액 내 표적 물질 분리, 농축 및 검출 방법 - Google Patents

시료용액 내 표적 물질 분리, 농축 및 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 분리하고자 하는 표적 물질에 특이적으로 결합하는 타겟팅 모이어티(moiety)가 표면에 결합되어 있는 자성입자, 자성물질이 부착된 자석홀더 및 상기 자석홀더가 삽입 가능하고 자성 입자를 겉표면에 포획할 수 있는 비자성 재질의 포집봉을 이용하여 시료용액 내 표적 물질을 분리, 농축 및 검출하는 방법 및 상기 자석홀더 및 포집봉으로 구성된, 미생물이 포함된 시료용액 내의 표적 물질을 분리하기 위한 장치에 관한 것으로, 본 발명의 상기 방법 및 장치가 종래의 자성입자 기반 방법의 복잡하고 시간 소모적인 방법들에 비해 분리하고자 하는 표적 물질의 분리 및 검출을 간편하고 효율적으로 수행할 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

Description

시료용액 내 표적 물질 분리, 농축 및 검출 방법{Method for separating, concentrating and detecting target material in sample solution}
본 발명은 자석홀더 및 포집봉으로 구성된 장치 기반의 표적 물질 분리, 농축 및 검출방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 분리하고자 하는 표적 물질에 특이적으로 결합하는 타겟팅 모이어티(moiety)가 표면에 결합되어 있는 자성입자, 자성물질이 부착된 자석홀더 및 상기 자석홀더가 삽입 가능하고 자성 입자를 겉표면에 포획할 수 있는 비자성 재질의 포집봉을 이용하여 시료용액 내 표적 물질을 분리, 농축 및 검출하는 일괄처리 방법 및 상기 자석홀더 및 포집봉으로 구성된, 미생물이 포함된 시료용액 내의 표적 물질을 분리하기 위한 장치에 관한 것이다.
식품, 의료 및 환경분야에서 매질 속에 포함된 위해(危害) 미생물을 검출하기 위해서, 그 매질 속에 포함된 미생물만을 선택적으로 분리한 후 극미량 미생물 농도에 따른 검출신호 증가를 위해 일정시간 미생물 배양과정을 거쳐 검출한다. 일반적으로, 미생물 배양시간은 장출혈성 대장균인 경우 12시간 정도이며 미생물에 따라 차이는 있으나 12시간에서 48시간까지 소요된다. 검출시간을 단축시키기 위해, 시료 매질 속 미생물을 신속히 분리하고 농축할 수 있는 기술이 면역자성법을 기반으로 발전하고 있는 추세이다.
면역자성법은 자성을 가지는 나노 또는 마이크로 크기의 입자 표면에 미생물과 선택적으로 반응하는 항체를 고정시켜 항원-항체 반응을 통해 시료기질 속 미생물과 선택적으로 반응하게끔 유도한 후 자석으로 미생물만 분리하는 기술이다. 종래의 면역자성법은 시료기질 속 미생물을 선택적으로 분리하고 농축하는 기술로서 분리된 미생물을 확인하기 위해서는 또 다른 검출법(평판도말, 비색법, 실-시간 PCR, SPR 및 ELISA 등)을 이용하였다. 따라서, 복잡하고 시간 소모적인 상기 종래 방법들을 개선하기 위해 미생물의 분리, 농출 및 검출을 손쉽게 수행할 수 있는 새로운 방법이 당업계에서 시급히 요구되고 있는 실정이다.
