KR20150021651A - 리소포스파티딜콜린 및 호모시스테인산을 포함하는 난소암 진단용 조성물 및 이를 사용하여 난소암을 진단하는 방법 - Google Patents

리소포스파티딜콜린 및 호모시스테인산을 포함하는 난소암 진단용 조성물 및 이를 사용하여 난소암을 진단하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생물학적 시료 내에 존재하는 저질량 이온인 리소포스파티딜콜린(16:0) 및 L-호모시스테인산을 이용한 난소암 진단에 관한 것이다. 본 발명을 이용하면 저렴한 비용으로 신속하고 정확하게 난소암을 진단할 수 있으므로, 난소암을 조기에 진단하여 치료하는 데 중요하게 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

리소포스파티딜콜린 및 호모시스테인산을 포함하는 난소암 진단용 조성물 및 이를 사용하여 난소암을 진단하는 방법{Composition comprising lysophosphatidylcholine and homocysteic acid for ovarian cancer diagnosis and method using the same}
본 발명은 생물학적 시료 내에 존재하는 저질량 이온인 리소포스파티딜콜린(16:0) 및 L-호모시스테인산을 이용한 난소암 진단에 관한 것이다.
난소암은 난소에 발생하는 악성 종양으로 50~70세 사이에 제일 많이 발생한다. 2002년 우리나라 통계에 의하면 매년 약 1,000~1,200명 정도가 새로 발병하고 있으며, 자궁 경부암에 이어 두번째로 흔한 부인과 암이다. 난소암의 약 90%를 차지하는 상피성 난소암은 대부분 3기 이상의 진행된 상태에서 발견되기 때문에 5년 생존율이 매우 나빠 40%가 채 되지 않는다.
난소암은 증상이 미미하여 약 60%정도가 이미 상당히 진행된 상태에서 병원을 찾게 되므로, 증상이 없더라도 1년에 한 번 정도는 정기적인 검진을 받는 것이 권장되고 있다. 현재 사용되고 있는 진단 방법으로는 병력 및 가족력의 문진, 난소의 촉진, 초음파 검사 및 혈액검사를 통해 CA125 바이오마커의 발현이 증가했는지 여부를 확인하는 방법 등이 있으며, 암이 의심되는 경우 CT 또는 MRI를 이용하여 확진하고 있다. 그러나 상기 방법들은 난소암이 이미 어느 정도 진행된 이후에야 난소암을 진단할 수 있고, 진단이 부정확하며 진단시 환자에게 불편을 야기한다는 단점이 있다.
한편, MALDI-TOF 질량분석기를 이용하면 혈액 내 이온의 스펙트럼을 추출할 수 있다. 기존 단백질체 연구들에 이용된 질량 분석은 주로 800 내지 2500 m/z 질량값 범위를 분석 대상으로 하였는데, 그 범위가 단백질이 트립신으로 잘려졌을 경우 펩타이드의 질량값 영역이기 때문이다. 또한, MALDI-TOF 질량분석기를 이용하면 저질량 이온의 질량 스펙트럼도 추출할 수 있다. 그러나 약 800 m/z 이하의 저질량 대역은 분석 대상이 아닌 매트릭스(matrix)의 피크(peak)들이 혼재하는 영역이기 때문에 그동안 이 영역에 대한 연구가 활발하지는 않았다.
MALDI-TOF 질량분석기를 이용하여 추출된 질량 스펙트럼은 현재 상용되고 있는 MarkerViewTM 소프트웨어의 주성분 분석 기반 선형 판별 분석(principal component analysisbased linear discriminant analysis, PCA-DA)을 이용하여 진단에 이용할 수 있다.
본 발명의 목적은 저질량 이온인 리소포스파티딜콜린(16:0) 및 L-호모시스테인산을 포함하는 난소암 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 대상의 생물학적 시료에서 리소포스파티딜콜린(16:0) 및 L-호모시스테인산을 검출하여 난소암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데 있다.
