KR20150047275A - Pharmaceutical composition comprising the organic solvent fraction yielded from hot water extraction of laminaria japonica as an effective component for prevention or treatment of thrombosis and health functional food comprising the same - Google Patents

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Abstract

In the present invention, provided are a pharmaceutical composition and healthy food product for preventing or treating thrombosis including an organic solvent fraction obtained from extracts of Laminaria japonica which is brown algae and extracted by using hot water as an active ingredient and, more specifically, a pharmaceutical composition and healthy food product for preventing or treating thrombosis including at least one fraction among hexene fraction, ethyl acetate fraction and butanol fraction as an active ingredient wherein the organic solvent fraction has good heat stability and prevents damage of blood coagulation, thereby being processed in various forms.

Description

다시마의 열수 추출물로부터 얻어진 유기용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품{PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE ORGANIC SOLVENT FRACTION YIELDED FROM HOT WATER EXTRACTION OF LAMINARIA JAPONICA AS AN EFFECTIVE COMPONENT FOR PREVENTION OR TREATMENT OF THROMBOSIS AND HEALTH FUNCTIONAL FOOD COMPRISING THE SAME}TECHNICAL FIELD [0001] The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating thrombosis, which contains an organic solvent fraction obtained from hot water extract of sea tangle, as an active ingredient, and a health functional food. TREATMENT OF THROMBOSIS AND HEALTH FUNCTIONAL FOOD COMPRISING THE SAME}

본 발명은 갈조류인 다시마(Laminaria japonica)의 열수 추출물로부터 얻어진 유기용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증(thrombosis)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 다시마의 열수 추출물로부터 순차적으로 분획된 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물 중 1종 이상의 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing brown algae ( Laminaria The present invention relates to a pharmaceutical composition and a health functional food for the prevention or treatment of thrombosis comprising an organic solvent fraction obtained from a hot water extract of kelp japonica as an active ingredient and more specifically to a pharmaceutical composition and a health functional food, A pharmaceutical composition for the prevention or treatment of thrombosis, which contains one or more fractions of hexane fraction, ethyl acetate fraction and butanol fraction as active ingredients, and a health functional food.

인체 구성성분으로 혈액은 산소, 영양분, 노폐물의 운반 기능과 완충작용, 체온유지, 삼투압 조절 및 이온 평형유지, 수분 일정유지, 액성 조절작용, 혈압의 유지 및 조절, 생체방어 등 다양한 중요 기능들을 가지고 있다. 따라서, 혈액 및 혈액 순환은 인간의 생존에 필수사항이며, 혈관의 손상시에는 재빨리 혈전을 생성하여 혈액손실을 방지해야 한다. 그러나, 혈관 내의 과다한 혈전 생성은 혈액 순환을 방해하며, 심한 경우 혈관을 막아 심혈관계 및 뇌 조직의 심각한 손상을 나타내어 혈전증(thrombosis)을 야기한다. 이러한 혈전증은 1) 혈관내피세포의 이상, 2) 혈액응고인자(XII 인자, XI 인자, IX 인자, X 인자 등) 및 혈액응고효소(트롬빈, 프로트롬빈 효소)의 과다한 응고 활성, 3) 혈소판 응집 및 4) 생성된 혈전의 용해 시스템의 비정상적 작용이 그 원인으로 알려져 있으며, 이러한 원인들은 개별적 또는 복합적으로 작용하여 혈관 내 과도한 혈전생성을 야기한다. 혈전성 질환의 예방과 치료를 위해, 현재 1) 혈액응고인자의 활성을 저해하여 혈전 생성을 억제하는 헤파린, 쿠마린 등의 다양한 항응고제, 2) 혈소판 응집을 저해하여 혈전 생성을 억제하는 아스피린과 같은 항혈소판제, 3) 이미 생성된 혈전을 녹여 혈전생성을 억제하는 유로키네이즈와 같은 혈전용해제 등이 사용되고 있다. 그러나, 이들은 가격이 매우 높을 뿐 아니라 출혈성 부작용과 위장장해 및 과민반응 등으로 그 사용이 한정되고 있는 실정이다. As a constituent of human body, blood has various important functions such as oxygen and nutrients, the function and buffering function of waste products, maintenance of body temperature, control of osmotic pressure and maintenance of ion balance, maintenance of moisture, regulation of fluidity, maintenance and regulation of blood pressure, have. Therefore, blood and blood circulation are essential for the survival of human beings. In case of damage of blood vessels, blood clots should be rapidly generated to prevent blood loss. However, excessive blood clot formation in the blood vessels interferes with blood circulation, and in severe cases, blood vessels are blocked to cause serious damage to cardiovascular system and brain tissue, resulting in thrombosis. Such thrombosis is caused by the following: 1) abnormal vascular endothelial cells, 2) excessive coagulation activity of blood coagulation factors (XII factor, XI factor, IX factor, X factor etc.) and blood coagulation enzyme (thrombin, prothrombin enzyme) 4) The abnormal function of the thrombus dissolution system is known to be responsible for these causes. These causes are caused individually or in combination, resulting in excessive blood clot formation in the blood vessels. For the prevention and treatment of thrombotic diseases, currently 1) various anticoagulants such as heparin and coumarin which inhibit the activity of blood coagulation factors to inhibit thrombogenesis, 2) anti-platelet aggregation inhibitors such as aspirin Thrombocytopenia, and 3) a thrombolytic agent such as europaea, which inhibits thrombus formation by dissolving already generated thrombus. However, they are not only very expensive, but also have limited use due to hemorrhagic side effects, gastrointestinal disorders, and hypersensitivity reactions.

한편, 다시마(Laminaria japonica)는 갈조식물군의 다시마과 해조류로, 수분 91%, 단백질 1.1%, 지방 0.2%, 탄수화물 4.2% 및 회분 3.5%를 함유하고, 12 kcal/100g의 낮은 칼로리를 나타내면서, 풍부한 식이섬유 및 미네랄을 가지고 있어, 삼면이 바다인 우리나라에서는 귀중한 식용 해산물로 이용되고 있다. 최근에는 다시마를 이용한 다시마분말 첨가 케이크(임은정 등, 2012, 한국식품영양학회지, 25: 922-929), 다시마 과립차(권유리 등, 2012. 한국식품저장유통학회지, 19: 525-531), 다시마 샐러드 드레싱(정현아 등, 2011, 한국식품영양학회지, 24: 520-527), 다시마 햄버거 패티(오현경 외, 2011, 한국식품영양학회지, 31: 570-579), 다시마 기능성 음용수(장연정 외, 2010, 한국산학기술학회 추계학술발표논문집, 729-732) 등 여러 가공식품 개발이 활발히 연구되고 있다On the other hand, kelp (Laminaria japonica ) is a seaweed and algae of algae. It contains 91% of moisture, 1.1% of protein, 0.2% of fat, 4.2% of carbohydrate and 3.5% of ash and has a low calorie of 12 kcal / It is used as a valuable edible seafood in Korea, which has sea on three sides. In recent years, kelp-added cakes with kelp powder (Kim Eunjung et al., 2012, The Korean Journal of Food Science and Nutrition, 25: 922-929), kelp granulosa (Kwon Yulryi et al., 2012. Korean Journal of Food Preservation, 19: 525-531) (Korean Journal of Food Science and Nutrition, 24: 520-527), kelp hamburger patty (Oh Hyun Kyung et al, 2011, The Korean Journal of Food Science and Nutrition, 31: 570-579) The development of various processed foods such as the Korean Society of Industrial and Technology Technology Fall Conference, 729-732) has been actively studied

