KR20150044109A - Primers for detecting Norovirus and RT-PCR kit for detecting Norovirus using same - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a norovirus detection primer set and a norovirus detection kit thereof, and more specifically, to a primer set which uses pacific primers developed and provided in the present invention to effectively detect norovirus, a detection kit including the same, and a detection method thereof. According to the present invention, a norovirus detection composition specifically reacts to the norovirus GII causing acute appendicitis and shows frequent appearance of mutant strains. The norovirus detection composition is sensitive to and reacts with mutant norovirus strains including 2012 Sydney-type mutant strains. Accordingly, the present invention can diagnose a norovirus GII infection more quickly and accurately than a conventional norovirus detection method.

Description

노로바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 노로바이러스 검출 RT-PCR 키트{Primers for detecting Norovirus and RT-PCR kit for detecting Norovirus using same}[0001] The present invention relates to a primer set for detecting norovirus, and a Norovirus detection RT-PCR kit using the primer set and a Norovirus detection RT-

본 발명은 노로바이러스 검출용 프라이머 세트 및 노로바이러스 검출 키트에 관한 것이다.
The present invention relates to a primer set for norovirus detection and a norovirus detection kit.

사람 노로바이러스(Human Norovirus)는 전 세계적으로 가장 많은 장염을 일으키는 병원성 미생물로 알려져 있으며, 비세균 성 장염의 약 90% 이상의 발병원인으로 알려져 있다. 특히 저항성이 낮은 노인이나 어린이들에게 치명적일 수있는 노로바이러스의 검출 확인은 국민보건상 중요한 과제 중 하나이다.Human Norovirus is the most common pathogenic microorganism in the world and is known to cause more than 90% of non-bacterial enteritis. Verification of the detection of norovirus, which may be fatal to elderly or children with low resistance, is one of the major challenges in public health.

노로바이러스는 칼리시비리대(caliciviridae)에 속하는 약 7.6 kb의 단일가닥(single stranded) RNA 바이러스 로서 3개의 ORF(open reading frame) 가 존재한다. ORF1은 바이러스의 복제에 필요한 비구조 단백질인 RdRp(RNA-dependent RNA polymerase)에 의해 전사하고, ORF2 및 ORF3는 각각 메이저와 마이너 캡시드(capsid) 단백질을 전사한다.Norovirus is a single stranded RNA virus of about 7.6 kb belonging to caliciviridae and has three open reading frames (ORFs). ORF1 is transcribed by the non-structural protein RdRp (RNA-dependent RNA polymerase) necessary for the replication of the virus, and ORF2 and ORF3 transcribe the major and minor capsid proteins, respectively.

노로바이러스는 유전학적 또는 면역학적으로 매우 다양한 바이러스로 알려져 있으며, 일반적으로 노로바이러스에 대한 항체는 인체에서 흔히 발견되지만 노로바이러스에 대한 면역학적 저항성은 나타나지 않는 것으로 알려져 있다. 노로바이러스에 대한 인체의 면역학적 저항성은 바이러스의 유전자형(genotype)에 따라 다르고, 바이러스의 유전자형의 종류는 매우 다양한 것으로 알려져 있다. 노로바이러스는 5가지의 유전자군(genogroup; GI-GV)이 존재하며, 이 중 2가지의 유전자군(GI 및 GII)이 인체에서 급성 장염을 일으키는 인체의 병원성 바이러스로 알려져 있다 (Vinje, J. et al, 2000). 노로바이러스의 GI과 GII는 감염 및 분자생물학적, 역학적, 및 계통학적으로도 매우 상이하며, 현재까지 노로바이러스(GI 및 GII)의 캡시드(capsid)의 염기서열에 따라 모두 31가지의 유전자형으로 분류되고 있다 (Kageyama, T. et al, 2004).Noroviruses are known to be highly genetically or immunologically diverse viruses. In general, antibodies to noroviruses are commonly found in humans, but immunological resistance to noroviruses is not known. The immunological resistance of the human body to norovirus depends on the genotype of the virus, and it is known that the genotype of the virus is very diverse. There are five genotypes (GI-GV) of norovirus, two of which are known as pathogenic viruses in the human body causing acute enteritis in the human body (Vinje, J. et al. et al., 2000). GI and GII of noroviruses are very different from each other in infection, molecular biology, epidemiology and phylogenetics and are classified into 31 genotypes according to the nucleotide sequences of capsid of norovirus (GI and GII) (Kageyama, T. et al, 2004).

