KR20150009448A

KR20150009448A - 인슐린 유사 성장 인자 2를 활용한 새로운 폐기종 유발 동물 모델 구축

Info

Publication number: KR20150009448A
Application number: KR1020140088396A
Authority: KR
Inventors: 이호영; 민혜영; 부혜진
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2013-07-16
Filing date: 2014-07-14
Publication date: 2015-01-26
Also published as: KR101627920B1

Abstract

본 발명은 폐기종 유발 동물 모델의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 인슐린 유사 인자 2(Insuline-like growth factor 2; IGF2) 단백질을 과발현시키는 단계를 포함하는, 폐기종 유발 동물 모델의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 형질전환 동물은 기존 모델과 달리 폐 조직 중에서 폐 상피세포에서만 국소적으로 발현되는 IGF2에 의한 폐 병변을 확인할 수 있어 폐기종과 같은 폐질환을 연구하기에 적합할 뿐 아니라, 폐기종의 치료 및 예방을 위한 새로운 분자지표로써, 폐기종 치료제를 스크리닝하기 위한 효과적인 모델 마우스로 이용할 수 있다.

Description

인슐린 유사 성장 인자 2를 활용한 새로운 폐기종 유발 동물 모델 구축 {Development of a novel emphysema-related animal model using insulin-like growth factor 2 (IGF2)}

본 발명은 폐기종 동물 모델의 제조 방법 및 이를 이용한 폐기종 치료제 후보약물 스크리닝 방법에 관한 것이다.

폐기종(emphysema)은 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease; COPD) 중 하나로, 말단 세 기관지의 폐포 간 공간 벽이 탄성을 잃고 파괴되어 비정상적으로 영구 확장됨으로써, 폐의 산소-이산화탄소 교환 능력이 감소되어 호흡이 곤란해지는 질환이다. COPD는 흡연율 및 평균 수명의 연장으로 인하여 발병률 및 사망률이 증가하는 추세로서, 우리나라에서 10대 사망 원인 중 하나이다. 뿐만 아니라, 세계보건기구에서는 2020년 COPD가 전 세계 사망 원인 중 3위에 해당할 것으로 예측하였다.

이러한 폐기종의 주요 원인은 흡연으로, 대기 오염이나 유해 작업 환경의 노출에 의해서도 생길 수 있으며, 호흡기 감염의 동반 시 진행 속도가 가속화된다. 폐기종의 증상인 조직 파괴로 인한 폐포 확장 증상은, matrix metalloproteinase (MMP), neutrophil elastase 등의 단백질 분해효소의 발현은 활성화되는 반면, 단백질 분해효소를 억제하는 α1-antitrypsin의 발현은 감소하기 때문인 것으로 알려졌다. 또한, 흡연에 의하여 폐포 내 대식세포 및 상피에서 여러 cytokine/chemokine의 분비가 유도되어 염증 반응이 활성화되면 염증 관련 세포들에 의한 cytokines/chemokines (TNF-α, IL-1β, IL-8, MCP-1, IFN-γ, IL-4, IL-13 등), reactive oxygen species (ROS) 등의 생성이 증가되어 단백질 분해효소의 발현 및 활성화로 인한 조직 손상이 가속화된다.

현재까지 폐기종에 대한 여러 병인이 알려지고 있으나, 아직까지 폐기종의 특성을 충분히 설명하지 못하고 있어 다른 요인에 의한 기전 연구가 필요한 실정이다.

한편, 인슐린 유사 성장인자(Insulin-like growth factor; IGF)는 아미노산의 조성 및 구조가 인슐린과 유사한 특성을 가지고 있으며, 정상 또는 암 세포에 대하여 성장을 촉진하고 사멸을 억제하는 인자로 작용한다. IGF는 70개의 아미노산으로 이루어진 IGF1과 67개의 아미노산으로 이루어진 IGF2로 나뉘며, IGF-1R, IGF-2R 또는 insulin receptor(IR)에 결합한다. IGF-1R 및 IR은 자체적으로 kinase 활성을 지니고 있어 IGF 결합에 의하여 autophosphorylation 되어 하위 신호를 전달하는 반면, IGF-2R은 이러한 활성을 지니고 있지 않아 IGF 매개 신호전달을 일으키지 않는다. IGF는 혈중 또는 세포 외액에서 IGF binding protein(IGFBP)에 결합하여 존재한다. 현재까지 6종의 IGFBP가 알려졌고 이들은 IGF를 다른 조직 또는 세포로 운반하거나 IGF가 수용체에 결합하는 것을 증가 또는 감소시켜 IGF의 작용을 조절하는 역할을 한다.

IGF-1R signaling은 세포 성장, 분화를 조절하고 세포 사멸을 억제하고, 여러 암 종에서 IGF-1R signaling이 활성화되는 것으로 나타났다. 특히 IGF2는 암세포에 과발현되어 있는 IR의 isoform인 IR-A에 결합력이 높아 IR-A를 통하여 세포 성장 촉진 신호전달을 활성화시키는 것으로 나타났다.

현재까지 폐기종 조직에서 IGFBP-3의 발현이 증가되어 있음이 알려져 있으나, IGF-1R signaling 또는 다른 IGF-1R signaling 관련 요소, 특히 IGF2와 폐기종과의 관련성에 대해서는 아직 보고된 바 없다.

