KR20150025281A

KR20150025281A - 전기화학적 실시간 중합효소연쇄반응에 기반한 목적 유전자의 검출 및 그를 위한 장치

Info

Publication number: KR20150025281A
Application number: KR20130102711A
Authority: KR
Inventors: 박현규; 안준기; 원병연; 김종원; 신인경; 정지혜; 조대연
Original assignee: 주식회사 랩 지노믹스
Priority date: 2013-08-28
Filing date: 2013-08-28
Publication date: 2015-03-10

Abstract

본 발명은 전기화학적 실시간 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 목적 유전자를 검출하는 방법, 이를 위한 키트, 및 장치에 관한 것이다.

Description

전기화학적 실시간 중합효소연쇄반응에 기반한 목적 유전자의 검출 및 그를 위한 장치{Detection of gene of interest based on electrochemical real-time PCR and device therefor}

본 발명은 중소기업청의 중소기업기술혁신개발사업의 일환으로 수행한 연구로부터 도출된 것이다.

[과제고유번호: SA113308, 과제명: 인플루엔자 감염 진단을 위한 전기화학적 real-time PCR 시스템 개발]

본 발명은 전기화학적 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 분석 방법 및 그를 위한 장치에 관한 것입니다.

인간 게놈 프로젝트의 완료 이후, 다양한 핵산검사의 기술개발이 가속화되었고, 이로 인해 유전자검사는 체외진단검사 분야 중 중추적인 위치를 차지하게 되었다. 항체 검출에 비해 특이성이 높아 감염 병원체로부터 유리된 유전자 분석, 생물학적 무기의 신속한 진단, 및 과학수사와 같은 여러 분야에서 활발히 응용되고 있어 유전자 검출을 기반으로 하는 진단 시장은 큰 폭으로 증가하고 있다.

특히, 1990년대 이후 개발된 핵산의 실시간 정량 증폭 기술은 급속히 시장이 확대되는 추세이다. 기존의 중합효소연쇄반응(PCR)은 표적 핵산의 증폭과 분석 과정이 분리되어 있는 반면, 실시간 PCR은 증폭 과정을 실시간으로 확인하고 표적핵산의 증폭과정 전의 최초 농도를 정확히 진단할 수 있는 기술로서, 최근의 신종 H1N1 인플루엔자 바이러스의 확진에 이용되면서 그 성능이 입증된 바 있다.

인플루엔자 바이러스는 바이러스성 호흡기 질환의 주요 원인 병원체로서 크게 A, B 및 C형으로 구분된다. 사람에서는 인플루엔자 A 및 B형 바이러스가 하기도 감염증을 포함한 질환을 유발하는 것으로 알려져 있는데 특히, A형 감염에 의해서 유행기간 동안 매년 약 10,000 여명의 사망자가 발생할 수 있는 것으로 알려져 있다. 인플루엔자 바이러스에 대한 연구 결과에 따르면, 각각 사람과 조류에 대해 감염성인 바이러스가 중간 숙주에서 재조합 및 증폭되어 사람에 대해 감염성을 갖는 새로운 바이러스가 출현할 수 있다. 1997년부터 2003년까지 홍콩, 이탈리아, 네덜란드 및 아시아 일부 국가에서 조류에만 감염될 수 있는 바이러스에 의한 인체 감염 발생이 보고된 바 있다. 전염성이 강해 빠르게 확산될 수 있고, 그 종류가 점점 다양해지고 있는 인체 감염 인플루엔자 바이러스를 신속 정확하게 진단할 수 있는 방법의 개발이 요구된다.

그러나, 현재의 형광 기반의 검출법의 특성상 고가의 시약 및 장비가 필요하고 분석 장비의 부피가 크기 때문에, 전문 설비과 인력을 갖춘 연구시설에서만 운용이 가능하고 검사 의뢰로부터 최종 진단 결과 통보까지 3~4일이 소요된다. 이로 인해, 2009-2010년의 신종플루 사태와 같은 긴급상황에 적절한 대처가 이루어지는데 큰 어려움이 있었다. 유전성, 전염성 질병의 신속, 간편한 현장 진단을 위해서는 검사가 필요한 다양한 장소에 쉽게 공급할 수 있게 하는 검사 방법 및 이를 위한 저가의 소형 장비 구현이 요구된다. 따라서, 저렴하고 소형화된 분석 장비와 운용이 간편하고 결과판독이 용이한 분석법 적용이 가능한 전기화학적 방법을 기반으로 하는 새로운 검출 기술 개발이 필요하다.

이에, 본 발명자들은 중합효소연쇄반응 결과를 실시간으로 용이하게 판독할 수 있는 전기화학적 분석에 대한 연구를 수행하여 본원발명을 완성하였다.

본 발명은 전기화학적 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 목적 유전자를 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 전기화학적 실시간 중합효소연쇄반응에 기반한 유전자 검출용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 전기화학적 실시간 중합효소연쇄반응에 기반한 유전자 검출용 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 양태는 하기 단계를 포함하는, 전기화학적 실시간 PCR에 의해 목적 유전자를 검출하는 방법을 제공한다:

검출 대상 시료를 제공하는 단계,

상기 시료에 전기화학적 활성물질과 PCR 반응 혼합액을 첨가하여 PCR 반응액을 준비하는 단계, 및

PCR 반응을 진행하면서 전기화학적 신호를 검출하는 단계.