인체 노로바이러스는 현재까지 배양방법 및 동물모델이 개발되어 있지 않은 이유로 바이러스의 보건학적 중요성은 매우 크나 인체의 감염요인, 면역반응, 바이러스의 분자생물학적 특징들에 관한 연구는 국내외에서 많이 수행되지 못했다. 현재까지 노로바이러스 관련 연구는 주로 분자역학(molecular epidemiology) 조사나 노로바이러스의 인간 투여실험(human challenge) 등의 방법들을 이용하여 수행되어 왔다 (Hutson, A. et al, 2004;Parino, T. A. et al, 1977). 그러나, 2003년 쥐 노로바이러스(murine norovirus)가 발견되어 murine macrophage RAW 264.7 세포주에서 배양이 가능하여 중요한 연구모델로 인식 되어졌다 (Karst, S. M, et al,2003).However, the research on the molecular biology of viruses, immune responses, and viruses in humans has not been conducted at home or abroad. To date, norovirus-related studies have been performed using methods such as molecular epidemiology studies or human challenge of norovirus (Hutson, A. et al, 2004; Parino, TA et al , 1977). However, in 2003, murine norovirus was found and it was recognized as an important study model because it could be cultured in murine macrophage RAW 264.7 cell line (Karst, S. M, et al, 2003).

노로바이러스의 분자계통학적 분석(phylogenetic analysis)은 주로 바이러스의 RdRp(RNA-dependent RNA polymerase) 또는 캡시드 유전자(ORF2)의 염기서열분석을 이용하여 수행되어 왔다. RdRp는 노로바이러스 유전자군(genogroup)에 상관없이 유전자 염기서열이 잘 보존되어 있고, 캡시드(ORF2)의 염기서열은 바이러스 항원과 밀접한 관계를 가지고 있어 분자계통학적 분류방식의 대상으로 많이 사용되고 있다.Phylogenetic analysis of norovirus has been performed primarily using sequencing of viruses such as RdRp (RNA-dependent RNA polymerase) or capsid gene (ORF2). RdRp is well conserved regardless of the genotypes of the Norovirus gene, and the nucleotide sequence of the capsid (ORF2) is closely related to the viral antigen and is widely used as a molecular genetic classification method.

노로바이러스를 검출하는 방법에는 민감도와 특이도가 높은 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)이나 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(Real-time RT-PCR) 법이 사용되고 있다. RT-PCR and real-time RT-PCR are used for detection of noroviruses. The RT-PCR method has a high sensitivity and specificity.

종래의 RT-PCR 혹은 Real-time RT-PCR은 가장 민감하고 정확한 진단법으로 노로바이러스 진단에 널리 사용되고 있다. 노로바이러스는 같은 발병지역에서 수득하였다 하더라도 서열 변형을 보이므로, 타겟 서열이 노로바이러스 유전자 중 가장 보존이 잘되는 부분으로 알려진 알려진 ORF1과 ORF2 사이 비전사 교차 영역을 기초로 특정하게 설계되는 한, RT-PCR이 기본이 된 진단 방법이 더욱 효율적일 수 있다. Conventional RT-PCR or real-time RT-PCR is the most sensitive and accurate diagnostic method widely used for the diagnosis of norovirus. As long as the target sequence is designed specifically based on the non-transcriptional region between ORF1 and ORF2 known to be the most conserved portion of the Norovirus gene, the RT- Diagnostic methods based on PCR can be more efficient.

RT-PCR을 통한 노로바이러스 유전자 검출의 정확성을 높이기 위해서는 바이러스의 RNA 추출법, PCR 저해물질의 제거 및 프라이머의 선정 등이 중요한 요인으로 알려져 있다. 기존의 노로바이러스 검출법을 살펴보면, 다양한 종류의 프라이머들이 바이러스 검출을 위해 사용되고 있다. In order to increase the accuracy of detection of norovirus gene by RT-PCR, RNA extraction of virus, removal of PCR inhibitor and selection of primer are important factors. In the case of the existing Norovirus detection method, various kinds of primers are used for virus detection.

