KR20150057584A - 바실러스 메틸로트로피쿠스 sci 균주 배양액을 이용하여 닭 내장을 사료로 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 우수한 단백질 분해효소를 생산하는 신규한 바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주를 배양한 배양액을 첨가하여 가금도축부산물인 닭 내장을 분해하여 동물성 사료를 제조하는 방법에 관한 것이다. 이를 위해 본 발명은 도계장에서 분리, 이송된 닭 내장을 반응기에 투입하고 증자하는 단계; 증자한 닭 내장을 배출시켜 방냉하는 단계; 닭 내장에 바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주 배양액을 첨가하는 단계; 혼합하면서 반응시켜 반응액을 수득하는 단계; 반응액을 방냉한 후 여과하여 여과액을 수득하는 단계; 여과액을 감압농축하여 농축액을 수득하는 단계; 농축액에 항산화제 및 항균제를 투입한 후 예비가열하는 단계; 및 열풍으로 분무건조하여 건조물을 수득하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주 배양액을 이용하여 닭 내장을 사료로 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 가축의 성장 촉진에 우수한 효과가 있는 동물성 사료를 제조할 수 있을 뿐만 아니라 어분 수입을 대체하고 국제 어분 수급 안정화에 기여할 수 있는 뛰어난 경제적 효과가 있다.

Description

바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주 배양액을 이용하여 닭 내장을 사료로 제조하는 방법{MANUFACTURING METHOD OF FEED WITH CHICKEN GIBLETS USING CULTURE FLUID OF BACILLUS METHYLOTROPHICUS SCI}

본 발명은 우수한 단백질 분해효소를 생산하는 신규한 바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주를 배양한 배양액을 이용하여 가금도축부산물인 닭 내장을 효율적으로 분해함으로써 가축의 성장 촉진에 우수한 효과가 있는 동물성 사료 원료를 제조하는 방법에 관한 것이다.

생산되는 식량 중에 상당량이 동물의 사료로 이용되고 인간과 동물사이에 식량을 두고 원초적인 치열한 경쟁을 벌여야할지도 모른다. 결국 전 세계적으로 고갈되어가고 있는 에너지와 단백질 자원 문제를 어떻게 해결할 것인가가 우리 앞에 던져진 원천적인 문제이며 해결해야할 과제이다.

이러한 문제를 해결하기 위해 그 동안 부존자원개발이라는 미명하에 많은 연구와 정책도 있었지만 시간이 지나고 나면 늘 원점에 서있는 듯한 참담함이 있었던 것도 사실이다. 이로 인하여 자원부족과 환경오염이라는 큰 문제에 당면하게 되었는데, 이는 영양자원을 단순히 사용하고 버리는 소비재로 생각하는 그릇된 습관에서 비롯된다. 영양자원은 단순소비재가 아니라 모든 생명체가 공유하며 순환시켜야 하는 무한자원인 것이다.

동물성 사료는 식물성 사료와는 달리 단백질 공급 능력이 높고 영양적인 측면에서도 아미노산 조성이 우수하여 고급 단백질 식품을 생산하는데 효율적인 사료자원이다.

현재 국내에서 생산되고 공급되고 있는 동물성 사료는 어분을 대표로 하여 육골분, 수지박, 우모분, 가금도축부산물, 혈분, 단세포 단백질 등이 있으나 최근 배합사료 생산량 증가와 원료공급능력 감소로 동물성 단백질 사료의 국내 생산량과 사용량이 감소하고 있다.

여기에 광우병 발생으로 동물성 단백질 사료의 동물 급여에 대한 부정적 시각이 확대되면서 유럽에서는 반추동물뿐만 아니라 비반추동물에까지 영향을 미치고 있어 동물성 단백질 사료의 자원적 가치가 심각하게 위협을 받고 있다.

다행히 우리나라에서는 광우병이 발생하지 않아 비반추동물에 동물성 사료를 급여하는데 대한 영향은 아직 크게 미치지 않고 있지만 축산물 소비자들의 입장에서는 경계심을 늦추지 않고 있어 단백질 자원의 확보는 더욱 어려워지고 있다.

더욱이 유럽을 중심으로 식물성 단백질 자원의 수요가 급증하면서 이마저 가격이 폭등하고 있어 새로운 단백질 사료 자원 개발에 대한 요구가 계속 높아지고 있다.

국내산 어분은 대략 13개사에서 연간 약 4만 톤을 생산하고 외국산 어분은 대략 17개국에서 연간 5만 톤을 수입하고 있다. 배합사료의 주원료인 어분의 가격 급등 및 품귀 현상으로 인해 세계 각국이 수산용 및 축산용 어분 확보를 위해서 경쟁하고 있으며 앞으로도 지속적으로 가격이 상승할 것으로 전망되고 있어 국제 어분 수급 안정화를 위한 대책이 시급이 마련되어야한다.

실제로 지난 2005년 어분 가격은 톤당 699~733달러에서 1,805~1,989원으로 5년 동안 300% 이상이 인상되어 평균 60%씩 상승해오고 있다.

연간 도계물량은 7억 5천 만수/년(농림수산식품부 2010년)으로 이를 중량으로 환산하면 135만 톤이며 발생되는 폐기물량(전체무게의 27.49%)은 370만 톤으로 추산된다. 수분(약 70%)을 제거한 건물 양을 추산했을 때 111만 톤이며, 단백질 원료로 환산하면 대략 73만 톤이다. 이를 아미노산으로 분해하여 추출하면 50만 톤이 사료 자원화 될 수 있다.

돼지는 돈모와 제각에서 발생되는 폐기물 양(0.1%)이 154만 톤으로 이를 이용하여 아미노산을 추출하면 10,046톤을 생산할 수 있다. 이를 현재 어분 수입 가격으로 환산하면 1조 4천억 원의 경제적 가치가 발생된다.

