KR20150031562A - C2-5 chemical producing acetogens and Production conditions using synthesis gas - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a strain, which uses a synthesis gas as a carbon source and produces an organic acid as a by-product. According to the present invention, an oscillibactersp._whose accession number is KCTC 12249BP uses a synthesis gas as a matrix and accordingly produces C5 of isovaleric acid, compared with an existing acetogen for producing C2 or C4 of carbon compounds, thereby expanding the range of producing biochemical compounds.

Description

합성가스를 이용하는 다탄소 화합물 생산용 균주 및 다탄소 화합물의 생산방법{C2-5 chemical producing acetogens and Production conditions using synthesis gas}[0001] The present invention relates to a method for producing a carbonaceous compound using a syngas and a method for producing the same,

본 발명은 가스 형태의 기질인 바이오매스 유래 합성가스를 기질로 하여 탄소수 2 내지 5의 다탄소 화합물을 생산할 수 있는 신규한 오실리박터속 균주 및 이를 이용하여 탄소수 2 내지 5의 다탄소 화합물을 생산하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a novel strains belonging to the genus Oshilacteria which can produce a multifunctional carbon compound having 2 to 5 carbon atoms using a syngas derived from a biomass as a substrate, which is a gaseous substrate, and a multifunctional carbon compound having 2 to 5 carbon atoms .

합성가스는 유기원료가 고온의 증기가 있는 조건에서 부분 산화될 경우에 발생하는 것으로 CO, H2 및 CO2를 주성분으로 하며, 원료로는 천연가스, 석탄, 유혈암(Oil shale) 및 역청사암(tar sand) 등이 사용될 수 있는데, 주로 천연가스 또는 석탄을 금속촉매 반응시킴으로써 제조하고 있다. Synthetic gas is generated when the organic raw material is partially oxidized under the condition of high temperature steam. It mainly consists of CO, H 2, and CO 2 , and raw materials include natural gas, coal, oil shale, (tar sand) can be used, and they are mainly produced by metal catalytic reaction of natural gas or coal.

금속촉매를 이용하여 합성가스를 다탄소화합물로 전환기술은 합성가스의 순도(CO 및 H2만 사용됨)가 매우 중요한데, 원료에 불순물이 포함되면 반응속도가 크게 감소하여 생산성이 떨어진다. 특히 불순물로 황화합물이 포함되는 경우에는 황화합물이 금속촉매를 비가역적으로 피독시키며, 촉매를 다시 활성화시키기 어렵고, 황화합물을 제거하기 위한 별도의 제조공정이 필요하며, CO나 H2를 농축시켜 사용해야 함으로 어려움이 있으며, 경제적이지 못하다. The purity of syngas (using only CO and H 2 ) is very important in the conversion of syngas to a multicomponent compound using a metal catalyst. When impurities are contained in the raw material, the reaction rate is greatly reduced and the productivity is lowered. In particular, when a sulfur compound is contained as an impurity, the sulfur compound is irreversibly poisoned by the metal catalyst, and it is difficult to reactivate the catalyst, and a separate manufacturing process is required to remove the sulfur compound, and it is difficult to concentrate CO or H 2 And it is not economical.

최근 바이오매스를 기화시켜 합성가스를 생산하는 기술이 개발되었는데, 바이오매스 이용공정은 석탄을 이용하는 경우보다 합성가스에 포함된 황화합물의 농도를 낮게 할 수 있거나 적은 에너지로 사용할 수 있으며, 더 낮은 온도(석탄:1500-1800℃, 바이오매스: 1100℃)에서 상대적으로 짧은 반응시간에 합성할 수 있어 주목받고 있다. Recently, a technology to produce syngas by vaporizing biomass has been developed. The process of using biomass can lower the concentration of sulfur compounds contained in syngas or use it with lower energy than the case of using coal, Coal: 1500-1800 占 폚, biomass: 1100 占 폚) at a relatively short reaction time.

이러한 바이오매스 유래의 합성가스를 이용할 수 있는 미생물로 아세토젠(Acethgens)이 있다. 호모아세토젠(Homoacetogen)이라고 정의하는 상기 미생물들은 우드-용달 경로(Wood-Ljungdahl pathway)를 통하여 CO나 H2를 유일한 에너지원으로 생장하는 혐기성 미생물로 대사경로 상에서 acethyl-CoA synthease(또는 carbon monoxide dehydrogenase, 이하, CODH)라는 효소를 가지고 있는데, CODH는 CO의 산화, CO2의 환원에 관여한다. 우드-용달 경로를 이용하면 합성가스를 별도의 정제나 농축공정 없이 유기산으로 전환시킬 수 있고, 상온 및 상압에서 이루어지며, 황 불순물에 영향을 받지 않으므로 이를 이용한 연구가 전세계적으로 활발히 진행되고 있다. 현재까지 합성가스를 발효하는 것으로 알려진 세균으로는 Clostridium ljungdahlii(Enzyme and Microbial Technology 14(8), 1992 602-608.; Applied Biochemistry and Biotechnology 45(6), 1994 145-157.; Biochemical Engineering Journal 27, 2005 110-119.), Clostridium autoethanogenum(Archives of Microbiology 161 (4), 1994345-351.), Clostridium carboxidivorans P7(Biotechnology and Bioengineering 97 (5), 2007 1080-1086.; Biomass and Bioenergy 23(6), 2002 487-493.) 및 Clostridium ragsdalei P11(미국등록특허 제7,704,723호) 등이 있다. Acethgens is a microorganism that can utilize such syngas derived from biomass. These microorganisms, which are defined as Homoacetogen, are anaerobic microorganisms which grow CO or H 2 as a unique energy source through the Wood-Ljungdahl pathway. Acethyl-CoA synthease (or carbon monoxide dehydrogenase , Hereinafter referred to as CODH), which is involved in the oxidation of CO and the reduction of CO 2 . The use of the wood-drag route allows syngas to be converted to organic acids without additional purification or concentration processes, and is carried out at room temperature and atmospheric pressure, and is not affected by sulfur impurities. Bacteria known to ferment synthetic gas to date include Clostridium ljungdahlii (Enzyme and Microbial Technology 14 (8), 1992 602-608 .; Applied Biochemistry and Biotechnology 45 (6), 1994 145-157 .; Biochemical Engineering Journal 27, 2005 110-119), Clostridium autoethanogenum (Archives of Microbiology 161 (4), 1994345-351.), Clostridium carboxidivorans P7 (Biotechnology and Bioengineering 97 (5), 2007 1080-1086 .; Biomass and Bioenergy 23 2002 487-493.) And Clostridium ragsdalei P11 (US Patent No. 7,704,723).