노로바이러스 GII. 4 의 경우 전세계으로 노로바이러스 발병의 60~80%를 차지하고, 2~3년에 한번씩 새로운 변이주가 출연하는 특징을 가지고 있으며(PLoS One. 2013 Aug 16;8(8):e71483. doi: 10.1371/journal.pone.0071483.), 최근 우리나라의 경우 국립보건연구원에서 2007년 구축하여 운영하고 있는 K-CaliciNet(노로바이러스 실사간 유전자 분석망)를 통해 2012년 국내 유행하는 노로바이러스주에 대한 유전자형을 분석한 결과 60%이상이 GII. 4 인 것으로 확인되었으며, 특히 최근 전 세계적으로 문제시 되고 있는 노로바이러스 GII.4 변이주 (Sydney-2012 strain)가 2012년 국내에서도 발견되었으며, 2012년 4분기 동안 GII.4 노로바이러스 중에서 GII.4 변이주(Sydney-2012 strain)가 67%를 차지하는 것으로 확인되었다.Norovirus GII. (PLoS One, 2013 Aug 16, 8 (8): e71483, doi: 10.1371 / 4) is characterized by 60 to 80% of the world's onset of norovirus worldwide and a new mutant appears every two to three years (K-CaliciNet), which has been established and operated by the National Institute of Health in 2007, has been used to analyze genotypes of norovirus strains that are prevalent in Korea in 2012 As a result, more than 60% of GII. 4 strain. In particular, the norovirus GII.4 mutant strain (Sydney-2012 strain), which has recently become a problem in the world, has been found in Korea in 2012, and GII.4 mutant strain of GII.4 mutant strain (Sydney-2012 strain) accounted for 67%.

그러나, 종래에 사용되던 프라이머를 활용한 검출법은 새로운 변이주에 대한 민감성과 효율성이 좋지 못하여 노로바이러스를 정확히 탐지할 수 없는 문제가 있었다.However, the detection method using the primer used in the past has a problem that the sensitivity and efficiency of the new mutant are not good and the Norovirus can not be detected accurately.

본 발명에서는 기존의 노로바이러스 뿐만 아니라 새로운 노로바이러스 변이주 또한 검출 할 수 있는 민감성과 효율성이 향상된 노로바이러스 특이적 프라이머를 디자인하고, 이를 이용한 노로바이러스 검출 RT-PCR 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다. The object of the present invention is to design a norovirus-specific primer having improved sensitivity and efficiency that can detect not only existing norovirus but also a novel norovirus mutant, and to provide a norovirus detection RT-PCR kit using the same.

본 발명에서는 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍; 또는 서열번호 1및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염기서열을 포함하는, 노로바이러스 검출용 프라이머세트를 제공한다.  In order to solve the above problems, the present invention provides a primer pair represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; Or a pair of primers represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, or a set of primers for detecting norovirus.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 프라이머세트는 표적서열이 노로바이러스의 RdRp(RNA-dependent RNA polymerase) 및 ORF1과 ORF2의 교차부위 영역 중 하나 이상인 것을 특징으로 한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the primer set of the present invention is characterized in that the target sequence is at least one of RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) of Norovirus and cross-region regions of ORF1 and ORF2.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 프라이머세트는 노로바이러스 GII 타입의 4805-5100부분(GenBank M86557)을 증폭시키는 것을 특징으로 한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the primer set of the present invention is characterized by amplifying the 4805-5100 part of Norovirus GII type (GenBank M86557).

또한, 본 발명에서는 상기의 특징을 가지는 노로바이러스 염기서열 증폭 시킬 수 있는 프라이머 세트를 포함 하는 것을 특징으로 하는 노로바이러스 검출 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a norovirus detection kit, which comprises a primer set capable of amplifying a norovirus base sequence having the above-described characteristics.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 노로바이러스 검출 키트는 반응 완충액, DNA 중합효소, 역전사 효소 및 dNTP 등을 더 포함한다.
According to a preferred embodiment of the present invention, the Norovirus detection kit further comprises a reaction buffer, DNA polymerase, reverse transcriptase and dNTP.

본 발명은 노로바이러스 검출용 프라이머 세트 및 노로바이러스 검출 semi-nested RT-PCR 키트에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명에서 개발한 특정 프라이머를 이용하여 노로바이러스를 효과적으로 검출 할 수 있는 프라이머세트, 이를 포함하는 검출 키트 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명의 노로바이러스 검출용 프라이머 세트는 급성 위장관염을 유발하고, 변이주의 출현이 잦은 노로바이러스 GII에 특이적으로 반응하며, 기존의 노로바이러스 뿐만 아니라 노로바이러스 변이주 또한 검출 할 수 있으며, 민감성과 효율성이 뛰어나 종래의 노로바이러스 진단 방법에 비하여 신속하고 정확하게 진단할 수 있다.The present invention relates to a primer set for detecting norovirus and a norovirus-detected semi-nested RT-PCR kit, and more particularly to a primer set capable of effectively detecting norovirus using the specific primer developed in the present invention, And a detection method using the same. The primer set for the detection of norovirus of the present invention induces acute gastroenteritis, specifically reacts with norovirus GII, which frequently shows mutant strains, and can detect norovirus mutants as well as conventional noroviruses. The sensitivity and efficiency Can be diagnosed promptly and accurately in comparison with the conventional method of diagnosing norovirus.

