KR20150047786A - 베타-아사론을 유효성분으로 함유하는 신경변성질환 예방 및 치료용 조성물, 그리고 베타-아사론 추출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 베타-아사론을 유효성분으로 함유하는 신경변성질환 예방 및 치료용 조성물, 그리고 베타-아사론 추출 방법에 관한 것으로, 신경교세포에 의해 야기되는 신경염증에 있어서 단일 화합물인 베타-아사론이, 활성화된 신경소교세포의 전염증 매개인자를 억제함으로써 신경염증 억제에 효능을 가질 수 있도록 하는 신경변성질환 예방 및 치료용 조성물, 그리고 베타-아사론 추출 방법에 관한 것이다.

Description

베타-아사론을 유효성분으로 함유하는 신경변성질환 예방 및 치료용 조성물, 그리고 베타-아사론 추출 방법 {Pharmaceutical composition and functional food for preventing or treating neurodegenerative disease by Beta-asarone as effective component, and Extracting Method of Beta-asarone}

본 발명은 단일 화합물인 베타-아사론을 유효성분으로 함유하는 신경변성질환 예방 및 치료용 조성물, 그리고 베타-아사론 추출 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 베타-아사론(Beta-asarone) 화합물이 항신경염증 보호 활성을 가짐으로써 신경변성 질환에 저항성을 나타내어 이를 유효성분으로 함유하는 알츠하이머, 파킨슨병 및 다발성 경화증 등의 신경변성질환의 예방 및 치료용 조성물, 그리고 베타-아사론 추출 방법에 관한 것이다.

중추 신경계 내에서 파킨슨병, 알츠하이머병, 외상 손상, 중풍, 발작에 의한 뇌손상에 대하여 신경염증 반응이 원인으로 일어난다는 많은 연구가 보고 되고 있다. (Block ML 등, Nat Rev Neurosci. 8(1), 57-69, 2007; Nelson, PT. 등, Ann Med, 34, 491-500, 2002; Griffin, W.S. 등, J Neuroinflammation, 3, 5, 2006)

이때의 염증반응은 급성 뇌 손상의 특징으로서 뇌 조직에서 휴지기의 성상교세포의 활성화로 인하여 호중구, 단핵구, 탐식세포가 유입이 되며, 전염증성 사이토카인(cytokines) 및 접합분자 그리고 다른 염증 매개체들이 활성을 나타낸다. 신경염증은 주로 뇌의 20% 정도를 구성하고 있는 신경교세포의 활성화로 인한 매개로 발생한다.

소교세포의 활성은 보통 세 가지 경로의 신호 전달과정으로부터 야기 된다. 첫째는 염증효소인 inducible nitric oxide synthase (iNOS)와 cyclooxygenase-2 (COX-2) 둘째는 염증성 사이토카인으로 잘 알려진 tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), 그리고 마지막으로 전사 인자인 nuclear factor-κB(NF-κB)로 인하여 유도된다고 보고되어 있다.(Mc Geer 등, Neurology, 38, 1285-91, 1988; Minghetti, L. 등, Prog Neurobiol, 54, 99-125, 1998; Le, W. 등, J Neurosci, 21, 8447-55, 2001)

신경교세포에서의 염증유도는 LPS(lipopolysaccharide)에 의하여 아질산염(NO)의 생산이 수반되며, 아질산염(NO)의 증가는 뇌 손상 시 세포독성에 매우 중요하게 작용하는 병리학적 기전임이 많은 보고를 통하여 알려져 있다.(Chen 등, J Biol Chem, 273, 19424-30, 1998)

수검초(Acorus gramineus Soland)는 석창포, 석향포, 창포, 석장포라는 향명을 가지고 있으며 천남성과 창포속에 속하는 상록의 여러해살이 풀이다. 물가의 바위 위나 자갈밭에 군생하며 재배가 가능하다.

수검초는 노인성 치매, 진정효과, 소화촉진, 진통제, 이뇨제로 사용되어 왔으며 항진균 작용 또 한 가지고 있어 예로부터 널리 사용되어 온 것으로 알려져 있다. 수검초 추출물의 대표적인 활성 성분으로는 알파-아사론, 베타-아사론, 페닐프로펜 등이 있다고 보고되어 왔다.

그 중, 알파-아사론은 신경보호 효능(Manikandan S 등, Pharmacol Res. 52(6), 467-74, 2005; Limon ID등, Neurosci Lett. 453(2), 98-103, 2009), 기억력보호(Kumar H 등, Biosci Biotechnol Biochem, 76(8), 1518-22, 2012), 항경련 (Pages N 등, Neurosci Res, 68(4), 337-44, 2010), 과지방혈증(Garduno L 등, Journal of ethnopharmacology, 55(2), 161, 1997) 등과 같은 다양한 용도로 사용되어 왔다. 또한, 베타-아사론은 진통제, 방향제, 구풍제, 해열제 등으로 사용되어 왔다. (Chang S.M 등, 학문당, Chinese Medicine Plant, 318-319, 1996). 하지만 신경계 질환의 보호 및 신경염증 억제 등에 관해서는 연구가 미비한 실정이다.

