KR20150046709A

KR20150046709A - 세포막결합성 리포좀에 의한 세포변형을 통하여 세포막성 소포에 약물을 포접하는 방법 및 이를 이용한 약물의 전달 방법

Info

Publication number: KR20150046709A
Application number: KR20140032446A
Authority: KR
Inventors: 박지호; 이준성; 김지영
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2013-10-22
Filing date: 2014-03-20
Publication date: 2015-04-30
Also published as: KR101586036B1

Abstract

본 발명은 세포막결합성 리포좀(membrane fusogenic liposome; MFL)을 이용하여 제조된 약물이 포접된 세포막성 수포, 이 세포막성 수포의 제조방법 및 이 세포막성 수포를 이용한 약물전달 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 본 발명의 세포막성 수포는 친수성 약물과 소수성 약물을 동시에 포접할 수 있으며, 세포에서 분리된 세포막성 수포이므로 주변 세포에 좀더 효율적이고 선택적인 약물 전달을 가능하도록 할 뿐만 아니라, 생체에서 기원한 나노재료로 안전하고, 세포막성 수포에 직접 약물을 봉입시키는 단계가 불필요함으로써, 상기 세포막성 수포는 세포막성 수포가 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 다양한 암 및 퇴행성 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

세포막결합성 리포좀에 의한 세포변형을 통하여 세포막성 수포에 약물을 포접하는 방법 및 이를 이용한 약물의 전달 방법{Method of drug loading in cell-derived membrane vesicles by engineering parent cells with membrane fusogenic liposomes and drug delivery method using thereof}

본 발명은 세포막결합성 리포좀(membrane fusogenic liposome; MFL)을 이용하여 세포로 전달된 약물이 그 세포로부터 분비되는 세포막성 수포에 자연스럽게 탑재되는 원리를 이용한 것으로 약물이 포접된 세포막성 수포 제조방법 및 이 세포막성 수포를 이용한 약물전달 방법에 관한 것이다.

세포막성 수포는 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 세포막 구조의 작은 소낭이다. 세포막성 수포의 직경은 대략 30-500 nm인 것으로 보고되어 있다. 세포막성 수포 중 하나인 엑소좀은 전자 현미경을 통한 연구에서 원형질막으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라 다낭체(multivesicular bodies, MVBs)라고 불리는 세포내 특정 구획에서 기원하며 세포 밖으로 방출 또는 분비되는 것으로 관찰되었다. 즉, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면, 그러한 소낭들은 세포 밖 환경으로 방출되는데, 이것을 엑소좀이라고 부른다. 또한 이러한 엑소좀 뿐만 아니라 세포막이 직접 도출되어 생성되는 마이크로수포(microvesicle)도 세포막성 수포중 하나이다. 세포막 이러한 세포막성 수포가 어떤 분자적 기작에 의해 만들어지는지 확실히 밝혀진 바가 없으나, 적혈구 세포뿐만 아니라, B-림프구, T-림프구, 수지상 세포, 혈소판, 대식 세포 등을 포함한 다양한 종류의 면역 세포들과 종양 세포 등도 살아 있는 상태에서 세포막성 수포를 생산하여 분비한다고 알려져 있다. 세포막성 수포는 정상 상태 및 병적 상태, 이 두 가지 모든 상태 하에서 다수의 다른 세포 유형으로부터 분리되어 방출된다고 알려져 있다. 또한, 세포막성 수포에는 면역학적으로 중요한 단백질인 주조직접합체(Major histocompatibility, MHC)와 열충격단백질(heat shock protein, HSP) 등을 포함하고 있다고 알려져 있다.

세포막성 수포는 암 발달에 있어서 중요한 역할을 담당하고 세포막성 수포의 생물학적 분자들의 운반은 면역 회피, 혈관생성 및 암 전이에 기여하기 때문에 암 분야에서 세포막성 수포와 관련된 연구는 활발히 진행되고 있다. 세포막성 수포를 매개로 한 siRNA 치료법은 알츠하이머 질환에 적용되어, 60%의 전사 억제 및 62%의 번역 억제 효과율을 나타낸 바가 보고되었다(Alvarez-Erviti et al., Nat Biotechnol, 2011). 세포에서 분리된 세포막성 수포를 커큐민(curcumin)과 혼합함으로써, 세포막성 수포 내에 캡슐화된 커큐민의 경우 세포막성 수포 내에 존재하지 않을 경우보다 긴 순환기를 나타내었다. 리포 다당류(lipopolysaccharid LPS)에 의한 패혈성 쇼크 마우스 모델에서 치료 효과를 보였다(Sun D et al., Molecular therapy, 2010).

이에 생체 내 이중지질막 구조로 이루어진 세포막성 수포에 약물을 포접시키고자 노력해왔는데, 지금까지는 세포로부터 세포막성 수포를 분리하고, 이 분리된 세포막성 수포에 생체 외(ex vivo)에서 약물을 포접시키는 방법이 보고되었으나, 세포막성 수포 표면에 약물이 포접됨으로써 아직까지 응집현상(aggregation)이 일어나 초원심분리시 침전이 생겨 세포막성 수포를 분리하기가 어렵고, 단백질 또는 세포막성 수포의 구조 손상이 일어나며, 친수성 및 소수성 약물의 동시 포접 불가능하다는 여러 가지 한계점이 존재하였다. 이에 본 발명자들은 분리된 세포막성 수포에 약물을 포접시키는 것이 아니고, 세포내부에서 자연스럽게 약물이 포접된 세포막성 수포를 분리시켜 수집함으로써 세포막성 수포 응집현상을 방지하고 세포막성 수포 고유의 성질을 그대로 유지한 채 약물을 탐재시키는 방법을 고안하게 되었다.

이에, 본 발명자들은 세포에서 분비되는 세포막성 수포(엑소좀을 포함한 세포로부터 분비되는 세포막으로 구성된 모든 수포)에 약물을 함유시키기 위한 새로운 방법을 개발하고자 세포막결합성 리포좀(membrane fusogenic liposomes; MFLs)을 이용하여 친수성 약물을 세포질로 소수성 약물을 세포막으로 전달하게 된다면 이렇게 전달된 두가지 약물들이 세포내에서 자연스럽게 세포막성수포의 내부 및 막에각각 포접될 것으로 예측하고 실험을 진행하였다. 그 결과, 친수성 또는 소수성 약물을 함유하는 세포막결합성 리포좀을 세포에 처리함으로써 처리된 세포에서 친수성 또는 소수성 약물을 함유하는 세포막성 수포가 분비됨을 확인하였다. 이와 같이 하여 제조된 세포막성 수포는 생체에서 기원되어 안전성이 확보되고, 소수성 제제 및 친수성 약물을 동시에 전달할 수 있을 뿐만 아니라, 종래 세포막성 수포를 분리한 후 약물을 포접시키는 방법과 달리, 세포막성 수포의 외부 단백질에 손상을 입힐 우려가 적고, 생체안전한 리포좀을 이용하므로 생체 내 실험이나 임상에도 적용이 보다 용이하게 되었다. 본 발명의 약물을 포접한 세포막성 수포는 원발병소 및 전이병소를 효과적으로 치료할 수 있음으로써 세포막성 수포가 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 다양한 질환에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 목적은 생체 내외에서 원하는 약물을 포접시킨 리포좀을 세포에 처리하여 세포로부터 약물이 포접된 세포막성 수포를 제공받는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포막성 수포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 세포로부터 약물을 포접한 세포막성 수포를 방출시킬 수 있는 리포좀을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 리포좀 또는 세포막성 수포를 이용하는 약물전달 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 리포좀 또는 세포막성 수포를 포함하는 약물전달용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 리포좀 또는 세포막성 수포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 리포좀 또는 세포막성 수포를 포함하는 항생제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 리포좀 또는 세포막성 수포를 포함하는 광민감제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은

1) 이중지질막으로 구성되며, 이중지질막에는 소수성 약물, 이중지질막 내부에는 친수성 약물을 포접하며 세포막에 융합하여 상기 소수성 약물 또는 친수성 약물을 포접하는 세포막성 수포를 분비시키는 리포좀(liposome)을 제조하는 단계;

2) 단계 1)의 리포좀을 세포에 처리하여 세포로부터 세포막성 수포를 방출시키는 단계; 및

3) 단계 2)에서 방출된 세포막성 수포를 수집하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 약물이 함유된 세포막성 수포의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 이중지질막으로 구성되며, 이중지질막에는 소수성 약물, 이중지질막 내부에는 친수성 약물을 포접하며 세포막에 융합하여 상기 소수성 약물 또는 친수성 약물을 포접하는 세포막성 수포를 분비시키는 것을 특징으로 하는 리포좀을 제공한다.