한국공개특허 제2010-0090957호에는 생체물질에 특이적으로 결합된 자성 비드(magnetic bead)를 포집하기 위한 것으로, 자석과 자성 비드를 포함하는 용액이 흐를 수 있는 유로를 제공하는, 자석에 감겨진 튜브를 구비한 자성 비드 포집 장치에 관한 '표적 생체물질의 분리 또는 정제를 위한 자성 비드 포집 장치 및 이를 구비한 미세유동 시스템'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2008-0008668호에는 '자성체 나노입자를 이용하여 단백질을 선택적으로 결합, 분리 또는 정제하는 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 자석홀더 및 포집봉으로 구성된 장치 기반의 시료용액 내 표적 물질 분리, 농축 및 검출 방법에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 자성물질이 부착된 자석홀더와 상기 자석홀더가 삽입가능한 유리 재질의 포집봉으로 구성된 장치를 사용하여 미생물 특이적 항체가 표면에 결합되어 있는 자성입자를 식품 균질화 시료용액 내에 혼합하여 미생물-항체 반응을 유도하고, 특정 미생물이 표면 항체에 결합되어 있는 자성입자를 상기 자석홀더 및 포집봉으로 구성된 장치를 사용하여 간단하고 신속하게 분리 및 검출함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해서, 본 발명은
(a) 분리하고자 하는 표적 물질에 특이적으로 결합하는 타겟팅 모이어티(moiety)가 표면에 결합되어 있는 자성입자를 미생물이 포함된 시료가 들어있는 시료용기 내에 처리하여 상기 표적 물질과 타겟팅 모이어티의 결합을 유도하는 단계;
(b) (i) 자성물질이 부착된 자석홀더 및 (ⅱ) 상기 자석홀더가 삽입 가능하고 자성 입자를 겉표면에 포획할 수 있는 비자성 재질의 포집봉으로 구성된 기구를 상기 (a) 단계의 표적 물질이 결합된 자성입자를 포함하는 반응 시료에 담궈 상기 표적 물질이 결합된 자성입자를 포집봉의 겉표면에 포집하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 자석홀더 및 포집봉을 서로 분리하여 포집봉 표면의 표적 물질을 분리하는 단계를 포함하는 자성입자, 자석홀더 및 포집봉을 이용하여 시료용액 내 표적 물질을 분리, 농축 및 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (i) 시료용액 내 자성입자를 포획할 수 있는 자성물질이 부착된 자석홀더 및 (ⅱ) 상기 자석홀더가 삽입 가능하고 자성 입자를 겉표면에 포획할 수 있는 비자성 재질의 포집봉으로 구성된, 미생물이 포함된 시료용액 내의 표적 물질을 분리하기 위한 장치를 제공한다.
본 발명에서는 비자성 재질의 포집봉을 사용하여 면역자성법을 수행한 경우, 분리하고자 하는 표적 물질과 결합하고 있는 자성입자가 자석으로부터 쉽고 간단하게 분리할 수 있으며 다량의 부피를 가지는 시료용액에 대해 병렬적으로 처리할 수 있어 기존 면역자성법으로 소요되는 수 시간을 수 분내로 단축시킬 수 있었다. 본 발명의 방법 및 장치가 종래의 자성입자 기반 방법의 복잡하고 시간 소모적인 방법들에 비해 분리하고자 하는 표적 물질의 분리 및 검출을 간편하고 효율적으로 수행할 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
도 1은 본 발명의 자성입자 분리 및 정제를 위한 자석홀더 및 포집봉으로 구성된 장치의 모식도이다.
도 2는 특정 미생물 및 유전자 결합 자성입자의 모습을 보여주는 도면이다.
도 3은 항체-자성입자 사용에 의한 시료 전처리 및 미생물 검출 과정을 보여주는 도면이다.
도 4는 유전자-자성입자 사용에 의한 시료 전처리 및 미생물의 유전자 검출 과정을 보여주는 도면이다.
도 5는 식품 시료로부터 분리하고자 하는 표적 미생물을 분리 및 농축하는 과정을 나타내는 도식이다.
도 6은 도 5 과정을 거쳐 얻은 농축된 농축미생물로부터 유전자를 검출하는 과정을 나타내는 도식이다.