또한 본 발명의 목적은 리소포스파티딜콜린(16:0) 및 L-호모시스테인산을 이용한 난소암 진단용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 리소포스파티딜콜린(16:0) 및 L-호모시스테인산의 양을 변화시키는지 여부를 측정하여 난소암 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 달성하기 위하여, 본 발명자들은 난소암 환자의 생물학적 시료의 질량 스펙트럼에서 일관되게 비-난소암 환자와 유의성 있는 차이를 나타나는 2개의 피크를 선발하고 상기 피크가 각각 저질량 이온인 리소포스파티딜콜린(16:0) 및 L-호모시스테인산임을 규명하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이에 본 발명은 리소포스파티딜콜린(16:0) 및 L-호모시스테인산을 포함하는 난소암 진단용 조성물을 제공한다.
리소포스파티딜콜린(16:0)은 리소인지질(lysophospholipid)의 일종인 리소포스파티딜콜린 중에서 16개의 탄소가 연결되어 이중결합 없이 단일 결합으로만 연결된 것을 의미한다.
L-호모시스테인산은 천연 아미노산으로서, 치매 및 심장 질환에서 그 수치가 높아지는 것으로 알려져 있다.
본 발명자들은 리소포스파티딜콜린(16:0)과 L-호모시스테인산을 함께 진단에 이용하면 난소암 진단 효과가 매우 우수함을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다. 일 예로, 본 명세서의 도 11에 모식도로 나타낸 방법을 이용할 경우 난소암 진단의 민감도는 88.0%, 특이도는 73.68%로 고루 우수하게 나타났다.
또한 본 발명은 1) 대상에서 추출한 생물학적 시료에서 L-호모시스테인산의 양을 측정하는 단계; 및 2) 대상에서 추출한 생물학적 시료에서 리소포스파티딜콜린(16:0)의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 난소암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
L-호모시스테인산 또는 리소포스파티딜콜린(16:0)의 양의 많고 적음은 상대적인 것으로, 측정 조건, 측정 키트 또는 기기 및 시료의 양 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 동일한 여건하에서 음성대조군인 비-난소암 환자의 생물학적 시료 및/또는 양성대조군인 난소암 환자의 생물학적 시료와 대상의 생물학적 시료 내의 L-호모시스테인산 또는 리소포스파티딜콜린(16:0)의 양을 비교하여 대상이 난소암 환자인지 여부를 진단할 수 있다. 또는 표준 여건 하에서 얻은 비-난소암 환자 및 난소암 환자의 표준적인 수치 데이터를 이용하여 대상의 진단에 이용할 수도 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 1)단계 또는 상기 2)단계는 A) 대상에서 추출한 생물학적 시료의 질량 스펙트럼을 수득하는 단계; 및 B) 상기 질량 스펙트럼과 비-난소암 환자의 질량 스펙트럼 또는 난소암 환자의 질량 스펙트럼을 비교하여 L-호모시스테인산의 양 또는 리소포스파티딜콜린(16:0)의 양의 차이를 확인하는 단계를 포함하는 단계로 수행될 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 1) 단계 또는 상기 2)단계는 항원-항체 결합반응을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 1)단계는 대상에서 추출한 생물학적 시료에서 L-호모시스테인산의 양이 10 nmol/ml을 초과하여 검출되는지 측정하여 수행될 수 있다. L-호모시스테인산의 양이 10 nmol/ml을 초과하여 검출되는 경우 바로 난소암 환자로 진단하고 2)단계를 수행하지 않을 수 있다. 그러나 L-호모시스테인산의 양이 10 nmol/ml 이하 검출되는 경우 2)단계를 수행하여 리소포스파티딜콜린(16:0)의 양을 비-난소암 환자 또는 난소암 환자와 비교하는 단계를 거쳐 난소암 환자로 진단할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 1)단계는 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)로 수행되고, 상기 2)단계는 LC-MS/MS로 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 방법은 1)단계를 수행한 후에 2)단계를 수행할 수 있다.