한편, 대한민국 공개특허 제10-2009-0114905호(2009. 11. 04 공개)에는 돼지 분뇨의 액비화를 촉진시키고 각종 악취의 제거능력이 우수한 바실러스 리케니포미스 EDS-2가 개시되어 있으며, 대한민국 공개특허 제10-2010-0054497호(2010. 05. 25 공개)에는 바실러스 리케니포미스 CMS-1 미생물을 유효성분으로 함유하는 가축분뇨 액비화 및 오폐수 처리용 미생물 제제가 개시되어 있다.

그러나 상기 기술들은 상온에서 가축분뇨를 액체비료로 제조하는 것을 목적으로 하고 있어 고온에서 가금도축부산물 등의 단백질원을 분해하여 사료로 활용하는 데에는 그대로 적용하기 어려운 문제가 있다. 이 밖에 국내에서도 단백질 분해효소를 고효율로 생산하는 균주를 탐색하여 가금도축부산물을 사료화하기 위한 연구가 진행되어 왔지만 아직 그 결과가 미미한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 인식하여 고온 분해를 기초로 하는 가금도축부산물 등의 단백질원 분해능력이 우수한 단백질 분해효소를 생산하는 균주를 분리 동정하고 이를 이용하여 가금도축부산물인 닭 내장을 사료화하는 새로운 가공처리방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 단백질 분해능력 및 열 저항성이 우수한 단백질 분해효소를 생산하는 신규한 미생물의 배양액을 이용하여 수분을 다량 함유하고 있을 뿐만 아니라 이물질 유입 등으로 쉽게 부패, 변질될 가능성이 높아 활용이 어려웠던 가금도축부산물인 닭 내장을 효율적으로 분해함으로써 가축의 성장 촉진에 우수한 효과가 있는 동물성 사료 원료를 제조할 수 있는 새로운 가공처리방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위해 본 발명은, 도계장에서 분리, 이송된 닭 내장을 반응기에 투입하고 100℃에서 2시간 동안 증자하는 단계; 상기 반응기로부터 증자한 닭 내장을 배출시켜 60℃가 될 때까지 강제 방냉하는 단계; 상기 방냉된 닭 내장에 바실러스 메틸로트로피쿠스(Bacillus methylotrophicus) SCI 균주(수탁번호 KFCC11557P)를 배양한 배양물을 첨가하는 단계; 상기 배양액 첨가 후 55℃ 내지 75℃에서 혼합하면서 30분 내지 2시간 동안 반응시켜 반응액을 수득하는 단계; 상기 반응액을 15℃ 내지 25℃로 방냉한 후 30메쉬 프레스 필터로 여과하여 여과액을 수득하는 단계; 상기 여과액을 감압농축하여 농축액을 수득하는 단계; 상기 농축액에 항산화제 및 항균제를 투입한 후 60℃로 예비가열하는 단계; 및 상기 예비가열 후 160℃ 내지 195℃의 열풍으로 분무건조하여 건조물을 수득하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주 배양액을 이용하여 닭 내장을 사료로 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은, 상기 균주는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 16s rDNA를 갖는 것을 특징으로 하는 바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주 배양물을 이용하여 닭 내장을 사료로 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은, 상기 배양액은 닭 내장 중량의 0.2% 내지 0.4%의 비율로 첨가하는 것을 특징으로 하는 바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주 배양액을 이용하여 닭 내장을 사료로 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은, 상기 감압농축은 -1.2 bar의 압력으로 2~4시간 동안 진행하여 상기 농축액의 수분 및 고형분의 중량비를 6 대 4로 조절하는 것을 특징으로 하는 바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주 배양물을 이용하여 닭 내장을 사료로 제조하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은, 상기 방법에 의하여 제조된 건조사료를 제공한다.

신규한 미생물인 바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주는 고온에서도 가금도축부산물인 닭 내장을 분해할 수 있을 뿐만 아니라 트립신 억제제를 제거하여 단백질성 영양분을 효율적으로 분해할 수 있다. 따라서, 상기 균주의 배양액을 이용하여 수분을 다량 함유하고 있을 뿐만 아니라 이물질 유입 등으로 쉽게 부패, 변질될 가능성이 높아 종래 활용이 어려웠던 가금도축부산물인 닭 내장을 처리하면 가축의 성장 촉진에 우수한 효과가 있는 동물성 사료를 제조할 수 있으므로, 본 발명은 산업적 용도로 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라 어분 수입을 대체하고 국제 어분 수급 안정화에 기여할 수 있는 뛰어난 경제적 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 닭 내장을 사료로 제조하는 방법을 보여주는 전체 공정도,
도 2는 닭 내장을 사료로 제조하는 방법의 공정 순서도,
도 3은 돼지에 대한 사양 실험을 위한 T-cannula 수술 모습(A) 및 장착 모습(B)의 사진,
도 4는 가금도축부산물을 사료화한 기존 제품(C)과 바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주가 생산하는 단백질 분해효소로 가수분해한 것(D)을 외관상 비교한 사진,
도 5는 가금도축부산물을 사료화한 기존 제품(E)과 바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주가 생산하는 단백질 분해효소로 가수분해한 제품(F)을 물에 용해시켜서 용해도를 비교한 사진,
도 6은 MALDI-TOF를 이용하여 바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주가 생산하는 단백질 분해효소로 가수분해한 닭 내장 사료의 분자량을 측정한 결과,
도 7은 펩신 소화율을 조사한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 8은 바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주의 16S rDNA 서열에 의해 유사종과의 유연관계를 분석한 결과이다.

이하, 바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주 배양액을 이용하여 닭 내장을 사료로 제조하는 방법을 상세히 설명하면 다음과 같다.

도 1은 본 발명에 따른 닭 내장을 사료로 제조하는 방법을 보여주는 전체 공정도이고, 도 2는 닭 내장을 사료로 제조하는 방법의 공정 순서도이다.

먼저, 본 발명에 따른 닭 내장을 사료로 제조하는 방법은, 크게 증자단계, 방냉단계, 배양액 첨가단계, 가수분해(반응액 수득)단계, 여과단계, 농축단계, 항산화제/항균제 투입 및 예비가열단계, 분무건조단계로 이루어진다.