예를 들어, 한국공개특허 제10-2009-0070419호 ‘항산화 유효성분이 있는 석창포 뿌리 추출물을 함유하는 발효유‘는 석창포의 항산화 효능에 주목하여 이를 발효유로서 이용하는 기술을 기재하고 있으나, 신경계 질환에 대한 보호 또는 신경염증 억제 등의 효능에 초점을 맞춘 기술이 아니었으며, 수검초와 관련한 다른 종래 기술의 경우에도 마찬가지였다.

이에 본 발명자들은 천연물을 이용한 신경변성질환 예방 및 치료용 조성물을 개발하기 위하여 노력해온 결과, 수검초를 이용하여 얻은 추출물로부터 분리한 베타-아사론을 이용하여 mouse BV2 microglia 세포에서 LPS에 의하여 유도된 염증 관련 인자들의 생산물, 유전자 및 단백질의 발현에 관련한 분자 생화학적 실험 분석법을 바탕으로 신경변성질환에 효능이 있음을 확인하고 본 발명을 성공적으로 완성하였다.

본 발명자들은, 신경염증을 조절하여 파킨슨병 또는 알츠하이머병과 같은 뇌질환 증상을 예방 및/또는 개선할 수 있는 유효물질을 꾸준히 연구한 결과, 단일 화합물인 베타-아사론을 유효성분으로 할 때 신경염증을 효과적으로 억제함을 확인하고 본 발명을 완성하였다. 따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 단일 화합물인 베타-아사론을 유효성분으로 함유하는 신경변성질환 예방 및 치료용 조성물과, 베타-아사론 추출 방법을 제공함에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 단일 화합물인 베타-아사론을 유효성분으로 함유하는 신경변성질환 예방 및 치료용 조성물과, 베타-아사론 추출 방법을 제공한다.

상기 베타-아사론의 추출을 위한 추출물은 수검초의 조추출물 또는 비극성용매 가용 추출물임을 특징으로 한다.

상기 조추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 80 내지 100% 에탄올에 가용한 추출물을 포함한다.

상기 비극성용매 가용추출물은 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 글리세린, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 또는 에테르로부터 선택된 용매, 바람직하게는 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트, 보다 바람직하게는 디클로로메탄에 가용한 추출물을 포함한다.

또한, 본 발명에서 상기 신경변성질환은 알츠하이머, 파킨슨병, 뇌졸중 및 다발성 경화증임을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 단일 화합물인 베타-아사론이 미세교세포의 활성을 억제하는 효능을 가짐을 이용하여 미세교세포를 매개로 하는 신경 염증을 예방하거나 치료할 수 있는 조성물과, 이러한 단일 화합물인 베타-아사론을 추출하는 방법을 제공하는 효과가 있다.

도 1은 수검초 추출물의 유효성분인 단일 화합물 베타-아사론을 LPS 24시간 처리 후 세포독성검사를 나타낸 그래프.
도 2는 LPS에 의해 유도되는 NO의 방출량, iNOS의 유전자 및 단백질 단계의 발현에 대해 단일 화합물인 베타-아사론에 의한 변화를 나타낸 그래프.
도 3은 LPS로 자극된 mouse BV2 microglia세포에서 단일 화합물인 베타-아사론의 COX-2 유전자 및 단백질의 발현저해를 나타낸 그래프.
도 4는 LPS로 자극된 mouse BV2 microglia세포에서 염증 매개 cytokine의 생산 시, 단일 화합물인 베타-아사론의 농도 의존적인 억제 효능을 나타낸 그래프.
도 5는 LPS로 자극된 BV-2 신경교세포에서 단일 화합물인 베타-아사론의 농도 의존적인 NF-κB 핵전사인자의 활성 억제 효능 결과와 IκB-α 분해 억제 및 인산화 억제 효능 결과를 나타낸 그래프.
도 6은 LPS로 자극된 mouse BV2 microglia세포에서 단일 화합물인 베타-아사론의 JNK의 억제를 매개로 한 농도 의존적인 효능 결과를 나타낸 그래프.

본 발명의 실시를 위한 구체적인 내용을 설명하기에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 발명자가 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 할 것이다.

또한, 본 발명에 관련된 공지 기능 및 그 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는, 그 구체적인 설명을 생략하였음에 유의해야 할 것이다.

