KR20150053258A

KR20150053258A - 고리-매개 등온 증폭법을 이용한 진균성 질병 검출 방법

Info

Publication number: KR20150053258A
Application number: KR1020150032911A
Authority: KR
Inventors: 윤병수; 임희영
Original assignee: 윤병수; 임희영
Priority date: 2015-03-10
Filing date: 2015-03-10
Publication date: 2015-05-15
Also published as: KR101552159B1

Abstract

꿀벌의 진균성 질병으로 백묵병과 석고병의 초기 감염 확인을 위한 방법으로서, 기존의 RT-PCR을 사용하는 것이 아니라, 더욱 더 정확성이 높은 고리-매개 등온 증폭법(Loop-mediated Isothermal Amplification; LAMP)을 사용하는 백묵병과 석고병의 탐지 방법이 개시된다. 본 발명은 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 조성물로 등온증폭반응을 수행하여 석고병(Stone brood disease) 또는 백묵병(Chalk brod disease)을 검출하는 방법을 제공한다.

Description

고리-매개 등온 증폭법을 이용한 진균성 질병 검출 방법{METHOD FOR THE DETECTION OF FUNGAL DISEASE BY LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION}

본 발명은 진균성 질병 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 고리-매개 등온 증폭법을 이용한 석고병 또는 백묵병 검출 방법에 관한 것이다.

꿀벌의 수분매개 활동에 의해 세계 식량의 25%가 생산되며, 양봉산업을 통해 각종 기능성 식품은 물론 각종 질병 치료제도 제공되고 있다. 또한, 꿀벌은 화분매개 곤충으로 전 세계 주요 100대 농작물의 71%를 수정하여 농업생산에 큰 영향을 줄 뿐만 아니라 각종 유용 산물을 생산하여 그 경제적 가치는 매우 높다. 그러나, 해충, 응애, 원생동물, 곰팡이, 박테리아, 바이러스 등에 의하여 유발된 질병으로 봉군 감소 및 폐사로 농업생산에 심각한 위기를 초래하고 있다.

그 중 꿀벌의 진균성 질병으로는 백묵병(Chalk brood disease)와 석고병(Stone brood disease)이 가장 잘 알려져 있으며, 국내에서는 이 두 질병의 이름이 혼동되어 사용되고 있다. 하지만, 백묵병은 아스코스파에라 아피스(Ascosphaera apis)가 원인균인 것에 비해서 석고병은 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 균에 의해 발병이 되며 아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus)에 의해 가장 빈번하게 발병된다. 석고병의 원인 균은 독일의 Maassen에 의해 최초로 보고되었으며, 발병은 병원성의 포자가 애벌레의 소화기 안에 들어가 발아하며, 이 균사가 각 조직에 침투해 들어가 자라남에 따라 애벌레가 치사되어 사체는 딱딱한 석고 모양의 형상으로 발견된다. 그렇기에 백묵병과 비교하여 증상이 비슷하기 때문에 일반 농가에서는 혼용되어 보고되기도 한다.

백묵병과 석고병은 강원도 지방의 양봉농가에서 가장 심각하게 인식된 질병으로 조사된 바 있으며, 적지 않은 피해를 주는 것으로 알려져 있다. 또한, 많은 경우 노제마, 바이러스, 부저병과 함께 혼합 감염을 야기시킬 위험성이 매우 높으며, 이런 혼합 감염은 보다 심각한 결과를 초래하게 된다. 그러므로, 꿀벌 진균성 질병의 빠른 조기진단, 예방법 및 치료법의 개발이 요구되고 있다.

[선행기술문헌]

- 공개특허 제2010-0083398호(2010.07.22)

이에 본 발명은 꿀벌의 진균성 질병으로 백묵병과 석고병의 초기 감염 확인을 위한 방법으로서, 기존의 RT-PCR을 사용하는 것이 아니라, 더욱 더 정확성이 높은 고리-매개 등온 증폭법(Loop-mediated Isothermal Amplification; LAMP)을 사용하는 백묵병과 석고병의 탐지 방법을 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 조성물로 등온증폭반응을 수행하여 석고병(Stone brood disease) 또는 백묵병(Chalk brod disease)을 검출하는 방법을 제공한다.

