KR20150067113A

KR20150067113A - (-)카테친, (-)에피카테친 갈레이트 및 (-)갈로카테친을 함유하는 피부 미용, 성형용, 및 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20150067113A
Application number: KR1020150077288A
Authority: KR
Inventors: 신동욱; 이상민; 송민정; 박선미; 노민수; 김한곤
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2015-06-01
Filing date: 2015-06-01
Publication date: 2015-06-17
Also published as: KR101656682B1

Abstract

본 발명은 녹차(Camellia sinensis)의 한 성분인 (-)카테친, (-) 에피카테친 갈레이트 및 (-)갈로카테친에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미용, 성형용 및 당뇨병 예방 또는 치료용 의학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 피부 미용, 성형용 및 당뇨병 예방 또는 치료용 의학적 조성물은 지방세포 분화를 촉진하여 피부의 볼륨 및 탄력을 증진시키고, 주름 및 피부처짐을 개선하며, 함몰부위를 성형을 통해 복구하도록 함으로써 미용에 효과적일 뿐만 아니라 아디포넥틴 발현을 촉진하여 제 2형 당뇨 및 당뇨합병증의 병 예방 및 당뇨병 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

(-)카테친, (-)에피카테친 갈레이트 및 (-)갈로카테친을 함유하는 피부 미용, 성형용, 및 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for improving diabetes mellitus and for promoting the differentiation of human mesenchymal stem cell to adipocytic cells containing (-)catechin, (-)epicatechin gallate, (-)gallocatechin}

본 발명은 녹차(Camellia sinensis)의 한 성분인 (-)카테친, (-) 에피카테친 갈레이트 및 (-)갈로카테친에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미용, 성형용 및 당뇨병 예방 또는 치료용 의학적 조성물에 관한 것이다.

녹차는 동백나무과의 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)의 싹이나 잎을 이용하여 제조한 것이다. 녹차에는 폴리페놀류인 카테친류, 식이섬유, 아미노산, 비타민 C 등의 유효 성분들이 다량으로 함유되어 있으며, 해독작용, 피로회복, 강심작용, 피부미용에 우수한 효능을 갖고 있는 것으로 밝혀졌다. 특히, 녹차에 가장 많이 함유되어 있는 성분인 폴리페놀중의 하나인 카테친류는 항암, 항균 등 다양한 효능을 가지고 있으며, 일반적으로 음용하는 차의 성분이므로 그 안전성이 입증되어 차의 조성물 뿐만 아니라 화장품의 조성물로도 널리 사용되고 있다.

현대 사회에서 탄력 있는 피부는 건강의 상징이 되고있다. 피하지방조직은 피부의 볼륨과 강도를 좌우하는 역할을 하며, 특히 얼굴 부위의 피부는 체중이나 나이 등의 요인으로 인해 처지고 탄력을 잃기 쉽다. 따라서 많은 여성들이 부작용과 경제적인 부담이 따르는 성형수술을 통해서라도 얼굴 부위의 피부 탄력을 증진시키고자 할 만큼 나이가 들어감에 따라 탄력을 잃는 피부는 여성들에게 민감한 문제로 대두되고 있다. 또한 폐경기 여성들에게서 주로 발생하는 호르몬, 혈액, 지방, 뼈 등의 대사 이상으로 인한 얼굴의 탄력 저하 및 지방의 감소는 여성들로 하여금 여성성에 대한 큰 상실감을 느끼게 한다.

