KR20150055246A - Pharmaceutical composition for treating skin inflammation containing Biliverdin reductase A fusion protein - Google Patents

Pharmaceutical composition for treating skin inflammation containing Biliverdin reductase A fusion protein Download PDF

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KR20150055246A
KR20150055246A KR1020130137333A KR20130137333A KR20150055246A KR 20150055246 A KR20150055246 A KR 20150055246A KR 1020130137333 A KR1020130137333 A KR 1020130137333A KR 20130137333 A KR20130137333 A KR 20130137333A KR 20150055246 A KR20150055246 A KR 20150055246A
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최수영
박진서
한규형
음원식
김덕수
김대원
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한림대학교 산학협력단
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Abstract

The present invention relates to a therapeutic composition of skin inflammation including Tat-BLVRA fusion proteins formed by covalently binding biliverdin reductase A to protein transport domains.

Description

빌리버딘 환원효소 Ａ 융합단백질을 함유하는 피부염증 치료용 약학 조성물 {Pharmaceutical composition for treating skin inflammation containing Biliverdin reductase A fusion protein}FIELD OF THE INVENTION [0001] The present invention relates to a pharmaceutical composition for treating skin inflammation containing a biliverdin reductase A fusion protein,

본 발명은 Tat-BLVRA 융합단백질을 포함하는 피부염증 치료제에 관한 것으로서, 인비트로와 인비보 실험을 통해 Tat-BLVRA 융합단백질이 피부염증 치료 효과가 있음을 제시하였다.The present invention relates to a therapeutic agent for skin inflammation comprising a Tat-BLVRA fusion protein, and shows that Tat-BLVRA fusion protein is effective for treating skin inflammation through invitro and invivo.

산화 스트레스 중 하나인 활성산소종에 의해 세포가 손상을 입게 되면 여러 신호전달들에 의해서 염증반응이 일어나게 된다. 빌리버딘 환원효소 A (Biliverdin reductase A)는 헴 (Heme)이 HO-1에 의해 분해되어 생성된 빌리버딘 (biliverdin)을 빌리루빈 (bilirubin)으로 전환시켜 주는 환원효소이며, 이 산화환원 순환 (redox cycle) 과정에서 활성산소종 제거자 (ROS-scarvenger)의 역할을 하여 세포 내 활성산소종을 제거함으로써 항산화제 기능을 나타낸다. 본 발명자들은 Tat-BLVRA 융합단백질이 Raw 264.7 대식세포에 ¼­ TPA로 유도된 염증 반응에서 정상 수준보다 증가된 활성산소종 수준을 감소시키고, 세포의 사멸에 대해 저항을 나타냄을 여러 실험을 통해 확인하였다. Tat-BLVRA 융합단백질이 Raw 264.7 세포와 마우스 귀에 효과적으로 세포침투 (transduction)되는 것을 웨스턴 블랏과 면역조직화학 분석을 통해 확인하였다. Tat-BLVRA 융합단백질은 Raw 264.7 세포에서 MAPK, Akt 그리고 NF-kB의 활성화를 현저하게 억제하였으며 세포내 활성산소종 생성과 DNA 조각화 수준도 억제하였다. 또한 TPA로 유도시킨 피부염증 마우스 모델에서 염증이 일어난 귀에 비해 Tat-BLVRA 융합단백질 처리군에서 귀의 두께와 중량 모두 감소하였으며, 조직에서도 MAPK 활성화와 친염증성 사이토카인의 발현이 억제되는 것을 웨스턴 블랏팅과 RT-PCR을 이용하여 확인하였다. 그러므로 우리는 이 결과들을 통해 Tat-BLVRA 융합단백질의 항염증 효능을 확인함으로써 피부염증 치료제로서의 가능성을 제시한다.
When the cells are damaged by reactive oxygen species, which is one of the oxidative stresses, the inflammation reaction is caused by various signal transductions. Biliverdin reductase A is a reductase that converts biliverdin produced by decomposition of heme into HO-1 into bilirubin, and this redox cycle (ROS-scarvenger) in the redox cycle, thereby removing the intracellular reactive oxygen species and thus functioning as an antioxidant. The present inventors have confirmed through various experiments that the Tat-BLVRA fusion protein decreases the levels of reactive oxygen species that are increased over normal levels in inflammation induced by TPA to Raw 264.7 macrophages and exhibits resistance to cell death . Western blot and immunohistochemical analysis confirmed that Tat-BLVRA fusion protein effectively transduced Raw 264.7 cells and mouse ears. Tat-BLVRA fusion protein markedly inhibited the activation of MAPK, Akt and NF-kB in Raw 264.7 cells and also inhibited the formation of intracellular reactive oxygen species and DNA fragmentation. In addition, in the skin inflammation mouse model induced by TPA, both the thickness and weight of the ear were decreased in the Tat-BLVRA fusion protein treated group compared with the inflamed ear, and the expression of MAPK activation and proinflammatory cytokine was suppressed in the tissues, RT-PCR. Therefore, we propose the possibility of treating skin inflammation by confirming the anti-inflammatory effect of Tat-BLVRA fusion protein through these results.

산화 스트레스는 신체 내의 기관, 세포들에 손상을 주어 염증 반응을 일으켜 결국 세포사멸을 일으키게 된다. 이런 산화 스트레스를 일으키는 원인으로는 활성산소종이 알려져 있다 [JE Carroll. INFLAMMATION AND OXIDATIVE DAMAGE DURING EXAM STRESS. June 12, 2006, Black, P. H. (2003). Brain, Behavior, and Immunity, 17(5), 350-364]. 활성산소종은 신체 면역체계에서 중요한 역할을 하는데 정상 세포에서 활성산소종이 적당한 양으로 생성되었을 때는 세포에 항산화반응을 조절하여 이로운 작용을 하지만 활성산소종의 양이 급격하게 증가를 하게 되면 지질, 단백질, 핵산 등이 손상되어 산화 스트레스가 증가하여 염증, 허혈, 파킨슨병과 같은 다양한 질병을 일으키게 된다 [JE Carroll. INFLAMMATION AND OXIDATIVE DAMAGE DURING EXAM STRESS. June 12, 2006, Champe, P.C. & Harvey, R.A. (1994). Lippincott's illustrated reviews: Biochemistry (2nd Ed). Philadelphia: J.B. Lippincott Co., Chung, H.Y., Jung, K.J. & Yu, B.P. (2005). Molecular inflammation as an underlying mechanism of aging: The anti-inflammatory action of calorie restriction. In Y. Surh, & L. Packer (Eds.), Oxidative stress, inflammation, and health (pp. 389-421). Boca Raton, FL: Taylor & Francis Group, Klaunig, J. E., &Kamendulis, L. M. (2004). Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 44, 239-267, Collino M. et al. (2006). Eur J Pharmacol. 2006 Jan 13;530(1-2):70-80, Floyd, R.A., 1999. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 222, 236-245, Love, S., 1999. Brain Pathol. 9, 119-131, Phillis, J.W., 1994. Prog. Neurobiol. 42, 441-448].Oxidative stress damages the organs and cells in the body, causing an inflammatory reaction that eventually leads to cell death. Active oxygen species are known to cause such oxidative stress [JE Carroll. INFLAMMATION AND OXIDATIVE DAMAGE DURING EXAM STRESS. June 12, 2006, Black, P. H. (2003). Brain, Behavior, and Immunity, 17 (5), 350-364]. Active oxygen species play an important role in the body's immune system. When the active oxygen species is produced in proper amounts in normal cells, it modulates the antioxidant activity in the cells, but if the amount of reactive oxygen species increases rapidly, , Nucleic acids, and the like, resulting in increased oxidative stress resulting in various diseases such as inflammation, ischemia, and Parkinson's disease [JE Carroll. INFLAMMATION AND OXIDATIVE DAMAGE DURING EXAM STRESS. June 12, 2006, Champe, P.C. & Harvey, R.A. (1994). Lippincott's illustrated reviews: Biochemistry (2nd Ed). Philadelphia: J.B. Lippincott Co., Chung, H.Y., Jung, K.J. & Yu, B.P. (2005). Molecular inflammation as an underlying mechanism of aging: The anti-inflammatory action of calorie restriction. In Y. Surh, & L. Packer (Eds.), Oxidative stress, inflammation, and health (pp. Boca Raton, FL: Taylor & Francis Group, Klaunig, J. E., & Kamendulis, L. M. (2004). Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 44, 239-267, Collino M. et al. (2006). Eur J Pharmacol. 2006 Jan 13; 530 (1-2): 70-80, Floyd, R. A., 1999. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 222, 236-245, Love, S., 1999. Brain Pathol. 9, 119-131, Phillis, J. W., 1994. Prog. Neurobiol. 42, 441-448.

진핵세포는 세포막으로 둘러싸여 있으며 이 막으로 인해 다른 세포들 사이에서 물질 이동이 제한되어 있다. 세포막은 지질 이중층 (lipid bilayer)으로 구성되어 있기 때문에 단백질, 핵산과 같은 거대분자들이 세포 내로 이동되는 것이 한계가 있다. 최근 이러한 한계들을 극복하기 위해 많은 연구들이 이루어지고 있는데, 그 중 하나가 단백질 수송 도메인 (protein transduction domain; PTD)이다. 단백질 수송 도메인은 위치 전환 단백질 (trasnlocatory protein)의 일부분을 사용하는 것으로 아미노산 서열 중 높은 염기성 부분이 단백질 수송 도메인으로 사용되어 세포 내로 이동이 가능하도록 유도하는 것으로 보인다. 단백질 수송 도메인에는 여러 가지 종류가 있는데 본 발명에서는 Tat 단백질 수송 도메인을 사용하여 구체적인 실험을 진행하였다. Tat 펩타이드는 HIV-1의 Tat 단백질 중 "RKKRRQRRR (Tat 49-57 아미노산)" 부분이 단백질 수송 기능을 하는 최소한의 부분임을 알게 되어 이 부분을 단백질 수송 도메인으로 사용하게 되었다 [Im SJ. Lee SK. BioWave. Vol. 8 No. 14 2006, Green, I. et al., Trends PharmacolSci 24, 213-5 (2003), Lindsay, M. A. Curr. Opin. Pharmacol. 2, 587-94 (2002), Leifert, J. A. et al., Gene Ther. 9, 1422-8 (2002), Mann, D. A. & Frankel, A. D. Embo J 10, 1733-9 (1991), Wender, P. A. et al., ProcNatlAcadSci USA 97, 13003-8 (2000), Torchilin, V. P. et al., ProcNatlAcadSci USA 98, 8786-91 (2001)]. Eukaryotic cells are surrounded by cell membranes, which limit the mass transfer between other cells. Since the cell membrane is composed of a lipid bilayer, there is a limit to the transfer of macromolecules such as proteins and nucleic acids into cells. Recently, many studies have been conducted to overcome these limitations, one of which is the protein transduction domain (PTD). The protein transport domain uses a portion of the trasnlocatory protein, which appears to induce high basicity portions of the amino acid sequence to be used as the protein transduction domain to allow migration into the cell. There are various kinds of protein transport domains. In the present invention, specific experiments were conducted using the Tat protein transport domain. The Tat peptide was found to be the smallest part of the Tat protein of HIV-1, the "RKKRRQRRR (Tat 49-57 amino acid)" moiety that carries the protein transport function, making this part the protein transport domain [Im SJ. Lee SK. BioWave. Vol. 8 No. 14, 2006, Green, I. et al., Trends PharmacolSci 24, 213-5 (2003), Lindsay, M. A. Curr. Opin. Pharmacol. 2, 587-94 (2002), Leifert, J. A. et al., Gene Ther. (2002), Torchilin, VP et al., ≪ RTI ID = 0.0 > ProcNatlAcadSci USA 98, 8786-91 (2001)].

헴 산화효소 (Hemeoxygenase; HO)에 의해 헴 (heme)이 빌리버딘 (Biliverdin), 철, CO로 대사하는 이러한 시스템은 질병 상태에서 활성산소종의 전반적인 생산을 감소시키는 중요한 역할을 하고 있다. HO 시스템은 생체 내에 중요한 항산화 기능을 하며, 헴 산화효소에 의해 생산된 빌리버딘이 빌리버딘 환원효소에 의해 빌리루빈으로 전환되는데, 빌리루빈은 강력한 항산화제로 알려져 있다 [Richard C.M. Siow et al., Cardiovascular Research 41 (1999) 385-394, Marks G. et al., Trend PharmacolSci 1991;12:185-188., Maines M.D. Annu Rev PharmacolToxicol 1997;37:517-554, Padmanaban G. et al., Trend BiolSci 1989;14:492-496]. 빌리버딘 환원효소 A는 생리적 빌리루빈 농도가 낮으면 빌리버딘 환원효소 A에 의해 빌리루빈/빌리버딘 사이클을 통한 강력한 항산화 보호 기능을 부여하는 것으로 보고된 바 있다 [Jansen T. et al., Front Pharmacol. 2012 Mar 16;3:30, Abraham, N. G., &Kappas ,A. (2008). Pharmacol. Rev. 60, 79-127, Baranano, D. E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16093-16098, Sedlak, T. W., & Snyder, S. H. (2004). Pediatrics 113, 1776-1782, Stocker, R. et al., (1987). Science 235, 1043-1046, Vitek, L., &Schwertner, H. A. (2007). Adv. Clin. Chem. 43, 1-57]. 세포가 활성산소종에 의해 자극을 받게 되면 빌리루빈이 빌리버딘으로 전환되는데, 이때 빌리버딘 환원효소 A가 다시 빌리버딘을 강력한 산화제인 빌리루빈으로 환원시켜 활성산소종 수준을 낮추어준다. 최근 빌리버딘 환원효소 A (BLVRA)가 빌리버딘을 빌리루빈으로 환원시키는 이와 같은 산화환원 사이클이 활성산소종과 같은 산화 스트레스에 저항하여 세포 사멸을 억제한다는 연구 결과가 발표되고 있다 [Baranano, D. E., Rao, M., Ferris, C. D., & Snyder, S. H. (2002). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16093-16098].
This system of metabolism of heme into biliverdin, iron, and CO by hemeoxygenase (HO) plays an important role in reducing the overall production of reactive oxygen species in disease states. HO system has important antioxidant functions in vivo, and bilirverine produced by heme oxidase is converted to bilirubin by biliverdin reductase, and bilirubin is known as a powerful antioxidant [Richard CM Siow et al., Cardiovascular 37: 517-554, Padmanaban G. et al., Trend Biol ScI 1989; < RTI ID = 0.0 >; 14: 492-496]. It has been reported that bilirubidin reductase A imparts strong antioxidant protection through bilirubin / biliverdin cycle by biliverdin reductase A when the physiological bilirubin concentration is low [Jansen T. et al., Front Pharmacol. 2012 Mar 16; 3:30, Abraham, NG, & Kappas, A. (2008). Pharmacol. Rev. 60, 79-127, Baranano, DE et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 16093-16098, Sedlak, TW, & Snyder, SH (2004). Pediatrics 113, 1776-1782, Stocker, R. et al., (1987). Science 235, 1043-1046, Vitek, L., & Schwertner, HA (2007). Adv. Clin. Chem. 43, 1-57]. When cells are stimulated by reactive oxygen species, bilirubin is converted to biliverdin, which in turn reduces bilirubin to bilirubin, a powerful oxidizing agent, to lower levels of reactive oxygen species. Recently, it has been reported that such a redox cycle, in which the bilirubin reductase A (BLVRA) reduces bilirubin to bilirubin, inhibits cell death by resisting oxidative stress such as reactive oxygen species (Baranano, DE , Rao, M., Ferris, CD, & Snyder, SH (2002). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 16093-16098].

본 발명은 피부염증 치료효과가 우수한 치료제 조성물을 제공하려는 것을 목적으로 한다.It is an object of the present invention to provide a therapeutic composition excellent in therapeutic effect of skin inflammation.

본 발명자들은 단백질 수송 도메인 Tat 펩타이드에 빌리버딘 환원효소 A를 융합시켜 세포 내로 단백질을 침투시켰고, 활성산소종에 의해 자극받아 빌리루빈이 빌리버딘으로 전환된 것을 빌리버딘 환원효소 A가 다시 빌리루빈으로 전환시켜 세포 내의 빌리루빈 양을 늘려주어 활성산소종을 감소시켜 피부염증 치료 효과를 보고자 연구를 수행하였으며, 인비트로와 인비보 실험을 통해 Tat-BLVRA 융합단백질이 피부염증 치료 효과가 있음을 제시하였다.
The present inventors have found that bilirubin reductase A is converted to bilirubin by converting the protein transport domain Tat peptide into bilirverin by being fused with bilirverine reductase A to permeate the protein into cells and being stimulated by active oxygen species, . In vitro and in vivo studies have shown that Tat-BLVRA fusion proteins are effective in treating skin irritation. In addition, it has been reported that Tat-BLVRA fusion proteins are effective in treating skin irritation by reducing reactive oxygen species by increasing bilirubin levels in cells .