또한, 본 발명은 이중지질막은 PEG 및 DOTAP가 결합된 지질로 구성되며, 친수성 또는 소수성 약물이 포접된 세포막결합성 리포좀(membrane fusogenic liposome; MFL)을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 리포좀 또는 상기 세포막성 수포를 포함하는 약물전달용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 리포좀 또는 상기 세포막성 수포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 리포좀 또는 상기 세포막성 수포를 포함하는 항생제를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 리포좀 또는 상기 세포막성 수포를 포함하는 광민감제를 제공한다.

본 발명의 세포막성 수포는 친수성 약물과 소수성 약물을 동시에 포접할 수 있으며, 세포에서 분리된 세포막성 수포(엑소좀)이므로 주변 세포에 좀더 효율적이고 선택적인 약물 전달을 가능하도록 할 뿐만 아니라, 생체에서 기원한 나노재료로 안전하고 세포막성 수포에 직접 약물을 봉입시키는 단계가 불필요함으로써, 상기 세포막성 수포는 세포막성 수포가 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 다양한 암 및 퇴행성 질환 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 B16F10, CT26, Hela 세포주에 DiI(적색)가 함유된 세포막결합성 리포좀(MFL), 비결합성 리포좀(NFL) 및 PLGA 나노입자(NP)를 각각 30 분 동안 처리한 다음 공초점 현미경으로 관찰(청색: hoechst로 염색된 세포핵)한 도이다.
도 2는 HeLa 세포에 세포막결합성 리포좀(MFL) 및 비결합성 리포좀(NFL)을 처리한 다음, 시행한 결합능 검사(fusion assay) 결과를 나타낸 도이다:
FD: R18 염료(dye)의 형광 증가량(세포막과 결합을 이루면서 형광이 증가함).
도 3은 세포막결합성 리포좀(MFL)은 세포막으로 전달하기 위해 이중지질막에 소수성 물질(Dil 또는 ZnPc)을 함유하고, 세포질 내로 전달하기 위해 상기 리포좀의 내부에 친수성 물질(칼세인; Calcein)을 포함하는 것을 설명한 도이다.
도 4는 Hela, B16F10, CT26 암세포주에서 Dil 및 칼세인을 함유하는 MFL 또는 NFL을 함께 넣고 30분 동안 배양한 다음, 세척한 세포에서 Dil 및 칼세인을 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 처리한 리포좀의 종류와 상관없이 Hela, B16F10, CT26 암세포주에서 세포막성 수포의 양은 유사함을 나타낸 도이다.
도 6은 리포좀의 이중지질막에 포접된 Dil이 세포막성 수포로 전달된 효율을 확인한 도이다.
도 7은 리포좀 내부에 포접된 칼세인이 세포막성 수포로 전달된 효율을 확인한 도이다.
도 8은 세포막결합성 리포좀(MFL)을 처리한 Hela, B16F10, CT26 각각의 암세포주에서 세포막성 수포를 투과전자현미경(TEM)으로 확인한 도이다.
도 9는 세포막결합성 리포좀(MFL)을 처리한 Hela, B16F10, CT26 각각의 암세포주에서 세포막성 수포의 크기를 동적 광산란(dynamic light scattering)으로 측정한 결과, 세포막성 수포의 크기가 평균 80 내지 100 nm임을 확인한 도이다.
도 10은 Hela, B16F10, CT26 각각의 암세포주에 세포막결합성 리포좀(MFL) 처리 유무에 따른 세포막성 수포 단백질의 분포 경향을 쿠마시브릴리언트블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색을 통해 확인한 도이다.
도 11은 세포막결합성 리포좀(MFL)을 처리한 Hela, B16F10, CT26 암세포에서 분리한 세포막성 수포에 대하여 엑소좀 특이적 단백질 CD63의 발현량을 웨스턴 블럿(western blot)으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 Hela, B16F10 및 CT26 세포에 세포막결합성 리포좀(MFL), 비결합성 리포좀(NFL) 및 PLGA 나노입자(NP, Dil만을 함유)을 처리한 다음, 분리한 세포막성 수포(400 μg)에서의 DiI 형광 강도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 DiI와 칼세인 형광물질이 포접된 세포막결합성 리포좀(MFL) 또는 비결합성 리포좀(NFL)을 30 분 동안 위쪽 필터에 있는 세포에 처리하고 세포와 반응하지 않은 리포좀들은 모두 제거한 후, 48 시간 동안 리포좀이 처리된 위쪽 세포로부터 방출되는 세포막성 수포들이 400 nm 구멍을 통하여 아래쪽 세포로 전달되는 것을 보여주는 것으로, 세포막결합성 리포좀에 의해 형광물질이 세포로 전달되면 이 세포가 방출하는 세포막성 수포에 의해 형광물질이 또 다른 세포로 전달됨을 보여주는 도이다.
도 14는 상기 도 13과 같은 방법으로 실시한 결과, 위쪽 필터의 배지 및 아래쪽 트랜스웰의 세포에서 리포좀(MFL 및 NFL)에 의해 전달된 물질(Dil 및 Calcein)에 대한 형광 강도를 비교한 도이다.
도 15는 Hela 세포에 세포막성 수포가 제거된 배지를 처리한 결과, 칼세인 또는 Dil 형광이 나타나지 않음을 나타낸 도이다.
도 16은 Hela, B16F10 및 CT26 세포에 광과민제(ZnPc)가 함유된 세포막결합성 리포좀(MFL) 및 비결합성 리포좀(NFL)을 처리한 다음 공초점 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 분리한 세포막성 수포(400 μg)에서 광과민제(ZnPc)의 형광 강도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 ZnPc가 포접된 세포막결합성 리포좀(MFL) 또는 비결합성 리포좀(NFL)을 30 분 동안 위쪽 필터에 있는 세포에 처리하고 세포와 반응하지 않은 리포좀들은 모두 제거한 후, 48 시간 동안 리포좀이 처리된 위쪽 세포로부터 방출되는 세포막성 수포들이 400 nm 구멍을 통하여 아래쪽 세포로 전달되는 것을 보여주는 것으로, 세포막결합성 리포좀에 의해 ZnPc가 세포로 전달되면 이 세포가 방출하는 세포막성 수포에 의해 ZnPc가 또 다른 세포로 전달된 다음, 세포막성 수포에 의해 ZnPc가 전달된 아래쪽 트랜스웰에 있는 세포 전체에 대하여 5 분 동안 660 nm 레이저(laser source) 처리를 하여 상기 세포의 생존능을 확인하는 방법을 나타낸 도이다.
도 19는 상기 도 18과 같은 방법으로 실시한 결과, 위쪽 필터 및 아래쪽 트랜스웰의 세포에서 레이저 처리 유무에 따른 세포 생존율을 비교한 도이다.
도 20는 세모막결합성 리포좀에 의한 세포변형을 통하여 약물을 세포에서 분비하는 세포막성 수포에 자연적으로 포접하는 방법의 개략도를 보여주는 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 약물이 포접된 세포막성 수포(membrane vesicle), 구체적으로 엑소좀(exosome)을 제공한다.

