KR20140142029A - 무균 미니 돼지의 폐포 대식세포에 대한 단클론 항체 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 무균 미니 돼지의 폐포 대식세포에 대한 단일클론 항체 및 그 용도에 관한 것이다.

Description

무균 미니 돼지의 폐포 대식세포에 대한 단클론 항체 및 그 용도{A Monoclonal antibody against Pulmonary Alveolar Macrophages of Gnotobiotic Miniature Swine and use of the same}

본 발명은 무균 미니 돼지의 폐포 대식세포에 대한 단일클론 항체 및 그 용도에 관한 것이다.

돼지 폐포 대식세포(pulmonary alveolar macrophage; 이하, 'PAM'라 함)의 개체발생(ontogeny) 및 발생을 조사하기 위하여 유용한 돼지 특이적인 항체는 충분하지 않다.

돼지는 단일 동물에서 많은 수의 세포를 얻을 수 있기 때문에 면역 시스템에서 세포의 이동(Binns, R.M., Pabst, R., Licence, S.T., 1985. Immunology 54, 105-111) 개체발생(Rothlein, R., Gallily, R., Kim, Y.B., 1981.Journal of the Reticuloendothelial Society 30, 483-495), 및 기능(Harmsen, A.G., Jeska, E.L., 1980. Journal of the Reticuloendothelial Society 27, 631-637; Rothlein, R., Kim, Y.B., 1982. Journal of immunology 129, 1859-1864;Rothlein, R., Kim, Y.B., 1983. Journal of immunology 131, 1438-1442) 의 조사를 위한 우수한 동물모델이다. 또한 무균 미니 돼지는 인간과 면역학적 유사성을 가진다.

불행하게도, 돼지 림프구, 단핵구 및 대식세포와 반응하는 단일클론 항체들은 거의 구할 수가 없다. 게다가 최근 이종장기 이식 연구는 장기 공여체로 무균 미니 돼지의 사용에 초점이 맞추어져 있다(Yang, Y.G., Sykes, M., 2007. Nature reviews. Immunology 7, 519-531).

그러나 돼지 면역 시스템에 대한 지식은 충분하게 이해되어 지지 않았다. 따라서 돼지의 천연 면역 시스템을 발견하기 위하여, 대식세포, 단핵구, 과립구, 수지상 세포 및 NK 세포와 같은 천연 면역 세포들을 첫째 결정되어야 할 필요가 있다. 이들 세포 중에서 대식세포는 천연 면역 조절에 중요한 역할을 한다(Sun, D., Lohmann-Matthes, M.L., 1982. European journal of immunology 12, 134-140). 또 하이브리도마 기술의 발달(Kearney, J.F., Radbruch, A., Liesegang, B., Rajewsky, K., 1979. Journal of immunology 123, 1548-1550;Kohler, G., Milstein, C., 1975. Nature 256, 495-497)은 여러 세포 표면 분자에 반응하는 많은 단일클론 항체(mAbs)들의 생성을 가능하게 하였다.

돼지 대식세포에 반응성을 가지는 단일클론들은 면역 조절 및 돼지 선천성 면역 시스템의 개체발생 및 발생을 조사하기 위한 유용한 도구일 수 있다. 또한 돼지 선천성 면역 조절에 대한 연구는 단일클론 항체들이 활성 또는 저해로서의 기능을 가질 수 있기 때문에 더 쉽게 얻을 수 있다(Sekido, N., Mukaida, N., Harada, A., Nakanishi, I., Watanabe, Y., Matsushima, K., 1993. Nature 365, 654-657).

[선행특허 문헌]

대한민국특허공개번호 제특2001-0033727

대한민국특허공개번호 제10-2004-0065213

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 무균 미니 돼지 대식세포 특이적인 항체를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 항원 단백질 Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1(ENPP1)에 대하여 반응하고, 무균미니돼지 대식세포에 특이적으로 반응하는 단일클론항체를 제공한다.

본 발명의 구현예에 있어서, 상기 항원 단백질 Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1(ENPP1)는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 항원 단백질은 130kDa의 다이머 분자인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는 대식세포 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 대식세포는 무균미니돼지 대식세포인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 a)돼지 조직으로부터 세포를 분리하는 단계;및

b) 상기 세포에 상기 본 발명의 단일클론 항체를 처리하는 단계를 포함하는 돼지 조직 유래 세포로부터 대식세포를 검출하는 방법을 제공한다.