한편, 탄소수가 5개인 이소발레르산은 향료, 약제조성물로 쓰일 뿐만 아니라 각종 병리현상 연구의 목적으로 사용되는 유기산으로, 서양쥐오줌풀(Valeriana), 꽃박하(Origanum majorana), 호프(Hop) 및 동물 지질로부터 얻을 수 있으나, 채산성이 매우 낮아 채유가 어렵다는 문제점이 있다. 대한민국등록특허 제0372218호에는 만헤이미아속 55E 및 전기균주를 혐기적인 또는 호기적인 조건에서 배양하여 유기산을 생산하는 방법에 관한 것으로, 이산화탄소로 포화된 혐기적 조건에서 숙신산, 젖산, 및 개미산을 생산하고 있으며, 미국공개특허 제2008/0311640호에서는 다양한 미생물을 이용하여 수소 및 유기산을 생산하고 있으나, 상기와 같은 종래 발명들은 acethyl-CoA pathway를 통해 아세테이트, 에탄올, 부틸레이트, 부탄올 등의 탄소수가 2 및 4개인 유기산을 생산하는데 불과하다. 따라서 탄소수가 2 내지 5개인 유기산, 특히, 이소발레르산을 생산할 수 있도록 생물학적 화합물 생산의 범위가 확대된 균주에 대한 연구가 요구되는 시점이다.On the other hand, isovaleric acid having five carbon atoms is used as a perfume, a pharmaceutical composition, and an organic acid used for various pathological studies. It is used in the fields of Valeriana, Origanum majorana, Hop and animal lipids But it has a problem in that it is difficult to raise the oil because of low profitability. Korean Patent No. 0372218 relates to a method for producing organic acids by cultivating Mannheimia sp. 55E and an electrophilic strain under anaerobic or aerobic conditions. More particularly, it relates to a method for producing succinic acid, lactic acid, and formic acid under anaerobic conditions saturated with carbon dioxide U.S. Patent Application Publication No. 2008/0311640 discloses that hydrogen and organic acids are produced using various microorganisms. However, the above-mentioned prior arts disclose that acetyl, CoA, And four individual organic acids. Therefore, it is time to study the strains which have expanded the production of biological compounds so as to produce organic acids having 2 to 5 carbon atoms, especially isovaleric acid.

본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 가스형태의 기질인 바이오매스 유래의 합성가스를 이용하여 탄소수가 2 내지 5인 다탄소 화합물, 특히 탄소수가 5개인 이소발레르산을 생산하는 특성을 가지는 균주를 제공하는데 있다. The first problem to be solved by the present invention is to use a syngas derived from biomass, which is a gaseous substrate, to produce a carbonaceous compound having 2 to 5 carbon atoms, particularly a strain having the characteristic of producing isovaleric acid having 5 carbon atoms .

본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 과제는 본 발명에 따른 균주를 이용하여 일산화탄소를 기질로 탄소수가 2 내지 5인 다탄소 화합물을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.A second problem to be solved by the present invention is to provide a method for producing a carbon compound having carbon atoms of 2 to 5 using carbon monoxide as a substrate using the strain according to the present invention.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 탄소수가 2 내지 5인 다탄소화합물을 생산하는 특성을 가지는 소의 분노에서 분리된 오실리박터속(Oscillibacter sp.) C5 [기탁번호: KCTC 12249BP]를 제공한다. To achieve the above object, the present invention is o-silico bakteo in (Oscillibacter isolated from bovine anger having a characteristic to produce the carbon compound is a carbon number of 2 to 5 sp.) C5 (Accession No .: KCTC 12249BP).

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 오실리박터속(Oscillibacter sp.) C5 [기탁번호: KCTC 12249BP]는 일산화탄소 가스원을 기질로 사용하여 탄소수가 2 내지 5인 다탄소화합물을 생산할 수 있는데, 상기 일산화탄소 가스원은 합성가스일 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the Oscillator sp.) C5 [Accession No .: KCTC 12249BP] can produce carbon-carbon compounds having 2 to 5 carbon atoms using a carbon monoxide gas source as a substrate. The carbon monoxide gas source may be a syngas.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 탄소수가 2 내지 5인 다탄소화합물은 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 이소부티르산, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 이소부탄올, 펜탄올 및 이소발레르산을 포함하는 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있는데, 특히 탄소수가 5개인 이소발레르산을 포함하는 다탄소화합물일 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the carbon black compound having 2 to 5 carbon atoms is selected from the group consisting of acetic acid, propionic acid, butyric acid, isobutyric acid, ethanol, propanol, butanol, isobutanol, pentanol and isovaleric acid , Especially a polycarbonate compound containing isovaleric acid having 5 carbon atoms.

본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 상기 오실리박터속(Oscillibacter sp.) C5 [기탁번호: KCTC 12249BP]는 혐기성 미생물일 수 있으며, According to another embodiment of the present invention, the Oscillator sp.) C5 [Accession No .: KCTC 12249BP] may be an anaerobic microorganism,

우드-용달 경로(Wood-Ljungdahl pathway)에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자를 가질 수 있는데, It may have a gene encoding enzymes involved in the Wood-Ljungdahl pathway,

상기 우드-용달 경로에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자는 아세틸 조효소에이 신타제(acetyl coA synthase), 카본 모노옥사이드 디히드로게나아제(carbon monoxide dehydrogenase), 포밀테트라하이드로폴레이트 신타제(formyltetrahydrofolate synthase), 포미미도테트하이드로폴레이트 사이클로디아미나제(formimidotetrahydrofolate cyclodeaminase), 포밀테트라하이드로폴레이트 사이클로하이들롤라제/메틸렌 테트라하이드로폴레이트 디하이드로게나제(formyltetrahydrofolatecyclohydrolase/methylenetetrahydrofolatedehydrogenase) 및 메틸렌 테트라하이드로폴레이트 리덕타제(methylene tetrahydrofolate reductase)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. Genes coding for the enzymes involved in the wood-mediated pathway include acetyl coA synthase, carbon monoxide dehydrogenase, formyltetrahydrofolate synthase, A formimidotetrahydrofolate cyclodeaminase, a formyltetrahydrofolate cyclohydrolase / methylenetetrahydrofolatedhehydrogenase, and a methylene tetrahydrofolate reductase, such as methylene tetrahydrofolate reductase), but the present invention is not limited thereto.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 배지에 일산화탄소를 충진하는 단계; 및 오실리박터속(Oscillibacter sp.) C5 [기탁번호: KCTC 12249BP]를 접종하여 배양하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 탄소수가 2 내지 5인 다탄소화합물의 제조방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, And Oscillibacter (KCTC 12249BP), and culturing the transformed plant cell line. The method for producing the carbon nanofibers having the carbon number of 2 to 5 is also provided.

상기 배양은 혐기 조건에서 수행될 수 있는데, The culture may be carried out under anaerobic conditions,

좀 더 상세하게는, pH 5.5 내지 8.0의 범위 및 25 내지 50℃의 온도범위에서 50 내지 500 rpm의 속도로 12 내지 72 시간 동안 진탕배양함으로써 수행함으로써 탄소수가 2 내지 5인 다탄소화합물을 제조할 수 있다. More specifically, by carrying out shaking culture at a pH of 5.5 to 8.0 and a temperature of 25 to 50 DEG C at a rate of 50 to 500 rpm for 12 to 72 hours, a multi-carbon compound having 2 to 5 carbon atoms is prepared .

본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 배양이 완료된 후 유기용매를 이용하여 상기 탄소수가 2 내지 5인 탄소화합물을 추출하는 단계를 더 포함할 수 있는데, According to another embodiment of the present invention, after the cultivation is completed, the method may further include extracting the carbon compound having 2 to 5 carbon atoms using an organic solvent,

상기 유기용매는 디클로로메탄, 디에틸에테르, 에틸아세테이트, 테트라하이드로퓨란, N,N-디메틸포름아미드, 톨루엔 및 클로로포름을 포함하는 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. The organic solvent may be at least one selected from the group consisting of dichloromethane, diethyl ether, ethyl acetate, tetrahydrofuran, N, N-dimethylformamide, toluene and chloroform.

본 발명에 따라 제조된 상기 탄소수가 2 내지 5인 탄소화합물은 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 이소부티르산, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 이소부탄올, 펜탄올 및 이소발레르산을 포함하는 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있는데, 특히, 탄소수가 5개인 이소발레르산을 포함하여 제조될 수 있다. The carbon compound having 2 to 5 carbon atoms prepared according to the present invention may be at least one selected from the group consisting of acetic acid, propionic acid, butyric acid, isobutyric acid, ethanol, propanol, butanol, isobutanol, pentanol and isovaleric acid In particular, can be prepared containing isovaleric acid with five carbon atoms.