본 발명자들은 기존 연구에서 IGF-1R signaling이 폐 암화 과정에서 활성화됨을 발표하였고(Kim et al., Cancer Res 2009;69:7439-7448), 예비 실험 결과 흡연 경력이 있는 폐암 환자의 조직에서 IGF-1R의 활성화 및 IGF1, IGF2의 발현이 증가하며, 특히 IGF1, IGF2와 IGF-1R의 활성화 정도가 유의적인 상관성이 있음을 확인하였다. 이는 담배 중 발암 성분에 의하여 IGF의 생성을 통하여 IGF-1R의 활성화를 유도할 수 있음을 나타내므로, 흡연에 의하여 유발되며 폐암 발병과도 관련이 있는 COPD에서도 적용될 수 있음을 시사한다.

기존 폐기종 마우스 모델은 담배 연기에 노출시키는 방법, 활성화된 염증 관련 세포를 주입하는 방법, elastase와 같은 폐기종 유발 효소를 처리하는 방법, 식이를 중단하거나 이를 elastase 처리와 병용하는 방법, LPS와 같은 염증유발 인자를 처리하는 방법, MMP-1, α1-antitrypsin 등 폐기종 관련 인자들의 발현을 조절한 유전자변형 마우스를 활용하는 방법 등이 알려져 있으나, protease 외 세포신호전달 관련 마커를 활용한 모델은 아직 제시되지 않았으며 특히 폐기종 관련 여러 모델에서 IGF, 특히 IGF2와의 상관성은 보고된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 폐기종의 모델 동물을 제조하기 위해 노력하던 중 인슐린 유사 성장 인자 2(IGF2)가 과발현된 형질전환 마우스의 폐 조직에서 폐기종의 특징적인 현상이 현저히 나타남을 확인함으로써, 이를 통해, IGF2 과발현 형질전환 마우스를 폐기종 모델 마우스로 유용하게 이용할 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 인슐린 유사 성장 인자 2(insuline-like growth factor 2; IGF2) 단백질을 과발현시키는 단계를 포함하는 폐기종 유발 동물 모델의 제조 방법; 및 상기 방법에 의해 제조된 동물 모델을 이용한 폐기종 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인슐린 유사 성장 인자 2(Insuline-like growth factor 2; IGF2) 단백질을 과발현시키는 단계를 포함하는 폐기종 유발 동물 모델의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 IGF2 단백질을 과발현시키는 단계는 동물의 폐 상피세포에서 이루어지는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 IGF2 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 IGF2 단백질은 서열번호 2로 기재되는 염기 서열을 포함하는 핵산 서열을 통해 인코딩되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 IGF2 단백질은 surfactant protein C (SPC) 프로모터 유전자와 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 surfactant protein C (SPC) promoter 유전자는 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 폐기종 유발 동물은 마우스인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 마우스는 IGF2 단백질을 hybrid C3H/C57B6 fertilized mouse egg에 microinjection하여 제조되는 것을 특징으로 한다.

아울러, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 동물 모델을 이용한 폐기종 치료제 후보약물 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 방법은 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:

1) 상기 본 발명의 방법에 의해 제조된 동물에 피검 화합물 또는 조성물을 투여하는 단계;

2) 상기 피검 화합물 또는 조성물이 처리된 동물(실험군)과 피검 화합물 또는 조성물을 미처리한 동물(대조군)로부터 각각 폐기종의 증상을 측정하는 단계; 및