이러한 피부의 탄력 저하를 개선하고자 현재 널리 사용되고 있는 방법이 지방이식수술이다. 지방이식수술은 튜립 니들(tulip needle) 모양의 끝이 날카롭지 않은 바늘을 갖는 주사기를 이용하여 자신의 지방을 채취해 탄력이 떨어져 보이는 피부의 각 부위에 이식하는 수술이다. 이러한 지방 이식은 나이가 들어감에 따라 노화되는 피부의 주름 개선을 비롯하여, 입술선, 턱선, 이마선의 교정, 코 성형과 화상이나 상처로 인하여 함몰된 피부, 암 절제 수술로 상실된 부분 등에 적용하여 좋은 성과를 보이고 있다. 하지만 지방이식수술 후, 이식 부피의 40~60%가 다시 인체 내에 흡수되는 등 이식한 지방의 생존율과 생존기간이 기대에 미치지 못해 재이식이 필요하다는 문제가 있다 (S Eremia et al., 2000, Dermatol. Sur. 26, 1150-1158; Fulton JE et al., 2001, Dermatol. Clin. 19(3), 523-530). 또한, 피부가 얇고 피하지방이 적은 부위에 지방이식수술을 하는 경우, 다양한 세포 덩어리가 존재함으로써 덩어리들이 만져지는 등의 문제가 발생한다. 따라서 이러한 위험 요소를 가지고 있는 지방이식수술을 대체할 수 있으며, 지방이 부족한 부위의 피하 지방층을 증가시킬 수 있는 조성물에 대한 요구가 높아지고 있다.

현재 판매되고 있는 피부 탄력 증진 효능을 가진 화장품의 대부분은 피부의 주름 제거 또는 진피 강화 등의 일반적인 효능을 가진 성분을 사용한 것이나 피부의 기본적인 구조가 피하 지방조직에 의해 유지되고 있으므로, 피부 외곽층에 있는 진피나 표피에 탄력을 부여하는 방법보다 지방 조직의 부피를 증가시키는 것이 피부의 볼륨 및 탄력을 유지할 수 있는 또 다른 해결책이 될 수 있다.

한편, 당뇨병(diabetes)은 전세계적으로 중요한 성인병 중의 하나로서, 최근 우리나라에서도 급속한 경제 성장과 더불어 당뇨병 유병률이 7~8%에 달하며, 60 내지 70대의 중요한 사망원인이 되고 있다. 당뇨병 환자 중 상당 비율은 제 2형 당뇨병을 앓고 있다. 제 2형 당뇨병은 인슐린 분비 및 작용 이상, 및 인슐린 저항성으로 특징된다.

현재까지 알려진 제 2형 당뇨병 치료제를 살펴 보면, 설포닐우레아(sulfonylurea) 계통의 약물이 있으며, 대표적으로 글리벤클라마이드 (glibenclamide)를 예로 들 수 있다. 이러한 약물들은 가장 먼저 당뇨병 치료제로 사용된 것으로서, 췌장의 베타세포에 직접적으로 작용하여 인슐린의 분비를 촉진시킴으로써 당뇨 치료 효능을 나타내었다. 하지만 이 약물의 큰 문제는 혈당 농도에 상관없이 효능을 나타냄으로써, 혈당이 낮아도 인슐린을 분비시켜 저혈당을 유발시킬 수 있다. 이는 저혈당증이 당뇨병의 주요사망원인인 심혈관 질환의 위험성 상승과 관련되기 때문에 문제가 된다.

또한 최근에는 제 2형 당뇨병에 대해 효과적인 새로운 종류의 합성 약물인 티아졸리딘다이온(Thiazolidinedione)이 보고되었다(Nolan 등, N. Engl. J. Med., 331: 1188-1193, 1994). 효과적인 당뇨병 치료제로서 티아졸리딘다이온의 효능은 지방유발 작용, 즉 전지방세포 및 줄기세포로부터 지방세포로 분화시키는 능력과 거의 일치한다(Harris 및 Kletzein, Mol. Pharmacol., 45 : 439-445, 1994 ; Wilson 등, J. Med. Chem., 39 : 665-668, 1996). 상기 보고된 지방 유발 효능의 티아졸리딘다이온은 인슐린 저항성을 개선시키며, 매우 많은 양을 투여할 때에도 저혈당 상태를 일으키지 않으면서 혈장 포도당 및 증가된 인슐린의 수준을 정상화 시킨다고 보고되었다. 하지만, 티아졸리딘다이온의 주요 문제점은 그의 생체 내 독성 부작용으로, 독성을 나타내지 않는 천연물 중에서 지방분화 촉진 효능을 나타내어 당뇨병을 예방 및 치료할 수 있는 물질의 개발이 필요한 상황이다.