본 발명은 빌리버딘 환원효소 A의 N 말단에 단백질 수송도메인이 공유결합된 빌리버딘 환원효소 A 융합단백질을 함유하는 피부염증 치료제 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a skin inflammation therapeutic composition comprising a bilirubidin reductase A fusion protein in which a protein transport domain is covalently bound to the N-terminus of bilirubidin reductase A.

본 발명은 상기 단백질 수송 도메인이 HIV Tat 펩타이드임을 특징으로 하는 피부염증 치료제 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a skin inflammation therapeutic composition characterized in that the protein transport domain is an HIV Tat peptide.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 빌리버딘 환원효소 A 융합단백질의 아미노산 서열이 서열번호 9임을 특징으로 하는 피부염증 치료제 조성물에 관한 것이다.
In addition, the present invention relates to a composition for treating skin inflammation, wherein the amino acid sequence of the bilirubidin reductase A fusion protein is SEQ ID NO: 9.

상기 빌리버딘 환원효소 A 융합단백질(이하 "Tat-BLVRA", "BLVRA 융합단백질", "빌리버딘 환원효소 A 융합단백질"과 혼용함)을 포함하여 수송도메인 융합단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 경구 또는 주사 형태로 제형화할 수 있다. 경구용 조성물로는 예를 들면 정제 및 젤라틴 캡슐이 있으며, 이들은 활성 성분 이외에도 희석제(예: 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활탁제(예: 실리카, 탤크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)을 함유하고, 정제는 또한 결합제(예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈)를 함유하며, 경우에 따라서 붕해제(예: 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨염) 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위함 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.A fusion protein comprising the transport domain fusion protein as an active ingredient, including the above-mentioned bilirubidin reductase A fusion protein (hereinafter referred to as "Tat-BLVRA", "BLVRA fusion protein", and "bilirubidin reductase A fusion protein" The pharmaceutical composition may be formulated in oral or injectable form by conventional methods in combination with carriers usually accepted in the pharmaceutical field. Oral compositions include, for example, tablets and gelatin capsules, which may contain, in addition to the active ingredient, a diluent such as lactose, dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose and / or glycine, , Magnesium stearate, stearic acid and its magnesium or calcium salt and / or polyethylene glycol) and the tablets may also contain binders such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and / or polyvinylpyrrolidone ), And may optionally contain a disintegrant (e.g., starch, agar, alginic acid or a sodium salt thereof) or a boiling mixture and / or an absorbent, a colorant, a flavoring agent and a sweetening agent. The injectable composition is preferably an isotonic aqueous solution or suspension, and the composition mentioned is sterilized and / or contains adjuvants such as preservatives, stabilizers, wetting or emulsifying solution accelerators, salts for controlling osmotic pressure and / or buffering agents. They may also contain other therapeutically valuable substances.

이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 경구로 투여하거나, 비경구 방식 즉, 정맥 내 , 피하, 복강 내 투여 또는 국소적용할 수 있다. 용량은 일일 투여량 0.0001~100㎎/㎏을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.The pharmaceutical preparations thus prepared may be administered orally or parenterally, that is, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, or topically, as desired. The dose may be administered in a single daily dose of 0.0001 to 100 mg / kg dividedly in several doses. The dosage level for a particular patient may vary depending on the patient's body weight, age, sex, health condition, time of administration, method of administration, excretion rate, severity of disease, and the like.

나아가, 본 발명은 상기 Tat-BLVRA 융합단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 아토피, 피부소양증과 같은 피부염증을 비롯한 염증질환의 예방과 치료에 유용한 약제학적 조성물을 제공한다.
Further, the present invention provides a pharmaceutical composition useful for the prevention and treatment of inflammatory diseases such as skin inflammation such as atopic and skin pruritus, which comprises a Tat-BLVRA fusion protein as an active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier. Lt; / RTI >

본 발명은 또한 빌리버딘 환원효소 A 단백질을 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 빌리버딘 환원효소 A 단백질 분자의 세포 내 전달은 HIV Tat 단백질 수송 도메인이 공유결합된 형태의 융합단백질을 구성하여 수행된다. 그러나, 본 발명의 단백질 수송 도메인이 서열번호 3의 Tat 펩타이드로만 한정되는 것은 아니고, 아미노산 서열 일부 치환이나 부가, 결여로 Tat 펩타이드와 유사한 기능을 하는 펩타이드를 제조하는 것이 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 당업자에게는 용이하므로, Tat 단백질 수송 도메인과 이로부터 아미노산 일부 치환으로 동일·유사한 단백질 수송기능을 수행하는 단백질 수송 도메인을 이용한 융합단백질도 본 발명의 범위에 속함은 자명하다고 할 것이다.The present invention also provides a method for efficiently delivering a biliverdin reductase A protein into a cell. Intracellular delivery of the biliverdin reductase A protein molecule according to the present invention is carried out by constructing a fusion protein in which the HIV Tat protein transport domain is covalently linked. However, the protein transport domain of the present invention is not limited only to the Tat peptide of SEQ ID NO: 3, but it is also possible to produce a peptide having a function similar to that of the Tat peptide by partial substitution, addition or deletion of the amino acid sequence, It will be apparent to those skilled in the art that fusion protein using the Tat protein transduction domain and the protein transduction domain carrying the same or similar protein transduction function with partial amino acid substitution therefrom also falls within the scope of the present invention.

구체적으로, 본 발명은 Tat-BLVRA 융합단백질, 이 융합단백질을 제조하기 위한 재조합 뉴클레오타이드와 벡터, 이 융합단백질을 포함하는 피부염증질환 치료, 예방 목적의 약학 조성물 등에 관한 것이다.Specifically, the present invention relates to a Tat-BLVRA fusion protein, a recombinant nucleotide and a vector for producing the fusion protein, a pharmaceutical composition for the treatment and prevention of skin inflammation diseases containing the fusion protein, and the like.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.The definitions of the main terms used in the description of the present invention and the like are as follows.

"Tat-BLVRA 융합단백질"이란 단백질 수송 도메인과 빌리버딘 환원효소 A를 포함하며, 수송 도메인과 목표 단백질(즉, 본 발명에서는 빌리버딘 환원효소 A를 의미함)의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다. 본 명세서에서는 "Tat-BLVRA", "Tat-BLVRA 융합단백질", "BLVRA 융합단백질", "빌리버딘 환원효소 A 융합단백질"과 혼용하였다."Tat-BLVRA fusion protein" includes a protein transport domain and a bilirubidin reductase A, and is characterized by a genetic fusion of a transport domain with a target protein (i. E., In the present invention, ≪ / RTI > In the present specification, "Tat-BLVRA", "Tat-BLVRA fusion protein", "BLVRA fusion protein" and "Vilrivenin reductase A fusion protein" were mixed.

"목표 단백질"이란 본래 표적 세포로 들어갈 수 없거나, 본래 유용한 속도로 표적 세포로 들어갈 수 없는 수송도메인 또는 이의 단편이 아닌 분자로서, 수송도메인과 융합되기 전의 분자 그 자체 또는 수송도메인-목표 단백질 복합체의 목표 단백질 부분을 의미한다. 목표 단백질로서는 폴리펩티드, 단백질, 펩타이드를 포함하며, 본 발명에서는 빌리버딘 환원효소 A를 의미한다."Target protein" is a molecule which is not originally able to enter the target cell, or which is not a transport domain or a fragment thereof that can not enter the target cell at an inherently useful speed, as a molecule itself before being fused with the transport domain, Means the target protein portion. The target protein includes a polypeptide, a protein, and a peptide. In the present invention, it refers to a biliverdin reductase A.

"융합단백질"이란 수송도메인 및 한 개 이상의 목표 단백질 부분을 포함하며, 수송도메인과 목표 단백질의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 복합체를 의미한다."Fusion protein" means a complex comprising a transport domain and one or more target protein fragments, formed by genetic fusion or chemical bonding of the transport domain and the target protein.

또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다.In addition, the term "genetic fusion" means a link consisting of a linear, covalent bond formed through genetic expression of a DNA sequence encoding a protein.

또한, "표적 세포"란 수송도메인에 의해 목표 단백질이 전달되는 세포를 의미하는 것으로서, 표적 세포는 체내 또는 체외의 세포를 말한다. 즉, 표적 세포는 체내 세포, 다시 말하여 살아있는 동물 또는 인간의 장기 또는 조직을 구성하는 세포 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물을 포함하는 의미이다. 또한, 표적 세포는 체외 세포, 즉 배양된 동물세포, 인체 세포 또는 미생물을 포함하는 의미이다.The term "target cell" refers to a cell to which a target protein is delivered by a transport domain, and the target cell refers to a cell in the body or in vitro. That is, the target cell is meant to include a body cell, that is, a living animal, or a cell or living organism of a human organ or tissue, or a microorganism found in a human being. In addition, the target cell means an extracellular cell, that is, a cultured animal cell, a human cell or a microorganism.

본 발명에서의 "단백질 수송 도메인"은 고분자 유기화합물, 예컨대 펩타이드, 단백질 등과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 유기화합물들을 세포 내로 도입시킬 수 있는 것을 말한다.The term "protein transport domain" in the present invention refers to a substance that can covalently bond with a polymer organic compound such as a peptide or a protein to introduce the organic compound into cells without requiring any additional receptor or carrier or energy.

또한, 본 명세서에서는 단백질, 펩타이드, 유기화합물을 세포 내로 "도입"시키는 것에 대하여 "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과"한다는 표현들과 혼용하였다.Also, in the present specification, the terms "transport", "penetration", "transport", "delivery", "permeation" and "passage" are used interchangeably with respect to "introducing" proteins, peptides and organic compounds into a cell.

본 발명은 단백질 수송 도메인이 빌리버딘 환원효소 A의 N 말단에 공유결합되어 세포침투 효율이 향상된 빌리버딘 환원효소 A 융합단백질을 유효성분으로 하는 피부염증질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of skin inflammation diseases, wherein the protein transport domain is covalently bound to the N-terminus of the bilirubidin reductase A to enhance the cell penetration efficiency, and a bilirubidin reductase A fusion protein as an active ingredient .

또한, 본 발명에서 상기 수송도메인은 HIV Tat인 것을 특징으로 한다.Further, in the present invention, the transport domain is characterized by being HIV Tat.

또한, 본 발명은 상기 융합단백질의 그 아미노산 서열이 서열번호 7과 같은 것을 특징으로 한다.In addition, the present invention is characterized in that the amino acid sequence of the fusion protein is the same as that of SEQ ID NO: 7.

본 발명은 또한, silent change에 따라 서열 내에서 하나 이상의 아미노산이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산(들)로 치환될 수 있다. 서열 내 아미노산 치환은 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다.The present invention may also be substituted with other amino acid (s) of similar polarity in which one or more amino acids functionally equivalent in sequence within the silent change. Amino acid substitutions in the sequence may be selected from other members of the class to which the amino acid belongs.

예컨대, 소수성 아미노산 분류는 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 프롤린 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양성 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성 전하를 띤 산성 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 또한, 본 발명의 융합단백질과 아미노산 서열 간의 일정 범위의 상동성 예컨대 85-100% 범위 내의 동일 유사한 생물학적 활성을 갖는 절편 또는 이들의 유도체들도 본 발명의 권리범위에 포함된다.
For example, the hydrophobic amino acid class includes alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, valine, tryptophan, proline and methionine. Polar neutral amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine and glutamine. Positive basic amino acids include arginine, lysine and histidine. Acidic amino acids with negative charge include aspartic acid and glutamic acid. Also included within the scope of the invention are fragments or derivatives thereof having homologous homology, for example within the range of 85-100%, between the fusion protein of the present invention and the amino acid sequence, having the same similar biological activity.

빌리버딘 환원효소 A (Biliverdinreductase A; BLVRA)는 빌리버딘을 빌리루빈으로 전환시키는 환원효소로서, 최근 세포 산화환원 사이클 조절에 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려지고 있다. 인간은 두 가지 종류의 빌리버딘 환원효소 (BLVRA, BLVRB)를 가지고 있다. 두 가지 효소 모두 빌리버딘을 빌리루빈으로 전환시키지만, BLVRA만이 빌리버딘을 강력한 항산화 기능을 가진 빌리루빈으로 환원시킨다. 최근 연구들이 BLVRA가 강한 생리적 항산화제인 빌리루빈의 생산을 통해 활성산소종 제거 능력을 가짐을 보여주고 있다 [Baranano, D. E., Rao, M., Ferris, C. D., & Snyder, S. H. (2002). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16093-16098, Sung Young Kim et al., EXPERIMENTAL and MOLECULAR MEDICINE, Vol. 43, No. 1, 15-23, January 2011, Beale S.I. et al., Arch BiochemBiophys 1984;235:371-384, Florczyk U.M. et al., Pharmacol Rep 2008;60:38-48, Maines M.D. Physiology (Bethesda) 2005;20:382-9, Schluchter WM, Glazer AN. J BiolChem 1997;272:13562-9, Sedlak T.W. et al., ProcNatlAcadSci USA 2009;106:5171-6, Wu B. et al., Med Hypotheses 2008;71:73-6, Barone E. et al., BiochimBiophysActa. 2011 Apr;1812(4):480-7, Kapitulnik J, Maines MD. Trends Pharmacol.Sci 2009;30:129-137, Maines M.D. Physiology (Bethesda) 2005;20:382-389, Franklin E.M. et al., FEBS J 2009;276:4405-4413].Biliverdin reductase A (BLVRA) is a reductase that converts bilirubin to bilirubin. It has recently been shown to play an important role in the regulation of cell redox cycle. Humans have two types of biliverdin reductase (BLVRA, BLVRB). Both enzymes convert bilirubin to bilirubin, but only BLVRA reduces bilirubin to bilirubin with strong antioxidant properties. Recent studies have shown that BLVRA has the ability to remove reactive oxygen species (BD) by producing bilirubin, a strong physiological antioxidant [Baranano, D., Rao, M., Ferris, C. D., & Snyder, S. H. (2002). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16093-16098, Sung Young Kim et al., EXPERIMENTAL and MOLECULAR MEDICINE, Vol. 43, No. 1, 15-23, January 2011, Beale S.I. et al., Arch Biochem Biophys 1984; 235: 371-384, Florczyk U.M. et al., Pharmacol Rep 2008; 60: 38-48, Maines M.D. Physiology (Bethesda) 2005; 20: 382-9, Schluchter WM, Glazer AN. J BiolChem 1997; 272: 13562-9, Sedlak T.W. et al., ProcNatlAcadSci USA 2009; 106: 5171-6, Wu B. et al., Med Hypotheses 2008; 71: 73-6, Barone E. et al., Biochim Biophycta. 2011 Apr; 1812 (4): 480-7, Kapitulnik J, Maines MD. Trends Pharmacol. Sci. 2009; 30: 129-137, Maines, MD. Physiology (Bethesda) 2005; 20: 382-389, Franklin E.M. et al., FEBS J 2009; 276: 4405-4413).