또 본 발명은 a)돼지 기관지폐포세척액으로부터 폐포 대식세포(PAM)을 제조하는 단계;b)상기 폐포대식세포로 마우스를 면역화하는 단계;c) 상기 면역화된 마우스로부터 얻은 지라 세포들을 쥐 골수(murine myeloma) 세포와 융합하고, 항 대식세포 항체를 생산하는 하이브리도마를 PAM에 대한 반응성에 대해서 에세이하여 얻는 단계;및 d)상기 항 대식세포 항체들을 생성하는 하이브리도마를 클론화하여 그 선택된 클론들을 증식하는 단계를 포함하는 상기 본 발명의 단일클론 항체를 생산하는 방법.

또 본 발명은 상기 본 발명의 단일클론 항체를 골수세포 계통 분화의 개체발생에 사용하는 방법.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명은 돼지 폐포 대식세포에 존재하는 표면 막 분자들과 반응하는 세 mAbs을 생성하고 특성을 규명한 것이다. 1) PM18-7는 모든 PAM상에는 존재하나 단핵구 또는 과립구에는 존재하지 아니하는 면역침전된 130 kDa 다이머분자를 면역침전하는 것을 발견하였었다. 2) mAb PM3-15는 비환원 조건 하에서 245 kDa 분자를 환원 조건 하에서는 150, 95 kDa을 면역침전하고 PAM, 지라 대식세포, 장간막 림프절 대식세포, 및 단핵구와 반응하였다. 3) mAb PM16-6는 비환원 조건하에서는 125 kDa 분자를 환원 조건 하에서는 75, 25 kDa 분자를 면역침전하였고 PAM, 단핵구 및 과립구와 반응하였다.

돼지 PAM의 개체발생을 더 규명하고 발생동안 나타나는 표면 항원을 동정하기 위하여 돼지 대식세포와 반응하는 mAbs이 필요하였다. 용이하게 얻을 수 있는 마우스나 인간 대식세포에 대하여 제조된 mAbs는 돼지 대식세포와 반응하지 않으므로 PAM와 반응하고 RBC, 말초 혈액 림프구 및 흉선세포와 반응하지 아니하는 하이브리도마를 선택하여 대식세포에 특이적인 에피토프를 인지하는 mAbs를 얻고, 다른 세포 타입에 일반적인 에피토프를 인지하는 mAbs를 제거하였다. PAM에만 반응하는 많은 하이브리도마 상등액은 재실험에서는 비반응성이었다. 그러나 선택된 세클론들(PM18-7, PM3-15 및 PM16-6)은 안정적이었고, mAbs 분비를 계속하였다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

면역글로불린 Class 결정

세 단일클론 항체들의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 타입을 결정하였다. 모든 단일클론 항체들은 kappa 경쇄를 가졌다. 단일클론 항체 PM16-6는 mu 중쇄를 포함하였고 따라서 IgM 분자이었다. PM3-15 및 PM18-7 단일클론 항체들은 gamma 1 중쇄를 가지고 IgG1 subclass이었다(표 1).

표 1은 Anti-PAM 단일클론 항체들의 아이소타이핑

에피토프들의 조직 분포는 단일클론 항체에 의하여 인지되었다

돼지 폐포 대식세포에 대한 단일클론 항체들을 제조하고 여러 조직들 유래 단일 세포 현탁액으로 각 항-대식세포 단일클론 항체의 반응성을 결정하기 위하여 ELISA 에세이를 사용하였다. 이들 결과에 기반하여, 세 종류의 단일클론 항체가 추가적인 특성규명을 위하여 선택되었다(표 2). 따라서 PM3-15, PM16-6 및 PM18-7는 면역 PAM 세포에 강한 결합(++++) , 어드히런트 신생 골수 세포 및 간 세포에 대한 중간 (++) 결합을 나타내었지만 림프구, 적혈구, 흉선세포 또는 마우스 J774 세포들에는 결합하지 않았다. 또한, PM3-15 및 PM16-6는 단핵구에 양성 반응성을 나타내었다. 단일클론 항체 PM3-15는 지라 대식세포 및 림프절 대식세포와 반응성 패턴을 나타내었고 이것은 PM16-6 또는 PM18-7으로는 보이지 않았다 (표 2).