상기 생물학적 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 복수, 낭액 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 리소포스파티딜콜린(16:0) 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 및 L-호모시스테인산 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 난소암 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 일 구현예로, 본 발명의 난소암 진단용 키트는 리소포스파티딜콜린(16:0)의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 및 L-호모시스테인산의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 1) 동물 모델에 시험 물질을 투여하는 단계; 및 2) 상기 동물 모델의 생물학적 시료에서 리소포스파티딜콜린(16:0)의 양 및 L-호모시스테인산의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 난소암 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 상기 동물 모델은 난소암 동물 모델일 수 있다.
본 발명을 이용하면 저렴한 비용으로 신속하고 정확하게 난소암을 진단할 수 있다. 따라서 난소암을 조기에 진단하여 치료하는 데 중요하게 응용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1 내지 도 3은 MALDI-TOF 질량분석기를 이용하여 추출한 전체 저질량 이온 질량 스펙트럼을 MarkerView™로 임포트하고 PCA-DA를 통해 난소암 환자(음수) 및 비-난소암 환자(양수)에서 얻은 판별 점수를 나타낸 도이다. 총 6회 반복 실험을 하였으므로 각각의 그래프는 1회 실험한 결과를 나타내며, 각 도에 2개의 그래프를 표시하였다.
도 4 내지 6은 MALDI-TOF 질량분석기를 이용하여 추출한 전체 저질량 이온 질량 스펙트럼을 MarkerView™로 임포트하고 PCA-DA를 통해 난소암 환자(음수) 및 비-난소암 환자(양수)에서 얻은 전체 저질량 이온의 피크들을 나타낸 도이다. 총 6회 반복 실험을 하였으므로 각각의 그래프는 1회 실험한 결과를 나타내며, 각 도에 2개의 그래프를 표시하였다.
도 7은 MALDI-TOF를 이용하여 선발된 난소암 진단용 저질량 이온이 L-호모시스테인산임을 확인한 도이다.
도 8은 MALDI-TOF를 이용하여 선발된 난소암 진단용 저질량 이온이 리소포스파티딜콜린(16:0)임을 확인한 도이다.
도 9는 L-호모시스테인산의 농도가 난소암 환자의 혈청에서 비-난소암 환자의 혈청에서보다 더 높게 나타남을 나타내는 도이다.
도 10은 리소포스파티딜콜린(16:0)의 농도가 난소암 환자의 혈청에서 비-난소암 환자의 혈청에서보다 더 낮게 나타남을 나타내는 도이다.
도 11은 L-호모시스테인산과 리소포스파티딜콜린(16:0)의 농도를 이용하여 난소암을 판별하는 방법을 간략하게 나타낸 모식도이다.
본 발명에서, "생물학적 시료"는 전혈, 혈청, 혈장, 요, 분변, 객담, 타액, 조직, 세포, 세포 추출물, 체외 세포 배양물 등과 같은 시료들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 아래에 기술되는 실시 예에서는 환자 또는 비환자의 혈청을 생물학적 시료로 사용하였다.
본 발명에서, "강도(intensity)"는 MALDI-TOF 질량분석기로부터 얻어지는 값을 말하며, 피크에 해당하는 질량 이온의 양과 상관 관계를 가진다.
본 발명에서, "정규화(normalization)"는 데이터의 범위를 일치시키거나 분포를 유사하게 만들어 주는 것을 말하며, 평균값, 중간값 등을 이용하여 정규화할 수 있으나 이에 제한되지 않고, 경우에 따라 다양한 공지의 방법들이 적용될 수 있다. 본 실시예에서는 각 시료별 강도의 소계를 구하고, 시료별 소계들의 평균을 구한 후, 각 시료별 강도의 소계가 이 평균과 일치하도록 각 피크 강도에 시료별 배율 인자를 곱하는 방식으로 정규화하였다. 즉, 이와 같이 정규화한 후에는 각 시료별 강도의 소계가 동일해진다.