먼저, 증자단계는 도계장에서 분리, 이송된 닭 내장을 반응기에 투입하고 100℃에서 2시간 동안 증자하는 단계이다. 원료인 닭 내장은 도계장에서 분리된 직후 1톤 케미콘 통에 신속히 옮겨 담고 냉동 탑차를 이용하여 공장으로 이송한다. 공장에서는 이송된 닭 내장을 반응기에 투입하고 증자를 실시한다. 증자는 반응기의 온도를 100℃ 이상으로 상승시킨 후 2시간 동안 정치하여 이루어진다. 증자과정에서 닭 내장에 함유된 기름(지방성분)과 물이 자연적으로 유출된다.

방냉단계는 증자가 완료된 후 반응기로부터 증자한 닭 내장을 배출시켜 적절한 온도가 될 때까지 냉각하는 단계이다. 증자가 끝나면 닭 내장과 닭 내장으로부터 유출된 물 등을 반응기의 드레인 밸브를 통해 배출시킨 후 60℃가 될 때까지 신속히 강제로 냉각시킨다.

배양액 첨가단계는 방냉된 닭 내장에 단백질 가수분해용 조성물인 바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주(수탁번호 KFCC11557P)를 배양한 배양액을 첨가하는 단계이다.

바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주는 본 발명자들이 경상남도 합천군의 야적 두엄에서 분리한 것으로 단백질 분해능력이 뛰어나며 100~110℃에서 일정 시간 열처리를 하여도 활성이 떨어지지 않는 열 저항성이 우수한 단백질 분해효소를 생산하는 것을 특징으로 한다. 상기 균주는 그람 염색과 카탈라제 검사, 포자 염색을 통하여 바실러스 균으로 확인되었으며, 16S rDNA 염기서열 분석을 통하여 동정한 결과 바실러스 메틸로트로피쿠스로 밝혀져 바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI로 명명되었고, 출원인에 의해 2013년 8월 29일 한국미생물보존센터에 기탁되었다(수탁번호 KFCC11557P).

바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 16S rDNA를 갖는다.

상기 균주는 35~40℃의 온도 범위에서 성장이 가장 왕성하며, 배양 후 약 44시간 이후에 단백질 분해효소의 생산량이 최고치에 달하며, 균주가 생산하는 단백질 분해효소는 50~80℃의 온도 범위에서 높은 활성을 나타내고, 가장 높은 활성을 나타내는 70℃에서는 pH 9~12의 범위에서 90% 이상의 활성적 역가를 나타내고, pH 11에서 가장 활성적인 역가를 나타낸다.

또한, 균주가 생산하는 단백질 분해효소는 100~110℃의 온도에서 30분간 열처리를 하여도 효소 활성이 떨어지지 않는 특징을 가지며 트립신 억제제(trypsin inhibitor) 제거능도 우수하므로 고온 분해를 기초로 하는 닭 내장 등의 가금도축부산물인 단백질원을 효율적으로 분해하여 가축의 성장 촉진에 우수한 효과가 있는 동물성 사료를 제조할 수 있다.

실험 결과에 따르면 균주가 생산하는 단백질 분해효소를 닭 내장 중량의 0.1% 첨가할 경우 원물의 가수분해율이 65%에 불과하나, 0.2% 이상 첨가하여 반응시킬 경우에는 가수분해율이 83% 이상으로 우수하므로, 바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주를 배양한 배양액은 닭 내장 중량의 0.2% 내지 0.4%의 비율로 첨가하는 것이 바람직하다.

가수분해(반응액 수득)단계는 닭 내장에 배양액을 첨가한 후 55℃ 내지 75℃의 온도에서 약 30rpm 수준으로 교반하여 닭 내장과 배양액을 혼합하며 반응(가수분해)시키는 단계이다. 반응(가수분해)은 약 30분 내지 2시간 동안 진행되며, 이로써 반응액(가수분해액)을 수득한다.

여과단계는 수득한 반응액(가수분해액)을 여과하여 분해가 불완전한 입자가 큰 고형물과 이물질 등을 제거하는 단계로, 반응액을 상온, 즉 15℃ 내지 25℃로 강제 방냉한 후 30메쉬 프레스 필터를 통과시켜 여과액을 수득한다.

농축단계는 여과액을 감압농축하여 농축액을 수득하는 단계이다. 감압농축은 -1.2 bar의 압력으로 2~4시간 동안 진행하여 농축액의 수분 및 고형분의 중량비율을 6 대 4로 조절하여 맞춘다(수분 함량 60중량%, 고형분 함량 40중량%).

감압농축이 완료된 농축액에는 사료첨가제인 항산화제와 항균제를 적정량 투입하여 혼합한 후, 분무건조에 들어가기 전에 예비가열을 실시한다(항산화제/항균제 투입 및 예비가열단계). 예비가열은 약 60℃의 온도에서 실시하는 것이 바람직하다.

예비가열 후에는 농축액을 다시 160℃ 내지 195℃의 열풍으로 분무건조하여 건조물을 수득한다(분문건조단계).

분무건조가 완료된 건조물(건조사료)은 저장조로 이송되어 보관되며, 시판에 앞서 필요에 따라 적절한 무게 단위로 포장된다.

이하, 본 발명을 아래 실험예에서 상세히 설명하지만 본 발명의 보호범위가 하기 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실험예

실험예 1 : 단백질 분해효소 생산 미생물의 분리 및 동정

본 발명에 사용된 균주는 경남 합천군 주위의 야적 두엄에서 분리하였으며, 멸균된 수저를 이용하여 일회용 멸균 봉지에 넣어 채집 후, 아이스박스에 담아 실험실에 운반하였다. 채집된 두엄 1g을 멸균수 9㎖에 넣고 충분히 섞어준 후 이 시료를 원액으로 하여 10배씩 희석하여 각각의 멸균된 배지에 접종하고 30℃에서 2일간 배양하였다. 효모 곰팡이, 또는 내산성 균의 배양은 YM agar(Difco) 배지를 사용하였고, 일반 세균의 배양을 위해서는 TSA agar(Difco) 배지를 사용하였다.

