KR20150042535A - 비용종 유래 중간엽 줄기세포 및 그 분리방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 비용종 유래 중간엽 줄기세포에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 치료과정에서 버려지는 비용종 조직을 처리하여 수득할 수 있는 인간 비용종 유래 중간엽에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 버려지는 조직으로부터 미분화 유지 능력, 다분화 능력 및 증식율이 우수한 비용종 유래 중간엽 줄기세포를 용이하게 분리할 수 있으므로 난치병의 치료 및 연구에 유용하다.

Description

비용종 유래 중간엽 줄기세포 및 그 분리방법 {Mesenchymal Stem Cells Drived from Nasal polyp and Method for Isolating the Same}
본 발명은 비용종 유래 중간엽 줄기세포에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 치료과정에서 버려지는 비용종 조직의 프로프리아층을 절편한 다음, 효소 처리하여 수득할 수 있는 인간 비용종 유래 중간엽 줄기세포 및 상기 중간엽 줄기세포의 분리방법에 관한 것이다.
비용종(nasal polyp)이란, 물혹 또는 코버섯이라고도 하며 코 안에 발생하는 양성종양의 일종으로 정확한 발병 원인은 밝혀지지 않았으나 염증 또는 알레르기와 연관이 높은 것으로 알려져 있다. 크기가 작은 경우 증상이 없을 수도 있으나 점점 크기가 증가하면서 코막힘과 같은 주증상이 나타나며 이로 인해 냄새를 잘 맡지 못하고 누런 콧물, 코가래, 두통, 코맹맹이 소리, 코골이 등의 증상이 동반된다. 물혹을 장기간 방치하면 콧구멍 밖으로 나오기도 하고 비중격이나 콧등이 넓어지는 변형을 초래하기도 하여 육안으로 확인할 수 있지만 작은 경우에는 내시경으로 확인하여야한다. 비용종의 치료법은 약물 치료와 수술적 치료 두 가지가 있는데, 약물 치료의 경우 종양이 매우 작은 경우에 시행된다. 수술적 치료는 약물치료에 효과가 없는 경우, 반복 또는 지속되는 감염이 있는 경우 또는 부비동염과 동반된 합병증이 있는 경우에 시행된다. 아주 작고 단발성인 간단한 것은 코에 국소마취를 하고 간단히 제거할 수 있으나, 보통 다발성인 경우가 많으며, 이러한 경우 축농층을 동반하므로 전신 마취하에 수술을 시행하게 된다. 수술적 치료과정에서 제거된 비용종 조직은 버려진다.
한편, 줄기세포(stem cell)란, 자기 복제 능력을 가지면서 두 종류 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 분화능에 따라서는 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cells)로, 기원 조직에 따라서는 배아줄기세포와 성체줄기세포로 분류할 수 있다 (Grudeva-Popova J.G., Folia Med (Plovdiv), 47(3-4):5-10, 2005).
만능 줄기세포(totipotent stem cells)는 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8세포기 까지의 세포가 이러한 성질을 가지며 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생할 수 있는 특성이 있다. 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells)는 수정 4-5일 후 나타나는 배반포(blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴(inner cell mass)에서 유래하며, 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못한다는 점에서 만능 줄기세포와 구별된다. 다분화능 줄기세포(multipotent stem cells)는 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포로서, 태아기, 신생아기 및 성체기의 각 조직 및 장기의 성장과 발달은 물론 성체조직의 항상성 유지와 조직손상 시 재생을 유도하는 기능에 관여하고 있는 것으로 알려져 있다.
배아줄기세포는 배엽이 나누어지기 전의 배아에서 유래된 세포로서 증식과 분화능력이 높은 장점이 있지만 하나의 생명체로 간주할 수 있는 배아를 파괴하여야 한다는 점에 있어 윤리적 문제가 존재하며 개체간의 면역성 문제 및 기형종(teratoma) 형성 문제가 있다. 성체줄기세포는 분화가 상당히 진행된 줄기세포로 분열과 분화능력에 한계가 있으나 윤리적 문제와 기형종 문제에 있어 자유롭다. 한편, 최근에는 배자발생관련 유전자를 도입하여 줄기세포와 유사한 특성을 보이는 유도만능 줄기세포(iPS cells)를 만드는데 성공하였는데(미국등록특허 제7,964,401호) 배아줄기세포와 성체줄기세포의 문제를 극복할 수 있는 새로운 줄기세포로 부각되었지만 역전사바이러스 벡터와 일부 유전자가 숙주세포의 DNA를 변화시켜 암을 유발할 수 있다는 것이 단점으로 남아있다.