이하, 본 발명에 따른 베타-아사론 추출 방법에 관해 상세히 설명한다.

먼저 본 발명의 단일 화합물인 베타-아사론은 수검초를 건조 및 세절하여 그 중량의 약 1 내지 10배 부피의, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 알코올을 첨가하여 초음파추출방법으로 추출한 후 여과하고, 여과한 추출물은 20 내지 100℃, 바람직하게는 30 내지 70℃에서 진공농축하여 본 발명의 베타-아사론을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 수검초 비극성용매 가용 추출물은 상기 절차에서 얻은 수검초 조추출물을 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 글리세린, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 또는 에테르로부터 선택된 용매, 바람직하게는 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트, 보다 바람직하게는 디클로로메탄을 가한 후 추출 분획하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 본 발명의 수검초 비극성용매 가용 추출물을 수득할 수 있다.

또한, 상기 수검초 비극성용매 가용 추출물을 전개용매로서 헥산: 에틸아세테이트의 100 : 1의 혼합용매를 사용하고, 고정상으로는 실리카겔 60(Silica gel 60, 70-230 mesh)을 사용하여, 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 18개의 하부 분획물로 나눈 후, 그 중 6, 7, 8번 분획물을 전개용매로서 헥산 : 디클로로메탄의 3:1의 혼합용매를 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 수행하여, 본 발명의 베타-아사론 화합물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기 제조방법으로 얻어지는 단일 화합물인 베타-아사론을 유효성분으로 함유하는 신경변성질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 단일 화합물인 베타-아사론은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다.

본 발명의 신경변성질환 예방 및 치료용 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 단일 화합물인 베타-아사론을 0.1 내지 50 중량부로 포함한다.

본 발명의 단일 화합물인 베타-아사론을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 베타-아사론의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 베타-아사론을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 베타-아사론은 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 베타-아사론은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 신경변성질환의 예방 및 개선 효과를 나타내는 상기 단일 화합물인 베타-아사론을 유효성분으로 포함하는 신경변성질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 건강기능식품은 베타-아사론 이외에 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있으며, 유효성분의 혼합양은 그의 사용목적, 예를 들면, 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강기능식품에 포함되는 베타-아사론의 유효량은 상기 약학 조성물의 유효량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안정성 면에서는 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

또한, 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예를 들면, 육류, 소시지, 빵, 쵸콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등을 들 수 있다.

또한, 신경변성질환의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 베타-아사론의 양은 전체 식품 중량의 0.01~30중량%, 바람직하게는 0.3~15중량%로 가할 수 있으며, 건강음료조성물은 100㎖를 기준으로 0.01~5g, 바람직하게는 0.03~1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 신경변성질환의 예방 및 개선을 위한 목적으로 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태인 건강기능식품으로 제조 및 가공이 가능하다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로 상기 베타-아사론을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 천연 탄수화물은 예를 들어, 포도당, 과당 등의 모노사카라이드; 말토오스, 수크로오스 등의 디사카라이드; 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 폴리사카라이드 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올 등이 있다. 또한, 향미제로는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물, 예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율을 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 베타-아사론은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 베타-아사론은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있으며, 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 상기 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 베타-아사론 100 중량부 당 0.1 내지 약 20중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시 예 1. 베타-아사론의 제조

본 발명에 따른 베타-아사론을 제조하기 위하여, 수검초로부터 하기와 같이 베타-아사론을 제조하였다.

1-1. 수검초 조추출물의 제조

본 발명에 따른 단일 화합물인 베타-아사론의 제조방법에서는 수검초 시료 30g~40g을 가속화용매추출기(ASE300, DIONEX Corporation, USA)로 GR급 에탄올 200ml을 첨가하여 추출한 후 여과하고, 여과한 추출물은 50℃에서 1500psi 압력으로 진공농축을 20분간 하여 수득하였다. 또한 당성분이 많은 뿌리 같은 경우 기기추출이 어려워서 수검초 시료 100g을 초음파분쇄기(Ultrasonic cleaner, BRANSON Ultrasonics corporation, USA)로 파쇄하여 GR급 에탄올 1L 첨가 후 50℃에서 3~7 일 진공농축하여 수득하였다.

1-2. 수검초 유기용매 가용 추출물의 제조

상기 실시 예 1-1에서 얻은 수검초 에탄올 가용 추출물 1kg을 물에 현탁시키고 디에틸에테르를 가하여 혼합한 후, 2 내지 3 차례 분획하여 수가용성 분획물 및 디에틸에테르 가용성 분획물을 얻은 후, 디에틸에테르 가용성 분획물을 건조하여 디에틸에테르 가용 추출물 30g을 수득하였다.