표 2는 단일클론 항체들에 의하여 인지되는 에피토프으 조직 분포를 나타냄

보체 의존적 세포독성

보체를 고정하는 PM3-15, PM16-6 및 PM18-7의 능력을 보체 의존적 세포독성(CDC) 에세이를 사용하여 결정하였다. 90% 이상의 PAM가 보체 및 PM16-6에 의하여 파쇄되고, 그것은 그것의 IgM 아이소타입과 일치하고 보체에 효과적으로 결합하는 IgM 아이소타입의 공지된 능력과 일치한다. 대조적으로, PAM를 PM3-15 또는 PM18-7과 반응할 경우, 파쇄의 퍼센트는 23에서 27% 범위로 매우 낮았다(표 3 및 도 1). IgG1 아이소타입의 항체들은 보체를 고정하는 능력이 없거나 매우 작다는 것이 알려졌다. 따라서 이들 다른 단일클론 항체의 보체 고정 능력은 그들의 IgG1 서브클래스와 일치한다.

표 3은 보체 의존적인 세포독성 에세이에서 보체를 고정하는 단일클론 항체들의 능력을 나타낸 표

돼지 식세포에 대한 PM3 -15, PM16 -6 및 PM18 -7 항원의 분포

PAM, PBMO, 및 과립구로 PM18-7, 3-15 및 16-6의 반응은 유동세포분석법으로 분석하엿다. 각 mAbs은 이들 세 종류의 식세포에 대하여 다른 결합 패턴을 나타내었다.

mAb PM18-7은 PAM에 대하여 91% 결합하였지만, PBMO 또는 과립구에 대해서는 결합하지 않았다. PAM 상에서 PM18-7에 의하여 인지된 항원을 발현은 밝은 형광 강도를 나타내었고 이것은 PAM의 대부분이 높은 밀도로 세포 표면 상에서 이들 분자를 발현한다는 것을 시사한다. 따라서 PM18-7이 PAM 특이적 항원을 인지한다는 것을 확인할 수 있다(도 2).

PM3-15는 PAM에 대해서 92%, PBMO에 대해서 86% 결합하였지만, 과립구에 대해서는 결합하지 않았다(3.5%). PM3-15는 PAM 상에서 밝은 형광 강도를 나타내었고 PBMO 상에서 중간정도 밝은 형광강도를 가졌다. 따라서, PM3-15에 반응하는 높은 밀도의 항원이 대부분의 PAM의 표면에 존재하고 PBMO의 표면 상에는 덜 풍부하게 존재하였다. PM3-15에 의하여 인지된 항원은 과립구의 세포 표면에는 존재하지 않았다. 따라서 이들 결과는 PM3-15가 단핵 식세포 특이적인 항원을 인지한다는 것을 나타낸다.

PM16-6은 82%의 PAM에, 89%의 PBMO에 그리고 84%의 과립구에 결합하였다. PM16-6의 형광 강도 결합 패턴은 PAM 상에서는 중간 밝기, PBMO 및 과립구 상에서 흐린 중간 정도이었다. 이 결과들은 대부분 PAM, PBMO, 및 과립구들은 그들의 세포 표면 상에 존재하는 PM16-6에 의하여 인지되는 그러나 다른 밀도로 인지되는 항원을 가졌다는 것을 시사한다. 항원은 PBMO 또는 과립구 상에서 보다 PAM 상에서 더 높은 밀도로 존재하였다. 따라서 PM16-6는 식세포 특이적 항원들을 인지한다는 것을 시사한다(도 3).

인간 및 마우스 대식세포 계통 세포와 마우스 항돼지 대식세포 단일클론 항체의 반응

인간 또는 마우스 세포와 반응하는 단일클론 항체들은 일반적으로 돼지 세포와는 반응하지 않는다. 돼지 세포와 반응하는 단일클론 항체들이 인간 또는 마우스 세포와 반응하는지 여부는 알려지지 않았다. 따라서 교차-반응성을 에세이하였다. 인간 단핵구 및 인간(U937) 및 마우스(WEHI-164) 세포주를 각 단일클론 항체 및 FITC-goat 항-마우스 IgG와 반응시킨 후, 형광 세포의 퍼센트를 조사하였다. PM3-15, PM16-6, 및 PM18-7는 테스트한 각 세포에 결합하지 않았다(도 2).