상기 다분화능 줄기세포는 성체 골수에서 최초로 분리되었고(Jiang Y. et al,, Nature. 4;418(6893):41-9, 2002), 그 후 피부, 혈관, 근육 및 뇌로부터도 확인되었다(Toma J.G. et al., Nat Cell Biol., 9:778-84, 2001; Sampaolesi M. et al., Science, 25;301(5632):487-92, 2003; Jiang Y. et al., Exp Hematol., 8:896-904, 2002). 대부분의 성체줄기세포는 장기조직에서 직접 얻어지는 원발성 세포(primary cell)인 경우가 대부분이며 이로 인해 주변조직의 상황에 의해 매우 예민하고 신속하게 세포운명 결정과정이 결정된다는 특징이 있다. 따라서 미분화 상태로 장기간 유지하는 것이 곤란하고 골수와 같이 조직의 채취에 기증자의 고통이 수반되는 경우가 있어 응용에 제한이 되어왔다.
MSC는 배양 기간이 길어지는 동시에, 여러 번의 계대배양을 거치면서 증식능력과 다양한 계통으로의 분화능력이 감소되는 것으로 알려져 있다. 일례로써, Prockop등(Brit J Haematol, 107:275-281 ,1999)의 연구에서 초기 계대(passage)의 MSC에 비해, 후기 계대의 MSC에서 콜로니 형성 능력이 현저히 감소하였으며, 골아세포로의 분화능력은 감소되지 않은 반면, 지방세포로의 분화가 억제되었음을 확인하였다. 즉, 줄기 세포들을 분리하여 체외에서 보존하기가 매우 어렵다는 단점이 있다.
이에, 본 발명자들은 수득과 체외 보존이 용이한 성체줄기세포를 분리하고자 예의 노력한 결과, 버려지는 비용종(nasal polyp)을 이용하는 경우 장기간 미분화 상태를 유지하고 다분화능력을 가지는 성체줄기세포를 분리할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 비용종(nasal polyp) 조직으로부터 성체줄기세포를 분리하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의하여 분리된 다분화 능력을 가지고 미분화 상태가 장기간 유지되는 성체줄기세포를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 비용종 조직 유래 펠렛을 배양한 다음 회수하는 것을 특징으로 하는, (a) CD90, CD73 및 CD44에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고, CD34 및 CD45에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄; 및 (b) 플라스틱에 부착되어 성장하며, 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타내고, 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가지는 성체 줄기세포의 분리방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기의 방법에 의하여 분리되고 (a) CD90, CD73 및 CD44에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고, CD34 및 CD45에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄; 및 (b) 플라스틱에 부착되어 성장하며, 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타내고, 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가지는 성체 줄기세포를 제공한다.
본 발명에 따르면, 버려지는 조직으로부터 미분화 상태로 장기간 유지가 가능하고 다분화 능력 및 증식율이 우수한 비용종 유래 중간엽 줄기세포를 용이하게 분리할 수 있으므로 난치병의 치료 및 연구에 유용하다.
도1은, 분리 배양된 비용 유래 중간엽 줄기세포의 면역학적 특성을 유세포분석으로 확인한 결과이다.
도2는, 분리 배양된 비용 유래 중간엽 줄기세포의 골세포 분화능력을 Alizarin Red S 염색으로 확인한 사진이다.
도3은, 분리 배양된 비용 유래 중간엽 줄기세포의 지방세포 분화능력을 Oil red O 염색으로 확인한 사진이다.
도4는, 분리 배양된 비용 유래 중간엽 줄기세포의 연골세포 분화능력을 Alizarin Red S 염색으로 확인한 사진이다.
도5는, 장기간 배양 후 비용 유래 중간엽 줄기세포의 자가복제 (self-renewal) 능력을 측정하기 위하여 CFU-f 분석한 결과이다.