전기화학적 실시간 PCR은 PCR 반응의 진행에 따라 증가되는 DNA를 별도의 처리 단계 없이 직접적으로 전기 화학적 신호로 검출하여 목적 유전자의 존재 여부를 검출할 수 있게 한다.

전기화학적 실시간 PCR은 기존의 형광 검출 기반의 실시간 PCR에 비해 장비 셋업 뿐 아니라 주변 전기적 장치와의 작동, 및 데이터 분석이 매우 간단하고, 관리와 보정이 비교적 쉬우며 장비의 소형화가 용이하다는 장점을 갖는다.

본 발명의 일 구체예에 따른 전기화학적 실시간 PCR에 기반한 방법은 형광 기반의 실시간 PCR과 동일한 수준의 분석 성능을 제공하는 것으로 확인하였다.

본 명세서에서 사용된 용어, 전기화학적 활성물질은 DNA와 반응하여 전기화학적 신호를 발생시킬 수 있는 물질을 의미한다. 예를 들면, DNA와 결합하기 전 및 후에 전기화학적 반응속도가 변하고, 이를 전기화학적 신호로 검출할 수 있게 하는 물질이다. 따라서, PCR 반응액 중에 포함시키는 경우, PCR이 진행되면서 DNA 농도가 증가하면 DNA와 결합하지 않은 전기화학적 활성물질로부터 발생하는 신호와 DNA와 결합한 전기화학적 활성물질로부터 발생하는 신호의 합인 전체 신호의 크기가 변한다. 도 1은 전기화학적 활성물질의 DNA와의 반응으로 인한 신호 변화 원리를 보여주는 개략도이다.

본 발명의 일 구체예에서, 전기적 신호는 SWV(square wave voltametry) 전류전압법을 이용하여 측정될 수 있다.

SWV 전류전압법 분석 조건은 -0.05 V 내지 -0.5 V의 전위(potential), 0.025 V의 펄스 크기, 및 25 Hz의 주파수일 수 있다.

전기화학적 활성물질은 전기화학적 신호의 민감도를 확보하기 위해 분자의 크기가 작고, DNA와의 반응성이 커야 한다. 본 발명의 방법에서 사용되는 전기화학적 활성물질은 메틸렌블루 또는 하이드록시퀴논을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 전기화학적 활성물질은 메틸렌블루이다.

본 발명의 일 구체예에서, 메틸렌블루는 PCR 반응 혼합액에 1 내지 10 μM의 농도로 첨가된다. 이 농도에서 메틸렌블루는 PCR 반응에 영향을 미치지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서, 메틸렌블루는 PCR 반응 혼합액에 10 μM의 농도로 첨가된다.

본 명세서에서 용어 "중합효소 연쇄반응"과 "PCR"은 호환적으로 사용된다.

본 명세서에서 용어 "실시간 중합효소 연쇄반응(Real-Time PCR, RT-PCR)"은 PCR 산물의 증가를 PCR의 매 사이클마다 실시간으로 관찰하는 방법으로, PCR 산물과 반응하는 전기화학적 활성 물질이나 형광 물질과 같은 표지 물질의 검출 및 정량에 의해 시료를 분석하는 방법이다. 이 방법은 기존의 PCR법이 최종 단계를 마치고 겔 상에서 염색하여 전기영동 후 PCR 산물을 확인하는 것에 비해, 전기영동의 추가 작업이 요구되지 않고 정확도 및 민감도가 뛰어나며, 재현율이 높다. 특히, 자동으로 특이 유전자의 증폭 유무를 확인할 수 있는 진단 방법으로 이용되며, 검출하고자 하는 DNA와 RNA의 정확한 정량이 가능하다(Mackay IM, Arden KE, Nitsche A. 2002. Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Res . 30(6):1292-1305). 기존의 정량적 PCR이 반응의 포화상태 이전의 지수적으로 증폭된 DNA 양을 측정하는데 비해 실시간 PCR은 지수적인 증폭이 일어나는 초기의 시료의 양을 표지물질의 지수적 증가가 탐지되기 시작하는 사이클의 수(Ct)로 나타내므로 보다 정확한 정량분석 방법이며 반응을 실시간으로 분석할 수 있다. 실시간 중합효소 연쇄 반응을 위해서는 프라이머가 검출가능한 수단에 의해 표지되거나 또는 별도의 표지된 프로브가 이용되거나, 또는 DNA와 반응하여 신호를 생성하는 물질이 PCR 반응액에 첨가된다.

본 명세서에서 용어 "중합효소 연쇄반응용 혼합물", "PCR 반응 혼합액", 또는 "중합효소 연쇄반응용 조성물"은 주형 이외의 중합효소 연쇄반응을 수행하기 위해 필요한 성분들을 모두 포함하는 혼합물을 의미한다. 일반적으로, 기본적인 중합효소 연쇄 반응용 혼합물은 각각 1μM 내지 50 mM의 정방향 및 역방향 프라이머, 10 mM Tris HCl pH 8.0 내지 9.0과 같은 중합효소 반응용 완충 용액, 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 각각 250 μM인 4종류의 dNTP, 및 0.5 내지 1U의 DNA 중합효소를 포함한다. 중합효소 연쇄 반응용 혼합물은 원하는 반응 용량 및 속도에 따라 x2 내지 x10과 같이 고배수의 농도로 이용될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "중합효소 연쇄반응용 반응액" 또는 "PCR 반응액"은 주형까지 첨가되어 중합효소 연쇄 반응을 수행하기 위해 필요한 모든 성분들이 포함된 반응액을 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 PCR 반응을 진행하면서 전기화학적 신호를 검출하는 단계는 PCR 반응액을 전극이 패터닝된 칩 위에 배치된 인큐베이션 챔버에 적용하여 칩 상에서 수행된다.

