KR20130037271A - Cell- transducible dj-1 fusion protein - Google Patents
Cell- transducible dj-1 fusion protein Download PDFInfo
- Publication number
- KR20130037271A KR20130037271A KR1020110101576A KR20110101576A KR20130037271A KR 20130037271 A KR20130037271 A KR 20130037271A KR 1020110101576 A KR1020110101576 A KR 1020110101576A KR 20110101576 A KR20110101576 A KR 20110101576A KR 20130037271 A KR20130037271 A KR 20130037271A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- fusion protein
- tat
- protein
- cell
- cells
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
Abstract
Description
본 발명은 세포 투과성 ＤＪ-1 융합단백질에 관한 것으로서, 좀더 구체적으로는 ＤＪ-1 융합단백질이 세포 내로 효율적으로 투과하여 인비트로와 인비보에서 세포사멸을 보호하고, 뇌허혈에 대한 치료제로서의 효능을 밝혔다.The present invention relates to a cell-permeable DX-1 fusion protein, and more specifically, the DX-1 fusion protein effectively penetrates into cells to protect apoptosis in vitro and in vivo, and to be effective as a therapeutic agent for cerebral ischemia. .
뇌허혈은 뇌 혈액 공급의 차단으로 발생하며 신경기능 장애 및 신경세포 사멸의 원인이 된다. 활성산소종은 산소와의 상호작용을 포함하는 다양한 세포 프로세스에서 생성되는 자연적이고 불가피한 부산물이다. 활성산소종은 세포 구성요소들과 상호작용하여 그 구조와 기능단백질, 지질 및 DNA와 같은 거대분자에 손상을 입히며, 장기간 활성산소종에 노출되면 병리학적 과정이 현저히 진행되어 세포 사멸에 이르게 된다 [R.A. Floyd, FASEB J. 4 (1990) 2587-2597, B. Halliwell, J.M.C. Gutteridge, Free radicals in biology and medicine. Oxford University Press, Oxford. 1999, A. Hald, J. Lotharius, Exp. Neurol. 193 (2005) 279-290]. 활성산소종이 뇌에 미치는 영향은 뇌로의 혈액 흐름 방해 및 재관류를 통하여 설명될 수 있는데, 이는 해마 CA1 부위에 활성산소종을 현저히 증대시켜 최종적으로 신경세포 사멸에 이르게 한다 [M.V. Frantseva et al., Free Radic. Biol. Med. 31 (2001) 1216-1227, P.S. Li et al., Free Radic. Biol. Med. 31 (2001) 1191-1197]. 그러므로, 활성산소종 생성의 조절은 뇌허혈 손상을 방어함에 있어서 매우 중요한 역할을 한다.Cerebral ischemia occurs due to blockage of the brain blood supply and causes neuronal dysfunction and neuronal death. Free radicals are natural and inevitable by-products of various cellular processes, including their interaction with oxygen. Free radicals interact with cellular components, damaging their structure, macromolecules such as functional proteins, lipids, and DNA, and prolonged exposure to free radicals leads to a pathological process that leads to cell death. RA Floyd, FASEB J. 4 (1990) 2587-2597, B. Halliwell, J.M.C. Gutteridge, Free radicals in biology and medicine. Oxford University Press, Oxford. 1999, A. Hald, J. Lotharius, Exp. Neurol. 193 (2005) 279-290. The effect of reactive oxygen species on the brain can be explained by disruption and reperfusion of blood flow to the brain, which significantly increases reactive oxygen species in the hippocampus CA1 region, resulting in neuronal cell death [M.V. Frantseva et al., Free Radic. Biol. Med. 31 (2001) 1216-1227, P.S. Li et al., Free Radic. Biol. Med. 31 (2001) 1191-1197. Therefore, regulation of reactive oxygen species production plays a very important role in defending cerebral ischemic injury.
DJ-1 단백질은 PARK7으로도 불리는데, 암유전자로 알려져 있으며, 파킨슨병의 열성 상염색체 (autosomal recessive gene)로도 알려져 있다. DJ-1은 Thi/Pfp1 수퍼패밀리에 속하는 호모다이머(homodimer)이며, 인간에서 이.콜라이까지 매우 ㅈ잘 보존되어(highly conserved) 있으며, 세포질, 핵 및 미토콘드리아에 분포한다 (Bonifati et al., 2003; Gupta et al., 2008; Lee et al., 2003; Nagakubo et al., 1997; Wilson et al., 2004). DJ-1 단백질은 항산화 활성, 섀퍼론-유사 성질 및 전사 조절 등의 다양한 기능을 수행한다 (Menzies et al., 2005; Xu et al., 2005; Zhou et al., 2006). 산화 스트레스에 대한 DJ-1의 보호 기능은 파킨슨 병에서 잘 알려져 있다. 그러나, DJ-1과 뇌허혈의 관계는 명확하게 알려져 있지 않다.The DJ-1 protein, also called PARK7, is known as an oncogene and also known as the autosomal recessive gene of Parkinson's disease. DJ-1 is a homodimer belonging to the Thi / Pfp1 superfamily and is highly conserved from human to E. coli and is distributed in the cytoplasm, nucleus and mitochondria (Bonifati et al., 2003; Gupta et al., 2008; Lee et al., 2003; Nagakubo et al., 1997; Wilson et al., 2004). DJ-1 proteins perform a variety of functions, including antioxidant activity, chaperone-like properties, and transcriptional regulation (Menzies et al., 2005; Xu et al., 2005; Zhou et al., 2006). DJ-1's protective function against oxidative stress is well known in Parkinson's disease. However, the relationship between DJ-1 and cerebral ischemia is not clearly known.
단백질 세포도입 기술 (Protein transduction technology)은 포유류 세포 내로 다양한 단백질을 수송하는데 성공적으로 이용되어 왔다. 외래 단백질을 세포 내로 수송하기 위하여 단백질 수송 도메인 (protein transduction domains; PTDs) 또는 세포 침투성 펩타이드 (cell penetrating peptides; CPPs)라 불리는 작은 단백질이 개발되었다 [J.S. Wadia, S.F. Dowdy, Curr. Opin. Biotechnol. 13 (2002) 52-56]. 단백질 수송 도메인과 융합된 융합단백질은 메카니즘은 명확히 밝혀지지 않았지만 인비트로와 인비보에서 치료용 단백질을 운반하는데 이용되어 왔다.Protein transduction technology has been successfully used to transport various proteins into mammalian cells. Small proteins called protein transduction domains (PTDs) or cell penetrating peptides (CPPs) have been developed to transport foreign proteins into cells [J.S. Wadia, S.F. Dowdy, Curr. Opin. Biotechnol. 13 (2002) 52-56. Fusion proteins fused with protein transport domains have been used to transport therapeutic proteins in vitro and in vivo, although the mechanism is unclear.
그러나, 모든 단백질이 단백질 수송 도메인과 융합단백질을 이루어 세포 내로 투과될 수 있는 것은 아니다. 2001년, 2004년 그리고 2007년에는 Tat 형질도입부위와 결합시킨 단백질이 세포 내로 도입은 되었으나 활성을 나타내지 않는는 연구결과가 논문으로 발표된 사실이 있다 (Sengoku, T. et al. Experimental Neurology 188(2004) 161-170, Falnes P.O. et al. Biochemistry 2001 Apr 10;40(14):4349-4358, Daniele Peroni et al., Neuroscience letters 421(2007) 110-114 등). 즉, 상기 참고논문들을 통하여 세포도입이 용이하지 않은 단백질에 형질도입부위를 융합시킨다고 해서 융합된 모든 단백질이 세포 내로 도입된 후 원활한 활성을 나타내지는 못하고 있음을 알 수 있다.
However, not all proteins can be fusion proteins with protein transport domains and permeable into cells. In 2001, 2004, and 2007, a study published a paper showing that proteins bound to Tat transduction sites were introduced into cells but were not active (Sengoku, T. et al. Experimental Neurology 188 (2004). ) 161-170, Falnes PO et al. Biochemistry 2001 Apr 10; 40 (14): 4349-4358, Daniele Peroni et al., Neuroscience letters 421 (2007) 110-114, etc.). In other words, by fusing the transduction site to a protein that is not easy to introduce through the reference papers, it can be seen that all the fused proteins do not exhibit smooth activity after being introduced into the cell.
본 발명은 DJ-1 단백질을 이용하여 투과성이 높고 효과가 우수한 뇌허혈 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공하려는 것을 목적으로 한다.
An object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing and treating cerebral ischemia with high permeability and excellent effect using DJ-1 protein.
본 발명자들은 Tat-DJ-1 융합단백질을 제조하고 허혈 손상에 대한 보호 효과를 시험하였다. 그 결과 Tat-DJ-1 융합단백질은 인비보와 인비트로에서 세포 내로 원활히 도입되었고, 세포 사멸에 대해 보호작용을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 Tat-DJ-1 융합단백질은 뇌허혈, 신경세포 사멸, 파킨슨 병과 같은 신경질환의 예방 및 치료제로서 이용 가능하다.
We prepared a Tat-DJ-1 fusion protein and tested its protective effect against ischemic injury. As a result, Tat-DJ-1 fusion protein was smoothly introduced into cells in vivo and in vitro, and showed protection against cell death. Therefore, the Tat-DJ-1 fusion protein of the present invention can be used as a prophylactic and therapeutic agent for neurological diseases such as cerebral ischemia, neuronal cell death and Parkinson's disease.
본 발명에서는 먼저, Tat-DJ-1 융합단백질을 과대발현시키고 쉽게 정제할 수 있는 Tat-DJ-1 발현벡터를 개발하였다. 이 발현벡터는 인간 DJ-1 cDNA, HIV Tat 펩타이드 그리고 여섯 개의 히스티딘이 연속적으로 연결되어 있다. 이 발현벡터를 이용하여 Tat-DJ-1 융합단백질을 대장균에서 과대발현시켜 자연상태로 Ni2+-친화 크로마토그래피 컬럼을 이용하여 정제하였다. Tat-DJ-1의 과대발현은 상당히 높게 나타났으며, 이런 결과로 정제된 단백질의 양도 높게 나타났다. 웨스턴 블랏으로 배양된 C6 성상세포종 세포에 정제된 Tat-DJ-1 융합단백질이 농도 및 시간 의존적으로 세포에 운반되는 것을 확인하였다. 세포 내로 투과된 Tat-DJ-1 융합단백질은 세포 내에서 최소 60시간 지속적으로 유지되었다. 또한, 세포 내로 투과된 Tat-1-DJ-1 융합단백질은 과산화수소로 유발시킨 신경세포 사멸을 저해하였다. 뿐만 아니라, 동물실험에서 세포 내로 투과된 Tat-DJ-1 융합단백질은 DNA 조각화에 대한 보호 효과도 나타내었으며, 뇌-혈관 장벽을 원활히 통과하였고, 일시적으로 유발한 전뇌 허혈 손상에 대해 보호 효과를 나타내었다. In the present invention, first, Tat-DJ-1 that can overexpress and easily purify the Tat-DJ-1 fusion protein Expression vectors were developed. This expression vector is a continuous linkage of human DJ-1 cDNA, HIV Tat peptide and six histidines. Using this expression vector, the Tat-DJ-1 fusion protein was overexpressed in E. coli and purified in a natural state using a Ni 2+ -affinity chromatography column. Overexpression of Tat-DJ-1 was significantly higher, resulting in higher amounts of purified protein. It was confirmed that Tat-DJ-1 fusion protein purified on C6 astrocytoma cells cultured by Western blot was delivered to the cells in a concentration and time dependent manner. The Tat-DJ-1 fusion protein permeated into cells was maintained for at least 60 hours in cells. In addition, Tat-1-DJ-1 fusion protein permeated into cells inhibited neuronal cell death induced by hydrogen peroxide. In addition, Tat-DJ-1 fusion protein permeated into cells in animal experiments showed a protective effect against DNA fragmentation, smoothly crossed the brain-vascular barrier, and protected against transiently induced whole brain ischemic injury. It was.