또한, 상기 등온증폭반응은 46~54℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

또한, 상기 등온증폭반응은 내부 프라이머 농도 20~60pmole 및 외부 프라이머 농도 5~15pmole에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

또한, 상기 등온증폭반응은 dNTP 농도 1.25~5mM에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

이러한 본 발명에 따르면, 기존 RT-PCR 반응을 수행하여 꿀벌의 진균성 질병을 검출하는 방법보다 신속하고 감도가 좋은 고리-매개 등온 증폭법을 이용하여, 등온이라는 장점으로 현장에 적용 가능할 뿐만 아니라, 꿀벌의 바이러스 감염여부도 쉽게 모니터링하여 판단할 수 있는 효과가 있다.

도 1 및 도 2는 각각 실시예 2에 따라 수행된 A. flavus-LAMP 및 A. apis-LAMP 결과를 나타낸 전기영동 사진,
도 3 및 도 4는 각각 실시예 3에 따라 프라이머 농도 및 dNTP 농도 변화에 따른 A. apis & A. flavus-LAMP 결과를 나타낸 전기영동 사진.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예의 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

본 발명자들은 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 조성물로 등온증폭반응을 수행할 경우 신속, 정확하게 석고병과 백묵병을 탐지할 수 있음을 발견하고 본 발명에 이르게 되었다.

따라서, 본 발명은 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 조성물로 등온증폭반응을 수행하여 석고병(Stone brood disease) 또는 백묵병(Chalk brod disease)을 검출하는 방법을 개시한다. 이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명한다.

실시예 1: 프라이머 설계 및 제작

아스코스파에라 아피스(이하, 'A. apis'라 칭함.) 및 아스퍼질러스 플라버스(이하, 'A. flavus'라 칭함.)-고리-매개 등온 증폭법(이하, 'LAMP'라 칭함.)에 사용할 프라이머 세트(primer set)를 하기 표 1에 나타내었다.

표 1을 참조하면, 정방향 내부 프라이머(Forward inner primer)인 A. apis & A. flavus-FIP는 A. flavus 안티센스 서열(antisense sequence)과 A. apis 안티센스 서열의 상보적인 염기서열(F2)과 TTTT 연결자(linker) 및 고리(loop)를 형성하는 염기서열(F1c) 부분을 결합한 것으로, 45개 뉴클레오티드(45nt)의 긴 뉴클레오티드(long-nucleotide)로 제작하였다. 역방향 내부 프라이머(Reverse inner primer)인 A. apis & A. flavus-BIP는 A. flavus 센스 서열(sense sequence)과 A. apis 안티센스 서열(antisense sequence)의 상보적인 염기서열(B2)과 TTTT 연결자(linker) 및 고리(loop)를 형성하는 염기서열(B1c) 부분을 결합한 것으로, 각각 48개 뉴클레오티드(48nt)의 긴 뉴클레오티드(long-nucleotide)로 제작하였다. 또한, 외부 프라이머(outer primer)인 A. apis & A. flavus-F3와 A. apis & A. flavus-B3는 내부 프라이머(inner primer)들의 바깥쪽에 위치하도록 설계하였으며, 각각 22개 뉴클레오티드(22nt) 및 20개 뉴클레오티드(20nt)의 크기로 제작하였다. 이 프라이머 세트는 Bionics사(한국)에 의뢰하여 제작하였으며 내부 프라이머들의 경우에는 PAGE 정제 후 사용하였다.

실시예 2: LAMP 최적 반응 온도 확인

먼저, A. flavus 검출을 위한 프라이머 세트의 활성 최적 온도를 측정하였다. 반응액은 주형인 A. flavus 플라스미드(plasmid) 1ng, A. flavus-FIP/BIP는 각각 40pmole, A. flavus-F3/B3는 각각 10pmole, 5mM dNTP, 10×완충액(Reaction buffer), 8U Bst DNA 중합효소(polymerase)(NEB, 미국), DMSO(최종농도 5%)를 첨가하여 총 20㎕로 조성하였다. Bst DNA 중합효소는 80℃ 이상이 되면 불활성화되는 특징을 가지고 있어, 94℃에서 5분간 DNA를 해리시킨 뒤 즉시 4℃로 온도를 낮추고 1분 정치 후에 첨가하였으며, 이후 60분간 DNA 신장을 진행하였고 80℃에서 10분간 정치해 Bst DNA 중합효소를 불활성화시킨 후 종료하였다. DNA 신장의 최적온도 측정은 45~65℃ 구간에서 1시간 동안 등온조건하에서 진행하였으며, 각 LAMP 반응이 끝난 후 전기영동으로 확인하여 A. flavus-LAMP에 대한 최적온도를 확인하였다.