단백질 수송기술 (Protein transduction technology)은 세포 내로 단백질을 전달할 수 있고, 세포 및 조직으로 질환 치료용 후보 단백질들을 운반 가능하게 발전하고 있다. 단백질 수송 도메인 (Protein transduction domains; PTDs)은 세포 침투 펩타이드 (cell-penetrating peptide; CPP)라고도 불리며 막에 손상을 주지않고 어떤 수용체를 사용하지 않고도 거대분자가 세포막을 통과하여 세포 안으로 투과될 수 있도록 한다 [Fatemeh Madani et al., Journal of Biophysics Volume 2011, Article ID 414729, 10 pages, P. Jarverand . U. Langel, BiochimicaetBiophysicaActa, vol. 1758, no. 3, pp. 260-263, 2006, S. El-Andaloussi et al., Current Pharmaceutical Design, vol. 11, no. 28, pp. 3597-3611, 2005, J. P. Richard et al., Journal of Biological Chemistry, vol. 278, no. 1, pp. 585-590, 2003, J. S. Wadia, R. V. Stan, and S. F. Dowdy, Nature Medicine, vol. 10, no. 3, pp. 310-315, 2004, I. M. Kaplan et al., Journal of Controlled Release, vol. 107, no. 3, pp. 571-572, 2005, G. P. H. Dietz and M. B¨ahr, Molecular and Cellular Neuroscience, vol. 27, no. 2, pp. 85-131, 2004, P. Saalik, A. Elmquist, M.Hansen et al., Bioconjugate Chemistry, vol. 15, no. 6, pp. 1246-1253, 2004, J. P. Richard et al., Journal of Biological Chemistry, vol. 280, no. 15, pp. 15300-15306, 2005, A. Fittipaldi, A. Ferrari, M. Zopp´e et al., Journal of Biological Chemistry, vol. 278, no. 36, pp. 34141-34149, 2003, I. Nakase, M. Niwa, T. Takeuchi et al., Molecular Therapy, vol. 10, no. 6, pp. 1011-1022, 2004, S. El-Andaloussi, H. J. Johansson, P. Lundberg, and U. Langel, Journal of Gene Medicine, vol. 8, no. 10, pp. 1262-1273, 2006]. 지금까지 본 발명자 그룹에서 수행하는 연구를 포함한 많은 연구들은 단백질 전달이 치료 단백질 응용 프로그램을 위한 도구로 사용될 수 있음을 증명하고 있다 [An, J. J. et al.,FEBSJ.275:1296-1308; 2008, Ahn, E. H. et al.,Toxicol. 276:192-197;2010, Kim, D. W. et al., FreeRadic.Biol.Med.47:941-952;2009, Lee, S. H. et al., BMB Rep.44:484-489; 2011, Dietz, G. P. Curr. Pharm. Biotechnol.11: 167-174; 2010, Kim M.J. et al., Free RadicBiol Med. 2013 Oct;63:432-45]. 단백질 수송 도메인에는 여러 종류가 있는데, 그 중에서도 우리는 아르기닌이 풍부한 세포 침투 펩타이드 중 하나인 Tat 단백질 수송 도메인을 사용하여 실험을 진행하였다. BLVRA 단백질은 거대분자이므로 세포 내, 조직 내로 침투시키기 어렵기 때문에 단백질 수송 도메인인 Tat 펩타이드와 결합시켜 세포 내 또는 조직 내로 침투시켰다 [Wadia J.S., Curr.Opin.Biotechnol. 2002; 13: 52-56, Wadia J.S., Dowdy S.F. Curr.Protein.Pept.Sci 2003; 4: 97-104, Jeong H.J. et al., Mol Cells. 2012 May;33(5):471-8]. 그래서, 우리는 활성산소종으로부터 유도된 세포 손상과 염증반응에서 Tat-BLVRA 융합단백질이 보호 효과를 가지는지 인비트로와 인비보 실험을 수행하였다. 먼저 BLVRA 단백질을 Tat 발현벡터에 융합한 다음 발현·정제 하였고 항-토끼 폴리히스티딘 항체를 사용하여 SDS-PAGE와 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다 (도 1). 대식세포인 Raw 264.7 세포들에 Tat-BLVRA 융합단백질이 농도, 시간별 의존적으로 세포 내로 투과되는 것을 확인하였고, 투과된 Tat-BLVRA 융합단백질이 세포 내에 48시간까지 존재함을 확인하였고 (도 2a, 2b 및 2c), 형광현미경을 사용하여 한 번 더 확인하였다. 본 발명자들은 Alexa488 형광안료와 DAPI를 사용하여 세포 내에서 Tat-BLVRA 융합단백질의 위치를 확인하였다 (도 2d). 그 결과, Tat-BLVRA 융합단백질이 세포외막에 결합되지 않고 Raw 264.7 세포 내로 효과적으로 투과됨을 확인하였다.Protein transduction technology is capable of transferring proteins into cells and is capable of carrying candidate proteins for treating diseases in cells and tissues. Protein transduction domains (PTDs), also called cell-penetrating peptides (CPPs), allow macromolecules to pass through cell membranes and into cells without damaging the membrane and without using any receptor [Fatemeh Madani et al., Journal of Biophysics Volume 2011, Article ID 414729, 10 pages, P. Jarverand. U. Langel, Biochimica et Biophysica Acta, vol. 1758, no. 3, pp. 260-263, 2006, S. El-Andaloussi et al., Current Pharmaceutical Design, vol. 11, no. 28, pp. 3597-3611, 2005, J. P. Richard et al., Journal of Biological Chemistry, vol. 278, no. 1, pp. 585-590, 2003, J. S. Wadia, R. V. Stan, and S. F. Dowdy, Nature Medicine, vol. 10, no. 3, pp. 310-315, 2004, I. M. Kaplan et al., Journal of Controlled Release, vol. 107, no. 3, pp. 571-572, 2005, G. P. H. Dietz and M. B¨ahr, Molecular and Cellular Neuroscience, vol. 27, no. 2, pp. 85-131, 2004, P. Saalik, A. Elmquist, M. Hansen et al., Bioconjugate Chemistry, vol. 15, no. 6, pp. 1246-1253, 2004, J. P. Richard et al., Journal of Biological Chemistry, vol. 280, no. 15, pp. 15300-15306, 2005, A. Fittipaldi, A. Ferrari, M. Zopp'e et al., Journal of Biological Chemistry, vol. 278, no. 36, pp. 34141-34149, 2003, I. Nakase, M. Niwa, T. Takeuchi et al., Molecular Therapy, vol. 10, no. 6, pp. 1011-1022, 2004, S. El-Andaloussi, H. J. Johansson, P. Lundberg, and U. Langel, Journal of Gene Medicine, vol. 8, no. 10, pp. 1262-1273, 2006]. A number of studies, including studies conducted in the present inventors group, have demonstrated that protein delivery can be used as a tool for therapeutic protein applications [An, J. J. et al., FEBSJ.275: 1296-1308; 2008, Ahn, E. H. et al., Toxicol. Lee, S. H. et al., BMB Rep.44: 484-489; Kim, D. W. et al., Free Radial Biol. Med. 47: 941-952; 2011, Dietz, G. P. Curr. Pharm. Biotechnol. 11: 167-174; 2010, Kim M.J. et al., Free RadicBiol Med. 2013 Oct; 63: 432-45]. There are many kinds of protein transport domains. Among them, we have conducted experiments using Tat protein transport domain, one of the arginine-rich cell penetration peptides. Since BLVRA protein is a macromolecule, it is intracellularly or intracellularly infiltrated by binding to the protein transport domain Tat peptide, since it is difficult to penetrate into cells and tissues [Wadia J. S., Curr. Op. Biotechnol. 2002; 13: 52-56, Wadia J. S., Dowdy S. F. Curr.Protein.Pept.Sci 2003; 4: 97-104, Jeong H.J. et al., Mol Cells. 2012 May; 33 (5): 471-8]. Thus, we performed in vitro and in vivo studies to determine whether Tat-BLVRA fusion protein has protective effects on cellular injury and inflammatory responses induced by reactive oxygen species. First, the BLVRA protein was fused to a Tat expression vector and expressed and purified. The anti-rabbit polyhistidine antibody was confirmed by SDS-PAGE and Western blotting (FIG. 1). It was confirmed that the Tat-BLVRA fusion protein was permeabilized intracellularly to the macrophage Raw 264.7 cells in a concentration-dependent and time-dependent manner, and it was confirmed that the permeated Tat-BLVRA fusion protein was present in the cells for up to 48 hours And 2c) and confirmed once again using a fluorescence microscope. The present inventors confirmed the position of Tat-BLVRA fusion protein in cells using Alexa488 fluorescent pigment and DAPI (Fig. 2d). As a result, it was confirmed that the Tat-BLVRA fusion protein was not bound to the extracellular membrane but was effectively permeated into Raw 264.7 cells.

Tat-BLVRA 융합단백질이 대식세포에서 생산되는 염증 매개자 (inflammatory mediator)들에 미치는 생물학적 효과를 알아보기 위해서 Raw 264.7 세포에 LPS (lipopolysaccharide)로 자극을 주어 3개의 MAPK 경로 (p38, ERK1/2, JNK), Akt 경로를 포함한 몇몇 세포내 신호전달경로를 활성화시켜 실험을 진행하였다. MAPK 경로 는 성장인자, 사이토카인 그리고 다양한 환경적 요인들을 매개체로 해서 신호전달이 시작되어 다양한 세포 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. MAPKs의 활성화가 증가하면 염증 매개자들의 활성이 조절된다. 몇몇 연구에서 MAPKs의 활성화는 LPS에 의해 유도된 COX-2, iNOS그리고 NF-κB의 활성에 관여한다고 보고되었다 [Gao Y. et al., ToxicolIn Vitro. 2012 Feb;26(1):1-6, Reibman, J. et al., 2000, J. Immunol. 165, 1618-1625, Kaminska, B., 2005. Biochim.Biophys.Acta 1754, 253-262, Carter, A.B. et al., 1999. J. Biol. Chem. 274, 30858-30863, Nakano, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 3537-3542]. 또한, LPS와 같은 산화 스트레스에 의해 생성된 활성산소종은 대식세포에서 NF-κB를 활성화시켜 Akt 경로를 조절하여 염증 반응에 관여한다 [Hsing C-H et al., (2011) PLoS ONE 6(3): e17598, Asehnoune K, Strassheim D, Mitra S, Kim JY, Abraham E (2004) J Immunol 172: 2522-2529]. 먼저 본 발명자들은 E.coli에서 재조합 단백질을 발현 및 정제하여 생긴 내독소 (endotoxin)를 triton X-114로 제거하고 다음 실험들을 진행하였다. 우리는 Raw 264.7 세포에 도입된 Tat-BLVRA 융합단백질이 Raw 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 p38, ERK, JNK의 인산화를 억제하는 것을 확인하였으며 (도 3a, 3b), Tat-BLVRA 융합단백질이 Akt 인산화도 억제시키는 것을 확인하였다 (도 3c, 3d).In order to investigate the biological effects of Tat-BLVRA fusion protein on inflammatory mediators produced in macrophages, Raw 264.7 cells were stimulated with LPS (lipopolysaccharide) to induce three MAPK pathways (p38, ERK1 / 2, JNK ) And activation of several intracellular signaling pathways including the Akt pathway. The MAPK pathway is known to play a crucial role in various cellular functions by initiating signaling through growth factors, cytokines, and various environmental factors. Increased activation of MAPKs modulates the activity of inflammatory mediators. In some studies, activation of MAPKs has been reported to be involved in the activation of LPS-induced COX-2, iNOS and NF-κB [Gao Y. et al., Toxicolin Vitro. 26 Feb (1): 1-6, Reibman, J. et al., 2000, J. Immunol. 165, 1618-1625, Kaminska, B., 2005. Biochim. Biophys. Acta 1754, 253-262, Carter, A.B. et al., 1999. J. Biol. Chem. 274, 30858-30863, Nakano, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,3537-3542]. In addition, reactive oxygen species produced by oxidative stress, such as LPS, activate NF-κB in macrophages and regulate the Akt pathway to participate in the inflammatory response [Hsing CH et al., (2011) PLoS ONE 6 (3) : e17598, Asehnoune K, Strassheim D, Mitra S, Kim JY, Abraham E (2004) J Immunol 172: 2522-2529]. First, the present inventors carried out the following experiments by removing endotoxin produced by expressing and purifying a recombinant protein in E. coli with triton X-114. We confirmed that the Tat-BLVRA fusion protein introduced into Raw 264.7 cells inhibits phosphorylation of p38, ERK, and JNK induced by LPS in Raw 264.7 cells (Fig. 3a, 3b) (Fig. 3c, 3d).

친염증성 사이토카인 유전자들을 제어하는 전사인자인 NF-κB [Uto, T. et al., AM.J.Chin.Med.38:985-994;2010, Rothgiesser, K. M. et al.,J.Cell Sci. 123: 4251-4258; 2010]는 포유류 NF-κB 형태인 호모헤테로다이머와 p50/p65 헤테로다이머가 대부분 세포에서 혼합 이합체이다. 자극을 받은 세포에서 NF-κB는 IκB의 인산화를 매개로 분해된다 [Rothgiesser, K. M. et al., J.Cell Sci. 123: 4251-4258; 2010]. 상피세포 성장인자와 MAPK의 활성화는 NF-κB 같은 다운스트림의 전사 인자를 유도한다 [Torres J. et al.,Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011 Jul 29;52(8):5842-52, Nakagami T. et al., Jpn J Ophthalmol. 2000;44:193-197, Abeyama K. et al., J Clin Invest. 2000;105:1751-1759, Liu Z. et al., Chin Med J (Engl). 2002;115:418-421]. 또한 Akt가 IKK를 통해 NF-κB의 인산화를 촉진시킨다고 보고되고 있다 [Dan H.C. et al., Genes Dev. 2008 Jun 1;22(11):1490-1500, Delhase, M. et al., 2000. Nature 406: 367-368, Madrid, L. et al., 2001. J. Biol. Chem. 276: 18934-18940, Ozes, O. et al., 1999. Nature 401: 82-85, Sizemore, N. et al., 2002. J. Biol. Chem. 277: 3863-3869]. 그리하여 본 발명자들은 Tat-BLVRA 융합단백질을 세포 또는 조직 내로 투과시켜 IκB의 생산과 IκB의 인산화가 억제되는지 확인하였다 (도 3e, 3f).NF-κB [Uto, T. et al., AM.J.Chin. Med. 38: 985-994; 2010, Rothgiesser, KM et al., J. Cell Sci . 123: 4251-4258; 2010] is a mixed dimer of mostly homo heterodimer and p50 / p65 heterodimer in mammalian NF-κB form. In stimulated cells, NF-κB is degraded via phosphorylation of IκB [Rothgiesser, K. M. et al., J. Cell Sci. 123: 4251-4258; 2010]. Activation of epithelial cell growth factor and MAPK induces downstream transcription factors such as NF-κB [Torres J. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011 Jul 29; 52 (8): 5842-52, Nakagami T. et al., Jpn J. Ophthalmol. 2000; 44: 193-197; Abeyama K. et al., J Clin Invest. 2000; 105: 1751-1759, Liu Z. et al., Chin Med J (Engl). 2002; 115: 418-421). It has also been reported that Akt promotes phosphorylation of NF-kB through IKK [Dan H.C. et al., Genes Dev. 2000 Jun. 22 (11): 1490-1500, Delhase, M. et al., 2000. Nature 406: 367-368, Madrid, L. et al., 2001. J. Biol. Chem. 276: 18934-18940, Ozes, O. et al., 1999. Nature 401: 82-85, Sizemore, N. et al., 2002. J. Biol. Chem. 277: 3863-3869. Thus, the present inventors confirmed that the Tat-BLVRA fusion protein was permeabilized into cells or tissues to inhibit the production of IκB and the phosphorylation of IκB (FIG. 3e, 3f).