도 1은 Genbank로부터 수집한 Noroviurs GII type 분리주의 염기서열을 DNASTAR 프로그램을 이용하여 정열하여 확인한 Norovirus GII type의 conserved region을 표시한 것이다.
도 2는 종래에 사용하던 프라이머와 본 발명의 프라이머를 사용한 semi-nested RT-PCR 증폭 산물을 1% Et-Br이 염색된 1.5% 아가로즈 젤에 전기 영동하여 UV 환경에서 확인한 것이다.
도 3은 본 발명의 프라이머와 종래에 사용하던 프라이머의 증폭부위를 도식화 한 것이다.FIG. 1 shows the conserved region of the Norovirus GII type, which was confirmed by sequencing using the DNASTAR program, the Noroviurs GII type isolate nucleotide sequence collected from Genbank.
FIG. 2 shows the result of semi-nested RT-PCR amplification using a conventional primer and the primer of the present invention in a 1% Et-Br stained 1.5% agarose gel.
FIG. 3 is a diagram showing amplification sites of primers of the present invention and primers used in the past.

이하에서는 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3을 포함하는 노로바이러스 검출 RT-PCR 키트에 관한 것으로, 본 발명에 따른 키트는 기존의 노로바이러스 뿐만 아니라 Grimsby-1995, Osaka-2007, Den Haag-2006b, Farmington Hills-2002, Hunter-2004, Yerseke-2006a 및 New Orieans-2009를 포함한 새로운 노로바이러스 변이주 Sydney-2012 또한 검출 할 수 있는 특징을 가지고 있다. The present invention relates to a Norovirus detection RT-PCR kit comprising SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, wherein the kit according to the present invention comprises not only conventional Norovirus but also Grimsby-1995, Osaka-2007, Den Haag The new Norovirus mutant Sydney-2012, including Farmington Hills-2002, Hunter-2004, Yerseke-2006a and New Orieans-2009,

본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 표적 서열은 노로바이러스의 RdRp(RNA-dependent RNA polymerase) 및 ORF1과 ORF2의 교차부위 영역 중 하나 이상인 것이다. 노로바이러스 RNA 게놈은 일반적으로 3개의 ORF(open reading frame)로 이루어 지는데 이는 ORF1, ORF2 및 ORF3 이다. ORF1은 바이러스의 복제에 필요한 비구조 단백질인 RdRp(RNA-dependent RNA polymerase)에 의해 전사하고, ORF2 및 ORF3는 각각 메이저와 마이너 캡시드(capsid) 단백질을 전사한다. 3개의 ORF중에서, 본 발명의 표적 서열은 ORF1과 ORF2가 겹치는 부분을 포함한다. In one embodiment of the present invention, in the primer set of the present invention, the target sequence is at least one of RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) of Norovirus and cross-region regions of ORF1 and ORF2. The Norovirus RNA genome generally consists of three ORFs (open reading frames), ORF1, ORF2 and ORF3. ORF1 is transcribed by the non-structural protein RdRp (RNA-dependent RNA polymerase) necessary for the replication of the virus, and ORF2 and ORF3 transcribe the major and minor capsid proteins, respectively. Among the three ORFs, the target sequence of the present invention includes a portion where ORF1 overlaps with ORF2.

본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 노로바이러스 검출을 할 시에, 사람 분변시료로부터 확보된 viral RNA의 경우 노로바이러스 분리주의 게놈서열인 X86557의 4805-5100에 해당하는 부분에 해당하는 서열목록 1과 서열목록 2로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction)반응을 하여 269bp의 표적서열을 증폭시킨다. In one embodiment of the present invention, when performing norovirus detection using the primer set of the present invention, in the case of viral RNA obtained from a human feces sample, a portion corresponding to 4805-5100 of X86557, (Reverse transcriptase-polymerase chain reaction) using a primer set consisting of SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2 to amplify a 269 bp target sequence.