한방에서는 다시마를 곤포라 하여 고혈압, 동맥경화, 갑상선종, 신장염과 노화 예방에 좋은 약재로 사용하고 있다. 다시마의 알려진 성분으로는 알린, 라미라닌, 알긴산, 후코이단 및 요오드 등의 다양한 미네랄 성분들이 있으며, 유용 생리활성으로는 항염증 활성(엄성환 등, 2010, 한국수산과학회지, 43: 117-124), 항산화 활성(김소정 외, 2013, 한국산학기술학회논문집, 14: 3081-3088), 항당뇨 활성(한지숙 외, 2007, 한국식품영양과학회지 36: 1391-1398), 혈당강하 및 혈중 콜레스테롤 저하효과(황혜진 외, 2010, 생명과학회지, 20: 895-810) 등이 보고되어 있다. 또한, 다시마에는 라미닌(laminine)이라는 혈압강화 작용의 저분자 질소 화합물이 알려져 있으며, 고분자 다당류의 일종인 알긴산은 혈청 콜레스테롤 저하 및 유해 금속 배출 등의 기능의 보고되어 있다(권유리 등, 2012. 한국식품저장유통학회지, 19: 525-531). 최근에는 다시마의 후코이단과 같은 황산기 결합 다당류에서 암세포 사멸촉진(Makarenkova 등, 2012. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol. 6: 68-75) 및 고지혈증 예방 효과(Huang 등, 2010. Pharm Biol. 48: 422-426) 등의 유용 생리활성이 보고되고 있다. 한편, 다시마 분말을 5% 농도로 식이로 공급한 마우스의 경우 혈소판 응집에는 유의적인 변화가 나타나지 않은 것으로 보고(강민숙 외, 2001, 한국영양학회지, 34: 141-149)된 바 있으나, 다시마의 수용성 황산다당류인 후코이단(Fucoidan)은 강력한 항혈전 활성을 나타냄이 보고(Zhao 등, 2012. Thrombosis Research. 129: 771-778)되어 있다. 현재까지 후코이단의 항혈전 기작은 혈액응고효소(트롬빈, 프로트롬빈)의 저해 및 혈액응고인자 저해 활성과 혈소판 응집저해가 모두 관련된 것으로 알려져 있다(Zhu 등, 2010, Thrombosis Research. 125: 419-426). 또한, 후코이단 이외의 황산기가 결합된 기타 수용성 다당류들의 항혈전 활성도 보고(Yoon 등, 2007, Carbohydrate Research. 342: 2326-2330)된 바 있다. 그러나, 다시마에서 후코이단과 같은 복합다당류 형태의 물질이 아닌 유기용매에 녹는 지용성 물질의 항혈전 활성은 현재까지 보고된 바 없다. In one room, kelp is used as a medicine for preventing hypertension, arteriosclerosis, goiter, nephritis and aging. The known components of kelp include various minerals such as algin, lamiranin, alginic acid, fucoidan and iodine. The useful physiological activities include antioxidant activity (Um, Sung Hwan et al., 2010, Journal of the Korean Fisheries Society, 43: 117-124) The effect of diabetes on blood glucose and blood cholesterol (Hwang, Hye-Jin (2007), Korean Journal of Food Science and Nutrition 36: 1391-1398) , 2010, Journal of Life Science, 20: 895-810). In addition, low-molecular nitrogen compounds of blood pressure-enhancing action called laminin are known in seaweed, and alginic acid, which is a kind of polymer polysaccharide, has been reported to have functions such as lowering of serum cholesterol and release of harmful metal (Kwon, Journal of Distribution, 19: 525-531). In recent years, it has been shown that fucoidan-like sulfate-like polysaccharides promote cancer cell death (Makarenkova et al., 2012. Zhik Mikrobiol Epidemiol Immunobiol. 6: 68-75) and hyperlipemia prevention effect (Huang et al., 2010. Pharm Biol. 48: 422-426) Have been reported. On the other hand, in the case of mice fed with 5% concentration of kelp powder, the platelet aggregation did not show any significant change (Kangmin Sook et al., 2001, Korean Nutrition Society, 34: 141-149) Fucoidan, a polysaccharide sulfate, exhibits strong antithrombotic activity (Zhao et al., 2012. Thrombosis Research. 129: 771-778). To date, it has been known that the anticoagulant mechanism of Fucoidan is related to inhibition of blood coagulation enzymes (thrombin, prothrombin) and inhibition of blood coagulation factors and inhibition of platelet aggregation (Zhu et al. 2010, Thrombosis Research. 125: 419-426). In addition, other anti-thrombotic activities of other water-soluble polysaccharides bound to sulfate groups other than fucoidan have been reported (Yoon et al., 2007, Carbohydrate Research. 342: 2326-2330). However, the antithrombotic activity of a lipophilic substance which dissolves in an organic solvent rather than a complex polysaccharide type substance such as fucoidan in sea tangle has not been reported to date.

현재까지 다시마와 관련된 특허는 다시마를 이용한 소스 제조(대한민국 등록특허 10-1310538호, 어간장 및 이의 제조방법), 피부개선용 조성물(대한민국 공개특허 10-2013-0076723호 피부개선용 조성물), 배변촉진용 환(대한민국 등록특허 10-1249872호, 다시마를 포함하는 천연재료에 의한 배변촉진용 환의 제조방법), 탈모방지 효능을 가진 음료(대한민국 등록특허 10-1266729호 탈모방지음료), 비만치료 약학조성물(대한민국 등록번호 10-1293032호, 다시마 및 부티르산 나트륨을 유효성분으로 함유하는 비만치료 또는 예방용 약학조성물) 등 다양한 특허가 등록 및 공개되어 있으나, 혈전증과 관련된 특허는 매우 제한되어 있다. 혈전증과 관련된 특허로는, 최근 다시마 또는 미역의 알긴산을 분해하여 이미 생성된 혈전을 분해하는 효능이 있는 알긴 올리고당 제조방법이 특허등록(대한민국 특허 10-0538553호, 김치나 젓갈의 유산균을 이용한 알긴올리고당 제조방법, 그 방법으로 제조된 알긴올리고당, 상기 알긴올리고당을 포함하는 바디화장품 및 음용캡슐)된 바 있고, 대한민국 등록특허 10-0337005호[콜레스테롤 및 혈전 저하기능이 강화된 생식타입의 차 조성물]에서는 다양한 곡식류, 해조류, 버섯류 분말에 홍국 및 나토키나제를 첨가하여 콜레스테롤 및 혈전저하 기능을 나타내는 차 조성물에 대해 개시하고 있으나, 다시마의 항혈전 효과에 대해서는 구체적으로 언급하고 있지 않으며, 대한민국 등록특허 10-0345040호[홍삼복합물을 함유한 혈액순환 개선제 및 그 제조방법]는 홍삼에 다시마, 영지, 육계피, 감초 등을 물로 추출한 후 이들 엑기스를 혼합한 홍삼 복합물을 함유한 혈액순환 개선제 및 그 제조방법을 개시한 것으로, 주요 혈액순환 개선효과는 홍삼을 비롯한 한약재에서 유래되는 것으로 알려져 있어, 다시마의 직접적인 항혈전 활성에 대해 보고된 것은 아니다. 따라서, 현재까지 다시마의 지용성 물질에 의한 항혈전 활성 관련 특허는 없으며, 특히, 혈전 생성억제 효과와 관련되어서는 수용성 다당류인 후코이단을 제외하면 알려진 바 없다.Until now, the patent related to kelp has been applied to the manufacture of sauce using kelp (Korean Patent No. 10-1310538, eel gum and its preparation method), composition for skin improvement (Korea Patent Application No. 10-2013-0076723) (Korean Patent No. 10-1249872, a method of manufacturing a pellet for accelerating bowel movement by natural materials including kelp), a beverage with a hair loss prevention effect (Korea Patent No. 10-1266729), an obesity therapeutic pharmaceutical composition (Korean Registration No. 10-1293032, a pharmaceutical composition for treatment or prevention of obesity containing kelp and sodium butyrate as an active ingredient) have been registered and disclosed. However, patents relating to thrombosis are very limited. As a patent related to thrombosis, recently, a method for producing an alginate oligosaccharide having an effect of decomposing alginic acid in sea tangle or seaweed and decomposing already formed thrombus has been patented (Korean Patent No. 10-0538553, alginate oligosaccharide A method for producing the same, an alginate oligosaccharide prepared by the method, body cosmetics containing the above-mentioned alginate oligosaccharide, and capsules for drinking), and Korea Patent No. 10-0337005 [the tea composition of the reproductive type with enhanced cholesterol and blood clotting function] The present invention discloses a tea composition which exhibits cholesterol and a thrombocyte function by adding red yeast and natto kinase to various grains, algae and mushroom powders, but does not specifically mention the anti-thrombotic effect of kelp, and Korean Patent No. 10-0345040 [Improvement agent for blood circulation containing a complex of red ginseng and method for producing the same] Discloses a blood circulation improving agent comprising a red ginseng complex obtained by extracting kelp, manure, broiler blood, licorice and the like with water and a mixture of these extracts, and a method for producing the same, wherein the improvement in blood circulation is derived from herbal medicines including red ginseng It is known that the direct antithrombotic activity of kelp is not reported. Therefore, until now, there have been no patents relating to anti-thrombotic activity of lipid-soluble substances in kelp, and especially in relation to the effect of inhibiting thrombosis, it is not known except fucoidan, a water-soluble polysaccharide.

KRKR 10-053855310-0538553 BB KRKR 10-034504010-0345040 BB

Zhu 등, 2010, Higher specificity of the activity of low molecular weight fucoidan for thrombin-induced platelet aggregation. Thrombosis Research. 125: 419-426 Zhu et al., 2010, Higher specificity of the activity of low molecular weight fucoidan for thrombin-induced platelet aggregation. Thrombosis Research. 125: 419-426

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 식용 및 약용으로 이용되고 있는 다시마의 열수 추출물로부터 순차 분획되어 얻어진 유기용매 분획, 특히, 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하는 트롬빈 및 혈액응고인자 저해 및 혈소판 응집저해에 따른 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 분획물을 포함하는 건강 기능 식품을 제공하고자 하는 것이다.Disclosure of Invention Technical Problem [8] Accordingly, the present invention has been made keeping in mind the above problems occurring in the prior art, and an object of the present invention is to provide an organic solvent fraction obtained by successively fractionating from a hot water extract of sea tangle used for edible and medicinal purposes, , Ethyl acetate fraction and butanol fraction as active ingredients, and a pharmaceutical composition for preventing or treating thrombotic diseases caused by inhibition of blood clotting factor and platelet aggregation inhibition, and a health functional food comprising the fraction .