1-3. 베타-아사론의 분리

상기 실시 예 1-2의 디에틸에테르 가용 추출물 30g을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 수행하였으며, 이때 전기용매로서 헥산 : 에틸아세테이트의 100 : 1의 혼합용매를 사용하였고, 고정상으로는 실리카겔 60(Sillica gel 60, 70-230 mesh)을 사용하여 분획을 수행하여 18개의 하부 분획물로 나눈 후, 그 중 6, 7 및 8번 분획(Rh-6, 7, 8)을 전개용매로서 헥산 : 디클로로메탄의 3 : 1의 혼합용매를 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 베타-아사론 1.1g을 얻었다.

실험 예

실험 시약 ( Reagents )

LPS (E. coli 0111:B4), Tween-20, bovine serum albumin (BSA), dimethyl sulfoxide (DMSO), p-nitrophenyl phosphate, 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-iphenyltetrazolium bromide (MTT), pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC) (Sigma Chemical Co, USA). 6-well, 12well, 96wel tissue culture plate 100mm culture plate. (NUNC Inc, IL, USA)

세포 배양 배지로는 DMEM을 사용하였으며, 5% FBS와 항생제로서 100 units/㎖ penicillin/streptomycin을 사용하였다 (Gibco/Invitrogen, USA). 단백질 분해효소 저해제 및 인산화 분해효소 저해제로는 Roche (USA) 사의 제품을 사용하였고, 실험에 사용한 항체들은 COX-2, NF-κB p65, Nucleolin (Santa Cruz, CA), iNOS, IκB-α, phosphor(p)-IκB-α, p38, p-p38 및 β-actin (Cell signaling, Co, USA), LCN-2 (R&D Systems, USA)를 사용하였다. 효소 활성 분석을 위해서는 PGE2 (Cayman Chemical Co., USA)와 nitric oxide synthase (NOS) 2 그리고 inducible NOS (iNOS) (Uscn Life Science Inc., China)를 사용하였다.

세포 배양 ( Cell culture )

불활성화 상태의 5% FBS와 100units/㎖ 1% penicillin/streptomycin을 첨가한 DMEM에서 습도가 유지되는 5% CO2, 95% O2 incubator에서 배양하였다.

모든 실험에서 세포의 수는 5 X 105cell/㎖을 사용하였다. LPS는 microglia BV-2 cell line에서 100ng/㎖로 각각 처리하였고, 베타-아사론은 배지에 희석하여 microglia BV-2 cell line에 10, 50, 그리고 100 농도로 1시간 전처리하였다.

베타-아사론의 세포 독성 검사는 MTT assay를 이용할 수 있으며, 구체적으로, NO assay를 수행한 후, microplate에 있는 세포에 0.5 mg/㎖ 농도의 MTT를 30㎕ 투입하고, incubator에서 2시간 반응시켜 DMSO 100㎕로 formazan crystals을 녹여 파장이 540 nm인 Vmax microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

실험 예 1 - Cell culture 및 세포독성검사( MTT assay )

MTT assay를 통해 천마 에탄올 추출물의 세포 독성 검사를 수행할 수 있다.

구체적으로, microplate 상의 세포에 0.5 mg/㎖ 농도의 MTT 30 ㎕을 투입한 후, incubator에서 2시간 반응시키고 DMSO 100 ㎕을 이용하여 formazan crystals을 녹인 후, 파장이 540 nm인 Vmax microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

실험 예 2 - Assay of NO

Assay of NO는 NO(nitric oxide)의 생산량을 정량적으로 측정하는 방법으로서 microplate(96well) assay 방법이다.

마이크로플레이트(microplate)에 세포 5 x 104 cell/well을 배양한 후, LPS와 천궁 추출물이 농도 차이를 가지도록 첨가하였으며, 24h 인큐베이터(incubator)에서 반응시키고, 그 중 상층액을 각각 50㎕씩 Griess reagent (1% sulfanilamide/0.1% N-(1-naphthyl)- ethylenediamine dihydrochloride/2.5% H3PO4)와 반응시켰으며, 파장이 550 nm인 Vmax 96-well microplate spectrophotometer를 사용하여 값을 측정하였다.

실험 예 3 - Isolation of total RNA and RT - PCR

Microglia BV-2 cell line의 전체 RNA 동정을 Trizol reagent(invitrogen, CA, USA)를 이용하여 제조 회사가 제시한 사용법에 따라 분리하였다.

microglia BV-2 cell line에 TRizol reagent 1 ㎖를 투입하고 chloroform 200 ㎕을 투입한 후 교반하였고 실온에서 5분 동안 반응시킨 후 원심분리(4℃, 10,000rpm, 10분)하였으며, 그 중 상층액 500 ㎕를 새로운 튜브로 이동시켰다.