PAM 에 대한 각 단일클론 항체에 결합된 항원 위치 동정

단일클론 항체들은 골수 계통 세포 상의 특이적인 항원을 인지한다. 본 발명에서 항원의 위치는 면역조직화학 방법에 의하여 동정되었다. PM18-7, PM3-15에 결합한 항원은 PAM 및 3d4/2의 표면 상에서 관찰되었고, PM16-6에 대한 항원은 표면 및 원형질 내 모두에서 관찰되었다(도 4). 이들 데이터는 본 발명에서 고안된 단일클론 항체들이 면역조직화학의 적용 및 골수세포 계통 분화의 개체발생에 사용될 수 있다는 것을 시사한다.

단일클론 항체에 의하여 인지된 항원들의 분자량

SDS-PAGE에 의하여 수반된 각 단일클론 항체로 PAM 전체 세포 파쇄액의 면역침전을 PM3-15, PM16-6 및 PM18-7에 의하여 인지되는 세포 표면 항원들의 분자량을 결정하기 위하여 수행하였다.

비환원 조건 하에서 260kDa의 분자량, 및 환원 조건 하에서 130kDa의 분자량을 가지는 하나의 밴드를 침전하는 PM18-7는 면역침전과 SDS-PAGE에 의하여 관찰되었다(도 5A). PM3-15는 비환원 조건 하에서는 245 kDa의 분자량을 그리고 환원 조건 하에서는 150, 95 kDa의 분자량을 가지는 밴드를 침전하는 것이 관찰되었다. PM16-6는 비 환원 조건 하에서는 125 kDa의 분자량을 환원 조건 하에서는 75, 25 kDa의 분자량을 가지는 침전이 관찰되었다(도. 5B). 네 실험들에서 얻어진 분자량의 요약은 PM18-7에 의하여 인지되는 항원은 ENPP1/CD203a으로, PM3-15는 CR3(CD11b/CD18)으로 그리고 PM16-6는 THOP1로 동정되었다.

표 4는 LC/MS-MS 단백질 시퀀싱 분석에 의한 항원 동정에 관한 표

본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에서 몇 종 마우스 항-돼지 대식세포 단일클론 항체를 생성하고 특성을 규명하였다. 첫 번째. 단일클론 항체 PM18-7, IgG1, kappa isotype,은 91%의 PAM, 6%의 단핵구, 및 2%의 과립구에 결합하고, 이것은 PM18-7가 PAM 특이적인 것을 나타낸다. 단핵구 유래 대식세포는 배양에 의하여 PM18-7 항원을 발현하기 위하여 유도될 수 없었다. PM18-7은 SDS-PAGE 상에서 비환원 조건하에서는 260 kDa의 분자로 환원 조건 하에서는 130 kDa의 분자로 면역침전되었다. 두 번째, 단일클론 항체 PM3-15, IgG1, kappa isotype은 92%의 PAM, 86%의 단핵구, 및 3%의 과립구에 결합하고 이것은 PM3-15가 단핵 식세포(mononuclear phagocyte) 특이적이라는 것을 시사한다. PM3-15는 SDS-PAGE 상에서 비환원 조건하에서는 245 kDa의 분자로 환원 조건 하에서는 150, 95 kDa의 분자로 면역침전되었다. 세번째, 단일클론 항체 PM16-6, IgM isotype,은 82%의 PAM, 89%의 단핵구, 및 82%의 과립구에 결합하고 이것은 PM16-6가 식세포(phagocyte) 특이적이라는 것을 나타낸다. PM16-6에 의하여 면역침전된 항체는 그 항원은 SDS-PAGE 상에서 비환원 조건하에서는 120 kDa의 분자로 환원 조건 하에서는 75, 25 kDa의 분자로 면역침전되었다. 최종적으로, PM18-7에 의하여 결합된 항원은 ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1 (ENPP1)으로, PM3-15에 의하여 결합된 항원은 integrin alpha M beta 2 precursor (ITGaM, CD11b)로 그리고 PM16-6에 의하여 결합된 항원은 Thimet oligopeptidase (THOP-1)으로 LC-MS/MS 단백질 시퀀싱 방법에 의하여 동정되었다.