본 발명에 따른 오실로스피라시에과에 속하는 신규한 균주인 오실리박터속(Oscillibacter sp.) C5 [기탁번호: KCTC 12249BP]는 소의 분뇨에서 분리한 것으로 합성가스를 기질로 사용하여 탄소수 2 내지 5개의 다탄소 화합물, 특히 탄소수가 5개인 이소발레르산을 생산할 수 있다. 본 발명에 따른 오실리박터속(Oscillibacter sp.) C5 [기탁번호: KCTC 12249BP]는 합성가스를 탄소원으로 이용하여 탄소수 2 및 4의 탄소화합물만 생산하는 종래의 아세토젠과는 상이하게 탄소수가 5개인 탄소화합물도 생산할 수 있어 생물학적 화합물의 생산 범위를 확대시켰다. Oscillibacter sp. C5 (Accession No .: KCTC 12249BP), a novel strain belonging to the genus Oscillospiraaceae according to the present invention, is isolated from cattle manure, It is possible to produce carbon compounds, especially isobaric acid having 5 carbon atoms. Oscillibacter sp. C5 according to the present invention has a carbon number of 5 or more, which is different from the conventional acetogen, which produces only carbon compounds having 2 and 4 carbon atoms, using synthesis gas as a carbon source. Individual carbon compounds could also be produced, thus expanding the production range of biological compounds.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 가스부양반응기를 도식화한 도이다. 도 1a는 미생물 농화배양에 사용된 시스템의 전체 도식도이며, 도 5b는 가스부양반응기의 구체적인 도식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 농화배양 후 Hungate tube 기술을 이용하여 단일 군집(single colony)을 형성한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따라 상동성 분석으로 작성된 오실리박터속 C5의 진화계통수이다.
도 4는 본 발명에 따른 오실리박터속(Oscillibacter sp.) C5 [기탁번호: KCTC 12249BP]를 전자주사현미경(Scanning Electron Microscope ; SEM)으로 활영한 이미지이다. 도 4a는 군집형태의 이미지이며, 도 4b는 확대 촬영한 이미지이다.
도 5는 본 발명에 따라 오실리박터속(Oscillibacter sp.) C5 [기탁번호: KCTC 12249BP]에 의해 제조된 유기산을 가스크로마토그래피 질량분석기로 분석한 데이다. 도 5a는 합성가스를 이용해 제조된 유기산의 가스크로마토그래피 질량분석기 결과이며, 도 5b는 비교예인 이소발레르산의 가스크로마토그래피 질량분석기 결과이다.
도 6은 본 발명에 따라 오실리박터속(Oscillibacter sp.) C5 [기탁번호: KCTC 12249BP]에 의해 제조된 유기산을 가스크로마토그래피 질량분석기로 분석한 결과 중, 이소발레르산의 피크를 내장된 library와 비교한 결과이다.
1 is a schematic view of a gas levitation reactor according to an embodiment of the present invention. FIG. 1A is an overall schematic diagram of a system used for microbial enrichment culture, and FIG. 5B is a specific schematic diagram of a gas levitation reactor.
FIG. 2 is a result of forming a single colony using the Hungate tube technique after the concentration cultivation according to an embodiment of the present invention.
FIG. 3 is an evolutionary diagram of C5 in acyclovir prepared by homology analysis according to the present invention.
4 is an image obtained by scanning an Oscillibacter sp. C5 [Deposit No. KCTC 12249BP] according to the present invention with a Scanning Electron Microscope (SEM). 4A is an image in the form of a cluster, and FIG.
FIG. 5 shows the analysis of an organic acid prepared by Oscillibacter sp. C5 (Accession No .: KCTC 12249BP) according to the present invention by a gas chromatography mass spectrometer. FIG. 5A is a gas chromatography mass spectrometry result of an organic acid prepared using a syngas, and FIG. 5B is a gas chromatographic mass spectrometry result of a comparative example of isovaleric acid.
FIG. 6 is a graph showing the results of analysis of an organic acid prepared by Oscillibacter sp. C5 (Accession No .: KCTC 12249BP) according to the present invention using a gas chromatograph mass spectrometer and comparing the peak of isovaleric acid with the internal library .

본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 발명이 속하는 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.All technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In general, the nomenclature used herein is well known and commonly used in the art to which the present invention pertains.

일반적으로 바이오매스 유래의 합성가스(CO, H2 및 CO2 등)를 환원력, 탄소원으로 사용하여 생장하고 부산물로서 유기물을 생산하는 미생물들을 아세토젠(Acetogen)이라고 명명하는데, 이러한 미생물들은 우드-용달 경로(Wood-Ljungdahl pathway)를 통하여 생장하는 혐기성 미생물로서, 대사경로 상에서 아세틸 조효소A 합성효소(acethyl-CoA synthease) 또는 일산화탄소 탈수소효소(carbon monoxide dehydrogenase, 이하, CODH)라는 이작용기 효소(bifunctional enzyme)를 가진다. 일산화탄소 탈수소효소는 일산화탄소의 산화, 이산화탄소의 환원에 관여하는 핵심요소로서 초산, 부티르산, 에탄올 및 부탄올 등을 생산하는데, 통상적으로 일산화탄소가 일산화탄소 탈수소효소에 의해 이산화탄소로 산화되고, 우드-용달 경로를 통하여 탄소가 2개인 아세틸 조효소A(acethyl-CoA)로 환원된다. 이때 합성된 아세틸 조효소A는 초산과 에탄올로 변환되며, 두 개의 아세틸 조효소A가 결합하여 탄소가 4 개인 아세토아세틸 조효소A(Acetoacetyl-CoA)로 변환되고 이것이 부티르산 및 부탄올로 변화된다. 종래의 아세토젠은 상기와 같이 탄소가 2 개 또는 4 개인 유기산만을 생산할 수 있으며, 탄소 수가 홀수개인 유기산 (탄소수가 3 또는 5개인 유기산)을 생산하는 균주에 대한 연구는 부족한 실정이다. 이에, 본 발명자들은 탄소수가 홀수 개인 유기산, 특히 탄소수가 5개인 이소발레르산을 생산할 수 있는 특성을 나타내는 균주를 찾기 위해 예의 노력한 결과 본 발명에 따른 신규한 균주인 오실리박터속(Oscillibacter sp.) C5 [기탁번호: KCTC 12249BP]를 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
In general, microorganisms that grow using biomass-derived syngas (such as CO, H 2, and CO 2 ) as a reducing power and carbon source and produce organic materials as by-products are named as Acetogen, (COD synthetase) or carbon monoxide dehydrogenase (CODH), which is a bifunctional enzyme, on the metabolic pathway, which is an anaerobic microorganism that grows through the Wood-Ljungdahl pathway. . The carbon monoxide dehydrogenase produces acetic acid, butyric acid, ethanol and butanol as a key element involved in the oxidation of carbon monoxide and the reduction of carbon dioxide. Usually, carbon monoxide is oxidized to carbon dioxide by a carbon monoxide dehydrogenase, Is reduced to acetyl coenzyme A (acethyl-CoA), which has two hydroxyl groups. At this time, the synthesized acetyl coenzyme A is converted into acetic acid and ethanol, and two acetyl coenzyme A binds to convert to acetoacetyl coenzyme A (Acetoacetyl-CoA) having four carbons, which is converted into butyric acid and butanol. Conventional acetogens can only produce organic acids having two or four carbon atoms as described above, and studies on strains producing organic acids having an odd number of carbon atoms (organic acids having 3 or 5 carbon atoms) are in short supply. Therefore, the present inventors have made intensive efforts to find a strain that can produce an organic acid having an odd number of carbon atoms, particularly, isovaleric acid having 5 carbon atoms. As a result, the novel strain Oscillibacter sp. C5 [Deposit number: KCTC 12249BP], thereby completing the present invention.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명에 따른 균주는 가스형태의 기질인 바이오매스 유래 일산화탄소(C1)을 이용하여 탄소수가 2 내지 5개인 유기산, 특히 탄소수가 3 또는 5인 유기산을 포함하는 유기산을 생산할 수 있다.The strain according to the present invention can produce an organic acid containing 2 to 5 carbon atoms, especially an organic acid having 3 or 5 carbon atoms, using carbon monoxide (C1) derived from biomass, which is a gaseous substrate.