동일한 양의 isopropanol 500 ㎕을 투입하고 실온에서 10분 동안 반응시킨 후 원심분리(4℃, 14000rpm, 15분)하였으며, 상층액을 제거하고 75% EtOH을 이용하여 2회 세척한 후 pellet을 건조하고 DEPC-water를 이용하여 용해하였다.

DNase(Roche AC, USA)을 1 : 10의 비율로 희석하여 2 ㎕를 투입하고 25℃에서 15분 동안 반응시킨 후 22 ㎕의 시료에 78 ㎕의 DEPC-water를 투입함으로써 100 ㎕의 시료를 제조하였다.

TRizol reagent 100 ㎕을 투입하고 교반한 후 chloroform 25 ㎕를 투입하고 교반하였으며, 상온에서 5분 동안 반응시키고 원심분리(4℃, 14000rpm, 15분)하였다.

그 중 상층액에서 약 140 ㎕를 새로운 튜브로 이동시키고 isopropanol과 10분 동안 반응시킨 후 원심분리(4℃, 14000rpm, 15분)하였으며, 다시 상층액을 제거하고 75% EtOH을 이용하여 2회 세척한 후 pellet을 건조하고, DEPC-water를 이용하여 용해하였다.

RT(reverse transcription) PCR을 위해 시료의 농도를 1 ㎍/㎕로 하고 SuperScript Ⅲ(invitrogen CA, USA)의 cDNA 합성법에 따라 cDNA를 합성한 후, 각 PCR 반응은 cDNA 1 ㎕(0.5㎍/㎕)을 사용하여 수행하였다.

반응 조성으로는 2 X dyemix DNA polymerase(enzynomics CA)를 사용하였으며, template 1 ㎕, 2 X dyemix 10 ㎕, primer-F 1 ㎕, primer-R 1 ㎕, 증류수 7 ㎕를 95℃ 2분, 95℃ 30초 - 58℃ 1분 - 72℃ 1분 25회 반복, 72℃ 5분, 4℃ 보관이라는 반응 조건 하에서 총 20㎕를 반응시켰다.

본 실험 예에서 사용한 primer들과 그 염기서열, genebank accession number 및 실험 조건들은 다음의 [표 1]에 명시한 바와 같다.

Abbreviations: iNOS, inducible nitric oxide synthase; COX-1, cyclooxygenase -1; COX-2, cyclooxygenase-2; IL-1β, interleukin-1β; IL-6, interleukin-6; TNF-α, tissue necrosis factor-alpha; GAPDH, glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase.

실험 예 4 - Western blot analysis

Microglia BV-2 cell에서 단백질의 동정을 위해서는, 세포를 1 X PBS로 2회 세척한 후, lysis buffer[1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% NaN3]을 이용하였다.

단백질의 정량을 위해서는 DC protein assay(bio-rad CA)의 bradford 방법을 사용하였고, 동일한 양의 단백질을 10 % SDS-PAGE에 전기영동한 후, 0.45 ㎛ polyvinylidene fluoride(PVDF: Millipore)를 사용하여 겔에서 membrane에 이동시켰다.

항체에 관해서는, 1차 항체로서 anti-β-actin(1:2000; Cell Signaling), anti-iNOS, anti-COX-1, anti-COX-2, anti-IκB-α, anti-phospho-IκB-α, anti-JNK, anti-phospho-JNK(1:1000; Cell Signaling), anti-p65(1:1000; Santa Cruz), anti-nucleolin(1:500; Santa Cruz)으로 희석하여 4℃에서 O/N(over-night)하고 2차 항체로서 Horseradish peroxidase(HRP)를 가지고 있는 항체를 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후, ECL kit(pierce, CA)로 반응시키고, LAS-3000(Fuji Co, Japan)을 사용하여 결과를 확인하였다.

실험 예 5 - Immunofluorescence assay

Microglia BV-2 cell에서 NF-κB p65의 이동을 측정하기 위하여 (5×104cells/well in 24-wellplate) 커버슬립 상에서 24시간 동안 배양하였다.

배양 물질을 1시간 동안 전처리한 후, LPS 처리 30분 경과 시 상층액 제거 후 메탄올 250 ㎕를 첨가하고 -20℃에서 20분 동안 고정하며 PBS(in 0.02% Tween)로 세척한 후 1 μM Hoechst로 세포핵을 염색하였으며, 안티바디를 침투하기 위하여 1% Triton으로 10분 동안 처리하여 세포막을 관통하였다.

1차 항체로는 1 mg/㎖ of monoclonal mouse anti-human NF-κB (p65) (Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, CA)로 60분 동안 실온에서 처리하였다.

2차 항체로는 1 : 100의 비율로 희석한 Alexa Fluor 568-labeled goat anti-mouse antibody (Invitrogen, CA)를 60분 동안 실온에서 처리하였다.