이러한 결과는 Tat-DJ-1 융합단백질이 세포 내로 투과가 잘 일어나고, 세포 내에서 허혈 손상에 대한 보호 기능을 나타내고 있음을 의미한다. 따라서 이러한 Tat-DJ-1 융합단백질은 뇌허혈 등 신경 질환 예방 및 치료 분야에 다양하게 응용될 가능성을 제시해 준다.
These results indicate that the Tat-DJ-1 fusion protein permeates well into cells and exhibits a protective function against ischemic damage in cells. Therefore, this Tat-DJ-1 fusion protein suggests a variety of applications in the prevention and treatment of neurological diseases such as cerebral ischemia.
본 발명은 Tat 단백질 수송 도메인이 DJ-1 단백질의 적어도 일측 말단에 공유결합된 세포 투과성(cell-transducing) DJ-1 융합단백질을 제공한다.The present invention provides a cell-transducing DJ-1 fusion protein wherein the Tat protein transport domain is covalently bound to at least one end of the DJ-1 protein.
또한, 본 발명은 세포 투과성 DJ-1 융합단백질이 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 세포 투과성 DJ-1 융합단백질을 제공한다.The present invention also provides a cell permeable DJ-1 fusion protein, characterized in that the cell permeable DJ-1 fusion protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 9.
또한, 본 발명은 상기 DJ-1의 카복시 말단과 아미노 말단의 일측 또는 양측에 단백질 수송도메인이 공유결합된 것을 특징으로 하는 세포 투과성 DJ-1 융합단백질을 제공한다.In addition, the present invention provides a cell-permeable DJ-1 fusion protein, characterized in that the protein transport domain is covalently bonded to one or both sides of the carboxy terminal and the amino terminal of the DJ-1.
또한, 본 발명은 세포 투과성 DJ-1 융합단백질을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 뇌허혈, 파킨슨병 또는 신경세포 사멸(apoptosis) 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.In addition, the present invention is a pharmaceutical composition for preventing or treating cerebral ischemia, Parkinson's disease or neuronal cell death (apoptosis), characterized in that it comprises a cell-permeable DJ-1 fusion protein as an active ingredient and comprises a pharmaceutically acceptable carrier. To provide.
또한, 본 발명은 DJ-1 cDNA에 단백질 수송도메인 펩타이드 코딩 DNA 서열이 결합되어 상기 세포 투과성 DJ-1 융합단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.The present invention also provides a recombinant polynucleotide encoding a protein transport domain peptide coding DNA sequence to DJ-1 cDNA encoding the cell permeable DJ-1 fusion protein.
또한, 본 발명은 상기 재조합 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.In addition, the present invention is characterized in that the recombinant polynucleotide has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8.
또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 발현시키기 위하여 상기 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는, 세포 투과성 DJ-1 융합단백질을 발현시키는 벡터를 제공한다.
The present invention also provides a vector expressing a cell permeable DJ-1 fusion protein, comprising the recombinant polynucleotide to express the fusion protein.
Tat-DJ-1 융합단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 주사형태 또는 도포제로 제형화할 수 있다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.Pharmaceutical compositions containing the Tat-DJ-1 fusion protein as an active ingredient can be formulated in injection form or coating form by conventional methods in combination with a carrier that is conventionally acceptable in the pharmaceutical art. Injectable compositions are preferably aqueous isotonic solutions or suspensions, and the compositions mentioned are sterile and / or contain auxiliaries (eg, preservatives, stabilizers, wetting or emulsifier solution promoters, salts or buffers for controlling osmotic pressure). In addition, they may contain other therapeutically valuable substances.
이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 비경구 방식 즉, 피하 투여, 근육 투여 또는 국소적용(topical application)할 수 있으며, 용량은 일일 투여량이 0.001㎍~1㎎/㎏의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.The pharmaceutical preparations thus prepared may be parenterally, ie, subcutaneously, intramuscularly or topically, as desired, and the dosage may range from 1 to 0.001 μg to 1 mg / kg of daily dosage. It can be divided into several doses. Dosage levels for a particular patient may vary depending on the patient's weight, age, sex, health condition, time of administration, method of administration, severity of the disease, and the like.
또한, 본 발명의 융합단백질을 유효성분으로 하는 도포제는 통상적인 제조방법에 따라 어떤 형태로든 용이하게 제조할 수 있다. 일례로서 크림형 도포제를 제조함에 있어서는 일반적인 수중유형(O/W) 또는 유중수형(W/O)의 크림 베이스에 본 발명의 Tat-DJ-1 융합단백질을 함유시키고 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등을 필요에 따라 사용하는 한편, 물성개선을 목적으로 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 병용할 수 있다.In addition, the coating agent using the fusion protein of the present invention as an active ingredient can be easily prepared in any form according to a conventional manufacturing method. As an example, in the preparation of a cream coating agent, the Tat-DJ-1 fusion protein of the present invention is contained in a general oil-in-water type (O / W) or water-in-oil type (W / O) cream base, and includes a perfume, a chelating agent, and a pigment. While antioxidants, preservatives, etc. may be used as necessary, synthetic or natural materials such as proteins, minerals, vitamins, etc. may be used together for the purpose of improving the properties.
본 발명자들은 Tat-DJ-1 융합단백질을 신경 세포 및 뇌에 침투실험한 결과 원활하게 침투하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, Tat-DJ-1 융합단백질을 약제 조성물의 주요성분으로 이용할 수 있음을 밝혔다.
The present inventors were able to confirm that the Tat-DJ-1 fusion protein penetrated smoothly as a result of infiltration into nerve cells and brain. Therefore, it was found that Tat-DJ-1 fusion protein can be used as a main component of the pharmaceutical composition.
본 발명은 DJ-1를 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 DJ-1 단백질 분자의 세포 내 전달은 DJ-1 단백질에 HIV-1 Tat 단백질 수송 도메인이 공유결합된 세포투과성 수송도메인이 공유결합된 형태의 융합단백질을 구성하여 수행된다. 본 발명의 상기 수송도메인의 일례로는 서열번호 3과 같은 아미노산 서열로 이루어진 Tat 펩타이드를 들 수 있다. 그러나, 본 발명의 단백질 수송 도메인이 서열번호 3의 Tat 펩타이드로만 한정되는 것은 아니고, Tat의 아미노산 서열 일부 치환이나 부가, 결여로 Tat 펩타이드와 유사한 기능을 하는 펩타이드를 제조하는 것이 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 당업자에게는 용이하므로, HIV-1 Tat 단백질 수송 도메인과 이로부터 아미노산 일부 치환으로 동일·유사한 단백질 수송기능을 수행하는 단백질 수송 도메인을 이용한 융합단백질도 본 발명의 범위에 속함은 자명하다고 할 것이다.The present invention provides a method for efficiently delivering DJ-1 into cells. Intracellular delivery of DJ-1 protein molecules according to the present invention is carried out by constructing a fusion protein in a covalently bonded form of a cell permeable transport domain covalently bonded to an HIV-1 Tat protein transport domain to the DJ-1 protein. An example of the transport domain of the present invention includes a Tat peptide consisting of an amino acid sequence such as SEQ ID NO: 3. However, the protein transport domain of the present invention is not limited to the Tat peptide of SEQ ID NO: 3, and it is in the field of the present invention to prepare a peptide having a function similar to the Tat peptide by partial substitution, addition, or lack of the amino acid sequence of Tat. Since it is easy for those skilled in the art, fusion proteins using the HIV-1 Tat protein transport domain and a protein transport domain that performs the same or similar protein transport function by substituting a partial amino acid therefrom are also within the scope of the present invention. something to do.
구체적으로, 본 발명은 Tat-DJ-1 융합단백질, 이 융합단백질을 제조하기 위한 재조합 뉴클레오타이드와 벡터, 융합단백질을 포함하는 치료, 예방 목적의 약학 조성물, 피부 외용제 조성물 등에 관한 것이다.Specifically, the present invention relates to a Tat-DJ-1 fusion protein, a recombinant nucleotide and a vector for producing the fusion protein, a treatment comprising the fusion protein, a pharmaceutical composition for the purpose of prevention, a composition for external application for skin, and the like.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.Definitions of main terms used in the detailed description of the present invention are as follows.
"Tat-DJ-1 융합단백질"이란 단백질 수송 도메인과 DJ-1 단백질을 포함하며, 수송 도메인과 화물 분자(cargo molecule, 즉 본 발명에서는 DJ-1를 의미함)의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다. 본 명세서에서는 "Tat-DJ-1" 또는 "DJ-1 융합단백질"과 혼용하였다."Tat-DJ-1 fusion protein" includes a protein transport domain and a DJ-1 protein, which is a genetic fusion or chemical bond between a transport domain and a cargo molecule (ie DJ-1 in the present invention). It means a covalent complex formed. In the present specification, it is mixed with "Tat-DJ-1" or "DJ-1 fusion protein".
또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다.In addition, the "genetic fusion" means a linear, covalent linkage formed through the genetic expression of the DNA sequence encoding the protein.
또한, "표적 세포"란 수송 도메인에 의해 화물 분자가 전달되는 세포를 의미하는 것으로서 표적 세포는 체내 또는 체외의 세포를 말한다. 즉, 표적 세포는 체내 세포, 다시 말하여 살아있는 동물 또는 인간의 장기 또는 조직을 구성하는 세포 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물을 포함하는 의미이다. 또한, 표적 세포는 체외 세포, 즉 배양된 동물 세포, 인체 세포 또는 미생물을 포함하는 의미이다.In addition, "target cell" means a cell to which a cargo molecule is delivered by a transport domain, and a target cell refers to a cell in or outside the body. That is, a target cell is meant to include cells in the body, that is, cells constituting organs or tissues of a living animal or human, or microorganisms found in a living animal or human. In addition, target cells are meant to include extracellular cells, ie cultured animal cells, human cells or microorganisms.
본 명세서의 "단백질 수송 도메인"은 펩타이드, 단백질과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 펩타이드나 단백질을 세포 내로 도입시킬 수 있는 것을 말하며, 예를 들면 Tat 펩타이드(서열번호 3)를 말한다.As used herein, the term "protein transport domain" refers to a covalent bond with a peptide or a protein, which may introduce the peptide or protein into a cell without requiring a separate receptor, carrier, or energy. For example, a Tat peptide (sequence) Says number 3).
본 명세서의 "목표 단백질"은 Tat 단백질 수송 도메인과 공유결합을 이루어 세포 내로 도입되어 활성을 나타내는 분자를 의미하며, 구체적으로는 DJ-1를 의미한다.As used herein, "target protein" refers to a molecule that is covalently bound to a Tat protein transport domain and introduced into a cell to exhibit activity, and specifically means DJ-1.
또한, 본 명세서에서는 단백질 또는 펩타이드를 세포 내로 "도입"시키는 것에 대하여 "형질도입", "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과"한다는 표현들과 혼용하였다.
In addition, the present specification is interchangeable with the expressions "transduction", "transport", "penetration", "transport", "transfer", "transmission", "pass" for "introducing" a protein or peptide into a cell. It was.