단백질 분해효소를 많이 생산하는 균종을 분리할 목적으로 두엄에서 분리된 균주 500여개를 이용하여 단백질 분해능 측정 실험에 이용하였다. Skim milk agar 배지를 이용하여 각각의 분리 균을 도말하고 25℃에서 48시간 동안 배양하여 단백질 분해효소에 의해서 형성된 투명 환을 보이는 균주를 분리하여 이용하였다. 또한 균주의 보관을 위하여 멸균된 Glycerol stock solution을 사용하여 냉동 보관하였으며, 실험은 Extra cellular protease의 활성 유지를 위하여 Skim milk 배지에서 계대 배양하면서 사용하였다.

분리된 균주를 그람 염색과, 카탈라제 검사, 포자 염색을 통하여 바실러스 균으로 확인하였다.

분리된 균주의 16S ribosomal DNA sequencing은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. chromosomal DNA을 Wizard genomic DNA purification kit(Promega, USA)를 이용해 분리한 후 16S rRNA sequencing에 사용하는 universal primer인 27F (5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')와 1492R(5'-GGATACCTTGTTACGACTT-3') primer를 사용하여 MyCycler Thermal Cycler system (Bio-Rad)을 이용해 PCR 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물은 Wizard SV Gel and PCR clean-up system(Promega, USA)을 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 ABI PRISM BigDye™ Terminator Cycle Sequencing kits(Applied Biosystems Co.)를 사용하여 ABI PRISM 3730XL Analyzer(96 capillary type)를 통해 염기서열을 분석 하였다. 그 결과는 BLASTN 프로그램을 이용하여 GENEBANK의 ribosomal DNA sequence와 비교하였으며, sequence의 상동성은 Clustal X 와 Mega 2 program을 이용하여 비교분석하였다. 동정 결과 바실러스 메틸로트로피쿠스로 밝혀져 바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI로 명명되었고, 출원인에 의해 2013년 8월 29일 한국미생물보존센터에 기탁되었다(수탁번호 KFCC11557P). 바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주의 16S rDNA 서열은 서열번호 1에 나타내었고, 도 8은 상기 균주의 16S rDNA 서열에 의해 유사종과의 유연관계를 분석한 결과이다.

실험예 2 : 실험 방법 및 결과 고찰

Ⅰ. 재료 및 방법

1. 재료 구입 및 보관 : 닭 내장은 충청남도 보령시 보령읍에 위치한 사조 산업으로부터 제공받았고 제공받아 사용하기 전까지 냉동시켰다.

2. 조성분 분석 방법 : 일반성분으로서 수분, 조단백질, 조지방, 조회분 및 조섬유는 상용적인 Weende 분석법에 따라 실시되었다. 먼저 조단백질은 Kjeldahl법을 통해 Boric acid법으로 계산하였으며, 조지방은 Soxhlet extractor를 이용하였고 조섬유의 정량은 조지방을 추출한 3g 정도의 시료를 550℃에서 3시간 동안 회화 시킨 후 계산하였다.

3. 광물질 정량 분석 : Ca, K. Na 및 Mg의 함량은 시료분말 약 500㎎을 H₂SO₂-H₂SO₄로 습식 분해하여 무기질화 시킨 후 유도 결합 플라즈마 발광 광도계(ICP Emission Spectrometer) 정성 정량 분석을 하였다. 각 광물질 원소의 표준 용액은 10ppm으로 하여 혼합된 표준 용액의 파장별 분광된 빛의 강도와 시료의 파장별 분광된 빛의 강도를 대비하여 정량하였다. 인은 파장별 표준 용액의 정량에 대한 재현성이 낮아 Ammonium meta vanodate용액을 이용하여 발색한 다음 470㎚에서 흡광도를 측정한 후 표준 곡선을 작성하여 정량하였다.

4. 유해물질 분석 : 유해물질 함유정도를 조사하기 위하여 중금속 원소로서 Cr, Hg, Pb, As, Cd 및 F 등의 정량을 ICP를 이용하여 실시하였다.

5. 전자 공여능

① 시액의 제조

시험 시액을 제조하기 위하여 시료 20g을 증류수 100㎖에 혼합하여 80℃에서 3시간 동안 중탕한다. 이것을 3,000rpm에서 20분간 원심 분리하고 농축하여 최종 20㎖로 제조하여 본 시험에 사용하였다. 대조액으로서 비타민 C를 증류수에 용해하여 사용하였다.

② 시약 제조

0.34㎎ DPPH를 MeOH 100㎖에 용해하여 최종 농도 0.1mM이 되게끔 제조하여 사용하였다.

③ 반응

각각의 시험 시료를 200㎕ 취하여 10㎖ pyrex test tube에 첨가한 후 제조된 DPPH 2㎖ 첨가하여 30분 동안 실온에서 반응시켰다. 반응물을 517㎚에서 흡광도를 측정한 후 아래의 반응공식에 의해서 소거 능을 조사하였다.

④ 공식

소거 능(%) = ( 1 - (시료가 첨가된 것에서 측정된 흡광도 값 DPPH 대신 증류수만 첨가하여 측정된 흡광도 값) / 시료 대신 증류수만 첨가하여 측정된 흡광도 값)×100

6. SDS-PAGE : Gel은 12% Separating gel과 5% Stacking gel을 이용하였고, 시료는 3배 농도의 sample buffer(1M Tris-HCl, pH 6.8, 50% glycerol, 10% SDS, 2-mercaptoethanol, 1% bromphenol blue)와 2:1(w/v)로 섞은 후 끓는 물에서 5분간 가열한 뒤 lane당 3㎍/㎖로 분리하였다. 전기영동은 100volt에서 90분간 시행하였으며 전기영동 후, gel은 Coomassie saining solution(1.0g Coomassie Blue R-250, 450㎖ methanol, 450㎖ H₂O, 100㎖ glacial acetic acid, 800㎖ H₂O)로 20분간 염색하고 Coomassie destaining solution(100㎖ methanol, 100㎖ glacial acetic acid, 800㎖ H₂O)로 적절히 탈색한 후 구성 단백질들의 분포를 비교 분석하였다.