LPS로 자극을 준 Raw 264.7 세포에서 Tat-BLVRA 융합단백질이 COX-2, iNOS와 여러 사이토카인 (IL-1β, IL-6, TNF-α)들의 생산을 억제하는지 확인한 결과, 투과된 Tat-BLVRA 융합단백질이 LPS에 의해 유도된 COX-2, iNOS와 친염증성 사이토카인 (IL-1β, IL-6, TNF-α)의 발현 수준을 농도 의존적으로 현저히 감소시켰으며 (도 4), 투과된 Tat-BLVRA 융합 단백질은 세포에 LPS를 처리하여 생성된 활성산소종을 억제하였다. 이러한 결과들은 투과된 Tat-BLVRA 융합단백질이 LPS에 의해 발생하는 산화 스트레스와 염증에 대항하여 효과적으로 세포를 보호함을 말해준다. 그러므로, Tat-BLVRA 융합단백질은 Akt, MAPK 경로와 NF-κB, 친염증성 사이토카인들의 발현을 억제한다. 활성산소종은 단백질 산화, DNA 손상, 지질 산화를 포함하는 산화적 손상을 일으켜 세포사멸에 이르게 하는 것으로 잘 알려져 있다 [Candelario-Jalil, E. et al., 2003. J. Neurochem. 86, 545-555, Lerouet, D. et al., 2002. Brain Res. 958, 66-75]. 그리하여 본 발명자들은 Tat-BLVRA 융합단백질을 투과시킨 후 LPS를 같이 처리하여 세포 생존율을 측정해 보았다. 세포를 1 ㎍/㎖의 LPS에 노출하였을 때, 세포는 오직 47%만이 생존하였다 (도 5a). 본 발명자들은 세포 내로 투과시킨 Tat-BLVRA 융합단백질이 LPS에 의해 생성된 산화 스트레스를 억제할 수 있는지를 활성산소종에 민감한 DCF-DA (dichlorofluoresceindiacetate)를 이용하여 실험하였다. DCF-DA는 세포 내 활성산소종 생성을 측정하는 데 많이 사용되고 있다. 그 결과, LPS를 처리하여 활성산소종이 생성된 세포와 비교했을 때, Tat-BLVRA 융합단백질을 투과시킨 세포에서 DCF-DA의 형광이 현저히 줄어드는 것으로 보아 Tat-BLVRA 융합단백질이 활성산소종 생성을 억제시키는 것을 알 수 있었다 (도 5b). 그러므로, Tat-BVLRA 융합단백질이 세포 내 활성산소종 제거자 기능을 수행함을 알 수 있다.In the Raw 264.7 cells stimulated with LPS, Tat-BLVRA fusion protein inhibited the production of COX-2, iNOS and several cytokines (IL-1β, IL-6, TNF-α) The fusion protein significantly decreased the expression level of COX-2, iNOS and proinflammatory cytokines (IL-1β, IL-6, TNF-α) induced by LPS in a concentration-dependent manner (FIG. 4) -BLVRA fusion protein inhibited reactive oxygen species produced by LPS treatment of cells. These results indicate that the permeable Tat-BLVRA fusion protein effectively protects cells against oxidative stress and inflammation caused by LPS. Therefore, Tat-BLVRA fusion protein inhibits the expression of Akt, MAPK pathway and NF-κB, proinflammatory cytokines. Active oxygen species are well known to cause oxidative damage including protein oxidation, DNA damage, and lipid oxidation leading to apoptosis [Candelario-Jalil, E. et al., 2003. J. Neurochem. 86, 545-555, Lerouet, D. et al., 2002. Brain Res. 958, 66-75]. Thus, the present inventors measured the cell survival rate after permeating Tat-BLVRA fusion protein and treating LPS together. When cells were exposed to 1 μg / ml of LPS, only 47% of the cells survived (FIG. 5a). We tested whether Tat-BLVRA fusion protein permeabilized into cells could inhibit oxidative stress produced by LPS using DCF-DA (dichlorofluoresceindiacetate) sensitive to reactive oxygen species. DCF-DA is widely used to measure intracellular reactive oxygen species production. As a result, the fluorescence of DCF-DA was markedly reduced in cells permeated with Tat-BLVRA fusion protein when LPS was treated and compared with cells produced with reactive oxygen species, suggesting that Tat-BLVRA fusion protein inhibits the production of reactive oxygen species (Fig. 5B). Therefore, it can be seen that the Tat-BVLRA fusion protein functions as an intracellular reactive oxygen species eliminator.

또한, 본 발명자들은 세포사멸 (apoptosis)이 일어났는지 확인하기 위해 캐스페이즈-9과 같은 세포사멸의 마지막 단계로 TUNEL (deoxynucleotidyl transferased UTP nick end labeling) 분석을 통해서 DNA 조각화를 확인하였다. DNA 조각화는 산화 스트레스를 포함한 다양한 요소들이 원인이 되어 일어나며, 여러 가지 신호전달을 통해서 결국 핵 안에서 DNA 조각화가 일어나 세포사멸에 이르게 한다. LPS를 처리한 세포에서 TUNEL-양성 세포의 수가 대조군 세포에 비해 좀더 높게 나왔다. Tat-BLVRA 융합단백질을 처리한 세포에서는 TUNEL-양성 세포의 수가 대조군과 비슷하게 나왔다. 이 결과들은 투과된 Tat-BLVRA 융합단백질이 세포 내 산화 스트레스에 의해 유도된 세포사멸에 저항하여 세포 생존에 기여한다는 것을 말해준다. TPA (12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate)는 강력한 종양 프로모터로 잘 알려진 물질로서, 피부암 개시 (skin tumor promotion)와 같은 피부염증 반응을 유도한다. 몇몇 연구들은 마우스 피부에서 TPA에 의한 급성/만성 염증의 특징인 부종, 상피세포 과형성 (epidermal hyperplasia) 그리고 염증세포 침투를 보여주었다 [Stanley P.L. et al., Skin Pharmacol. 1991;4(4):262-271, Chung, W. Y. et al., Carcinogen.28:1224-1231; 2007, Lai, C. S. et al., Carcinogen. 28: 2581-2588;2007, Medeiros, R. et al., Eur.J.Pharmacol.559: 227-235; 2007, Nakadate T. Jpn J Pharmacol. 1989 Jan;49(1):1-9]. 3일간 하루에 한 번씩 TPA 처리 후 한 시간이 지난 다음 마우스 귀에 Tat-BLVRA 융합단백질을 국소처리하면 TPA에 의해 유도된 귀의 두께 및 중량 증가가 현저히 억제되었다. 국소 적용된 Tat-BLVRA 융합단백질은 피부염증의 초기 단계중 하나인 피부로의 단구 (monocyte) 침투를 현저히 억제하였다. 비록 자세한 메카니즘은 좀 더 밝혀져야 하지만, Tat-BLVRA 융합단백질은 TPA로 유도된 피부염증에 대하여 보호효과를 나타내었다 (도 6). 앞선 많은 연구들에서 마우스 귀에 TPA를 처리하면 MAPK와 (PI3K)/Akt를 통해서 NF-κB의 활성화를 유도해서 사이토카인이 활성화됨을 확인하였다. 또한 TPA에 의해 유도된 피부 염증에서 iNOS, COX-2의 생산과 친염증성 사이토카인 발현이 증가하는 것을 확인하였다 [Kuo D.H. et al., J Agric Food Chem. 2010 May 12;58(9):5777-83, Agarwal, A. et al., Oncogene 2005, 24, 1021-1031, Pan, M. H. et al., J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 4467-4477, Landino, L. M. et al., Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 1996, 93, 15069-15074, Murayama, K. et al., Oncogene 2007, 26, 4882-4888]. Tat-BLVRA 융합단백질은 p38,ERK1/2 그리고 JNK의 인산화 수준을 눈에 띄게 억제하였다 (도 7d). 이러한 결과들은 Tat-BLVRA 융합단백질이 MAPK의 활성을 이끄는 신호전달경로 조절을 통해 항염증성 효과를 나타냄을 의미한다. 그리하여 TPA에 의해 유도된 COX-2, iNOS 그리고 IL-1β, IL-6, TNF-α 같은 친염증성 사이토카인 발현 수준을 감소시킴으로써 Tat-BLVRA 융합단백질이 염증에 대하여 세포를 보호하는 효과가 있음을 동물모델에서 확인하였다 (도 7a, 7b, 7c). 이런 결과들을 바탕으로 Tat-BLVRA 융합단백질은 MAPK 경로가 TPA로 유도된 COX-2,iNOS 생산의 억제 및 IL-1β, IL-6, TNF-α의 발현 억제를 조절할 수 있고, Tat-BLVRA 융합단백질이 MAPK의 활성화를 이끄는 신호전달경로의 조절에 관여한다는 것을 알 수 있다. 결과적으로 본 발명자들은 Tat-BLVRA 융합단백질이 세포와 조직 내로 효과적으로 투과되어 산화 스트레스로 인한 세포 사멸 (cell death)과 피부 염증에 저항하여 MAPK와 Akt 경로에 의한 NF-κB의 활성화 조절, COX-2, iNOS와 친염증성 사이토카인 발현을 억제하여 Raw 264.7 세포에서 보호효과를 나타냄을 입증하였으며, 활성산소종 생산 수준 척도로 사용되는 DCF-DA 측정과 DNA 손상으로 인한 DNA 조각화를을 측정하는 TUNEL 분석법 실험에서도 Tat-BLVRA 융합단백질의 보호효과를 확인하였으며, 마우스 귀에서 TPA로 부종을 유도한 다음 MAPK 경로, iNOS와 COX-2의 발현 및 사이토카인들의 발현조절을 통하여 조직에서도 보호효과를 나타냄을 확인하였다. 본 발명자들은 Tat-BLVRA 융합단백질이 피부 염증뿐만 아니라 다양한 다른 활성산소종 관련 질병들에서 단백질 치료제로써 치료효과를 나타낼 수 있음을 제안한다.
The present inventors also confirmed DNA fragmentation through TUNEL (deoxynucleotidyl transferased UTP nick end labeling) analysis as the last step of apoptosis such as caspase-9 in order to confirm whether apoptosis occurred. DNA fragmentation is caused by various factors, including oxidative stress. DNA fragmentation occurs in the nucleus through various signal transduction, leading to apoptosis. The number of TUNEL-positive cells in LPS-treated cells was higher than in control cells. In the cells treated with the Tat-BLVRA fusion protein, the number of TUNEL-positive cells was similar to that of the control group. These results indicate that the permeable Tat-BLVRA fusion protein contributes to cell survival by resisting apoptosis induced by intracellular oxidative stress. TPA (12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate) is a well-known substance as a powerful tumor promoter and induces skin inflammatory responses such as skin tumor promotion. Several studies have shown edema, epidermal hyperplasia, and inflammatory cell infiltration, characterized by acute / chronic inflammation by TPA in mouse skin [Stanley PL et al., Skin Pharmacol. 1991; 4 (4): 262-271, Chung, WY et al., Carcinogen. 28: 1224-1231; 2007, Lai, CS et al., Carcinogen. 28: 2581-2588; 2007, Medeiros, R. et al., Eur.J.Pharmacol.559: 227-235; 2007, Nakadate T. Jpn J Pharmacol. 1989 Jan; 49 (1): 1-9). After one hour of TPA treatment once a day for 3 days, topical treatment of Tat-BLVRA fusion protein in the mouse ear significantly suppressed TPA-induced ear thickness and weight gain. The topically applied Tat-BLVRA fusion protein significantly inhibited monocyte penetration into the skin, one of the earliest stages of skin inflammation. Although the detailed mechanism has to be elucidated further, the Tat-BLVRA fusion protein has a protective effect against TPA-induced skin inflammation (FIG. 6). Previous studies have shown that TPA treatment of mouse ears leads to NF-κB activation and activation of cytokines through MAPK and (PI3K) / Akt. In addition, it has been shown that iNOS, COX-2 production and pro-inflammatory cytokine expression are increased in skin inflammation induced by TPA [Kuo DH et al., J Agric Food Chem. Agnwal, A. et al., Oncogene 2005, 24, 1021-1031, Pan, MH et al., J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 4467-4477, Landino, LM et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 1996, 93, 15069-15074, Murayama, K. et al., Oncogene 2007, 26, 4882-4888]. The Tat-BLVRA fusion protein markedly inhibited phosphorylation levels of p38, ERK1 / 2 and JNK (Fig. 7d). These results indicate that the Tat-BLVRA fusion protein exhibits an anti-inflammatory effect by regulating the signaling pathway leading to the activation of MAPK. Thus, Tat-BLVRA fusion protein has the effect of protecting cells against inflammation by decreasing TPA-induced proinflammatory cytokine expression levels such as COX-2, iNOS and IL-1β, IL-6 and TNF-α (Fig. 7a, 7b, 7c). Based on these results, Tat-BLVRA fusion protein can regulate TPX-induced COX-2, iNOS production and inhibition of IL-1β, IL-6 and TNF-α expression by the MAPK pathway and Tat- Proteins are involved in the regulation of the signaling pathways leading to MAPK activation. As a result, the present inventors have found that the Tat-BLVRA fusion protein is effectively permeated into cells and tissues to regulate activation of NF-κB by MAPK and Akt pathways, COX-2 activation by resistance to cell death and skin inflammation due to oxidative stress , inhibits iNOS and proinflammatory cytokine expression and demonstrates protective effects in Raw 264.7 cells. TUNEL assay method to measure DNA fragmentation due to DNA damage and DCF-DA measurement used as a measure of reactive oxygen species production level , The protective effect of the Tat-BLVRA fusion protein was confirmed, and it was confirmed that TPA induced edema in the mouse ear, and then the MAPK pathway, the expression of iNOS and COX-2, and the expression of cytokines, . The present inventors propose that the Tat-BLVRA fusion protein can exhibit a therapeutic effect as a protein therapeutic agent in various other reactive oxygen species-related diseases as well as skin inflammation.

본 발명의 BLVRA 융합단백질은 배양세포 실험 및 동물 실험에서 세포 내로 효과적으로 투과하여 현저한 피부염증 치료효과를 나타내었다.
The BLVRA fusion protein of the present invention was effectively permeated into cells in cultured cell and animal experiments and showed remarkable therapeutic effect on skin inflammation.