지방 세포 분화 과정 중 지방세포에서 분비되는 대표적인 아디포카인(adipokine) 중 하나인, 아디포넥틴(adiponectin)은 항당뇨작용을 비롯하여 다양한 효능이 공지 되어있으며(Clin Nutr. 2004 Oct.; 23(5):963-74, Adiponectin, the missing link in insulin resistance and obesity) 또한, 아디포넥틴은 지방세포가 분화되면서 발현이 증가하는 단백질로 지방 세포 분화 과정 중 아디포넥틴의 발현을 증가시키는 물질은 당뇨병 치료 효능을 나타낼 수 있을 것이다.

지방세포를 이용한 연구는 다양한 분야에서 활발하게 진행되고 있다. 일반적으로 사용되는 지방전구세포(생쥐의 미분화지방세포;3T3-L1 preadipocyte) 는 인슐린과 같은 분화 유도 물질에 의해 지방세포로 분화되는 특성을 가지고 있기 때문에, 많이 사용되어 왔다. 그렇지만, 사람에게 사용되기도 한 당뇨병 치료제인 술포닐 우레아 (sulfonylurea) 계열의 약물인 글리벤클라마이드 (glibencalmide) 또는 글림피라이드 (glimpiride) 같은 물질에 대한 세포의 반응성은 실험연구자에 따라 정반대의 결과가 나오는 등 생쥐의 미분화 지방세포를 사람에게 적용하기 위한 전단계의 연구 재료로 사용하기에는 단점을 가지고 있다. 최근 두 실험 결과는 서로 상반된 결과를 보였는데, 글리벤클라마이드 (glibencalmide) 또는 글림피라이드 (glimpiride)를 생쥐의 미분화지방세포에 처리한 결과, 한 그룹은 아디포넥틴의 발현이 일어났다 (Fukuen et al., 2005, J. Biol. Chem., 23653-9)고 발표하였으나, 다른 한 그룹은 발현되지 않는다 (Inukai et al.,2005.Biochem.Biophys.Res.Comm.,328-484-90))고 발표하였다.

이러한 치명적인 단점을 극복하는 대안으로서, 지방세포를 이용하는 연구에 있어서 최근 주목을 받고 있는 것이 사람의 중간엽줄기세포(human mesenchymal ctem cell)이다. 사람의 중간엽줄기세포는 일반적으로 지방전구세포를 지방세포로 분화시키는 데 사용되는 방법과 유사한 방법을 이용하여 지방세포로 분화시킬 수 있기 때문에(Xu et al., 2006, Exp. Cell Res, 312, 1856-1864), 지방세포 분화 연구에 널리 이용되고 있다(Pittenger et al., 1999, Science, 284, 143-146). 이러한 중간엽줄기세포는 지방세포 뿐만 아니라 연골세포, 뼈세포 등의 다른 유형의 세포로도 분화될 수 있음이 공지되어 있으며(Meirelles et al., 2006, J. Cell Sci., 119, 2204~2213), 신체의 대부분의 조직에 분포되어 있다.