본 발명은 단백질 수송 도메인이 DJ-1 단백질의 적어도 일측 말단에 공유결합된 세포 투과성(cell-transducing) DJ-1 융합단백질에 관한 것이다. 또한, 유전자의 침묵변이(silent change)에 따라 서열 내에서 하나 이상의 아미노산이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산(들)로 치환될 수 있다. 서열 내 아미노산 치환은 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다. 예컨대, 소수성 아미노산 분류는 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 프롤린 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양성 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성전하를 띤 산성 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 또한, 본 발명의 융합단백질과 아미노산 서열간의 일정 범위의 상동성 예컨대 85-100% 범위 내의 동일 유사한 생물학적 활성을 갖는 절편 또는 이들의 유도체들도 본 발명의 권리범위에 포함된다.The present invention relates to a cell-transducing DJ-1 fusion protein wherein the protein transport domain is covalently bound to at least one end of the DJ-1 protein. In addition, one or more amino acids in the sequence may be replaced with other amino acid (s) of similar polarity that function functionally equivalently according to the silent change of the gene. Amino acid substitutions in the sequence may be selected from other members of the class to which the amino acid belongs. For example, hydrophobic amino acid classifications include alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, valine, tryptophan, proline and methionine. Polar neutral amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine and glutamine. Positive basic amino acids include arginine, lysine and histidine. Negatively charged acidic amino acids include aspartic acid and glutamic acid. Also included within the scope of the invention are fragments or derivatives thereof having the same similar biological activity within a range of homology, such as 85-100%, between the fusion protein of the invention and the amino acid sequence.
또한, 본 발명은 상기 세포 투과성 DJ-1 융합단백질이 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.In addition, the present invention is characterized in that the cell-permeable DJ-1 fusion protein has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
또한, 본 발명은 상기 단백질 수송도메인(protein transducing domain; "PTD")이 DJ-1 단백질의 카복시 말단과 아미노 말단의 일측 또는 양측에 공유결합된 것을 특징으로 한다.In addition, the present invention is characterized in that the protein transducing domain (PTD) is covalently bonded to one or both sides of the carboxy and amino terminus of the DJ-1 protein.
또한, 본 발명은 상기 세포 투과성 DJ-1 융합단백질을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.The present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising the cell-permeable DJ-1 fusion protein as an active ingredient and comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
또한, 본 발명은 DJ-1 cDNA에 단백질 수송도메인 펩타이드 코딩 DNA 서열이 결합되어 상기 세포도입성 융합단백질을 코딩하는 서열번호 6번을 비롯한 재조합 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 범위는 서열번호 6번의 재조합 폴리뉴클레오타이드뿐만 아니라 유전암호의 축퇴(codon degeneracy)에 의한 서열을 갖는 핵산분자들에도 미친다.The present invention also relates to a recombinant polynucleotide comprising SEQ ID NO: 6, wherein the protein transport domain peptide coding DNA sequence is coupled to DJ-1 cDNA to encode the cell-induced fusion protein. The scope of the present invention extends not only to recombinant polynucleotides of SEQ ID NO: 6 but also to nucleic acid molecules having a sequence by codon degeneracy of the genetic code.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 융합단백질을 발현시키기 위하여 상기 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는, 세포 투과성 융합단백질을 발현시키는 벡터에 관한 것이다.
In addition, the present invention relates to a vector expressing a cell permeable fusion protein, characterized in that comprising the recombinant polynucleotide to express the fusion protein.
본 발명의 DJ-1 융합단백질은 성상세포 내로 시간 의존적, 투여량 의존적으로 투과되었으며, 성상세포 내에서 활성산소종에 의한 세포사멸로부터 세포를 보호하였다. 또한, 본 발명의 DJ-1 융합단백질은 뇌-혈관 장벽을 원활히 투과하여 뇌허혈 손상에 대한 보호효과를 나타내었다. 뿐만 아니라, 본 발명의 DJ-1 융합단백질은 해마에서 뇌허혈에 의해 발생하는 지질 과산화를 현저히 저해하였다.The DJ-1 fusion protein of the present invention was permeated into astrocytes in a time dependent and dose dependent manner and protected cells from apoptosis by reactive oxygen species in astrocytes. In addition, the DJ-1 fusion protein of the present invention exhibited a protective effect against cerebral ischemic injury by smoothly penetrating the brain-vascular barrier. In addition, the DJ-1 fusion protein of the present invention significantly inhibited lipid peroxidation caused by cerebral ischemia in hippocampus.
이러한 결과는 본 발명의 DJ-1 융합단백질이 뇌허혈 예방 및 치료제로서 유용함을 말해준다.
These results suggest that the DJ-1 fusion protein of the present invention is useful as an agent for preventing and treating cerebral ischemia.
도 1은 Tat-DJ-1 융합단백질의 모식도 (A)와 발현 및 정제된 융합단백질을 12% SDS-PAGE한 결과 (B) 및 항토끼 폴리히스티딘 항체로 웨스턴 블랏 분석한 결과 (C)이다.
레인 1: 유도되지 않은 Tat-DJ-1,
레인 2: 유도된 Tat-DJ-1,
레인 3: 정제된 Tat-DJ-1.
도 2는 Tat-DJ-1 융합단백질을 성상세포 내로 도입한 결과이다. Tat-DJ-1 융합단백질 (0.5-3 mM)과 대조군 DJ-1 단백질을 60 분간 배양배지에 가하였다 (A). 3 mM Tat-DJ-1 융합단백질과 대조군 DJ-1 단백질을 10 ~ 60 분간 배양배지에 가하였다 (B). 3 mM Tat-DJ-1 융합단백질을 침투시킨 세포를 1 ~ 72 시간 동안 배양하였다 (C). 이를 웨스턴 블랏팅으로 분석하였고, 세포 도입된 Tat-DJ-1 융합단백질의 분포는 형광현미경으로 관찰하였다 (D).
도 3은 세포 생존율과 활성산소종 생성에 미치는 세포 도입된 Tat-DJ-1 융합단백질의 영향을 나타낸다. 한 시간 동안 Tat-DJ-1 융합단백질 (1-3 mM)로 미리 처리한 성상세포에 0.7 mM 과산화수소를 가하여 세포생존율을 MTT를 이용한 발생 분석으로 평가하였다 (A). * P < 0.05 및 ** P < 0.01, 과산화수소 처리한 세포와 비교함. Tat-DJ-1 융합단백질 (3 mM)로 한 시간 처리한 성상세포에 과산화수소 (0.7 mM)를 가하였다. 세포내 활성산소종 수준을 DCFDA 염색으로 평가하였다 (B). 형광강도는 ELISA 판독기로 측정하였다 (C). ** P < 0.01, 과산화수소 처리한 세포와 비교함.
도 4는 Tat-DJ-1 융합단백질이 과산화수소에 의해 유도된 DNA 조각화 (fragmentation)를 보호함을 나타낸다. 3 mM Tat-DJ-1 융합단백질로 한 시간 처리한 세포를 H2O2 (0.7 mM)에 18시간 동안 노출시켰다. DNA 조각화는 TUNEL 염색으로 탐지하였다. 각 막대는 세 번의 실험에서 얻어진 평균 ± 표준편차이다.
도 5는 혈관-뇌 장벽을 가로질러 Tat-DJ-1 융합단백질을 세포도입한 결과이다. 저빌 뇌에서 세포도입된 Tat-DJ-1 융합단백질을 항-히스티딘 항체를 이용하여 면역조직화학 방법으로 분석하였다.
도 6은 CA1 부위의 허혈손상에 대한 Tat-DJ-1 융합단백질의 효과를 나타낸다. 뇌허혈 손상 4일 및 7일 후 저빌 뇌 해마의 CA1 부위에서 크레실 바이올렛 염색한 현미경 사진이다. 음성 대조군 (A, 정상); 양성 대조군 (B, 담체 주사군), 대조군 DJ-1 단백질 (C, D), Tat 펩타이드 (E, F) 및 Tat-DJ-1 융합단백질 (3 mg/kg)을 각각 저빌에 주사하였다 (G-H). 크기 막대는 50 ㎛이다. 값은 각각 대조군과 유의한 차이를 보이는 것이다. ** P < 0.01.
도 7은 세포도입된 Tat-DJ-1 융합단백질이 뇌 말론다이알데하이드 (malondiadehyde; MDA) 수준에 미치는 영향을 나타낸다. Tat-DJ-1 융합단백질을 뇌허혈 30분 전에 처리하였다. 뇌허혈 손상 후 3시간이 경과하면 해마를 절개하여 MDA를 측정하였다.
레인 1: 샴 수술군
레인 2: 뇌허혈 유도군
레인 3: Tat-DJ-1 융합단백질 처리 대조군,
레인 4: DJ-1 단백질 처리군,
레인 5: Tat 펩타이드 처리군,
뇌허혈 유도군과 비교하여 ** P < 0.01.1 is a schematic diagram of the Tat-DJ-1 fusion protein (A) and 12% SDS-PAGE of the expressed and purified fusion protein (B) and Western blot analysis with the anti-rabbit polyhistidine antibody (C).
Lane 1: uninduced Tat-DJ-1,
Lane 2: induced Tat-DJ-1,
Lane 3: purified Tat-DJ-1.
Figure 2 is the result of introducing the Tat-DJ-1 fusion protein into astrocytes. Tat-DJ-1 fusion protein (0.5-3 mM) and control DJ-1 protein were added to the culture medium for 60 minutes (A). 3 mM Tat-DJ-1 fusion protein and control DJ-1 protein were added to the culture medium for 10 to 60 minutes (B). Cells infiltrated with 3 mM Tat-DJ-1 fusion protein were incubated for 1-72 hours (C). This was analyzed by Western blotting, and the distribution of cell-introduced Tat-DJ-1 fusion protein was observed by fluorescence microscopy (D).
3 shows the effect of cell-introduced Tat-DJ-1 fusion protein on cell viability and reactive oxygen species production. 0.7 mM hydrogen peroxide was added to astrocytes pretreated with Tat-DJ-1 fusion protein (1-3 mM) for one hour, and cell viability was evaluated by developmental analysis using MTT (A). * P <0.05 and ** P <0.01, compared with hydrogen peroxide treated cells. Hydrogen peroxide (0.7 mM) was added to astrocytes treated with Tat-DJ-1 fusion protein (3 mM) for one hour. Intracellular reactive oxygen species levels were assessed by DCFDA staining (B). Fluorescence intensity was measured by ELISA reader (C). ** P <0.01, compared with hydrogen peroxide treated cells.
4 shows that the Tat-DJ-1 fusion protein protects DNA fragmentation induced by hydrogen peroxide. Cells treated with 3 mM Tat-DJ-1 fusion protein for one hour were exposed to H 2 O 2 (0.7 mM) for 18 hours. DNA fragmentation was detected by TUNEL staining. Each bar is the mean ± standard deviation obtained from three experiments.
5 shows the results of cell introduction of the Tat-DJ-1 fusion protein across the vascular-brain barrier. Tat-DJ-1 fusion proteins transduced in gerbil brains were analyzed by immunohistochemistry using anti-histidine antibodies.
Figure 6 shows the effect of Tat-DJ-1 fusion protein on ischemic injury of the CA1 site. Cresyl violet stained micrographs at CA1 site of
Figure 7 shows the effect of transduced Tat-DJ-1 fusion protein on brain malondiadehyde (MDA) levels. Tat-DJ-1 fusion protein was treated 30 minutes before cerebral ischemia. Three hours after cerebral ischemic injury, the hippocampus was dissected to measure MDA.