다음으로, A. apis 검출을 위한 프라이머 세트의 활성 최적 온도를 측정하였다. 반응액은 주형인 A. apis 플라스미드 1ng, A. apis & A. flavus-FIP/BIP는 각각 40pmole, A. apis & A. flavus-F3/B3는 각각 10pmole, 2.5mM dNTP, 10×완충액, 8U Bst DNA 중합효소(NEB, 미국), DMSO(최종농도 5%)를 첨가하여 총 20㎕로 조성하였다. Bst DNA 중합효소는 80℃ 이상이 되면 불활성화되는 특징을 가지고 있어, 94℃에서 5분간 DNA를 해리시킨 뒤 즉시 4℃로 온도를 낮추고 1분 정치 후에 첨가하였으며, 이후 60분간 DNA 신장을 진행하였고 80℃에서 10분간 정치해 Bst DNA 중합효소를 불활성화시킨 후 종료하였다. DNA 신장의 최적온도 측정은 45~65℃ 구간에서 1시간 동안 등온조건하에서 진행하였으며, 각 LAMP 반응이 끝난 후 전기영동으로 확인하여 A. apis & A. flavus-LAMP에 대한 최적온도를 확인하였다.

도 1 및 도 2는 각각 실시예 2에 따라 수행된 A. flavus-LAMP 및 A. apis-LAMP 결과를 나타낸 전기영동 사진이다. 도 1 및 도 2에서 레인 1 내지 8은 각각 45℃, 46.7℃, 48.2℃, 53.4℃, 56.7℃, 61.8℃, 63.4℃, 65℃에서 진행한 LAMP-PCR 결과이고, 레인 N은 LAMP-PCR의 음성 대조군(negative control) 결과를 나타내고 있다.

먼저, 도 1을 참조하면, 실험 결과 46~54℃에서 양호한 증폭을 보인 것을 알 수 있고, 47℃부터 강하게 증폭이 되는 것을 확인할 수 있었으며, 그 중에서도 약 48℃부터 LAMP에 의한 증폭량이 가장 크게 나온 것으로 확인되었다. 따라서, A. flavus는 상기 사용된 프라이머에서는 48℃가 최적의 온도인 것으로 확인되었다.

다음으로, 도 2를 참조하면, 실험 결과 백묵병 또한, 46~54℃에서 양호한 증폭을 보인 것을 알 수 있고, 47℃부터 강하게 증폭이 되는 것을 확인할 수 있었으며, 그 중에서도 약 48℃부터 증폭량이 가장 크게 나온 것으로 확인되었다. 따라서, 결과적으로 진균성 질병(백묵병, 석고병)용 LAMP 키트(Kit)의 최적온도를 48℃로 확정할 수 있었다.

실시예 3: LAMP 최적 반응액 조성 확인

먼저, A. flavus-LAMP의 최적 반응 조건을 확립하기 위하여 프라이머 세트와 dNTP의 농도를 달리하여 반응액 조성에 따른 최적 조건을 확인하였다. 프라이머의 농도는 Notomi 등(2000)이 제시한 외부 프라이머와 내부 프라이머의 농도가 1:4일때 가장 높은 효율을 보였다는 결과를 바탕으로 이 비율을 유지하되 프라이머의 절대농도만을 변화시켜 그 결과를 측정하였다. 즉, 내부 프라이머의 각 농도가 20pmole, 40pmole, 60pmole, 80pmole, 100pmole일 때 외부 프라이머의 각 농도는 5pmole, 10pmole, 15pmole, 20pmole, 25pmole로 하여 LAMP를 수행하였다. dNTP의 경우 각각 1.25mM, 2.5mM, 5mM, 7.5mM, 10.0mM이 되도록 조성하여 측정함으로써 최적 반응 조건을 확인하였다.

다음으로, A. apis & A. flavus-LAMP의 최적 반응 조건을 확립하기 위하여 프라이머 세트와 dNTP의 농도를 달리하여 반응액 조성에 따른 최적 조건을 확인하였다. 프라이머의 농도는 Notomi 등(2000)이 제시한 외부 프라이머와 내부 프라이머의 농도가 1:4일 때 가장 높은 효율을 보였다는 결과를 바탕으로 이 비율을 유지하되 프라이머의 절대농도만을 변화시켜 그 결과를 측정하였다. 즉, 내부 프라이머의 각 농도가 20pmole, 40pmole, 60pmole, 80pmole, 100pmole일 때 외부 프라이머의 각 농도는 5pmole, 10pmole, 15pmole, 20pmole, 25pmole로 하여 LAMP를 수행하였다. dNTP의 경우 각각 1.25mM, 2.5mM, 5mM, 7.5mM, 10.0mM이 되도록 조성하여 측정함으로써 최적 반응 조건을 확인하였다.