3) 대조군에 비하여 실험군에서 폐기종의 증상이 감소된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 단계 1)의 피검화합물 또는 조성물은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사 산물 및 생활성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법에 의해 제조된 동물 모델은 기존 모델과 달리 IGF2를 폐 특이적으로 과발현되도록 유전자변형 마우스로 제작한 것이어서 기존의 담배 연기 노출, 활성화된 염증 관련 세포 주입, elastase 같은 폐기종 유발 효소 처리, LPS와 같은 염증유발 인자를 처리하는 방법 등에 의해 폐기종을 유발하는 모델에 비해 동물 개체 간 차이가 거의 없고, 단시간에 폐기종을 유발시킴으로써 비용이 저렴한 장점이 있다. 또한 폐기종의 원인으로 지목되는 담배의 특정 성분에 의해 폐 상피세포에서 발현이 증가되는 것으로 확인된 IGF2를 타겟으로 하고 있어서 폐기종의 병변 과정을 연구하는데 적합하다. 뿐만 아니라, 폐기종의 발생 및 진행 과정에서 IGF2의 발현조절에 관련된 기작 및 biomarker들을 규명함으로써 폐기종 및 COPD와 관련된 새로운 지표 발굴에도 활용될 수 있다. 또한 발굴된 biomarker들을 이용, 폐기종의 치료 및 예방을 대상으로 하는 신약 개발에 이용가능한 마우스 모델로도 이용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 IGF2 과발현 형질전환 마우스에서 적출된 폐의 폐기종 유발 여부를 확인하기 위한, 폐 조직의 사진 및 H&E 염색 결과이다.
도 2는 본 발명의 IGF2 과발현 형질전환 마우스에서 적출된 폐의 폐기종 유발 여부를 확인하기 위한, 폐 조직의 Masson's trichrome 염색 결과이다.
도 3은 본 발명의 IGF2 과발현 형질전환 마우스에서 적출된 폐의 폐기종 유발 여부를 확인하기 위한, 폐 조직의 사진이다.
도 4는 본 발명의 IGF2 과발현 형질전환 마우스의 폐조직에서 단백분해효소 MMP(matrix metalloproteinase)의 활성도 및 발현 정도를 확인하기 위한, in situ Zymography 및 gelatin Zymography 결과이다.
도 5는 본 발명의 IGF2 과발현 형질전환 마우스의 폐조직에서 α1-antitrypsin 및 MMP 단백질의 발현 변화를 확인하기 위한, 웨스턴 블랏팅 및 정량화 결과이다.
도 6은 폐 상피세포에서 IGF2 과발현에 의하여 유도된 폐 조직 손상 유발 효소인 MMP-1이 IGF2 발현 억제에 의하여 그 발현이 감소되는 것을 RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 7은 폐 상피세포(BEAS-2B)에서 IGF2 발현을 Knock-down에 의해 저하(K/D)시키거나 과발현(O/E)시킨 후 α1-antitrypsin의 발현 변화를 확인하기 위한, RT-PCR 결과이다.
도 8은 담배 유래 발암원인 NNK의 장기간 동안의 처리(20, 30, 100일)에 의하여 사람 폐 상피세포인 HBEC 및 NHBE에서 폐기종과 연관된 것으로 알려진 IGFBP-3와 더불어 IGF2의 유전자 발현 변화를 RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 9는 담배 유래 발암원인 NNK의 장기간 동안의 처리(7~150일)에 의하여 사람 폐 상피세포인 HBEC1과 BEAS-2B에서 IGF2의 processing에 관여하는 효소인 furin, PC-1 및 PC-7의 유전자 발현 변화를 RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 10은 NNK 및 IGF2에 의하여 사람 폐 상피세포에서 furin의 발현이 증가하고, IGF2가 과발현된 조건에서 NNK를 처리하면 furin의 발현이 촉진됨을 RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 11a 및 11b는 담배 유래 발암원인 NNK의 장기간 동안의 처리(20~150일)에 의하여 사람 폐 상피세포인 HBEC1과 BEAS-2B에서 폐 조직 손상을 유발하는 효소인 MMP-1, MMP-9, MMP-10, MMP-12, MMP-13의 유전자 발현 변화를 RT-PCR 및 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과이다.
도 12는 담배 유래 발암원인 NNK를 사람 폐 상피세포인 HBEC1과 BEAS-2B에 처리시, 항단백분해효소인 α1-antitrypsin의 발현이 감소되는 것을 RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 13은 담배 유래 발암원인 NNK과 benzo[a]pyrene을 사람 폐 상피세포인 BEAS-2B에 병용처리시(NNK/B(a)P), α1-antitrypsin 발현 감소 및 MMP 발현 증가를 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과이다.
도 14는 마우스에 폐기종을 유발하는 담배 주요성분인 NNK과 benzo[a]pyrene를 병용투여(NNK/B(a)P)한 후, 폐조직을 적출하여 H&E 염색을 통하여 폐기종 유발 여부를 확인한 결과이다.
도 15는 마우스에 폐기종을 유발하는 담배 주요성분인 NNK과 benzo[a]pyrene를 병용투여(NNK/B(a)P)한 후, 폐조직을 적출하여 IGF2 단백질의 발현 변화를 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과이다.
도 16은 마우스에 폐기종을 유발하는 담배 주요성분인 NNK과 benzo[a]pyrene를 병용투여(NNK/B(a)P)한 후, 폐조직을 적출하여 α1-antitrypsin 및 MMP 단백질의 발현 변화를 RT-PCR, 웨스턴 블롯팅, 및 gelatin zymography로 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 인슐린 유사 성장 인자 2(Insuline-like growth factor 2; IGF2) 단백질을 과발현시키는 단계를 포함하는 폐기종 유발 동물 모델의 제조 방법을 제공한다.

상기 IGF2 단백질을 과발현시키는 단계는 동물의 폐 상피세포에서 이루어지는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 IGF2 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 IGF2 단백질은 서열번호 2로 기재되는 염기 서열을 포함하는 핵산 서열을 통해 인코딩되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 IGF2 단백질은 surfactant protein C (SPC) 프로모터 유전자와 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 한다.

상기 surfactant protein C (SPC) promoter 유전자는 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 동물 모델을 제공한다.

상기 동물의 종류로는 마우스, 랫트(rat), 소, 말, 돼지, 원숭이, 오리, 개, 고양이 등이 될 수 있고, 마우스인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 마우스는 IGF2 단백질을 hybrid C3H/C57B6 fertilized mouse egg에 microinjection하여 제조되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

아울러, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 동물 모델을 이용한 폐기종 동물 모델 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 방법은 하기의 단계를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다:

상기 단계 1)의 피검화합물 또는 조성물은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사 산물 및 생활성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, alveolar type II 상피세포에 특징적으로 발현하는 surfactant protein C (SPC) promoter를 사용하여 폐 상피세포에만 IGF2가 발현되도록 한 형질전환 마우스를 제작하였으며, 이를 통해 기존 모델과 달리 폐 선택적/국소적으로 발현되는 IGF2에 의한 폐기종을 확인할 수 있었다.