Lane 1: Siamese Surgery Group
Lane 2: cerebral ischemia induction group
Lane 3: Tat-DJ-1 fusion protein treatment control,
Lane 4: DJ-1 protein treatment group,
Lane 5: Tat peptide treatment group,
** P <0.01 compared to cerebral ischemia induction group.
아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래의 실시예의 기재에 의하여 한정되는 것은 아니다. 특히, 아래 실시예에서는 DJ-1 융합단백질로서 Tat-DJ-1만을 예시하였으나, 단백질 수송 도메인이 DJ-1 단백질의 카복시 말단에 융합된 융합단백질 및 양 말단에 융합된 융합단백질 또한 Tat-DJ-1 융합단백질과 유사하게 C6 세포 내로 원활히 도입되며, 세포 내에서 세포사멸을 저하시키는 활성을 나타낸다 (데이터 미기재).
Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in more detail with reference to specific embodiments. However, the scope of the present invention is not limited by the description of the following examples. In particular, in the examples below, only Tat-DJ-1 is illustrated as the DJ-1 fusion protein, but the protein transport domain is a fusion protein fused to the carboxy terminus of the DJ-1 protein and a fusion protein fused to both ends is also Tat-DJ- Similar to 1 fusion protein, it is smoothly introduced into C6 cells, and exhibits an activity of lowering apoptosis in cells (data not shown).
세포 및 재료Cells and materials
성상세포는 한국 세포주 연구재단 (서울, 한국)에서 입수한 C6 랫트 성상세포종 (astrocytoma) 세포주를 이용하였다. 세포는 10% 우태혈청 및 항생제 (100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 100 U/㎖ 페니실린)을 함유한 DMEM 배지에서 37 ℃, 95% 공기 및 5% CO2 조건으로 배양하였다.Astrocytes were C6 rat astrocytoma cell line obtained from Korea Cell Line Research Foundation (Seoul, Korea). Cells were incubated at 37 ° C., 95% air and 5% CO 2 conditions in DMEM medium containing 10% fetal calf serum and antibiotics (100 μg / ml streptomycin, 100 U / ml penicillin).
플라스미드 pET-15b와 이.콜라이 BL21 (DE3)은 Novagen (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. FBS와 항생제는 Gibco BRL (Franklin Lakes, NJ, USA)에서 구입하였다. 올리고뉴클레오타이드는 Gibco BRL custom primers에서 입수하였다. Ni2+-니트릴로삼초산 세파로즈 수퍼플로우는 Qiagen (Valencia, CA, USA)에서 구입하였다. 합성 Tat 펩타이드는 PEPTRON (Daejeon, Korea)에서 구입하였다. 기타 화학물질 및 제제는 최상급을 사용하였다.
Plasmid pET-15b and E. coli BL21 (DE3) were purchased from Novagen (San Diego, CA, USA). FBS and antibiotics were purchased from Gibco BRL (Franklin Lakes, NJ, USA). Oligonucleotides were obtained from Gibco BRL custom primers. Ni 2+ -nitrilotriacetic acid Sepharose superflow was purchased from Qiagen (Valencia, CA, USA). Synthetic Tat peptide was purchased from PEPTRON (Daejeon, Korea). Other chemicals and formulations used the finest.
TatTaste -- DJDJ -1 -One 융합단백질Fusion protein 발현 및 정제 Expression and Purification
HIV Tat 발현벡터는 본 발명자들의 방법에 따라 제조하였다 (Kwon et al., 2000). 인간 DJ-1 단백질의 cDNA 서열은 센스 프라이머 5'-CTCGAGGCTTCCAAAAGAGC-3' 및 안티센스 프라이머 5'-GGATCCCTAGTCTTTAAGAA-3'을 이용하여 PCR 방법으로 증폭하였다. 얻어진 PCR 산물은 TA 클로닝 벡터에 서브클론하고 pTat 발현 벡터와 연결하고 6 히스티딘 오픈 리딩 프레임도 함께 넣어 발현벡터를 제조하고 이. 콜라이 DH5α에 클론하였다.HIV Tat expression vectors were prepared according to our method (Kwon et al., 2000). The cDNA sequence of the human DJ-1 protein was amplified by PCR using sense primers 5'-CTCGAGGCTTCCAAAAGAGC-3 'and antisense primers 5'-GGATCCCTAGTCTTTAAGAA-3'. The obtained PCR product was subcloned into the TA cloning vector, linked with the pTat expression vector, and put together with 6 histidine open reading frames to prepare an expression vector. It was cloned into E. coli DH5α.
재조합 Tat-DJ-1 플라스미드를 이. 콜라이 BL21에 도입하여 형질전환하고 0.5 mM IPTG (isopropyl-β-D-thio-galactoside; Duchefa, Haarlem, Netherlands)로 37℃에서 3-4 시간 동안 발현을 유도하였다. 수확한 세포는 초음파 분해로 용균하여 Tat-DJ-1 융합단백질을 Ni2 +-니트릴로삼초산 세파로즈 수퍼플로우 친화 크로마토그래피 컬럼 및 PD-10 컬럼 크로마토그래피 (Amersham, Brauncschweig, Germany)로 정제하였다. 단백질 농도는 브래드포드 방법으로 우혈청 알부민을 표준물질로 하여 평가하였다 (Bradford, 1976).
Recombinant Tat-DJ-1 plasmid; Transfection was introduced into E. coli BL21 and induced expression at 37 ° C. for 3-4 hours with 0.5 mM IPTG (isopropyl-β-D-thio-galactoside; Duchefa, Haarlem, Netherlands). Harvested cells are the Tat-DJ-1 fusion proteins by lysis by sonication Ni 2 + - was purified by three seconds acid Sepharose Super Flow affinity chromatography column and PD-10 column chromatography (Amersham, Brauncschweig, Germany) with a nitrile . Protein concentration was assessed using the bovine serum albumin as a standard by the Bradford method (Bradford, 1976).
성상세포 내로 Into astrocytes TatTaste -- DJDJ -1 -One 융합단백질Fusion protein 도입 Introduction
Tat-DJ-1 융합단백질의 세포내 도입을 위해 세포를 다양한 농도의 Tat-DJ-1 융합단백질로 한 시간 동안 처리하였다. 그 후 세포를 트립신-EDTA로 처리하고 PBS로 세척하였다. 세포를 수확한 후 웨스턴 블랏을 위해 세포 추출물을 제조하였다.
Cells were treated with various concentrations of Tat-DJ-1 fusion protein for one hour for intracellular introduction of the Tat-DJ-1 fusion protein. Cells were then treated with trypsin-EDTA and washed with PBS. After harvesting the cells, cell extracts were prepared for western blot.
웨스턴Western 블랏Blot 분석 analysis
세포 용균액 내의 단백질을 12% SDS-PAGE로 분리하였다. 분리된 단백질들은 나이트로셀룰로스 막에 전기이동시킨 다음 5% 탈지유를 포함하는 PBS로 블로킹시 켰다. 막은 토끼 항히스티딘 폴리클론 항체 (1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)로 탐지한 다음 염소 항토끼 면역글로불린 (1:10,000 희석함; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)과 함께 배양하였다. 결합된 항체는 강화된 화학발광으로 시각화하였다 (Amersham, Franklin Lakes, NJ, USA).
Proteins in cell lysate were separated by 12% SDS-PAGE. The separated proteins were electrophoresed onto nitrocellulose membranes and then blocked with PBS containing 5% skim milk. Membrane was detected with rabbit antihistidine polyclonal antibody (1: 1000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) and then goat anti-rabbit immunoglobulin (diluted 1: 10,000; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) Cultured together). Bound antibodies were visualized by enhanced chemiluminescence (Amersham, Franklin Lakes, NJ, USA).
형광현미경 분석Fluorescence Microscope Analysis
커버슬립 상의 성상세포를 3mM Tat-DJ-1 융합단백질로 처리하였다. 한 시간 동안 37℃로 배양한 다음 세포를 PBS로 두 번 씻고 4% 파라포름알데하이드로 실온에서 5분간 고정시켰다. 세포를 30 분간 3% 우혈청 알부민, 0.1% Triton X-100을 포함하는 PBS (PBS-BT)로 삼투 가능하도록 하고 블로킹시키고 PBS-BT로 씻어주었다. 1:2000으로 희석된 1차 항체 (His-probe, Santa Cruz Biotechnology)로 90 분 동안 실온에서 배양하였다. 1:15000으로 희석된 2차 항체 (Alexa fluor 488; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 어두운 곳에서 실온으로 45 분간 배양하였다. 핵은 1 ㎍/㎖의 4'6-다이아미디노-2-페닐인돌 (4'6-diamidino-2-phenylindole; DAPI; Roche, Basel, Switzerland)로 5 분간 염색하였다. 형광 분포는 Eclipse 80i 현미경 (Nikon, Tokyo, Japan)으로 분석하였다.
Astrocytes on coverslips were treated with 3 mM Tat-DJ-1 fusion protein. After incubation at 37 ° C. for one hour, the cells were washed twice with PBS and fixed for 5 minutes at room temperature with 4% paraformaldehyde. Cells were allowed to osmotically, blocked and washed with PBS (PBS-BT) containing 3% bovine serum albumin, 0.1% Triton X-100 for 30 minutes. Incubated for 90 minutes at room temperature with primary antibody (His-probe, Santa Cruz Biotechnology) diluted 1: 2000. The secondary antibody (Alexa fluor 488; Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA) diluted 1: 15000 was incubated for 45 minutes at room temperature in the dark. The nuclei were stained for 5 minutes with 1 μg / ml of 4'6-diamidino-2-phenylindole (4'6-diamidino-2-phenylindole;DAPI; Roche, Basel, Switzerland). Fluorescence distribution was analyzed by Eclipse 80i microscope (Nikon, Tokyo, Japan).
MTTMTT 분석 analysis
과산화수소로 처리한 성상세포의 생존율을 결정하기 위해 MTT {3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dipheyltetrazolium bromide} 분석을 이용하였다. Tat-DJ-1 융합단백질 (1-3 mM)로 한 시간 동안 미리 처리한 성상세포 배양배지에 H2O2 (0.7 mM)를 24 시간 동안 처리하였다. 540 ㎚ 흡광도는 Multiskan MCC/340 ELISA 판독기 (Labsystems, Oy, Helsinki, Finland)로 측정하였고, 세포 생존율은 미처리 대조군 세포의 백분율로 정의하였다.
MTT {3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-dipheyltetrazolium bromide} assay was used to determine the survival rate of astrocytes treated with hydrogen peroxide. Astrocyte culture media previously treated with Tat-DJ-1 fusion protein (1-3 mM) for 1 hour were treated with H 2 O 2 (0.7 mM) for 24 hours. 540 nm absorbance was measured with a Multiskan MCC / 340 ELISA reader (Labsystems, Oy, Helsinki, Finland) and cell viability was defined as the percentage of untreated control cells.
세포내Intracellular 활성산소종Reactive oxygen species 수준 측정 Level measurement
활성산소종에 의해 형광물질인 DCF (dichlorofluorescein)로 변환되는 DCF-DA (2',7'-dichlorofluorescein diacetate)를 이용하여 세포내 활성산소종 수준을 측정하였다. 성상세포는 Tat-DJ-1 융합단백질 (3 mM)이 있는 상태 또는 없는 상태로 한 시간 동안 배양하고 그 후 0.7 mM 과산화수소로 30 분간 처리하였다. 세포는 PBS로 두 번 세척한 후 15 μM DCF-DA를 넣어 15 분간 배양하였다. 세포 형광강도 정량은 여기 485 ㎚, 방출 538 ㎚에서 Fluoroskan ELISA 판독기 (Labsystems Oy, Helsinki, Finland)로 측정하였다.