본 발명의 세포막성 수포는 세포막으로부터 분비된 것이므로 세포막의 이중지질층으로 구성되어 있다.

본 발명의 리포좀(liposome)은 세포의 이중지질막으로 구성되며, 이중지질막 내부에는 소수성 약물, 이중지질막 내부에는 친수성 약물을 포접하며, 세포막에 융합하여 상기 소수성 약물 또는 친수성 약물을 포접하는 세포막성 수포를 분비시킬 수 있다.

리포좀의 이중지질막은 세포의 이중지질막과 유사한 성분으로 구성되고, 구체적으로 기본 지질(base lipid) 및 PEG(polyethylene glycol; 폴리에틸렌 글리콜)가 결합된 지질로 구성되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

따라서 본 발명의 세포막성 수포는 친수성 약물 또는 소수성 약물을 포접할 수 있고, 생체 내에 존재하는 이중지질막 구조로서 합성 리포좀에서 일어나는 응집현상이 일어나지 않는 장점이 있다.

상기 세포막성 수포는 생체 내 물질이므로 합성된 리포좀에 비하여 생체 내에서 응집이 일어나지 아니하고, 세포의 세포내식작용(endocytosis)에 의해 세포 내로 쉽게 들어가므로 세포 내로의 약물전달을 용이하게 할 수 있다.

또한 세포막성 수포의 불규칙한 확산이나 순환에 의해 이동하는 것이 아니라 특정한 목적과 표적을 향해 이동시킬 수 있다(Peinado et al., Nature medicine, 2012; Zhu et al., Small, 2012; Mittelbrunn et al., Nature communications, 2011).

세포막성 수포의 크기는 80 내지 100 mm인 것이 바람직하나(도 9 참조), 이에 한정되지 않는다.

상기 세포막성 수포는 친수성 약물이나 소수성 약물을 각각, 또는 동시에 포접시킬 수 있다.

상기 세포막성 수포는 공지의 방법에 의하여 세포막성 수포 특수 타겟 조직이나 세포로 이동시킬 수 있다.

상기 친수성 약물 또는 소수성 약물은 세포막 염료, 광과민제(photosensitiser), 항암제, 항생제(antibiotics)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 항암제는 칼세인(Calcein), 젬시타빈(gemcitabine), 부술판(Busulfan), 클로람부실(Chlorambucil), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 멜파란(Melphalan), 시스플라틴(Cisplatin), 이포스파미드(Ifosfamide), 시타라빈(Cytarabine), 5-플루오로우라실(5-FU), 메토트렉세이트(Methotrexate; MTX), 다우노루비신(Daunorubicin), 아드리아마이신(Adriamycin), 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 빈데신(Vindesine), 프로카바진(Procarbazine), 타목시펜(Tamoxifen), 메게스테롤 아세테이트(Megesterol acetate), 플루타미드(Flutamide) 및 고세렐린 아세테이트(Gosereline acetate, Zoladex)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 암은 폐암, 고환암, 방광암, 전립선암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 췌장암, 피부암, 위암 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 항생제는 페니실린(penicillin)계 항생제, 세팔로스포린(cephalosporine)계 항생제, 마크로라이드(macrolide)계 항생제, 테트라시클린(tetracycline)계 항생제, 퀘놀론(quinolone)계 항생제, 항히스타민제, 항균제, 클린다마이신(clindamycin), 메트로니다졸(metronidazole), 클로람페니콜(chloramphenicol), 악티노마이신-D(Actinomycin-D), 블레오마이신(Bleomycin) 및 미토마이신-C(Mitomycin-C)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 하기 단계로 구성되는 약물이 함유된 세포막성 수포의 제조방법을 제공한다:

1) 이중지질막으로 구성되며, 이중지질막에는 소수성 약물, 이중지질막 내부에는 친수성 약물을 포접하며 세포막에 융합하여 상기 소수성 약물 또는 친수성 약물을 포접하는 세포막성 수포를 분비시키는 리포좀을 제조하는 단계;

3) 단계 2)에서 방출된 세포막성 수포를 수집하는 단계.

리포좀은 세포내식작용에 의해 세포 내부로 들어가게 됨으로써, 포접된 약물을 전달하게 된다.

본 발명의 리포좀은 세포 내부로 들어가지 못하고 세포막에 결합된다.

상기 이중지질막은 기본 지질 및 PEG가 결합된 지질로 구성되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 기본 지질은 세포막과 동일한 성분으로 구성되어 있으며, 포스파티딜콜린(phosphatidicolin) 및 포스포에탄올아민(phosphoethanolamine) 계열의 모든 인지질로 구성된 군으로부터 하나 이상의 인지질로 구성된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 PEG는 시판되는 것을 사용할 수 있으며, 말단이 메톡시기(methoxy group)로 구성되고, 사슬(chain)의 길이가 2,000인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 일반적으로 리포좀을 페길화(PEGylation)하는 경우, RES의 식균세포에 의한 파괴를 방지하는 효과를 가져와 혈액 내 체류시간을 증가시키는 장점을 갖는다.

상기 기본 지질 및 PEG가 결합된 지질은 50 내지 80 중량부 및 1 내지 20 중량부인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 리포좀의 크기는 115 내지 125 mm인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

리포좀은 보통 면역세포의 세포내식작용에 의해 분해되는데, 리포좀의 구성성분으로 PEG이 함유되면 세포에 의한 세포내식작용이 저해되어 순환기가 증가하게 된다(Bailon P et al., Bioconjugate Chem., 2001).

상기 리포좀의 순환기는 330 분 내지 350 분인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 이중지질막은 양전하가 부하된 지질(Positively charged lipid)을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 기본 지질: PEG가 결합된 지질:양전하가 부하된 지질은 60 내지 90 중량부:1 내지 10 중량부:5 내지 30 중량부이다. 바람직하기로는 70 내지 85 중량부:1 내지 5 중량부:10 내지 25 중량부이고, 더욱 바람직하기로는 70 내지 80 중량부:1 내지 5 중량부:15 내지 25 중량부이다.

본 발명의 양전하가 부하된 지질은,

18:1 TAP(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane),

14:0 TAP(1,2-dimyristoyl-3-trimethylammonium-propane),

16:0 TAP(1,2-dipalmitoyl-3-trimethylammonium-propane),

18:0 TAP(1,2-stearoyl-3-trimethylammonium-propane),

18:0 DDAB(Dimethyldioctadecylammonium),

12:0 EPC(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine),

14:0 EPC(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine),

14:1 EPC(1,2-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine),

16:0 EPC(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine),

18:0 EPC(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine),

18:1 EPC(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine),

16:0-18:1 EPC(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine) 및

DOTMA(1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 리포좀의 표면 전위는 (+) 50 mV이나, 본 발명의 세포막결합성 리포좀의 표면 전위는 10 내지 20 mV이다. 리포좀의 표면 전위가 10 mV 이하이면 세포막과 결합하지 않고, 20 mV 이상이면, 세포내식작용에 의해 세포 내부로 들어간다. 바람직하기로는 리포좀의 표면 전위가 12 내지 20 mV이고, 보다 바람직하기로는 16 내지 20 mV이다.