본 발명에서, "파레토 스케일링"은 정규화한 각 피크 강도에서 질량값별 평균값을 뺀 후 표준편차의 제곱근으로 나누는 것을 말한다. 보다 일반적인 스케일링 방법인 오토스케일링(autoscaling)에서는 표준편차로 나누는 것을 통해 데이터의 크기 정보를 완전히 상쇄시키는 것에 비해, 파레토 스케일링에서는 데이터의 크기 정보를 부분적으로 유지하는 것을 통해 노이즈(noise)의 증폭을 피할 수 있다는 장점이 있다.
본 발명에서, "가중치(weighting factor)"는 가중치를 곱한 후의 데이터의 수치적 크기가 통계적 관점에서의 중요성에 비례하도록 조정하는 인자를 말하는데, 아래에 기술되는 실시 예에서 주성분 분석 기반 선형 판별 분석 결과 획득한 피크별 인자적재값을 가중치의 일례라 할 수 있다.
본 발명에서, "저질량 이온(low mass ion)"은 MALDI-TOF 질량분석기 등을 이용하여 획득한 질량값이 1500 m/z보다 작은 이온을 의미한다.
본 발명에서, MALDI-TOF 질량분석기에 의해 측정된 질량값은 "±0.1 m/z"의 오차 범위를 포함한다. 다양한 실험 환경에 따라 질량값 측정치에 다소의 오차가 발생할 수 있기 때문이다. 실험 환경에 따라 오차 범위는 "±0.5 m/z"일 수 있다.
본 발명에서, MALDI-TOF 질량분석기에 의해 측정된 질량값은 MALDI-TOF 질량분석기의 포지티브 모드(positive mode)에서 획득된 질량값임에 유의한다.
본 발명에서, 가중치 벡터(vector)의 부호는 판별 점수가 양수인 경우 양성으로 판정되고 음수인 경우 음성으로 판정되도록 조정한다. 주성분 분석에서의 인자적재값 벡터는 수학적으로 고유 벡터(eigenvector)에 해당하는데, 이 벡터의 부호는 임의로 정할 수 있다. 즉, 계산된 피크별 인자적재값에 전체적으로 -1을 곱하여 부호를 변경한다고 하여도 수학적으로는 동일한 고유치 문제(eigenvalue problem)에 대한 동등한 해라고 할 수 있으나, 판별 점수가 음수인 경우를 양성으로 양수인 경우를 음성으로 판별하게 된다. 본 발명에서는 판별 점수가 양수인 경우 양성으로 판정되고 음수인 경우 음성으로 판정되도록 고유 벡터의 부호를 조정하였으나, 본 발명의 범위가 이에 제한되지 않음에 유의한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예 는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들에 제한되는 것은 아니다.
또한, 이하에서 언급된 시약 및 용매는 특별한 언급이 없는 한 Honeywell Burdick & Jackson®로부터 구입한 것이다.
시료 준비-혈청 수집 대상
142명의 난소암 환자 및 100명의 비-난소암 환자로부터 혈청을 수집하였다. 난소암 환자들의 난소암 진행 상태에 대한 정보는 상기와 같다.
[표 1]
Figure pat00001
진단 및 질병의 단계와 범위의 판정을 위하여, 모든 난소암 환자들은 자궁 및 부속기 절제술, 골반림프절절제술, 대동맥주위림프절절제술, 대망절제술, 복강내 세포검사 등을 포함하는 병기설정수술을 시행 받으며 병리검사 결과에 의해서 난소암의 진단과 병기가 최종 확정되었다.
[ 실시예 ]
< 실시예 1> 난소암 진단용 저질량 이온 피크의 결정
1-1. 혈청 준비 및 질량 스펙트럼 측정
혈청에서 80% 이상의 단백질을 배제하기 위하여 지방산을 선택적으로 추출하는 방법인 Bligh and Dyer 방법(Bligh, E. G and Dyer, W. J (1959)--Canadian journal of Biochemistry and Physiology, vol 37, page 911)을 적용하였다.