이들 항체들은 돼지 폐포 대식세포(PAM)의 개체발생(ontogeny) 및 발생을 조사하기 위하여 유융하다.

도 1은 단일클론 항체들에 의한 돼지 폐포 대식세포에 대한 보체 의존적 세포독성을 나타낸 그림.
도 2는 인간 또는 마우스 단핵구/대식세포주와 mAbs의 반응을 나타낸 그림. 데이터는 MFI(Means of fluorescence intensity)로 나타냄. 세포들을 FACS Calibur machine (BD™, New Jersey, USA)으로 조사하였다.
도 3은 유동 세포분석을 각 골수 계통 세포, 대식세포(PAM), 단핵구(PBMO) 및 과립구(PMN)에 대한 단일클론 항체로 수행하였다. PM18-7 mAb는 PAM에만 포지티브, PM3-15는 PAM 및 PBMO에 포지티브하고 PM16-6은 PAM, PBMO 및 PMN에 포지티브하였다. 2차 대조군은 mAb없이 1차 항체로 배양한 것을 나타낸다.
도 4는 PAM 및 3d4/2(PAM 세포주)에 대한 각 단일클론항체에 의하여 수행된 면역조직화학을 나타낸다. A, E; 단지 2차 항체 (goat anti-mouse Ig(H+L))를 PAM 및 3d4/2에 대해서 처리, B, F; PM18-7를 1차 항체로 사용, C, G; PM3-15를 1차 항체로 사용, D, H; PM16-6를 1차 항체로 사용하였다.
도 5는 PAM 전체 세포 파쇄액의 mAb 면역침전에 의하여 검출된 항원의 분자량을 SDS-PAGE로 비환원 및 환원 조건 하에서 동정한 그림. 비 환원(A) 및 환원(B) 조건 하에서 mAb들의 면역침전체는 각 mAbs에 결합된 항원을 나타냄. 환원 조건 하에서 PM18-7 및 PM3-15의 면역침전체를 이해할 수 있다(C).

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

본 발명에 사용된 동물은 University of Health Sciences/The Chicago Medical School의 동물 실험시설에 있는 Minnesota 미니 돼지를 사용하였다(Chung and Kim, 1988; Rothlein and Kim, 1982, 1983). 현재 Chicago Medical School로부터 무균 미니 돼지는 건국대로 옮겨왔다 .

실시예 1: 폐포 대식세포( Pulmonary Alveolar Macrophage ; PAM )의 제조

PAM은 기관지폐포세척액(bronchial lavage)에 의하여 얻었다(Myrvik et al., 1961). 요약하면 2 리터의 phosphate-buffered saline (PBS)를 기관지내로 주사하고 그것을 재회수하였다. 폐포세척액을 빼내서 1000xg 에서 10분간 원심분리하였다. 그 펠렛화된 세포들을 high balanced salt solution (HBSS)에서 3회 세척하고, 완전 배지(25 mM Hepes, 2 mM L-Glutamine, 100 U penicillin/ml, 100 ug streptomycin/ml, 및 10 % 열 불활성화된 FBS가 보충된 RPMI-1640 배지)에 재부유하고 계수하였다. 이 방법은 90-95% 이상의 순도를 가지는 PAM 을 얻었다.

실시예 2: 말초 혈액 단핵구 세포( Peripheral blood mononuclear cells ; PBMC )의 제조

말초 혈액 유래 단핵 세포들은 Boyum의 Ficoll-Paque™ PLUS (GE healthcare, Germany) 밀도 구배 원심분리법에 의하여 제조되었다. 단핵 세포들을 완전 배지에서 재부유하고 37℃ 및 5% humidified CO2에서 1시간 배양하였다. 말초 혈액 림프구(PBL)를 단핵구를 포함하는 비부착(non-adherent) 층으로 붓고 5 분 동안 얼음에 놓았다. 그 다음 그 단핵구들을 rubber policeman을 가지고 플레이트로부터 스크랩을 하여 완전배지에 재부유하였다 .