도 3 및 도 4는 각각 실시예 3에 따라 프라이머 농도 및 dNTP 농도 변화에 따른 A. apis & A. flavus-LAMP 결과를 나타낸 전기영동 사진이다. 도 3에서 레인 M은 1kbp 래더 마커(ladder marker), 레인 1 내지 5는 A. apis-LAMP 결과이고 각각 내부 프라이머 농도/외부 프라이머 농도가 20pmole/5pmole, 40pmole/10pmole, 60pmole/15pmole, 80pmole/20pmole, 100pmole/25pmole일 때, 레인 6 내지 10은 A. flavus-LAMP 결과이고 각각 내부 프라이머 농도/외부 프라이머 농도가 20pmole/5pmole, 40pmole/10pmole, 60pmole/15pmole, 80pmole/20pmole, 100pmole/25pmole일 때, 레인 N은 음성 대조군(negative control) 결과를 나타내고 있다. 또한, 도 4에서 레인 M은 1kbp 래더 마커(ladder marker), 레인 1 내지 5는 A. apis-LAMP 결과이고 각각 dNTP 농도가 1.25mM, 2.5mM, 5mM, 7.5mM, 10.0mM일 때, 레인 6 내지 10은 A. flavus-LAMP 결과이고 1.25mM, 2.5mM, 5mM, 7.5mM, 10.0mM일 때, 레인 N은 음성 대조군(negative control) 결과를 나타내고 있다.

도 3을 참조하면, 먼저, 각각의 내부 프라이머 농도 60~100pmole 및 외부 프라이머 농도 5~15pmole에서 양호한 증폭을 보인 것을 알 수 있고, 내부 프라이머가 40pmole이고 외부 프라이머가 10pmole일 때 부터 석고병 및 백묵병 유전자의 증폭을 가장 잘 확인할 수 있었다. 물론 레인 3~5 또한 증폭이 양호하였으나, 레인 2와의 증폭량에서 큰 차이를 보이지 않고 있기에 레인 2에 사용한 조성의 프라이머를 최적 프라이머 농도로 확인하였다.

다음으로, dNTP 농도 1.25~5mM에서 양호한 증폭을 보인 것을 알 수 있고, 1.25mM의 dNTP와 2.5mM의 dNTP에서 반응이 가장 잘 일어난 것을 확인할 수 있었다. dNTP 농도가 5mM을 초과하면 양쪽 모두 증폭이 일어나지 않았고, 가장 반응이 잘 일어난 농도는 2.5mM로 확인되었다.

실시예 4: 최종 확립 조건

실시예 3에서 확인된 최적 반응액 조성을 기초로 하기 표 2에 제시된 조성으로 실험을 진행하였다. Bst DNA 중합효소는 80℃ 이상이 되면 불활성화되는 특징을 가지고 있어, 99℃에서 10분간 DNA를 해리시킨 뒤 즉시 4℃로 온도를 낮추고 1분 정치 후에 첨가하였으며, 이후 60분간 DNA 신장을 진행하였고, 80℃에서 10분간 정치해 Bst DNA 중합효소를 불활성화시킨 후 종료하였다. DNA 신장의 최적온도로 확인된 48℃ 구간에서 1시간 동안 등온조건하에서 진행하였으며, 각 LAMP 반응이 끝난 후 전기영동으로 확인한 결과 DNA가 성공적으로 증폭됨을 확인하였다.

이상에서 설명한 본 발명의 바람직한 실시예들은 기술적 과제를 해결하기 위해 개시된 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 사상 및 범위 안에서 다양한 수정, 변경, 부가 등이 가능할 것이며, 이러한 수정 변경 등은 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.

Claims

서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 조성물로 등온증폭반응을 수행하여 석고병(Stone brood disease) 또는 백묵병(Chalk brod disease)을 검출하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 등온증폭반응은 46~54℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 등온증폭반응은 내부 프라이머 농도 20~60pmole 및 외부 프라이머 농도 5~15pmole에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 등온증폭반응은 dNTP 농도 1.25~5mM에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.