이에 본 발명자들은 지방조직을 이루는 지방세포의 분화를 촉진함으로써 근본적으로 피부의 불륨감과 탄력을 증가시켜 줄 수 있는 활성 성분을 개발하기 위해 녹차의 카테친 성분에 대해서 연구 및 검토한 결과, 여러 가지 녹차 성분 중에서 (-)카테친, (-)에피카테친 갈레이트 및 (-)갈로카테친이 지방세포의 분화를 효과적으로 촉진하는 것을 발견하였으며, 중간엽줄기세포에 처리한 결과, (-)카테친, (-)에피카테친 갈레이트 및 (-)갈로카테친에 의해 중간엽줄기세포가 지방세포로 분화하는 것을 효과적으로 촉진하며, 아디포넥틴의 발현을 증가시킴을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

이에 본 발명의 목적은 (-)카테친, (-)에피카테친 갈레이트 및 (-) 갈로카테친에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미용, 성형용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (-)카테친, (-)에피카테친 갈레이트 및 (-)갈로카테친에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 제 2형 당뇨 및 당뇨합병증의 예방 및 당뇨병 치료개선용 의학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 (-)카테친, (-)에피카테친 갈레이트 및 (-)갈로카테친의 용도에 관한 것이다.

보다 상세하게는 (-)카테친, (-)에피카테친 갈레이트 및 (-)갈로카테친에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미용, 성형용 조성물에 관한 것이다.

또한, (-)카테친, (-)에피카테친 갈레이트 및 (-)갈로카테친에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 제 2형 당뇨 및 당뇨합병증의 예방 및 당뇨병 치료개선용 의학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명자들은 중간엽줄기세포에 (-)카테친, (-)에피카테친 갈레이트 및 (-)갈로카테친을 처리하였을 때, 지방세포 분화가 촉진된다는 것을 밝혔다.

이에 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

인간의 골수 중간엽줄기세포(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBM-MSCs)를 지방세포 분화로 분화 유도시에 (-)카테친(C), (-)에피카테친(EC), (-)에피카테친 갈레이트(ECG), (-)에피갈레이트카테친(EGC), (-)에피갈로카테친 갈레이트(EGCG), (-)카테친갈레이트(CG), (-)갈로카테친(GC), (-)갈로카테친 갈레이트(GCG) 및 트로글리타존 (troglitazone), 글리벤클라마이드 (Glibenclamide) (Sigma-aldrich, U.S.A로부터 구입) 각각을 10일 동안 이틀 간격으로 처리한 후 지방세포 내의 지질체를 염색하여 500nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이 다른 카테친류와 달리, 특히 (-)카테친, (-)에피카테친 갈레이트 및 (-) 갈로카테친 10 mM에서 지방세포의 분화를 촉진하였다 (P value < 0.01).

상기 지방조직의 증가 효과로는 미용 또는 성형 목적의 지방조직 증가 효과가 있으나, 이로 한정되지는 않는다. 상기 지방세포 분화는 동물, 바람직하게는 포유동물의 지방전구세포 또는 중간엽줄기세포의 지방세포 분화이고, 보다 바람직하게는 인간의 중간엽줄기세포의 지방세포 분화이며, 가장 바람직하게는 인간의 골수로부터 유래한 중간엽줄기세포이다.

아디포넥틴은 지방세포에서만 분비되는 대표적인 단백질 호르몬으로 인슐린의 민감도(insulin sensitivity)를 증가시켜주는 기능을 하는 것으로 당뇨병을 앓고 있는 환자들에게 당뇨병의 진전을 억제해주는 것으로, 인간의 골수 중간엽줄기세포에서 분비되는 아디포넥틴의 양에 대한 (-)카테친의 효과를 알아보기 위해 지방세포 분화 촉진에 따라 배양액으로 분비되는 지방세포 분화 촉진의 지표인 아디포넥틴의 양을 측정하였다.

상기 동일한 유도방법으로 분화된 지방세포에 (-) 카테친을 농도별로 처리(A)하였으며, (-)에피카테친(EC), (-)에피카테친 갈레이트(ECG), (-)에피갈레이트카테친(EGC), (-)에피갈로카테친 갈레이트(EGCG), (-) 카테친갈레이트(CG), (-)갈로카테친(GC), (-)갈로카테친 갈레이트(GCG)의 경우 10mM 씩 각각 처리 (B)하였다. 아디포넥틴의 분비량을 측정하기 위해 지방 분화 10일째에 세포 배양 배지를 채취한 후, 아디포넥틴 ELISA Kit(R&D systems, cat. No. DY1065)를 이용하여 아디포넥틴의 양을 정량하였다.