박제를 위하여 mounting solution으로 커버글라스에 고정하였으며, 박제 후 형광 염색된 cells을 관측하기 위하여 암실에서 형광 현미경을 이용하여 관측함으로써 결과를 확인하였다.

실험 결과

1. Microglia BV -2 cells 에서 LPS 의 세포 독성 검사

LPS로 자극된 Microglia BV-2 cell에서 LPS 및 단일 화합물인 베타-아사론이 세포 생존에 미치는 영향을 확인하였다. 세포 독성 검사는 MTT assay를 수행하였으며, 그 결과 도 1에서 보는바와 같이, MTT 측정 결과 LPS 및 단일 화합물인 베타-아사론 단독으로 또는 같이 처리한 모든 실험군에서 대조군에 비하여 세포 생존율이 변하지 않음을 확인 할 수 있었다. 이는 신경염증 유도 물질인 LPS와 단일 화합물인 베타-아사론이 세포 생존에는 영향을 주지 않음을 알 수 있다.

2. LPS 로 자극된 Microglia BV -2 cells 에서 단일 화합물인 베타-아사론의 농도 의존적인 NO 방출, iNOS 유전자 및 단백질의 발현저해 작용

단일 화합물인 베타-아사론의 항염증 효능을 분석하기 위하여 동일한 신경염증 유발 인자인 LPS(100ng/㎖)로 자극된 Microglia BV-2 cells에서 생산되는 아질산염(NO)의 농도 의존적으로 저해효능을 보이는지 확인하였다.

아질산염(NO)의 측정은 Griess 시약을 이용한 NO assay를 사용하였으며, 그 결과 BV2 세포에서 LPS에 의해서 유도되는 아질산염(NO)은 33.2 ± 0.37 μM로 대조군으로 사용한 0.83 ± 0.03 mM에 비하여 약 40배의 증가를 보였으며, 실험군으로 단일 화합물인 베타-아사론을 농도별로 처리를 한 결과 도 2a와 같이 각각 28.86 ± 0.47μM, 23.58 ± 0.40μM, 12.02 ± 0.43μM로 아질산염(NO)의 량이 줄어드는 것이 확인되었다.

또한, 아질산염(NO)의 합성 유도 효소인 iNOS의 유전자 및 단백질 단계에서의 단일 화합물인 베타-아사론이 농도 의존적으로 발현을 저해하는 것을 확인할 수 있었다(도 2b).

iNOS 유전자의 발현 양상을 BV2에 LPS 및 단일 화합물인 베타-아사론을 농도별로 처리하고 6시간 배양한 후, RNA를 동정하여 RT-PCR을 시행하여 유전자의 발현 양상을 정량적인 방법을 통하여 분석하였다.

그 결과, 도 2c에서와 같이 LPS를 처리하지 않은 대조군에서는 iNOS 유전자의 발현량이 거의 없음을 확인할 수 있었다. LPS를 처리한 실험군에서는 iNOS 유전자의 발현량이 확연히 증가하였고, 단일 화합물인 베타-아사론의 농도 의존적으로 감소하는 발현변화 양상을 확인할 수 있었다.

또한, iNOS 단백질의 발현 양상을 분석하기 위하여 iNOS 유전자의 분석과정과 같은 농도의 LPS 및 단일 화합물인 베타-아사론을 처리하였으며, 동일한 배양시간 후, 단백질을 동정하여 Western blot을 시행하여 iNOS 단백질의 발현 변화를 정량적으로 분석하였다.

그 결과, 도 2d에서 보는 바와 같이 LPS를 처리하지 않은 대조군에서는 iNOS 단백질 발현량이 거의 없음을 확인할 수 있었다. LPS를 처리한 실험군에서는 iNOS 단백질의 발현량이 확연히 증가하였고, 단일 화합물인 베타-아사론의 농도 의존적으로 감소하는 발현변화 양상을 확인할 수 있었다.

3. LPS 로 자극된 Microglia BV -2 cells 에서 단일 화합물인 베타-아사론의 COX-2 유전자 및 단백질의 발현저해

염증생성에 관여하는 효소인 COX-2(cyclooxygenase type 2)의 유전자 및 단백질의 발현양상의 변화를 알아보기 위하여, BV-2 cell에 LPS 및 단일 화합물인 베타-아사론을 농도별로 처리하고 시간별로 배양하였다. 6시간 후 RNA를 동정하여 RT-PCR을 시행하여 유전자의 발현 양상을 정량적인 방법을 통하여 분석하여 COX-2 유전자의 발현 양상의 변화를 확인하였다.