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 다시마(Laminaria japonica) 열수 추출물로부터 얻어진 유기용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating thrombosis comprising an organic solvent fraction obtained from a hot water extract of Laminaria japonica as an active ingredient.

상기 유기용매 분획물은 다시마의 열수 추출물을 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차 분획하여 얻어진 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 분획물인 것이 바람직하다.The organic solvent fraction is preferably at least one fraction selected from the group consisting of a hexane fraction, an ethyl acetate fraction and a butanol fraction obtained by successively fractionating a hot water extract of sea tangle with hexene, ethyl acetate and butanol.

또한, 본 발명은 본 발명의 상기 다시마 열수 추출물로부터 얻어진 유기용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 건강 기능 식품을 제공한다. In addition, the present invention provides a health functional food containing the organic solvent fraction obtained from the hot-water extract of kelp of the present invention as an active ingredient.

본 발명의 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품의 유효성분으로서의 다시마의 열수 추출물로부터 얻어진 유기 용매 분획물은, 본 명세서의 실시예를 통해 증명된 바와 같이, 다시마를 열수 추출하여 추출물을 조제한 후, 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올을 이용하여 순차적으로 분획하여 조제되며, 조제된 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물은 우수한 트롬빈 저해효과, 혈액응고인자 저해효과에 의한 항혈전 활성을 나타내어 혈전 생성을 효율적으로 억제할 수 있는 효과가 있으며, 혈행개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전증의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다. 특히, 본 발명의 다시마의 열수 추출물로부터 순차 분획되어 얻어진 유기용매 분획물들은 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성조건 및 혈장 내에서도 인간트롬빈 직접저해, 혈액응고인자 저해 효과의 손실이 나타나지 않아, 추출액, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 상시 복용이 가능한 형태로 조제할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 제약 산업 및 식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.The pharmaceutical composition for the prevention or treatment of thrombosis according to the present invention and the organic solvent fraction obtained from the hot water extract of kelp as an active ingredient of the health functional food can be obtained by extracting the kelp by hot water extraction, The hexane fraction, the ethyl acetate fraction and the butanol fraction thus prepared had excellent thrombin inhibitory effect and antithrombotic activity by the effect of inhibiting the blood coagulation factor, and the thrombin generation And there is an excellent effect that can be used for prevention and treatment of thrombosis such as ischemic stroke and hemorrhagic stroke through improvement of blood circulation. Particularly, the organic solvent fractions obtained by successive fractionation from the hot water extract of sea tangle according to the present invention are excellent in thermal stability, and do not exhibit the direct inhibition of human thrombin or inhibition of blood coagulation factor even in an acidic condition of pH 2 and plasma, Powder, ring, tablet, etc., and can be prepared in a form that can be taken at any time. Therefore, it is an extremely useful invention in the pharmaceutical industry and the food industry.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 발명자들은 항혈전 및 혈류개선 활성을 나타내는 기능성 식품 소재 개발을 목표로, 다시마 추출물과 이의 순차적 유기용매 분획물을 조제한 후, 인간 혈장과 인간 트롬빈, 프로트롬빈, 혈액응고인자들을 이용하여 혈전생성 저해활성을 평가하고, 인간 농축혈소판을 이용한 다시마의 혈소판 응집저해 활성을 측정하여, 다시마의 열수 추출물로부터 순차 분획된 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올 분획물에서 트롬빈 혈액응고효소의 저해, 혈액응고인자 저해 및 혈소판 응집저해 효과를 나타내는, 기존에 알려지지 않은 물질 특성을 갖는 항혈전 분획물을 확인하였다. 상기 분획물들은 항혈전 활성을 나타낸다고 보고된 수용성 다당류인 후코이단 성분이 존재하지 않는 지용성 분획이다. 흥미롭게도, 다시마의 에탄올 추출물 및 이의 유기용매 분획에서는, 다시마의 열수 추출물과 달리, 미약한 트롬빈 혈액응고효소의 저해 및 혈액응고인자 저해만이 관찰될 뿐이었다. 또한, 본 발명의 발명자들은 상기와 같이 회수된 항혈전 활성 성분인 유기 용매 분획물이 열 안정성과 산 안정성이 우수한 특징을 가짐을 확인함으로써 상기 분획물들을 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품으로 활용하고자 하였다. The inventors of the present invention prepared seaweed extract and sequential organic solvent fractions thereof for the purpose of developing a functional food material exhibiting anti-thrombotic and blood flow improving activity, and then, using human plasma, human thrombin, prothrombin and blood coagulation factors, Activity was evaluated and platelet aggregation inhibitory activity of kelp using human concentrated platelets was measured. The inhibition of thrombin coagulation enzyme, inhibition of blood clotting factor and platelet aggregation in hexane, ethyl acetate and butanol fractions, which were sequentially fractionated from hot water extract of sea tangle, The antithrombotic fraction exhibiting inhibitory effects and having a previously unknown substance characteristic was identified. These fractions are lipid soluble fractions that are free of fucoidan component, a water-soluble polysaccharide reported to exhibit antithrombotic activity. Interestingly, in the ethanol extract of kelp and its organic solvent fraction, only weak thrombin coagulation enzyme inhibition and blood coagulation factor inhibition were observed unlike hot water extract of kelp. Furthermore, the inventors of the present invention have found that the organic solvent fractions, which are the antithrombotic active ingredients recovered as described above, have excellent thermal stability and acid stability, so that the fractions can be used as a pharmaceutical composition for preventing or treating thrombosis, .

구체적으로, 본 발명자들은 다시마를 이용하여 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품을 개발하기 위하여 다시마의 열수 추출물을 조제하고, 이를 다양한 유기용매들로 순차 분획하여 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 잔류물을 수득하고, 이를 각각 인간 혈장과 인간 트롬빈에 대한 트롬빈 직접저해(Thrombin Time), 프로트롬빈 저해(Prothrombin Time) 및 활성부분 트롬보플라스틴 타임(activated Partial Thromboplastin Time: aPTT), 혈소판 응집 저해능을 평가하였다. 그 결과, 다시마의 열수 추출물의 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물에서 임상에서 항혈전제로 사용하고 있는 아스피린(상품명: 프로텍트)보다 강력한 트롬빈 및 혈액응고인자 저해활성을 확인하였다. Specifically, the present inventors prepared a hot water extract of sea tangle to develop a pharmaceutical composition and a health functional food for preventing or treating thrombosis using sea tangle, and sequentially fractionated it with various organic solvents to obtain a hexane fraction, an ethyl acetate fraction , Butanol fractions and water residues were obtained and compared to thrombin time, prothrombin time and activated partial thromboplastin time (aPTT) for human plasma and human thrombin, respectively. , And the inhibition of platelet aggregation was evaluated. As a result, stronger thrombin and blood coagulation factor inhibitory activity were confirmed in hexane fraction, ethyl acetate fraction and butanol fraction of hot water extract of sea tangle than in aspirin (trade name: Protect) which is used clinically as an antithrombotic agent.

따라서, 본 발명은 다시마의 열수 추출물로부터 얻어진 유기용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a pharmaceutical composition and a health functional food for preventing or treating thrombosis, which comprises an organic solvent fraction obtained from hot water extract of sea tangle as an active ingredient.

바람직한 구체예로서, 상기 다시마의 열수 추출물의 유기용매 분획물은 다시마의 열수 추출물을 헥센으로 분획 후, 에틸아세테이트로 분획하고, 이후 부탄올로 순차 분획하여 얻어진 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 유기용매 분획물이다.As a preferred example, the organic solvent fraction of the hot-water extract of sea tangle is selected from the group consisting of a hexane fraction, an ethyl acetate fraction and a butanol fraction obtained by fractionating the hot-water extract of sea tangle with hexene, then fractionating with ethyl acetate, Wherein the organic solvent fraction is at least one organic solvent fraction selected from the group consisting of:

이하에서는, 본 발명의 다시마의 열수 추출물로부터 얻어진 유기용매 분획물의 제조 방법 및 효능 실험 등을 보다 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the method for producing the organic solvent fraction obtained from the hot-water extract of sea tangle of the present invention and the efficacy test will be described in more detail.

우선, 본 발명의 발명자들은 다시마의 열수 추출물 및 에탄올 추출물을 각각 조제하여 5.0mg/ml의 농도에서 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 측정하였다. 그 결과, 에탄올 추출물에서는 유의적인 항혈전 활성이 나타나지 않았으나, 열수 추출물에서 강력한 항혈전 활성이 나타남을 확인하였으며, 특히, 트롬빈과 혈액응고인자 저해를 통해 강력한 항혈전 활성을 나타냄을 확인하였다. First, the inventors of the present invention prepared a hot-water extract and an ethanol extract of sea tangle, respectively, and measured thrombin time, prothrombin time, and apathy time at a concentration of 5.0 mg / ml. As a result, the ethanol extract showed no significant antithrombotic activity, but the hydrothermal extract showed strong antithrombotic activity. In particular, thrombin and blood coagulation factor inhibition showed strong antithrombotic activity.