본 발명에 따른 균주는 균주에서 수득한 16S 리보솜 DNA(16S rDNA)의 상동성을 비교하고 분석한 결과 오실로스피라시에과(Oscillospiraceae family)에 속했으며, 가장 가까운 균주인 오실리박터 발레리시젠스(Oscillibacter valericigenes)와 98%의 상동성(similaiity)를 가지는 것으로 밝혀졌으나, 상기 오실리박터 발레리시젠스는 일산화탄소를 이용하는 균주가 아님을 확인하고, 이를 토대로 선별된 균주가 일산화탄소를 이용할 수 있는 균주 중 지금까지 발견되지 않은 속(genus)에 속해있는 것을 확인하였는바, 이를 오실리박터속(Oscillibacter sp.) C5로 명명하고, 국제기탁기관인 한국생명공학연구소 미생물자원센터(KCTC, 대한민국 대전광역시 유성구 과학로 125 소재)에 기탁하여 2012년 7월 23일자로 기탁번호를 KCTC 12249BP로 부여받았다.
The strain according to the present invention was obtained by comparing and analyzing the homology of 16S ribosomal DNA (16S rDNA) obtained from the strain, and found that the Oscillospiraceae family ), and the closest strain, Oscillibacter valericigenes ) and 98% homology. However, it was confirmed that the above-mentioned E. coli Valeriensis is not a strain using carbon monoxide, and based on this, the selected strains were found to contain carbon monoxide It was confirmed that it belongs to an undiscovered genus. It was named as Oscillibacter sp. C5 and was deposited with the KSCC (KCTC, Korea Science and Engineering Foundation, Daejeon Metropolitan City, Korea) KCTC 12249BP, deposited on July 23, 2012 as the deposit number.

본 발명에 따르면 상기 탄소수가 2 내지 5인 다탄소화합물은 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 이소부티르산, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 이소부탄올, 펜탄올 및 이소발레르산을 포함하는 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있는데, 특히, 프로피온산, 프로판올 및 이소발레르산 등의 탄소수가 3 또는 5인 다탄소화합물을 포함할 수 있다. According to the present invention, the multi-carbon compound having 2 to 5 carbon atoms is at least one selected from the group consisting of acetic acid, propionic acid, butyric acid, isobutyric acid, ethanol, propanol, butanol, isobutanol, pentanol and isovaleric acid In particular, it may include a multi-carbon compound having 3 or 5 carbon atoms such as propionic acid, propanol and isovaleric acid.

본 발명에 따른 상기 오실리박터속(Oscillibacter sp.) C5 [기탁번호: KCTC 12249BP]는 우드-용달 경로(Wood-Ljungdahl pathway)에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자를 가질 수 있어 일산화탄소 탄소원을 기질로 사용하여 탄소수가 2 또는 4인 다탄소화합물을 제조할 수 있으며, 상기 우드-용달 경로에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자는 아세틸 조효소에이 신타제(acetyl coA synthase), 카본 모노옥사이드 디히드로게나아제(carbon monoxide dehydrogenase), 포밀테트라하이드로폴레이트 신타제(formyltetrahydrofolate synthase), 포미미도테트하이드로폴레이트 사이클로디아미나제(formimidotetrahydrofolate cyclodeaminase), 포밀테트라하이드로폴레이트 사이클로하이들롤라제 / 메틸렌 테트라하이드로폴레이트 디하이드로게나제(formyltetrahydrofolate cyclohydrolase / methylene tetrahydrofolate dehydrogenase) 및 메틸렌 테트라하이드로폴레이트 리덕타제(methylene tetrahydrofolate reductase)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. The silica according to the present invention five bakteo in (Oscillibacter sp.) C5 [Accession No .: KCTC 12249BP] can have a gene coding for enzymes involved in the Wood-Ljungdahl pathway, using a carbon monoxide carbon source as a substrate to produce carbon compounds with 2 or 4 carbon atoms And genes coding for the enzymes involved in the wood-mediated pathway are acetyl coA synthase, carbon monoxide dehydrogenase, formate tetrahydrofolate synthase Formyltetrahydrofolate cyclohydrogenase, formyltetrahydrofolate cyclohexanase, formyltetrahydrofolate cyclohydrolase / methylene tetrahydrofolate dehydrogenase, and the like. Methylene tetrahydrofolate reductase tetrahydrofolate reductase), but the present invention is not limited thereto.

상기 일산화탄소 탄소원은 합성가스 일 수 있는데, 상기 합성가스는 CO, H2 및 CO2를 포함하는 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 일산화탄소를 탄소원으로 사용할 시, 일산화탄소 탈수소화효소에 의해 일산화탄소가 이산화탄소로 산화되며 이때 발생한 전자와 이산화탄소를 이용하여 우드-용달 경로를 통해 유기산을 생산하며, 이산화탄소를 사용하는 경우 전자원으로 H2이 수반되어야하며 동일한 경로를 통하여 유기산을 생성할 수 있다.The carbon monoxide carbon source may be a synthesis gas, and the synthesis gas may be any one selected from the group consisting of CO, H 2, and CO 2 . When carbon monoxide is used as a carbon source, carbon monoxide is oxidized to carbon dioxide by a carbon monoxide dehydrogenase, and organic acids are produced through a wood-droplet pathway by using generated electrons and carbon dioxide. When carbon dioxide is used, H 2 And it is possible to generate organic acids through the same route.

한편 본 발명에 따르면, 상기 탄소수가 5개인 이소발레르산은 다음과 같은 기전을 통해 제조될 수 있다. 기질로 일산화탄소를 이용하여 대사경로 상에서 우드-용달 경로를 통해 아세틸 조효소A를 생성하고, 2-이소프로필말레이트 하이드롤레이즈, 3-이소프로필말레이트 디하이드라타제 및 디하이도로데나제를 이용하는 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 경로를 통해 L-루신을 제조한 후, 알파-케토산 디하이드로게나제에 의해 이소발레릴-CoA로 변환되고, 포스포트랜스아실레이즈를 이용해 이소발레릴포스페이트로 변환시킨 후, 아실키나제에 의해 이소발레르산을 생성시킬 수 있다. According to the present invention, the isovaleric acid having 5 carbon atoms can be prepared by the following mechanism. Acetyl coenzyme A was produced through the wood-eluting pathway in the metabolic pathway using carbon monoxide as a substrate, and KEGG using 2-isopropyl maleate hydrolase, 3-isopropyl maleate dihydratase and dihydrogenase L-leucine is produced through the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway and then converted to isovaleryl-CoA by alpha-keto acid dehydrogenase, and is transformed into isovaleryl phosphate using phosphotransacylase After conversion, isovaleric acid can be generated by an acyl kinase.