7. Trypsin inhibitor 제거 능 측정 : 표준 단백질 Maker는 Intron(주)에서 구입하여 SDS-PAGE를 이용하여 분석하였다.

8. 평균 펩타이드 길이 측정

① 유리 아미노산중의 평균 펩타이드 길이 측정

알파아미노태 질소(㎍)/가용성 질소(㎍) = 1/평균 펩타이드 길이

② 총 질소 중의 평균 펩타이 길이 측정

알파아미노태 질소(㎍)/총 질소(㎍) = 1/평균 펩타이드 길이

③ 가용성 질소 측정(유리 아미노산 함량 측정)

시료를 곱게 분쇄하여 시료 내 존재하는 지방성분을 제거하기 위하여 5배의 n-hexan을 넣고 실온에서 1시간 동안 교반시키는 과정을 2번 반복하였다. 이렇게 해서 나온 분말을 30mM Tris-HCl(pH 8.0), 1M NaCl과 함께 1:10(W/V) 비율로 섞은 후 실온에서 3시간 동안 단백질 성분을 추출하였다. 이 용액을 4℃, 12,000rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상등액을 사용하기 전까지 20℃에서 보관하였다. 추출된 단백질 2가지 방법을 이용하였다. 첫째로 Bradford method에 근거한 Bio-Rad의 Protein Assay로 정량하였고 표준물질로 BSA를 사용하였다. 두 번째로 Keldhal Method를 이용하여 Crude protein 함량을 정량하였다.

④ 알파 아미노태 질소 함량 측정

시료 5g에 증류수 25㎖를 100㎖ 비이커에 넣어 1시간 동안 교반하여 균질화 시킨 뒤에 0.1N-NaOH로 pH 8.4로 조정하였다. 여기에 미리 pH 8.4로 조정된 36% 포름알데히드액 20㎖을 가한 뒤 pH가 다시 떨어지면 0.1N NaOH용액으로 pH 8.4까지 적정한다. 같은 조작으로 0.1N-NaOH용액의 바탕 시험을 실시하여 다음 식에 따라 아미노태 질소 함량을 구했다.

Amino Nitrogen(%) = ((A-B)×0.0044×F×100)/시료량

Where, A : 0.1N-NaOH용액의 시료 적정량(㎖)

B : 0.1N-NaOH용액의 Blank test(㎖)

F : 0.1N-NaOH용액의 농도 계수(1.008)

9. 분쇄도 측정 : 시료 100g을 단계별로 상하 수직으로 설치되어있는 Sieve에 넣어 1분간 진동시켜 통과되는 율을 계산하였다.

10. Trypsin inhibitor activity 측정 : 시료를 곱게 분쇄하여 시료 내 존재하는 지방성분을 제거하기 위하여 5배의 n-hexan을 넣고 실온에서 1시간 동안 교반시키는 과정을 2번 반복하였다. 이렇게 해서 나온 분말을 30mM Tris-HCl(pH 8.0), 1M NaCl과 함께 1:10(W/V) 비율로 섞은 후 실온에서 3시간 동안 단백질 성분을 추출하였다. 이 용액을 4℃, 12,000rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상등액을 사용하였다. Trypsin standard curve는 Trypsin 30㎎, 90㎎, 150㎎, 210㎎, 270㎎을 각각 0.0025N HCl로 녹여 100㎖이 되도록 채운 후 1㎖을 취하여 activity를 측정하였다.

11. 펩타이드 생성량 측정 : Folin phenol 시약을 이용하여 Tyrosine생성량으로 생성량을 측정하였다.

10배 희석하여 추출한 시료액 0.7㎖에 0.44M TCA(Trichloroacetic acid) 0.7㎖를 첨가하고 37℃ 항온수조에서 30분간 반응시키고 22,250rpm에서 10분간 원심분리하여 침전물을 제거시켰다. 회수된 상등액 1㎖에 0.55M Na₂CO₃ 2.5㎖과 Phenol reagent 0.5㎖을 차례로 넣고 혼합한 후 ELISA Reader(37℃, 30분간 방치) 660㎚에서 측정하였다.

12. 펩신 소화율 : 시료 1g을 정확히 취하여 탈지한 다음 200㎖ 삼각 플라스크에 넣고 0.001%~0.002% 펩신 염산용액 150㎖을 가하고 45℃ 항온 수조에서 흔들어 주면서 16시간 동안 소화시킨 다음 여과지(Whatman No2)로 여과하였다. 불소화물을 온수로 세척하고 불소화물과 여과지를 단백질 분해수기에 넣고 조단백질 함량을 구하고 별도로 시료에 대한 조단백질의 함량도 구한 다음 펩신 소화율을 측정하였다.

펩신 소화율(%) = 〔(A-B)/A〕×100

0.2% 펩신용액을 만드는 방법은 다음과 같다.

①0.075N 염산용액 : HCl(농염산) 6.6㎖를 증류수 1,000㎖로 희석하여 만듦

②0.2% 펩신-염산액 : 2.00g의 펩신 시약(역가 1:10,000)을 칭량하고 0.075N 염산용액 1,000㎖에 녹여 균질화함

13. 펩타이드 분자량 측정 : 가수 분해된 단백질의 펩타이드를 분석하기 위하여 MALDI-TOFF를 이용하였다.

14. 병원성 미생물 검사 : 대장균 군을 검사하기 위하여 MacConkey medium을 이용하였고, 포도상 구균을 검사하기 위하여 Staphylococcus medium을 이용하였으며, Salmonella균을 검출하기 위하여 SS medium을 총 균수를 측정하기 위하여 Standard plate agar를 이용하였다.

15. 가수분해도 측정 : 닭 내장의 가수분해도를 측정하기 위하여 바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주(KFCC11557P)가 생성한 단백질 분해효소를 증류수에 용해한 다음 닭 내장에 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%가 되게끔 첨가하고 온도를 70℃로 올린 다음 30분 단위로 3시간 동안 혼합 교반하면서 시료를 채취하였다. 채취된 시료는 Whatman No. 40을 이용하여 여과한 후 남은 여액을 건조시킨 후 무게를 측정하여 가수분해도를 측정하였다.