도 1 a, b, c는 Tat-BLVRA 융합단백질 제조 및 정제에 관한 모식도 및 웨스턴 블랏팅 결과사진이다. Tat-BLVRA 융합단백질 발현벡터 시스템은 pET-15b 벡터에 기반하여 구축하였다. 합성한 Tat 올리고머는 pET-15b의 NdeI 및 XhoI 제한부위 사이에 클론하고, 인간 BLVRA cDNA를 pET-15b의 XhoI 및 BamHI 제한부위 사이에 클론하였다. a는 대조군 BLVRA 단백질과 Tat-BLVRA 융합단백질 다이어그램이다. 각 단백질은 여섯 개의 히스티딘 잔기로 구성된 His 태그를 포함한다. IPTG를 가하여 단백질 발현을 유도하였다. 유도후, 정제된 단백질은 12% SDS-PAGE로 분석하고 항-토끼 폴리히스티딘 항체로 웨스턴 블랏팅하였다 (b, c).
도 2 a, b, c, d는 Raw 264.7 세포 내로 Tat-BLVRA 융합단백질의 투과를 나타낸다. Tat-BLVRA 융합단백질 (0.5~7 μM)과 대조군 BLVRA 단백질을 배양배지에 120분간 가하였고 (a), Tat-BLVRA 융합단백질과 대조군 BLVRA 단백질을 각각 7 μM씩 처리시간을 달리하여 2~48시간 동안 배양배지에 가하여 배양하였다. 웨스턴 블랏팅을 수행하여 띠의 강도를 밀도계로 측정하였다 (c). 세포투과된 Tat-BLVRA 융합단백질의 분포는 형광현미경으로 관찰하였다 (d). 크기 막대 = 20 ㎛.
도 3 a, b, c, d, e, f는 Raw 264.7 세포 내에서 LPS로 유도된 NF-kB, MAPK 및 Akt 활성화에 미치는 Tat-BLVRA 융합단백질의 저해효과를 나타낸다. Raw 264.7 세포는 두 시간 동안 Tat-BLVRA 융합단백질 및 대조군 BLVRA 단백질로 미리 처리하거나 하지 않고 15분간 1 ㎍/㎖ LPS로 자극하였다. 세포 추출액을 제조한 후 MAPK 단백질 활성화를 웨스턴 블랏팅으로 분석하고, 띠의 강도를 밀도계로 측정하였다 (a, b). Raw 264.7 세포는 두 시간 동안 Tat-BLVRA 융합단백질 및 대조군 BLVRA 단백질로 미리 처리하거나 하지 않고 20분간 1 ㎍/㎖ LPS로 자극하였다. 세포 추출액을 제조한 후 Akt 활성화를 웨스턴 블랏팅으로 분석하고, 띠의 강도를 밀도계로 측정하였다 (c, d). Raw 264.7 세포는 두 시간 동안 Tat-BLVRA 융합단백질 및 대조군 BLVRA 단백질로 미리 처리하거나 하지 않고 10분간 1 ㎍/㎖ LPS로 자극하였다. 세포 추출액을 제조한 후 IκB 활성화를 웨스턴 블랏팅으로 분석하고, 띠의 강도를 밀도계로 측정하였다 (e, f). **P <0.01, LPS 처리 세포와 비교한 값임.
도 4 a, b, c, d는 Raw 264.7 세포에서 LPS로 유도된 친염증성 사이토카인 iNOS와 COX-2 발현에 미치는 Tat-BLVRA의 저해효과를 나타낸다. Raw 264.7 세포는 두 시간 동안 Tat-BLVRA 융합단백질 및 대조군 BLVRA 단백질로 미리 처리하거나 하지 않고 12시간 동안 1 ㎍/㎖ LPS로 자극하였다. 세포 용균액을 제조한 후 iNOS와 COX-2 단백질 발현을 웨스턴 블랏팅으로 분석하고, 띠의 강도를 밀도계로 측정하였다 (a, b). Raw 264.7 세포는 두 시간 동안 Tat-BLVRA 융합단백질 및 대조군 BLVRA 단백질로 미리 처리하거나 하지 않고 24시간 동안 1 ㎍/㎖ LPS로 자극하였다. 총 RNA를 세포에서 추출한 후 iNOS, COX-2, IL-1β, IL-6, TNF-α 및 GAPDH mRNA를 특이적 프라이머를 사용하여 RT-PCR 하고, 띠의 강도를 밀도계로 측정하였다 (c, d). Raw 264.7 세포는 두 시간 동안 Tat-BLVRA 융합단백질 및 대조군 BLVRA 단백질로 미리 처리하거나 하지 않고 30분간 1 ㎍/㎖ LPS로 자극하였다. 세포내 활성산소종 수준을 DCF-DA로 염색한 후 DLISA 플레이트 판독기로 형광강도를 측정하였다 (e, f). 크기 막대 = 25 ㎛. **P < 0.01, LPS 처리세포와 비교한 값임.
도 5 a, b, c는 Raw 264.7 세포에서 세포 생존율 및 활성산소종 생산에 미치는 세포투과된 Tat-BLVRA 융합단백질의 효과를 나타낸다. Tat-BLVRA 융합단백질 (0.1-0.4 μM) 및 대조군 BLVRA 단백질 (0.1-0.4 μM)로 두 시간 선처리한 Raw 264.7 세포에 1 ㎍/㎖ LPS를 가하였다. 세포생존율은 트리판 블루 분석법으로 평가하였다 (a). 세포내 활성산소종 수준은 DCF-DA 염색후 측정하였고, 형광강도는 ELISA 플레이트 판독기로 측정하였다 (b). 크기 막대 = 50 ㎛. *P < 0.05와 **P < 0.01은 LPS 처리한 세포와 비교한 값이다. 세포는 TAt-BLVRA 융합단백질 (0.1-0.4 μM)로 두 시간 동안 처리한 후 LPS 1 ㎍/㎖에 네 시간 동안 노출하였다. DNA 조각화는 TUNEL 염색으로 탐지하였고, 형광 강도는 ELISA 플레이트 판독기로 측정하였다 (c). 크기 막대 = 50 ㎛.
도 6 a, b, c는 TPA로 유도되는 귀 부종에 대한 Tat-BLVRA 융합단백질의 저해효과를 나타낸다. 마우스 귀를 TPA (귀 한 쪽에 1 ㎍)로 하루 한 번 삼일간 처리하였다. Tat-BLVRA 융합단백질은 TPA 처리 한 시간 후 3일간 마우스 귀에 국소 도포하였다. 조직학적 분석을 위해 귀 피부 절편을 제조하고, 헤마토자일린과 에오신으로 염색하였다 (a). TPA로 유도되는 귀 부종에 대한 저해는 귀 두께 (b)와 귀 중량 (c)의 변화를 측정하여 분석하였다. 크기 막대 = 50 ㎛와 25 ㎛. **P < 0.01은 TPA 처리한 마우스와 비교한 값이다.
도 7 a, b, c, d는 마우스 귀에서 TPA로 유도되는 iNOS, COX-2, 사이토카인 발현 및 MAPK 활성화에 미치는 Tat-BLVRA 융합단백질의 저해효과를 나타낸다. 마우스는 TPA (귀 한 쪽에 1 ㎍)로 자극한 후 Tat-BLVRA 융합단백질을 귀에 국소도포하였다. 마우스 귀 추출물을 제조하고 웨스턴 블랏팅으로 iNOS와 COX-2 단백질 발현을 분석하였고, 띠 강도는 밀도계로 측정하였다 (a, b). 총 RNA를 귀 생검에서 추출하여 iNOS, COX-2, IL-1β, IL-6, TNF-α 및 GAPDH mRNA를 특이적 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 분석한 후 띠 강도는 밀도계로 측정하였다 (c). **P < 0.01은 TPA 처리 마우스와 비교한 값이다. 마우스 귀는 TPA (귀 한 쪽에 1 ㎍)로 하루 한 번씩 삼 일간 처리하였다. Tat-BLVRA 융합단백질은 TPA 처리 한 시간 후 마우스 귀에 국소 도포하였다. 귀 생검 추출물을 제조하고, 웨스턴 블랏팅으로 MAPK 단백질 활성화를 분석하고 띠 강도는 밀도계로 측정하였다 (d). **P < 0.01은 TPA 처리한 마우스와 비교한 값이다.FIGS. 1A, 1B, and 1C are photographs of the results of a schematic and Western blotting result for the preparation and purification of a Tat-BLVRA fusion protein. The Tat-BLVRA fusion protein expression vector system was constructed based on the pET-15b vector. The synthesized Tat oligomers were cloned between the NdeI and XhoI restriction sites of pET-15b and human BLVRA cDNA cloned between the XhoI and BamHI restriction sites of pET-15b. a is a control BLVRA protein and Tat-BLVRA fusion protein diagram. Each protein contains a His tag consisting of six histidine residues. IPTG was added to induce protein expression. After induction, the purified protein was analyzed by 12% SDS-PAGE and Western blotted with anti-rabbit polyhistidine antibody (b, c).
Figures 2a, b, c, d show the permeation of Tat-BLVRA fusion protein into Raw 264.7 cells. The Tat-BLVRA fusion protein (0.5-7 μM) and the control BLVRA protein were added to the culture medium for 120 minutes (a), and the Tat-BLVRA fusion protein and the control BLVRA protein were treated with 7 μM each for 2 to 48 hours Lt; / RTI &gt; was added to the culture medium for incubation. Western blotting was performed to measure the strength of the band using a density meter (c). The distribution of the permeable Tat-BLVRA fusion protein was observed by fluorescence microscopy (d). Size bar = 20 탆.
Figures 3A, b, c, d, e, and f show the inhibitory effect of Tat-BLVRA fusion protein on LPS-induced NF-kB, MAPK and Akt activation in Raw 264.7 cells. Raw 264.7 cells were stimulated with 1 μg / ml LPS for 15 minutes without pretreatment with Tat-BLVRA fusion protein and control BLVRA protein for two hours. After the cell extract was prepared, activation of MAPK protein was analyzed by Western blotting and the intensity of the band was measured by density meter (a, b). Raw 264.7 cells were stimulated with 1 μg / ml LPS for 20 minutes without pretreatment with Tat-BLVRA fusion protein and control BLVRA protein for two hours. After the cell extract was prepared, Akt activation was analyzed by Western blotting and the intensity of the band was measured by density meter (c, d). Raw 264.7 cells were stimulated with 1 μg / ml LPS for 10 minutes without pretreatment with Tat-BLVRA fusion protein and control BLVRA protein for two hours. After the cell extract was prepared, IκB activation was analyzed by Western blotting and the intensity of the band was measured by density meter (e, f). ** P <0.01, compared with LPS-treated cells.
Figures 4a, b, c, and d show the inhibitory effects of Tat-BLVRA on LPS-induced proinflammatory cytokine iNOS and COX-2 expression in Raw 264.7 cells. Raw 264.7 cells were stimulated with 1 μg / ml LPS for 12 hours without pretreatment with Tat-BLVRA fusion protein and control BLVRA protein for two hours. After preparing the cell culture solution, iNOS and COX-2 protein expression was analyzed by Western blotting and the intensity of the band was measured by density meter (a, b). Raw 264.7 cells were stimulated with 1 μg / ml LPS for 24 hours without pretreatment with Tat-BLVRA fusion protein and control BLVRA protein for two hours. Total RNA was extracted from cells and RT-PCR was performed using specific primers for iNOS, COX-2, IL-1β, IL-6, TNF-α and GAPDH mRNAs and the intensity of the band was measured by density meter (c, d). Raw 264.7 cells were stimulated with 1 μg / ml LPS for 30 minutes without pretreatment with Tat-BLVRA fusion protein and control BLVRA protein for two hours. After intracellular reactive oxygen species levels were stained with DCF-DA, the fluorescence intensity was measured with a DLISA plate reader (e, f). Size bar = 25 탆. ** P <0.01, compared with LPS-treated cells.
Figures 5a, b, and c show the effect of cytotoxic Tat-BLVRA fusion protein on cell survival and reactive oxygen species production in Raw 264.7 cells. 1 μg / ml LPS was added to Raw 264.7 cells pretreated with Tat-BLVRA fusion protein (0.1-0.4 μM) and control BLVRA protein (0.1-0.4 μM) for two hours. Cell viability was assessed by trypan blue assay (a). Intracellular reactive oxygen species levels were measured after DCF-DA staining and fluorescence intensity was measured with an ELISA plate reader (b). Size bar = 50 μm. * P <0.05 and ** P <0.01 compared with LPS treated cells. Cells were treated with TAt-BLVRA fusion protein (0.1-0.4 μM) for two hours and then exposed to 1 μg / ml of LPS for four hours. DNA fragmentation was detected by TUNEL staining and fluorescence intensity was measured by ELISA plate reader (c). Size bar = 50 μm.
Figures 6a, b and c show the inhibitory effect of Tat-BLVRA fusion protein on TPA-induced ear edema. Mouse ears were treated with TPA (1 ug on one side of the ear) for three days once a day. The Tat-BLVRA fusion protein was topically applied to the mouse ear for 3 days after TPA treatment. Ear tissue sections were prepared for histological analysis and stained with hematoxylin and eosin (a). Inhibition of ear edema induced by TPA was measured by measuring changes in ear thickness (b) and ear weight (c). Size bars = 50 μm and 25 μm. ** P <0.01 compared with TPA-treated mice.
Figures 7a, b, c, and d show the inhibitory effect of Tat-BLVRA fusion protein on TPA-induced iNOS, COX-2, cytokine expression and MAPK activation in the mouse ear. Mice were stimulated with TPA (1 ug on either side of the ear) and Tat-BLVRA fusion protein was topically applied to the ear. Mouse ear extracts were prepared and analyzed for iNOS and COX-2 protein expression by Western blotting, and band intensities were measured by density meter (a, b). Total RNA was extracted from ear biopsies and analyzed by RT-PCR using specific primers for iNOS, COX-2, IL-1β, IL-6, TNF-α and GAPDH mRNA c). ** P <0.01 compared with TPA treated mice. Mouse ears were treated with TPA (1 ug per side) for 3 days once a day. The Tat-BLVRA fusion protein was topically applied to the mouse ear after TPA treatment. The ear biopsy extract was prepared, MAPK protein activation was analyzed by Western blotting, and the band intensity was measured by density meter (d). ** P <0.01 compared with TPA-treated mice.

아래에서는 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에만 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in more detail with reference to embodiments. However, it is apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited to the description of the embodiments.

재료material

플라스미드 pET-15b와 이. 콜라이 균주 BL21 (DE3)는 Novagen (Hinlden, Germany)ㅇ에서 구입하였다. 지시된 일차 항체 및 액틴은 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)와 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 각각 구입하였다. TPA는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) 제품이다. 4-6주령 수컷 ICR 마우스는 한림대학교 실험동물센터에서 구입하였다. 다른 모든 화학약품과 시료는 상업적으로 입수 가능한 최상급을 사용하였다.
Plasmid pET-15b and this. Coli strain BL21 (DE3) was purchased from Novagen (Hinlden, Germany). The indicated primary antibodies and actin were purchased from Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA) and Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). TPA is a product of Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). 4-6 week old male ICR mice were purchased from Hallym University Experimental Animal Center. All other chemicals and samples were of the highest available commercially available.

TatTaste -- BLVRABLVRA 융합단백질Fusion protein 발현 및 정제 Expression and purification

세포 침투성 HIV-1 Tat 발현 벡터는 종래 기술에 따라 본 연구실에서 제조하였다 (Kwon et al., 2000). 인간 빌리버딘 환원효소 A의 cDNA 서열은 센스 프라이머 5'-CTCGAGAATACAG AGCCCGAGAG-3' 및 안티센스 프라이머 5'-GGATCCTTACTTCCTTGAACAGCAA -3'를 이용하여 PCR로 증폭하였다. PCR 산물은 자르고, 용출하고, TA-클로닝 벡터에 연결되었다. 인간 BLVRA cDNA를 포함하는 정제된 TA 벡터는 여섯 개의 히스티딘 오픈리딩 프레임과 함께 발현 벡터 내로 연결되어 발현벡터를 제조하였고. 이. 콜라이 DH5α 세포 내로 클론되었다. 유사한 방법으로 Tat 펩타이드를 융합시키지 않은 대조군 BLVRA 단백질을 구축하고 발현하였다.The cell-permeable HIV-1 Tat expression vector was prepared in our laboratory according to the prior art (Kwon et al., 2000). The cDNA sequence of human bilirubidin reductase A was amplified by PCR using sense primer 5'-CTCGAGAATACAG AGCCCGAGAG-3 'and antisense primer 5'-GGATCCTTACTTCCTTGAACAGCAA -3'. The PCR product was cut, eluted, and ligated into the TA-cloning vector. A purified TA vector containing human BLVRA cDNA was ligated into an expression vector together with six histidine open reading frames to produce an expression vector. this. And cloned into E. coli DH5 [alpha] cells. In a similar manner, a control BLVRA protein without Tat peptide fusion was constructed and expressed.

재조합 Tat-BLVAR 플라스미드는 이.콜라이 BL21 세포 (Novagen)로 형질변환되어 0.1mM의 IPTG (Duchefa, Haarlem, Netherlands)로 18 ℃에서 18시간 동안 발현을 유도하였다. 하비스트한 세포는 초음파 처리로 용균하고, Tat-BLVRA 융합단백질은 Ni2 +-나이트릴로삼초산 세파로즈 친화 크로마토그래피로 정제하였다. 염은 PD-10 컬럼 크로마토그래피 (Amersham, Brauncschweig, Germany)로 제거하였다. 단백질 농도는 소 혈청 알부민을 표준물질로 이용하여 브래드로드법으로 측정하였다 (Bradford, 1976).
The recombinant Tat-BLVAR plasmid was transformed into E. coli BL21 cells (Novagen) and induced expression at 18 ° C for 18 hours with 0.1 mM IPTG (Duchefa, Haarlem, Netherlands). The harvested cells were lysed by sonication and the Tat-BLVRA fusion protein was purified by Sepharose affinity chromatography on Ni 2 + -nitriloic acid. The salts were removed by PD-10 column chromatography (Amersham, Braunschweig, Germany). Protein concentration was measured by the Bradford method using bovine serum albumin as a standard (Bradford, 1976).

RawRaw 264.7 세포 내로  Into 264.7 cells TatTaste -- BLVRABLVRA 융합단백질의Of the fusion protein 도입 Introduction

쥐 대식세포 Raw 264.7은 20 mM HEPES/NaOH (pH 7.4), 5 mM NaHCO3, 10% 우태혈청 (FBS) 및 항생제 (100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 100 Ｕ/㎖ 페니실린 및 50 ㎎/㎖의 젠타마이신)를 함유한 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)에서 37 ℃로 95% 공기와 5% CO2의 습한 조건에서 배양하였다.The mouse macrophage Raw 264.7 was incubated with 20 mM HEPES / NaOH (pH 7.4), 5 mM NaHCO3, 10% fetal calf serum (FBS) and antibiotics (100 ug / ml streptomycin, 100 U / ml penicillin and 50 mg / ) were cultured in DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium ) and humid conditions of 95% air and 5% CO 2 in a 37 ℃ containing.

Tat-BLVRA 융합단백질의 세포투과를 위해, 세포는 다양한 농도의 Tat-BLVRA 융합단백질 (0.1~0.4 μM)로 두 시간 동안 처리하였다. 그런 다음, 세포는 트립신-EDTA로 처리하고 PBS로 씻어주었다. 세포를 하비스트한 후 웨스턴 블랏팅을 위해 세포 추출물을 제조하였다.
For cell permeation of the Tat-BLVRA fusion protein, cells were treated with various concentrations of Tat-BLVRA fusion protein (0.1-0.4 μM) for two hours. The cells were then treated with trypsin-EDTA and washed with PBS. Cells were harvested and cell extracts were prepared for Western blotting.