실시예 3: polymorph nuclear cells ( PMN )의 제조

과립구들을 덱스트란 침전에 의하여 회수하였다. 요약하면 20 ml의 헤파린 처리된 전혈(whole blood)을 4 ml의 dextran (2 % Dextran 500 및 4 % Dextran 70, Pharmacia)과 혼합한 후, 그 혼합액을 상온에서 1시간 방치하였다. plasma-dextran-leukocyte 혼합물을 포함하는 상층을 제거하고 BSS로 2회 세척하였다. 오염된 적혈구를 적혈구 라이시스 버퍼(Sigma™, St. Louis, MO)로 파쇄하였다.

실시예 4: 단일 세포 현탁액의 제조

단일 세포 현탁액은 무균 미니 돼지로부터 무균적으로 제거된 간, 장간막 림프절, 지라 및 흉선으로부터 얻었다.

세포를 조직으로부터 얻어서 위치시켜서 찌꺼기가 가라앉도록 하였다. 그 상등액에 있는 세포들을 회수하여 원심분리하고 HBSS에서 3회 세척한 후, 완전 배지에서 재부유하였다. 골수 세포들을 돼지으로부터 갈비 또는 대퇴골로부터 얻었다. 그 뼈들을 30 ml BSS와 18 게이지 바늘을 가지는 주사기를 사용하여 씻어내었다. 단일 세포 현탁액을 HBSS에서 3회 세척하고 완전배지에서 재부유하였다.

실시예 5: 단일클론 항체

PAM으로 면역화된 마우스로부터 얻은 지라 세포들을 P3X63-Ag8-653 murine myeloma 세포와 융합하였다(Kearney et al., 1979). 항 대식세포 항체를 생산하는 Hybridomas를 ELISA에 의하여 PAM에 대한 반응성에 대해서 에세이하였다. 항 대식세포 항체들을 생성하는 하이브리도마는 단일 클론을 확인하기 위하여 현미경 관찰에 의하여 제한된 희석에서 수회 클론화하였다. 그 선택된 클론들은 pristane-primed balb/c 마우스에서 복수(ascites fluid) 및 배양 상등액을 위하여 증식하였다.

실시예 6:ELISA 에세이

여러 조직 세포에 대한 단일클론 항체의 결합은 ELISA 방법에 의하여 결정되었다. 요약하면, 5 × 10⁵ 세포/웰을 0.5% glutaraldehyde로 96웰 플랫 버텀 마이크로 타이터 플레이트에 고정하고 PBS로 세척하였다. 그 웰을 뽑아내고, 100 ul의 하이브리도마 배양 상등액을 첨가하고 그 플레이트를 37℃에서 90분간 배양하였다. 그 플레이트를 PBS로 3회 세척한 후, 50 ul의 효소 표지된 항체 (Sheep 항-마우스 면역글로불린의 베타 galactosidase 부착된 F(ab')₂ 절편, Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD)를 첨가하였다. 그 플레이트를 37℃에서 90분간 배양하고 PBS로 5회 이상 세척하였다. 기질(100 ul의 NGP; 0-nitro-phenyl-beta-D-galactopyranoside, BRL)을 첨가하고 그 플레이트를 37℃에서 추가적으로 90분 배양하였다. 면역화된 동물로부터 얻은 마우스 혈청을 대식세포로 코팅된 웰에서 양성 대조군으로 사용하였다. 이 시약을 포함한 웰들은 밝은 노란색을 나타내었다. PBS를 포함하는 대식세포로 코팅된 웰을 음성 대조군으로 사용하였고, 무색을 나타내었다. 플레이트에서 mAbs 결합된 세포들은 발색반응을 나타내었다. 각 웰에서 발견된 색 강도를 평가하기 위하여 ++++까지 임의 스케일을 사용하였다.