16. 돼지에 대한 사양 실험

① 외과적 수술

15㎏ 3원교잡종 [(Landrace × Yorkshire) × Duroc] 이유 자돈 4두를 공시하여 회장과 맹장 인접부의 약 15cm 위치에 T-cannula를 외과적 수술 기법을 이용하여 장착하였다. 수술 전 16~20시간 동안 절식 후 Stresnil(Janssen Pharmaceutica, Belgium)과 Zoletil 50(VirbacS.A,France)을 이용하여 마취 후 수술을 실시하였다. 수술 후 28℃가 유지되는 대사 케이지에 옮겨졌으며, 시험 전 약 7일간의 회복 기간을 거친 후 시험 사료를 급여하였다. 도 3은 돼지에 대한 사양 실험을 위한 T-cannula 수술 모습(A) 및 장착 모습(B)의 사진이다.

② 시험 동물 및 시험설계

시험의 개시 시 체중은 평균 15.82 ±0.64㎏이었다. 시험설계는 1)대두박, 2)어분, 3)가소화양계내장분말(PDCBM) 및 4)가소화돈모분말(PDPBM)처리구로 총 4처리로써 4×4 Latin square 방법으로 실시하였다.

시험사료는 NRC 사양표준(1998)에서 제시한 영양소요구량에 준하여 제조하였으며 각 시험사료 내 조단백질 함량을 일치하여 설계하였다. 시험사료의 영양소 소화율을 측정하기 위하여 사료 내 표시물로 0.2%의 Cr₂O₃을 첨가 배합하였다. 사료급여량은 Armstrong 및 Mitchell(1955)이 제시한 방법에 따라 0.05×BW^{0 . 9}계산하여 1일 2회에 걸쳐(08시, 20시) 급여하였으며, 물은 자유로이 마실 수 있게 하였다.

③ 외관상 전장 소화율 및 회장 소화율 : 건물, 질소 및 에너지

시험사료 교체 시 체중을 측정하여 사료급여량을 설정하였으며, 각 기간 동안 4일간의 적응 기간 후 5~6일째 분을 각각 채취하여 일반성분 소화율을 분석하였고, 7-8일째 회장 소화물을 채취하여 회장 내 일반성분 소화율을 측정하였다. 모든 분석은 AOAC(2000)에 의해 분석하였다.

④ 외관상 전장 및 회장 아미노산 소화율

아미노산 분석은 분 샘플시료 0.25g에 6N HCl 100㎖를 가하여 질소 가스를 주입한 후 밀봉하여 110℃에서 24시간 가수분해시킨 후, 증발농축기(HANSHIN, Korea)로 50℃에서 염산을 증발시켰다. 최종 증발 건조되어 있는 물질을 증류수로 여과하고 sample dilution buffer(SYKAM, Germany) 용액으로 희석하였다. 희석액을 syringe(3㎖), filter(0.45㎛)를 이용하여 filteration한 후 자동아미노산 분석기(SYKAM, Germany)를 이용하여 분석하였다.

⑤ 통계처리

모든 자료는 SAS(2001)의 General Linear Model Procedure를 이용하여 분산 분석을 실시하였고, 유의성이 있을 경우 Duncan's multiple range test(Duncan, 1955)로 처리 평균 간의 차이를 P<0.05에서 검정하였다.

Ⅱ. 결과

1. 가수분해도

닭 내장에 단백질 분해효소를 첨가하여 가수분해율을 측정한 결과 단백질 분해효소를 닭 내장 중량의 0.2% 이상 첨가하여 반응시킨 것이 원물의 83% 이상을 가수분해시키는 것으로 나타났다.

[표 1] 단백질 분해효소를 이용한 닭 내장의 가수분해율 측정

2. 평균 펩타이드 길이 측정

단백질 분해효소로 가수분해한 닭 내장 건조물의 평균 펩타이드 길이를 측정한 결과 가용성 물질 중에서는 2.84개의 아미노산이 결합되어 있었으며, 저온건조 어분에는 3.62개, 계육분에는 4.51개의 아미노산이 결합되어 있었다.

[표 2] 평균 펩타이드의 길이 측정

3. 외관상 차이

도 4는 가금도축부산물을 사료화한 기존 제품과 바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주가 생산하는 단백질 분해효소로 가수분해한 것을 외관상 비교한 사진이다. 기존 제품은 거친 모습을 보이고 닭털이 함유되어있는 것이 보이지만 바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주가 생산하는 단백질 분해효소로 가수분해한 제품은 입자도가 아주 균일하게 되어있다.

도 5는 가금도축부산물을 사료화한 기존 제품(E)과 바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주가 생산하는 단백질 분해효소로 가수분해한 제품(F)을 물에 용해시켜서 용해도를 비교한 사진이다. 본 발명에 따른 사료 제품이 기존 제품보다 더 높은 수용성화도를 나타내었다.

4. 항산화력 측정

비타민 C를 대조군으로 항산화를 조사한 결과 0.1% 이상일 때는 DPPH를 거의 다 제거하였으며, 단백질 분해효소 가수분해물 상등액에서는 100㎕ 이상에서 완전히 제거시킬 수 있는 것으로 나타났다.

[표 3] DPPH를 이용한 항산화력 측정

6. Trypsin 억제제 제거 능력

트립신은 대표적인 항 영양인자로서 식물성 단백질인 대두에 많이 함유되어있는데 육류 제품에서도 많이 존재하는 것으로 보고되고 있다. 저온 건조 어분과 계육분 그리고 바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주가 생산하는 단백질 분해효소로 가수분해한 닭 내장 사료에서 각각 5.83㎎/g, 4.75㎎/g, 0.0031㎎/g으로 분석되어 단백질 분해효소로 가수분해한 닭 내장에서 트립신 억제제가 많이 제거된 것으로 나타났다.

[표 4] 트립신 억제제 활성 측정

7. 분자량 측정

도 6은 MALDI-TOF를 이용하여 바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주가 생산하는 단백질 분해효소로 가수분해한 닭 내장 사료의 분자량을 측정한 결과이다. 이에 따르면 분자량이 10kDa 이하로 분해되었다는 것을 확인할 수 있다.