또한, IGF2 과발현 형질전환 마우스에서 폐기종의 특징적인 현상인 collagen 조직의 파괴, 단백분해효소인 MMP-9의 발현 증가 및 항단백분해효소인 α1-antitrypsin의 발현 감소가 나타남을 확인하였으며, 이러한 단백분해효소 및 항단백분해효소의 발현 변화를 IGF2의 발현을 조절한 폐 상피세포에서 재확인하였다.

또한, 담배 성분인 NNK를 장기간 처리한 폐 상피세포에서 IGF2, IGFBP-3 및 폐 조직 손상을 일으키는 MMP-1, MMP-10, MMP-12, MMP-13의 발현과 IGF2 processing에 관여하는 furin의 발현이 증가됨을 확인하였고, IGF2에 의하여 MMP-1의 발현이 증가됨을 확인하였다.

또한, 담배 성분인 NNK와 benzo[a]pyrene를 마우스에 병용 투여시, 폐 조직에서 IGF2 과발현 형질전환 마우스와 유사한 폐기종 병변이 발생되고, IGF2 발현 증가, 단백분해효소 MMP-9의 발현 증가, 항단백분해효소인 α1-antitrypsin의 발현 감소 효과가 발생함을 확인하였다.

이로써, 폐기종을 유발할 수 있는 신규 유전자 변형마우스 모델과 담배 발암원이 IGF2 발현을 증가시켜 폐기종을 유발할 수 있는 작용기전을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 방법에 의해 제조된 IGF2 과발현 형질전환 마우스는 폐기종의 치료 및 예방을 위한 새로운 분자지표와 폐기종 치료제를 스크리닝하기 위한 새로운 모델 동물로 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. IGF2 과발현 형질전환 마우스의 제작

1-1. SPC - IGF2 transgene 의 발현벡터 제작

형질전환 마우스 제작을 위한 유전자 변형 벡터인 SPC-kbpA는 Dr. DeMayo (Baylor Medical School)로부터 분양받은 것을 이용하였다. 600 bp 길이의 인간 IGF2 cDNA를 PC-kbpA 벡터의 EcoRI 위치에 subcloning 하여 SPC-IGF2 plasmid를 제작하였다. 그러므로 IGF-2유전자 발현은 surfactant protein C (SPC) promoter의 조절 하에 있도록 제작되었다.

1-2. 유전자 변형 마우스 제작

SPC-IGF2 plasmid를 restriction enzyme인 NdeI 및 NotI을 처리하여 SPC/IGF2 transgene을 절단하였다. 6 kb의 insert를 gel electrophoresis를 통해 분리한 후 transgene을 hybrid C3H/C57B6 fertilized mouse egg에 microinjection하였다.

사람 IGF2 transgene을 포함하는 마우스는 PCR analysis로 확인하였다. 마우스 꼬리 일부를 절단한 후 genomic DNA를 분리한 다음 SPC promoter/IGF2 연결 부위 700 bp에 대한 primer를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이때 사용한 primer 서열은 forward primer 5’- CATGGAATTCAGACACCAATGGGAATCC-3’, reverse primer 5’-CATGGAATTCTGCTCACTTCCGATTGCTG-3’이다. PCR은 95℃, 5분에서 initial denaturation을 실시한 뒤 95℃, 45초, 58℃, 45초, 72℃, 45초씩 총 35 cycles을 수행하였고, 72℃에서 7분간 final extension 반응을 실시하였다. 생성된 PCR product는 RedSafe dye가 포함된 2% agarose gel로 전기영동하여 분리하였고, UV transilluminator에서 관찰하여 IGF2 포함 여부를 확인하였다.

실시예 2. 제작된 IGF2 과발현 형질전환 마우스의 폐기종 유발 확인

상기 실시예 1에서 제작된 본 발명의 IGF2 과발현 형질전환 마우스에서 폐기종이 유발되었는지의 여부를 확인하기 위하여, 하기 실험을 수행하였다.

2-1. 실험방법

H&E 염색

폐 선택적 IGF2 유전자변형 (과발현) 마우스의 폐를 분리하고, 분리한 폐를 10% formalin을 사용하여 24 시간 동안 고정한 뒤 파라핀 블록에 embedding하였다. 파라핀 블록은 4 μm의 두께로 박절하고 silane coating 슬라이드에 부착 후 건조하였다. 말린 slide glass를 65 ℃ dry-oven에 넣어 overnight으로 탈파라핀을 진행하였다. 그 후 slide glass를 xylene에 5 분씩 2회 넣어두었다. 탈파라핀 시킨 후, 100%, 95%, 70%, 50% 단계별 에탄올로 함수시키고 Harris hematoxylin 용액에 1 분 30 초간 염색한 뒤 1% HCl alcohol 용액과 ammonia로 침적시킨 다음, eosin 용액으로 30 초간 염색하였다. 그 후 95%, 100% 에탄올을 이용하여 순차적으로 탈수시킨 후 xylene으로 투명화한 뒤 봉입하여 현미경으로 관찰하고 사진을 촬영하였다.