도 7은 Fe3O4 자성나노입자의 전자현미경 사진이다. 좌측이 TEM 사진이고, 우측이 SEM 사진이다.
도 8은 제작한 Fe3O4 나노입자의 XRD 스펙트럼이다.
도 9는 타겟팅 모이어티가 고정된 자성입자 제작을 위한 모식도이다.
도 10은 포집막을 이용한 자성체 분리(a) 및 시간에 따른 포집 자성체 흡광도 변화(b)를 나타낸다.
도 11은 초음파를 이용한 분산(a) 후 포집 자성체 흡광도 변화(b)를 나타낸다.
도 12는 미생물에 흡착된 자성입자의 현미경 사진이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 분리하고자 하는 표적 물질에 특이적으로 결합하는 타겟팅 모이어티(moiety)가 표면에 결합되어 있는 자성입자를 미생물이 포함된 시료가 들어있는 시료용기 내에 처리하여 상기 표적 물질과 타겟팅 모이어티의 결합을 유도하는 단계;
(b) (i) 자성물질이 부착된 자석홀더 및 (ⅱ) 상기 자석홀더가 삽입 가능하고 자성 입자를 겉표면에 포획할 수 있는 비자성 재질의 포집봉으로 구성된 기구를 상기 (a) 단계의 표적 물질이 결합된 자성입자를 포함하는 반응 시료에 담궈 상기 표적 물질이 결합된 자성입자를 포집봉의 겉표면에 포집하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 자석홀더 및 포집봉을 서로 분리하여 포집봉 표면의 표적 물질을 분리하는 단계를 포함하는 자성입자, 자석홀더 및 포집봉을 이용하여 시료용액 내 표적 물질을 분리, 농축 및 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 (a) 단계는 분리하고자 하는 표적 물질에 특이적으로 결합하는 타겟팅 모이어티(moiety)가 표면에 결합되어 있는 자성입자를 미생물이 포함된 시료가 들어있는 시료용기 내에 처리하여 상기 표적 물질과 타겟팅 모이어티의 결합을 유도하는 단계이다 (도 3의 (2)단계).
시료 용기 내에는 분리하고자 하는 미생물, 기타 미생물, 식품 기질 등이 포함되어 있으며, 이들 중에 분리하고자 하는 미생물을 분리하기 위해 분리하고자 하는 표적 물질에 특이적으로 결합하는 타겟팅 모이어티(moiety)가 표면에 결합되어 있는 자성입자를 미생물이 포함된 시료에 처리하면, 상기 표적 물질에 특이적으로 결합하는 타겟팅 모이어티가 반응하여 표적 물질-타겟팅 모이어티 결합체가 생성이 된다.
또한, 표적 물질이 미생물 내에 존재하는 단백질 또는 유전자인 경우에는 분리하고자 하는 미생물에 외부에너지를 가하여 미생물의 세포벽 및 막을 제거하여 단백질 또는 유전자를 노출시킨 후 동일한 방법으로 타겟팅 모이어티와 반응을 시켜 표적 물질-타겟팅 모이어티 결합체의 생성을 유도할 수 있다. 미생물의 세포벽 및 막을 제거하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면 효소 처리(예컨대, lysozyme 등), 열처리, 화학약품(예컨대, NaOH, SDS 등) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 표적 물질은 분리하고자 하는 미생물을 말하며, 바람직하게는 유해 미생물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 유해 미생물 표면, 유해 미생물 내의 단백질 및 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 유해 미생물은 바람직하게는 유해 진핵생물 및 유해 박테리아이고, 예를 들어 대장균(예컨대, E. coli O157:H7), 살모넬라(Salmonella; 예컨대, Salmonella enteritidis , Salmonella typhi), 쉬겔라(Shigella; 예컨대, Shigella dysenteriae), 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae), 슈도모나스(Pseudomonas; 예컨대, Pseudomonas aeruginosa), 모락셀라(Moraxella; 예컨대, Moraxella catarrhalis), 헬리코박터(Helicobacter; 예컨대, Helicobacter pylori), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas; 예컨대, Stenotrophomonas maltophilia) 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