본 발명에서는, 폐기되는 비용종으로부터 성체줄기세포를 분리하기 위하여 비용종 조직을 처리 및 배양한 다음, 회수되는 세포를 대상으로 줄기세포로서의 특성을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, 비용종 수술과정에서 생기는 비용종을 잘게 자르고 효소처리한 다음, 원심 분리하여 얻어진 펠렛을 배양하여 중간엽 줄기세포를 분리하였다. 또한 상기 중간엽 줄기세포의 줄기세포 마커 발현 및 다분화능력을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 인간 비용종 조직 유래 펠렛을 배양한 다음 회수하는 것을 특징으로 하는, (a) CD90, CD73 및 CD44에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고, CD34 및 CD45에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄; 및 (b) 플라스틱에 부착되어 성장하며, 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타내고, 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가지는 성체 줄기세포의 분리방법에 관한 것이다.
본 발명의 비용종 조직 유래 펠렛은 비용종(nasal polyp) 조직의 프로프리아층 (lamina propria)을 효소 처리하여 얻는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 프로프리아 층은 줄무늬가 있는 황갈색으로 olfactory ephithelium 과 구분되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 효소는 트립신 (trypsin), 콜라게나제 (collagenase), 하이알루로니다제 (hyaluronidase), 헤파리나제 (heparinase), 엘라스타제 (Elastase), 프로나제 (Pronase), 디엔아제 (DNase), 디스파제 (Dispase), 파파인 (Papain) 및 키모트립신 (Chymotrypsin)으로 구성된 군에서 하나 이상의 효소를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기의 방법에 의하여 분리된 비용종 유래 중간엽 줄기세포를 11계대까지 장기 배양한 후 자가복제 능력(self-renewal)을 유지하고 있는지 조사한 결과, 배양 초기와 유사한 복제능력을 유지하고 있음을 확인 하였다.
다른 관점에서, 본 발명은 (a) CD90, CD73 및 CD44에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고, CD34 및 CD45에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄; 및 (b) 플라스틱에 부착되어 성장하며, 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타내고, 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가지는 성체 줄기세포에 관한 것이다.
상기 성체줄기세포는 미분화 상태로 최소한 10 계대이상 배양되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 중배엽 유래 세포는 연골세포, 골 세포, 신경 세포, 성상세포 및 지방세포인 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 상세하게 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 비용종 유래 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양
비용종 치료 수술 과정에서 생기는 비용종 조직을 수득하여, 무균 상태에서 세포를 분리하였다. 이를 PBS (Phosphate Buffered Saline)로 세척하고, 실체 현미경(Nikon, Japan) 하에서 프로프리아(lamina propria) 층을 분리하였다. 프로프리아 층은 줄무늬가 있는 황갈색으로 olfactory epirhelium과 구분될 수 있다. 분리한 프로프리아 층을 PBS로 세척하고 10~50um 두께로 잘게 자른 후, 37℃에서 45 분 동안 0.1% 콜라게네이즈(Sigma, USA) 용액을 처리하였다. 10% FBS로 효소를 불활성화 시킨 다음 100㎛ 나일론 메쉬를 통과시켜 잔여 조직을 여과하였다. 회수된 세포는 10% 우태아혈청 (Fetal Bovine Serum; GIBCO, USA)과 1% 비필수 아미노산 (non-essential amino acids) 및 항생제 (penicillin/streptomycin) 가 포함된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배양액에서 세척하고, 부유하여 37℃ 및 5% CO2의 가습 배양기 (humidified chamber)에서 배양하였다. 24시간 후 DMEM으로 배양접시를 세척한 후 배양접시가 가득 찰 때까지 세포를 배양하였다.
초기 세포배양은 DMEM을 사용하며, 10％ FBS를 첨가하여 사용하였다. 또한 항생제로 1％ 페니실린-스트렙토마이신(100 IU/ml,GIBCO)을 첨가하였고, 항진균제로 암포테리신 B(0.5μg/ml, Amresco), 마이코플라스마 억제제로 타일로신(10μg/ml, Serva, Heidelberg), 그리고 2 mM 글루타민과 1mM 소디움 피루베이트를 더 첨가하였다. 분리된 비용 유래 줄기세포를 104 cells/ml 농도가 되도록 현탁한 후 세포 부유액 10 ml를 T25 플라스크에 옮겨 상기조건에서 배양하였다.