상기 리포좀은 세포막결합성 리포좀(membrane fusogenic liposome; MFL)인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 세포막결합성 리포좀의 이중지질막은 PEG 및 DOTAP(N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)]-N,N,N-trimethylammonium propane methyl sulphate; N-[1-(2,3-디올레오일옥시)]-N,N,N-트리메틸암모늄 프로판 메틸 설파이트)가 결합된 지질로 구성되고, 친수성 또는 소수성 약물이 포접될 수 있다.

상기 PEG 및 DOTAP가 결합된 지질은 3 내지 8 중량부 및 15 내지 48 중량부인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

리포좀에 포접되는 약물에는 친수성 약물 또는 소수성 약물 중 어느 하나 이상이 바람직하고, 세포막 염료, 광과민제, 항암제, 항생제 중 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 항암제는 칼세인, 젬시타빈, 부술판, 클로람부실, 시클로포스파미드, 멜파란, 시스플라틴, 이포스파미드, 시타라빈, 5-플루오로우라실, 메토트렉세이트, 악티노마이신-D, 블레오마이신, 다우노루비신, 아드리아마이신, 미토마이신-C, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 프로카바진, 타목시펜, 메게스테롤 아세테이트, 플루타미드 및 고세렐린 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 항생제는 페니실린계 항생제, 세팔로스포린계 항생제, 마크로라이드계 항생제, 테트라시클린계 항생제, 퀘놀론계 항생제, 항히스타민제, 항균제, 클린다마이신, 메트로니다졸, 클로람페니콜, 악티노마이신-D, 블레오마이신 및 미토마이신-C로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 세포막결합성 리포좀은 우수한 세포막에 대한 결합능을 가지며, 세포에 처리될 경우 함유하고 있는 소수성 약물 또는 친수성 약물은 세포막과 세포질로 각각 전달하여 세포막에서 분비되는 세포막성 수포에 높은 수율로 약물이 봉입되게 한다. 그리고 분비된 세포막성 수포는 주변 세포 내로 쉽게 들어가므로 세포막 융합성 리포좀에 포접된 약물을 세포 내로 전달하게 된다.

상기한 바와 같이 세포막결합성 리포좀을 생체 내에 투여하면 됨으로써, 상기 세포막결합성 리포좀은 그 차제로 우수한 약물전달제이다.

또한, 본 발명에서는 생체 외에서 세포에 약물이 포접된 세포막결합성 리포좀을 투여하여 약물이 포접된 세포막성 수포를 분비시키고 이를 수집하여 인체에 투여함으로써 원하는 부위에 약물을 전달시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 리포좀 또는 상기 세포막성 수포를 포함하는 항생제용 약학적 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 리포좀 또는 상기 세포막성 수포를 포함하는 광민감제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 세포막결합성 리포좀이 세포와 결합되지 않고 내부로 들어가는 비결합성 리포좀(nonfusogenic liposome; NFL)이나 소수성 물질의 전달체로 자주 쓰이는 생분해성 PLGA 나노입자와 비교하여 세포막과의 결합능이 유의적으로 우수함을 확인하였다(도 1 참조). 또한, 비결합성 리포좀과 비교하여, 세포막결합성 리포좀의 크기 및 표면 전위는 감소하고, 반감기는 약 6배나 증가함을 확인하였다(표 1 참조). 또한, 암세포에 MFL 및 NFL을 처리하여 결합능을 검사한 결과, MFL이 유의적인 수준으로 세포막에 더 잘 결합함을 확인하였다(도 2 참조). 또한, Dil 및 칼세인을 함유하는 MFL 또는 NFL을 암세포에 넣고 배양한 다음, 세척한 세포에서 Dil 및 칼세인의 형광 강도를 측정한 결과, MFL의 경우에 Dil은 세포막에서, 칼세인은 세포질에서 특이적으로 발광함을 확인하였고, 리포좀을 세척하여 제거하였음에도 그 형광이 남아있음으로써, 소수성 약물로 Dil 및 친수성 약물로 칼세인을 포접한 세포막결합성 리포좀이 세포에 Dil 및 칼세인을 운반함을 확인하였다(도 4 참조).

또한, MFL 및 NFL을 처리한 여러 암세포에서 분리한 세포막성 수포에 있어서, 처리한 리포좀의 종류와 상관없이 세포막성 수포의 양이 유사함을 확인하였다(도 5 참조). NFL을 처리한 양에 따른 세포막성 수포 내부의 DiI 형광량 측정 결과를 통해 MFL의 세포막 결합능이 세포내부로 흡수되는 것보다 더욱 효과적임을 확인하였다(도 12 참조). 세포막성 수포 내 Dil 및 칼세인의 형광을 측정한 결과, 비결합성 리포좀을 처리한 경우 및 무처리군과 비교하여 세포막결합성 리포좀을 처리한 경우에 유의적으로 높은 형광 강도를 확인하였다(도 6 및 도 7 참조). 또한, 세포막결합성 리포좀을 처리한 세포에서 세포막성 수포의 모습을 투과전자현미경으로 관찰한 결과, 기존에 보고된 일반적인 세포에서의 세포막성 수포의 모습과 유사함을 확인하였고(도 8 참조), 세포막성 수포 크기에 있어서 평균적으로 80 내지 100 nm 범위 내에 유사한 분포 경향으로 존재함을 확인하였다(도 9 참조). 분리한 세포막성 수포에 함유된 단백질을 SDS-PAGE 젤에서 크기별로 분리하여 관찰한 결과, MFL처리 유무에 따른 유의적인 단백질 분포 차이를 발견하지 못하였으며(도 10 참조), 엑소좀 특이적 단백질인 CD63이 공통적으로 유의적인 발현량을 보임을 확인하였다(도 11 참조).

본 발명의 구체적인 실시예에서, 배지를 이용하여 리포좀에 포접한 물질 대한 형광 강도를 비교한 결과, MFL을 이용한 경우 아래쪽 배지에서 상기 포접한 물질이 유의적인 수준으로 높음을 확인함으로써 MFL이 포접한 물질이 효율적으로 운반됨을 확인하였다(도 14 및 도 15 참조). 또한, MFL이 세포막성 수포로 항암 약물도 전달할 수 있는지 여부를 확인하기 위해 광과민제(ZnPc)가 함유된 MFL을 제작하고 이를 세포에 처리하여 세포막과 잘 결합함을 확인하였다(도 16 및 도 17 참조). 상기 위쪽 필터의 배지 및 아래쪽 트랜스웰의 배지에 광과민제 처리의 유무에 따른 세포 생존율을 비교한 결과, 광과민제가 포접된 세포막결합성 리포좀을 처리한 세포로부터 분비된 광과민제를 포함하는 세포막성 수포가 유의적인 수준으로 아래쪽 트랜스웰로 이동됨으로써, 레이저가 위쪽 필터 및 아래쪽 트랜스웰 둘 다에서 유의적으로 세포의 광역학적 파괴를 야기하고, 광과민제가 포접된 세포막결합성 리포좀을 암세포에 처리함으로써 광역학적 암 치료에 응용될 수 있음을 확인하였다(도 19 참조).

따라서, 본 발명의 세포막결합성 리포좀은 우수한 세포막에 대한 결합능을 가지며, 세포에 처리될 경우 함유하고 있는 소수성 제제 및 친수성 제제를 동시에 주변의 원형질막 및 세포질에 운반함으로써 효율적이고 선택적인 약물 전달을 가능하도록 할 뿐만 아니라, 생체에서 기원한 나노재료로 안전하고 응집현상이 일어나지 아니하여 순환이 잘 되므로 세포막성 수포가 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 다양한 암 및 퇴행성 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 약물 전달용 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 예를 들어 하나 이상의 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 덱스트린, 글리세롤, 에탄올뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다. 이러한 조성물은 투여 후 활성 성분의 빠른 방출, 또는 지속적이거나 지연된 방출을 제공하도록 제제화될 수 있다.