그 결과, 도 3a에서 보는 바와 같이, 단일 화합물인 베타-아사론을 농도별로(10, 50, 100 ㎍/㎖) 처리한 발현양은 LPS를 처리한 대조군과 비교해 77.52% ± 9.42, 61.50% ± 3.49 및 38.91% ± 8.98로 LPS만 처리한 군에 비하여 농도 의존적으로 COX-2 유전자의 발현양을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 18시간 후 단백질을 동정하여 Western blot 을 시행하여 COX-2 단백질의 발현 양상을 확인하였다.

그 결과, 도 3b에서 보는 바와 같이 LPS만 처리한 군과 비교했을 때, 단일 화합물인 베타-아사론을 농도별로(10, 50, 100 ㎍/㎖) 처리한 발현양은 80.45% ± 7.29, 69.10% ± 3.68 및 57.15% ± 4.49로 LPS만 처리한 군에 비하여 농도 의존적으로 COX-2 단백질의 발현양을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.

4. LPS 로 자극된 Microglia BV -2 cells 에서 염증 매게 사이토카인의 생산 시, 단일 화합물인 베타-아사론의 농도 의존적인 억제 효능

염증 매개 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6 유전자의 발현 양상의 변화를 도출하기 위하여 염증 매게 사이토카인 유전자의 발현 양상을 BV2 cell에 LPS 및 단일 화합물인 베타-아사론을 농도별로 처리하고 6시간 배양한 후, RNA를 동정하여 RT-PCR을 시행하고, 유전자의 발현 양상을 정량적인 방법을 통하여 분석하여 세 가지 유전자에서 공통적인 발현 변화를 확인할 수 있었다.

그 결과 도 4에서 보는 바와 같이, LPS를 처리하지 않은 대조군에서는 TNF-α, IL-1β, IL-6 유전자의 발현량이 거의 없었으며, LPS(100ng/㎖)를 처리한 실험군에서는 대조군에 비하여 단일 화합물인 베타-아사론 처리 시, 농도 의존적으로 감소(TNF-α; 77.13% ± 0.45, 51.76% ± 4.03 and 26.45% ± 0.05, IL-1β; 84.41% ± 11.8, 34.04% ± 4.66 and 23.92% ± 0.55, IL-6; 117.13% ± 6.88, 91.15% ± 1.25 and 43.56% ± 7.69)하는 발현 변화 양상을 확인하였다. GAPDH는 유전자 정량 분석의 대조군으로 사용하였다.

5. LPS 로 자극된 BV -2 신경교세포에서 단일 화합물인 베타-아사론의 NF -κB 핵전사인자의 활성 억제 효능 결과

단일 화합물인 베타-아사론의 효능 분석을 위하여 LPS에 의한 염증 유도 시 전염증성 cytokine들을 발현시키는 전사인자인 NF-κB의 활성화에 미치는 영향을 확인하였는데, NF-κB를 구성하는 p65의 핵질에서 핵 안으로의 유입을 면역형광 염색법을 통하여 확인하였고, 핵단백질을 동정하여, 핵 내에서의 NF-κB p65의 발현을 Western blot을 통하여 확인하였다.

Microglia BV-2 cells에 LPS (100ng/㎖) 및 단일 화합물인 베타-아사론을 5 농도로 처리하고 30분간 배양한 후, 면역형광법을 통하여 NF-κB를 구성하는 p65 단백질이 핵질에서 핵 내로 유입되는 정도를 확인하였다 (도 5A). 아무것도 처리하지 않는 경우에는 단백질 p65가 핵질에 많이 내재되어 있는 사실을 확인하였으며, LPS 처리 시 단백질 p65가 핵 안으로 많이 유입된 사실을 확인하였고, 단일 화합물인 베타-아사론을 처리하면 단백질 p65의 핵 안으로의 유입을 방지하는 사실을 확인하였다.

도 5B는 면역형광법으로 확인한 사실을 보다 정확히 확인하기 위하여 핵단백질을 동정하여 Western blot을 통해 핵단백질의 발현 양상을 정량적으로 확인한 결과이다. LPS를 처리하지 않은 대조군에서는 NF-κB p65의 발현이 거의 없었지만, LPS를 처리한 실험군에서는 NF-κB p65의 발현이 증가하였고, 단일 화합물인 베타-아사론를 처리하면, 그 발현 정도가 감소하는 사실을 확인하였다. Nucleolin은 핵단백질의 정량 확인을 위한 대조 단백질이다.

도 5A 및 도 5B는 LPS로 자극된 Microglia BV-2 cells에서 NF-κB 활성에 따른 GLA의 농도 의존적인 저해 효능을 나타낸 것이다.