폐 상피세포 RNA 추출 및 RT - PCR

RT-PCR 분석을 위한 total RNA는 마우스에서 적출된 폐의 상피세포에서 분리하였다. 우선 Trizol Reagent를 첨가하여 세포를 균질화한 후, 여기에 chloroform을 첨가하여 13,000 rpm에서 20 분간 원심분리하였다. 상층액을 회수하여 동량의 isopropanol을 첨가하여 13,000 rpm에서 20 분간 원심분리하여 RNA를 침전시켰다. 침전된 RNA는 75% 에탄올로 세척한 후, 건조시켜 nuclease-free water에 용해시켰다. 260 nm의 흡광도를 측정하여 RNA를 정량하였고, A260/A280nm의 비율이 1.8~2.0 범위 내의 값을 갖는 RNA를 실험에 사용하였다. 모든 실험은 RNase-free한 조건하에서 이루어졌다.

cDNA는 PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit를 이용하여 2 ㎍의 total RNA, oligo dT primer (50 μM), dNTP mixture, 그리고 RNase free dH₂O로 65 ℃ 5분간 반응하였고, 그 후 Template RNA primer mixture에 5×PrimeScript Buffer, RNase inhibitor, PrimeScript RTase, 및 RNase free dH₂O를 넣어 42 ℃ 1 시간, 그리고 95 ℃에서 5 분간 heating 시킴으로써 반응을 중지시켜 합성하였다.

Polymerase chain reaction (PCR)은 2 μL cDNA, 4 μM primer sets, EconoTaq® 10 μL, 그리고 증류수를 가하여 반응액을 20 μL로 맞춘 다음 PCR 기기를 이용하여 수행하였다. PCR 조건은 95 ℃/10 초, 55~58 ℃/30 초, 72 ℃/1 분으로 하여 25~33회 증폭하였다. PCR 산물은 2% agarose gel에서 전기영동한 후 ethidium bromide (EtBr)로 염색하여 UV transilluminator에서 특정 밴드를 관찰하였다.

Western blotting

IGF2 과발현 형질전환 마우스 및 NNK/B(a)P를 처리한 마우스로부터 폐를 적출한 뒤, 폐 조직을 취하여 RIPA lysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.25% sodium deoxycholate, 1 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM Na₃VO₄, protease inhibitor cocktail)에 넣고 TissueLyser를 이용하여 조직을 분쇄하여 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질을 BCA법을 이용하여 정량한 뒤, 동일한 양의 단백질 (20∼50 μg)을 SDS-PAGE로 전기 영동하였다. 분리된 단백질을 PVDF membrane으로 transfer한 뒤, 단백질이 옮겨진 membrane을 TBST (20 mM Tris-HCl (pH 8), 137 mM NaCl, 0.1% Tween-20)에 희석한 3% bovine serum albumin (BSA) 용액으로 실온에서 1시간 동안 blocking하였다. Membrane을 1차 항체가 1:1,000의 비율로 희석된 3% BSA가 함유된 TBST에 넣고 4℃에서 밤새 배양하였다. Membrane을 TBST로 실온에서 1시간 동안 세척하였다. 세척한 membrane을 2차 항체가 1:5,000 ∼ 1:10,000의 비율로 희석된 3% skim milk가 함유된 TBST에 넣고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. Membrane을 TBST로 실온에서 1시간 동안 세척한 뒤, ECL solution과 배양 후 X-ray film에 노출시켜 단백질 발현을 확인하였다.

IGF2 shRNA lentiviral vector 처리

폐 상피세포인 HBEC1 세포를 2×10⁵세포/well로 분주한 후 하루 동안 배양하였다. IGF2 shRNA lentiviral vector, Opti-MEM, FuGENE HD Transfection reagent를 혼합하여 실온에서 30분간 반응시키고, 세포에 처리하였다. 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 48시간 배양한 후 실험에 이용하였다.

IGF2 pBABE retroviral vector 처리

폐 상피세포인 HBEC1 세포를 2×10⁵/well로 6 well plate에 분주하고, 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 동안 키운 후 well에 세포가 70~80%로 자랐을 때 lipofectamine 2000 4 μL와 DNA 1 ㎍ Opti-MEM에 희석하고 세포가 seeding되어 있는 dish에 넣고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 6시간 동안 배양하여 transfection 하였다. 배양 후 growth factor를 포함하는 complete media를 넣어준 다음 37℃, 5%, CO₂ incubator에서 하루 동안 배양한 후 실험에 이용하였다.

Masson's trichrome staining

muscle, collagen은 산성 염료인 Biebrich Scarlet acid fuchsin에 의해 적색으로 염색되고, phosphomolybdic, phosphotungstic acid는 collagen을 탈색시키며, 염기성 염료인 anillin blue와 collagen의 basic group을 결합시켜 blue로 염색시킴에 따라, 교원섬유(collagen fiber)의 양과 형태를 광학현미경으로 확인할 수 있는 방법이다.

파라핀으로 고정된 폐 조직 절편을 100%, 95%, 70% alcohol로 탈파라핀화 및 수화시킨 다음 증류수로 세척하였다. 필요에 따라 Boulin's solution으로 56℃에서 1시간 동안 재 고정한 후 물로 5∼10분 동안 세척하였다. 조직을 Weigert's iron hematoxylin working soluion으로 10분간 염색한 뒤 온수 및 증류수로 세척하고, Biebrich scarlet-acid fuchsin solution으로 10∼15분간 염색하였다. 염색된 조직을 증류수로 세척한 뒤 phosphomolybdic-phosphotungstic acid solution에 10∼15분간 염색하고, aniline blue solution을 5∼10분 동안 처리한 뒤 증류수로 가볍게 세척하고 1% acetic acid solution을 2∼5분간 처리하였다. 증류수로 세척한 다음 염색된 조직을 95% ethanol과 absolute ethanol로 탈수시키고 xylene으로 세척하였다. Mounting solution으로 mounting 후 조직을 관찰하였다.