본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 노로바이러스 검출 할 시에, 환경시료로부터 확보된 viral RNA의 경우 노로바이러스 분리주의 게놈서열인 X86557의 4805-5100 부분에 해당하는 서열목록 1과 서열목록 2로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction)반응을 한 후, 얻어진 증폭산물과, 노로바이러스 분리주의 게놈서열인 X86557의 4805-5078 부분에 해당하는 서열목록 1과 서열목록 3으로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 semi-nested PCR(polymerase chain reaction) 반응을 하여 273bp의 표적 서열을 증폭시킨다. In one embodiment of the present invention, in the case of detecting norovirus using the primer set of the present invention, in the case of viral RNA obtained from an environmental sample, a sequence listing corresponding to the 4805-5100 portion of X86557, (Reverse transcriptase-polymerase chain reaction) using a primer set consisting of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, and then subjected to reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) A semi-nested PCR (polymerase chain reaction) reaction is carried out using a primer set consisting of a list 1 and a sequence 3 to amplify a target sequence of 273 bp.

본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 노로바이러스를 검출 할 시에, 본 발명의 프라이머와 검체를 이용하여 증폭시킨 PCR 증폭 산물을 1.5% Agarose gel에 전기영동하여 목적 밴드의 크기를 확인하여 노로바이러스 검출 여부를 확인한다. 더 나아가 목적 크기의 밴드를 확인한 검체에 한하여 유전자 시퀀싱을 통하여 증폭 산물의 염기서열의 시퀀스를 확인하여 더 정확한 바이러스 타입을 확인할 수 있다.
In one embodiment of the present invention, when detecting norovirus using the primer set of the present invention, the PCR amplification product amplified using the primer and the sample of the present invention is subjected to electrophoresis on 1.5% agarose gel, Check the size to check whether norovirus is detected. Furthermore, for a sample of which the band of the target size has been confirmed, the sequence of the amplified product can be confirmed by gene sequencing to confirm a more accurate virus type.

이하에서는 본 발명을 실시 예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이하의 실시 예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples. However, the present invention is not limited by the following examples.

<< 참조예Reference Example 1>  1> 노로바이러스Norovirus viralviral RNARNA 시료 준비 Sample Preparation

물환경바이러스 소재은행으로부터 노로바이러스 양성 혹은 양성의심 분변시료와, 환경시료를 분양 받았다. 분양 받은 시료 중 분변시료는 DPBS에 10% w/v으로 희석한 후 원심 분리하여 상층액을 분리하여 확보한 것을 가지고 QIA Amp Viral RNA Mini Kit (Qiagen GmbH, Germany)를 사용하여 viral RNA를 사용하여 확보하였고, 환경 시료도 동일하게 QIA Amp Viral RNA Mini Kit (Qiagen GmbH, Germany)를 사용하여 viral RNA를 사용하여 확보하였다.
Water Environment Virus samples from the Bank of Bank of Korea have been distributed to people who are positive or suspicious of norovirus and environmental samples. The fecal samples were diluted to 10% w / v in DPBS and centrifuged to obtain supernatants. Using the QIA Amp Viral RNA Mini Kit (Qiagen GmbH, Germany), viral RNA was used And environmental samples were also obtained using viral RNA using the QIA Amp Viral RNA Mini Kit (Qiagen GmbH, Germany).

<< 비교예Comparative Example 1> 종래  1> Conventional 방법에의한By the way 노로바이러스Norovirus 검출 detection

상기 <참조 예 1>에 의한 방법으로 추출한 viral RNA 시료를 주형으로, 아래 <표 1> 에 나타난 종래에 사용되던 프라이머 세트를 이용한 semi-nested RT-PCR을 수행하였다. Semi-nested RT-PCR was performed using a viral RNA sample extracted by the method of Reference Example 1 as a template and using a conventional primer set as shown in Table 1 below.

종래에 사용되던 노로바이러스 GII type 검출 프라이머 세트 Conventional Norovirus GII type detection primer set GenotypeGenotype PrimerPrimer Sequence(5’-3’)Sequence (5'-3 ') PolarityPolarity Locationa Location a ReferenceReference GIIGII GII-F1M
(서열번호 4)GII-F1M
(SEQ ID NO: 4) CNT GCG AGG GCG ATC GCA ACNT GCG AGG GCG ATC GCAA ++ 5058-50765058-5076 J Virol Methods. 2002 Feb;100(1-2):107-14.J Virol Methods. 2002 Feb; 100 (1-2): 107-14. GII-R1M
(서열번호 5)GII-R1M
(SEQ ID NO: 5) CCR CCN GCA TRH CCR TTR TACCR CCN GCA TRH CCR TTR TA -- 5382-54015382-5401 GII-F3
(서열번호 6)GII-F3
(SEQ ID NO: 6) TTG TGA ATG AAG ATG GCG TCG ARTTTG TGA ATG AAG ATG GCG TCG ART ++ 5088-50655088-5065 GIIGII SRII-1
(서열번호 7)SRII-1
(SEQ ID NO: 7) CGC CAT CTT CAT TCA CAA ACGC CAT CTT CAT TCA CAAE -- 5078-50965078-5096 Int J Food Microbiol. 2006 May 1;108(3):391-6. Epub 2006 Feb 24.Int J Food Microbiol. 2006 May 1; 108 (3): 391-6. Epub 2006 Feb 24. SRII-2
(서열번호 8)SRII-2
(SEQ ID NO: 8) TWC TCY TTY TAT GGT GAT GAT GATWC TCY TTY TAT GGT GAT GAT GA ++ 4583-46054583-4605 SRII-3
(서열번호 9)SRII-3
(SEQ ID NO: 9) TTW CCA AAC CAA CCW GCT GTTW CCA AAC CAA CCW GCT G -- 4767-47854767-4785