따라서, 본 발명은 시판 다시마로부터 열수 추출물을 조제하는 단계; 상기 열수 추출물로부터 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올 등의 유기용매 분획물 및 물 잔류물로 조정제하는 단계; 상기 추출물 및 분획물의 항혈전 효능 및 안정성 조사단계; 및 상기 활성 분획물의 안정성 평가단계를 포함한다.Accordingly, the present invention provides a method for preparing a hot-water extract, comprising the steps of: preparing a hot-water extract from commercial kelp; Adjusting an organic solvent fraction such as hexane, ethyl acetate, butanol, etc., and a water residue from the hot water extract; Examining the antithrombotic efficacy and stability of the extract and fraction; And evaluating the stability of the active fraction.

바람직한 구체예로서, 본 발명의 "다시마 열수 추출물"은 건조된 다시마를 100℃의 열수로 추출하는 단계 및 상기 추출액을 0.06mm 이하의 여과망을 사용하여 여과하고, 이를 감압농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다.As a preferred embodiment, the "kelp hot-water extract" of the present invention is obtained by extracting dried kelp with hot water at 100 ° C and filtering the extract using a filter net of 0.06 mm or less and concentrating it under reduced pressure .

바람직한 구체예로서, 본 발명의 "유기용매 분획물"은 다시마 열수 추출물을 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차 분획하여 얻어진, 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 분획물이다. As a preferred embodiment, the "organic solvent fraction" of the present invention is a fraction selected from the group consisting of hexane fraction, ethyl acetate fraction and butanol fraction obtained by successively fractionating a hot spring water extract of kelp with hexene, ethyl acetate and butanol .

다시마 열수 추출물의 유기용매 분획물은 헥센 분획, 에틸아세테이트 분획 및 부탄올 분획 모두에서 우수한 트롬빈 저해(연장된 트롬빈 타임) 및 혈액응고인자 저해(연장된 에이피티 타임)가 나타났다. 이러한 헥센 분획, 에틸아세테이트 분획 및 부탄올 분획의 항혈전 활성은 현재 항혈전제로 사용되는 아스피린의 3~5배의 항혈전 활성으로 상기 활성 분획물은 위장장해와 같은 부작용이 보고된 아스피린을 대치할 수 있음을 제시한다.The organic solvent fractions of the kelp hydrothermal extract showed excellent thrombin inhibition (prolonged thrombin time) and inhibition of blood coagulation factors (prolonged apathy time) in both the hexene fraction, ethyl acetate fraction and butanol fraction. The antithrombotic activity of the hexane fraction, the ethyl acetate fraction and the butanol fraction is 3 to 5 times the antithrombotic activity of the aspirin currently used as an antithrombotic agent, and the active fraction can replace the aspirin reported side effects such as gastrointestinal disorders .

본 발명의 다시마의 열수 추출물로부터 얻어진 유기용매 분획물은 감압증류 및 동결건조, 또는 분무건조 등과 같은 통상적인 분말화 과정을 거쳐 분말로 제조될 수 있다. 이들은 100℃의 열처리와 pH 2의 인체 위 내의 pH에서도 활성을 유지하며, 혈장 내에서도 안정하게 유지된다.The organic solvent fraction obtained from the hot water extract of sea tangle of the present invention may be prepared into powder by a conventional powdering process such as vacuum distillation, freeze drying, spray drying and the like. They remain active even at 100 ° C heat treatment and pH 2 in human body, and remain stable in plasma.

본 발명의 다시마의 열수 추출물로부터 얻어진 유기용매 분획물은 혈전증과 관련된 다양한 질환들의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다. 상기 질환들은, 예를 들어, 동맥 혈전증으로서, 급성 심근 경색증, 가슴 통증, 호흡 곤란, 의식 소실, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 두통, 운동 이상, 감각 이상, 성격 변화, 시력 저하, 간질 발작, 폐 혈전증, 심부정맥 혈전증, 하지 부종, 통증 및 급성 말초 동맥 폐쇄증 등을 들 수 있고, 정맥 혈전증으로서, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증 및 중심 망막정맥 폐쇄 등을 들 수 있다.The organic solvent fraction obtained from the hot-water extract of sea tangle of the present invention can be used for preventing or treating various diseases related to thrombosis. Such diseases include, for example, arterial thrombosis such as acute myocardial infarction, chest pain, dyspnea, loss of consciousness, ischemic stroke, hemorrhagic stroke, headache, dyskinesia, sensory abnormality, personality change, visual disturbance, epileptic seizure, , Deep vein thrombosis, lower limb edema, pain and acute peripheral artery occlusion. Vein thrombosis can include deep vein thrombosis, portal vein thrombosis, acute renal vein thrombosis, cerebral sinus thrombosis, and central retinal vein occlusion.

본 발명의 다시마의 열수 추출물로부터 얻어진 유기용매 분획물을 포함하는 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition comprising the organic solvent fraction obtained from the hot water extract of sea tangle according to the present invention may be administered orally or rectally in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, The composition can be formulated into various forms such as formulations, injections of sterilized injection solutions, and the like, and can be administered by various routes including oral administration or intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, rectal, topical administration and the like.

이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록 시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.Such pharmaceutical compositions may further comprise carriers, excipients or diluents, and examples of suitable carriers, excipients or diluents that may be included include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, But are not limited to, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose, amorphous cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, Mineral oils and the like. In addition, the pharmaceutical composition of the present invention may further include a filler, an anti-coagulant, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, an antiseptic, and the like.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. In the present invention, "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level will depend on the type of disease, severity, The sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration and the rate of release, the duration of the treatment, factors including co-administered drugs, and other factors well known in the medical arts.

본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or multiply. It is important to take into account all of the above factors and to administer the amount in which the maximum effect can be obtained in a minimal amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.

바람직한 구체예로서, 본 발명의 약학적 조성물 중 유효성분으로서 다시마의 열수 추출물로부터 얻어진 유기용매 분획물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 ㎏ 당 1 내지 5,000mg, 바람직하게는 100 내지 3,000mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.As a preferable example, the effective amount of the organic solvent fraction obtained from the hot water extract of sea tangle as an active ingredient in the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the age, sex and body weight of the patient, and is generally 1 to 5,000 mg per kg of body weight , Preferably 100 to 3,000 mg per day or every other day, or one to three divided doses per day. However, the dosage may not be limited in any way because it may be increased or decreased depending on route of administration, severity of disease, sex, weight, age, and the like.

본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a subject through various routes. All modes of administration may be expected, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intra-uterine or intracerebroventricular injections.

본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.In the present invention, "administration" means providing a predetermined substance to a patient by any suitable method, and the administration route of the pharmaceutical composition of the present invention is either oral or non-oral May be administered orally. The composition of the present invention may also be administered using any device capable of delivering an effective ingredient to a target cell.

본 발명에서 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.In the present invention, the term "object" includes, but is not limited to, human, monkey, cow, horse, sheep, pig, chicken, turkey, quail, cat, dog, mouse, rat, rabbit or guinea pig , Preferably a mammal, more preferably a human.

또한, 본 발명의 건강 기능 식품은 혈전증의 예방 또는 개선에 효과적인 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 다시마의 열수 추출물로부터 얻어진 유기용매 분획물을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.In addition, the health functional food of the present invention can be variously used for foods and beverages effective for prevention or improvement of thrombosis. Examples of foods containing the organic solvent fraction obtained from the hot water extract of tangle of the present invention include various foods, beverages, gums, tea, vitamin complex, health supplement foods and the like, and they may be powder, granules, It can be used in beverage form.

본 발명의 다시마의 열수 추출물로부터 얻어진 유기용매 분획물은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100ml를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.The organic solvent fraction obtained from the hot water extract of sea tangle according to the present invention may be added in an amount of 0.01 to 15% by weight of the whole food, and the health beverage composition may be added in an amount of 0.02 to 10 g, preferably 0.3 to 1 g, Can be added.

본 발명의 건강 기능 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. The health functional food of the present invention may contain, as an additional ingredient, a food-acceptable food-aid additive such as natural carbohydrates and various flavors, in addition to containing the above-mentioned compound as an essential ingredient in the indicated ratio.

상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다. Examples of the natural carbohydrate include sugar sugars such as glucose, monosaccharides such as fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol.