약제학적으로 허용가능한 담체는 당업자에게 잘 알려진 여러 가지 인자에 따라 제조될 수 있는데, 예를 들면 이용된 특정 생리활성물질, 이의 농도, 안정성 및 의도된 생체이용성; 본 발명의 세포막결합성 리포좀으로 치료하고자 하는 질환 및 질병 또는 상태; 치료받을 개체, 나이, 크기 및 일반적인 상태; 조성물을 투여하는데 이용되는 경로, 예를 들어 비강, 구강, 안구, 국소, 경피 및 근육 등의 요인을 고려해야 하나, 이에 제한되지는 않는다. 일반적으로 경구 투여 경로 이외의 생리활성물질 투여에 이용되는 약제학적으로 이용가능한 담체에는 D5W, 덱스트로즈 및 생리학적 염을 용적의 5% 이내로 포함하는 수용액을 포함한다. 또한 약제학적으로 이용가능한 담체에는 보존제 및 항산화제와 같은 활성 성분들의 안정성을 보강시킬 수 있는 추가 성분들을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 약물 전달용 조성물의 투여량은 의도하는 치료에 유효한 용량으로 투여된다. 특정의 의학적 질환을 치료하거나 또는 이의 진행을 억제시키는데 요구되는 치료상 유효량은 의학 분야에 공지된 예비임상 연구 및 임상연구를 이용하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명에서 상기 치료상 유효량은 임상의 또는 연구자가 목적하는, 특정 조직, 시스템, 및 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 유발시키는 활성 성분의 양을 말한다. 본 발명의 약물 전달용 조성물의 투여 경로는 적합한 모든 투여 경로가 이용될 수 있다. 본 발명에 따른 세포막결합성 리포좀은 세포막 또는 조직막에 융합되어 세포내식작용에 의해 세포 내부로 유입될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 세포 배양

암세포(HeLa, B16F10, CT26), 섬유아세포(L929) 및 큰포식세포(Raw 264.7)를 공통적으로 습도 100%, CO2 5% 및 온도 37℃ 조건의 인큐베이터(Thermo scientific)에서 배양하였다. 또한, 종양 세포를 멤브레인 필터(membrane filter) 및 트랜스웰(transwell)의 낮은 챔버(lower chamber)에서 배양하였다. 구체적으로, HeLa 세포, B16F10 피부암 세포 및 Raw 264.7 큰포식세포는 10% (v/v) FBS(fetal bovine serum) 및 1% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin; Life Technologies Inc., Carlsbad, CA, USA)을 포함하는 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; Welgene, 대구, 대한민국)에서 배양하였다. CT26 결장선암 세포 및 L929 섬유아세포는 10% (v/v) FBS 및 1% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute; Welgene, 대구, 대한민국)에서 배양하였다.

< 실시예 2> 리포좀 구성 비율에 따른 리포좀의 특성 확인

엑소좀을 분리 후 형광표지자를 결합하는 기존 방법 대신, 엑소좀이 세포막에서 기원된다는 점에 착안하여, 세포막을 소수성 염료로 염색한 다음 세포막성 수포를 분리하여 생체 내에서 분비되는 세포막성 수포(엑소좀)에도 약물이나 형광표지자가 존재하는 성질을 이용하여, 생체 내에서 분비되는 세포막성 수포에도 약물이나 형광표지자를 함유시키기 위해 세포 내부로 들어가지 않고 세포막에 결합하는 성질을 가진 리포좀을 선별하였다.

구체적으로, 먼저 유기용매에 녹아있는 지질들(Avanti polar lipids, Alabaster, Alabama USA)을 모두 섞은 다음 유기용매를 완전히 제거하였다. 그런 다음 지질 케이크(lipid cake)를 만들고, 이후 수화(hydration) 과정을 통해 리포좀이 형성되도록 하였다. 마지막으로 리포좀의 크기를 약 100 nm로 만들기 위해 100 nm 멤브레인 필터(membrane filter)를 이용하여 당업계에 알려진 압출(extrusion) 방법을 수행하였다. 또한, PLGA 나노입자를 제작하기 위하여 당업계에 잘 알려진 에멀전(emulsion) 형성 방법을 이용하여 제작하였다. 또한, PEG(polyethylene glycol)의 양은 고정하고 DOTAP(N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)]-N,N,N-trimethylammonium propane methyl sulphate)의 양을 변화하면서 세포막에 가장 효과적으로 결합하는 성질을 가지는 리포좀을 융합 검사(fusion assay)를 이용하여 정량적으로 선별 및 공초점 현미경(confocal microscopy; TCS SP8 X, Leica, Wetzlar, Germany)을 이용하여 세포막결합성을 확인하였다. 구체적으로, X 63 oil-immersion 광학 렌즈(objective lense)를 이용하여 측정하였으며 리포좀을 세포에 30분간 처리한 후 세포와 반응하지 않은 리포좀을 제거한 후 살아있는(live) 상태에서 세포를 이미징하였다. R18(self-quenching lipid dye octadecyl rhodamine B, Invitrogen, Grand Island, NY, USA)를 리포좀에 함유시킨 다음, 이를 세포에 처리하여 실시간으로 분광형광계(spectrofluorometer, Molecular Device, Sunnyvale, CA)를 이용하여 실시간으로 형광의 증가량을 측정함으로써 결합능을 정량적으로 분석하였다. 또한, 리포좀의 크기 및 표면 전위는 동적 광산란(dynamic light scattering)을 Zetasizer Nano ZS90(Malvern Instruments, Worcestershire, UK)으로 측정하였다.

그 결과, 도 1 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 리포좀의 구성 비율을 달리하여 크기 및 표면전위를 조절한 결과, 리포좀 내 DOTAP의 비율이 0인 리포좀 L4와 비교하여, DOTAP의 비율을 높임으로써 표면전위 값을 15 내지 17 mV로 조절할 수 있음을 확인하였다(표 1). 또한, 리포좀을 처리한 세포에서 측정한 결과, DMPC 및 PEG-PE만으로 구성된 L4의 경우에도 DiI의 형광 세기 값이 측정되었으며, 이와 비교하여 DOTAP의 비율을 높임으로써 리포좀의 표면 전위값이 증가할수록 DiI의 형광 세기 또한 유의적으로 증가함을 확인하였다(도 1).