Intracellular reactive oxygen species levels were measured using DCF-DA (2 ', 7'-dichlorofluorescein diacetate), which is converted into a fluorescent substance, DCF (dichlorofluorescein) by reactive oxygen species. Astrocytes were incubated for one hour with or without Tat-DJ-1 fusion protein (3 mM) and then treated with 0.7 mM hydrogen peroxide for 30 minutes. Cells were washed twice with PBS and incubated for 15 minutes with 15 μM DCF-DA. Cell fluorescence intensity quantitation was measured with a Fluoroskan ELISA reader (Labsystems Oy, Helsinki, Finland) at excitation 485 nm, emission 538 nm.
TUNELTUNEL 분석 analysis
성상세포를 Tat-DJ-1 융합단백질 (3 mM)이 있는 상태 또는 없는 상태로 한 시간 동안 배양한 후 0.7 mM 과산화수소로 18 시간 동안 처리하였다. TUNEL {TdT (Terminal deoxynucleotidyl transferase)-mediated biotinylated UTP nick end labeling} 염색은 세포 사멸 탐지 킷트 (Cell Death Detection kit; Roche Applied Science)를 이용하여 수행하였다. 영상은 Eclipse 80i 형광현미경 (Nikon)을 이용하여 얻었다.
Astrocytes were incubated for one hour with or without Tat-DJ-1 fusion protein (3 mM) and then treated with 0.7 mM hydrogen peroxide for 18 hours. TUNEL {Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) -mediated biotinylated UTP nick end labeling} staining was performed using a Cell Death Detection Kit (Roche Applied Science). Images were obtained using an Eclipse 80i fluorescence microscope (Nikon).
실험동물 및 대뇌 Laboratory Animals and Cerebral 전뇌Whole brain 허혈 ( Ischemia ( cerebralcerebral forebrainforebrain ischemiaischemia ))
몽고 저빌 (Meriones unguiculatus, 65-75g)은 한림대 실험동물센터에서 입수하였다. 동물은 일정한 온도 (23 ℃)와 상대습도 (60%)로 12시간 밝음: 12시간 어두움 상태로 사육하였으며, 물과 사료는 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다. 모든 동물 및 사육은 국립수의과학검역원의 실험동물 사육과 이용에 관한 안내규정에 적합함을 한림대학교 의과대학 동물 사육 및 이용 위원회가 승인한다. Mongolia Gerbil ( Meriones unguiculatus , 65-75 g) was obtained from Hallym University Experimental Animal Center. Animals were bred 12 hours bright: 12 hours dark at constant temperature (23 ° C) and relative humidity (60%), and water and feed were freely consumed. All animals and livestock are approved by the National Veterinary Research and Quarantine Service's Animal Breeding and Use Committee, Hallym University Medical College.
대뇌 전뇌 허혈 (cerebral forebrain ischemia) 모델은 종래 방법으로 제조하였다 [J.S. Wadia, S.F. Dowdy, Curr. Opin. Biotechnol. 13 (2002) 52-56]. 세포도입된 Tat-DJ-1 융합단백질이 허혈 손상을 보호하는지를 알아보기 위하여 총경동맥 폐색 전 저빌에 Tat-DJ-1 융합단백질 (3 mg/kg)을 30 분간 피하주사하였다. 총경동맥은 분리되어 신경섬유가 없는 상태에서 비트라우마성 동맥류 클립 (non-traumatic aneurysm clips)으로 폐색시켰다. 검안경으로 안구의 중앙동맥을 관찰하여 완전한 혈류 차단을 확인하였다. 폐색 5분 후 동맥류 클립을 제거하였다. 검안경에서 혈류 복원 (재관류)이 직접 관찰되었다.A cerebral forebrain ischemia model was prepared by conventional methods [J.S. Wadia, S.F. Dowdy, Curr. Opin. Biotechnol. 13 (2002) 52-56. Tat-DJ-1 fusion protein (3 mg / kg) was subcutaneously injected for 30 minutes in a gerbil prior to total carotid artery occlusion to determine whether the transduced Tat-DJ-1 fusion protein protects ischemic injury. The common carotid artery was isolated and blocked with non-traumatic aneurysm clips in the absence of nerve fibers. Observation of the central artery of the eye with an ophthalmoscope confirmed complete blood flow blockage. The aneurysm clip was removed 5 minutes after occlusion. Blood flow restoration (reperfusion) was directly observed in the ophthalmoscope.
허혈-재관류 4일 및 7일 후 PBS (pH 7.4)로 심장을 관통하여 관류하고 4% 파라포름알데하이드를 함유한 0.1 M PBS (pH 7.4)로 고정하여 뇌조직 시료를 얻었고 이를 샴 (수술)군, 담체 처리군, Tat 펩타이드 처리군, DJ-1 단백질 처리 대조군 및 Tat-DJ-1 융합단백질 처리군 (각 3 mg/kg)에 이용하였다. 각 뇌 조직은 밤새 30% 수크로즈를 침투시켜 동결 방지처리하였다. 조직은 저온유지장치로 동결시키고 50 ㎛ 절편화하였고 연속 절편은 PBS 함유 6웰 플레이트에 수집하였다. 크레실 바이올렛 염색을 수행하였다 [I.K. Hwang et al., Free Radic. Biol. Med. 39 (2005) 392-402].
4 and 7 days after ischemia-reperfusion, brain tissue samples were obtained by perfusion through the heart with PBS (pH 7.4) and fixed with 0.1 M PBS (pH 7.4) containing 4% paraformaldehyde. , Carrier treated group, Tat peptide treated group, DJ-1 protein treated control group and Tat-DJ-1 fusion protein treated group (3 mg / kg each). Each brain tissue was incubated overnight with 30% sucrose infiltration. Tissues were frozen in cryostat and 50 μm sections and serial sections were collected in 6 well plates containing PBS. Cresyl violet staining was performed [IK Hwang et al., Free Radic. Biol. Med. 39 (2005) 392-402.
정량분석Quantitative analysis
신경세포 수와 면역반응성의 강도는 영상분석시스템을 이용하여 계산하였다. 면역반응구조의 염색 강도는 상대 흡광도로 평가하였고, 대조군에 대한 백분율을 그래프에 나타내었다. 데이타는 일방 ANOVA를 이용하여 통계학적 유의성을 분석하였다.
Neuronal cell numbers and intensity of immunoreactivity were calculated using an image analysis system. The staining intensity of the immune response structure was assessed by relative absorbance and the percentages for the control group are shown in the graph. The data were analyzed for statistical significance using one-way ANOVA.
결과 1: Result 1: TatTaste -- DJDJ -1 -One 융합단백질Fusion protein 발현 및 정제 Expression and Purification
인간 DJ-1 cDNA 서열, Tat 단백질 수송 도메인 (Tat 49-57) 및 N 말단에 6개의 히스티딘 잔기가 연이어 있는 세포 침투성 Tat-DJ-1 융합단백질 발현 벡터 (pTat-DJ-1)를 구축하였다. 또한, HIV-1 Tat 단백질 수송 도메인이 없는 DJ-1 단백질 발현 벡터도 같은 방법으로 구축하였다 (도 1의 A).A human permeable Tat-DJ-1 fusion protein expression vector (pTat-DJ-1) with human DJ-1 cDNA sequence, Tat protein transport domain (Tat 49-57) and six histidine residues at the N terminus was constructed. In addition, DJ-1 protein expression vectors without the HIV-1 Tat protein transport domain were constructed in the same manner (FIG. 1A).
발현 유도 후 Tat-DJ-1 융합단백질은 Ni2 +-니트릴로삼초산 세파로즈 수퍼플로우 친화 크로마토그래피 컬럼 및 PD-10 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 정제된 Tat-DJ-1 융합단백질에 대해 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. 도 1의 B와 같이, 발현 및 정제된 Tat-DJ-1 융합단백질은 분자량이 약 28 kDa인 것으로 측정되었다. 단백질은 항토끼 폴리히스티딘 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석으로 확인하였다 (도 1의 C).
After the expression induction Tat-DJ-1 fusion proteins Ni 2 + - acrylonitrile was purified by three seconds acid Sepharose Super Flow affinity chromatography column and PD-10 column chromatography. SDS-PAGE and Western blot analysis were performed on the purified Tat-DJ-1 fusion protein. As shown in B of FIG. 1, the expressed and purified Tat-DJ-1 fusion protein was determined to have a molecular weight of about 28 kDa. Proteins were identified by Western blot analysis using anti-rabbit polyhistidine antibodies (FIG. 1C).
결과 2: 성상세포 내로 Outcome 2: into astrocytes TatTaste -- DJDJ -1 -One 융합단백질Fusion protein 도입 Introduction
3 mM Tat-DJ-1 융합단백질을 성상세포 배양배지에 시간을 달리 하여 10 ~ 60 분간 처리한 후 웨스턴 블랏팅하여 세포도입을 분석하였다. 세포 내로 도입된 Tat-DJ-1 융합단백질의 세포내 농도는 60 분까지 점차 증가하였다. Tat-DJ-1 융합단백질의 투여량 증가에 따른 변화를 분석하기 위해 다양한 농도 (0.5 ~ 3 mM)의 Tat-DJ-1 융합단백질을 성상세포에 60 분간 처리하였고 세포도입된 단백질 수준을 웨스턴 블랏팅으로 측정하였다. 성상세포 내로 단백질 도입은 농도 의존적이었다. 도 2의 A와 B에서 나타난 바와 같이, Tat-DJ-1 융합단백질은 시간 의존적 및 농도 의존적으로 성상세포 내로 효과적으로 도입되었다. 그러나, 대조군 DJ-1 단백질은 세포 내로 도입되지 않았다. 성상세포 내로 도입된 Tat-DJ-1 융합단백질의 세포내 안정성은 도 2의 C와 같다. 3 mM Tat-DJ-1 융합단백질을 세포 배양배지에 가한 다음 시간 경과에 따른 단백질 수준을 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다. 도입된 Tat-DJ-1 융합단백질의 세포내 수준은 한 시간 이후부터 탐지되었다. 비록 단백질 수준은 점차 감소하긴 하였으나 60 시간 동안 세포 내에 도입된 Tat-DJ-1 융합단백질이 관찰되었다.The 3 mM Tat-DJ-1 fusion protein was treated in astrocytic culture medium at different times for 10 to 60 minutes, followed by Western blotting to analyze cell introduction. The intracellular concentration of Tat-DJ-1 fusion protein introduced into the cells gradually increased up to 60 minutes. In order to analyze the change according to the dose increase of Tat-DJ-1 fusion protein, various concentrations (0.5-3 mM) of Tat-DJ-1 fusion protein were treated with astrocytes for 60 minutes, and the level of the introduced protein was measured in Western blot. Measured by lotting. Protein introduction into astrocytes was concentration dependent. As shown in A and B of FIG. 2, Tat-DJ-1 fusion protein was effectively introduced into astrocytes in a time dependent and concentration dependent manner. However, control DJ-1 protein was not introduced into the cells. Intracellular stability of Tat-DJ-1 fusion protein introduced into astrocytes is shown in FIG. 3 mM Tat-DJ-1 fusion protein was added to the cell culture medium and protein levels over time were analyzed by Western blotting. Intracellular levels of the introduced Tat-DJ-1 fusion protein were detected after one hour. Although protein levels gradually decreased, Tat-DJ-1 fusion protein was introduced into the cells for 60 hours.