실시예 7: Isotype 결정

단일클론 항체들의 면역글로불린 아이소타입은 특이적인 항체들을 사용한 Ouchterlony 이중 희석법에 의하여 결정되었다(Litton Biogenetics, Kensington, MD)(Eby et al., 1973). 25 ml의 1.2% agarose (0.3 g/25 ml)를 아가로스를 완전하게 녹이기 위하여 가열하여 1 X assay 버퍼 내에서 제조하였다. 그 용액을 55-60℃로 냉각하고 호리즌탈 표면 상에 위치된 grease free 유리 슬라이드 상에 4 ml/slide로 부었다. 그 젤을 30분간 셋팅하고 그 템플레이트 상에 그 유리 플레이트를 유지시켜 웰을 펀치하였다. 하단 웰을 100 ul의 하이브리도마 세포 상등액으로 채우고 그 상단 두 웰들을 각각 10 ul의 Antigen 1 및 2로 채우었다. 그 유리 플레이트들을 moist 챔버에서 37℃에서 오버나잇을 유지하였다. 배양 후, 항원과 항혈청 사이에 불투투명한 침전 선이 관찰되었다.

실시예 8: 보체 의존적 세포독성( Complement Dependent Cytotoxicity ; CDC )

보체를 고정하는 단일클론 항체의 능력을 보체 의존적 세포독성 에세이로 결정하였다. 요약하면, PAM(50 ul 완전배지 내 4 x 10⁶ cells/ml)을 96웰 플랫 바텀 플레이트 내 50 ml의 단일클론 항체 상등액으로 37℃에서 30분간 배양하였다. 그 후 그 세포들을 얼음에 위치시키고 생존률을 0.4% trypan blue 염료 배제를 사용하여 평가하였다. 각 웰로부터 적어도 200 개 세포를 계수하였다. 음성 대조군, 배지 단독 속 대식세포 및 보체를 가지는 배지 속 대식세포를 각 실험에 대해서 런닝하였다. 그 결과들은 적어도 5번 실험의 평균값이다.

퍼센트 세포독성 = 100-[(PAM+mAb+C)/(PAM+C)*100]

실시예 9: 유세포 분석 및 형광 현미경법

100 ul의 완전 배지 내에 4 x 10⁶ 세포/ml로 재부유된 대식세포, 단핵구 또는 과립구들을 100 ul의 단일클론 항체 상등액으로 30분간 4℃에서 배양하였다. 그 후 그 세포들을 PBS-BSA-Azide로 2회 세척하고 50 ul의 1:20 희석된 FITC 부착된 친화 정제된 F(ab')₂ goat 항-마우스 IgG (Tago, Inc., Burlingame, CA and R&D systems, US)으로 추가적으로 30분 동안 4℃에서 배양하였다. 그 세포들을 2회 이상 세척하고 1 % formalin으로 고정하였다. 음성 대조군들은 FITC 부착된 goat 항-마우스 Ig로 배양된 세포들, MOPC(Balb/c 종양 세포주 유래 IgG1 isotype 대조군, Sigma™, St. Louis, MO) 및 FITC goat 항-마우스 Ig로 배양된 세포들, 또는 TEOC183 (Balb/c plasmacytoma 유래 IgM isotype 대조군, Sigma™, St. Louis, MO) 및 FITC goat 항-마우스 Ig(H+L)으로 배양된 세포들로 구성되었다. 단일클론 항체들 76-7-4 (돼지 항-B 세포에 대한 단일클론항체) 및 74-22-15 (돼지 항-phagocytes)를 American Type Tissue Collection (Rockville, MD)로부터 구입하고 일부 실험에서 음성 및 양성 대조군으로 사용하였다. 그 분석은 MDADS 프로그램(Coulter)을 사용하여 5,000 개 세포에 기반한다.