in situ Zymography

COPD를 일으키는 주된 인자로 알려진 단백분해효소 MMP(matrix metalloproteinase)의 활성도를 폐 조직 내에서 검색하는 방법으로, fluorescein isothiocyanate(FITC)가 결합된 DQ gelatin을 포함한 reaction buffer를 슬라이드에 적정량 가한 후, 37℃의 암실에서 12시간 동안 반응시켰다. 활성화된 MMP가 DQ gelatin을 분해하게 되고, 억제되었던 FITC가 형광을 내게 되므로, FITC의 형광 강도는 MMP의 활성과 비례한다.

gelatin zymography

실험동물의 기관지를 절개한 다음 PBS 3ml을 이용하여 시험동물의 폐를 총 4회 세척하고, 세척액을 3000 rpm에서 3분간 원심분리한 후 위의 상층액을 얻어 농축시켜 기관지 폐포 세척액을 얻었다. 이후, 기관지 폐포세척액 내의 단백질 농도를 측정한 후 각 샘플의 단백질 농도를 5× sample buffer를 이용하여 동량으로 혼합한 후 0.1% gelatin을 함유한 10% SDS-PAGE에 전기영동하였다. 전기영동 후 겔을 2.5% Triton X-100에 20분씩 2번 담그고 배양버퍼를 넣어 37℃에서 24시간 담근 후, 겔은 0.5% Coomassie brilliant blue 250 용액으로 착색시킨 후 탈색버퍼를 이용하여 탈색시킨 후 판독하였다.

Immunocytochemistry

폐 조직 세포를 0.8×10⁶이 되도록 6-well culture plate에 cover-slip을 넣어 분주한 후, 37℃, 5% CO₂ incubator에서 밤새 배양하였다. 세포가 부착된 후 NNK/benzo[a]pyrene를 각각 10μM의 농도로 처리하고, 3일 후 배지를 제거한 후 PBS를 사용하여 5분씩 3회 세척하였다. 그 후 cold MeOH로 실온에서 30분 동안 세포를 고정시키고 다시 PBS를 사용하여 5분씩 3회 세척하고, 3% BSA solution을 사용하여 4℃에서 1시간 동안 blocking을 수행하였다. 그 후, blocking buffer에 α1-antitrypsin에 특이적으로 결합하는 1차 항체를 1:100으로 희석하여 4℃에서 밤새 반응시켰다. 슬라이드를 PBST(1:1000)로 10분씩 3회 세척한 후, 2차 항체인 Alexa 488(1:1000)을 사용하여 상온에서 1시간 동안 차광상태에서 반응시켰다. 그 후, PBST(1:000)를 사용하여 10분씩 4회 세척하였고, DAPI가 포함된 mounting solution을 사용하여 mounting을 진행한 후, 형광현미경으로 관찰하였다.

2-2. 실험결과

1) 폐 조직 염색 및 적출된 폐 형태 확인

H&E 염색

상기 실시예 2-1의 H&E 염색을 통하여 생후 30일의 폐 선택적 IGF2 유전자변형(과발현) 마우스의 폐에서 폐기종으로의 조직 변화, 즉 폐 조직의 손상과 이로 인하여 폐포가 커지는 증상을 확인하였으며, 이를 도 1에 나타내었다. 도 1의 상단 사진 및 하단 좌측은 폐 조직 및 조직 단면에 대한 H&E 염색 결과를 나타낸 것으로, IGF2의 발현 정도가 다른 두 line(line 1, line 2)에서 동일하게 폐기종이 유발되었음을 확인하였다.

Masson's trichrome staining

상기 실시예 2-1의 Masson's trichrome staining 방법을 이용하여, 교원섬유(collagen fiber)의 양과 형태를 관찰하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 정상군(WT)의 폐조직은 교원섬유의 밀도가 조밀하고 배열이 규칙적인 반면, IGF2 유전자변형(과발현) 마우스의 폐조직은 교원섬유가 파괴되어 밀도가 엉성하고 배열이 불규칙적이며 양도 많이 줄어들어 있는 것을 확인할 수 있었다. 즉, COPD 환자들에서 발견되는 섬유화와 폐포벽이 무너지며 교원섬유가 파괴되어 콜라겐이 붕괴되는 현상을 확인하였다.

적출된 폐 형태 확인

또한, 19개월의 IGF2 과발현 형질전환 마우스의 폐에서, 폐기종으로의 조직 변화 중 하나인 폐 조직의 손상 현상을 육안으로 확인하였으며, 이를 도 3에 나타내었다.

2) 단백질분해효소( MMP -9) 및 항단백분해효소(α1-antitrypsin)의 발현/활성 확인

in situ Zymography

COPD를 일으키는 주된 인자로 알려진 단백분해효소 MMP(matrix metalloproteinase)의 활성도를 폐조직 내에서 확인하기 위하여, 상기 실시예 2-1의 방법으로 in situ Zymography를 실시하였다.