세포도입된 단백질이 세포 내 위치를 확인하기 위하여 세포를 핵 특이적 마커인 DAPI (diamidino-2-phenylindole)로 이중염색하였다. 도 2의 D와 같이, Tat-DJ-1 융합단백질은 핵과 세포질에서 탐지되었다. 이와 같은 결과는 Tat-DJ-1 융합단백질이 세포 내로 원활히 도입되었음을 말해준다.
Cells were double-stained with nuclear-specific marker DAPI (diamidino-2-phenylindole) to identify the location of the transduced protein. As shown in D of FIG. 2, Tat-DJ-1 fusion protein was detected in the nucleus and cytoplasm. These results indicate that the Tat-DJ-1 fusion protein was smoothly introduced into the cells.
결과 3: 산화 스트레스 하에서 세포 생존율에 미치는 세포도입 Outcome 3: Cell introduction on cell viability under oxidative stress TatTaste -- DJDJ -1 -One 융합단백질의Of the fusion protein 영향 effect
세포도입된 Tat-DJ-1 융합단백질이 산화 스트레스로부터 세포를 보호하는지를 알아보기 위하여 과산화수소 처리 후 MTT 분석으로 세포 생존율을 평가하였다. 세포를 0.7 mM H2O2에 노출시킨 후 45%의 세포만이 생존하였다. 도 3a와 같이, Tat-DJ-1 융합단백질로 선처리한 세포에서는 과산화수소에 노출된 세포의 생존율이 최대 68%까지 현저히 증가하였다. 그러나, 대조군 DJ-1 단백질은 같은 조건에서 보호 효과를 나타내지 않았다. 이러한 결과는 도입된 Tat-DJ-1 융합단백질이 세포 내에서 산화 스트레스에 의해 유도되는 세포 사멸에 대해 방어 역할을 수행함을 가리킨다.Cell viability was evaluated by MTT assay after hydrogen peroxide treatment to determine whether the transduced Tat-DJ-1 fusion protein protects the cells from oxidative stress. Only 45% of cells survived after exposure of the cells to 0.7 mM H 2 O 2 . As shown in Figure 3a, in the cells pretreated with the Tat-DJ-1 fusion protein, the survival rate of the cells exposed to hydrogen peroxide significantly increased up to 68%. However, the control DJ-1 protein did not show a protective effect under the same conditions. These results indicate that the introduced Tat-DJ-1 fusion protein plays a protective role against cell death induced by oxidative stress in cells.
또, 본 발명자들은 Tat-DJ-1 융합단백질이 과산화수소에 의한 세포 내 활성산소종 생성을 억제하는지를 시험하였다. 활성산소종 생성은 DCFHDA 형광 염색약의 세포내 산화를 이용하여 측정하였다. 세포를 0.7 mM 과산화수소에 30 분간 노출시켰다. 과산화수소는 DCF 신호를 현저히 증가시켰다. 그러나, Tat-DJ-1 융합단백질 존재 하에서 과산화수소에 의한 활성산소종 생성은 감소하였다 (도 3b). 활성산소종 생성은 Fluoroskan ELISA 판독기로 측정하였다. 도 3c와 같이, 세포 도입된 Tat-DJ-1 융합단백질은 대조군 DJ-1 단백질과 비교할 때 성상세포 내에서 과산화수소에 의한 활성산소종 생성을 현저히 억제하였다.In addition, the present inventors tested whether the Tat-DJ-1 fusion protein inhibits the generation of reactive oxygen species in cells by hydrogen peroxide. Reactive oxygen species generation was measured using intracellular oxidation of DCFHDA fluorescent dyes. The cells were exposed to 0.7 mM hydrogen peroxide for 30 minutes. Hydrogen peroxide significantly increased the DCF signal. However, the generation of reactive oxygen species by hydrogen peroxide in the presence of the Tat-DJ-1 fusion protein was reduced (FIG. 3B). Reactive oxygen species generation was measured with a Fluoroskan ELISA reader. As shown in FIG. 3c, the introduced Tat-DJ-1 fusion protein significantly inhibited the generation of reactive oxygen species by hydrogen peroxide in astrocytes when compared to the control DJ-1 protein.
DNA 조각화에 대한 세포도입된 Tat-DJ-1 융합단백질의 보호 효과를 TUNEL 염색으로 결정하였다. 도 4와 같이, 과산화수소 처리한 세포는 대조군 세포에 비하여 염색된 세포가 현저히 증가하였고, 반면, Tat-DJ-1 융합단백질로 처리한 세포는 염색된 세포 비율이 현저히 감소하였다. 이와 같은 결과는 세포 도입된 Tat-DJ-1 융합단백질이 세포 내에서 과산화수소에 의해 유도되는 활성산소종 생성 및 DNA 조각화를 효과적으로 억제함을 나타내는 것이다.
The protective effect of the transduced Tat-DJ-1 fusion protein on DNA fragmentation was determined by TUNEL staining. As shown in FIG. 4, the cells treated with hydrogen peroxide significantly increased the stained cells compared to the control cells, whereas the cells treated with the Tat-DJ-1 fusion protein significantly reduced the percentage of stained cells. These results indicate that the introduced Tat-DJ-1 fusion protein effectively inhibits the generation of reactive oxygen species and DNA fragmentation induced by hydrogen peroxide in cells.
결과 5: 세포도입된 Result 5: Cell Transduction TatTaste -- DJDJ -1 -One 융합단백질은Fusion proteins 허혈 손상을 보호한다. Protects ischemic damage.
본 발명자들은 Tat-DJ-1 융합단백질이 뇌-혈관 장벽을 가로지르는지를 면역조직화학 방법으로 시험하였다. 도 5와 같이, 샴 대조군 동물에서 DJ-1 단백질은 탐지되지 않았다. 반면, Tat-DJ-1 융합단백질 처리 동물의 뇌에서는 전체적으로 DJ-1 단백질 수준이 현저히 증가하였다. 따라서, 이러한 결과는 Tat-DJ-1 융합단백질이 저빌의 뇌-혈관 장벽을 가로질러 효과적으로 도입됨을 말해준다.We tested by immunohistochemistry whether the Tat-DJ-1 fusion protein crosses the brain-vascular barrier. As shown in FIG. 5, no DJ-1 protein was detected in the Siamese control animals. In contrast, the levels of DJ-1 protein were significantly increased in the brains of Tat-DJ-1 fusion protein treated animals. Thus, these results indicate that Tat-DJ-1 fusion protein is effectively introduced across Gerbil's brain-vascular barrier.
본 발명자들은 또한, 저빌 동물모델에 일시적 전뇌 허혈을 유발한 이후 신경세포 생존율에 미치는 Tat-DJ-1 융합단백질의 영향을 시험하였다. 뇌허혈 손상 4일 및 7일 후 샴 대조군, 담체 처리 대조군, Tat 펩타이드 처리군, DJ-1 단백질 처리 대조군 및 Tat-DJ-1 융합단백질 처리군 동물들을 희생시켜 크레실 바이올렛 염색하였다. Tat-DJ-1 융합단백질의 보호효과는 크레실 바이올렛 조직화학으로 평가하였다 (도 6). 담체 처리군에서 탐지된 양성 뉴런의 백분율은 샴 수술군의 12%였다. Tat-DJ-1 융합단백질 처리군 (4일 후 및 7일 후)에서 양성 뉴런은 샴 수술군의 각각 64% 및 53%였다.We also tested the effect of Tat-DJ-1 fusion protein on neuronal survival after transient transient cerebral ischemia in gerbil animal models. Four and seven days after cerebral ischemia injury, animals were stained with cresyl violet at the expense of Siamese control, carrier treated control, Tat peptide treated group, DJ-1 protein treated control group and Tat-DJ-1 fusion protein treated group animals. The protective effect of Tat-DJ-1 fusion protein was evaluated by Cresyl violet histochemistry (FIG. 6). The percentage of positive neurons detected in the carrier treated group was 12% of the Siamese surgical group. Positive neurons in the Tat-DJ-1 fusion protein treated groups (after 4 days and after 7 days) were 64% and 53% of the Siamese surgical groups, respectively.
본 발명자들은 Tat-DJ-1 융합단백질이 허혈에 의해 유도되는 지질 과산화를 억제하는지를 해마의 말론다이알데하이드 (MDA) 수준을 측정하여 시험하였다. 도 7과 같이, 담체 처리군에서는 샴 대조군과 비교하여 MDA 수준이 현저히 증가하였다. Tat-DJ-1 융합단백질 처리군에서는 해마 MDA 수준이 허혈손상군과 비교하여 현저히 감소하였다. 동일한 실험 조건 하에서 Tat 펩타이드 처리군 및 DJ-1 단백질 처리 대조군은 허혈 손상군과 유사한 패턴을 나타내었다. 이러한 결과는 Tat-DJ-1 융합단백질이 저빌 뇌-혈관 장벽을 효과적으로 투과하여 허혈 손상에 의해 유발된 신경세포 손상을 효과적으로 보호함을 말해준다.We tested whether the Tat-DJ-1 fusion protein inhibits lipid peroxidation induced by ischemia by measuring malondialdehyde (MDA) levels in the hippocampus. As shown in Figure 7, the carrier treated group significantly increased the MDA level compared to the Siamese control group. Hippocampal MDA levels were significantly decreased in the Tat-DJ-1 fusion protein group compared to the ischemic injury group. Under the same experimental conditions, the Tat peptide treated group and the DJ-1 protein treated control group showed a similar pattern to the ischemic injury group. These results indicate that the Tat-DJ-1 fusion protein effectively penetrates the gerbil brain-vascular barrier, effectively protecting neuronal damage caused by ischemic injury.