8. 펩신 소화율

각각의 제품을 펩신 0.001%, 0.002%, 0.2%로 처리하여 소화율을 조사하였다. 단백질 분해효소로 가수분해한 닭 내장은 0.001%로 펩신을 처리하였을 때 95%이상의 소화율을 나타내었다. 도 7은 펩신 소화율을 조사한 결과를 보여주는 그래프이다.

8. 일반성분 분석

바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주가 생산하는 단백질 분해효소로 가수분해한 닭 내장을 분무건조한 것의 일반성분을 분석하면 다음의 표 5와 같다.

[표 5]

9. 아미노산 함량 분석

표 6은 닭 내장을 바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주가 생산하는 단백질 분해효소로 가수분해하여 아미노산과 진정아미노산 비율을 조사한 자료이다. 진정 아미노산 비율은 각각 83%를 나타내었다. 이러한 수치는 일반적인 단백질원의 진정 아미노산 비율과 아주 흡사한 것이다.

[표 6]

10. 전장소화율 및 회장소화율 : 건물, 질소 및 에너지

자돈에서의 소화율을 측정하기 위하여 표 7과 같이 사료의 구성성분을 조성하였다. 자돈 사료 내 다른 동물성 단백질 원료가 건물, 질소 및 에너지 외관상 전장 및 회장소화율에 미치는 영향은 표 8에 나타내었다. 외관상 소화율에 있어 건물 및 질소 소화율에서는 어분, 가소화 양계 내장분말 및 가소화 돈모 분말 처리구가 대두박 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났고(P<0.05), 에너지 소화율에 있어서는 어분 처리구가 대두박 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). 회장 소화율에서는 건물, 질소 및 에너지 소화율에 있어서 어분, 가소화 양계 내장분말 및 가소화 돈모 분말 처리구가 대두박 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05).

[표 7]

[표 8]

11. 외관상 전장 아미노산 소화율

자돈 사료 내 다른 동물성 단백질 원료가 외관상 전장 아미노산 소화율에 미치는 영향은 표 9에 나타내었다. 필수 아미노산 소화율에 있어 Lysine 및 총 필수 아미노산의 소화율에서 어분, 가소화 양계 내장분말 및 가소화 돈모 분말 처리구가 대두박 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). 비필수 아미노산에 있어서는 Alanine 및 Glutamic acid 소화율에서 어분, 가소화 양계 내장분말 및 가소화 돈모 분말 처리구가 대두박 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났으며(P<0.05), Asparatic acid 및 총 비필수 아미노산 소화율에서 어분 및 가소화 양계 내장분말 처리구가 대두박 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). 총 외관상 아미노산 소화율에 있어서는 어분, 가소화 양계 내장분말 및 가소화 돈모 분말 처리구가 대두박 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05).

[표 9]

12. 회장 아미노산 소화율

자돈 사료 내 다른 동물성 단백질 원료가 회장 아미노산 소화율에 미치는 영향은 표 10에 나타내었다. 필수 아미노산 소화율에 있어서 Histidine은 가소화 돈모 분말 처리구가 대두박 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났으며(P<0.05), Isoleucine는 어분 및 가소화 양계 내장분말 처리구가 대두박 및 가소화 돈모 분말 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). Leucine에 있어서는 어분 처리구가 대두박, 가소화 양계 내장분말 및 가소화 돈모 분말 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났으며(P<0.05), Lysine에 있어서는 가소화 양계 내장분말이 대두박에 비해 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). Methionine은 어분 처리구가 대두박 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났고(P<0.05), Phenylalanine은 가소화 돈모 분말 처리구가 대두박, 어분 및 가소화 양계 내장분말에 비해 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). 총 필수 아미노산 소화율에 있어서는 어분, 가소화 양계 내장분말 및 가소화 돈모 분말 처리구가 대두박 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05).

비필수 아미노산 소화율에 있어서는 Alanine은 어분 및 가소화 양계 내장분말 처리구가 대두박 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났으며(P<0.05), Asparatic acid 및 Glutamic acid는 어분, 가소화 양계 내장분말 및 가소화 돈모 분말 처리구가 대두박 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). Proline 및 Serine에 있어서는 어분 처리구가 가장 높았고 가소화 양계 내장분말 및 가소화 돈모 분말 처리구가 대두박 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났으며(P<0.05), Tyrosine는 어분 처리구가 대두박 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05).

[표 10]

13. 전장 소화율 및 회장 소화율 : 건물, 질소 및 에너지

표 11은 자돈사료의 기본 구성성분을 나타낸 자료이며, 자돈 사료 내 다른 동물성 단백질 원료가 건물, 질소 및 에너지 외관상 전장 및 회장 소화율에 미치는 영향은 표 12에 나타내었다. 외관상 소화율에 있어 건물 및 질소 소화율에서는 어분, 가소화 돈모 분말 처리구가 대두박 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났고(P<0.05), 에너지소화율에 있어서는 어분 처리구가 대두박 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). 회장 소화율에서는 건물, 질소 및 에너지 소화율에 있어서 어분, 가소화 돈모 분말 처리구가 대두박 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05).

[표 11]

[표 12]

14. 외관상 전장 아미노산 소화율

자돈 사료 내 다른 동물성 단백질 원료가 외관상 전장 아미노산 소화율에 미치는 영향은 표 13에 나타내었다. 필수 아미노산 소화율에 있어 Lysine 및 총 필수 아미노산의 소화율에서 어분 및 가소화 돈모 분말 처리구가 대두박 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). 비필수 아미노산에 있어서는 Alanine 및 Glutamic acid 소화율에서 어분, 가소화 돈모 분말 처리구가 대두박 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났으며(P<0.05), Asparatic acid 및 총 비필수 아미노산 소화율에서 어분 및 가소화 양계 내장 분말 처리구가 대두박 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). 총 외관상 아미노산 소화율에 있어서는 어분 및 가소화 돈모 분말 처리구가 대두박 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05).