그 결과, 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 당뇨병 치료제로 사용되는 트로글리타존 (troglitazone), 글리벤클라마이드(Glibenclamide)처럼 (-)카테친의 농도가 증가함에 따라 아디포넥틴의 분비량이 증가하였다. 각 데이터 값은 IDX (-) 음성 대조군으로 보정하였다 (도3A : 값이 커서 로그 스케일로 변환). 또한, (-)에피카테친 갈레이트 또는 (-)갈로카테친이 다른 카테친류에 비해 상대적으로 많게 아디포넥틴을 분비하는 것을 확인하였다(도 3B). 이 결과로부터, (-)카테친, (-)에피카테친 갈레이트 또는 (-)갈로카테친이 인간의 골수 중간엽줄기세포의 지방 분화 과정에서 지방 분화의 대표적 지표인 아디포넥틴의 분비량을 증가시킨다는 것을 발견하였다.

또한 상기 (-)카테친의 지방세포 분화 촉진효과를 정량적으로 알아보기 위하여 상기 동일한 유도방법으로 분화된 지방세포에 (-)카테친을 농도별로 처리하여 지방세포 분화정도를 조사한 결과, 사람 중간엽줄기세포의 지방세포 분화는 키메린의 농도가 높은 실험군에서 지방세포 분화 촉진효과가 더 높은 것을 확인할 수 있었으며, 이 결과로부터, (-)카테친이 사람 중간엽줄기세포의 지방세포 분화를 용량 의존적으로 촉진한다는 것을 확인할 수 있다.

마지막으로 (-)카테친에 의해 지방세포 분화가 촉진될 때 지방세포 분화와 관련된 표지마커 유전자의 발현이 증가된다는 것을 확인하였다. 즉, 지방세포 관련 유전자인 리포단백리파아제(Lipoprotein lipase, LPL), 지방산 결합 단백질 4(FABP4), 아디포넥틴(adiponectin)의 전사 수준이 증가된다는 것을 확인하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 결과로부터, (-)카테친이 지방세포 관련 유전자들이 관여하는 세포 내 특정 기전을 조절하여 지방세포 분화를 촉진시킴을 확인하였다.

이에, 본 발명은 (-)카테친, (-)에피카테친 갈레이트 및 (-)갈로카테친에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 지방세포 분화를 촉진하기 위한 의학적 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 피하지방층에서 지방세포로의 분화를 촉진함으로써 피부의 탄력과 볼륨감을 동시에 제공할 수 있으며 또한, (-)카테친, (-)에피카테친 갈레이트 및 (-)갈로카테친은 노화되고 탄력을 잃은 피부를 위한 새로운 개념의 피부 노화 방지 기능 및 탄력 증진 기능의 효능을 위해서도 적용 가능하다. 하지만 이러한 효능은 신체의 특정 피하지방층에만 국한되는 것은 아니라 지방층이 많은 여성의 가슴 부위를 포함할 수 있어 미용 및 성형 목적의 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다. 또한, 상기의 지방세포 분화 촉진 효능으로 인한 피부 외용제 조성물의 적용 부위는 신체의 모든 지방 조직을 포함하며, 특정 부위에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 피부 외용제 조성물로서 사용될 경우, 전체 조성물에 대하여 0.0001 내지 5중량%로 함유되는 것으로 신체 부위에 따라 그 제형에 있어서 특별히 한정되지 않는다. 구체적으로 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 젤 또는 피부 점착 타입 화장료의 제형을 갖는 화장료 조성물일 수 있으며, 또한 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 경피 투여형 제형일 수 있다.