실시예 2: 비용 유래 중간엽 줄기세포의 특성 확인
형광 활성화 세포 분류 분석기 (FACS; BD Science, USA)를 이용하여 줄기세포 마커 항원을 분석하였다. 3번째 계대의 세포를 배양접시로부터 수거하고, PBS로 두 번 세척하였다. 그 후 세포를 2% FBS/PBS 완충액에 넣고, 적당한 비율로 희석된 fluorescein isothiocyanate (FITC) 또는 PE (phycoerythrin)가 결합된 항체를 첨가하여 4℃에서 30 분간 처리한 후 FACS로 세포의 형광발현을 측정하였다. 분석 이전에 사멸한 세포와 잔해들을 제거하기 위하여 프로피디움 요오드화물 (propidium iodide) 5 ㎍/㎖을 추가하였다. 얻어진 결과는 CellQuest (BD Science, USA) 프로그램을 사용하여 분석하였다.
유세포 분석결과, 도 1에 나타난 바와 같이, CD90, CD73 및 CD44에 대해서는 양성을 나타내고, CD34, CD45에 대해서는 음성을 나타내었다. 이러한 결과는 이미 보고된 간엽줄기세포 (mesenchymal stem cell, MSC)의 대표적 표지인자의 발현 양상과 일치한다.
실시예 3: 비용 유래 중간엽 줄기세포의 다분화 능력 확인
3-1. 골세포 분화 유도 및 확인
골세포로의 분화를 유도하기 위하여 비용종 유래 중간엽 줄기세포(2×104 cells/well)를 24-well 세포용기에 접종한 다음, 골세포 분화용액 (DMEM + 1% FBS + 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 0.1 μM dexamethasone, 50 μM ascorbic acid, 10 mM β-glycerophosphate)에서 3주 동안 배양하였다.
분화 유도기간 후 골세포로의 분화 검증을 위해 alizarin red S 염색법을 실시하였다. 비용종 유래 중간엽 줄기세포를 4% 파라포름알데히드 고정액으로 15분 처리한 후 PBS 용액으로 세정한 다음, 2% 알리자린 레드 S 용액으로 10분 동안염색하였다. 염색과정이 끝난 후 증류수로 5회 세정을 실시하고 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 2주간 기본 배양액에서 배양한 세포는 염색이 되지 않았으나 분화유도 배지에 배양한 세포는 붉게 염색된 것을 확인(도2)하여 비용종 유래 중간엽 줄기세포가 골세포로 분화하였음을 확인하였다.
3-2. 지방세포 분화 유도 및 확인
지방세포로의 분화를 유도하기 위하여 비용종 유래 중간엽 줄기세포(2×104 cells/well)를 24-well 세포용기에 접종한 다음, 지방세포 분화용액 (DMEM + 5% FBS + 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 1 μM dexamethasone, 10 μg/ml insulin, 100 μM indomethacin, 0.5 μM IBMX)에서 2주 동안 배양하였다.
분화 유도기간 후 지방세포로의 분화 검증을 위해 세포 내 지방 축적을 확인하기 위한 Oil red O 염색법을 실시하였다. 비용종 유래 중간엽 줄기세포를 4% 파라포름알데히드 고정액으로 15분 처리한 후 PBS 용액으로 세정한 다음, 60% 이소프로파놀로 세정하였다. 세정 후 0.2% Oil red O용액으로 10분 동안 염색하고 증류수로 3회 세정하였다. 염색과정이 끝난 후 100% 이소프로파놀로 탈염과정을 실시하고 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 2주간 기본 배양액에서 배양한 세포는 세포 내에 lipid droplet 염색이 나타나지 않았으나 분화유도 배지에 배양한 세포는 세포 내에 축적된 지방이 붉게 염색된 것을 확인(도3)하여 비용종 유래 중간엽 줄기세포가 지방세포로 분화하였음을 확인하였다.
3-3. 연골세포 분화 유도 및 확인
연골세포로의 분화를 유도하기 위하여 비용종 유래 중간엽 줄기세포(2×104 cells/well)를 24-well 세포용기에 접종한 다음, 연골세포 분화용액 (10 ng/ml TGFβ-3, 0.1μM dexamethasone, 50μg/ml ascorbic acid, 40μg/ml proline, 100μg/ml pyruvate (Sigma), 0.5 mg/ml ITS+ Premix, 500 ng/mL BMP-6)에서 3주 동안 배양하였다.