본 발명에 따른 오실리박터속(Oscillibacter sp.) C5 [기탁번호: KCTC 12249BP]는 절대혐기성, 비운동성의 단간(rod)균으로, 25 내지 50℃의 범위에서 생육이 관찰되나, 바람직한 생육온도는 32 내지 40℃이며, 더욱 바람직한 생육온도는 35-38℃이다. 또한 pH 5.5 내지 8.0 범위에서 생육이 관찰되나, 바람직한 생육 pH는 6 내지 7.5 범위이며, 더욱 바람직한 pH는 6.5 내지 7.2 범위이다.In five bakteo silica according to the invention (Oscillibacter C5 [Deposit number: KCTC 12249BP] is a rod bacterium of absolute anaerobic and non-flowability, and growth is observed in the range of 25 to 50 ° C, but the preferred growth temperature is 32 to 40 ° C, The temperature is 35-38 ° C. The growth is observed in the range of pH 5.5 to 8.0, but the preferred growth pH is in the range of 6 to 7.5, and the pH is more preferably in the range of 6.5 to 7.2.

본 발명은 배지에 일산화탄소를 충진하는 단계; 및 오실리박터속( Oscillibacter sp.) C5 [기탁번호: KCTC 12249BP]를 접종하여 배양하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 탄소수가 2 내지 5인 다탄소화합물의 제조방법을 제공한다. The present invention relates to a method for producing carbon monoxide; And five bakteo in Sicily (Oscillibacter (KCTC 12249BP), and culturing the transformed plant cell line. The method for producing the carbon nanofibers having the carbon number of 2 to 5 is also provided.

본 발명에 따른 오실리박터속(Oscillibacter sp.) C5 [기탁번호: KCTC 12249BP]는 절대혐기성 균으로 상기 배양은 혐기조건에서 수행되어야 하며, pH 5.5 내지 8.0의 범위 및 25 내지 50℃의 조건에서 50 내지 500 rpm의 속도로 12 내지 72 시간 동안 진탕배양함으로써 탄소수가 2 내지 5인 다탄소화합물을 제조할 수 있는데, 바람직하게는 pH는 6 내지 7.5 범위 및 32 내지 40℃ 범위의 조건에서 100 내지 300 rpm의 속도로 12 내지 72 시간 동안 진탕배양함으로써 제조될 수 있다.In five bakteo silica according to the invention (Oscillibacter C5 [Accession No .: KCTC 12249BP] is an absolute anaerobic strain, and the cultivation should be carried out under anaerobic conditions, and at a pH of 5.5 to 8.0 and at 25 to 50 ° C at a rate of 50 to 500 rpm, For a period of time ranging from 100 to 300 rpm for 12 to 72 hours at a pH in the range of from 6 to 7.5 and a temperature in the range of from 32 to 40 < RTI ID = 0.0 > Followed by culturing with shaking.

상기 배양이 완료된 후, 유기용매를 이용하여 상기 탄소수가 2 내지 5인 다탄소화합물을 추출하는 단계를 더 포함할 수 있는데, 상기 유기용매는 디클로로메탄, 디에틸에테르, 에틸아세테이트, 테트라하이드로퓨란, N,N-디메틸포름아미드, 톨루엔 및 클로로포름을 포함하는 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
After the completion of the culturing, the organic solvent may be extracted with an organic solvent, and the organic solvent may include dichloromethane, diethyl ether, ethyl acetate, tetrahydrofuran, N, N-dimethylformamide, toluene and chloroform.

이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to preferred embodiments. It will be apparent, however, to those skilled in the art that these embodiments are for further explanation of the present invention and that the scope of the present invention is not limited thereby.

실시예 1. 오실리박터속(Oscillibacter sp.) C5의 분리Example 1: Synthesis of Oscillibacter sp.) Isolation of C5

실시예 1.1. 소의 분뇨로부터 균주 분리 및 배양Example 1.1. Isolation and Culture of Strain from Cattle Manure

소에서 수득한 분뇨 0.5g을 혐기성 챔버에 넣고, 0.1 ml의 Na2Sㆍ9H2O 및 10 ml의 멸균식염수로 희석한 후 1 부피%로 물질전달계수가 향상된 가스부양 반응기(Gas-lift reactor, 참조: Park et al., J Ind Microbiol Biotechnol., 40:995-1003, 2013)에 접종한 후, 30℃로 운전하였다. 0.5 g of the manure obtained from cattle was placed in the anaerobic chamber and diluted with 0.1 ml of Na 2 S.9H 2 O and 10 ml of sterile saline and then diluted to 1 volume% with a gas-lift reactor , Park et al., J Ind Microbiol Biotechnol., 40: 995-1003, 2013).

사용된 배지는 인산완충 기본배지(phosphate buffered basal medium, PBBM)로서 구성성분은 0.9g/L의 NaCl, 0.32g/L의 MgSO4ㆍ7H2O, 0.15g/L의 CaCl2, 1.0g/L의 NH4Cl, 15.0mg/L의 Nitrilotriacetic acid, 1.0mg/L의 FeSO4ㆍ7H2O, 1.0mg/L의 MnCl2ㆍ4H2O, 1.7mg/L의 CoCl2ㆍ6H2O, 1.0mg/L의 ZnCl2, 1.0mg/L의 CaCl2ㆍ2H2O, 0.2mg/L의 CuCl2ㆍ2H2O, 0.1mg/L의 H3BO3, 0.1mg/L의 Na2MoO4, 0.17mg/L의 Na2SeO3, 0.26mg/L의 NiSO4ㆍ6H2O, 10mg/L의 NaCl, 0.002mg/L의 Biotin, 0.002mg/L의 Folic acid, 0.1mg/L의 Pyridoxine HCl, 0.05mg/L의 Thiamine HCl, 0.05mg/L의 Riboflavin, 0.05mg/L의 Nicotinic acid, 0.05mg/L의 Pantothenic acid, 0.001mg/L의 Cyanocobalamine, 0.005mg/L의 p-aminobenzoic, 0.005mg/L의 Lipoic acid, 10mM의 phosphate buffer, 0.00002%의 Resazurin, 2g/L의 효모추출물로 이루어져 있다. 배양한지 8일 후 기질인 일산화탄소를 모두 소비하였으며, 농화배양액을 10- 7으로 희석하여 헝게이트 롤튜브(Hungate roll tube 참조: Miller et al., Appl Microbiol 27(5):985-987, 1974) 방법을 사용하여 단일 집락을 형성하게 한 뒤 이들 각각을 일산화탄소 1기압으로 충진한 인산완충 기본배지에 접종하여 180 rpm으로 진탕배양하였다. 생산된 유기산들은 가스크로마토그래피 불꽃 이온화검출기(Gas chromatography- Flame Ionization Detector, GC-FID, ACME 6000, Young Lin Instrument Co., Anyang, Korea)로 측정하여 이소발레르산을 생산할 수 있는 능력을 보이는 균주를 선별하였다.
The culture media used were phosphate buffered basal medium (PBBM) containing 0.9 g / L NaCl, 0.32 g / L MgSO 4 .7H 2 O, 0.15 g / L CaCl 2 , 1.0 g / L of NH 4 Cl, 15.0 mg / L of nitrilotriacetic acid, 1.0 mg / L of FeSO 4 .7H 2 O, 1.0 mg / L of MnCl 2 .4H 2 O, 1.7 mg / L of CoCl 2 .6H 2 O, CaCl of 1.0mg / L of ZnCl 2, 1.0mg / L 2 and 2H 2 O, 0.2mg / L of CuCl 2 and 2H 2 O, 0.1mg / L of H 3 BO 3, of 0.1mg / L Na 2 MoO 4 , 0.17 mg / L Na 2 SeO 3 , 0.26 mg / L NiSO 4 .6H 2 O, 10 mg / L NaCl, 0.002 mg / L Biotin, 0.002 mg / L Folic acid, 0.1 mg / L Pyridoxine HCl, 0.05 mg / L Thiamine HCl, 0.05 mg / L Riboflavin, 0.05 mg / L Nicotinic acid, 0.05 mg / L Pantothenic acid, 0.001 mg / L Cyanocobalamine, 0.005 mg / L p- Lipoic acid, 10 mM phosphate buffer, 0.00002% Resazurin, and 2 g / L yeast extract. Eight days after the culture, all of the carbon monoxide was consumed. Dilute the concentrated culture solution to 10 - 7 , and add Hungrate roll tube (Miller et al., Appl Microbiol 27 (5): 985-987, 1974) , And then each of them was inoculated into phosphate buffered basal medium filled with 1 atm of carbon monoxide and cultured with shaking at 180 rpm. The produced organic acids were measured by a gas chromatography-flame ionization detector (GC-FID, ACME 6000, Young Lin Instrument Co., Anyang, Korea) to produce a strain showing the ability to produce isovaleric acid Respectively.