R=A or G, B=C or G or T, Y=C or T, and N=A or C or G or TR = A or G, B = C or G or T, Y = C or T, and N = A or C or G or T

aAccession number in GenBank X86557 서열에 기반된 프라이머의 염기위치
 a Accession number in base position of primer based on GenBank X86557 sequence

구체적으로 서열번호 4(GII-F1M)와 서열번호 5(GII-R1M)의 프라이머 세트와 One step RT-PCR kit(Qiagen GmbH, Germany)를 사용하여 RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction)반응을 한 후 얻어진 증폭산물과 서열번호 6(GII-F3)과 서열번호 5(GII-R1M)의 프라이머 세트와 EmeraldAmp® PCR Master Mix(Takara Bio INC. Japan)를 사용하여 semi-nested PCR을 수행하였다. Specifically, reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) was performed using a primer set of SEQ ID NO: 4 (GII-F1M) and SEQ ID NO: 5 (GII- , Semi-nested PCR was carried out using the obtained amplification product, a primer set of SEQ ID NO: 6 (GII-F3) and SEQ ID NO: 5 (GII-R1M) and an EmeraldAmp® PCR Master Mix (Takara Bio INC. .

그리고, 서열번호 7(SRII-1)과 서열번호 8(SRII-2)의 프라이머 세트와 One step RT-PCR kit(Qiagen GmbH, Germany)를 사용하여 RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction)반응을 한 후 얻어진 증폭산물과 서열번호 8(SRII-2)과 서열번호 9(SRII-3)의 프라이머 세트와 EmeraldAmp® PCR Master Mix(Takara Bio INC. Japan)를 사용하여 semi-nested PCR을 수행하였다.  A reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) reaction was performed using a primer set of SEQ ID NO: 7 (SRII-1) and SEQ ID NO: 8 (SRII-2) and a One step RT- PCR kit (Qiagen GmbH, Germany) , Semi-nested PCR was carried out using the obtained amplification product, a primer set of SEQ ID NO: 8 (SRII-2) and SEQ ID NO: 9 (SRII-3) and an EmeraldAmp PCR Master Mix (Takara Bio INC. .

상기 각각의 semi-nested RT-PCR 증폭 산물을 1% Et-Br(Ethidium Bromide)이 염색된 1.5% Agarose gel에 전기 영동하여 UV(Ultraviolet) 환경에서 각 표적 서열이 특이적으로 증폭 하였는지 확인하였다(도 2).
Each semi-nested RT-PCR amplified product was electrophoresed on 1.5% agarose gel stained with 1% Et-Br (Ethidium Bromide) to confirm that each target sequence was specifically amplified in an UV (Ultraviolet) environment 2).

<< 실시예Example 1>  1> NorovirusNorovirus 분리주에In a separator 공통적인 표적 서열의 증폭을 위한  For amplification of a common target sequence primerprimer designdesign

본 연구에서는 Norovirus GII type 53개의 분리주의 유전자 정보의 공통적인 표적 서열의 선발 및 그를 증폭할 수 있는 primer design 한다.In this study, selection of a common target sequence of 53 isolates of Norovirus GII type and primer design to amplify it.

먼저, Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)로부터 Norovirus GII type 분리주의 염기서열을 입수하고, DNASTAR 프로그램을 이용하여 각 염기서열을 alignment 하여 conserved region을 확인하고(도 1), conserved region을 바탕을 primer design을 한다(표2).
First, obtain the Norovirus GII type isolate nucleotide sequence from Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) and identify the conserved region by aligning each nucleotide sequence using the DNASTAR program ( 1) and primer design based on the conserved region (Table 2).