분화 유도기간 후 연골세포로의 분화 검증을 위해 세포 내 지방 축적을 확인하기 위한 Safrain O 염색법을 실시하였다. 비용종 유래 중간엽 줄기세포를 4% 파라포름알데히드 고정액으로 15분 처리한 후 PBS 용액으로 세정한 다음, 0.1% safranin O 용액으로 5분 동안 염색하였다. 염색과정이 끝난 후 PBS로 수세하고 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 3주간 기본 배양액에서 배양한 세포는 염색되지 않았으나 분화유도 배지에 배양한 세포는 푸르게 염색된 것을 확인(도4)하여 비용종 유래 중간엽 줄기세포가 연골세포로 분화하였음을 확인하였다.
실시예 4: CFU -F 분석
중간엽 줄기세포의 특징 중 하나인 자가복제 능력을 확인하기 위하여 집랍형성단위(colony forming unit-fibroblast, CFU-f)를 측정하였다.
비용 유래 줄기세포를 104 cells/ml 농도가 되도록 현탁한 후 세포 부유액 10 ml를 100mm dish에 접종하여 2주간 배양하였다. 계대배양에 따른 자가복제 능력을 비교하기 위하여 1계대의 세포와 11계대의 세포를 비교하였다. 세포배양은 DMEM을 사용하며, 10％ FBS를 첨가하여 사용하였으며 항생제로 1％ 페니실린-스트렙토마이신(100 IU/ml,GIBCO)을 첨가하였고, 항진균제로 암포테리신 B(0.5μg/ml, Amresco), 마이코플라스마 억제제로 타일로신(10μg/ml, Serva, Heidelberg), 그리고 2 mM 글루타민과 1mM 소디움 피루베이트를 더 첨가하였다. 배양 후 비용종 유래 중간엽 줄기세포를 4% 파라포름알데히드 고정액으로 15분 처리한 후 PBS 용액으로 세정한 다음, crystal violet (Sigma, St. Louis, MO)으로 염색하였다. 염색 후 PBS로 수세하고 현미경으로 관찰하였으며 50개 이사의 세포로 이루어진 세포군락의 수를 계수하였다. 그 결과, 도 5에 나타내었듯이 분리된 비용종 유래 중간엽 줄기세포는 줄기세포의 특성인 자가복제능력을 지니고 있음이 확인 되었으며, 계대가 지속되어도 미분화 상태가 유지됨을 확인할 수 있었다.

Claims (7)

  1. 인간 비용종 조직 유래 펠렛을 배양한 다음 회수하는 것을 특징으로 하는, 다음과 같은 특성을 나타내는 성체 줄기세포의 분리방법:
    (a) CD90, CD73 및 CD44에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고, CD34 및 CD45에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄; 및
    (b) 플라스틱에 부착되어 성장하며, 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타내고, 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐.
  2. 제1항에 있어서, 상기 비용종 조직 유래 펠렛은 비용종(nasal polyp) 조직의 프로프리아층 (lamina propria)을 효소 처리하여 얻는 것을 특징으로 하는 성체 줄기세포의 분리방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 프로프리아 층은 줄무늬가 있는 황갈색으로 olfactory ephithelium 과 구분되는 것을 특징으로 하는 성체 줄기세포의 분리방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 효소는 트립신 (trypsin), 콜라게나제 (collagenase), 하이알루로니다제 (hyaluronidase), 헤파리나제 (heparinase), 엘라스타제 (Elastase), 프로나제 (Pronase), 디엔아제 (DNase), 디스파제 (Dispase), 파파인 (Papain) 및 키모트립신 (Chymotrypsin)으로 구성된 군에서 하나 이상의 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 성체 줄기세포의 분리방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 분리되고, 다음과 같은 특성을 가지는 성체 줄기세포:
    (a) CD90, CD73 및 CD44에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고, CD34 및 CD45에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄; 및
    (b) 플라스틱에 부착되어 성장하며, 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타내고, 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐.
  6. 제5항에 있어서, 상기 성체줄기세포는 미분화 상태로 최소한 10 계대 이상 배양되는 것을 특징으로 하는 성체줄기세포.
  7. 제5항에 있어서, 중배엽 유래 세포는 연골세포, 골 세포, 신경 세포, 성상세포 및 지방세포인 것을 특징으로 하는 성체 줄기세포.
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