그 결과, 도 4A에 나타낸 바와 같이, 정상군(b 참조)에 비하여 IGF2 과발현 형질전환 마우스의 폐 조직(d 참조)에서 MMP 활성이 증가됨을 알 수 있었다.

gelatin Zymography

기관지 폐포세척액(BAL) 내의 MMP-9의 단백질 분해능을 알아보기 위하여, 상기 실시예 2-1의 방법으로 gelatin zymography를 시행하였다. 기관지 폐포세척액(BAL)은 주로 염증세포들로 구성되어 있어 COPD 질환에서 염증반응의 증폭여부를 알아볼 수 있다.

그 결과, 도 4B에 나타낸 바와 같이, 정상군(WT)에 비하여 IGF2 과발현 형질전환 마우스의 폐 조직(IGF-2 TG)에서 MMP-9의 발현이 증가됨을 알 수 있었다.

Western blotting

COPD 환자에서는 항단백분해효소인 α1-antitrypsin의 발현이 감소되고 단백분해효소인 MMP-9의 발현이 증가되기 때문에, IGF2 과발현 형질전환 마우스에서도 이러한 현상이 일어나는지 확인하기 위하여, 적출된 폐에 대하여 상기 실시예 2-1의 방법으로 Western blotting을 수행하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 군 당 4마리의 마우스로부터 확보된 폐 조직에 대하여 실시한 결과, 정상군(WT)에 비하여 IGF2 과발현 형질전환 마우스(IGF2 TG)에서 α1-antitrypsin의 발현이 감소되고 MMP-9의 발현이 증가됨을 확인하였는 바, 이는 항단백분해효소와 단백분해효소간의 불균형에 의해 폐포 확장 증상이 나타날 수 있음을 시사하는 것이다.

RT - PCR

IGF2 발현이 증가됨에 따라 폐 조직 손상을 유발하는 MMP-1의 발현이 증가되고, IGF2 발현 억제에 의하여 basal level 또는 IGF2 발현 증가에 의해 유도된 MMP-1 발현이 감소됨을 확인하였다(도 6 참조).

또한, 폐 상피세포 BEAS-2B에서 IGF2 발현을 Knock-down에 의해 저하(K/D)시키거나 과발현(O/E)시킨 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, IGF2의 발현이 저하(K/D)되면 대조군(EV; empty vector)에 비하여 항단백분해효소인 α1-antitrypsin의 발현이 증가된 반면 IGF2이 과발현(O/E)되면 대조군에 비하여 α1-antitrypsin의 발현이 감소함을 알 수 있었다.

3) 담배 유래 발암원(NNK)과 IGF2 , MMP 유전자 발현의 상관관계 확인

담배 유래 발암원인 NNK의 장기간 동안의 처리(20, 30, 100일)에 의하여 사람 폐 상피세포인 HBEC 및 NHBE에서 폐기종과 연관된 것으로 알려진 IGFBP-3와 더불어 IGF2의 유전자 발현이 증가됨을 확인하였다(도 8),

또한, 담배 유래 발암원인 NNK의 장기간 동안의 처리 (7∼150일)에 의하여 사람 폐 상피세포인 HBEC1과 BEAS-2B에서 IGF2의 processing에 관여하는 효소인 furin, PC-1 및 PC-7의 유전자 발현이 증가되고(도 9), NNK 및 IGF2에 의하여 사람 폐 상피세포에서 furin의 발현이 증가하며, IGF2가 과발현된 조건에서 NNK를 처리하면 furin 발현 증가 효과가 강화됨을 확인하였다(도 10).

또한, NNK의 장기간 동안의 처리 (20∼150일)에 의하여 사람 폐 상피세포인 HBEC1과 BEAS-2B에서 폐 조직 손상을 유발하는 단백질 분해효소인 MMP-1, MMP-9, MMP-10, MMP-12, MMP-13의 유전자 발현이 증가됨을 확인하였다(도 11A 및 11B).

또한, 담배 유래 발암원인 NNK을 사람 폐 상피세포인 HBEC1과 BEAS-2B에 처리시, 항단백분해효소인 α1-antitrypsin의 발현이 감소됨을 확인하였다(도 12).

아울러, 담배 유래 발암원인 NNK과 benzo[a]pyrene을 사람 폐 상피세포인 BEAS-2B에 병용처리시, α1-antitrypsin 발현 감소 및 MMP 발현 증가 효과가 더욱 강화됨을 확인하였고, 상기 실시예 2-1의 방법으로 immunocytochemistry를 수행한 결과 NNK와 benzo[a]pyrene을 병용 투여한 폐 상피세포에서 α1-antitrypsin의 발현이 감소되는 것을 재확인하였다(도 13).

이러한 결과는, 담배 발암원에 의하여 발현 및 활성화된 IGF2는 폐 조직 손상을 유발하는 MMP의 발현을 유도하고, α1-antitrypsin의 발현을 억제함으로서 폐기종을 유발하는 것으로 종합할 수 있다. 본 연구 결과는 담배 발암원에 의한 MMP의 활성화에 따른 폐 조직 손상 과정에 있어 IGF2가 관여될 수 있음을 새롭게 규명한 것이다.