<110> Industry Academic Cooperation Foundation, Hallym University <120> Cell-transducing DJ-1 fusion protein <130> hallym-sychoi-DJ-1 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of human DJ-1 protein <400> 1 ctcgaggctt ccaaaagagc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of human DJ-1 protein <400> 2 ggatccctag tctttaagaa 20 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> HIV <400> 3 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 4 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide encoding Tat-DJ-1 fusioin protein <400> 4 catcatcatc atcatcacag cagcggcctg gtgccgcgcg gcagccatag gaagaagcgg 60 agacagcgac gaagactcga gatggcttcc aaaagagctc tggtcatcct ggctaaagga 120 gcagaggaaa tggagacggt catccctgta gatgtcatga ggcgagctgg gattaaggtc 180 accgttgcag gcctggctgg aaaagaccca gtacagtgta gccgtgatgt ggtcatttgt 240 cctgatgcca gccttgaaga tgcaaaaaaa gagggaccat atgatgtggt ggttctacca 300 ggaggtaatc tgggcgcaca gaatttatct gagtctgctg ctgtgaagga gatactgaag 360 gagcaggaaa accggaaggg cctgatagcc gccatctgtg caggtcctac tgctctgttg 420 gctcatgaaa taggctgtgg aagtaaagtt acaacacacc ctcttgctaa agacaaaatg 480 atgaatggag gtcattacac ctactctgag aatcgtgtgg aaaaagacgg cctgattctt 540 acaagccggg ggcctgggac cagcttcgag tttgcgcttg caattgttga agccctgaat 600 ggcaaggagg tggcggctca agtgaaggct ccacttgttc ttaaagacta g 651 <210> 5 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tat-DJ-1 fusioin protein <400> 5 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Glu Met Ala Ser Lys Arg 1 5 10 15 Ala Leu Val Ile Leu Ala Lys Gly Ala Glu Glu Met Glu Thr Val Ile 20 25 30 Pro Val Asp Val Met Arg Arg Ala Gly Ile Lys Val Thr Val Ala Gly 35 40 45 Leu Ala Gly Lys Asp Pro Val Gln Cys Ser Arg Asp Val Val Ile Cys 50 55 60 Pro Asp Ala Ser Leu Glu Asp Ala Lys Lys Glu Gly Pro Tyr Asp Val 65 70 75 80 Val Val Leu Pro Gly Gly Asn Leu Gly Ala Gln Asn Leu Ser Glu Ser 85 90 95 Ala Ala Val Lys Glu Ile Leu Lys Glu Gln Glu Asn Arg Lys Gly Leu 100 105 110 Ile Ala Ala Ile Cys Ala Gly Pro Thr Ala Leu Leu Ala His Glu Ile 115 120 125 Gly Cys Gly Ser Lys Val Thr Thr His Pro Leu Ala Lys Asp Lys Met 130 135 140 Met Asn Gly Gly His Tyr Thr Tyr Ser Glu Asn Arg Val Glu Lys Asp 145 150 155 160 Gly Leu Ile Leu Thr Ser Arg Gly Pro Gly Thr Ser Phe Glu Phe Ala 165 170 175 Leu Ala Ile Val Glu Ala Leu Asn Gly Lys Glu Val Ala Ala Gln Val 180 185 190 Lys Ala Pro Leu Val Leu Lys Asp 195 200 <210> 6 <211> 653 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide encoding DJ-1-Tat fusioin protein <400> 6 catcatcatc atcatcacag cagcggcctg gtgccggcgg cagccactcg agatggcttc 60 caaaagagct ctggtcatcc tggctaaagg agcagaggaa atggagacgg tcatccctgt 120 agatgtcatg aggcgagctg ggattaaggt caccgttgca ggcctggctg gaaaagaccc 180 agtacagtgt agccgtgatg tggtcatttg tcctgatgcc agccttgaag atgcaaaaaa 240 agagggacca tatgatgtgg tggttctacc aggaggtaat ctgggcgcac agaatttatc 300 tgagtctgct gctgtgaagg agatactgaa ggagcaggaa aaccggaagg gcctgatagc 360 cgccatctgt gcaggtccta ctgctctgtt ggctcatgaa ataggctgtg gaagtaaagt 420 tacaacacac cctcttgcta aagacaaaat gatgaatgga ggtcattaca cctactctga 480 gaatcgtgtg gaaaaagacg gcctgattct tacaagccgg gggcctggga ccagcttcga 540 gtttgcgctt gcaattgttg aagccctgaa tggcaaggag gtggcggctc aagtgaaggc 600 tccacttgtt cttaaagacg gatcctagga agaagcggag acagcgacga aga 653 <210> 7 <211> 210 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DJ-1-Tat fusioin protein <400> 7 Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His Leu Glu Met Ala Ser Lys 1 5 10 15 Arg Ala Leu Val Ile Leu Ala Lys Gly Ala Glu Glu Met Glu Thr Val 20 25 30 Ile Pro Val Asp Val Met Arg Arg Ala Gly Ile Lys Val Thr Val Ala 35 40 45 Gly Leu Ala Gly Lys Asp Pro Val Gln Cys Ser Arg Asp Val Val Ile 50 55 60 Cys Pro Asp Ala Ser Leu Glu Asp Ala Lys Lys Glu Gly Pro Tyr Asp 65 70 75 80 Val Val Val Leu Pro Gly Gly Asn Leu Gly Ala Gln Asn Leu Ser Glu 85 90 95 Ser Ala Ala Val Lys Glu Ile Leu Lys Glu Gln Glu Asn Arg Lys Gly 100 105 110 Leu Ile Ala Ala Ile Cys Ala Gly Pro Thr Ala Leu Leu Ala His Glu 115 120 125 Ile Gly Cys Gly Ser Lys Val Thr Thr His Pro Leu Ala Lys Asp Lys 130 135 140 Met Met Asn Gly Gly His Tyr Thr Tyr Ser Glu Asn Arg Val Glu Lys 145 150 155 160 Asp Gly Leu Ile Leu Thr Ser Arg Gly Pro Gly Thr Ser Phe Glu Phe 165 170 175 Ala Leu Ala Ile Val Glu Ala Leu Asn Gly Lys Glu Val Ala Ala Gln 180 185 190 Val Lys Ala Pro Leu Val Leu Lys Asp Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg 195 200 205 Arg Arg 210 <210> 8 <211> 682 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide encoding Tat-DJ-1-Tat fusioin protein <400> 8 catcatcatc atcatcacag cagcggcctg gtgccgcgcg gcagccatag gaagaagcgg 60 agacagcgac gaagactcga gatggcttcc aaaagagctc tggtcatcct ggctaaagga 120 gcagaggaaa tggagacggt catccctgta gatgtcatga ggcgagctgg gattaaggtc 180 accgttgcag gcctggctgg aaaagaccca gtacagtgta gccgtgatgt ggtcatttgt 240 cctgatgcca gccttgaaga tgcaaaaaaa gagggaccat atgatgtggt ggttctacca 300 ggaggtaatc tgggcgcaca gaatttatct gagtctgctg ctgtgaagga gatactgaag 360 gagcaggaaa accggaaggg cctgatagcc gccatctgtg caggtcctac tgctctgttg 420 gctcatgaaa taggctgtgg aagtaaagtt acaacacacc ctcttgctaa agacaaaatg 480 atgaatggag gtcattacac ctactctgag aatcgtgtgg aaaaagacgg cctgattctt 540 acaagccggg ggcctgggac cagcttcgag tttgcgcttg caattgttga agccctgaat 600 ggcaaggagg tggcggctca agtgaaggct ccacttgttc ttaaagacgg atcctaggaa 660 gaagcggaga cagcgacgaa ga 682 <210> 9 <211> 211 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tat-DJ-1-Tat fusioin protein <400> 9 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Glu Met Ala Ser Lys Arg 1 5 10 15 Ala Leu Val Ile Leu Ala Lys Gly Ala Glu Glu Met Glu Thr Val Ile 20 25 30 Pro Val Asp Val Met Arg Arg Ala Gly Ile Lys Val Thr Val Ala Gly 35 40 45 Leu Ala Gly Lys Asp Pro Val Gln Cys Ser Arg Asp Val Val Ile Cys 50 55 60 Pro Asp Ala Ser Leu Glu Asp Ala Lys Lys Glu Gly Pro Tyr Asp Val 65 70 75 80 Val Val Leu Pro Gly Gly Asn Leu Gly Ala Gln Asn Leu Ser Glu Ser 85 90 95 Ala Ala Val Lys Glu Ile Leu Lys Glu Gln Glu Asn Arg Lys Gly Leu 100 105 110 Ile Ala Ala Ile Cys Ala Gly Pro Thr Ala Leu Leu Ala His Glu Ile 115 120 125 Gly Cys Gly Ser Lys Val Thr Thr His Pro Leu Ala Lys Asp Lys Met 130 135 140 Met Asn Gly Gly His Tyr Thr Tyr Ser Glu Asn Arg Val Glu Lys Asp 145 150 155 160 Gly Leu Ile Leu Thr Ser Arg Gly Pro Gly Thr Ser Phe Glu Phe Ala 165 170 175 Leu Ala Ile Val Glu Ala Leu Asn Gly Lys Glu Val Ala Ala Gln Val 180 185 190 Lys Ala Pro Leu Val Leu Lys Asp Gly Ser Arg Lys Lys Arg Arg Gln 195 200 205 Arg Arg Arg 210 <110> Industry Academic Cooperation Foundation, Hallym University <120> Cell-transducing DJ-1 fusion protein <130> hallym-sychoi-DJ-1 <160> 9 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of human DJ-1 protein <400> 1 ctcgaggctt ccaaaagagc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of human DJ-1 protein <400> 2 ggatccctag tctttaagaa 20 <210> 3 <211> 9 <212> PRT HIV <400> 3 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 4 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide encoding Tat-DJ-1 fusioin protein <400> 4 catcatcatc atcatcacag cagcggcctg gtgccgcgcg gcagccatag gaagaagcgg 60 agacagcgac gaagactcga gatggcttcc aaaagagctc tggtcatcct ggctaaagga 120 gcagaggaaa tggagacggt catccctgta gatgtcatga ggcgagctgg gattaaggtc 180 accgttgcag gcctggctgg aaaagaccca gtacagtgta gccgtgatgt ggtcatttgt 240 cctgatgcca gccttgaaga tgcaaaaaaa gagggaccat atgatgtggt ggttctacca 300 ggaggtaatc tgggcgcaca gaatttatct gagtctgctg ctgtgaagga gatactgaag 360 gagcaggaaa accggaaggg cctgatagcc gccatctgtg caggtcctac tgctctgttg 420 gctcatgaaa taggctgtgg aagtaaagtt acaacacacc ctcttgctaa agacaaaatg 480 atgaatggag gtcattacac ctactctgag aatcgtgtgg aaaaagacgg cctgattctt 540 acaagccggg ggcctgggac cagcttcgag tttgcgcttg caattgttga agccctgaat 600 ggcaaggagg tggcggctca agtgaaggct ccacttgttc ttaaagacta g 651 <210> 5 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tat-DJ-1 fusioin protein <400> 5 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Glu Met Ala Ser Lys Arg 1 5 10 15 Ala Leu Val Ile Leu Ala Lys Gly Ala Glu Glu Met Glu Thr Val Ile 20 25 30 Pro Val Asp Val Met Arg Arg Ala Gly Ile Lys Val Thr Val Ala Gly 35 40 45 Leu Ala Gly Lys Asp Pro Val Gln Cys Ser Arg Asp Val Val Ile Cys 50 55 60 Pro Asp Ala Ser Leu Glu Asp Ala Lys Lys Glu Gly Pro Tyr Asp Val 65 70 75 80 Val Val Leu Pro Gly Gly Asn Leu Gly Ala Gln Asn Leu Ser Glu Ser 85 90 95 Ala Ala Val Lys Glu Ile Leu Lys Glu Gln Glu Asn Arg Lys Gly Leu 100 105 110 Ile Ala Ala Ile Cys Ala Gly Pro Thr Ala Leu Leu Ala His Glu Ile 115 120 125 Gly Cys Gly Ser Lys Val Thr Thr His Pro Leu Ala Lys Asp Lys Met 130 135 140 Met Asn Gly Gly His Tyr Thr Tyr Ser Glu Asn Arg Val Glu Lys Asp 145 150 155 160 Gly Leu Ile Leu Thr Ser Arg Gly Pro Gly Thr Ser Phe Glu Phe Ala 165 170 175 Leu Ala Ile Val Glu Ala Leu Asn Gly Lys Glu Val Ala Ala Gln Val 180 185 190 Lys Ala Pro Leu Val Leu Lys Asp 195 200 <210> 6 <211> 653 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide encoding DJ-1-Tat fusioin protein <400> 6 catcatcatc atcatcacag cagcggcctg gtgccggcgg cagccactcg agatggcttc 60 caaaagagct ctggtcatcc tggctaaagg agcagaggaa atggagacgg tcatccctgt 120 agatgtcatg aggcgagctg ggattaaggt caccgttgca ggcctggctg gaaaagaccc 180 agtacagtgt agccgtgatg tggtcatttg tcctgatgcc agccttgaag atgcaaaaaa 240 agagggacca tatgatgtgg tggttctacc aggaggtaat ctgggcgcac agaatttatc 300 tgagtctgct gctgtgaagg