< 실시예 3> 세포막결합성 리포좀( membrane fusogenic liposome ; MFL )의 세포막 결합능 확인

상기 <실시예 2>에서 비교한 리포좀 중 세포막결합능이 가장 높은 리포좀을 세포막결합성 리포좀으로 명명하였고, 세포막 결합능을 확인하기 위해 융합 검사를 실시하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 1>과 같은 조건에서 배양한 Hela, CT26 및 B16F10 암세포주에 적색으로 염색한 DiI이 포접된 세포막결합성 리포좀(MFL) 0.14 × 10-6 몰(mole), 비결합성 리포좀(NFL) 0.14 × 10-6 몰 및 PLGA 나노입자(NP) 35 ㎍을 각각 30 분 동안 처리한 후, 세포와 반응하지 않은 리포좀을 제거하였다. 그런 다음 48 시간 이후 세포의 상층액으로부터 초원심분리기(Ultracentrifuge)를 이용하여 세포막성 수포를 분리하였다. MFL, NFL 및 PLGA 나노입자를 처리한 각각의 B16F10, CT26, Hela 암세포에서 리포좀이 세포막과 결합한 정도를 확인하고자, 시료를 공초점 현미경으로 관찰하였다. 또한, HeLa 세포에 MFL 및 NFL을 30 분 동안 처리한 시료를 대상으로 상기 <실시예 2>와 같은 방법으로 융합 검사를 실시하였다. 또한, 세포막결합성 리포좀 이중지질막에 소수성 물질(Dil 또는 ZnPc)을 함유하고, 상기 리포좀의 내부에 친수성 물질(칼세인; Calcein)을 포함하도록 제작하였다(도 3). 그런 다음, Hela, B16F10, CT26 암세포주에서 Dil 및 칼세인을 함유하는 MFL 또는 NFL을 함께 넣고 30분 동안 배양한 다음, 세척한 세포에서 Dil 및 칼세인을 관찰하였다. 또한, 리포좀의 크기 및 표면전위는 상기 <실시예 2>와 같은 방법으로 측정하였다. 순환기는 마우스의 꼬리 정맥에 리포좀 및 PLGA를 주입한 다음, 일정 시간 동안 마우스로부터 혈액을 채취하여 혈액 내에 존재하는 DiI의 형광 세기를 분광형광계(spectrofluorometer, Molecular Device, Sunnyvale, CA)로 측정하였다. 측정된 값을 토대로 반감기를 계산하여 순환기를 산정하였다.

그 결과, 도 2, 표 2 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 세포막결합성 리포좀이 세포와 결합되지 않고 내부로 들어가는 비결합성 리포좀(nonfusogenic liposome; NFL)이나 소수성 물질의 전달체로 자주 쓰이는 생분해성 PLGA 나노입자와 비교하여 세포막과 유의적으로 더욱 잘 결합함을 확인하였다(도 2A). 또한, 비결합성 리포좀과 비교하여, 세포막결합성 리포좀의 크기는 평균 4.5 nm가 작고, 표면 전위는 약 30%정도이며, 반감기는 약 6배임을 확인하였다(표 2). HeLa 세포에 MFL 및 NFL을 처리한 후, 결합능 검사를 실시한 결과, MFL이 유의적인 수준의 세포막 결합능을 가짐을 확인하였다(도 2B). 또한, Dil 및 칼세인을 함유하는 MFL 또는 NFL을 함께 세 가지 다른 암세포주에 넣고 배양한 다음, 세척한 세포에서 Dil 및 칼세인 형광 강도를 관찰한 결과, MFL의 경우에 Dil의 적색 형광은 세포막에서, 칼세인의 녹색 형광은 세포질에서 특이적으로 발광함을 확인하였고, 리포좀을 세척하여 제거하였음에도 그 형광이 남아있음으로써, Dil 및 칼세인을 포접한 세포막결합성 리포좀이 세포에 Dil 및 칼세인을 효율적으로 운반함을 확인하였다(도 4).

< 실시예 4> 세포막결합성 리포좀을 처리한 세포에서 분리한 세포막성 수포의 물리적 특징 확인

상기 <실시예 3>에서 확인한 세포막결합성 리포좀을 처리를 통한 Dil 및 칼세인의 세포 전달에 있어서, Dil 및 칼세인이 세포로 전달되어 세포막성 수포에 포함되어 있는지를 확인하기 위하여, Dil 및 칼세인을 포접한 세포막결합성 리포좀 또는 비결합성 리포좀을 처리한 세포에서 세포막성 수포를 분리하고, 세포막성 수포의 양, 모양, 크기 및 세포막성 수포 내 Dil 및 칼세인의 형광 발광 정도를 비교하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 3>과 같은 방법으로 Dil 및 칼세인을 포접한 세포막결합성 리포좀 또는 비결합성 리포좀을 처리하고 Hela, CT26 및 B16F10 암세포주를 48 시간 동안 배양하였다. 먼저 세포막성 수포를 분리하기 위하여 분별 원심분리를 실시하였다. 구체적으로, 48 시간 동안 배양한 세포 배양액을 수확한 다음, 4℃에서 300 g로 5 분 - 200g로 20 분 - 10,000 g로 30 분 동안 원심분리하여 세포와 찌꺼기(debri)를 제거하였다. 이후 세포막성 수포를 분리하기 위해 초원심분리기(ultracentrifuge, Ultra 5.0, Hanil science, 인천, 대한민국)를 이용하여 4℃, 120 분, 110,000 g의 조건 하에서 상기 <실시예 3>과 같은 방법으로 세포막성 수포를 분리하였다. 분리한 세포막성 수포를 PBS를 이용하여 재현탁(resuspension)하였다. 그런 다음, 분리한 세포막성 수포의 단백질 양을 암세포별(Hela, CT26 및 B16F10)로 세포막결합성 리포좀(MFL) 처리군, 비결합성 리포좀(NFL) 처리군 또는 무처리 대조군에 대하여 각각 측정하였다. BCA protein assay kit(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 세포막성 수포에 존재하는 단백질의 양을 측정함으로써 세포막성 수포의 양을 간접적으로 측정하였다. 또한, 분리된 세포막성 수포가 생체 외에서(in vitro) 안정적인지를 확인하고자 상기 분리된 세포막성 수포를 PBS 및 배양액에 넣어 둔 후, 투과전자현미경(transmission electron microscopy; TEM)(JEM-3011,[JEOL Ltd, Tokyo, Japan)을 이용하여 그 모양을 관찰하였고, 세포막성 수포의 크기를 동적 광산란(dynamic light scattering)으로 측정해 조사하였다. 구체적으로, 세포막성 수포를 분리하여 PBS 상태에 담겨져 있는 세포막성 수포 용액을 DLS장비를 이용하여 직경(diameter)을 측정하였다. MFL, NFL 또는 PLGA 나노입자(NP, Dil만을 함유)을 처리한 세포에서 분리한 세포막성 수포 400μg에 해당하는 용액의 양에 포함되어 있는 DiI 및 칼세인의 형광의 세기를 분광형광계 장비를 이용하여 측정하였다. DiI의 경우, 자극(excitation) 530 nm, 배출(emission) 570 nm 조건에서, 칼세인의 경우, 자극 490 nm, 배출 520 nm 조건에서 측정하였다. 이때, 세포에 MFL 또는 NFL의 처리량에 있어서, NFL은 조성 상 PEG가 없기 때문에 MFL과 비교하여 세포에 월등히 많은 양이 흡수되므로 MFL과 같은 양(0.14 × 10^-6 몰)을 처리하거나(도 12의 NFL), 또는 세포에 같은 양의 리포좀이 흡수되도록 양을 낮추어 처리(도 12의 NFL(적은 양); 0.07 × 10^-6 몰)하였다. 세포막성 수포로 DiI가 전달된 정도를 비교하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, Hela, B16F10 및 CT26 암세포주에 MFL 또는 NFL을 처리한 후 세포막성 수포를 분리한 결과, 처리한 리포좀의 종류와 상관없이 세포막성 수포의 양이 유사함을 확인하였다(도 5). 또한, 도 12에 나타낸 바와 같이, NFL을 MFL과 유사한 양(많은 양)을 처리한 경우 세포막성 수포 내부에서 유의적으로 높은 DiI 형광량이 측정되었으나, 세포에 같은 양이 흡수되도록 NFL을 적은 양으로 처리한 결과, 세포막성 수포로의 형광표지자(DiI) 전달에 있어서 MFL의 세포막 결합능이 세포내부로 흡수되는 것보다 더욱 효과적임을 확인하였다(도 12). 또한, 도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, Dil 및 칼세인 모두의 형광 발광 정도에 있어서, 비결합성 리포좀을 처리한 경우 및 무처리군과 비교하여 세포막결합성 리포좀을 처리한 경우에 유의적으로 높은 형광 강도를 보임을 확인하였다(도 6 및 도 7). 또한, 도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 세포막결합성 리포좀을 처리한 세포에서 세포막성 수포의 모습을 투과전자현미경으로 확인한 결과, 기존에 보고된 일반적인 세포에서의 세포막성 수포의 모습과 유사함을 확인하였고(도 8), 세포막성 수포 크기에 있어서 세포주에 따라 평균 크기가 약간 차이가 나타났지만 평균적으로 80 내지 100 nm 범위 내에 유사한 분포 경향으로 존재함을 확인하였다(도 9).