본 발명의 노로바이러스 검출용 프라이머 세트A primer set for detecting norovirus of the present invention GenotypeGenotype PrimerPrimer Sequence(5’-3’)Sequence (5'-3 ') PolarityPolarity Locationa Location a GIIGII NKII-F
(서열번호1)NKII-F
(SEQ ID NO: 1) CTY AGG CAR ATG TAC TGG ACYCTY AGG CAR ATG TAC TGG ACY ++ 4805-48254805-4825 NKII-R1
(서열번호2)NKII-R1
(SEQ ID NO: 2) TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACTCG ACG CCA TCT TCA TTC AC -- 5081-51005081-5100 NKII-R2
(서열번호3)NKII-R2
(SEQ ID NO: 3) GGA GCC AGA TTG CGA TCG CGGA GCC AGA TTG CGA TCG C -- 5060-50785060-5078

R=A or G, B=C or G or T, Y=C or T, and N=A or C or G or TR = A or G, B = C or G or T, Y = C or T, and N = A or C or G or T

aAccession number in GenBank X86557 서열에 기반된 프라이머의 염기위치
 a Accession number in base position of primer based on GenBank X86557 sequence

<< 실시예Example 2> 제작된  2> manufactured 프라이머primer 세트를 이용한  Using a set 노로바이러스Norovirus 유전자의 증폭 Gene amplification

표 2 에 나타난 제작된 프라이머 세트를 이용하여, 노로바이러스 유전자를 증폭한다.Using the prepared primer set shown in Table 2, the norovirus gene was amplified.

노로바이러스 GII 타입의 viral RNA를 주형으로 하고, 표 2에서 design한 primer set인 서열번호 1 과 서열번호 2의 프라이머 세트와 One step RT-PCR kit(Qiagen GmbH, Germany)을 이용하여 RT-PCR(1차 PCR)을 수행하고, 1차 PCR 산물을 이용하여 semi-nested PCR을 위한 프라이머 세트 서열번호 1과 서열번호3을 첨가하여 EmeraldAmp® PCR Master Mix(Takara Bio INC. Japan)를 이용하여 semi-nested PCR(2차 PCR)을 수행 하였다. 2차 PCR을 완료한 후 증폭 산물을 1% Et-Br(Ethidium Bromide) 가 염색된 1.5% 아가로즈 젤에 전기 영동하여 각 표적 서열이 특이적으로 증폭 하였는지 확인 하였다 (도 2).
RT-PCR was carried out using primers set forth in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and One step RT-PCR kit (Qiagen GmbH, Germany) Primer set 1 and SEQ ID NO: 3 for semi-nested PCR were added using the first PCR product and semi- nested PCR was performed using EmeraldAmp® PCR Master Mix (Takara Bio INC. Japan) nested PCR (secondary PCR) was performed. After completion of the second PCR, the amplified product was electrophoresed on a 1.5% agarose gel stained with 1% Et-Br (Ethidium Bromide) to confirm that each target sequence was specifically amplified (FIG. 2).

<< 실시예Example 3> 종래의  3> Conventional 노로바이러스Norovirus 유전자 검출  Gene detection 프라이머를Primer 이용한 검출법과 본 발명의  And the detection method of the present invention 노로바이러스Norovirus 유전자 검출  Gene detection 프라이머를Primer 이용한 검출법의 비교 Comparison of detection methods used

본 발명의 노로바이러스 유전자 검출 프라이머를 이용한 노로바이러스 검출 법과 종래의 방법에 의한 노로바이러스 검출 법을 상기 <비교예 1>과 <실시예 2>의 결과를 바탕으로 비교하여 보면, 총 18개의 시료 중 F1M/R1M 프라이머 세트를 이용한 경우 양성 11개, SRII 프라이머 세트의 경우 양성 11개, 본 발명의 노로바이러스 검출 프라이머인 NKII 프라이머 세트의 경우 양성 16개로 종래의 검출 법 보다 노로바이러스 검출률이 높았다.Based on the results of the detection of norovirus using the norovirus gene detection primer of the present invention and the detection of norovirus by the conventional method based on the results of the above-mentioned Comparative Example 1 and Example 2, The detection rate of norovirus was higher than that of the conventional detection method when the F1M / R1M primer set was used for 11 positive, for the SRII primer set 11 positive, and for the Norovirus detection primer of the present invention, 16 for the NKII primer set.

뿐만 아니라, 본 발명의 프라이머를 사용하여 semi-nested RT-PCR한 후 증폭 산물을 1% Et-Br(Ethidium Bromide) 가 염색된 1.5% 아가로즈 젤에 전기 영동 하고 UV(Ultraviolet)환경에서 목적 밴드를 확인 하였을 때 밴드의 시그날 또한 종래의 방법보다 더 선명하고, 강했다.
In addition, after semi-nested RT-PCR using the primer of the present invention, the amplified product was electrophoresed on a 1.5% agarose gel stained with 1% Et-Br (Et-Bromide) The signal of the band was also clearer and stronger than the conventional method.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변형시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the present invention without departing from the spirit or scope of the invention as defined in the appended claims. It can be understood that it is possible.