일반적으로 PCR 반응은 튜브에서 수행되나, 이는 전기화학적 신호 측정에는 적합하지 않다. 따라서, 본원발명의 방법에서는 PCR 반응이 진행되는 동시에 전기화학적 신호측정이 가능할 수 있도록 칩 상에서 PCR 반응이 수행된다. 구체적으로, PCR 반응은 전극 표면에서 수행된다. 전기화학적 활성 물질이 포함된 중합효소연쇄 반응액을 적용하여 반응이 진행되면서 발생하는 전기화학적 신호 변화를 검출할 수 있도록 하기 위해, 기준(reference) 전극, 보조(counter) 전극 및 작업(working) 전극을 패터닝된 칩을 준비하고, 그 위에 반응액을 유지시킬 수 있는 인큐베이션 챔버 프레임을 배치하여 인큐베이션 챔버를 형성시킨다. 인큐베이션 챔버 프레임은 상기 칩과 접촉하여 인큐베이션 챔버를 형성하는 프레임으로서, 하부면에 형성되어 있는 홈(groove)에 결합된 밀봉(sealing) 부재에 의해 인큐베이션 챔버를 형성할 영역이 정의되어 있다. 도 4는 전극이 패터닝된 칩과 그 위에 조립된 인큐베이션 챔버를 보여준다.

인큐베이션 챔버에 PCR 반응액을 넣고 기포가 생기지 않도록 주의하면서 커버 슬립을 덮는다. 그 후, 상기 챔버를 PCR용 온도조절장치(thermocycler)에 배치하고 PCR 반응을 수행한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 칩은 유리로 제조되고, 그 위에 금으로 패터닝된 기준 전극, 작업 전극, 및 보조 전극을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 기준 전극은 Ag/AgCl 층으로 코팅되어, 준-기준 전극(pseudo-reference electrode)로 작용한다.

칩 기반 PCR의 특이성과 검출 수준의 확보를 위해 칩을 형성하는 유리의 열전도도가 매우 중요하다. 바람직하게는, 두께 1 mm 이하의 파이렉스 글래스 웨이퍼(pyrex glass wafer)를 사용한다.

칩 기반 PCR 수행에서는 반응 동안 반응액 내의 물질들의 전극표면으로의 비특이적 흡착으로 인한 전기적 신호 간섭을 방지해야 한다. 이를 위해, 칩 상의 전극 표면을 DNA 중합효소와 같은 단백질의 비특이적 흡착으로 인한 전기적 신호 간섭을 막기 위해 머캅토헥산올로 처리한다. 또한 반응액 중에 BSA(Bovine serum albumin) 단백질을 포함시켜, 전기화학적 신호 간섭을 최소화시킨다.

PCR 반응액 중에 기포가 생기면 열전도율이 떨어질 뿐만 아니라 전기적 신호 측정이 제한될 수 있기 때문에, PCR 반응액을 인큐베이션 챔버에 넣은 후 커버 슬립을 덮을 때에는 기포가 생기지 않도록 주의해야한다.

PCR 반응액의 부피는 인큐베이션 챔버의 크기를 조절하는 것에 의해 조절될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 목적 유전자는 인플루엔자 검출을 위한 InfA, swInfA, swH1 및 RNaseP이다.

InfA는 범용 인플루엔자 A(universal influenza A)를 검출한다.

swInfA는 돼지 인플루엔자 A(swine influenza A)(NP 유전자)를 특이적으로 검출하며, swH1은 돼지 인플루엔자 A, 서브타입 H1 (HA 유전자)을 특이적으로 검출한다.

RNaseP는 인간 RNaseP를 검출하며, 인간 임상 시료에서 양성 대조군으로 작용한다.

시료 중에서 이들 유전자의 검출에 근거하여 인플루엔자 A 또는 H1N1 인플루엔자의 감염 여부를 확인하는데 필요한 정보를 얻을 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 InfA, swInfA, swH1 및 RNaseP는 각각 서열번호 1과 2, 서열번호 3과 4, 서열번호 5와 6, 및 서열번호 7과 8의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된다.

본 발명의 일 구체예에서, 인플루엔자 검출을 위한 PCR 반응은 95℃에서 5분의 예비 변성, 95℃에서 20초 변성, 59℃에서 20초 어닐링, 및 72℃에서의 30초 신장으로 구성된 사이클의 40회 반복, 및 72℃에서 5분의 최종 신장으로 수행된다.