혈청의 4배 부피의 메탄올/클로로포름(2:1, v/v)을 25㎕의 혈청과 함께 격렬하게 교반한 후에 10분 동안 실온에서 배양하였다. 혼합물은 4℃에서 10분 동안 6000 ×g로 원심 분리하였다. 수득한 상청액을 1시간 동안 농축기(concentrator)에서 완전히 건조시켰으며, 30분 동안 교반기(vortexer)에서 30㎕의 50% 아세토니트릴(acetonitrile)/0.1% 트라이플루오린화 아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)으로 용해시켰다. 상기 용액을 알파-시아노-4-하이드록시 시남산(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid) 용액과 혼합하였으며(1:12, v/v), 1㎕의 혼합물을 MALDI-target에 위치시켰다. 환자의 혈청 추출물의 개별 질량 스펙트럼을 4700 Proteomics Analyzer(AB SCIEX, Poster City, CA)를 사용하여 측정하였다. 한 개의 시료에 대해 질량 스펙트럼 데이터는 20번 반복 측정된 스펙트럼의 평균으로 추출된다. 모든 개별 시료의 질량값 구간은 최대 질량값이 약 2500 m/z이 되도록 조정하였다. 실험적 오류를 최소화하기 위하여, 초점 질량(focus mass), 레이저 강도(laser intensity), 타깃 플레이트(target plate), 데이터 수집 시각(data acquisition time)을 포함하는 다양한 요소를 점검하였다. 바람직한 초점 질량 및 레이저 강도로 500 m/z 및 5000이 각각 고정되어 사용되었다. 재현성을 확인하기 위하여, 검증 집합의 시료들은 고정된 초점 질량 및 레이저 강도와 함께, 다른 타깃 및 다른 데이터 수집 시각 하에서 6회 반복 측정하였다.
각 그래프는 1회 측정한 결과를 나타내며, 각 도에 2개의 그래프를 표시하였다.
1-2. 난소암 진단용 저질량 이온의 선발
MALDI-TOF 질량분석기를 이용하여 추출한 T2D 파일 형식의 저질량 이온 질량 스펙트럼을 MarkerView™ Software version 1.2 (Applied Biosystems/MDS Sciex, Toronto, Canada)로 임포트하였다.
임포트 조건으로 하기 표 2의 조건들을 사용하였다.
[표 2]
Figure pat00002
MarkerViewTM에는 다수의 정규화 방법이 존재하는데, "Normalization Using Total Area Sums" 방법을 사용하여 정규화를 수행하였다. 이 방법에서는 각 시료별 강도의 소계를 구하고, 시료별 소계들의 평균을 구한 후, 각 시료별 강도의 소계가 이 평균과 일치하도록 각 피크 강도에 시료별 배율 인자(scaling factor)를 곱한다. 즉, 이와 같이 정규화한 후에는 각 시료별 강도의 소계가 동일해진다.
다음, 정규화한 피크 강도들을 파레토 스케일링(Pareto scaling)하였다. 즉, 정규화한 각 피크 강도에서 질량값별 평균값을 뺀 후 표준편차의 제곱근으로 나누어 피크 강도들을 파레토 스케일링하였다.
다음, 파레토 스케일링한 피크 강도들에 대해 주성분 분석 기반 선형 판별 분석(principal component analysisbased linear discriminant analysis, PCA-DA)을 수행하여 판별 점수(discriminant score, DS)를 계산하였다. 즉, 두 단계로 주성분 분석을 수행하여 각 피크별 가중치(weighting factor)인 인자적재값(factor loading)을 구하고, 파레토 스케일링된 강도에 이 인자적재값을 곱한 후 더하여 각 시료별 판별 점수를 계산하였다. 표 2의 임포트 조건에서 피크의 최대 개수를 5000개로 하였고, 충분히 많은 시료들을 함께 임포트하였으므로, 본 계산에서 인자적재값은 5000개가 계산되었으며, 따라서 5000개의 항을 더하여 한 개의 판별 점수가 계산되었다. 결과는 t-test로 검정하였다.