상기 향미제로는 타우마틴, 레바우디오시드 A, 글리시르히진, 사카린, 아스파르탐 등을 사용할 수 있다. 상기 향미제의 비율은 본 발명의 건강 기능 식품 100ml당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g을 사용한다. 상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 다시마의 열수 추출물로부터 얻어진 유기용매 분획물 100중량부 당 0.01 내지 약 20중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.Examples of the flavor agent include tau martin, rebaudioside A, glycyrrhizin, saccharin, and aspartame. The proportion of the above-mentioned flavoring agent is generally about 1 to 20 g, preferably about 5 to 12 g per 100 ml of the health functional food of the present invention. In addition to the above, the health functional food of the present invention may contain various kinds of nutrients, vitamins, minerals, flavors such as synthetic flavors and natural flavors, colorants and heavy stabilizers, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, Thickening agents, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonating agents used in carbonated drinks, and the like. In addition, the health functional food of the present invention may contain flesh for producing natural fruit juice, fruit juice drink, vegetable drink and the like. These components may be used independently or in combination. The ratio of such additives is generally selected in the range of 0.01 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the organic solvent fraction obtained from the hot-water extract of sea tangle of the present invention.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 하나의 구체예일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예의 범위로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. The following examples are only a preferred embodiment of the present invention, and the scope of the present invention is not limited to the scope of the following examples.

[[ 실시예Example ]]

실시예Example 1: 다시마  1: Kelp 열수Heat number 추출물 및 이의 유기용매  Extracts and their organic solvents 분획물의Fraction 조제  pharmacy

2013년 경북 ㈜안동간고등어에서 제공한 경남산 건 다시마를 이용하여 열수 및 에탄올 추출물을 조제하였다. 에탄올 추출물은 건 다시마에 대해 10배 부피의 에탄올(95%, 덕산, 한국)을 가하고, 상온에서 8시간씩 3회 추출하였다. 열수 추출물은 건 다시마에 10배 부피의 물을 가하고 100℃에서 1시간씩 3회 고온 추출하였다. 각각의 추출액은 필터기를 사용하여 이물질을 제거한 후 회수하고, 이를 감압 농축하여 분말로 제조하고 사용 전까지 저온 밀봉 보관하였다. 이후, 에탄올 추출물 및 열수 추출물을 증류수에 현탁한 후, 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적 분획하였으며, 최종적으로 물 잔류물을 얻었다. In 2013, hot water and ethanol extracts were prepared from Gyeongnam dried sea tangle, supplied from Andong Kanggak language co., Ltd. The ethanol extracts were extracted three times at room temperature for 8 hours with 10 times volume of ethanol (95%, Duksan, Korea) to dry kelp. The hot - water extracts were prepared by adding 10 times volume of water to dried kelp and subjected to high temperature extraction three times at 100 ° C for 1 hour. Each of the extracts was recovered after removing the foreign substances by using a filter machine, and concentrated under reduced pressure to prepare powder, which was stored at low temperature until use. Thereafter, the ethanol extract and the hot water extract were suspended in distilled water, and then fractionated with hexane, ethyl acetate, and butanol sequentially to obtain a final water residue.

이때 다시마의 에탄올 추출물 및 열수 추출물의 수득율은 각각 9.1±0.7% 및 50.5±1.2%로 나타나 열수 추출물이 에탄올 추출물보다 5배 이상 많았다. 다시마의 열수 및 에탄올 추출물의 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 잔류물의 수득율은 표 1에 나타낸 바와 같으며, 열수 추출물의 경우 96.5%가 물 잔류물이고, 유기용매 분획물은 3.5%인데 비해, 에탄올 추출물의 경우 물 잔류물이 84.8%, 유기용매 분획물이 15.2%를 나타내어 추출물의 성분에 많은 차이가 있음을 알 수 있었다.The yields of ethanol extract and hot water extract of sea tangle were 9.1 ± 0.7% and 50.5 ± 1.2%, respectively, and the hot water extract was 5 times more than the ethanol extract. The yields of hexane fraction, ethyl acetate fraction, butanol fraction and water residue of hot water and ethanol extract of sea tangle were as shown in Table 1. In the case of hot water extract, 96.5% was water residue and 3.5% of organic solvent fraction , And ethanol extracts showed 84.8% of water residue and 15.2% of organic solvent fraction.

다시마 Kelp 열수Heat number 및 에탄올 추출물 및 이들의 유기용매 분획 효율  And ethanol extracts and their organic solvent fractionation efficiencies 구분division 추출효율 또는 분획효율(%)Extraction Efficiency or Fraction Efficiency (%) 추출용매Extraction solvent 추출물extract 헥센 분획Hexene fraction 에틸아세테이트
분획
Ethyl acetate
Fraction
부탄올 분획Butanol fraction 물 잔류물Water residue
다시마Kelp 열수Heat number 50.5±1.250.5 ± 1.2 0.10.1 0.80.8 2.62.6 96.596.5 에탄올ethanol 9.1±0.79.1 ± 0.7 5.55.5 2.02.0 7.77.7 84.884.8

실시예Example 2: 다시마 추출물 및 유기용매  2: Seaweed extract and organic solvent 분획물의Fraction 성분 분석  Component analysis

조제된 다시마 열수 및 에탄올 추출물 및 이들의 분획물을 대상으로 총 플라보노이드(total flavonoid), 총 폴리페놀(total polyphenol), 총당 및 환원당 함량을 측정하였다. 총 플라보노이드 함량 측정은 각각의 시료를 18시간 메탄올 교반 추출하고, 여과한 추출 검액 400μl에 90% diethylene glycol 4 ml를 첨가하고 다시 1N NaOH 40μl를 넣고 37℃에서 1시간 반응 후 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 rutin을 사용하였다. 총 폴리페놀 함량은 추출 검액 400μl에 50μl의 Folin-ciocalteau, 100μl의 Na2CO3 포화용액을 넣고 실온에서 1시간 방치한 후 725nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다. 환원당은 DNS법으로, 총당은 phenol-sulfuric acid법을 이용하여 정량하였다. 그 결과는 다음 표 2에 나타내었다.Total flavonoid, total polyphenol, total sugar, and reducing sugar contents were measured in hot water and ethanol extracts and their fractions. To determine the total flavonoid content, each sample was stirred for 18 hours in methanol, 4 ml of 90% diethylene glycol was added to 400 μl of the filtered extract, 40 μl of 1N NaOH was added, and the reaction was conducted at 37 ° C. for 1 hour and then absorbance was measured at 420 nm . As a standard reagent, rutin was used. Total polyphenol content was determined by adding 50 μl of Folin-ciocalteau, 100 μl of Na 2 CO 3 The saturated solution was added and allowed to stand at room temperature for 1 hour, and the absorbance was measured at 725 nm. Tannic acid was used as a standard reagent. Reducing sugar was determined by DNS method and total sugar was quantified by phenol-sulfuric acid method. The results are shown in Table 2 below.

다시마 추출물 및 유기용매 Sea tangle extract and organic solvent 분획물의Fraction 성분 분석  Component analysis 구분division 시료sample 함량 (mg/g)Content (mg / g) 총플라보노이드Total flavonoid 총 폴리페놀Total polyphenol 총당Total 환원당Reducing sugar 다시마/ 열수Kelp / hot water 열수 추출물Hot water extract 0.50±0.730.50 + - 0.73 1.32±0.021.32 + 0.02 40.32±0.5940.32 ± 0.59 14.78±2.0414.78 ± 2.04 헥센 분획물Hexene fraction 0.05±0.080.05 ± 0.08 1.15±0.021.15 ± 0.02 14.81±0.4814.81 ± 0.48 8.11±0.908.11 ± 0.90 에틸아세테이트
분획물
Ethyl acetate
Fraction
0.32±0.010.32 ± 0.01 4.15±0.044.15 + 0.04 14.06±0.4414.06 + - 0.44 9.60±0.009.60 ± 0.00
부탄올 분획물Butanol fraction 0.02±0.010.02 ± 0.01 2.70±0.012.70 + - 0.01 16.24±0.2816.24 ± 0.28 11.13±0.2411.13 ± 0.24 물 잔류물Water residue 0.01±0.040.01 ± 0.04 1.56±0.061.56 + 0.06 42.95±0.4042.95 ± 0.40 18.90±0.7818.90 ± 0.78 다시마/ 에탄올 Kelp / ethanol 에탄올 추출물Ethanol extract 0.02±0.030.02 0.03 0.30±0.010.30 0.01 9.99±0.799.99 ± 0.79 8.87±0.068.87 ± 0.06 헥센 분획물Hexene fraction 0.75±0.680.75 + - 0.68 2.18±0.142.18 ± 0.14 45.37±2.4645.37 + - 2.46 31.77±0.9631.77 ± 0.96 에틸아세테이트
분획물
Ethyl acetate
Fraction
0.29±1.330.29 ± 1.33 4.39±0.024.39 + 0.02 84.92±2.2684.92 + - 2.26 35.59±0.3635.59 ± 0.36
부탄올 분획물Butanol fraction 0.02±0.030.02 0.03 1.06±0.051.06 ± 0.05 13.38±0.1213.38 + - 0.12 9.13±0.069.13 + 0.06 물 잔류물Water residue 0.03±0.010.03 ± 0.01 0.03±0.010.03 ± 0.01 9.01±0.329.01. + -. 0.32 6.71±0.246.71 ± 0.24

표 2에 나타낸 바와 같이, 다시마 열수 추출물의 경우 특이하게도 에탄올 추출물보다 높은 함량의 총 플라보노이드 및 총 페놀성분을 함유하고 있었으며, 열수 추출물의 대부분의 당은 물 잔류물로 이행되었으나, 에탄올 추출물의 당은 헥센 및 에틸아세테이트 분획으로 이행되어 열수 및 에탄올 추출물의 유기용매 분획물도 상당한 차이가 있음을 확인하였다. As shown in Table 2, the total amount of total flavonoids and total phenol components were higher in the case of the hot-water extract of kelp, especially the ethanol extract, and most of the sugar in the hot-water extract was converted into water residue. However, Hexene and ethyl acetate fractions, indicating that the organic solvent fractions of hydrothermal and ethanol extracts were significantly different.