용어 "타겟팅 모이어티(targeting moiety)"는 타겟 미생물의 표면에 존재하는 항원 또는 미생물 내의 단백질 또는 유전자에 결합할 수 있는 모든 물질을 의미한다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 타겟팅 모이어티는 단백질, 단편을 이용한 조립항체, 펩타이드, 항체, 항체 단편 또는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 것일 수 있으며, 바람직하게는 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 타겟팅 모이어티는 항체의 Fab 및 Fc 부위를 포함하며, 이 Fab 부위를 통하여 타겟 미생물의 표면 항원과 비공유결합을 하게 된다. 본 명세서에서 용어 "Fab 부위"는 타겟 미생물의 표면 항원(예컨대, 수용체)과 상호작용하는 항체의 일 부위를 의미한다. 일반적으로, 파파인으로 전장 항체를 절단하면 Fab 부위와 Fc 부위 두 부위를 얻게 된다. 하나의 클래스에서 모든 항체의 Fab 부위는 거의 동일한 특성이 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, Fab 부위는 IgG의 Fab 부위를 의미한다. 한편, 타겟 미생물의 표면 항원과 결합하는 특성을 갖는 범위 내에서는 Fab 부위는 통상적인 Fab 부위의 일부 서열일 수도 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 타겟팅 모이어티는 항체의 Fab 부위를 포함하는 항체, 앱타머, 폴리펩타이드, 펩타이드, 리간드, 렉틴, 당, 지질, 당지질 또는 핵산이며, 보다 바람직하게는, 항체의 Fab 부위를 포함하는 항체, 앱타머 또는 리간드이며, 가장 바람직하게는 항체이다.
타겟팅 모이어티가 Fab 부위를 포함하는 항체인 경우에는, 타겟팅 모이어티로서 전장 항체가 이용될 수 있다. 전장 항체는 폴리클론 또는 단일클론 항체를 포함한다. 세포의 특정 표면 분자에 결합하는 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 항원으로서의 세포 표면 분자를 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.
본 발명의 시료용액 내 표적 물질을 분리, 농축 및 검출하는 방법은 자성입자 기반된 방법이다.
본 발명의 상기 자성입자는 5 내지 1,000nm의 크기를 가지는 다양한 물질의 입자로, 금속 입자 또는 금속산화물 입자 등일 수 있다. 금속 입자로는 Pd, Pt, Cu, Ni, Co, Fe, Mn, Ru, Rh, Os, Ir 등의 입자일 수 있으며, 금속 산화물 입자는 화학식 MxOy(단, M은 금속으로 Fe, Pt, Ni 또는 Mn이며, O는 산소, x와 y는 정수를 나타낸다)로 나타낼 수 있는 화합물일 수 있으며, 바람직하게는 금속산화물 Fe2O3 또는 Fe3O4인 자성입자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 자성입자의 표면은 타겟팅 모이어티와의 결합에 이용될 수 있는 물질로 코팅되어 있으며, 상기 코팅 물질로는 머캅도헥사데카노익산(Mercaptohexadecanoic acid, MHDA), 시스타민, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 