본 발명의 일 구체예에서, 인플루엔자 검출을 위한 PCR 반응액은 180 내지 200, 바람직하게는 191 ㎍의 소혈청 알부민(BSA) 및 0.5 내지 1 U, 바람직하게는 0.6 U의 DNA 중합효소를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태는 PCR 반응 혼합액 및 메틸렌블루를 포함하는, 전기화학적 실시간 중합효소연쇄반응에 기반한 목적 유전자 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 키트는 PCR 반응과 동시에 전기화학적 신호 측정이 가능한 진단 칩을 더 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 진단 칩은 진단 목적으로 사용되는 바이오칩으로, 유리, 실리콘, 플라스틱 등으로 제조된 기판 사에서 DNA, 단백질, 기타 화학이나 생물학적 시료를 반응시켜 진단을 위해 필요한 정보를 얻기 위해 사용될 수 있는 칩을 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 진단 칩은 그 표면에 금으로 패터닝된 작업 전극, 기준 전극 및 보조 전극을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 키트는 진단 칩 상의 전극 위에 배치되는 PCR 반응용 인큐베이션 챔버 프레임을 더 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 인큐베이션 챔버 프레임은 그 하부면에 밀봉(sealing) 부재가 존재하여, 칩 등의 표면에 접촉하여 챔버로 기능할 수 있는 영역을 정의할 수 있는 프레임을 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 진단 칩은 중합효소연쇄반응을 위해 온도조절장치(thermocycler)에 장착된다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 목적 유전자는 인플루엔자 바이러스를 검출하기 위한, InfA, swInfA, swH1 및 RNaseP이다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 키트는 각각 InfA, swInfA, swH1 및 RNaseP를 증폭하기 위한 서열번호 1과 2, 서열번호 3과 4, 서열번호 5와 6, 및 서열번호 7과 8의 프라이머 세트를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태는 표면에 전극이 패터닝된 칩, 상기 칩과 접촉하여 인큐베이션 챔버를 형성하는 프레임으로서, 하부면에 형성되어 있는 홈(groove)에 결합된 밀봉 부재에 의해 인큐베이션 챔버를 형성할 영역이 정의되어 있는 인큐베이션 챔버 프레임, 상기 칩을 수용하는 수용부가 형성되어 있는 칩 지지대, 상기 칩 지지대가 배치되는 온도조절장치, 및 상기 전극에 연결된 전기화학 분석 장치를 포함하는, 전기화학적 실시간 중합효소연쇄반응용 장치를 제공한다.

도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 전극이 패터닝된 칩, 인큐베이션 챔버 프레임 및 칩 지지대의 조립에 의해 형성된 인큐베이션 챔버와 전기화학 분석 장치의 연결을 보여주고, 도 7은 본 발명의 일 구체예에 따른 칩 지지대를 온도조절장치에 장착시키는 것을 보여준다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 칩은 두께 1 mm 이하의 파이렉스 글래스 웨이퍼로 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 전극은 작업전극, 기준전극 및 보조전극으로 구성되며, 금으로 패터닝된다.

본 발명의 일 구체예에서, 기준 전극은 전착(electrodeposition) 방법을 이용하여 Ag/AgCl 층으로 코팅하여 준기준 전극(pseudo-reference electrode)로 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 인큐베이션 챔버 프레임은 그 하부면에 있는 홈에 결합된 밀봉(sealing) 부재가 존재하여, 칩과 접촉시 밀봉되어 그 프레임에 정의되는 인큐베이션 챔버를 형성한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 인큐베이션 챔버 프레임의 실링 부재는 원형 실링 표면(annular sealing surface)을 갖는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 원형 실링 표면의 부재는 O-링일 수 있다. 실링 부재의 재질은 압축 시 변형가능한 탄성력 있는 어떤 폴리머도 사용가능하나 바람직하게는 고무 재질, 특히, 니트릴계 고무일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 전기화학 분석 장치는 컴퓨터와 연결되어 전용 소프트웨어에 의해 제어되고 작동된다.

이하에서 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따른 방법과 키트 및 장치는 전기화학적 유전자 간편 진단 시스템을 구현하여, 인플루엔자를 포함한 다양한 유전성 질환 및 감염성 질환의 조기 진단에 기여할 수 있다.

도 1은 전기화학적 활성물질인 메틸렌블루의 DNA와의 반응으로 인한 신호 변화 원리를 보여주는 개략도이다.
도 2는 메틸렌블루와 DNA의 반응에 대한 순환전압전류법(CV)에 의한 산화환원신호 측정결과(2a: 실선은 DNA와 결합하고 있는 메틸렌블루를 나타내고, 점선은 자유상태의 메틸렌블루를 나타낸다)와 스캔 속도에 따른 산화환원전류의 변화(2b:○은 자유상태의 메틸렌블루를 나타내고, ●는 DNA와 결합하고 있는 메틸렌블루를 나타낸다)를 보여준다.
도 3은 DNA 농도 증가에 따른 메틸렌블루의 전기화학적 검출 신호의 감소를 보여준다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따른 전극이 패터닝된 칩과 그 위에 조립된 인큐베이션 챔버를 보여준다.
도 5는 메틸렌블루의 농도에 따른 PCR에 대한 영향을 보여준다.
도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 전극이 패터닝된 칩, 인큐베이션 챔버 프레임 및 칩 지지대의 조립에 의해 형성된 인큐베이션 챔버와 전기화학 분석 장치의 연결을 보여준다.
도 7은 본 발명의 일 구체예에 따른 칩 지지대를 온도조절장치에 장착시키는 것을 보여준다.
도 8a는 유전자 InfA의 최초 카피수에 따른 전기화학적 실시간 PCR의 증폭 커브이고, 도 8b는 유전자 InfA의 최초 카피수에 따른 Ct 값을 보여준다.
도 9a는 유전자 swInfA의 최초 카피수에 따른 전기화학적 실시간 PCR의 증폭 커브이고, 도 9b는 유전자 swInfA의 최초 카피수에 따른 Ct 값을 보여준다.
도 10a는 유전자 swH1의 최초 카피수에 따른 전기화학적 실시간 PCR의 증폭 커브이고, 도 10b는 유전자 swH1의 최초 카피수에 따른 Ct 값을 보여준다.
도 11a는 유전자 RNaseP의 최초 카피수에 따른 전기화학적 실시간 PCR의 증폭 커브이고, 도 11b는 유전자 RNaseP의 최초 카피수에 따른 Ct 값을 보여준다.