<110> Norogene Corp. <120> Primers for detecting Norovirus and Norovirus RT-PCR detection kit <130> DPA2013-0364 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NKII-F <400> 1 ctyaggcara tgtactggac y 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NKII-R1 <400> 2 tcgacgccat cttcattcac 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NKII-R2 <400> 3 ggagccagat tgcgatcgc 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GII-F1M <400> 4 cntgcgaggg cgatcgcaa 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GII-R1M <400> 5 ccrccngcat rhccrttrta 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GII-F3 <400> 6 ttgtgaatga agatggcgtc gart 24 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRII-1 <400> 7 cgccatcttc attcacaaa 19 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRII-2 <400> 8 twctcyttyt atggtgatga tga 23 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRII-3 <400> 9 ttwccaaacc aaccwgctg 19 <110> Norogene Corp. <120> Primers for detecting Norovirus and Norovirus RT-PCR detection          kit <130> DPA2013-0364 <160> 9 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NKII-F <400> 1 ctyaggcara tgtactggac y 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NKII-R1 <400> 2 tcgacgccat cttcattcac 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NKII-R2 <400> 3 ggagccagat tgcgatcgc 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GII-F1M <400> 4 cntgcgaggg cgatcgcaa 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GII-R1M <400> 5 ccrccngcat rhccrttrta 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GII-F3 <400> 6 ttgtgaatga agatggcgtc gart 24 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRII-1 <400> 7 cgccatcttc attcacaaa 19 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRII-2 <400> 8 twctcyttyt atggtgatga tga 23 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRII-3 <400> 9 ttwccaaacc aaccwgctg 19

Claims (7)

서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍; 또는
서열번호 1 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염기서열을 포함하는, 노로바이러스 검출용 프라이머세트.
A pair of primers represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; or
A primer set for detecting norovirus, comprising at least one base sequence selected from the group consisting of primers represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3.
제 1항에 있어서,
표적 서열은 노로바이러스의 RdRp(RNA-dependent RNA polymerase) 및 ORF1과 ORF2의 교차부위 영역 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 노로바이러스 검출용 프라이머세트.
The method according to claim 1,
Wherein the target sequence is at least one of RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) of Norovirus and cross-region regions of ORF1 and ORF2.
제 1항에 있어서,
상기 프라이머세트는 노로바이러스 GII 타입의 4805-5100부분(GenBank M86557)을 증폭시키는 것을 특징으로 하는 노로바이러스 검출용 프라이머세트.
The method according to claim 1,
Wherein the primer set amplifies the 4805-5100 part of Norovirus GII type (GenBank M86557).
제 3항에 있어서,
상기 프라이머세트는 노로바이러스 GII 타입의 4805-5100부분(GenBank M86557)과 80% 이상의 상동성이 있는 부분을 증폭시키는 것을 특징으로 하는 노로바이러스 검출용 프라이머세트.
The method of claim 3,
Characterized in that the primer set amplifies a part having a homology of 80% or more with the 4805-5100 part of Norovirus GII type (GenBank M86557).
제 1항에 있어서,
염기서열 1과 80% 이상의 상동성이 있는 프라이머, 또는 염기서열 2와 80% 이상의 상동성이 있는 프라이머, 또는 염기서열 3과 80% 이상의 상동성이 있는 프라이머로 이루어진 노로바이러스 검출용 프라이머세트.
The method according to claim 1,
A primer having a homology of 80% or more with the nucleotide sequence 1 or a primer having a homology of 80% or more with the nucleotide sequence 2 or a primer having the homology of 80% or more with the nucleotide sequence 3;
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 노로바이러스 검출 키트.
A norovirus detection kit comprising the primer set of any one of claims 1 to 5.
제 6항에 있어서,
상기 진단용 키트는 반응 완충액, DNA 중합효소 및 역전사 효소 및 dNTP를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 노로바이러스 진단 semi-nested RT-PCR 키트.The method according to claim 6,
Wherein the diagnostic kit further comprises reaction buffer, DNA polymerase and reverse transcriptase, and dNTP.
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KR20170117012A (en) 2017-09-30 2017-10-20 윤현규 Method and kit for detecting Caliciviridae viruses causing acute gastroenteritis using real-time PCR

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