알부민, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌이민, 키토산, 히아루론산, 폴리락틱글라이코릭산(PLGA), 폴리락틱산, 폴리락타이드, 폴리글라이콜릭산, 폴리아미노산, 폴리아세탈, 폴리오써칼본에이트, 폴리칼본에이트, 폴리칼보락톤 폴리아크릴산, 폴리메타아크릴산, 폴리사카라이드, 폴리케탈, 폴리에테르, 폴리아마이드,폴리말레익안하드라이드, 폴리메틸비닐에테르 또는 상기 고분자의 공중합체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 (b) 단계는 (i) 자성물질이 부착된 자석홀더 및 (ⅱ) 상기 자석홀더가 삽입 가능하고 자성 입자를 겉표면에 포획할 수 있는 비자성 재질의 포집봉으로 구성된 기구를 상기 (a) 단계의 표적 물질이 결합된 자성입자를 포함하는 반응 시료에 담궈 상기 표적 물질이 결합된 자성입자를 포집봉의 겉표면에 포집하는 단계이다 (도 3의 (3)단계). 이 단계는 표적 물질이 결합된 자성입자가 자성을 가지므로 자석홀더에 부착된 자성물질에 의해 서로 포집봉 표면에서 결합을 하는 단계이다. 즉, 표적 물질이 결합된 자성입자는 자성물질에 직접 결합하는 것이 아니라, 포집봉의 표면에 일시적으로 결합한 후 포집용기로 옮겨 자성물질을 제거하면 자성입자가 용이하게 분리되는 것이다. 따라서, 포집봉은 자성물질에 결합된 자성입자의 분리를 용이하게 하기 위해 사용되는 것이며, 이러한 목적을 달성하기 위해 포집봉은 비자성 재질이어야 하며, 상기 비자성 재질은 유리, 플라스틱, 세라믹스 또는 오스테나이트계 스테인리스강(Austenitic Stainless Steel)일 수 있으며, 바람직하게는 유리일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 (c) 단계는 상기 (b) 단계의 자석홀더 및 포집봉을 서로 분리하여 포집봉 표면의 표적 물질을 분리하는 단계이다. 이 단계는 구체적으로 (d) 상기 (b) 단계의 자석홀더-포집봉을 시료용기로부터 분리하여 포집용기로 옮기는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계의 자석홀더 및 포집봉을 서로 분리하여 포집봉 표면의 표적 물질이 결합된 자성입자를 포집용기 내로 분산시키는 단계로 이루어질 수 있다. 상기 (d) 단계는 포집봉에 일시적으로 결합된 자성입자를 포집용기에 분산시키기 위해 포집용기로 옮기는 단계이다 (도 3의 (4)단계).
상기 (e) 단계는 포집봉에 일시적으로 결합된 표적 물질이 결합된 자성입자가 자성물질이 부착된 자석홀더가 포집봉으로부터 분리됨으로 인해 자성물질이 제거되어 포집봉 표면에서 떨어져 나와 포집용기 내로 분산되는 것이다 (도 3의 (5)단계).
본 발명의 방법은 상기 (e) 단계의 포집용기 내 분산된 표적 물질을 농축 및 검출하는 단계를 포함할 수 있다 (도 3의 (6)단계). 미생물 또는 유전자를 보다 용이하게 검출하기 위해 미생물 또는 유전자에 결합된 자성입자를 제거할 수도 있다. 표적 물질이 미생물인 경우에는 미생물을 검출하기 위해 당업계에 통상적으로 이용되는 방법을 사용할 수 있으며, 표적 물질이 유전자인 경우에는 PCR 방법 등을 통해 유전자를 증폭하여 검출할 수도 있다.
또한, 본 발명은 (i) 시료용액 내 자성입자를 포획할 수 있는 자성물질이 부착된 자석홀더 및 (ⅱ) 상기 자석홀더가 삽입 가능하고 자성 입자를 겉표면에 포획할 수 있는 비자성 재질의 포집봉으로 구성된, 미생물이 포함된 시료용액 내의 표적 물질을 분리하기 위한 장치를 제공한다.
본 발명의 미생물이 포함된 시료용액 내의 표적 물질을 분리하기 위한 장치는 자석홀더 및 포집봉으로 구성되는데, 자석홀더는 이의 말단에 시료용액 내 자성입자를 포획할 수 있는 자성물질(자석)이 부착되어 있으며, 포집봉에 삽입하거나 포집봉으로부터 분리를 용이하게 하기 위해서 포집봉보다는 길이가 긴 것이 바람직하다. 또한, 자석홀더의 손잡이 부분은 파지를 용이하게 하기 위해, 홈이 형성될 수 있다.