[표 13]

15. 회장 아미노산 소화율

자돈 사료 내 다른 동물성 단백질 원료가 회장 아미노산 소화율에 미치는 영향은 표 14에 나타내었다. 필수 아미노산 소화율에 있어서 Histidine은 가소화 돈모 분말 처리구가 대두박 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났으며(P<0.05), Isoleucine는 어분 및 대두박이 가소화 돈모 분말 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). Leucine에 있어서는 어분 처리구가 대두박 및 가소화 돈모 분말 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났으며(P<0.05), Methionine은 어분 처리구가 대두박 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). 총 필수 아미노산 소화율에 있어서는 어분 및 가소화 돈모 분말 처리구가 대두박 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05).

비필수 아미노산 소화율에 있어서는Alanine은 어분이 대두박 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났으며(P<0.05), Asparatic acid 및 Glutamic acid는 어분, 가소화 양계 내장 분말 및 가소화 돈모 분말 처리구가 대두박 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). Proline 및 Serine에 있어서는 어분 처리구가 가장 높았고 가소화 돈모 분말 처리구가 대두박 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났으며(P<0.05), Tyrosine는 어분 처리구가 대두박 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05).

[표 14]

16. 자돈 혈액 성상 비교

표 15는 돈모와 저온 처리 건조한 어분을 섭취한 자돈의 혈액 내 기본적인 물질의 변화를 측정한 자료이다.

3주와 6주의 임파구나 적혈구 백혈구 글루코즈는 변화가 없었다. 그러나 6주째 크레아틴과 혈액 내 질소 함량은 처리구간별로 차이가 있었는데 크레아틴의 함량이 돈모가 어분에 비하여 낮았고 BUN은 LT 어분과 비슷하였다.

[표 15]

17. 성장 단계별 Growth performance측정

표 16은 이유 후 2~3주와 4~5주 사이에 체중, 일일 사료섭취량, 일당 증체량 등을 측정한 자료이다. LT 어분과 비교했을 때 별다른 차이점을 보이지 않았지만, 대두박 보다는 더 나은 결과를 나타내었다.

[표 16]

18. 분변의 점수

표 17은 자돈의 분변을 외관상으로 관찰하였을 때 색깔이나 묽기의 정도를 살펴본 자료이다. 외관상 차이는 전혀 나타나지 않는 것으로 나타났다.

[표 17]

한국미생물보존센터(국내) KFCC11557P 20130829

<110> SCI Inc. <120> MANUFACTURING METHOD OF FEED WITH CHICKEN GIBLETS USING CULTURE FLUID OF BACILLUS METHYLOTROPHICUS SCI <130> HP-2013-0114 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1427 <212> DNA <213> Bacillus methylotrophicus SCI <400> 1 gcggcgtgcc tatacatgca gtcgagcgga cagatgggag cttgctccct gatgttagcg 60 gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac 120 cggggctaat accggatggt tgtttgaacc gcatggttca gacataaaag gtggcttcgg 180 ctaccactta cagatggacc cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa 240 ggcgacgatg cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac actgggactg agacacggcc 300 cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag tctgacggag 360 caacgccgcg tgagtgatga aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtta gggaagaaca 420 agtgccgttc aaatagggcg gcaccttgac ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta 480 cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa 540 agggctcgca ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt 600 cattggaaac tggggaactt gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg 660 aaatgcgtag agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt ctgtaactga 720 cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt 780 aaacgatgag tgctaagtgt tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc taacgcatta 840 agcactccgc ctggggagta cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg acgggggccc 900 gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt 960 gacatcctct gacaatccta gagataggac gtccccttcg ggggcagagt gacaggtggt 1020 gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 1080 ccttgatctt agttgccagc attcagttgg gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc 1140 ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg 1200 ctacaatgga cagaacaaag ggcagcgaaa ccgcgaggtt aagccaatcc cacaaatctg 1260 ttctcagttc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gctggaatcg ctagtaatcg 1320 cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttct acacaccgcc cgtcacacca 1380 cgagagtttg taacacccga agtcggtgag gtaacctttt aggagcc 1427

Claims (5)

1. 도계장에서 분리, 이송된 닭 내장을 반응기에 투입하고 100℃에서 2시간 동안 증자하는 단계;
   상기 반응기로부터 증자한 닭 내장을 배출시켜 60℃가 될 때까지 강제 방냉하는 단계;
   상기 방냉된 닭 내장에 바실러스 메틸로트로피쿠스(Bacillus methylotrophicus) SCI 균주(수탁번호 KFCC11557P)를 배양한 배양액을 첨가하는 단계;
   상기 배양액 첨가 후 55℃ 내지 75℃에서 혼합하면서 30분 내지 2시간 동안 반응시켜 반응액을 수득하는 단계;
   상기 반응액을 15℃ 내지 25℃로 방냉한 후 30메쉬 프레스 필터로 여과하여 여과액을 수득하는 단계;
   상기 여과액을 감압농축하여 농축액을 수득하는 단계;
   상기 농축액에 항산화제 및 항균제를 투입한 후 60℃로 예비가열하는 단계; 및
   상기 예비가열 후 160℃ 내지 195℃의 열풍으로 분무건조하여 건조물을 수득하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주 배양액을 이용하여 닭 내장을 사료로 제조하는 방법.
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 균주는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 16S rDNA를 갖는 것을 특징으로 하는, 바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주 배양액을 이용하여 닭 내장을 사료로 제조하는 방법.
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 배양액은 닭 내장 중량의 0.2% 내지 0.4%의 비율로 첨가하는 것을 특징으로 하는 바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주 배양액을 이용하여 닭 내장을 사료로 제조하는 방법.
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 감압농축은 -1.2 bar의 압력으로 2~4시간 동안 진행하여 상기 농축액의 수분 및 고형분의 중량비를 6 대 4로 조절하는 것을 특징으로 하는 바실러스 메틸로트로피쿠스 SCI 균주 배양액을 이용하여 닭 내장을 사료로 제조하는 방법.
5. 청구항 1의 방법에 의하여 제조된 건조사료.

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