도 1 내지 도 3은 PCA-DA를 통해 난소암 환자 및 비-난소암 환자에서 얻은 판별 점수를 나타낸 도이다. 총 6회 반복 실험을 하였으므로 각각의 실험을 하였으므로 각각의 그래프는 1회 실험한 결과를 나타내며, 각 도에 2개의 그래프를 표시하였다. PCA-DA 결과에서 난소암 환자의 판별 점수는 음수로(그래프상에서 빨간색 점), 비-난소암 환자의 판별 점수는 양수로(그래프상에서 파란색 점) 나타난다.
도 4 내지 6은 PCA-DA를 통해 난소암 환자(음수) 및 비-난소암 환자(양수)에서 얻은 전체 저질량 이온의 피크들을 나타낸 도이다. 총 6회 반복 실험을 하였으므로 각각의 그래프는 1회 실험한 결과를 나타내며, 각 도에 2개의 그래프를 표시하였다. 6번의 실험 결과에서 184 m/z의 피크와 496 m/z의 피크가 난소암 환자와 비-난소암 환자 간에 일관되게 유의성 있는 차이를 보이는 것으로 확인되었다. 따라서 이 피크들을 난소암 진단용 저질량 이온 피크로 선발하였다.
< 실시예 2> 난소암 진단용 저질량 이온 피크에 해당하는 저질량 이온의 규명
실시예 1에서 선발한 184 m/z의 피크와 496 m/z의 피크를 나타내는 물질들을 규명하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.
2-1. 184 m/z의 피크를 나타내는 물질의 규명
인간 대사체 데이터베이스에서 184 m/z의 피크를 나타내는 물질을 스크리닝하였다. 에피네프린과 L-호모시스테인산이 가장 강력한 후보 물질로 확인되었다. 따라서 에피네프린과 L-호모시스테인산 표준 물질을 각각 사용하여 MS/MS 패턴을 분석하여 L-호모시스테인산에 의해 나타난 것이 맞는지 확인하고자 하였다.
도 7의 A는 MALDI-TOF 방법으로 확인한 난소암 환자의 MS 패턴을 나타낸 것이며, 도 7의 B는 난소암 환자에서 나타난 184 m/z의 피크를 MS/MS하여 L-호모시스테인산의 MS/MS 패턴과 동일하게 나타남을 확인한 것이다. 따라서 184 m/z의 피크를 나타내는 물질은 L-호모시스테인산임을 알 수 있었다.
2-2. 496 m/z의 피크를 나타내는 물질의 규명
인간 대사체 데이터베이스에서 496 m/z의 피크를 나타내는 물질을 스크리닝하였다. 이 피크를 나타내는 후보 물질은 리소포스파티딜콜린(16:0) 1종뿐인 것으로 확인되었다. 도 8의 A는 MALDI-TOF 방법으로 확인한 난소암 환자의 MS 패턴을 나타낸 것이며, 도 8의 B는 난소암 환자에서 나타난 496 m/z의 피크를 MS/MS하여 리소포스파티딜콜린(16:0)의 MS/MS 패턴과 동일하게 나타남을 확인한 것이다. 따라서 496 m/z의 피크를 나타내는 물질은 리소포스파티딜콜린(16:0)임을 알 수 있었다.
< 실시예 3> L- 호모시스테인산의 측정
L-호모시스테인산 ELISA 키트 (Cusabio Biotech)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 기재된 방법대로 L-호모시스테인산의 수치를 측정하였다. 난소암 환자 25명의 시료를 사용하였고, 비-난소암 환자 64명의 시료를 대조군으로 사용하였다.
L-호모시스테인산의 농도는 난소암 환자의 혈청에서 더 높게 나타났다(도 9).
< 실시예 4> 혈액 내 리소포스파티딜콜린(16:0)의 측정
리소포스파티딜콜린(16:0)은 표준물질 또는 ELISA 키트 구입이 쉽지 않아 난소암 환자와 비-난소암 환자의 리소포스파티딜콜린(16:0) 농도를 LC-MS/MS 분석을 통하여 상대적으로 정량하였다. 난소암 환자 25명의 시료를 사용하였고, 비-난소암 환자의 시료를 대조군으로 사용하였다.
LC-MS/MS 분석은 하기의 방법으로 수행하였다.