실시예 1. 전기화학적 활성 물질의 선택 및 특성규명

(1) 전기화학적 활성 물질의 선택

전기화학적 실시간 PCR에 이용하기에 적합한, DNA와 반응할 수 있고, 그에 따라 전기화학적 신호의 변화를 가져오는 활성물질을 선택하기 위해, DNA와 반응성이 있다고 알려진 전기화학적 활성 물질인 메틸렌블루(Methylene blue; MB)와 하이드로퀴논(Hydroquinone; HQ)을 대상으로 DNA와의 반응에 따른 검출신호를 테스트했다. 전기화학적 신호의 민감도와 검출 한계 확보를 위해 전기화학적 분석방법 중 signal/noise 가 가장 작은 분석 방법인 SWV (square wave voltammetry) 전류전압법을 이용하여 전기적 검출 신호를 측정했다.

SWV 전류전압법 분석 조건은 -0.05 V 내지 -0.5 V의 전위, 0.025 V의 펄스 크기, 및 25 Hz의 주파수였다.

동일 농도의 메틸렌블루(MB)와 하이드로퀴논(HQ)의 전기화학적 신호를 측정한 결과 전위에 의한 산화환원으로부터의 발생되는 전기화학적 검출신호는 메틸렌 블루(MB)에서 하이드로퀴논(HQ)보다 약 2배 이상의 높았다. 이에 의해 산화환원에 의한 높은 전기화학적 검출신호를 보이는 메틸렌블루를 전기화학적 실시간 연쇄반응에 이용할 전기화학적 활성 물질로 선택했다.

(2) 메틸렌블루의 전기화학적 특성

도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 전기화학적 활성 물질인 메틸렌블루는 DNA와 반응하기 전과 후에 전기화학적 반응속도가 변화한다. PCR이 진행되면서 DNA 농도가 증가하게 되면 DNA와 반응하지 않은 메틸렌블루와(자유상태 메틸렌블루) DNA와 반응한 메틸렌블루(메틸렌블루-DNA 복합체)로부터 나오는 전체 신호의 크기가 변화한다.

자유상태의 메틸렌블루와 DNA와 반응한 메틸렌블루의 순환전압전류법(cyclic voltammetry; CV)에 의한 분석 결과(도 2a) 자유상태 메틸렌블루 (점선)는 높은 산화환원 신호를 보이는 반면 DNA와 반응하고 있는 메틸렌블루 (실선)는 자유상태의 메틸렌블루(점선)와 비교해 현저하게 낮은 산화환원 신호를 보였다. 이때, 산화 전위와 환원 전위 간의 차이는 동일하며, 이는 자유 메틸렌블루와 DNA와 결합한 메틸렌블루의 전자전달계수는 동일하다는 것을 의미한다.

자유상태의 메틸렌블루와 DNA와 결합한 메틸렌블루는 각각 스캔 속도(scan rate)에 따른 산화환원 전류의 플롯에서 알 수 있는 바와 같이(도 2b), 스캔 속도의 제곱근이 음극 피크 전류(cathodic peak current)에 비례했다. 이는 두 상태로부터 나오는 신호는 메틸렌블루가 전극표면에 흡착되지 않고, 확산에 의해서 발생한 신호라는 것을 의미한다. 또한, 이 플롯에서 기울기는 DNA와 반응 후에 현저히 감소되었다. 이로부터, DNA 농도 증가에 따른 메틸렌블루의 전기화학적 반응 속도 감소는 메틸렌블루가 DNA와 반응한 후에 확산 계수가 감소하기 때문인 것으로 확인하였다.

도 3은 DNA 농도 증가에 따른 메틸렌블루의 전기화학적 검출 신호 감소를 보여준다. 전기화학적 신호를 내는 활성물질인 메틸렌블루는 DNA와 반응하기 전과 후에 확산 계수가 달라 PCR에 의한 핵산 증폭이 진행되면서 DNA 농도가 증가하게 되면 확산 계수가 상대적으로 큰 자유상태의 메틸렌블루의 농도는 감소하는 반면 확산 계수가 작은 DNA와 결합한 메틸렌블루의 농도는 증가되고, 결과적으로 PCR이 진행됨에 따라 두 물질로부터 측정되는 전체신호는 감소했다.

(3) PCR 반응액 중 메틸렌블루의 농도

메틸렌블루의 농도가 PCR 반응에 미치는 영향을 조사하기 위해 PCR 반응액 중 메틸렌블루의 농도를 0, 1, 5 및 10 μM로 변화시켰다.