agatactgaa ggagcaggaa aaccggaagg gcctgatagc 360 cgccatctgt gcaggtccta ctgctctgtt ggctcatgaa ataggctgtg gaagtaaagt 420 tacaacacac cctcttgcta aagacaaaat gatgaatgga ggtcattaca cctactctga 480 gaatcgtgtg gaaaaagacg gcctgattct tacaagccgg gggcctggga ccagcttcga 540 gtttgcgctt gcaattgttg aagccctgaa tggcaaggag gtggcggctc aagtgaaggc 600 tccacttgtt cttaaagacg gatcctagga agaagcggag acagcgacga aga 653 <210> 7 <211> 210 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DJ-1-Tat fusioin protein <400> 7 Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His Leu Glu Met Ala Ser Lys 1 5 10 15 Arg Ala Leu Val Ile Leu Ala Lys Gly Ala Glu Glu Met Glu Thr Val 20 25 30 Ile Pro Val Asp Val Met Arg Arg Ala Gly Ile Lys Val Thr Val Ala 35 40 45 Gly Leu Ala Gly Lys Asp Pro Val Gln Cys Ser Arg Asp Val Val Ile 50 55 60 Cys Pro Asp Ala Ser Leu Glu Asp Ala Lys Lys Glu Gly Pro Tyr Asp 65 70 75 80 Val Val Val Leu Pro Gly Gly Asn Leu Gly Ala Gln Asn Leu Ser Glu 85 90 95 Ser Ala Ala Val Lys Glu Ile Leu Lys Glu Gln Glu Asn Arg Lys Gly 100 105 110 Leu Ile Ala Ala Ile Cys Ala Gly Pro Thr Ala Leu Leu Ala His Glu 115 120 125 Ile Gly Cys Gly Ser Lys Val Thr Thr His Pro Leu Ala Lys Asp Lys 130 135 140 Met Met Asn Gly Gly His Tyr Thr Tyr Ser Glu Asn Arg Val Glu Lys 145 150 155 160 Asp Gly Leu Ile Leu Thr Ser Arg Gly Pro Gly Thr Ser Phe Glu Phe 165 170 175 Ala Leu Ala Ile Val Glu Ala Leu Asn Gly Lys Glu Val Ala Ala Gln 180 185 190 Val Lys Ala Pro Leu Val Leu Lys Asp Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg 195 200 205 Arg Arg 210 <210> 8 <211> 682 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide encoding Tat-DJ-1-Tat fusioin protein <400> 8 catcatcatc atcatcacag cagcggcctg gtgccgcgcg gcagccatag gaagaagcgg 60 agacagcgac gaagactcga gatggcttcc aaaagagctc tggtcatcct ggctaaagga 120 gcagaggaaa tggagacggt catccctgta gatgtcatga ggcgagctgg gattaaggtc 180 accgttgcag gcctggctgg aaaagaccca gtacagtgta gccgtgatgt ggtcatttgt 240 cctgatgcca gccttgaaga tgcaaaaaaa gagggaccat atgatgtggt ggttctacca 300 ggaggtaatc tgggcgcaca gaatttatct gagtctgctg ctgtgaagga gatactgaag 360 gagcaggaaa accggaaggg cctgatagcc gccatctgtg caggtcctac tgctctgttg 420 gctcatgaaa taggctgtgg aagtaaagtt acaacacacc ctcttgctaa agacaaaatg 480 atgaatggag gtcattacac ctactctgag aatcgtgtgg aaaaagacgg cctgattctt 540 acaagccggg ggcctgggac cagcttcgag tttgcgcttg caattgttga agccctgaat 600 ggcaaggagg tggcggctca agtgaaggct ccacttgttc ttaaagacgg atcctaggaa 660 gaagcggaga cagcgacgaa ga 682 <210> 9 <211> 211 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tat-DJ-1-Tat fusioin protein <400> 9 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Glu Met Ala Ser Lys Arg 1 5 10 15 Ala Leu Val Ile Leu Ala Lys Gly Ala Glu Glu Met Glu Thr Val Ile 20 25 30 Pro Val Asp Val Met Arg Arg Ala Gly Ile Lys Val Thr Val Ala Gly 35 40 45 Leu Ala Gly Lys Asp Pro Val Gln Cys Ser Arg Asp Val Val Ile Cys 50 55 60 Pro Asp Ala Ser Leu Glu Asp Ala Lys Lys Glu Gly Pro Tyr Asp Val 65 70 75 80 Val Val Leu Pro Gly Gly Asn Leu Gly Ala Gln Asn Leu Ser Glu Ser 85 90 95 Ala Ala Val Lys Glu Ile Leu Lys Glu Gln Glu Asn Arg Lys Gly Leu 100 105 110 Ile Ala Ala Ile Cys Ala Gly Pro Thr Ala Leu Leu Ala His Glu Ile 115 120 125 Gly Cys Gly Ser Lys Val Thr Thr His Pro Leu Ala Lys Asp Lys Met 130 135 140 Met Asn Gly Gly His Tyr Thr Tyr Ser Glu Asn Arg Val Glu Lys Asp 145 150 155 160 Gly Leu Ile Leu Thr Ser Arg Gly Pro Gly Thr Ser Phe Glu Phe Ala 165 170 175 Leu Ala Ile Val Glu Ala Leu Asn Gly Lys Glu Val Ala Ala Gln Val 180 185 190 Lys Ala Pro Leu Val Leu Lys Asp Gly Ser Arg Lys Lys Arg Arg Gln 195 200 205 Arg Arg Arg 210
Claims (7)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110101576A KR20130037271A (en) | 2011-10-06 | 2011-10-06 | Cell- transducible dj-1 fusion protein |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110101576A KR20130037271A (en) | 2011-10-06 | 2011-10-06 | Cell- transducible dj-1 fusion protein |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20130037271A true KR20130037271A (en) | 2013-04-16 |
Family
ID=48438288
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020110101576A KR20130037271A (en) | 2011-10-06 | 2011-10-06 | Cell- transducible dj-1 fusion protein |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20130037271A (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20160013730A (en) | 2014-07-28 | 2016-02-05 | 가톨릭대학교 산학협력단 | Methods of TAT-A20 fusion protein with good cell penetration and use thereof |
| EP3219326A1 (en) * | 2016-03-14 | 2017-09-20 | Institut Catalá De Ciencies Cardiovasculars (ICCC) | Prevention and/or treatment of ischemia or ischemia/reperfusion injury |
| KR101947281B1 (en) * | 2017-09-27 | 2019-05-08 | 한림대학교 산학협력단 | Phmaceutical composition for treating Parkinson's disease containing Cytokine induced apoptosis inhibitor 1 fusion protein |
-
2011
- 2011-10-06 KR KR1020110101576A patent/KR20130037271A/en not_active Application Discontinuation
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20160013730A (en) | 2014-07-28 | 2016-02-05 | 가톨릭대학교 산학협력단 | Methods of TAT-A20 fusion protein with good cell penetration and use thereof |
| EP3219326A1 (en) * | 2016-03-14 | 2017-09-20 | Institut Catalá De Ciencies Cardiovasculars (ICCC) | Prevention and/or treatment of ischemia or ischemia/reperfusion injury |
| WO2017157958A1 (en) * | 2016-03-14 | 2017-09-21 | Institut Català De Ciències Cardiovasculars (Iccc) | Prevention and/or treatment of ischemia or ischemia/reperfusion injury |
| JP2019516778A (en) * | 2016-03-14 | 2019-06-20 | フンダシオ、インスティトゥト、デ、レセルカ、デ、エレ、オスピタル、デ、ラ、サンタ、クレウ、イ、サン、パウＦｕｎｄａｃｉｏ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｄｅ Ｒｅｃｅｒｃａ Ｄｅ Ｌ’Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｄｅ Ｌａ Ｓａｎｔａ Ｃｒｅｕ Ｉ Ｓａｎｔ Ｐａｕ | Prevention and / or treatment of ischemic injury or ischemia reperfusion injury |
| JP7277356B2 (en) | 2016-03-14 | 2023-05-18 | フンダシオ、インスティトゥト、デ、レセルカ、デ、エレ、オスピタル、デ、ラ、サンタ、クレウ、イ、サン、パウ | Prevention and/or treatment of ischemic injury or ischemia reperfusion injury |
| KR101947281B1 (en) * | 2017-09-27 | 2019-05-08 | 한림대학교 산학협력단 | Phmaceutical composition for treating Parkinson's disease containing Cytokine induced apoptosis inhibitor 1 fusion protein |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6203215B2 (en) | Prominin-1 peptide fragment and use thereof | |
| KR20130037271A (en) | Cell- transducible dj-1 fusion protein | |
| Kim et al. | PEP-1-p18 prevents neuronal cell death by inhibiting oxidative stress and Bax expression | |
| KR101869686B1 (en) | Anti-inflammatory pharmaceutical composition containing CIAPIN1 fusion protein | |
| KR101764583B1 (en) | Pharmaceutical composition for treating cerebral ischemia containing TXNL1 fusion protein | |
| KR101218067B1 (en) | Cell transducing glyoxalase fusion protein and pharmaceutical composition containing thereof | |
| KR101732349B1 (en) | Pharmaceutical composition for treating Parkinson's disease containing cell-transducible PIM2 fusion protein | |
| KR20210021186A (en) | A pharmaceutical composition containing cell-transducing CNRIP1 fusion protein for preventing or treating neuronal disorder | |
| KR20150126234A (en) | Polypeptides derived from receptor for advanced glycation end products (RAGE) and pharmaceutical composition for preventing and treating cerebrovascular disease comprising the same | |
| KR20130037269A (en) | Cell-transducing metallothinein-iii fusion protein | |
| KR101962067B1 (en) | Phmaceutical composition for treating Parkinson's disease containing TXNL1 fusion protein | |
| KR101955882B1 (en) | Pharmaceutical composition for treating cerebral ischemia containing RAN fusion protein | |
| KR101439203B1 (en) | Pharmaceutical composition containing FK506 binding protein fusion protein and fenobam for treating brain ischemic damage | |
| KR20180021470A (en) | Anti-infalmmatory pharmaceutical composition containing Atox1 fusion protein | |
| KR101298014B1 (en) | Cell-transducible PRAS40 fusion protein | |
| KR20170029671A (en) | Pharmaceutical composition for treating Parkinson's disease containing cell-transducible ATOX1 fusion protein | |
| KR20190111454A (en) | Pharmaceutical composition for treating cerebral ischemia containing GSTA2 fusion protein | |
| KR20190036280A (en) | Pharmaceutical composition for treating cerebral ischemia containing Cyclophilin A fusion protein | |
| KR20150055246A (en) | Pharmaceutical composition for treating skin inflammation containing Biliverdin reductase A fusion protein | |
| KR20220158291A (en) | A pharmaceutical composition containing cell-transducing Inorganic Pyrophosphatase 1 fusion protein for preventing or treating motor neuronal disorder | |
| KR20130134530A (en) | Pharmaceutical composition for parkinson's disease containing pea-15 fusion protein | |
| KR20230045653A (en) | Pharmaceutical composition for treating cerebral ischemia containing cell-transducing STUB1 fusion protein | |
| KR20190115178A (en) | Phmaceutical composition for treating Parkinson's disease containing GSTA2 fusion protein | |
| KR100998498B1 (en) | Cell-transducing creatine kinase fusion protein | |
| KR20210114590A (en) | Pharmaceutical composition for treating cerebral ischemia containing TAGLN3 fusion protein |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| WITN | Withdrawal due to no request for examination |