< 실시예 5> 분리된 세포막성 수포의 면역생화학적 특성 분석

상기 <실시예 4>에서 분리하여 물리적 특정을 확인한 세포막성 수포에 대하여 면역생화학적 특정을 확인하기 위하여, 분리된 세포막성 수포에 대하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿(western blot)을 시행하여 단백질 프로필을 확인하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 4>와 같이 MFL 또는 NFL을 처리하여 배양한 세포에서 세포막성 수포를 분리한 다음, 상기 분리한 세포막성 수포 단백질의 분포 양상을 SDS-PAGE 젤로 크기별로 분리한 다음, 쿠마시브릴리언트블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색을 하여 시각화하였다. 상기 분리한 세포막성 수포에 대하여 엑소좀 특이적 단백질 CD63의 발현량을 확인하고자 웨스턴 블럿(western blot)을 실시하였다. 구체적으로, 분리한 세포막성 수포 시료를 이용하여 웨스턴 블럿을 하기와 같은 방법으로 실시하였다: 세포 용해물을 저온에서 원심분리한 다음, 잔해를 제외한 시료(Cleared lysate)를 수득하였다. SDS PAGE 젤에 로딩한 단백질을 멤브레인으로 전이시킨 다음, 멤브레인에 하기 1차 항체(항-CD63 항체; System Biosceinces, Mountain View, CA, USA)를 프로브로 사용하여 혼성화반응을 수행하였다. HRP가 접합된 2차 항체(secondary antibody Goat anti-Rabbit HRP; System Biosceinces, Mountain View, CA, USA)를 추가적으로 반응시킨 다음, 해당 단백질의 밴드를 시각화하였다.

그 결과, 도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, 분리한 세포막성 수포를 SDS-PAGE 젤에서 크기별로 분리한 다음 쿠마시브릴리언트블루 염색을 하여 관찰한 결과, MFL처리 유무에 따른 세포막성 수포 단백질 분포의 유의적인 차이를 발견하지 못하였으며(도 10), 엑소좀 특이적 단백질인 CD63은 공통적으로 유의적인 발현량을 보임을 통해 분리된 세포막성 수포에 엑소좀이 많이 포함됨을 확인하였다.

< 실시예 6> 세포막결합성 리포좀의 포접물에 대한 인접세포로의 이동 확인

광역학적 치료(photodynamic therapy; PDT)로의 활용을 위하여, 세포막결합성 리포좀 처리가 세포막성 수포를 통한 비결합성 리포좀(NFL) 처리보다 인접한 세포에 리포좀에 포접된 약물을 더욱 효과적으로 이동시키는지를 확인하고자, 암세포를 멤브레인 필터 및 트랜스웰의 낮은 챔버에서 배양하는 실험을 수행하였다.

구체적으로, 도 13에 나타낸 바와 같이, DiI와 칼세인 형광물질이 포접된 세포막결합성 리포좀(MFL) 또는 비결합성 리포좀(NFL)을 30 분 동안 위쪽 필터에 있는 세포에 처리하고 세포와 반응하지 않은 리포좀들은 모두 제거한 후, 48 시간 동안 리포좀이 처리된 위쪽 세포로부터 방출되는 세포막성 수포들이 400 nm 구멍을 통하여 아래쪽 세포로 전달되는 것을 보여주는 것으로 세포막결합성 리포좀에 의해 형광물질이 세포로 전달되면 이 세포가 뿜는 세포막성 수포에 의해 형광물질이 또 다른 세포로 전달됨을 보여주는 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 14 및 도 15에 나타낸 바와 같이, MFL 또는 NFL을 처리한 위쪽 필터의 배지 및 그 아래쪽 트랜스웰의 배지에서 리포좀에 포접한 물질(Dil 및 칼세인)에 대한 형광 강도를 비교한 결과, 아래쪽 배지에서 NFL의 경우보다 MFL을 이용한 경우에 상기 포접한 물질이 유의적인 수준으로 더욱 높은 형광 강도가 나타남으로써, MFL이 상기 포접한 물질을 인접세포로 효율적으로 운반함을 확인하였다(도 14). 또한, Hela 세포에 세포막성 수포가 제거된 배지를 처리한 결과, 칼세인 또는 Dil 형광이 나타나지 않음을 확인하였다(도 15).

< 실시예 7> 광과민제의 전달 확인

암의 광역학적 치료법에 있어서, 광과민제(photosensitizer) 및 가시광선이 산소와 결합하여 생성된 세포독성 ROS는 아폽토시스(apoptosis) 또는 괴사(necrosis) 과정을 통해 악성 세포를 사멸시키고, 종양 미소 혈관계(tumour microvasculature)를 억제시키며, 숙주 면역 체계를 자극한다고 알려져 있다(Castano, et al. Nat Rev Cancer, 2006). 이에 상기 <실시예 6>에서 세포막결합성 리포좀이 리포좀에 포접된 약물을 효과적으로 이동시킬 수 있음을 확인한 것과 같이, 리포좀에 포접된 약물을 광과민제로 바꾸어 광과민제의 전달 여부를 확인하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 1>과 같은 방법으로 배양한 Hela, B16F10 및 CT26 세포에 광과민제(ZnPc; Sigma aldhirich, St. Louis, MO, USA) 6.75 ㎍가 함유된 세포막결합성 리포좀(MFL) 및 비결합성 리포좀(NFL)을 처리한 다음 공초점 현미경(TCS SP8 X; Leica, Wetzlar, Germany)으로 관찰하였다. 그리고, 분리한 세포막성 수포 400 μg에서 광과민제(ZnPc)의 형광 강도를 측정하였다.

도 16 및 도 17에 나타낸 바와 같이, 광요법에 의한 암치료용 광과민제(ZnPc)를 포접한 MFL을 제작하고 이를 세포에 처리한 결과, MFL이 세포막과 잘 결합함을 확인하였고 이러한 세포에서 분리한 세포막성 수포(엑소좀)에도 상기 광과민제가 전달되어 함유되어 있음을 확인하였다(도 16 및 도 17).

< 실시예 8> 레이저 처리 유무에 따른 세포막결합성 리포좀을 처리한 세포의 세포 생존능 확인

레이저 치료와 접목하여 활용될 가능성을 알아보기 위하여, 레이저 처리 유무에 따른 세포 생존능 검사를 실시하였다.

구체적으로, 도 18과 같이, ZnPc가 포접된 세포막결합성 리포좀(MFL) 또는 비결합성 리포좀(NFL)을 30 분 동안 위쪽 필터에 있는 세포에 처리하고 세포와 반응하지 않은 리포좀들은 모두 제거한 후, 48 시간 동안 리포좀이 처리된 위쪽 세포로부터 방출되는 세포막성 수포들이 400 nm 구멍을 통하여 아래쪽 세포로 전달되는 것을 보여주는 것으로 세포막결합성 리포좀에 의해 ZnPc가 세포로 전달되면 이 세포가 뿜는 세포막성 수포에 의해 ZnPc가 또 다른 세포로 전달됨을 보여주는 도이다. 또한 세포막성 수포에 의해 ZnPc가 전달된 아래쪽 트랜스웰에 있는 세포 전체에 대하여 5 분 동안 660 nm 레이저(laser source) 처리를 하여 상기 세포의 생존능을 확인하는 실험을 수행하였다. MTT(Sigma aldhirich, St. Louis, MO, USA) 용액을 처리한 후 당업계에 잘 알려진 방법대로 MTT 독성 검사를 수행하였다.