포집봉은 자석홀더를 삽입하고 자성 입자를 겉표면에 포획하는 것으로서, 자석홀더보다는 직경이 커야 하며, 길이는 짧아야 한다. 또한, 포집봉은 자성물질에 결합된 자성입자의 분리를 용이하게 하기 위해 비자성 재질이어야 하며, 상기 비자성 재질은 유리, 플라스틱, 세라믹스 또는 오스테나이트계 스테인리스강일 수 있으며, 바람직하게는 유리일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
자석홀더와 포집봉은 원형, 사각형, 삼각형, 기타 다각형 등의 다양한 형태가 가능할 수 있으며, 시료용기에 담구기 위해서 시료용기보다는 직경이 작은 것이어야 한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 장치에서, 상기 표적 물질은 미생물 표면, 미생물 내에 존재하는 단백질 및 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 자성입자의 제작
Fe 3 O 4 자성나노입자의 제작
본 발명에서는 시료 전처리에 응용하기 위하여 외부자장에 강하게 작용하고 외부자장 제거시 이완시간을 최소화할 수 있는 SPIO 특성을 갖는 Fe3O4 자성나노입자를 제작하였다. 상기의 나노입자는 다음과 같은 방법에 의해 제작하였다. 3-넥 라운드 플라스크(500ml)에 0.5M의 NaOH 250ml를 채운 후 0.1M FeCl2·4H2O, 0.2M Fe3Cl6·4H2O, 0.4M HCl 25ml 수용액을 제조한 후 주입하고 기계적 교반기(mechanical stirrer)를 이용하여 1500 rpm의 속도로 교반하며, 용액의 온도는 80℃로 30분간 유지하였다. 자연 냉각 후 영구자석을 이용하여 상층액을 제거하고 pH 2 정도의 HCl 수용액을 이용하여 중화시킨 후 증류수, 에탄올을 사용하여 세척한 후 100ml 증류수에 분산시켜 상온 보관하였다.
Fe 3 O 4 자성나노입자 특성평가
제작한 Fe3O4 자성나노입자는 TEM 및 SEM을 통해 입자의 크기 및 분포를 확인하였으며 평균 5 nm 정도, 일부 10 nm 이상 크기도 존재하나 80% 이상 4~6 nm 내에 존재하였다(도 7). 또한 XRD를 통해 Fe3O4 재질 (PDF#19-0629)의 자성입자임을 확인하였다(도 8). 제작한 Fe3O4 자성나노입자의 농도는 약 5 mM 수준이었다.
2. 타겟팅 모이어티가 고정된 자성입자의 제작
자성입자를 이용한 시료 중 특정 미생물을 분리/농축하기 위하여 자성입자 표면상에 타겟팅 모이어티로서 항체를 고정시켜야 한다. 타겟팅 미생물로서 E. coliO157:H7을 표적으로 하였으며 그 항체 (antibody E. coli 157:H7, Bac Trace, Kerkegaard & Perry Laboratories Inc.)를 고정시키기 위해 자성입자 표면을 다음과 같은 방법으로 개질하였다. 제조한 수용액 중에 분산된 0.5 mM 자성입자를 원심분리기를 이용하여 에탄올에 재분산시킨 후 APTMS (3-Aminoproplytrimethoxysilane, 97%, Aldrich)를 첨가하여 2시간 반응시켰다. 반응 후 에탄올로 5회 세척한 후 G.A (Glutaric anhydride, 95%, Aldrich)를 자성입자 에탄올 용액에 첨가한 후 2시간 반응시켜 말단 -COOH를 형성하였다. 반응 후 에탄올로 5회 세척, 수용액으로 3회 세척 후 수용액 8 ml에 분산하여 0.4M EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, 97%, Aldrich)와 0.1M NHS (N-Hydroxysuccinimide, 98%, Aldrich)를 혼합한 2 ml 수용액을 제조한 후 8 ml 자성입자 수용액에 첨가하여 5분간 반응시켜 자석으로 세척하고, 세척 후 5 ml PBS (pH 7.4) 버퍼에 분산시켰다. E. coli 157:H7의 항체의 배향특성을 고려하기 위하여 프로틴 G (Pro.G, Sigma)를 첨가한 후 4시간 반응시켜 자석을 이용하여 세척 후 1 ml PBS에 분산시켰다. 10 ㎍/ml 농도의 항체를 첨가한 후 2시간 반응시킨 후 자석을 이용하여 세척하고 30 mg/ml BSA (98%, Sigma-Aldirch) 5 ml를 제조한 후 항체가 결합된 자성입자와 1시간 반응시켰으며 자석을 이용하여 세척한 후 PBS 10 ml에 분산시켜 냉장보관하였다.