나노플로우 HPLC 기기(Easy nLC, Thermo Fisher Scientific)를 LTQ 질량 스펙트로미터(Thermo Scientific)에 온라인으로 연결하였다. 분석 칼럼(50cm, 내부 지름 75um)은 PepMap® RSLC , C18, 2um, 100Å을 사용하였다. 역상 크로마토그래피가 0.1% 포름산(완충액 A) 및 0.1% 포름산 내의 아세토나이트릴(완충액 B)을 포함하는 이원 완충액 시스템을 사용하여 수행되었다. 시료는 유속 300 nL/min으로 3-50% 완충액 B의 선형 경사로 분리되었다. 경사 시간은 90분이고, LC MS/MS에 대한 총 가동 시간은 120분이었다. 추출된 리소포스파티딜콜린(16:0)은 Selected reaction monitoring(SRM) 모드에 의해 분석되었다. 리소포스파티딜콜린(16:0) 지질에 대한 SRM 전이는 m/z 496.4 → 183.96 및 m/z 496.4 → 478.33으로 설정되었다. SRM 데이터는 단편 이온 질량 ± 2 m/z 내에서 획득되었고, 각 SRM 전이 및 개별적인 체류 시간은 특이적 LPC에 의해 확립되었다. 리소포스파티딜콜린(16:0)에 대한 적절한 피크를 통합함으로써 데이터를 가공하였고, 그 후 이원 t-검정에 의해 계산된 peak area를 계산하여 비교하였다.
리소포스파티딜콜린(16:0)의 농도를 의미하는 183.96 m/z와 478.33 m/z는 각각 난소암 환자의 혈청에서 비-난소암 환자의 혈청에서보다 더 낮게 나타났다(도 10).
< 실시예 5> 진단방법의 구성
진단의 정확도를 결정하기 위한 척도로서 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)가 사용된다. 진단 검사 결과에서 양성(positive)은 질병에 걸렸다는 것을 의미하고 음성(negative)은 질병에 걸리지 않았다는 것을 의미할 때, 민감도(sensitivity)는 환자가 질병에 걸렸을 경우, 진단 검사의 결과가 양성으로 나올 확률을 의미하고, 특이도(specificity)는 환자가 질병에 걸리지 않았을 경우, 진단 검사의 결과가 음성으로 나올 확률을 의미한다. 즉, 민감도와 특이도가 높을수록 진단의 정확도가 높다는 것을 의미한다.
실시예 3에서 측정한 L-호모시스테인산의 농도를 이용한 난소암 진단의 정확도를 계산하였다.
ELISA 분석에서 L-호모시스테인산의 농도가 10 nmol/ml을 초과하여 검출될 경우 난소암으로, 10 nmol/ml 이하가 검출될 경우 비-난소암으로 진단하는 것으로 진단방법을 구성하였을 때, 민감도는 64.0%, 특이도는 100%로 계산되었다.
실시예 4에서 측정한 리소포스파티딜콜린(16:0)의 peak area를 이용한 난소암 진단의 정확도를 계산하였다.
LC-MS/MS 분석에서 리소포스파티딜콜린(16:0)의 peak area가 50,000 미만일 경우 난소암으로, 그 이상일 경우 비-난소암으로 진단하는 것으로 진단방법을 구성하였을 때, 민감도는 76.0%, 특이도는 47.4%로 계산되었다.