실시예 1.2 균주의 동정 Example 1.2 Identification of Strain

본 발명에서 선정된 오실리박터속( Oscillibacter sp.) C5를 동정하기 위해 전기 균주로부터 Insta-gene™ Matrix(Bio rad) 사용제품을 이용하여 게놈 DNA(Genomic DNA)를 분리하였다. 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 1:5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'(서열번호 1)과 프라이머2: 5'-TACGGYTACCTTGTTACG ACTT-3'(서열번호 2)를 사용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행함으로써, 16S rDNA를 증폭하였다. 이어, 증폭된 16S rDNA의 염기서열을 알아내고, MEGA 버전 4.0을 사용하여 두 가닥의 염기서열을 연결하였다. DNA 염기서열 분석은 National Center for Biotechnology Information의 BLAST software (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)로 수행되었으며, 이를 하기 표 1에 나타내었다. The selection of the present invention o silica bakteo in (Oscillibacter To identify C5, genomic DNA was isolated from an electric strain using Insta-gene ™ Matrix (Bio rad) product. Using the separated genomic DNA as a template, PCR was performed using primer 1: 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 '(SEQ ID NO: 1) and primer 2: 5'-TACGGYTACCTTGTTACG ACTT-3' (SEQ ID NO: 2) chain reaction, PCR) was performed to amplify 16S rDNA. Next, the base sequence of the amplified 16S rDNA was determined and the two strands of the base sequence were ligated using MEGA version 4.0. DNA sequencing was performed with BLAST software (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) of the National Center for Biotechnology Information, which is shown in Table 1 below.

하기 표에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따라 선정된 균주는 일산화탄소를 기질로 유기산을 생산하는 균주(단 Oscillibacter valericigenes Escherichia coli는 제외)와 상동성을 나타냈으나, 84 내지 85 %의 상동성에 불과하였다. 한편 상기 균주는 오실리박터 발레리시젠스(Oscillibacter valericigenes)와 98%의 상동성을 나타내었다. 상기와 같은 상동성 분석을 토대로 진화계통수(phylogenetic tree)를 도 3에 나타내었다.
As shown in the following table, the strain selected according to the present invention is a strain producing organic acids using carbon monoxide as a substrate (however, Oscillibacter valericigenes and Escherichia coli ), but only 84 to 85% homology. On the other hand, the strain is an Oscillibacter valericigenes ) and 98% homology. A phylogenetic tree based on the above-described homology analysis is shown in FIG.

종명Class name 코드번호Code number 상동성(%)Homology (%) 오실리박터 발레리시젠스(Oscillibacter valericigenes) DSM 18026T Oscillibacter < RTI ID = 0.0 > valericigenes ) DSM 18026T AB238598AB238598 9898 부틸로박테리움 메틸로트리피쿰(Butyribacterium methylotrophicum) ATCC 33266T Butyribacterium methylotrophicum ATCC 33266T AF064241.1AF064241.1 8585 아세토박테리움 카비노리쿰(Acetobacterium carbinolicum) DSM 2925T Acetobacterium carbinolicum DSM 2925T X96956X96956 8484 아세토박테리움 피메타리움(Acetobacterium fimetarium) ATCC 51795T Acetobacterium < RTI ID = 0.0 > fimetarium ) ATCC 51795T X96959X96959 8484 아세토박테리움 말리쿰(Acetobacterium malicum) ATCC 51201T Acetobacterium < RTI ID = 0.0 > malicum ) ATCC 51201T X96957X96957 8484 아세토박테리움 파울도슘(Acetobacterium paludosum) ATCC 51793T Acetobacterium fuldosium ( Acetobacterium paludosum ) ATCC 51793T X96958X96958 8585 아세토박테리움 툰드레(Acetobacterium tundra) DSM 9173T Acetobacterium < RTI ID = 0.0 > tundra ) DSM 9173T AJ297449)AJ297449) 8585 아세토박테리움 우디(Acetobacterium woodii) DSM 1030T Acetobacterium < RTI ID = 0.0 > woodii ) DSM 1030T NR_026323.1NR_026323.1 8484 아세토박네리움 바키(Acetobacterium bakii) DSM 8239T Acetobacterium bakii ) DSM 8239T X96960X96960 8484 클로스트리디움 오토에타노지눔(Clostridium autoethanogenum) DSM 10061T Clostridium autoethanogenum DSM 10061T < RTI ID = 0.0 > Y18178.1Y18178.1 8484 클로스트리디움 카복시도란스(Clostridium carboxidivorans) DSM15243T Clostridium carboxidivorans DSM 15243T FR733710.1FR733710.1 8484 클로스트리디움 락스달라이(Clostridium ragsdalei) ATCC BAA-622T Clostridium < RTI ID = 0.0 > ragsdalei ) ATCC BAA-622T DQ020022.1DQ020022.1 8484 모렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica) ATCC 39289T Moorella thermoacetica ) ATCC 39289T AJ633105.1AJ633105.1 8484 대장균(Escherichia coli) Escherichia coli ) AE014075.1AE014075.1 8080

상기 표 1 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 분리된 균주는 오실로스피라시에과(Oscillospiraceae family)에 속했으며, 가장 가까운 균주인 오실리박터 발레리시젠스(Oscillibacter valericigenes)와 98%의 유사성을 보이지만, 상기 오실리박터 발레리시젠스는 일산화탄소를 이용하는 균주가 아님을 문헌(Iino et al., Int J Syst Evol Microbiol., 57(8): 1840-1845, 2007)으로 확인하여, 상기 균주가 일산화탄소를 소비할 수 있는 오실리박터속의 신종 균주임을 알 수 있었다. 또한, 혐기성 미생물로 일산화탄소를 이용하여 탄소수 2 또는 4개의 탄소화합물을 생산하는 종래의 아세토젠과는 상이하게 탄소수 2 또는 4개의 탄소화합물 이외에도 탄소수가 3 또는 5인 화합물을 더 생산하는 특이성을 가져 상기 결과로부터 상기 균주를 오실리박터속 C5라 명명하였다.
As shown in Table 1 and Fig. 3, the isolated strains were Oscillospiraceae family and shows 98% similarity to the closest strain Oscillibacter valericigenes , but the Oshiltera valeriensis is not a carbon monoxide-derived strain (Iino et al., Int J Syst Evol Microbiol., 57 (8): 1840-1845, 2007). As a result, it was found that the strain is a novel strain in oyster barter capable of consuming carbon monoxide. Further, unlike the conventional acetogen, which produces 2 or 4 carbon atoms using carbon monoxide as the anaerobic microorganism, it has the specificity of further producing a compound having 3 or 5 carbon atoms in addition to the carbon atoms of 2 or 4 carbon atoms From the result, the strain was named C5 in oyster.