메틸렌블루를 0, 1, 5 및 10 μM 포함하는 PCR 반응액에서 각각 인플루엔자 감염체로부터 수득된 DNA 시료를 주형으로 서열번호 1과2, 서열번호 3과 4, 서열번호 5와 6, 및 서열번호 7과 8의 프라이머쌍을 이용하여 InfA, swInfA, swH1, 및 RNaseP를 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 반응액은 시료 5 ㎕를 첨가하여 최종 50 ㎕였다(10 mM dNTP(각 2.5 mM) 4 ㎕; 10X 완충액 5 ㎕; 정방향/역방향 프라이머 (각각 20 μM) 0.5 ㎕ x 2; 메틸렌 블루(500 μM) 1 ㎕; DNA 중합효소 0.4 ㎕; BSA 1.8 ㎕; 및 증류수 31.8 ㎕). PCR 반응은 95℃에서 5분의 예비 변성, 95℃에서 20초 변성, 59℃에서 20초 어닐링, 및 72℃에서의 30초 신장으로 구성된 사이클의 40회 반복, 및 72℃에서 5분의 최종 신장으로 수행했다. 그 결과가 도 5에 도시된다. 메틸렌블루의 농도가 10 μM일 때 PCR 반응에 대한 영향이 적은 것으로 관찰되었다.

실시예 2. 전기화학적 실시간 PCR 장치의 구현

실시예 1에서 선택된 메틸렌블루를 전기화학적 활성물질로 이용한 전기화학적 실시간 PCR용 장치를 구현했다.

두께 1mm의 파이렉스 유리 웨이퍼에 유리 포토 패터닝 공정(glass photo patterning process)을 이용하여 금으로 작업전극, 기준전극 및 보조전극을 도 4와 같이 패터닝했다. 패터닝된 세 개의 금 전극 중 측정 간의 인가 전압에 영향을 주는 전극인 기준 전극으로 사용될 전극은 전착(electrodeposition) 방법에 의해 Ag/AgCl 층으로 코팅하여 준기준 전극(pseudo-reference electrode)로 사용했다. 전착 공정은 2 mM AgNO₃ 용액을 이용하여 환원전위 0 내지 -0.4V의 스캔 속도로 수행했다.

이와 같이 전극이 패터닝된 칩을 제조한 후, 이 칩의 전극 위에 하부면에 형성되어 있는 홈에 결합된 밀봉 부재에 의해 인큐베이션 챔버를 형성할 영역이 정의되어 있는 인큐베이션 챔버 프레임을 배치하여 프레임-밀봉 인큐베이션 챔버를 형성시키고, 이 챔버에 PCR 반응액을 주입한 후 커버 슬립을 덮어 전극 기반 PCR용 인큐베이션 챔버를 형성했다. 도 6은 패터닝된 칩에서 전극 기반 PCR를 수행하기 위해 조립된 인큐베이션 챔버를 보여준다.

이 챔버를 온도조절장치 위에 장착시킨 슬라이드 그리들 어댑터와 같은 칩 지지대 상에 배치하고, 전극에 전기화학 분석장치를 연결시키고, 전기화학 분석장치를 컴퓨터에 연결시켜, 전기화학적 실시간 PCR용 장치를 구현시켰다. 이때 칩과 칩 지지대 간의 접촉 면적을 넓혀 열전도율을 높이기 위해 그 사이에 미네랄 오일을 떨어뜨렸다. 도 7은 슬라이드 그리들 어댑터를 PCR용 온도조절장치 위에 올려 칩 기반 PCR용 장치를 구현하는 것을 보여준다.

실시예 3. 전기화학적 실시간 PCR 에 의한 목적 유전자의 검출

메틸렌블루를 전기화학적 활성물질로 이용하여, 실시간 PCR에 의해 인플루엔자 A를 검출하기 위해, 인플루엔자 바이러스 유전자, InfA, swInfA, swH1, 및 RNaseP를 증폭시켰다.

PCR 반응액에 10 μM의 메틸렌블루를 첨가하고, 각 유전자를 하기 표 1의 프라이머쌍에 의해 증폭시켰다. PCR 반응액은 시료 5 ㎕를 첨가하여 최종 50 ㎕였다. 그 조성은 하기 표 2에 표시된다. 1 mm 두께 파이렉스 유리 웨이퍼에 금전극이 패터닝된 진단 칩 상에 조립된 인큐베이션 챔버에 PCR 반응액을 주입하고, 커버 글래스를 기포가 생기지 않도록 주의하면서 덮은 후, 온도조절장치 상에서 PCR 반응을 수행했다. PCR 반응은 95℃에서 5분의 예비 변성, 95℃에서 20초 변성, 59℃에서 20초 어닐링, 및 72℃에서의 30초 신장으로 구성된 사이클의 40회 반복, 및 72℃에서 5분의 최종 신장으로 수행했다. 총 소요시간은 57분이었다.