웨스턴Western 블랏Blat 분석 analysis

세포 용균액 단백질은 12% SDS-PAGE로 분리하였다. 분리된 단백질들은 나이트로셀룰로스 막으로 전기전이되었고, 5% 탈지유 함유 PBS로 블로킹시켰다. 막은 토끼 항히스티딘 폴리클론 항체 (1:5000; Santa Cruz Biotechnology)로 탐침한 다음 염소 항토끼 면역글로블린 (dilution 1:5000; Sigma-Aldrich)과 함께 배양하였다. 단백질은 제조자의 지시 (Amersham, Piscataway, NJ, USA)에 따라 강화 화학형광으로 탐지하였다.
The cell culture proteins were separated by 12% SDS-PAGE. The separated proteins were electrotransferred to the nitrocellulose membrane and blocked with PBS containing 5% skim milk. The membranes were probed with rabbit antihistidine polyclonal antibody (1: 5000; Santa Cruz Biotechnology) and then incubated with goat anti-rabbit immunoglobulin (dilution 1: 5000; Sigma-Aldrich). Proteins were detected by intensified chemical fluorescence according to the manufacturer's instructions (Amersham, Piscataway, NJ, USA).

공촛점Confocal 현미경 분석 Microscope analysis

형광물질이 표지된 단백질을 직접 탐지하기 위해, 정제된 Tat-BLVRA 융합단백질과 대조군 BLVRA 단백질을 EZ-레이블 FITC 단백질 레이블 킷트 (Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 레이블하였다. 배양한 Raw 264.7 세포는 커버슬립 상에서 배양하여 3 μM의 Tat-BLVRA 융합단백질과 대조군 BLVRA 단백질로 처리하였다. 37 ℃에서 한 시간 동안 배양한 다음, 세포는 PBS로 두 번 세척하고, 상온에서 3분간 4% 파라포름알데하이드로 고정시켰다. 세포는 침투 가능하도록 처리한 후 3% 우혈청 알부민, 0.1% Triton X-100 함유 PBS (PBS-BT)로 30분간 블로킹시킨 다음 PBS-BT로 세척하였다. 일차 항체 (His-probe, Santa Cruz Biotechnology)는 1:2000으로 희석한 다음 상온에서 한 시간 30분간 배양하였다. 이차 항체 (Alexafluor488, Invitrogen)는 1:15000으로 희석한 후 어두운 곳에서 상온으로 한 시간 배양하였다. 핵은 1:3000로 희석한 1 ㎍/ml DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole; Roche)로 3분간 염색하였다. 형광 분포는 FV-300 공촛점 현미경 (Olympus, Tokyo, Japan)으로 분석하였다.
The purified Tat-BLVRA fusion protein and the control BLVRA protein were labeled using an EZ-label FITC protein label kit (Pierce, Rockford, Ill., USA) to directly detect fluorescently labeled proteins. Cultured Raw 264.7 cells were cultured on cover slips and treated with 3 μM Tat-BLVRA fusion protein and control BLVRA protein. After incubation for one hour at 37 ° C, cells were washed twice with PBS and fixed with 4% paraformaldehyde for 3 minutes at room temperature. Cells were treated for infiltration and blocked with PBS containing 3% rabbit serum albumin, 0.1% Triton X-100 (PBS-BT) for 30 min and washed with PBS-BT. The primary antibody (His-probe, Santa Cruz Biotechnology) was diluted 1: 2000 and incubated at room temperature for one hour and 30 minutes. The secondary antibody (Alexafluor 488, Invitrogen) was diluted 1: 15000 and incubated in the dark for one hour at room temperature. The nuclei were stained with 1 μg / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole; Roche) diluted 1: 3000 for 3 minutes. Fluorescence distribution was analyzed by FV-300 confocal microscope (Olympus, Tokyo, Japan).

iNOSiNOS 및  And COXCOX -2 발현수준 결정-2 expression level determination

Raw 264.7 세포는 6-웰 플레이트에서 12시간 동안 배양하여 70%를 얻었다. 배양 후 세포는 Tat-BLVRA 융합단백질 (0.1-0.4μM)로 두 시간 동안 처리하였고, 이후 LPS (1 ㎍/㎖)로 12시간 동안 처리하였으며, 배양배지를 하비스트하였다. RNA 수준뿐만 아니라 iNOS 및 COX-2 단백질의 발현은 웨스턴 블랏팅과 RT-PCR로 측정하였다.
Raw 264.7 cells were cultured in 6-well plates for 12 hours to yield 70%. After incubation, the cells were treated with Tat-BLVRA fusion protein (0.1-0.4 μM) for two hours, followed by treatment with LPS (1 μg / ml) for 12 hours and harvesting the culture medium. Expression of iNOS and COX-2 proteins as well as RNA levels was measured by Western blotting and RT-PCR.

RTRT -- PCRPCR 분석 analysis

총 RNA는 제조자 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)의 지시에 따라 Easy blue kit를 이용하여 Raw 264.7 세포에서 분리하였다. 그런 다음 RNA (2 ㎍)는 역전사효소 및 올리고-(dT) 프라이머를 이용하여 역전사하였다. cDNA에 대한 PCR 증폭은 다음의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 수행하였다: COX-2 센스 프라이머, 5'-CAAAGGCCTCCATTGACCAGA-3'; COX-2 안티센스 프라이머, 5'-TGGACCAGGTTTTTCCACCG-3'; IL-1β 센스 프라이머, 5'-TGCAGAGTTCCCCAACTGGTACTC-3'; IL-1β 안티센스 프라이머, 5'-GTGCTGCCTAATGTCCCTTGAATC-3'; IL-6 센스 프라이머, 5'-CAAGAAAGACAAAGCCAGAGTCCTT-3'; IL-6 안티센스 프라이머, 5'-TGGATGGTCTTGGTCCCTTAGCC-3'; TNF-α 센스 프라이머, 5'-AAGTTCCCAAATGGCCTCCC-3'; TNF-α 안티센스 프라이머, 5'-TGGCACCACTAGTTGGTTGTCTTT-3'; 및 GADPH 센스 프라이머 5'-TGAAGGTCGGTGAACGGATTTGG-3'; GAPDH 안티센스 프라이머, 5'-CATGTAGGCCATGAGGTCCAC CAC-3'. PCR은 PCR Premix kit (Intron Biotechnology, Seoul, Korea)를 이용하여 수행하였고, 각 프라이머는 72 ℃에서 5분간 처리하여 종결하였다. PCR 산물은 1% 아가로즈 젤 상에서 분리하여 에티듐 브로마이드 염색 후 UV로 관찰하였다.
Total RNA was isolated from Raw 264.7 cells using the Easy blue kit according to the manufacturer's instructions (Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA). RNA (2 μg) was then reverse transcribed using reverse transcriptase and oligo- (dT) primers. PCR amplification for cDNA was performed using the following sense and antisense primers: COX-2 sense primer, 5'-CAAAGGCCTCCATTGACCAGA-3 '; COX-2 antisense primer, 5'-TGGACCAGGTTTTTCCACCG-3 '; IL-1 [beta] sense primer, 5'-TGCAGAGTTCCCCAACTGGTACTC-3 '; IL-1? Antisense primer, 5'-GTGCTGCCTAATGTCCCTTGAATC-3 '; IL-6 sense primer, 5'-CAAGAAAGACAAAGCCAGAGTCCTT-3 '; IL-6 antisense primer, 5'-TGGATGGTCTTGGTCCCTTAGCC-3 '; TNF-α sense primer, 5'-AAGTTCCCAAATGGCCTCCC-3 '; TNF-α antisense primer, 5'-TGGCACCACTAGTTGGTTGTCTTT-3 '; And GADPH sense primer 5'-TGAAGGTCGGTGAACGGATTTGG-3 '; GAPDH antisense primer, 5'-CATGTAGGCCATGAGGTCCAC CAC-3 '. PCR was performed using a PCR Premix kit (Intron Biotechnology, Seoul, Korea), and each primer was terminated by treatment at 72 ° C for 5 minutes. The PCR products were separated on 1% agarose gel, stained with ethidium bromide and observed with UV.

세포생존율 분석Cell survival analysis

세포생존율은 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석법으로 측정하였다. LPS (lippopolysaccaride)로 처리한 Raw 264.7 세포의 세포생존율을 MTT를 이용하여 분석하였다. 세포를 먼저 Tat-BLVRA 융합단백질 (0.1~0.4 μM)로 두 시간 동안 처리한 후, LPS (6 ㎍/㎖)를 배양배지에 20시간 동안 가하였다. 570 ㎚ 흡광도를 ELISA 마이크로플레이트 판독기로 측정하였다.
Cell viability was measured by MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay. The cell viability of Raw 264.7 cells treated with LPS (lippopolysaccaride) was analyzed using MTT. Cells were first treated with Tat-BLVRA fusion protein (0.1-0.4 μM) for two hours and then LPS (6 μg / ml) was added to the culture medium for 20 hours. The absorbance at 570 nm was measured with an ELISA microplate reader.

세포내Intracellular 활성산소종Active oxygen species 수준 측정 Measure level

세포내 활성산소종 수준은 활성산소종 민감성 안료 DCF-DA (2',7'-dichlorofluorescein diacetate)를 이용하여 측정하였는데, 이 안료는 활성산소종에 의해 형광을 띠는 DCF로 변환된다 [13,14]. Raw 264.7 세포는 두 시간 동안 Tat-BLVRA 융합단백질을 가하거나 가하지 않고 배양한 후 1 ㎍ LPS로 30분간 처리하였다. 세포는 PBS로 두 번 세척한 후 DCF-DA (20 M)를 가하여 15분간 배양하였다. 세포의 형광강도는 여기 485 ㎚, 방출 538 ㎚에서 ELISA 플레이트 판독기 (LabsystemsOy, Helsinki, Finland)를 이용하여 측정하였다.
Intracellular reactive oxygen species levels were measured using reactive oxygen species-sensitive pigment, DCF-DA (2 ', 7'-dichlorofluorescein diacetate), which is converted to fluorescent DCF by reactive oxygen species [13, 14]. Raw 264.7 cells were cultured for 2 hours with or without added Tat-BLVRA fusion protein and treated with 1 μg LPS for 30 minutes. Cells were washed twice with PBS and DCF-DA (20 M) was added for 15 min. The fluorescence intensity of the cells was measured using an ELISA plate reader (LabsystemsOy, Helsinki, Finland) at excitation 485 nm and emission 538 nm.

TUNELTUNEL 분석 analysis

Raw 264.7 세포를 Tat-BLVRA 융합단백질 (0.4μM)을 가하거나 가하지 않은 상태로 두 시간 배양한 후 LPS (1 ㎍)로 30분간 처리하였다. TUNEL (Terminal deoxynucleotidyltransferasedUTP nick end labeling) 염색은 Cell Death Detection kit (Roche Applied Science)로 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 사진은 형광현미경 (Nikon eclipse 80i, Japan)으로 촬영하였다.
Raw 264.7 cells were cultured for two hours with and without Tat-BLVRA fusion protein (0.4 μM) and treated with LPS (1 μg) for 30 minutes. Terminal deoxynucleotidyltransferaseUTP nick end labeling (TUNEL) staining was performed according to the manufacturer's instructions with a Cell Death Detection kit (Roche Applied Science). The photographs were taken with a fluorescence microscope (Nikon eclipse 80i, Japan).

TPATPA 로 유도된 Induced 피부염증Skin inflammation 및 조직학적 분석 And histological analysis

4-6주령 ICR 마우스를 일정 온도 (23 ℃) 및 일정 상대습도 (60%)로 12시간은 밝게, 12시간은 어둡게 조절하고, 사료와 물에 자유롭게 접근 가능하도록 하여 사육하였다. 동물과 관련된 모든 실험 절차와 관리는 국립수의과학검역원 (National Veterinary Research & Quarantine Service of Korea)의 실험동물 보호 및 이용에 관한 가이드를 따랐고, 이를 한림대학교 의과대학 동물 보호 및 이용 위원회가 입증한다.4-6 week old ICR mice were bred with constant temperature (23 ° C) and constant relative humidity (60%) for twelve hours light and twelve hours dark and free access to feed and water. All laboratory procedures and controls related to animals have been followed by the National Veterinary Research and Quarantine Service of Korea, which is guided by the Committee on Animal Protection and Utilization.

피부 염증은 각 마우스의 오른쪽 귀에 TPA를 국부적용하여 유도하였다. 다섯 마리의 마우스를 한 군으로 하였다. TPA (1.0 ㎍)를 20 ㎕ 아세톤에 용해시켜 마우스 귀 안쪽 표면 및 바깥 표면에 3일 동안 매일 적용하였다. Tat-BLVRA 융합단백질 (10 ㎍)과 대조군 BLVRA 단백질 (10 ㎍)을 TPA 처리한 다음 한 시간 후 마우스 귀에 국부 적용하였다. 3일째, TPA를 적용하고 한 시간 경과한 후 Tat-BLVRA 융합단백질과 대조군 BLVRA 단백질을 동일 부위에 적용하였다. 융합단백질을 최종 처리하고 24시간이 경과한 후 마우스는 희생되어 5 ㎜ 직경의 귀 생검을 펀치 (Kai Industries, Gifu, Japan)로 얻어 중량을 측정하였다. 귀 두께는 디지탈 두께 측정기 (Mitutoyo Corporation, Toyko, Japan)로 측정하였다. 조직학적 분석을 위해 귀 생검은 4% 파라포름알데하이드로 고정시켰고, 파라핀에 포매하고 5 ㎛ 두께로 절편화한 후 헤마토자일린과 에오신으로 염색하였다.
Skin inflammation was induced by local application of TPA to the right ear of each mouse. Five mice were used as one group. TPA (1.0 [mu] g) was dissolved in 20 [mu] l acetone and applied to the inner and outer surfaces of the mouse ear daily for 3 days. Tat-BLVRA fusion protein (10 [mu] g) and control BLVRA protein (10 [mu] g) were treated with TPA and then applied locally to the mouse ear one hour later. On day 3, one hour after application of TPA, Tat-BLVRA fusion protein and control BLVRA protein were applied to the same site. After 24 hours of the final treatment of the fusion protein, the mice were sacrificed and the ear biopsy of 5 mm diameter was punched (Kai Industries, Gifu, Japan) and weighed. Ear thickness was measured with a digital thickness meter (Mitutoyo Corporation, Toyko, Japan). For histological analysis, the ear biopsy was fixed with 4% paraformaldehyde, embedded in paraffin, sectioned to 5 ㎛ thickness, and stained with hematoxylin and eosin.

통계학적 분석Statistical analysis

데이타는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 각 군간 비교는 Student’s t-test와 일방 ANOVA를 이용하였다. 오차는 P <0.01일 때 유의한 것으로 하였다.
Data are presented as mean ± standard deviation. Student's t-test and one-way ANOVA were used for comparison between the groups. The error was statistically significant when P <0.01.

결과 1: Result 1: TatTaste -- BLVRABLVRA 융합단백질Fusion protein 정제 refine

인간 BLVRA cDNA를 Tat 펩타이드가 포함된 pET-15b 플라스미드에 서브클론하여 세포 내로 투과할 수 있는 발현벡터를 가진 Tat-BLVRA를 제조하였다. 제조된 Tat-BLVRA 발현벡터는 아미노 말단에 연속적으로 인간 BLVRA cDNA 서열, Tat 펩타이드, 6개의 히스티딘 잔기를 포함하고 있다 (도 1의 A). 또한, Tat 펩타이드가 없는 대조군 BLVRA 발현벡터를 제조하였다. Tat-BLVRA 융합단백질과 대조군 BLVRA 단백질 발현을 유도한 후 니켈 이온-나이트릴로삼초산 세파로즈 친화 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 발현된 단백질을 정제하였고 PD-10 컬럼을 이용하여 염을 비롯한 다른 불순물들을 제거하였다. Tat-BLVRA 융합단백질과 대조군 BLVRA 단백질의 순도는 SDS-PAGE와 웨스턴 블랏 분석을 통하여 확인하였다 (도 1의 B, 1의 C). 발현 후 정제한 Tat-BLVRA 융합단백질은 약 38kDa의 예측 분자질량을 가지고 있다. Tat-BLVRA 융합단백질은 항 토끼 폴리히스티딘 항체를 사용하여 웨스턴 블랏 분석으로 확인하였다.
Human BLVRA cDNA was subcloned into a pET-15b plasmid containing the Tat peptide to prepare Tat-BLVRA having an expression vector capable of penetrating into cells. The Tat-BLVRA expression vector thus prepared contains a human BLVRA cDNA sequence, a Tat peptide, and six histidine residues consecutively at the amino terminus (FIG. 1A). In addition, a control BLVRA expression vector free of Tat peptide was prepared. After expressing the Tat-BLVRA fusion protein and the control BLVRA protein, the expressed protein was purified using a sepharose affinity chromatograph column with nickel ion-nitrilate, and PD-10 column was used to remove salts and other impurities Respectively. The purity of the Tat-BLVRA fusion protein and the control BLVRA protein was confirmed by SDS-PAGE and Western blot analysis (C in Fig. 1, B, 1). After expression, the purified Tat-BLVRA fusion protein has a predicted molecular mass of about 38 kDa. The Tat-BLVRA fusion protein was confirmed by Western blot analysis using anti-rabbit polyhistidine antibody.