실시예 2. 오실리박터속 C5의 특성조사Example 2. Characterization of C5 in oshilter

본 발명의 오실리박터속 C5의 군집형태는 헝게이트 롤튜브 방법을 이용하여 확인하였다. 160 ml의 혐기성미생물 배양 전용 유리병(Wheaton Scientific Co., Millville, USA)에 동일한 80 ml의 인산완충 기본배지를 넣고 밀봉 후 일산화탄소를 1기압으로 충진한 뒤 121℃에서 15분간 멸균 후 오실리박터속 C5을 1%(v/v) 접종하고 37℃의 온도로 180 rpm으로 진탕 배양하여 OD600 0.8까지 키웠다. 헝게이트 튜브에 동일한 배지 및 일산화탄소를 충진하고 2.5%(v/v)의 한천을 넣고 멸균한 후 배양한 오실리박터속 C5를 10- 7으로 희석하고, 이를 접종하였다. 48시간 후, 형성된 집락(colony)을 관찰한 결과, 집락은 엷은 흰색(whitish) 의 부드러운(smooth) 표면을 가지며, 직경이 약 1 내지 2mm로 측정되었다. 또한, 주사전자현미경(SEM)을 이용하여, 오실리박터속 C5의 단세포를 관찰하였으며, 이를 도 4에 나타내었다. The cluster form of C5 in the organism of the present invention was confirmed by the Hunggart roll tube method. The same 80 ml of phosphate buffered basal medium was added to 160 ml of anaerobic microorganism culture glass bottle (Wheaton Scientific Co., Millville, USA), filled with carbon monoxide at 1 atm after sealing, sterilized at 121 ° C for 15 minutes, The genus C5 was inoculated with 1% (v / v) and incubated at 37 ° C with shaking at 180 rpm and grown to OD 600 0.8. The same medium and carbon monoxide were filled in the hungry tube and sterilized with 2.5% (v / v) of agar, and the cultured C5 inoculum was diluted to 10 - 7 and inoculated. After 48 hours, observing the colony formed, the colonies had a whitish smooth surface and were measured at diameters of about 1 to 2 mm. In addition, a single cell of C5 inoculum was observed using a scanning electron microscope (SEM), which is shown in Fig.

도 4에 나타낸 바와 같이, 오실리박터속 C5는 크기가 0.4 X 1.6 내지 0.5 X 2.0㎛인 비운동성의 단간(rod)형의 형태임을 확인할 수 있다.
As shown in Fig. 4, it can be confirmed that the silicic acid content C5 is in the form of a non-running rod having a size of 0.4 X 1.6 to 0.5 X 2.0 탆.

시험예 1. C2 내지 C5의 다탄소화합물 검증Test Example 1. Verification of multi-carbon compounds C2 to C5

본 발명에서 제조된 다탄소화합물을 검증하기 위하여 가스크로마토그래피 질량분석기(Gas chromatography-Mass Spectrometry, GC-MS, Agilent model 6890N, Agilent Technologies, CA, USA)를 사용하였다. 160 ml의 혐기성미생물 배양 전용 유리병에 동일한 80 ml의 인산완충 기본배지를 넣고 밀봉 후 일산화탄소를 1기압으로 충진한 뒤 121℃에서 15분간 멸균 후 전배양 된 미생물을 1%(v/v) 접종하고 180 rpm의 속도로 진탕배양기에서 48시간 배양하였다. 배양 후 배양액은 액체-액체 추출법(liquid-liquid extraction)을 이용하여 전처리하였으며 유기용매로는 디클로로메탄이 사용되었다. A gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS, Agilent model 6890N, Agilent Technologies, CA, USA) was used to verify the multi-carbon compounds prepared in the present invention. The same 80 ml of phosphate buffered basal medium was added to 160 ml of the anaerobic microorganism-cultivated glass bottle. After sealing, the autoclave was filled with carbon monoxide at 1 atm. After sterilization at 121 ° C for 15 minutes, the pre-cultured microorganism was inoculated with 1% (v / v) And cultured in a shaking incubator at a speed of 180 rpm for 48 hours. After incubation, the culture was pretreated with liquid-liquid extraction and dichloromethane was used as the organic solvent.

도 5a에 나타낸 바와 같이 가스크로마토그래피를 통해 초산, 프로피온산, 이소부티르산, 부티르산 및 이소발레르산이 검출되었다. 종래의 아세토젠에서 생성되지 않았던 탄소수가 5개인 이소발레르산이 본 발명에 따른 오실리박터속(Oscillibacter sp.) C5 [기탁번호: KCTC 12249BP]에 의해 생성되는 것을 검증하기위하여 정성분석을 시행하였다. As shown in FIG. 5A, acetic acid, propionic acid, isobutyric acid, butyric acid and isovaleric acid were detected through gas chromatography. Qualitative analysis was carried out to verify that isovaleric acid having 5 carbon atoms which was not produced in the conventional acetogen was produced by the Oscillibacter sp. C5 (Accession No: KCTC 12249BP) according to the present invention.

정성분석을 위한 표준시료는 100 ppm (0.915 mM)의 이소발레르산 표준용액(sigma-aldrich 99%, USA, 제품번호 129542)을 사용하였다.A standard sample for qualitative analysis was 100 ppm (0.915 mM) of isovaleric acid standard solution (Sigma-aldrich 99%, USA, product number 129542).

기체 크로마토그래피에 의해 분리된 유기산들은 각각 질량분석기 이온원 전자에너지(70eV)에 의해 이온화되고 사중극자를 통해 질량 대 전하비(m/z)로 분리 되었다. 도 5는 표준물질과 액체-액체 추출법(liquid-liquid extraction)으로 회수한 시료를 가스크로마토그래피 질량분석기의 특정 이온들만을 선택할 수 있는 SIM (Selective Ion Monitoring)모드로 측정한 그래프이고, 도 6은 각 이온들의 상대 세기를 내장된 library와 비교한 그래프이다. 도 5에서 보듯이, 표준물질과 샘플이 동일한 시간대(14.2분)에서 피크가 확인하였다. 그리고 질량 대 전하비에 의해 측정된 이온의 쪼개진 경향이 거의 유사함을 알 수 있었다. 도 6에서 확인할 수 있듯이, 각 이온들의 상대 세기를 해석 및 library를 탐색한 결과 이소발레르산(isovaleric acid 혹은 3-Methylbutanoic acid) 과 Quality 90의 높은 유사도를 나타냄을 알 수 있었다.The organic acids separated by gas chromatography were ionized by mass spectrometer ion source electron energy (70 eV) and separated by mass to charge ratio (m / z) through quadrupole. FIG. 5 is a graph showing a sample obtained by a liquid-liquid extraction with a reference material in a SIM (Selective Ion Monitoring) mode in which only specific ions of a gas chromatography mass spectrometer can be selected. FIG. It is a graph comparing the relative intensity of each ion with the built-in library. As shown in Fig. 5, peaks were confirmed at the same time zone (14.2 minutes) between the reference material and the sample. It was also found that the cleavage tendencies of the ions measured by mass versus charge were almost similar. As can be seen in FIG. 6, the relative intensities of the respective ions were analyzed and the library was searched. As a result, it was found that the degree of similarity of isovaleric acid (3-Methylbutanoic acid) was high.