또한 각 제형의 외용제 조성물에 있어서 상기한 본 발명의 (-)카테친 이외의 다른 성분들은 기타 피부 외용제의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 이 경우 선택적으로 의학적 효과의 약효를 증진시키기 위한 성분을 포함할 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, (-)카테친, (-)에피카테친 갈레이트 및 (-)갈로카테친에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미용, 성형용 및 당뇨병 예방 또는 치료용 의학적 조성물은 인간의 골수 중간엽줄기세포의 지방세포 분화를 촉진하여 피부의 볼륨 및 탄력을 증진시키고, 주름 및 피부처짐을 개선하며, 함몰부위를 성형을 통해 복구하도록 함으로써 미용에 효과적일 뿐만 아니라 당뇨병을 개선할 수 있는 인슐린 민감도를 증가시키는 아디포넥틴 발현을 촉진하여 제 2형 당뇨 및 당뇨합병증의 병 예방 및 당뇨병 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 (-)카테친(C), (-)에피카테친 갈레이트(ECG) 및 (-) 갈로카테친(GC)에 관한 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 (-)카테친(C), (-)에피카테친 갈레이트(ECG), (-)에피갈레이트카테친(EGC), (-)갈로카테친(GC) 및 다양한 카텐친류와 트로글리타존 (troglitazone), 글리벤클라마이드(Glibenclamide) 각각 10mM 처리 후 지방세포로의 분화 진행 정도를 오일레드오 염색(ORO staining)을 하여 정량적으로 측정하여 나타낸 것이다.
도 3 은 (-)카테친 1, 3, 10mM 를 농도별 처리 후 아디포넥틴 단백질의 발현양과 다양한 카테친류의 처리에 따른 아디포넥틴 단백질 발현량의 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 (-)카테친 1, 3, 10mM 농도별 처리 후하여, 지방세포 분화 촉진 효능을 현미경 사진과 이들의 결과를 오일레드오 염색 (ORO staining)을 통해 정량적으로 측정하여 나타낸 것이다.
도 5는 사람 중간엽줄기세포인 대조구와 (-)카테친 10mM의 농도로 처리한 후 표지마커 아디포넥틴(A), FABP4(B), LPL(C) 대한 역전사 중합 효소 연쇄반응의 결과이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것을 아니다.

실시예 1: 인간의 골수 중간엽줄기세포 배양 및 (-)카테친, (-)에피카테친 갈레이트 또는 (-)갈로카테친의 특이적인 지방세포 분화 촉진 효과 확인

인간의 골수 중간엽줄기세포(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBM-MSCs)를 론자사(Lonza, Inc. Walkersbille, MD, USA)에서 구입하여 론자사의 지침서에 따라 배양하였다. 지방세포 분화는 인도메타신(indomethacin) 대신 트로글리타존(troglitazone, TRO)을 사용하여 중간엽줄기세포의 지방세포 분화를 유도한 점을 제외하고는 론자사에서 권장하는 방법을 사용하여 진행하였다. 구체적으로, 중간엽줄기세포의 배양액에 인슐린 1mg/ml, 덱사메타손 (dexamethasone, DEXA) 1mM, 이소부틸메틸잔틴 (isobutylmethylxanthine, IBX) 0.5mM 및 TRO 2mM을 넣고 배양하여 중간엽줄기세포를 지방세포로 분화시켰다. 실험군의 경우, 지방세포 분화 유도시에 (-)카테친(C), (-)에피카테친(EC), (-)에피카테친 갈레이트(ECG), (-)에피갈레이트카테친(EGC), (-)에피갈로카테친 갈레이트(EGCG), (-)카테친갈레이트(CG), (-)갈로카테친(GC), (-)갈로카테친 갈레이트(GCG) 및 트로글리타존 (troglitazone), 글리벤클라마이드 (Glibenclamide) (Sigma-aldrich, U.S.A로부터 구입) 각각 10mM 처리 후 (10일 동안 이틀 간격으로 처리) 각각 10mM을 배지에 첨가하였다.