결과 2: Result 2: Raw2Raw2 64.7 세포 내로  64.7 cells TatTaste -- BLVRABLVRA 융합단백질Fusion protein 도입 Introduction

Tat-BLVRA 융합단백질의 세포 침투를 확인하기 위해 Raw 264.7 세포에 2시간 동안 Tat-BLVRA 융합단백질을 다양한 농도 (0.5-7 μM)로 처리하여 웨스턴 블랏팅으로 측정하였다 (도 2a). Tat-BLVRA 융합단백질은 농도 의존적으로 세포 내에 도입되는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 세포 내로 투과된 Tat-BLVRA 융합단백질은 최대 7 μM 농도에서 포화되었다. 이 결과는 Tat-BLVRA 융합단백질이 세포투과되는 최대 농도가 7 μM이라는 것을 나타낸다. 우리는 또한 Tat-BLVRA 융합단백질 7 μM을 다양한 시간 동안 (10-120분) 처리하여 세포 내로 시간 의존적으로 투과되는 것을 단백질 수준에서 웨스턴 블랏팅으로 분석했다 (도 2b). Tat-BLVRA 융합단백질은 세포 내로 120분까지 단계별로 투과되었다. 도 2a와 2b의 결과로 보아 Tat-BLVRA 융합단백질이 농도별, 시간별로 세포 내로 효과적으로 투과되는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 단백질 수송 도메인을 가지고 있지 않은 대조군 BLVRA 단백질은 세포 내로 투과되지 않았다. 다음으로 우리는 Raw 264.7 세포에서 Tat-BLVRA 융합단백질이 세포 내에 얼마나 안정적으로 존재하는지 알아보았다. Tat-BLVRA 융합단백질을 7 μM 농도로 세포의 배양배지에 다양한 시간 동안 처리하여 그 결과를 단백질 수준에서 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다. 띠의 농도는 밀도계를 사용하여 측정하였다 (도 2c). 그 결과, Tat-BLVRA 융합단백질은 관찰 시간 동안 세포 내에서 점차적으로 감소하였지만 최대 48시간까지 존재하는 것을 확인하였다. Raw 264.7 세포로 Tat-BLVRA 융합단백질의 투과는 직접 형광 분석법으로 확인하였다. 단백질의 세포 위치를 명확히 하기 위해서 핵 특이적 마커인 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)를 사용하여 염색하였다 (도 2d). 파라포름알데하이드에 의한 세포 고정이 Tat-BLVRA 융합단백질의 형광에 직접적으로 영향을 주지 않았다. Tat-BLVRA 융합단백질은 거의 모든 배양세포 내로 침투되는 반면 대조군 BLVRA 단백질을 처리한 경우 BLVRA 단백질은 세포 내에서 발견되지 않았다. 본 발명자들은 Tat-BLVRA 융합단백질을 처리한 세포에서 BLVRA 단백질의 활성을 결정했다. 동일한 실험 조건 하에서 Raw 264.7 세포로 투과된 Tat-BLVRA 융합단백질의 활성을 도 2D에 나타내었다. 이러한 결과는 Tat-BLVRA 융합단백질이 효율적으로 세포에 투과되어 활성을 나타냄을 의미한다.
To confirm cell penetration of Tat-BLVRA fusion protein, Raw 264.7 cells were treated with various concentrations (0.5-7 μM) of Tat-BLVRA fusion protein for 2 hours and measured by Western blotting (FIG. It was confirmed that the Tat-BLVRA fusion protein was introduced into cells in a concentration-dependent manner. However, the Tat-BLVRA fusion protein permeated into the cells saturates at a maximum concentration of 7 μM. This result indicates that the maximum concentration of the Tat-BLVRA fusion protein is 7 μM. We also analyzed 7 μM of the Tat-BLVRA fusion protein for various time periods (10-120 min) and time-dependent penetration into the cells by Western blotting at the protein level (FIG. 2B). The Tat-BLVRA fusion protein was transfected into the cells stepwise up to 120 minutes. As shown in FIGS. 2A and 2B, it was confirmed that the Tat-BLVRA fusion protein was effectively permeated into cells by concentration and time. However, control BLVRA protein not carrying the protein transduction domain was not penetrated into the cells. Next, we examined how stable the Tat-BLVRA fusion protein is in the cells in Raw 264.7 cells. The Tat-BLVRA fusion protein was treated at a concentration of 7 μM in the culture medium for various times and the results were confirmed by Western blotting at the protein level. The concentration of the band was measured using a density meter (Fig. 2C). As a result, it was confirmed that Tat-BLVRA fusion protein gradually decreased in the cells during the observation time but remained up to 48 hours. The permeation of Tat-BLVRA fusion protein into Raw 264.7 cells was confirmed by direct fluorescence analysis. In order to clarify the cell position of the protein, DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole), which is a nuclear specific marker, was used to stain (Fig. Cellular fixation by paraformaldehyde did not directly affect the fluorescence of the Tat-BLVRA fusion protein. Tat-BLVRA fusion protein infiltrated into almost all cultured cells whereas BLVRA protein was not found in cells when treated with control BLVRA protein. We determined the activity of BLVRA protein in cells treated with Tat-BLVRA fusion protein. The activity of Tat-BLVRA fusion protein permeabilized with Raw 264.7 cells under the same experimental conditions is shown in Figure 2D. These results indicate that Tat-BLVRA fusion protein is efficiently permeated into cells and is active.

결과 3: Result 3: RawRaw 264.7 세포에서  In 264.7 cells LPSLPS 로 유도되는 Induced MAPKMAPK 활성화에 미치는  On activation TatTaste -BLVRA -BLVRA 융합단백질의Of the fusion protein 효과 effect

본 실험은 p38, JNK (c-Jun N-terminal kinase) 그리고 ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinase)를 포함한 MAPK, Akt와 NF-κB의 활성에서 Tat-BLVRA 융합단백질의 효과에 대해서 조사하기 위해 수행하였다. MAPK 신호와 NF-κb는 Raw 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 염증 반응에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있으며, Akt는 여러 신호 전달기작의 초기에 관여하며 IκB를 인산화하여 NF-κB 활성에 영향을 미친다고 알려져 있다. LPS에 의해 유도된 MAPK 활성화에 미치는 Tat-BLVRA 융합단백질의 효과를 조사하기 위해 Raw 264.7 세포에서 Tat-BLVRA 융합단백질이 존재하거나 존재하지 않을 때 LPS 1㎍/㎖으로 20분 동안 세포에 자극을 준 다음 MAPKs에 대한 특정 항체를 사용하여 웨스턴 블랏팅하여 분석하였다 (도 3a). Tat-BLVRA 융합단백질을 처리한 세포에서는 LPS에 의해 유도된 p38, ERK1/2, JNK의 수준이 감소하였다. 다음으로, Akt의 활성화에 대해 Tat-BLVRA 융합단백질의 효과를 알아보기 위해 Raw 264.7 세포에서 Tat-BLVRA 융합단백질이 존재하거나 존재하지 않을 때 LPS 1㎍/㎖을 10분 동안 처리한 다음 Akt 항체를 사용하여 웨스턴 블랏팅하여 분석하였다 (도 3c). 또한, LPS에 의해 유도된 IκB 인산화와 IκB 분해 (degradation)를 포함한 NF-κB 활성의 신호 단계에서 Tat-BLVRA 융합단백질의 규제효과를 조사하였다. Tat-BLVRA 융합단백질을 처리한 세포에서는 LPS에 의해 유도된 IκB 인산화와 IκB 분해가 억제되었다 (도 3e). 그러나, 대조군 BLVRA 단백질을 처리한 세포에서는 MAPK, Akt와 NF-κB의 활성화에 영향이 없었다 (도 3b, 3d, 3f).
To investigate the effect of Tat-BLVRA fusion protein on MAPK, Akt and NF-κB activities including p38, JNK (c-Jun N-terminal kinase) and ERK1 / 2 (extracellular signal-regulated kinase) Respectively. MAPK signal and NF-κb are known to play an important role in LPS-induced inflammatory responses in Raw 264.7 cells. Akt is involved early in several signaling pathways and phosphorylates IκB to affect NF-κB activity It is known. In order to investigate the effect of Tat-BLVRA fusion protein on LPS-induced MAPK activation, cells were stimulated for 20 minutes with 1 μg / ml of LPS in the presence or absence of Tat-BLVRA fusion protein in Raw 264.7 cells And analyzed by Western blotting using specific antibodies for the following MAPKs (Figure 3a). In the cells treated with the Tat-BLVRA fusion protein, the level of p38, ERK1 / 2, and JNK induced by LPS decreased. Next, in order to examine the effect of Tat-BLVRA fusion protein on the activation of Akt, when Tat-BLVRA fusion protein is present or absent in Raw 264.7 cells, 1 μg / ml of LPS is treated for 10 minutes and Akt antibody (Figure 3c). In addition, the regulatory effect of Tat-BLVRA fusion protein at the signaling stage of NF-κB activation including IκB phosphorylation and IκB degradation induced by LPS was investigated. In the cells treated with the Tat-BLVRA fusion protein, LPS-induced IκB phosphorylation and IκB degradation were inhibited (FIG. 3e). However, activation of MAPK, Akt and NF-κB was not affected in cells treated with control BLVRA protein (FIGS. 3b, 3d, 3f).

결과 4: Result 4: RawRaw 264.7 세포에서  In 264.7 cells LPSLPS 로 유도된 염증반응 및 Induced inflammatory response and 활성산소종Active oxygen species 생성에 미치는  On the production of TatTaste -- BLVRABLVRA 융합단백질의Of the fusion protein 효과 effect

LPS로 COX-2, iNOS를 유도시킨 다음 Tat-BLVRA 융합단백질의 효과를 평가하였다. Raw 264.7 세포에서 Tat-BLVRA 융합단백질이 존재하거나 존재하지 않을 때 LPS 1 ㎍/㎖를 12시간 처리하였다. Tat-BLVRA 융합단백질은 LPS에 의해 유도된 COX-2, iNOS의 단백질 발현량을 농도 의존적으로 감소시켰다 (도 4a, 4b). 다음으로 LPS에 의해 자극받은 Raw 264.7 세포에서 친염증성 사이토카인의 생산 및 활성산소종 생성에 미치는 Tat-BLVRA 융합단백질의 효과에 대해서 실험하였다. 사이토카인 수준은 LPS를 단독 처리한 후에 증가하였다. Tat-BLVRA 융합단백질은 IL-1β, IL-6, iNOS 그리고 TNF-α의 생산을 눈에 띄게 감소시켰다. 그러나, COX-2의 생산은 Tat-BLVRA 융합단백질을 세포도입 시켰을 때 약간 감소하였다. 반면, 대조군 BLVRA 단백질을 처리한 세포에서는 사이토카인 수준이 감소하지 않았다 (도 4c, 4d). 이러한 결과들은 Tat-BLVRA 융합단백질이 LPS에 의해 유도된 COX-2, iNOS, 그리고 사이토카인 발현수준을 억제시킴을 말해준다.
The effect of Tat-BLVRA fusion protein was assessed by induction of COX-2 and iNOS with LPS. When Tat-BLVRA fusion protein was present or absent in Raw 264.7 cells, 1 μg / ml of LPS was treated for 12 hours. The Tat-BLVRA fusion protein decreased the amount of protein expression of COX-2, iNOS induced by LPS in a concentration-dependent manner (Fig. 4a, 4b). Next, the effect of Tat-BLVRA fusion protein on the production of proinflammatory cytokines and reactive oxygen species production in Raw 264.7 cells stimulated by LPS was examined. Cytokine levels increased after LPS alone treatment. The Tat-BLVRA fusion protein markedly reduced the production of IL-1β, IL-6, iNOS and TNF-α. However, the production of COX-2 was slightly decreased when the Tat-BLVRA fusion protein was introduced into the cells. On the other hand, cytokine levels did not decrease in cells treated with control BLVRA protein (Fig. 4c, 4d). These results suggest that Tat-BLVRA fusion protein inhibits LPS-induced COX-2, iNOS, and cytokine expression levels.

결과 5: 산화 스트레스 하에서 세포생존율에 미치는 Result 5: Effect on cell viability under oxidative stress TatTaste -- BLVRABLVRA 융합단백질의Of the fusion protein 영향 effect

산화 스트레스 하에서 Tat-BLVRA 융합단백질의 세포 투과 여부에 따라 세포가 보호되는지 확인하기 위하여, 세포에 LPS를 처리한 후 MTT {3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide} 분석을 수행하여 세포생존율을 측정하였다. 세포가 LPS 6 ㎍/㎖에 노출되었을 때 세포는 오직 49%만 생존했다 (도 5a). 도 5a의 결과를 보면 세포가 LPS에 노출되었을 때 Tat-BLVRA 융합단백질을 먼저 처리한 세포들은 세포생존율이 75%까지 증가하였다. 그러나, 대조군 BLVRA 단백질을 먼저 처리한 세포에서는 같은 조건 아래에서 세포를 보호하는 효과가 나타나지 않았다.In order to confirm that the cells were protected according to the cell permeability of Tat-BLVRA fusion protein under oxidative stress, MTT {3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide} assay was performed to determine cell viability. When the cells were exposed to 6 μg / ml of LPS, only 49% of the cells survived (FIG. 5a). As shown in FIG. 5A, when cells were exposed to LPS, cells treated with Tat-BLVRA fusion protein increased cell viability up to 75%. However, the cells treated with the control BLVRA protein did not show the effect of protecting the cells under the same conditions.

우리는 또한 Tat-BLVRA 융합단백질의 세포도입이 활성산소종 생성 억제 효과를 나타내는지를 시험하였다. 활성산소종 수준 세포에 LPS를 처리하였을 때 증가했다. 또한, 세포에 Tat-BLVRA 융합단백질을 처리하였을 때 활성산소종 생성이 현저하게 감소한 반면, 대조군 BLVRA 단백질을 처리한 세포는 그렇지 않았다 (도 5b).We also tested whether the cytotoxic effect of Tat-BLVRA fusion protein on the production of reactive oxygen species. And increased when LPS was treated with reactive oxygen species level cells. In addition, treatment of Tat-BLVRA fusion protein with cells significantly reduced reactive oxygen species production, whereas cells treated with control BLVRA protein did not (Fig. 5b).

다음으로, 세포 내로 투과된 Tat-BLVRA 융합단백질이 DNA 조각화 (fragmentation)에 대하여 보호효과를 나타내는지를 TUNEL 염색을 통하여 확인하였다 (도 5c). 도 5c의 결과를 보면, LPS를 처리한 세포들 사이에서 염색된 세포들의 수가 대조군과 비교하여 현저하게 증가하였고, 반면 Tat-BLVRA 융합단백질을 처리한 세포들은 염색된 세포의 수가 눈에 띄게 감소하였다. 그러나, 대조군 BLVRA 단백질을 처리한 염색된 세포의 수는 LPS 처리군과 비슷했다.Next, it was confirmed by TUNEL staining that the Tat-BLVRA fusion protein permeated into the cells showed a protective effect against DNA fragmentation (Fig. 5C). 5C, the number of stained cells among LPS-treated cells was significantly increased compared with the control group, whereas the number of stained cells in Tat-BLVRA fusion protein-treated cells was significantly reduced . However, the number of stained cells treated with control BLVRA protein was similar to that of the LPS-treated group.

이러한 결과들은 세포 투과된 Tat-BLVRA 융합단백질이 세포사멸을 유도하는 산화 스트레스에 대항하는 중요한 세포사멸 방어 기작을 수행한다는 것을 의미한다.
These results indicate that the cell-permeable Tat-BLVRA fusion protein performs an important cell death defense mechanism against oxidative stress leading to apoptosis.