한국생명공학연구소 미생물자원센터Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KCTC12249BPKCTC12249BP 2012072320120723

Claims (14)

탄소수가 2 내지 5인 다탄소화합물을 생산하는 특성을 가지는 소의 분노에서 분리된 오실리박터속(Oscillibacter sp.) C5 [기탁번호: KCTC 12249BP]. Oscillibacter sp. C5 (Accession No .: KCTC 12249BP) isolated from bovine anger having the characteristics of producing multi-carbon compounds having 2 to 5 carbon atoms. 제1항에 있어서, 일산화탄소 가스원을 기질로 사용하는 것을 특징으로 하는 오실리박터속(Oscillibacter sp.) C5 [기탁번호: KCTC 12249BP].The Oscillobacter sp. C5 according to claim 1, wherein the carbon monoxide gas source is used as a substrate. [Deposit number: KCTC 12249BP]. 제2항에 있어서, 상기 일산화탄소 가스원은 합성가스인 것을 특징으로 하는 오실리박터속(Oscillibacter sp.) C5 [기탁번호: KCTC 12249BP].[Claim 3] The process according to claim 2, wherein the carbon monoxide gas source is a synthesis gas. O5 C5 [Deposit number: KCTC 12249BP] Oscillibacter sp. 제2항에 있어서, 상기 탄소수가 2 내지 5인 다탄소화합물은 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올 및 이소발레르산을 포함하는 군 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 오실리박터속(Oscillibacter sp.) C5 [기탁번호: KCTC 12249BP].[Claim 4] The method according to claim 2, wherein the carbon black compound having 2 to 5 carbon atoms is at least one selected from the group consisting of acetic acid, propionic acid, butyric acid, ethanol, propanol, butanol, pentanol and isovaleric acid Oscillibacter sp. C5 [Accession No .: KCTC 12249BP]. 제1항에 있어서, 상기 오실리박터속(Oscillibacter sp.) C5 [기탁번호: KCTC 12249BP]는 혐기성 미생물인것을 특징으로 하는 오실리박터속(Oscillibacter sp.) C5 [기탁번호: KCTC 12249BP].The method of claim 1, wherein the O-silico bakteo in C5 (Oscillibacter sp.) [Accession number: KCTC 12249BP] is in O-silico bakteo characterized in that the anaerobic microorganisms C5 (Oscillibacter sp.) [Accession number: KCTC 12249BP]. 제1항에 있어서, 상기 오실리박터속(Oscillibacter sp.) C5 [기탁번호: KCTC 12249BP]는 우드-용달 경로(Wood-Ljungdahl pathway)에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자를 가지는 것을 특징으로 하는 오실리박터속(Oscillibacter sp.) C5 [기탁번호: KCTC 12249BP].2. The method according to claim 1, wherein the Oscillibacter sp. C5 (Accession No: KCTC 12249BP) has a gene encoding an enzyme involved in the Wood-Ljungdahl pathway. Oscillibacter sp. C5 [Accession No .: KCTC 12249BP]. 제5항에 있어서, 상기 우드-용달 경로에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자는 아세틸 조효소에이 신타제(acetyl coA synthase), 카본 모노옥사이드 디히드로게나아제(carbon monoxide dehydrogenase), 포밀테트라하이드로폴레이트 신타제(formyltetrahydrofolate synthase), 포미미도테트하이드로폴레이트 사이클로디아미나제(formimidotetrahydrofolate cyclodeaminase), 포밀테트라하이드로폴레이트 사이클로하이들롤라제/메틸렌 테트라하이드로폴레이트 디하이드로게나제(formyltetrahydrofolatecyclohydrolase/methylenetetrahydrofolatedehydrogenase) 및 메틸렌 테트라하이드로폴레이트 리덕타제(methylene tetrahydrofolate reductase)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 오실리박터속(Oscillibacter sp.) C5 [기탁번호: KCTC 12249BP]6. The method of claim 5, wherein the gene coding for the enzymes involved in the wood-feeding pathway is acetyl coA synthase, carbon monoxide dehydrogenase, Formyltetrahydrofolate cyclohexanone, formyltetrahydrofolate synthase, formimidotetrahydrofolate cyclodeaminase, formyltetrahydrofolate cyclohydrolase / methylenetetrahydrofolatedhydrogenase and methylene tetrahydrophosphate, ( OTC ) C5 [accession number: KCTC 12249BP] which is at least one selected from the group consisting of genes coding for methylene tetrahydrofolate reductase, 배지에 일산화탄소를 충진하는 단계; 및 오실리박터속(Oscillibacter sp.) C5 [기탁번호: KCTC 12249BP]를 접종하여 배양하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 탄소수가 2 내지 5인 다탄소화합물의 제조방법.Filling the medium with carbon monoxide; And a step of inoculating and culturing Oscillibacter sp. C5 (accession number: KCTC 12249BP). 제8항에 있어서, 상기 배양은 혐기 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 탄소수가 2 내지 5인 다탄소화합물의 제조방법.9. The method according to claim 8, wherein the culture is carried out under anaerobic conditions. 제8항에 있어서, 상기 배양은 25 내지 50℃에서 50 내지 500 rpm으로 12 내지 72 시간 동안 진탕배양하는 것을 특징으로 하는 탄소수가 2 내지 5인 다탄소화합물의 제조방법.9. The method of claim 8, wherein the culturing is carried out with shaking culture at 25 to 50 DEG C and 50 to 500 rpm for 12 to 72 hours. 제8항에 있어서, 상기 배양은 pH 5.5 내지 8.0에서 수행되는 것을 특징으로 하는 탄소수가 2 내지 5인 다탄소화합물의 제조방법.9. The method according to claim 8, wherein the culture is performed at a pH of 5.5 to 8.0. 제8항에 있어서, 배양이 완료된 후 유기용매를 이용하여 상기 탄소수가 2 내지 5인 탄소화합물을 추출하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 탄소수가 2 내지 5인 다탄소 화합물의 제조방법.The method of claim 8, further comprising extracting the carbon compound having 2 to 5 carbon atoms using an organic solvent after completion of culturing. 제8항에 있어서, 상기 배양은 일산화탄소를 기질로 하여 오실리박터속(Oscillibacter sp.) C5 [기탁번호: KCTC 12249BP]에 의해 탄소수가 2 내지 5인 탄소화합물을 생성시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 탄소수가 2 내지 5인 다탄소 화합물의 제조방법.The method of claim 8, wherein the culturing is by the carbon monoxide as a substrate O-silico bakteo in C5: characterized in that it comprises the step of carbon atoms is produced from 2 to 5 carbon compound by [accession number KCTC 12249BP] (Oscillibacter sp.) Wherein the carbon number is 2 to 5. 제8항에 있어서, 상기 탄소수가 2 내지 5인 탄소화합물은 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올 및 이소발레르산을 포함하는 군 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 탄소수가 2 내지 5인 다탄소 화합물의 제조방법.9. The method of claim 8, wherein the carbon compound having 2 to 5 carbon atoms is at least one selected from the group consisting of acetic acid, propionic acid, butyric acid, ethanol, propanol, butanol, pentanol, and isovaleric acid. 2 to 5 carbon atoms.
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