실시예Example 3: 다시마 추출물 및 유기용매  3: Seaweed extract and organic solvent 분획물의Fraction 혈액응고저해 활성 평가  Evaluation of blood coagulation inhibitory activity

다시마 추출물 및 분획물들의 혈액응고 저해활성을 평가하였다. 혈액응고 저해활성은 기존에 보고된 방법에 준해 평가하였으며(류 등 2010. J. Life Science, 20. 922-928), 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티 타임을 측정하였다. 구체적인 측정 방법은 다음과 같다.The blood coagulation inhibitory activity of kelp extract and fractions was evaluated. The blood coagulation inhibitory activity was evaluated according to the previously reported method (Li et al. 2010. J. Life Science , 20. 922-928), thrombin time, prothrombin time and apathy time were measured. The specific measurement method is as follows.

트롬빈Thrombin 타임( time( ThrombinThrombin TimeTime ))

37℃에서 0.5U 트롬빈(Sigma Co., USA) 50μl와 20mM CaCl2 50μl, 시료 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 혈장(control plasma, Thermo Fisher Scientific Inc, MA, USA) 100μl를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 32.1초의 응고시간을 나타내었다. 결과는 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 혈액응고 저해활성은 시료 첨가시의 트롬빈 타임을 용매 대조구의 트롬빈 타임으로 나눈 값으로 나타내었다.50 [mu] l 0.5 U thrombin (Sigma Co., USA) and 20 mM CaCl 2 (Control plasma, Thermo Fisher Scientific Inc, MA, USA) was added to the tube, and then the plasma was incubated for 1 hour until the plasma coagulated The time was measured. As a control, aspirin (Sigma Co., USA) was used and DMSO was used as a solvent control instead of the sample. DMSO showed a clotting time of 32.1 sec. The results were expressed as the mean value of three repeated experiments, and the coagulation inhibition activity was expressed as the thrombin time at the time of adding the sample divided by the thrombin time at the solvent control.

프로트롬빈Prothrombin 타임( time( prothrombinprothrombin timetime ))

표준혈장(MD Pacific Co., China) 70μl와 시료 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온 후, 130μl의 PT reagent를 첨가하고 혈장(control plasma, Thermo Fisher Scientific Inc, MA, USA)이 응고될 때까지의 시간을 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 18.1초의 응고시간을 나타내었다. 결과는 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 혈액응고 저해활성은 시료 첨가시의 프로트롬빈 타임을 용매 대조구의 프로트롬빈 타임으로 나눈 값으로 나타내었다.70 μl of standard plasma (MD Pacific Co., China) and 10 μl of sample were added to a tube of Amelung coagulometer KC-1A (Japan) and incubated at 37 ° C. for 3 minutes. Then, 130 μl of PT reagent was added, Scientific Inc, MA, USA) was used as the average value of the experiment in which the time until solidification was repeated three times. As a control, aspirin (Sigma Co., USA) was used and DMSO was used as a solvent control instead of the sample. DMSO showed a clotting time of 18.1 sec. The results were expressed as the mean value of three repeated experiments, and the coagulation inhibition activity was expressed as the prothrombin time at the time of adding the sample divided by the prothrombin time at the solvent control.

aPTTaPTT ( ( activatedactivated PartialPartial ThromboplastinThromboplastin TimeTime ))

혈장(control plasma, Thermo Fisher Scientific Inc, MA, USA) 100μl 와 시료 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온한 후, 50μl의 aPTT reagent(Sigma, ALEXINTM, USA) 를 첨가하고 다시 37℃에서 3분간 배양하였다. 이후 50μl CaCl2(35mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였으며, 이 경우 55.1초의 응고시간을 나타내었다. 결과는 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 혈액응고 저해활성은 시료 첨가시의 에이피티 타임을 용매 대조구의 에이피티 타임으로 나눈 값으로 나타내었다.Plasma (control plasma, Thermo Fisher Scientific Inc , MA, USA) 100μl with the sample 10μl Amelung coagulometer KC-1A (Japan ) was added to the tube and then heated at 37 ℃ 3 bungan, 50μl of the aPTT reagent (Sigma, ALEXIN TM of , USA) and incubated at 37 ° C for 3 minutes. After the addition of 50 μl CaCl 2 (35 mM), the time until the plasma coagulated was measured. As the solvent control, DMSO was used instead of the sample. In this case, the solidification time was 55.1 seconds. The results were expressed as the mean value of the experiment which was repeated three times, and the coagulation inhibition activity was expressed as the apitime time when the sample was added divided by the apitime time of the solvent control.

다시마 열수 추출물 및 분획물들의 혈액응고 저해활성은 표 3에 나타내었다. 한편 다시마 에탄올 추출물 및 이의 분획물은 유의적인 혈액응고 저해활성을 나타내지 않았다(결과 미제시). The blood coagulation inhibitory activity of the kelp hydrothermal extract and fractions is shown in Table 3. On the other hand, seaweed ethanol extract and its fractions did not show significant blood clotting inhibitory activity (no result).

다시마 Kelp 열수Heat number 추출물 및 유기용매  Extracts and organic solvents 분획물의Fraction 혈액응고 저해 활성  Blood coagulation inhibitory activity 시료sample 농도(mg/ml)Concentration (mg / ml) 혈액응고 저해활성* Blood coagulation inhibitory activity * 트롬빈 타임Thrombin time 프로트롬빈 타임Prothrombin time 에이피티 타임 Apathy time 디엠에스오DMSO -- 1.0±0.0 1.0 ± 0.0 1.0±0.0 1.0 ± 0.0 1.0±0.0 1.0 ± 0.0 아스피린aspirin 1.51.5 1.8±0.0 1.8 ± 0.0 1.6±0.1 1.6 ± 0.1 1.7±0.0 1.7 ± 0.0
열수
추출물

Heat number
extract
5.05.0 >15.0 > 15.0 >15.0 > 15.0 >15.0 > 15.0
2.52.5 >15.0 > 15.0 4.7±0.1 4.7 ± 0.1 >15.0 > 15.0 1.21.2 >15.0 > 15.0 3.1±0.1 3.1 ± 0.1 >15.0 > 15.0 0.60.6 >15.0 > 15.0 1.6±0.1 1.6 ± 0.1 >15.0 > 15.0
헥센
분획

Hexen
Fraction
5.05.0 >15.0 > 15.0 2.1±0.2 2.1 ± 0.2 12.4±0.5 12.4 ± 0.5
2.52.5 8.7±0.1 8.7 ± 0.1 1.3±0.0 1.3 ± 0.0 5.9±0.1 5.9 ± 0.1 1.21.2 5.1±0.1 5.1 ± 0.1 1.0±0.21.0 ± 0.2 2.9±0.2 2.9 ± 0.2 0.60.6 3.3±0.0 3.3 ± 0.0 1.0±0.11.0 ± 0.1 2.3±0.1 2.3 ± 0.1
에틸아세테이트
분획

Ethyl acetate
Fraction
5.05.0 >15.0 > 15.0 3.2±0.1 3.2 ± 0.1 >15.0 > 15.0
2.52.5 >15.0 > 15.0 2.1±0.1 2.1 ± 0.1 7.7±0.4 7.7 ± 0.4 1.21.2 8.0±0.2 8.0 ± 0.2 1.4±0.1 1.4 ± 0.1 3.4±0.2 3.4 ± 0.2 0.60.6 4.3±0.1 4.3 ± 0.1 1.1±0.2 1.1 ± 0.2 2.5±0.0 2.5 ± 0.0
부탄올
분획

Butanol
Fraction
5.05.0 9.6±0.2 9.6 ± 0.2 1.4±0.1 1.4 ± 0.1 3.6±0.2 3.6 ± 0.2
2.52.5 4.1±0.0 4.1 ± 0.0 1.0±0.1 1.0 ± 0.1 2.8±0.1 2.8 ± 0.1 1.21.2 2.7±0.1 2.7 ± 0.1 1.0±0.1 1.0 ± 0.1 1.8±0.1 1.8 ± 0.1 0.60.6 2.0±0.1 2.0 ± 0.1 1.0±0.1 1.0 ± 0.1 1.3±0.2 1.3 ± 0.2

잔류물

water
Residue
5.05.0 >15.0 > 15.0 >15.0 > 15.0 >15.0 > 15.0
2.52.5 >15.0 > 15.0 4.3±0.5 4.3 ± 0.5 >15.0 > 15.0 1.21.2 >15.0 > 15.0 3.3±0.1 3.3 ± 0.1 >15.0 > 15.0 0.60.6 >15.0 > 15.0 1.8±0.0 1.8 ± 0.0 >15.0 > 15.0

혈액응고 저해활성* : 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값Blood coagulation inhibition activity * : Coagulation time at sample addition divided by coagulation time of solvent control

표 3에 나타낸 바와 같이 먼저 항혈전제로 사용되고 있는 아스피린은 1.5mg/ml 농도에서 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 각각 1.8배, 1.6배, 1.7배 연장시켜 우수한 혈액응고저해 활성을 확인하였다. As shown in Table 3, aspirin used as an antithrombotic agent prolonged thrombin time, prothrombin time, and apathy time by 1.8, 1.6, and 1.7 times, respectively, at a concentration of 1.5 mg / ml.