결과 6: 마우스에서 Result 6: TPATPA 로 유도된 귀 부종에 대한 Of induced ear edema TatTaste -- BLVRABLVRA 융합단백질의Of the fusion protein 효과 effect

피부염증에서 일반적인 모델은 TPA (Tetradecanoylphorbol Acetate)로 유도한 마우스 귀 부종 모델이다. TPA의 여러 국소 응용 프로그램으로 마우스 귀에 만성 피부염증을 유도시켰다. 마우스 귀에 3일 동안 TPA를 세 번 처리하여 염증을 유발시켜 귀 무게뿐만 아니라 귀 두께를 증가시키고 염증성 세포 침윤을 유도시켰다. 마우스 귀에 Tat-BLVRA 융합단백질을 1시간 처리한 후 하루에 한 번씩 3일 동안 TPA를 처리하였을 때 귀 두께와 무게를 검사한 결과, TPA로 유도된 부종과 증식은 현저히 억제되었고, 반면 대조군 BLVRA 단백질은 억제 효과가 나타나지 않았다 (도 6a, 6b, 6c). 다음으로, TPA에 의해 유도된 MAPK 활성화, COX-2, iNOS 그리고 친염증성 사이토카인의 발현 대한 Tat-BLVRA 융합단백질의 효과를 알아보았다. 마우스 귀에 Tat-BLVRA 융합단백질을 한 시간 처리한 후 TPA를 함께 한 시간 처리하였을 때 조직 균질화물 (tissue homogenates)에서 MAPK, COX-2, iNOS 그리고 사이토카인 발현 정도를 측정하였다. TPA를 처리한 마우스 귀에 Tat-BLVRA 융합단백질을 도포한 후 귀 생검 시료에서 COX-2, iNOS의 발현을 평가하였다. 마우스 귀에 TPA를 처리한 후 Tat-BLVRA 융합단백질을 도포해준 다음, RT-PCR과 웨스턴 블랏팅을 통해 분석한 결과, iNOS, COX-2의 mRNA 발현이 억제되었다. 그러나, 대조군 BLVRA 단백질은 거의 억제 효과를 나타내지 않았다 (도 7a, 7b). Tat-BLVRA 융합단백질은 IL-1β, IL-6, TNF-α와 같은 친염증성 사이토카인의 생산도 현저히 감소시킨 반면, 대조군 BLVRA 단백질은 사이토카인 수준을 감소시키지 못하였다 (도 7c).A common model for skin inflammation is the mouse ear edema model induced by TPA (Tetradecanoylphorbol Acetate). Several topical applications of TPA have induced chronic skin inflammation in the mouse ear. The mouse ear was treated with TPA three times for 3 days to induce inflammation to increase ear thickness as well as ear thickness and to induce inflammatory cell infiltration. TPA-induced edema and proliferation were significantly inhibited in the ear thickness and weight of TPV treated with Tat-BLVRA fusion protein for 1 hour, (Figs. 6A, 6B and 6C). Next, we examined the effects of TPA-induced MAPK activation, COX-2, iNOS and proinflammatory cytokines on Tat-BLVRA fusion protein. The expression of MAPK, COX-2, iNOS and cytokine was measured in tissue homogenates when Tat-BLVRA fusion protein was treated with TPA for one hour. Expression of COX-2 and iNOS was evaluated in eukaryotic biopsy specimens after Tat-BLVRA fusion protein was applied to TPA-treated mouse ears. The expression of iNOS and COX-2 mRNA was inhibited by RT-PCR and Western blotting after applying TPA to the mouse ear and Tat-BLVRA fusion protein. However, the control BLVRA protein showed almost no inhibitory effect (FIGS. 7A and 7B). The Tat-BLVRA fusion protein also significantly reduced the production of proinflammatory cytokines such as IL-1β, IL-6, and TNF-α, whereas control BLVRA protein did not decrease cytokine levels (FIG.

TPA를 마우스 귀에 처리하면 다양한 친염증성 유전자들의 발현 조절을 통해 MAPK의 활성화가 유도된다. 그래서 우리는 TPA에 의해 유도된 MAPK의 활성화에 미치는 Tat-BLVRA 융합단백질의 기능을 확인하는 실험을 진행하였다. 먼저 Tat-BLVRA 융합단백질을 마우스 귀에 도포한 후 TPA를 처리하고, 생검 조직에서 웨스턴 블랏팅으로 MAPKs 활성화를 분석하였다 (도 7d). 도 7d와 같이 Tat-BLVRA 융합단백질은 TPA로 유도한 p38, ERK1/2, 그리고 JNK의 인산화를 감소시켰다. 반면, 대조군 BLVRA 단백질은 MAPK 활성에 어떠한 영향도 미치지 않았다.Treatment of TPA with mouse ears leads to the activation of MAPK through modulation of various proinflammatory genes. Therefore, we conducted an experiment to confirm the function of Tat-BLVRA fusion protein on TPA-induced activation of MAPK. First, the Tat-BLVRA fusion protein was applied to the mouse ear, treated with TPA, and MAPKs activation was analyzed by Western blotting in biopsy tissue (Fig. 7d). As shown in Figure 7d, the Tat-BLVRA fusion protein reduced TPA-induced phosphorylation of p38, ERK1 / 2, and JNK. On the other hand, the control BLVRA protein had no effect on MAPK activity.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation, Hallym University <120> Pharmaceutical composition for treating skin inflammation containing biliverdin reductase A fusion protein <130> hallym-tatBLVRA <160> 19 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 1 taggaagaag cggagacagc gacgaagac 29 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 2 tcgagtcttc gtcgctgtct ccgcttcttc c 31 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ctcgagatgg cagaaccgca gcccccgtcc 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ctcgagatga aggtagaggt gctgcctgcc 30 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 5 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ctcgagaata cagagcccga gag 23 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggatccttac ttccttgaac agcaa 25 <210> 8 <211> 924 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of Tat-BLVRA fusion protein <400> 8 aggaagaagc ggagacagcg acgaagactc gagatgaatg cagagcccga gaggaagttt 60 ggcgtggtgg tggttggtgt tggccgagcc ggctccgtgc ggatgaggga cttgcggaat 120 ccacaccctt cctcagcgtt cctgaacctg attggcttcg tgtcgagaag ggagctcggg 180 agcattgatg gagtccagca gatttctttg gaggatgctc tttccagcca agaggtggag 240 gtcgcctata tctgcagtga gagctccagc catgaggact acatcaggca gttccttaat 300 gctggcaagc acgtccttgt ggaatacccc atgacactgt cattggcggc cgctcaggaa 360 ctgtgggagc tggctgagca gaaaggaaaa gtcttgcacg aggagcatgt tgaactcttg 420 atggaggaat tcgctttcct gaaaaaagaa gtggtgggga aagacctgct gaaagggtcg 480 ctcctcttca cagctggccc gttggaagaa gagcggtttg gcttccctgc attcagcggc 540 atctctcgcc tgacctggct ggtctccctc tttggggagc tttctcttgt gtctgccact 600 ttggaagagc gaaaggaaga tcagtatatg aaaatgacag tgtgtctgga gacagagaag 660 aaaagtccac tgtcatggat tgaagaaaaa ggacctggtc taaaacgaaa cagatattta 720 agcttccatt tcaagtctgg gtccttggag aatgtgccaa atgtaggagt gaataagaac 780 atatttctga aagatcaaaa tatatttgtc cagaaactct tgggccagtt ctctgagaag 840 gaactggctg ctgaaaagaa acgcatcctg cactgcctgg ggcttgcaga agaaatccag 900 aaatattgct gttcaaggaa gtaa 924 <210> 9 <211> 307 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tat-BLVRA fusion protein <400> 9 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Glu Met Asn Ala Glu Pro 1 5 10 15 Glu Arg Lys Phe Gly Val Val Val Val Gly Val Gly Arg Ala Gly Ser 20 25 30 Val Arg Met Arg Asp Leu Arg Asn Pro His Pro Ser Ser Ala Phe Leu 35 40 45 Asn Leu Ile Gly Phe Val Ser Arg Arg Glu Leu Gly Ser Ile Asp Gly 50 55 60 Val Gln Gln Ile Ser Leu Glu Asp Ala Leu Ser Ser Gln Glu Val Glu 65 70 75 80 Val Ala Tyr Ile Cys Ser Glu Ser Ser Ser His Glu Asp Tyr Ile Arg 85 90 95 Gln Phe Leu Asn Ala Gly Lys His Val Leu Val Glu Tyr Pro Met Thr 100 105 110 Leu Ser Leu Ala Ala Ala Gln Glu Leu Trp Glu Leu Ala Glu Gln Lys 115 120 125 Gly Lys Val Leu His Glu Glu His Val Glu Leu Leu Met Glu Glu Phe 130 135 140 Ala Phe Leu Lys Lys Glu Val Val Gly Lys Asp Leu Leu Lys Gly Ser 145 150 155 160 Leu Leu Phe Thr Ala Gly Pro Leu Glu Glu Glu Arg Phe Gly Phe Pro 165 170 175 Ala Phe Ser Gly Ile Ser Arg Leu Thr Trp Leu Val Ser Leu Phe Gly 180 185 190 Glu Leu Ser Leu Val Ser Ala Thr Leu Glu Glu Arg Lys Glu Asp Gln 195 200 205 Tyr Met Lys Met Thr Val Cys Leu Glu Thr Glu Lys Lys Ser Pro Leu 210 215 220 Ser Trp Ile Glu Glu Lys Gly Pro Gly Leu Lys Arg Asn Arg Tyr Leu 225 230 235 240 Ser Phe His Phe Lys Ser Gly Ser Leu Glu Asn Val Pro Asn Val Gly 245 250 255 Val Asn Lys Asn Ile Phe Leu Lys Asp Gln Asn Ile Phe Val Gln Lys 260 265 270 Leu Leu Gly Gln Phe Ser Glu Lys Glu Leu Ala Ala Glu Lys Lys Arg 275 280 285 Ile Leu His Cys Leu Gly Leu Ala Glu Glu Ile Gln Lys Tyr Cys Cys 290 295 300 Ser Arg Lys 305 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 caaaggcctc cattgaccag a 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 tggaccaggt ttttccaccg 20 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tgcagagttc cccaactggt actc 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gtgctgccta atgtcccttg aatc 24 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 caagaaagac aaagccagag tcctt 25 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 tggatggtct tggtccctta gcc 23 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 aagttcccaa atggcctccc 20 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 tggcaccact agttggttgt cttt 24 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 tgaaggtcgg tgaacggatt tgg 23 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 catgtaggcc atgaggtcca ccac 24 <110> Industry Academic Cooperation Foundation, Hallym University <120> Pharmaceutical composition for treating skin inflammation          containing biliverdin reductase A fusion protein <130> hallym-tatBLVRA <160> 19 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 1 taggaagaag cggagacagc gacgaagac 29 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 2 tcgagtcttc gtcgctgtct ccgcttcttc c 31 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ctcgagatgg cagaaccgca gcccccgtcc 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ctcgagatga aggtagaggt gctgcctgcc 30 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 5 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg   1 5 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ctcgagaata cagagcccga gag 23 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggatccttac ttccttgaac agcaa 25 <210> 8 <211> 924 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of Tat-BLVRA fusion protein <400> 8 aggaagaagc ggagacagcg acgaagactc gagatgaatg cagagcccga gaggaagttt 60 ggcgtggtgg tggttggtgt tggccgagcc ggctccgtgc ggatgaggga cttgcggaat 120 ccacaccctt cctcagcgtt cctgaacctg attggcttcg tgtcgagaag ggagctcggg 180 agcattgatg gagtccagca gatttctttg gaggatgctc tttccagcca agaggtggag 240 gtcgcctata tctgcagtga gagctccagc catgaggact acatcaggca gttccttaat 300 gctggcaagc acgtccttgt ggaatacccc atgacactgt cattggcggc cgctcaggaa 360 ctgtgggagc tggctgagca gaaaggaaaa gtcttgcacg aggagcatgt tgaactcttg 420 atggaggaat tcgctttcct gaaaaaagaa gtggtgggga aagacctgct gaaagggtcg 480 ctcctcttca cagctggccc gttggaagaa gagcggtttg gcttccctgc attcagcggc 540 atctctcgcc tgacctggct ggtctccctc tttggggag tttctcttgt gtctgccact 600 ttggaagagc gaaaggaaga tcagtatatg aaaatgacag tgtgtctgga gacagagaag 660 aaaagtccac tgtcatggat tgaagaaaaa ggacctggtc taaaacgaaa cagatattta 720 agcttccatt tcaagtctgg gtccttggag aatgtgccaa atgtaggagt gaataagaac 780 atatttctga aagatcaaaa tatatttgtc cagaaactct tgggccagtt ctctgagaag 840 gaactggctg ctgaaaagaa acgcatcctg cactgcctgg ggcttgcaga agaaatccag 900 aaatattgct gttcaaggaa gtaa 924 <210> 9 <211> 307 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tat-BLVRA fusion protein <400> 9 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Glu Met Asn Ala Glu Pro   1 5 10 15 Glu Arg Lys Phe Gly Val Val Val Gly Val Gly Arg Ala Gly Ser              20 25 30 Val Arg Met Arg Asp Leu Arg Asn Pro His Ser Ser Ala Phe Leu          35 40 45 Asn Leu Ile Gly Phe Val Ser Arg Arg Glu Leu Gly Ser Ile Asp Gly      50 55 60 Val Gln Gln Ile Ser Leu Glu Asp Ala Leu Ser Ser Gln Glu Val Glu  65 70 75 80 Val Ala Tyr Ile Cys Ser Glu Ser Ser Ser His Glu Asp Tyr Ile Arg                  85 90 95 Gln Phe Leu Asn Ala Gly Lys His Val Leu Val Glu Tyr Pro Met Thr             100 105 110 Leu Ser Leu Ala Ala Ala Gln Glu Leu Trp Glu Leu Ala Glu Gln Lys         115 120 125 Gly Lys Val Leu His Glu Glu His Val Glu Leu Leu Met Glu Glu Phe     130 135 140 Ala Phe Leu Lys Lys Glu Val Val Gly Lys Asp Leu Leu Lys Gly Ser 145 150 155 160 Leu Leu Phe Thr Ala Gly Pro Leu Glu Glu Glu Arg Phe Gly Phe Pro                 165 170 175 Ala Phe Ser Gly Ile Ser Arg Leu Thr Trp Leu Val Ser Leu Phe Gly             180 185 190 Glu Leu Ser Leu Val Ser Ala Thr Leu Glu Glu Arg Lys Glu Asp Gln         195 200 205 Tyr Met Lys Met Thr Val Cys Leu Glu Thr Glu Lys Lys Ser Pro Leu     210 215 220 Ser Trp Ile Glu Glu Lys Gly Pro Gly Leu Lys Arg Asn Arg Tyr Leu 225 230 235 240 Ser Phe His Phe Lys Ser Gly Ser Leu Glu Asn Val Pro Asn Val Gly                 245 250 255 Val Asn Lys Asn Ile Phe Leu Lys Asp Gln Asn Ile Phe Val Gln Lys             260 265 270 Leu Leu Gly Gln Phe Ser Glu Lys Glu Leu Ala Ala Glu Lys Lys Arg         275 280 285 Ile Leu His Cys Leu Gly Leu Ala Glu Glu Ile Gln Lys Tyr Cys Cys     290 295 300 Ser Arg Lys 305 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 caaaggcctc cattgaccag a 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 tggaccaggt ttttccaccg 20 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tgcagagttc cccaactggt actc 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gtgctgccta atgtcccttg aatc 24 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 caagaaagac aaagccagag tcctt 25 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 tggatggtct tggtccctta gcc 23 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 aagttcccaa atggcctccc 20 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 tggcaccact agttggttgt cttt 24 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 tgaaggtcgg tgaacggatt tgg 23 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 catgtaggcc atgaggtcca ccac 24

Claims (3)

빌리버딘 환원효소 A의 N 말단에 단백질 수송도메인이 공유결합된 빌리버딘 환원효소 A 융합단백질을 함유하는 피부염증 치료제 조성물.
A skin inflammation therapeutic composition comprising a bilirubidene reductase A fusion protein having a protein transport domain covalently bound to the N terminus of the bilirubidin reductase A.
청구항 1에 있어서,
상기 단백질 수송 도메인은 HIV Tat 펩타이드 또는 PEP-1 펩타이드임을 특징으로 하는 피부염증 치료제 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the protein transport domain is an HIV Tat peptide or a PEP-1 peptide.
청구항 1에 있어서,
상기 빌리버딘 환원효소 A 융합단백질은 그 아미노산 서열이 서열번호 9임을 특징으로 하는 피부염증 치료제 조성물.The method according to claim 1,
Wherein the bilirubidin reductase A fusion protein has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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