도 5A는 Microglia BV-2 cells를 24well plate에 5 X 104cell/well이 되도록 한 후, 24시간 배양하고, 단일 화합물인 베타-아사론을 농도별로 1시간 전처리하며, LPS (100ng/㎖)로 세포를 자극하고 30분 후, 상층액을 제거하고 면역형광법으로 관측한 결과이다.

도 5B는 Microglia BV-2 cells를 6well plate에 1 X 106cell/㎖이 되도록 한 후, 24시간 배양하고, 단일 화합물인 베타-아사론을 농도별로 1시간 전처리하며, LPS (100ng/㎖)로 세포를 자극하고 30분 후, 세포 상층액을 제거하고, 세포에서 핵단백질만을 따로 동정하며, mouse 단일클론성 항체인 NF-κB p65를 사용하여, Western blot을 통해 분석한 결과이다.

6. LPS 로 자극된 Microglia BV -2 cells 에서 단일 화합물인 베타-아사론의 JNK의 억제를 매개로 한 농도 의존적인 효능 결과

LPS 처리를 통하여 염증 반응이 대표적으로 MAPKs(Mitogen-activated protein kinase) pathway를 통하여 발현이 진행된다는 사실은 다수 논문을 통해 보고된바 있으며, 본 발명자들은 단일 화합물인 베타-아사론이 MAPK 경로를 통하여 염증 반응을 억제하는지 여부를 확인하였다.

그 결과 도 6a를 참조하면, MAPKs의 구성요소중 하나인 JNK에서 LPS를 처리하지 않은 대조군에서는 p-JNK 단백질 발현량이 거의 없었다. LPS(100ng/㎖)를 처리한 실험군에서는 대조군에 비하여 단일 화합물인 베타-아사론에 농도 의존적 (10, 50, 100 ㎍/㎖)으로 인산화되는 양이 LPS를 처리한 대조군과 비교해 75.68% ± 5.02, 46.22% ± 1.71 및 30.11% ± 6.14로 농도 의존적으로 감소하는 양상을 확인하였다.

도 6a에 나타낸 결과 확인을 위해, Microglia BV-2 cells를 6 well plate에 1 X 106cell/㎖이 되도록 하고 4시간 배양하며, 천궁 추출물을 농도별로 1시간 전처리하였다. 그리고 LPS(100ng/㎖)로 세포를 자극하고 30분 후, 세포 상층액을 제거하여 단백질을 동정하였다. 그리고 LPS　다클론 항체인 JNK, p-JNK를 사용하여, Western blot을 통해 분석하였다.

Claims (7)

1. 조추출물 또는 비극성용매 가용 추출물이며 단일 화합물인 베타-아사론을 유효성분으로 함유하는 신경변성질환 예방 및 치료용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 조추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매에 가용한 추출물을 포함함을 특징으로 하는 신경변성질환 예방 및 치료용 조성물.
   
3. 제 1항에 있어서,
   상기 비극성용매 가용 추출물은 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 글리세린, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 또는 에테르로부터 선택된 용매에 가용한 추출물을 포함함을 특징으로 하는 신경변성질환 예방 및 치료용 조성물.
   
4. 베타-아사론 추출 방법에 있어서,
   (A) 수검초를 건조하는 단계;
   (B) 건조한 수검초에 그 중량의 1 내지 5배 부피의 알코올을 첨가하는 단계;
   (C) 알코올을 첨가한 수검초를 초음파 추출 방법으로 추출한 후 여과하는 단계;
   (D) 여과한 추출물을 30℃ 내지 70℃에서 진공농축하는 단계;
   (E) 진공농축한 추출물에 비극성용매를 가한 후 추출 분획하는 단계;
   (F) 추출 분획한 추출물에 1차 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 수검초 비극성용매 가용 추출물을 수득하는 단계;
   (G) 수검초 비극성용매 가용 추출물을 전개용매로서 사용하는 2차 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 다수의 하부 분획물을 수득하는 단계; 및
   (H) 일부 하부 분획물을 전개용매로서 사용하는 3차 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 베타-아사론을 수득하는 단계;를 포함하는 베타-아사론 추출 방법.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 (E) 단계의 비극성용매는 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 글리세린, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 또는 에테르로부터 선택된 용매인 것을 특징으로 하는 베타-아사론 추출 방법.
   
6. 제4항에 있어서,
   상기 (G) 단계의 2차 실리카겔 칼럼 크로마토그래피는, 헥산 : 에틸아세테이트의 100 : 1 혼합용매를 사용하며, 고정상으로 실리카겔 60을 사용하는 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 베타-아사론 추출 방법.
   
7. 제4항에 있어서,
   상기 (H) 단계의 3차 실리카겔 칼럼 크로마토그래피는, 헥산 : 디클로로메탄의 3:1 혼합용매를 사용하는 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 베타-아사론 추출 방법.
   

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