한편, 다시마의 열수 추출물은 0.6mg/ml농도에서 트롬빈 타임, 및 에이피티 타임을 용매 대조구에 비해 15배 이상 연장시켰으며, 이러한 항혈전 활성은 유기용매 분획 후의 물 잔류물에서도 거의 동일하게 나타났다. On the other hand, in the hot water extract of sea tangle, the thrombin time and apathy time were prolonged more than 15 times as compared with the solvent control at the concentration of 0.6 mg / ml, and the antithrombotic activity was almost the same even after the organic solvent fraction.

그러나, 유기용매 분획물인 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올 분획에서도 지금까지 알려지지 않았던 매우 우수한 항혈전 활성이 나타났으며, 특히 에틸아세테이트 분획에서는 2.5mg/ml 농도에서 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 각각 15배 이상, 2.1배, 및 7.7배 연장시켰으며, 1.2mg/ml농도에서도 각각 8.0배, 1.4배, 및 3.4배, 연장시켜 분획물 중에서 가장 우수한 혈액응고저해 활성을 확인하였다. 다시마 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 건 다시마의 0.4%에 불과하나, 우수한 신규활성으로 항혈전제로 사용 가능하리라 판단된다. However, the hexane, ethyl acetate and butanol fractions, which are organic solvent fractions, exhibited a remarkable antithrombotic activity, which was not known until now. Particularly in the ethyl acetate fraction, thrombin time, prothrombin time, Fold, 2.1 times, and 7.7 times, respectively, and 8.0 times, 1.4 times, and 3.4 times, respectively, at the concentration of 1.2 mg / ml to confirm the best blood coagulation inhibitory activity among the fractions. Ethyl acetate fraction of kelp hydrothermal extract was only 0.4% of dry seaweed, but it could be used as an antithrombotic agent with excellent novel activity.

한편, 다시마의 에탄올 추출물 및 이의 분획물에서는 혈액응고저해 활성을 발견할 수 없으며, 특히 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획에서는 5mg/ml 농도에서도 항혈전 활성은 거의 나타나지 않았다. 이러한 결과는 다시마의 항혈전 활성 분획의 경우 열수를 이용한 용매추출과 이의 특정 유기 용매 분획물에서만 우수한 항혈전 활성을 나타남을 의미한다. 또한 현재까지 다시마의 수용성 다당류에 의한 항혈전 활성은 잘 알려져 있으나, 지용성 물질, 특히 헥센 분획, 에틸아세테이트 분획 및 부탄올 분획에 대해서는 알려진 바 없으므로, 이들 분획물들의 활성물질을 정제시 더욱 강력한 항혈전 효과를 기대할 수 있을 것이다. On the other hand, no blood coagulation inhibitory activity was found in the ethanol extract of the sea tangle and its fractions. Especially, in the ethyl acetate fraction of the ethanol extract, the antithrombotic activity hardly appeared even at the concentration of 5 mg / ml. These results indicate that the antithrombotic active fraction of kelp shows excellent antithrombotic activity only in the solvent extraction using hot water and its specific organic solvent fraction. In addition, the antithrombotic activity by water-soluble polysaccharides of kelp is well known, but lipophilic substances, especially hexene fraction, ethyl acetate fraction and butanol fraction, are not known. Therefore, You can expect it.

실시예Example 4: 다시마 추출물 및 유기용매  4: Seaweed extract and organic solvent 분획물의Fraction 인간 혈소판 응집 저해활성  Human platelet aggregation inhibitory activity

다시마 추출물 및 분획물의 항혈전 활성 평가의 일환으로 인간 혈소판에 대한 응집저해활성을 평가하였으며, 평가방법은 다음과 같다.To evaluate the antithrombotic activity of kelp extract and fractions, aggregation inhibitory activity against human platelets was evaluated, and the evaluation method was as follows.

혈소판 응집저해 활성(Platelet Aggregation Inhibitory Activity PlateletPlatelet aggregationaggregation inhibitioninhibition activityactivity ))

혈소판은 건강한 인간의 전혈로부터 3.2% sodium citrate 용액과 1:9의 비율로 혼합한 후, 1,100rpm에서 10분간 원심분리하여 상층의 PRP(platelet rich plasma)를 취하고, 이를 washing buffer(138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 0.36 mM NaH2PO4, 5.5 mM Glucose, 1 mM EDTA, pH 6.5)로 1회 세척하였다. 이후, suspending buffer(138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 0.36 mM NaH2PO4, 5.5 mM Glucose, 0.49 mM MgCl2, 025% gelatin, pH 7.4)에 재현탁한 후, 3,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 다시 suspending buffer에 재현탁하였으며, 이때 혈소판 수는 4x109/ml 되도록 조정하였다. 이후 1 ml 현탁액에 2.5μl collagen을 가해 5분간 반응시키고, whole-blood aggregometer(Chrono-log, USA)를 사용하여 37℃에서 혈소판 응집을 측정하였으며, 응집강도, 기울기, 연장시간 및 하강면적으로 나타내었다. Platelets were mixed with 3.2% sodium citrate solution in a ratio of 1: 9 from healthy human whole blood, centrifuged at 1,100 rpm for 10 minutes, and the upper layer of platelet rich plasma (PRP) to 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO 3 , 0.36 mM NaH 2 PO 4, 5.5 mM Glucose, 1 mM EDTA, pH 6.5) and washed once. After resuspending in suspending buffer (138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO 3 , 0.36 mM NaH 2 PO 4 , 5.5 mM Glucose, 0.49 mM MgCl 2 , 025% gelatin, pH 7.4) After centrifugation for several minutes, the cells were resuspended in a suspending buffer, and the platelet count was adjusted to 4 × 10 9 / ml. Platelet aggregation was measured at 37 ° C using a whole-blood agarometer (Chrono-log, USA). The platelet aggregation was measured by cohesive strength, slope, elongation time, and falling area .

다시마의 열수 추출물 및 유기용매 분획물의 혈소판 응집저해능을 측정한 결과는 다음 표 4에 나타내었다.The results of measuring the inhibition of platelet aggregation of hot water extract and organic solvent fraction of sea tangle are shown in Table 4 below.

다시마 Kelp 열수Heat number 추출물 및 유기용매  Extracts and organic solvents 분획물의Fraction 인간 혈소판 응집저해 활성  Human platelet aggregation inhibitory activity 구분division 시료
(0.25 mg/ml)
sample
(0.25 mg / ml)
혈소판 응집 저해 활성* Platelet Aggregation Inhibitory Activity *
강도
(Amplitude:
ohm)
burglar
(Amplitude:
ohm)
기울기
(Slope)
inclination
(Slope)
연장시간
(Lag time:초)
Extension time
(Lag time: seconds)
하강면적
(Area
under)
Fall area
(Area
under)
상대 응집율(%)Relative Flocculation Rate (%)
다시마Kelp 열수 추출물Hot water extract 28 28 6 6 1818 226.6226.6 183.4 183.4 헥센 분획물Hexene fraction 1313 22 3333 97.0 97.0 78.5 78.5 에틸아세테이트 분획물Ethyl acetate fraction 1515 2 2 1717 122.1 122.1 98.998.9 부탄올 분획물Butanol fraction 1414 2 2 3131 105.7105.7 85.6 85.6 물 잔류물Water residue 26 26 6 6 1717 211.6 211.6 171.3 171.3 디엠에스오 (DMSO)DMSO (DMSO) 1818 33 1616 124.3124.3 100.0100.0 아스피린 (0.25mg/ml)Aspirin (0.25 mg / ml) 88 1One 3939 49.849.8 40.440.4 아스피린 (0.5mg/ml)Aspirin (0.5 mg / ml) 44 00 5252 30.130.1 24.424.4