실시예 1. 항체인 타겟팅 모이어티가 결합된 자성입자를 이용한 시료 전처리의 특성 평가
시료 전처리 특성을 파악하기 위하여 포집막에 자성체 포집 결과(도 3의 (3)), 분산시 분산특성 결과 (도 3의 (6)) 및 분산 후 미생물 검출 결과로부터 제안한 시료 전처리의 특성을 평가하였다.
포집봉 대신 시료 전처리 단계 확인을 위하여 자석(네오듐)만을 포집막 (유리튜브) 내 하단부에 위치시킨 후 자성분리 특성을 확인하였으며 자성체 분산을 위해 포집막에서 자석을 분리시킨 후 초음파를 이용하여 2 mL PBS 버퍼 속에 분산시켰다. 도 3의 (3) 과정을 수행한 후 나노입자 자성체가 자석에 흡착된 상태로 이는 도 10(b)에서 알 수 있듯이 5분 이내 90% 이상 흡착됨을 알 수 있다. 또한 최초 주입한 자성체의 농도에서 포집한 자성체를 확인하기 위하여 도 11에서와 같이 포집된 자성체를 분산시켜 그 흡광도를 측정하였을 경우 초음파 분산 후 3분 이내 90% 회수가능함을 알 수 있었다.
실시예 2. 포집된 자성체에서의 미생물 확인
제조한 자성체를 이용한 E. coli 157:H7의 포집 특성을 확인하기 위하여 투과전자현미경을 이용, 흡착특성을 확인하였다. 표적미생물인 E. coli 157:H7을 식품 시료 (우유, 양배추) 25g에 10 및 1000 CFU/mL를 오염시킨 후 PBS 버퍼 225mL로 균질화하였다. 이는 식품공전의 미생물 검출을 위한 시료 전처리 방법에 따라 시행되었다. 225 mL의 용액을 29 mL씩 8개 포집 용기로 나눠 균등하게 주입하고 포집봉과 포집막 8개를 이용하여 병렬적으로 처리하였다. 그 결과 도 12의 현미경 사진과 같이 10 CFU/mL E. coli 157:H7의 225 mL PBS 버퍼속에서도 미생물을 분리/농축할 수 있음을 확인하였다.