목적 유전자	서열
InfA	정방향 프라이머: 5'-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3' (서열번호 1) 역방향 프라이머: 5'-TAGACGMTTTGTCCARAATGCCCT-3' (서열번호 2) 증폭산물 (106bp): GACCRATCCTGTCACCTCTGAC TAAGGGAATTTTAGGATTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTACAGCG TAGACGMTTTGTCCARAATGCCCT
swInfA	정방향 프라이머: 5'-GCACGGTCAGCACTTATYCTRAG-3' (서열번호 3) 역방향 프라이머: 5'-GACCAAATGAAAACCCAGCCCAC-3' (서열번호 4) 증폭산물 (195bp): GCACGGTCAGCACTTATYCTRAG GGGATCAGTTGCACATAAAT CCTGCCTGCCTGCTTGTGTG TATGGGCTTGCAGTAGCAAGTGGGCATGACTTTGAAAGGGAAGGGTACTCACTGGTCGGGATAGACCCATTCAAATTACT CCAAAACAGTCAAGTGGTCAGCCTGATGA GACCAAATGAAAACCCAGCCCAC
swH1	정방향 프라이머: 5'-GTGCTATAAACACCAGCCTYCCA-3' (서열번호 5) 역방향 프라이머: 5'-GCCACAGGATTAAGGAATATCCCG-3' (서열번호 6) 증폭산물 (116bp): GTGCTATAAACACCAGCCTYCCA TTTCAGAATATACATCCGATCACAATT GGAAAATGTCCAAAATATGTAAAAAGCACAAAATTGAGACTG GCCACAGGATTAAGGAATATCCCG
RnaseP	정방향 프라이머: 5'-AGATTTGGACCTGCGAGCG-3' (서열번호 7) 역방향 프라이머: 5'-ACAGCCGCTCACCTTG-3' (서열번호 8) 증폭산물 (71bp): AGATTTGGACCTGCGAGCG GG TTCTGACCTGAAGGCTCTGC GCGGACTTGTGGAG ACAGCCGCTCACCTTG

시약	부피 (㎕)
10 mM dNTP(각 2.5 mM)	4
10X 완충액	5
프라이머 (정방향/역방향, 각 20 μM)	0.5 * 2
메틸렌 블루 (500 uM)	1
Taq 중합효소	0.4
BSA	1.8
DW	31.8
합계	45

칩 기반 PCR 수행에서 반응액 중 물질들이 전극표면에 비특이적으로 흡착하여 발생하는 전기적 신호 간섭을 줄이기 위해, 전극 표면을 머캅토헥산올로 처리하고, PCR 반응액에 BSA(Bovine serum albumin) 191 ㎍ 첨가하여 전기화학적 신호 간섭을 최소화시켰다. PCR 반응액 중 DNA 중합효소는 0.6 U이었다.

또한, 진단 칩을 온도조절장치 위에 슬라이드 그리들 어댑터(slide griddle adaptor)를 장착한 후 배치하고, 이때, 슬라이드 그리들 어댑터와 진단 칩 사이의 접촉 면적을 최대화하여 열전도율을 높이기 위해 미네랄 오일을 이용했다.

(1) InfA

InfA 인플루엔자 바이러스 유전자를 목적 유전자로 한 전기화학적 실시간 PCR을 수행하여 도 8과 같은 결과를 얻었다. InfA 유전자가 존재할 경우, PCR 동안 증폭되는 DNA 농도가 증가함에 따라 전기화학적 활성물질인 메틸렌블루와 복합체를 이루고, 따라서 자유상태 메틸렌블루는 감소하게 된다. 전술된 바와 같은, SWV(Square Wave Voltammetry)를 이용하여 5 사이클마다 메틸렌블루의 환원 반응에서 발생하는 전류를 측정하였다. InfA 유전자가 없는 경우, 메틸렌블루의 환원 전류는 10 % 이내로 신호가 감소했고, InfA 유전자가 있는 경우, 메틸렌블루의 환원 전류는 40 % 이상의 신호 변화를 보이고, 유전자의 최초 카피(initial copy) 수에 따라 전류 신호의 감소 경향이 다르게 나타났다(도 8a). 역치 수준(threshold level)에서 10¹⁰, 10⁸, 및 10⁶의 최초 카피수에 대한 Ct 값을 통하여 98.5 % 신뢰도로 104 % 의 PCR 효율을 확인했다(도 8b).

(2) swInfA

swInfA를 목적 유전자로 한 전기화학적 실시간 PCR을 수행하여 도 9와 같은 결과를 얻었다. swInfA 유전자가 없는 경우, 메틸렌블루의 환원 전류는 10 % 이내로 신호가 감소했고, swInfA 유전자가 있는 경우, 메틸렌블루의 환원 전류는 40% 이상의 신호 변화를 보였으며, 유전자의 최초 카피수에 따라 전류 신호의 감소 경향이 다르게 나타났다(도 9a). 역치 수준에서 10¹⁰, 10⁸, 및 10⁶의 최초 카피수에 대한 Ct 값을 통하여 99 % 신뢰도로 106 % 의 PCR 효율을 확인했다(도 9b).

(3) swH1

swH1을 목적 유전자로 한 전기화학적 실시간 PCR을 수행하여 도 10과 같은 결과를 얻었다. swH1 유전자가 없는 경우, 메틸렌블루의 환원 전류는 10 % 이내로 신호가 감소했고, swH1 유전자가 있는 경우, 메틸렌블루의 환원 전류는 40% 이상의 신호 변화를 보였으며, 유전자의 최초 카피수에 따라 전류 신호의 감소 경향이 다르게 나타났다(도 10a). 역치 수준에서 10¹⁰, 10⁸, 및 10⁶의 최초 카피수에 대한 Ct 값을 통하여 98.4 % 신뢰도로 109 % 의 PCR 효율을 확인했다(도 10b).