4) 폐기종 유발 담배 성분인 NNK와 benzo[a]pyrene의 마우스( in vivo ) 병용투여 효과 확인

H&E 염색

마우스에 폐기종을 유발하는 담배 주요성분인 NNK과 benzo[a]pyrene(이하, B(a)P)를 5개월 (5M) 및 7개월 (7M) 동안 병용투여한 후 폐조직을 적출하여, 상기 실시예 2-1의 방법으로 H&E 염색을 실시한 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 정상군(WT)에 비하여 NNK/B(a)P 병용처리된 마우스 군에서, IGF2 과발현 형질전환 마우스와 유사하게 밀도가 엉성하고 배열이 불규칙한 폐기종 병변이 발생됨을 알 수 있었다.

in vivo 상에서 IGF2 발현 증가 확인

폐기종을 유발하는 담배 주요성분인 NNK과 benzo[a]pyrene를 마우스에 병용투여시, in vivo 상에서도 IGF2의 발현이 증가되었는지 확인하기 위하여, 적출된 폐조직을 대상으로 real-time PCR 및 웨스턴 블랏팅을 수행하였다.

그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, 대조군(VEH; vehicle (corn oil) 처리군)에 비하여 NNK/B(a)P 병용처리된 군에서 IGF2의 발현이 증가됨을 확인하였다.

in vivo 상에서 α1- antitrypsin 및 MMP 발현 변화 확인

COPD 환자에서는 항단백분해효소인 α1-antitrypsin의 발현이 감소되고 단백분해효소인 MMP의 발현이 증가되기 때문에, 폐기종을 유발하는 담배 주요성분인 NNK과 benzo[a]pyrene를 마우스에 병용 투여 시에도 이러한 현상이 일어나는지 확인하기 위하여, 폐 조직을 적출하여 상기 실시예 2-1의 방법으로 RT-PCR, 웨스턴 블롯팅, 및 gelatin zymography를 수행하였다.

그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, 대조군(VEH; vehicle (corn oil) 처리군)에 비하여 NNK/B(a)P 병용처리된 군에서 α1-antitrypsin의 mRNA 및 단백질 발현양이 감소되고, MMP-9의 mRNA 및 단백질 발현양이 증가됨을 확인하였다. 또한, gelatin Zymography 결과, MMP-9 및 MMP-12의 발현이 증가되었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Development of a novel emphysema-related animal model using insulin-like growth factor2 (IGF2) <130> PB14-12106 <150> KR 13/083697 <151> 2013-07-16 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Ile Pro Met Gly Lys Ser Met Leu Val Leu Leu Thr Phe Leu 1 5 10 15 Ala Phe Ala Ser Cys Cys Ile Ala Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu 20 25 30 Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg 35 40 45 Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg 50 55 60 Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu Leu 65 70 75 80 Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala Lys Ser Glu Arg Asp Val Ser Thr 85 90 95 Pro Pro Thr Val Leu Pro Asp Asn Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys 100 105 110 Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Lys Gln Ser Thr Gln Arg Leu Arg Arg 115 120 125 Gly Leu Pro Ala Leu Leu Arg Ala Arg Arg Gly His Val Leu Ala Lys 130 135 140 Glu Leu Glu Ala Phe Arg Glu Ala Lys Arg His Arg Pro Leu Ile Ala 145 150 155 160 Leu Pro Thr Gln Asp Pro Ala His Gly Gly Ala Pro Pro Glu Met Ala 165 170 175 Ser Asn Arg Lys 180 <210> 2 <211> 5182 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 cgcctgtccc cctcccgagg cccgggctcg cgacggcaga gggctccgtc ggcccaaacc 60 gagctgggcg cccgcggtcc gggtgcagcc tccactccgc cccccagtca ccgcctcccc 120 cggcccctcg acgtggcgcc cttccctccg cttctctgtg ctccccgcgc ccctcttggc 180 gtctggcccc ggcccccgct ctttctcccg caaccttccc ttcgctccct cccgtccccc 240 ccagctccta gcctccgact ccctcccccc ctcacgcccg ccctctcgcc ttcgccgaac 300 caaagtggat taattacacg ctttctgttt ctctccgtgc tgttctctcc cgctgtgcgc 360 ctgcccgcct ctcgctgtcc tctctccccc tcgccctctc ttcggccccc ccctttcacg 420 ttcactctgt ctctcccact atctctgccc ccctctatcc ttgatacaac agctgacctc 480 atttcccgat accttttccc ccccgaaaag tacaacatct ggcccgcccc agcccgaaga 540 cagcccgtcc tccctggaca atcagacgaa ttctcccccc ccccccaaaa aaaagccatc 600 cccccgctct gccccgtcgc acattcggcc cccgcgactc ggccagagcg gcgctggcag 660 aggagtgtcc ggcaggaggg ccaacgcccg ctgttcggtt tgcgacacgc 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Claims

폐기종 유발 동물 모델의 제조 방법으로서, 상기 방법은 인슐린 유사 성장 인자 2(Insuline-like growth factor 2; IGF2) 단백질을 과발현시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1항에 있어서, 상기 IGF2 단백질을 과발현시키는 단계는 동물의 폐 상피세포에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1항에 있어서, 상기 IGF2 단백질은 surfactant protein C (SPC) 프로모터 유전자와 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1항에 있어서, 상기 폐기종 유발 동물은 마우스인 것을 특징으로 하는, 방법.
제 4항에 있어서, 상기 마우스는 IGF2 단백질을 hybrid C3H/C57B6 fertilized mouse egg에 microinjection하여 제조되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1항의 방법에 의해 제조된 동물 모델을 이용한 폐기종 치료제 후보약물 스크리닝 방법.