중간엽줄기세포의 지방세포 분화 유도 10일 후, 세포 배양액을 제거하고 인산염완충용액(phosphate buffered saline, PBS)으로 세포를 세척한 뒤, 10% 포르말린/PBS 용액 0.2ml/cm²을 사용하여 세포를 10분간 고정시켰다. 고정된 세포를 60% 이소프로판올 용액 0.5ml/cm²로 1회 세척하고, 오일레드오(Oil Red O)를 60% 이소프로판올에 녹인 염색액 0.2ml/cm²로 10분간 지방세포 내의 지질체를 염색하였다. 염색된 오일레드오를 100% 이소프로판올 용액으로 용출시킨 후, 500nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다 (도 2). 각 데이터 값은 IDX (-) 음성 대조군으로 보정하였다. 도2에서 볼 수 있는 바와 같이 다른 카테친류와 달리, 특히 (-)카테친, (-)에피카테친 갈레이트 및 (-) 갈로카테친 10 mM에서 지방세포의 분화를 촉진하였다 (P value < 0.01).

실시예 2: 인간의 골수 중간엽 줄기세포에서 분비되는 아디포넥틴의 양에 대한 (-)카테친의 효과

아디포넥틴은 지방세포에서만 분비되는 대표적인 단백질 호르몬으로 인슐린의 민감도(insulin sensitivity)를 증가시켜주는 기능을 하는 것으로 당뇨병을 앓고 있는 환자들에게 당뇨병의 진전을 억제해주는 것으로 알려져 있다. 이에 지방세포 분화 촉진의 지표인 아디포넥틴을 측정하는 것은 중요한 의미를 지니므로, 지방세포 분화 촉진에 따라 배양액으로 분비되는 양을 측정하였다.

상기 실시예 1에서와 같이 중간엽줄기세포로부터 지방세포의 분화를 유도하며, (-) 카테친 (1, 3, 10mM) 을 농도별로 처리(A)하였으며, (-) 에피카테친(EC), (-)에피카테친 갈레이트(ECG), (-)에피갈레이트카테친(EGC), (-) 에피갈로카테친 갈레이트(EGCG), (-)카테친갈레이트(CG), (-)갈로 카테친(GC), (-)갈로카테친 갈레이트(GCG)의 경우 10mM 씩 각각 처리 (B)하였다.

아디포넥틴의 분비량을 측정하기 위해 지방 분화 10일째에 세포 배양 배지를 채취한 후, 아디포넥틴 ELISA Kit(R&D systems, cat. No. DY1065)를 이용하여 아디포넥틴의 양을 정량하였다. 아디포넥틴 ELISA Kit를 이용한 구체적인 측정 방법은 다음과 같다. Capture antibody를 96well plate 에 반응 시키고, washing buffer로 씻은 후 sample을 가해 상온에서 2시간 동안 반응시킨다. 그 후 각 단계를 넘어갈 때 마다 3번씩 washing 을 하면서, detection antibody, HRP enzyme, substrate solution, stop solution을 차례로 가하고 protocol에 제시된 시간만큼 반응시킨다. 최종 반응 후 Spectrophotometer 를 이용하여 450nm 의 파장에서 흡광도를 측정한다.