그 결과, 도 19에 나타낸 바와 같이, MFL 또는 NFL을 처리한 위쪽 필터의 배지 및 아래쪽 트랜스웰의 배지에서 레이저 처리의 유무에 따른 세포 생존율을 비교한 결과, 상기 <실시예 7>의 결과에 따라 광과민제가 포접된 세포막결합성 리포좀을 처리한 세포로부터 분리된 광과민제를 포함하는 세포막성 수포가 유의적인 수준으로 아래쪽 트랜스웰로 이동됨으로써, 레이저가 위쪽 필터 및 낮은 트랜스웰 둘 다에서 유의적으로 세포의 광역학적 파괴를 야기함을 확인하였다(도 19). 이를 통해, 광과민제가 포접된 세포막결합성 리포좀을 암세포에 처리함으로써 광요법에 의한 암 치료에 응용될 수 있음을 확인하였다.

Claims

1) 이중지질막으로 구성되며, 이중지질막에는 소수성 약물, 이중지질막 내부에는 친수성 약물을 포접하며 세포막에 융합하여 상기 소수성 약물 또는 친수성 약물을 포접하는 세포막성 수포를 분비시키는 리포좀(liposome)을 제조하는 단계;
2) 단계 1)의 리포좀을 세포에 처리하여 세포로부터 세포막성 수포를 방출시키는 단계; 및
3) 단계 2)에서 방출된 세포막성 수포를 수집하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 약물이 함유된 세포막성 수포의 제조방법.

제 1항에 있어서, 상기 이중지질막은 기본 지질(base lipid) 및 PEG(polyethylene glycol; 폴리에틸렌 글리콜)가 결합된 지질로 구성되는 것을 특징으로 하는 약물이 함유된 세포막성 수포의 제조방법.

제 2항에 있어서, 상기 기본 지질 및 PEG가 결합된 지질은 50 내지 80 중량부 및 1 내지 20 중량부인 것을 특징으로 하는 약물이 함유된 세포막성 수포의 제조방법.

제 2항에 있어서, 상기 이중지질막은 양전하가 부하된 지질(Positively charged lipid)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약물이 함유된 세포막성 수포의 제조방법.

제 4항에 있어서, 기본 지질:PEG가 결합된 지질:양전하가 부하된 지질은 60 내지 90 중량부:1 내지 10 중량부: 5 내지 30 중량부인 것을 특징으로 하는 약물이 함유된 세포막성 수포의 제조방법.

제 5항에 있어서, 기본 지질:PEG가 결합된 지질:양전하가 부하된 지질은 70 내지 85 중량부:1 내지 5 중량부: 10 내지 25 중량부인 것을 특징으로 하는 약물이 함유된 세포막성 수포의 제조방법.

제 1항에 있어서, 상기 리포좀은 표면전위가 12 내지 20 mV인 것을 특징으로 하는 약물이 함유된 세포막성 수포의 제조방법.

제 1항의 방법으로 제조된 소수성 약물 또는 친수성 약물을 포접하는 세포막성 수포.

이중지질막으로 구성되며, 이중지질막에는 소수성 약물, 이중지질막 내부에는 친수성 약물을 포접하며 세포막에 융합하여 상기 소수성 약물 또는 친수성 약물을 포접하는 세포막성 수포를 분비시키는 것을 특징으로 하는 리포좀.

제 9항에 있어서, 상기 리포좀은 표면전위가 12 내지 20 mV인 것을 특징으로 하는 약물이 함유된 세포막성 수포의 제조방법.

제 9 항에 있어서, 상기 이중지질막은 기본 지질 및 PEG가 결합된 지질로 구성되는 것을 특징으로 하는 약물이 함유된 리포좀.

제 11 항에 있어서, 상기 기본 지질 및 PEG가 결합된 지질은 50 내지 80 중량부 및 1 내지 20 중량부인 것을 특징으로 하는 약물이 함유된 리포좀.

제 11 항에 있어서, 상기 이중지질막은 양전하가 부하된 지질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약물이 함유된 리포좀.

제 13항에 있어서, 기본 지질:PEG가 결합된 지질:양전하가 부하된 지질은 60 내지 90 중량부:1 내지 10 중량부: 5 내지 30 중량부인 것을 특징으로 하는 약물이 함유된 리포좀.

제 14항에 있어서, 기본 지질:PEG가 결합된 지질:양전하가 부하된 지질은 70 내지 85 중량부:1 내지 5 중량부: 10 내지 25 중량부인 것을 특징으로 하는 약물이 함유된 리포좀.

이중지질막은 PEG 및 DOTAP(N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)]-N,N,N-trimethylammonium propane methyl sulphate; N-[1-(2,3-디올레오일옥시)]-N,N,N-트리메틸암모늄 프로판 메틸 설파이트)가 결합된 지질로 구성되며, 친수성 또는 소수성 약물이 포접된 세포막결합성 리포좀(membrane fusogenic liposome; MFL).

제 16항에 있어서, 상기 PEG 및 DOTAP가 결합된 지질은 3 내지 8 중량부 및 15 내지 48 중량부인 것을 특징으로 하는 세포막결합성 리포좀.

제 16항에 있어서, 상기 약물은 세포막 염료, 광과민제, 항암제, 항생제인 것을 특징으로 하는 세포막결합성 리포좀.

제 18항에 있어서, 상기 항암제는 칼세인(Calcein), 젬시타빈(gemcitabine), 부술판(Busulfan), 클로람부실(Chlorambucil), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 멜파란(Melphalan), 시스플라틴(Cisplatin), 이포스파미드(Ifosfamide), 시타라빈(Cytarabine), 5-플루오로우라실(5-FU), 메토트렉세이트(Methotrexate; MTX), 다우노루비신(Daunorubicin), 아드리아마이신(Adriamycin), 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 빈데신(Vindesine), 프로카바진(Procarbazine), 타목시펜(Tamoxifen), 메게스테롤 아세테이트(Megesterol acetate), 플루타미드(Flutamide) 및 고세렐린 아세테이트(Gosereline acetate, Zoladex)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 세포막결합성 리포좀.

제 18항에 있어서, 상기 항생제는 페니실린(penicillin)계 항생제, 세팔로스포린(cephalosporine)계 항생제, 마크로라이드(macrolide)계 항생제, 테트라시클린(tetracycline)계 항생제, 퀘놀론(quinolone)계 항생제, 항히스타민제, 항균제, 클린다마이신(clindamycin), 메트로니다졸(metronidazole), 클로람페니콜(chloramphenicol), 악티노마이신-D(Actinomycin-D), 블레오마이신(Bleomycin) 및 미토마이신-C(Mitomycin-C)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 세포막결합성 리포좀.

제 9항 또는 제 16항의 리포좀 또는 제 8항의 세포막성 수포를 포함하는 약물전달용 조성물.

제 9항 또는 제 16항의 리포좀 또는 제 8항의 세포막성 수포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.

제 22항에 있어서, 상기 암은 폐암, 고환암, 방광암, 전립선암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 췌장암, 피부암, 위암 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포막결합성 리포좀.

제 9항 또는 제 16항의 리포좀 또는 제 8항의 세포막성 수포를 포함하는 항생제(antibiotics).

제 9항 또는 제 16항의 리포좀 또는 제 8항의 세포막성 수포를 포함하는 광민감제(photosensitiser).