혈소판 응집 저해 활성* : 응집강도, 기울기, 하강면적이 각각 작을수록 응집저해가 우수하며, 연장시간이 길수록 응집저해가 우수 Platelet aggregation inhibition activity * : The smaller the cohesion strength, the slope and the lowering area, the better the coagulation inhibition. The longer the extension time, the better the coagulation inhibition

표 4에 나타낸 바와 같이, 먼저 아스피린은 우수한 인간 혈소판 응집저해 활성을 나타내었으며, 농도의존적인 응집저해 활성을 확인하였다. 그러나, 다시마의 열수 추출물 및 유기용매 분획 후의 물 잔류물은 혈소판 응집을 오히려 촉진시키는 것으로 나타났다. 이는 기존의 수용성 다당류인 후코이단이 혈소판 응집을 촉진시킨다는 보고(Zhu 등, 2010, Thrombosis Research. 125: 419-426)를 고려하면 열수 추출물에 혈소판 응집 촉진인자도 함께 존재함을 의미한다. 한편, 열수 추출물의 분획물 중 혈소판 응집저해는 헥센 분획, 부탄올 분획, 에틸아세테이트 분획 순으로 나타났으나, 전체적으로 미약한 활성을 나타내었다.As shown in Table 4, aspirin exhibited excellent human platelet aggregation inhibitory activity and ascertained concentration dependent coagulation inhibitory activity. However, the hot water extracts of kelp and the water residues after organic solvent fraction were found to promote platelet aggregation rather. This suggests that fucoidan, a conventional water-soluble polysaccharide, promotes platelet aggregation (Zhu et al., 2010, Thrombosis Research. 125: 419-426). On the other hand, inhibition of platelet aggregation in the hydrothermal extract fractions was in the order of hexene fraction, butanol fraction, and ethyl acetate fraction, but showed weak activity as a whole.

실시예 3과 실시예 4의 결과를 종합하여 분석하면, 다시마의 열수 추출물 및 유기용매 분획 후의 물 잔류물(전체의 96.5% 차지)은 강한 혈액응고저해 활성을 통해 혈전생성을 억제하더라도, 저농도에서의 강력한 혈소판 응집촉진활성으로 실제적인 항혈전 효과를 기대하기 어려울 것으로 판단된다. 이는 다시마 분말을 5% 농도로 식이공급한 마우스의 경우 혈류개선에는 유의적인 변화가 나타나지 않은 보고(강민숙 외, 2001, 한국영양학회지, 34: 141-149)와 일치한다. 그러나, 다시마 열수 추출물로부터 순차적으로 얻어진 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물은 우수한 혈액응고저해를 나타내면서도 혈소판 응집 촉진 활성을 나타내지 않아 실제적 항혈전 활성이 기대된다. 특히, 다시마 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획은 수율이 높고, 활성이 가장 강력하여, 향후 신규 항혈전제로 개발이 유망하며, 이러한 활성은 트롬빈 및 혈액응고인자 저해에 의한 것임을 확인하였다.Analysis of the results of Example 3 and Example 4 showed that even though the hot water extract of sea tangle and the water residue (accounting for 96.5% of the total) after the organic solvent fraction inhibited thrombus formation through strong anticoagulant activity, It is difficult to expect a real antithrombotic effect because of its strong platelet aggregation promoting activity. This is consistent with a report in which no significant change in blood flow improvement was observed in mice fed a 5% concentration of kelp powder (Kang, Min-Sook et al., 2001, The Korean Nutrition Society, 34: 141-149). However, the hexane fraction, ethyl acetate fraction and butanol fraction obtained sequentially from the kelp hydrothermal extract do not show platelet aggregation promoting activity while exhibiting excellent blood coagulation inhibition, so that actual antithrombotic activity is expected. In particular, the ethyl acetate fraction of the kelp hydrothermal extract was high in yield and strongest in activity, and it was confirmed that the antithrombotic agent was expected to be developed as a novel antithrombotic agent in the future, and that the activity was due to inhibition of thrombin and blood coagulation factors.

실시예Example 5: 다시마  5: Kelp 열수Heat number 추출물로부터 순차  Sequence from extract 분획된Fractionated 헥센Hexen , 에틸아세테이트 및 부탄올 , Ethyl acetate and butanol 분획물의Fraction 활성물질의 화학적 특성 및 안정성 Chemical properties and stability of active materials

상기 실시예 1에서 얻은 다시마 열수 추출물 및 이의 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 잔류물을 갑압건조하여 분말 조제한 후, 회수된 활성물질을 대상으로 인간 적혈구 용혈활성을 확인하였고, 특히 에틸아세테이트 분획물을 대상으로 혈장 안정성, 열 안정성 및 산 안정성을 추가로 확인하였다.The hematopoietic activity of the recovered active substance was confirmed after the crude hot water extract and the hexane fraction, the ethyl acetate fraction, the butanol fraction and the water residue of the tuna hot-water extract obtained in Example 1 were subjected to a pressure-drying to prepare a powder, The fractions were further tested for plasma stability, thermal stability and acid stability.

조정제된 헥센 분획, 에틸아세테이트 분획 및 부탄올 분획의 활성물질은 0.5 mg/ml 농도까지 인간 적혈구에 대한 용혈 활성은 나타나지 않았으며(표 5), 특히, 조정제된 에틸아세테이트 분획의 활성물질은 100℃에서 2시간 처리, pH 2(0.01M HCl)에서의 2시간 처리, 혈장에서 2시간 처리시에도 에이피티 타임으로 측정한 혈액응고 저해활성의 유의적인 감소가 나타나지 않아 높은 안정성을 나타내었다(표 6).The active substances of the adjusted hexene fraction, ethyl acetate fraction and butanol fraction showed no hemolytic activity on human erythrocytes up to a concentration of 0.5 mg / ml (Table 5), and in particular, 2 hours treatment, 2 hours treatment in pH 2 (0.01 M HCl) and 2 hours treatment in plasma showed no significant decrease in blood coagulation inhibition activity measured by apitime (Table 6) .

다시마 Kelp 열수Heat number 추출물 및 유기용매  Extracts and organic solvents 분획물의Fraction 인간 적혈구  Human red blood cells 용혈활성Hemolytic activity 시료 (0.5 mg/ml)The sample (0.5 mg / ml) 인간 적혈구 용혈활성 (%)Human hemolytic hemolytic activity (%) 열수 추출물Hot water extract 0.6±0.70.6 ± 0.7 헥센 분획물Hexene fraction 3.3±0.23.3 ± 0.2 에틸아세테이트 분획물Ethyl acetate fraction 3.1±0.43.1 ± 0.4 부탄올 분획물Butanol fraction 3.2±0.83.2 ± 0.8 물 잔류물Water residue 3.2±0.83.2 ± 0.8 트리톤 X-100 (triton X-100) 0.1%Triton X-100 (0.1% 100±0.0100 ± 0.0 엠포테리신 B (amphotericin B) 0.1 mg/mlAmphotericin B 0.1 mg / ml 100±0.0100 ± 0.0

다시마 Kelp 열수Heat number 추출물의 에틸아세테이트  The ethyl acetate extract 분획물의Fraction 안정성  stability 처리 (1.2mg/ml)Treatment (1.2 mg / ml) 혈액응고 저해활성* Blood coagulation inhibitory activity * 에이피타임 (처리전)APT (before processing) 에이피타임 (처리후)APT (after processing) 100℃, 2시간100 캜, 2 hours 7.7±0.4a 7.7 ± 0.4 a 7.5±0.5 a 7.5 ± 0.5 a pH 2. 2시간pH 2. 2 hours 7.7±0.4 a 7.7 ± 0.4 a 7.2±0.5 a 7.2 ± 0.5 a 혈장, 2시간 Plasma, 2 hours 7.7±0.4 a 7.7 ± 0.4 a 7.7±0.3 a 7.7 ± 0.3 a

혈액응고 저해활성* : 시료 첨가시의 에이피티 타임을 용매 대조구의 에이피티 타임으로 나눈 값
Blood coagulation inhibition activity * : The value obtained by dividing the apical time at the time of adding the sample by the apical time of the solvent control

Claims (3)

다시마(Laminaria japonica) 열수 추출물로부터 얻어진 유기용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. Sea tangle ( Laminaria japonica) a pharmaceutical for the prevention and treatment of thrombosis comprising the organic solvent fraction obtained from the hot-water extract as an active ingredient compositions. 제 1항에 있어서, 상기 유기용매 분획물은 다시마의 열수 추출물을 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차 분획하여 얻어진 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 분획물인 것을 특징으로 하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.[Claim 2] The method according to claim 1, wherein the organic solvent fraction is a fraction selected from the group consisting of a hexane fraction, an ethyl acetate fraction and a butanol fraction obtained by successively fractionating hot water extract of sea tangle with hexene, ethyl acetate and butanol, Or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 제 1항 또는 제 2항에 기재된 유기용매 분획물을 포함하는 건강 기능 식품.A health functional food comprising the organic solvent fraction according to any one of claims 1 to 6.
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