상기 결과로부터 난소암의 정확한 진단을 위해서는 리소포스파티딜콜린(16:0)과 L-호모시스테인산 각각을 이용하는 것만으로는 부족하다고 판단되어, 도 11과 같은 진단방법을 구성하였다. 이 방법에 따르면, 먼저 시판되는 ELISA 키트를 이용하여 대상의 생물학적 시료 내의 L-호모시스테인산의 양을 측정하였다. 비-난소암 환자의 생물학적 시료 내에서 L-호모시스테인산은 일반적으로 검출되지 않았으며, 검출되는 경우에도 난소암 환자의 경우보다 극히 적은 양에 해당하는 5 nmol/ml 이하, 많은 양이 검출되는 경우에도 10 nmol/ml 이하의 양으로 검출되었다. L-호모시스테인산이 10 nmol/ml 보다 많이 검출된 경우 대상이 난소암 환자인 것으로 진단할 수 있다. L-호모시스테인산이 10 nmol/ml 이하의 양으로 검출된 경우, LC-MS/MS 방법을 이용하여 대상의 생물학적 시료 내에 리소포스파티딜콜린(16:0)의 양을 측정하였다. 리소포스파티딜콜린(16:0)의 양이 비-난소암 환자의 생물학적 시료 내의 리소포스파티딜콜린(16:0)의 양보다 상대적으로 적거나, 난소암 환자의 생물학적 시료 내의 리소포스파티딜콜린(16:0)의 양 수준으로 적게 나타난 경우, 대상이 난소암 환자인 것으로 진단할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 리소포스파티딜콜린(16:0)의 peak area가 50,000 미만으로 나타난 경우 대상을 난소암 환자로 진단하였으나, 리소포스파티딜콜린(16:0)의 양의 많고 적음은 상대적인 것으로, 측정 조건, 측정 기기 및 시료의 양 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 동일한 여건하에서 얻은, 음성대조군인 비-난소암 환자의 생물학적 시료 및/또는 양성대조군인 난소암 환자의 생물학적 시료와 대상의 생물학적 시료 내의 리소포스파티딜콜린(16:0)의 양을 비교하여 대상이 난소암 환자인지 여부를 진단할 수 있다. 또는 표준 여건 하에서 비-난소암 환자 및 난소암 환자의 표준적인 수치 데이터를 이용하여 대상의 진단에 이용할 수도 있다.
도 11은 L-호모시스테인산과 리소포스파티딜콜린(16:0)의 농도를 이용하여 난소암을 판별하는 진단방법을 간략하게 나타낸 모식도이다.
난소암 환자 25명과 비-난소암 환자 19명의 시료를 사용하여 도 11의 진단방법에 적용했을 때, 민감도는 88.0%, 특이도는 73.68%로 계산되었다.

Claims (10)

  1. 리소포스파티딜콜린(16:0) 및 L-호모시스테인산을 포함하는 난소암 진단용 조성물.
  2. 1) 대상에서 추출한 생물학적 시료에서 L-호모시스테인산의 양을 측정하는 단계;및
    2) 대상에서 추출한 생물학적 시료에서 리소포스파티딜콜린(16:0)의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 난소암 진단을 위한 정보 제공 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 방법은 1)단계를 수행한 후에 2)단계를 수행하는 방법.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 1)단계 또는 상기 2)단계는
    A) 대상에서 추출한 생물학적 시료의 질량 스펙트럼을 수득하는 단계;및
    B) 상기 질량 스펙트럼과 비-난소암 환자의 질량 스펙트럼 또는 난소암 환자의 질량 스펙트럼을 비교하여 L-호모시스테인산의 양 또는 리소포스파티딜콜린(16:0)의 양의 차이를 확인하는 단계를 포함하여 수행되는 방법.
  5. 제 2항에 있어서, 상기 1)단계 또는 상기 2)단계는 항원-항체 결합반응을 이용하는 방법.
  6. 제 2항에 있어서, 상기 1)단계는 대상에서 추출한 생물학적 시료에서 L-호모시스테인산의 양이 10 nmol/ml을 초과하여 검출되는지 측정하는 단계인 방법.
  7. 제 2항에 있어서, 상기 1)단계는 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)로 수행되고, 상기 2)단계는 LC-MS/MS로 수행되는 방법.
  8. 제 2항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 복수, 낭액 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  9. 리소포스파티딜콜린(16:0) 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 및 L-호모시스테인산 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 난소암 진단용 키트.
  10. 1) 동물 모델에 시험 물질을 투여하는 단계; 및
    2) 상기 동물 모델의 생물학적 시료에서 리소포스파티딜콜린(16:0)의 양 및 L-호모시스테인산의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 난소암 치료제를 스크리닝하는 방법.
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