도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, IDX를 처리하여 지방세포 분화를 유도한 경우, IDX 처리군에 비해 당뇨병 치료제로 사용되는 트로글리타존 (troglitazone)(2 mM), 글리벤클라마이드 (Glibenclamide) (10mM)처럼, 1, 3, 10mM 의 농도별에 따라 (-)카테친이 처리된 실험군에서 아디포넥틴의 분비량이 증가하였다. 각 데이터 값은 IDX (-)음성 대조군으로 보정하였다 (도3A:값이 커서 로그 스케일로 변환). 또한, (-)에피카테친 갈레이트 또는 (-)갈로카테친이 다른 카테친류에 비해 상대적으로 많게 아디포넥틴을 분비하는 것을 확인하였다 (도 3B). 이 결과로부터, (-)카테친, (-)에피카테친 갈레이트 및 (-) 갈로카테친이 인간의 골수 중간엽줄기세포의 지방 분화 과정에서 지방 분화의 대표적 지표인 아디포넥틴의 분비량을 증가시킨다는 것을 발견하였다.

실시예 3: (-)카테친의 인간 중간엽줄기세포의 지방세포 분화 촉진 효과의 정량적 측정

실시예 1에서와 같이 중간엽줄기세포로부터 지방세포의 분화를 유도하되, (-)카테친 1, 3, 10mM 의 농도별로 처리하였다. 지방세포 분화 정도를 측정하기 위해, 실시예 1에서와 같이 지방세포를 오일레드오로 염색한 후, 이어서, 헤마톡실린(hematoxylin)으로 재염색을 하여 세포핵을 쉽게 구분할 수 있도록 한 후, 현미경으로 관찰하였다(도 4A). 아울러, 일부 염색된 오일레드오를 100% 이소프로판올 용액으로 용출시킨 후, 500nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다 (도 4B). 예상했듯이, (-)카테친에 의해 농도별로 지방세포 분화가 촉진되었다. 각 데이터 값은 IDX (-) 음성 대조군으로 보정하였다.

실시예 4: 지방세포 분화와 관련된 유전자들의 발현 수준에 대한 (-)카테친의 효과

실시예 1에서 확인한 바와 같이, (-)카테친에 의해 인간의 골수 중간엽줄기세포의 지방세포 분화가 촉진될 때, 지방세포 분화와 관련된 유전자들의 발현 패턴을 조사하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 중간엽줄기세포를 지방세포로 분화 유도하여 (-)카테친을 10mM의 농도로 7일간 처리 한 후, 트리졸 시약(Trizol reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포 내의 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 키아젠사의 RNA 키트(QIAGEN RNeasy kt, QIAGEN, Valencia, CA)로 한번 더 정제한 후, 애질런트사의 바이오어낼라이저 2100 모델 기기(Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 RNA의 질(quality)을 확인하였다. 인비트로젠사의 역전사키트(Superscript Reverse Transcriptase (RT) kit, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하였고, 이를 실시간 역전사 중합 효소 연쇄반응(real time-reverse transcription polymerase chain reaction, Q-RT-PCR)을 통해 정량적으로 분석하였다. 중간엽줄기세포의 지방세포 분화 촉진 시, 하기 지방세포 분화 관련 유전자의 발현 패턴 변화를 어플라이드바이오시스템사의 택맨 유전자 발현 시스템(TaqMan gene expression assay kit, Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 평가하였다. 지방세포 분화와 관련하여 발현패턴을 살펴본 유전자는 LPL (Lipoprotein lipase-Hs00173425_m1), 아디포넥틴(Hs00605917_m1), FABP4(Fatty acid binding protein-Hs00609791_m1)이다.

그 결과, 10mM의 (-)카테친을 처리하였을 때, 지방세포 관련 유전자인 LPL, 아디포넥틴(adiponectin)의 전사수준이 유의적으로 증가하였다(도 5). 도 5에 나타난 결과로부터, (-)카테친이 지방세포 관련 유전자들이 관여하는 세포 내 특정 기전을 조절하여 지방세포 분화를 촉진시킴을 확인하였다.

Claims

(-)카테친, (-)에피카테친 갈레이트 및 (-)갈로카테친 중 적어도 하나 이상을 포함하는 중간엽줄기세포의 지방세포 분화 촉진제.
제1항에 있어서,
상기 중간엽줄기세포는 인간 골수 유래인 지방세포 분화 촉진제.