Claims (14)

  1. (a) 분리하고자 하는 표적 물질에 특이적으로 결합하는 타겟팅 모이어티(moiety)가 표면에 결합되어 있는 자성입자를 미생물이 포함된 시료가 들어있는 시료용기 내에 처리하여 상기 표적 물질과 타겟팅 모이어티의 결합을 유도하는 단계;
    (b) (i) 자성물질이 부착된 자석홀더 및 (ⅱ) 상기 자석홀더가 삽입 가능하고 자성 입자를 겉표면에 포획할 수 있는 비자성 재질의 포집봉으로 구성된 기구를 상기 (a) 단계의 표적 물질이 결합된 자성입자를 포함하는 반응 시료에 담궈 상기 표적 물질이 결합된 자성입자를 포집봉의 겉표면에 포집하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 자석홀더 및 포집봉을 서로 분리하여 포집봉 표면의 표적 물질을 분리하는 단계를 포함하는 자성입자, 자석홀더 및 포집봉을 이용하여 시료용액 내 표적 물질을 분리, 농축 및 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, (c) 단계는
    (d) 상기 (b) 단계의 자석홀더-포집봉을 시료용기로부터 분리하여 포집용기로 옮기는 단계; 및
    (e) 상기 (d) 단계의 자석홀더 및 포집봉을 서로 분리하여 포집봉 표면의 표적 물질이 결합된 자성입자를 포집용기 내로 분산시키는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 시료용액 내 표적 물질을 분리, 농축 및 검출하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 표적 물질은 미생물 표면, 미생물 내의 단백질 및 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 시료용액 내 표적 물질을 분리, 농축 및 검출하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 비자성 재질은 유리, 플라스틱, 세라믹스 또는 오스테나이트계 스테인리스강인 것을 특징으로 하는 시료용액 내 표적 물질을 분리, 농축 및 검출하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 자성입자는 MxOy(단, M은 금속으로 Fe, Pt, Ni 또는 Mn이며, O는 산소, x와 y는 정수를 나타낸다)인 것을 특징으로 하는 시료용액 내 표적 물질을 분리, 농축 및 검출하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 MxOy는 Fe2O3 또는 Fe3O4인 것을 특징으로 하는 시료용액 내 표적 물질을 분리, 농축 및 검출하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 타겟팅 모이어티는 항체, 이의 단편, 단편을 이용한 조립항체 및 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 시료용액 내 표적 물질을 분리, 농축 및 검출하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 자성입자는 5 내지 1,000nm의 크기를 가지는 자성입자인 것을 특징으로 하는 시료용액 내 표적 물질을 분리, 농축 및 검출하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 자성입자의 표면은 타겟팅 모이어티와의 결합에 이용될 수 있는 물질로 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는 시료용액 내 표적 물질을 분리, 농축 및 검출하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 자성입자의 표면은 머캅도헥사데카노익산(Mercaptohexadecanoic acid, MHDA), 시스타민, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 알부민, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌이민, 키토산, 히아루론산, 폴리락틱글라이코릭산(PLGA), 폴리락틱산, 폴리락타이드, 폴리글라이콜릭산, 폴리아미노산, 폴리아세탈, 폴리오써칼본에이트, 폴리칼본에이트, 폴리칼보락톤 폴리아크릴산, 폴리메타아크릴산, 폴리사카라이드, 폴리케탈, 폴리에테르, 폴리아마이드,폴리말레익안하드라이드, 폴리메틸비닐에테르 또는 상기 고분자의 공중합체인 것을 특징으로 하는 시료용액 내 표적 물질을 분리, 농축 및 검출하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 유해 미생물인 것을 특징으로 하는 시료용액 내 표적 물질을 분리, 농축 및 검출하는 방법.
  12. (i) 시료용액 내 자성입자를 포획할 수 있는 자성물질이 부착된 자석홀더 및
    (ⅱ) 상기 자석홀더가 삽입 가능하고 자성 입자를 겉표면에 포획할 수 있는 비자성 재질의 포집봉으로 구성된, 미생물이 포함된 시료용액 내의 표적 물질을 분리하기 위한 장치.
  13. 제12항에 있어서, 상기 비자성 재질은 유리, 플라스틱, 세라믹스 또는 오스테나이트계 스테인리스강인 것을 특징으로 하는 미생물이 포함된 시료용액 내의 표적 물질을 분리하기 위한 장치.
  14. 제12항에 있어서, 상기 표적 물질은 미생물 표면, 미생물 내의 단백질 및 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 미생물이 포함된 시료용액 내의 표적 물질을 분리하기 위한 장치.
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