(4) RnaseP

RnaseP를 목적 유전자로 한 전기화학적 실시간 PCR을 수행하여 도 11과 같은 결과를 얻었다. RnaseP 유전자가 없는 경우, 메틸렌블루의 환원 전류는 10 % 이내로 신호가 감소했고, RnaseP 유전자가 있는 경우, 메틸렌블루의 환원 전류는 40% 이상의 신호 변화를 보였으며, 유전자의 최초 카피수에 따라 전류 신호의 감소 경향이 다르게 나타났다(도 11a). 역치 수준에서 10¹⁰, 10⁸, 및 10⁶의 최초 카피수에 대한 Ct 값을 통하여 98.8 % 신뢰도로 109 % 의 PCR 효율을 확인했다(도 11b).

메틸렌블루를 이용한 전기화학적 실시간 PCR에 의해 4종의 목적 유전자(InfA, swInfA, swH1, RnaseP)에 대하여 모두 90 내지 110%의 PCR 효율을 얻었고 10개 정도의 최초 카피까지 선형의 Ct 값으로 우수한 증폭 효율을 가지므로 10 카피 이하까지 정확한 검출이 가능하다. 신호 민감도는 40 사이클의 PCR에서 3 x 10-6 A/cycle·cm²였다.

<110> Lab Genomics <120> Detection of gene of interest based on electrochemical real-time PCR and device therefor <130> PN102436 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for InfA <400> 1 gaccratcct gtcacctctg ac 22 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for InfA <400> 2 tagacgmttt gtccaraatg ccct 24 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for swInfA <400> 3 gcacggtcag cacttatyct rag 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for swInfA <400> 4 gaccaaatga aaacccagcc cac 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for swH1 <400> 5 gtgctataaa caccagccty cca 23 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for swH1 <400> 6 gccacaggat taaggaatat cccg 24 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for RNaseP <400> 7 agatttggac ctgcgagcg 19 <210> 8 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for RNaseP <400> 8 acagccgctc accttg 16

Claims

전기화학적 실시간 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 목적 유전자를 검출하는 방법으로서,
검출 대상 시료를 제공하는 단계,
상기 시료에 전기화학적 활성물질과 PCR 반응 혼합액을 첨가하여 PCR 반응액을 준비하는 단계, 및
PCR 반응을 진행하면서 전기화학적 신호를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 전기화학적 활성물질은 메틸렌블루인 것인 방법.
청구항 2에 있어서, 메틸렌블루는 PCR 반응 혼합액에 1 내지 10 μM의 농도로 첨가되는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 PCR 반응을 진행하면서 전기화학적 신호를 검출하는 단계는 PCR 반응액을 전극이 패터닝된 칩 위에 배치된 인큐베이션 챔버에 적용하여 칩 상에서 수행되는 것인 방법.
청구항 4에 있어서, 상기 칩은 유리로 제조되고, 그 위에 금으로 패터닝된 기준 전극, 작업 전극, 및 보조 전극을 포함하는 것인 방법.
청구항 5에 있어서, 상기 기준 전극은 Ag/AgCl 층으로 코팅되어, 준-기준 전극(pseudo-reference electrode)로 작용하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 목적 유전자는 인플루엔자 검출을 위한 InfA, swInfA, swH1 및 RNaseP인 것인 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 InfA, swInfA, swH1 및 RNaseP는 각각 서열번호 1과 2, 서열번호 3과 4, 서열번호 5와 6, 및 서열번호 7과 8의 프라이머 세트를 이용하여 증폭되는 것인 방법.
PCR 반응 혼합액 및 메틸렌블루를 포함하는, 전기화학적 실시간 중합효소연쇄반응에 기반한 목적 유전자 검출용 키트.
청구항 9에 있어서, 상기 키트는 PCR 반응과 동시에 전기화학적 신호 측정이 가능한 진단 칩을 더 포함하는 것인 키트.
청구항 10에 있어서, 상기 진단 칩은 금으로 패터닝된 작업 전극, 기준 전극 및 보조 전극을 포함하는 것인 키트.
청구항 11에 있어서, 상기 기준 전극은 Ag/AgCl 층으로 코팅되어, 준-기준 전극(pseudo-reference electrode)로 작용하는 것인 키트.
청구항 9에 있어서, 상기 키트는 진단 칩 상의 전극 위에 배치되는 PCR 반응용 인큐베이션 챔버 프레임을 더 포함하는 것인 키트.
청구항 13에 있어서, 상기 진단 칩은 중합효소연쇄반응을 위해 온도조절장치(thermocycler)에 장착되는 것인 키트.
청구항 9에 있어서, 상기 목적 유전자는 인플루엔자 바이러스를 검출하기 위한, InfA, swInfA, swH1 및 RNaseP인 것인 키트.
청구항 15에 있어서, 상기 키트는 각각 InfA, swInfA, swH1 및 RNaseP를 증폭하기 위한 서열번호 1과 2, 서열번호 3과 4, 서열번호 5와 6, 및 서열번호 7과 8의 프라이머 세트를 포함하는 것인 키트.
표면에 전극이 패터닝된 칩, 상기 칩과 접촉하여 인큐베이션 챔버를 형성하는 프레임으로서, 하부면에 형성되어 있는 홈(groove)에 결합된 밀봉(sealing) 부재에 의해 인큐베이션 챔버를 형성할 영역이 정의되어 있는 인큐베이션 챔버 프레임, 상기 칩을 수용하는 수용부가 형성되어 있는 칩 지지대, 상기 칩 지지대가 배치되는 온도조절장치, 및 상기 전극에 연결된 전기화학 분석 장치를 포함하는, 전기화학적 실시간 중합효소연쇄반응용 장치.