실시예 10: 면역침전법

세포들을 콜드 PBS로 3회 세척하였다. 대식세포를 400 ul의 50 mM Tris, 150mM NaCl, 5mM EDTA, 0.1 mM PMSF, 및 0.5% NP-40, pH 7.95로 파쇄하고 30 분간 얼음에 위치시킨 후 4℃에서 15분간 12000 x g로 원심분리하여 펠렛 핵으로 하였다. 그 세포 파쇄액을 20 ul의 단일클론 항체 MOPC ascites (American Type Culture Collection, Rockville, MD) 및 20 ul의 Protein A & G (sc-2003, Santacruz)를 첨가하여 프리클리어(preclear)하고 4℃에서 밤새 회전시켰다. 80 ul의 프리클리어된 파쇄액을 100 ul의 단일클론 항체 배양 상등액으로 상온에서 1시간 회전시켰다. 20 ul의 Protein A & G agarose 비드를 첨가하고 그 혼합액을 추가적으로 1시간 동안 회전시켰다. 그 면역 침전물을 5회 세척한 후, 2% SDS를 함유한 30ul의 샘플 버퍼를 첨가하였다. 환원 조건을 위하여 샘플 버퍼는 또한 5% 2-mercaptoehanol을 포함하였다. 샘플을 비환원 및 환원 조건 하에서 10 % acrylamide gel을 사용하여 불연속적인 SDS-PAGE로 분석하였다. Prestained 10-245 kDa 표준물질(PM007-0500, Genedirx™)을 사용하였다. commassie blue 용액으로 염색된 아크릴아마이드 젤의 사진을 LAS-3000 머신의 DIA 프로그램(Fujifilm™, Boston, MA.)으로 촬영하였다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> A Monoclonal antibody against Pulmonary Alveolar Macrophages of Gnotobiotic Miniature Swine and use of the same <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 862 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 1 Val Leu Ser Val Cys Val Leu Thr Thr Ile Leu Gly Cys Ile Phe Gly 1 5 10 15 Leu Lys Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val Lys Ser Cys Lys Gly Arg Cys 20 25 30 Phe Glu Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg Cys Asp Val Ala Cys Val Asp 35 40 45 Leu Gly Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln Glu Thr Cys Ile Ala Pro Glu 50 55 60 Arg Ile Trp Thr Cys Ser Lys Phe Arg Cys Gly Glu Lys Arg Leu Ser 65 70 75 80 Arg Ser Leu Cys Ser Cys Ser Asp Asp Cys Arg Asp Lys Gly Asp Cys 85 90 95 Cys Ile Asn Tyr Ser Ser Val Cys Arg Gly Glu Lys Ser Trp Val Glu 100 105 110 Glu Thr Cys Glu Ser Ile Ser Glu Pro Gln Cys Pro Thr Gly Phe Glu 115 120 125 Lys Pro Pro Val Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr 130 135 140 Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys Leu Lys Thr 145 150 155 160 Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr Pro Thr Lys Thr 165 170 175 Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His 180 185 190 Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met Asn Ala Asn Phe 195 200 205 Ala Leu Lys Thr Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp Tyr Lys Gly Glu 210 215 220 Pro Ile Trp Leu Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Met Lys Ser Gly Thr Phe 225 230 235 240 Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Lys Ile Asn Gly Ile Leu Pro Asp Leu 245 250 255 Tyr Lys Ile Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg Ile Leu Ala 260 265 270 Val Leu Lys Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg Pro His Phe Tyr 275 280 285 Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser Tyr Gly Pro 290 295 300 Val Ser Ser Glu Val Ile Arg Ala Leu Gln Arg Val Asp Asp Met Val 305 310 315 320 Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu His Arg Cys Leu 325 330 335 Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly Ser Cys Lys 340 345 350 Lys Tyr Val Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Ile Lys Asn Val Lys 355 360 365 Val Val Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser Asp Val Pro Asp 370 375 380 Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Lys Asn Leu Ser Cys 385 390 395 400 Gln Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys His Phe Leu Pro 405 410 415 Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu Pro Leu Thr Phe 420 425 430 Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro Ser Glu Arg Lys 435 440 445 Tyr Cys Gly Gly Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Ala Phe Ser Asn Met 450 455 460 Gln Ala Leu Phe Ile Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys His Ser Ile Glu 465 470 475 480 Val Asp Pro Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met Cys Asp Leu 485 490 495 Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly Ser Leu Asn 500 505 510 His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His Pro Lys Glu Val 515 520 525 Arg Ser Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg Ala Pro Gln Glu Asn Leu 530 535 540 Asp Cys Ser Cys Asp Pro Ser Ile Leu Pro Ile Val Asp Phe Gln Thr 545 550 555 560 Gln Leu Asn Leu Thr Met Ala Glu Glu Lys Val Ile Lys Arg Gly Thr 565 570 575 Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Asn Ser Thr Val Cys 580 585 590 Leu Leu Tyr Gln His Gln Phe Val Ser Gly Tyr Ser His Asp Leu Leu 595 600 605 Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn Asp Ser Phe Ser 610 615 620 Ala Glu Asp Phe Ser Xaa Cys Leu Tyr Gln Asp Leu Arg Ile Pro Leu 625 630 635 640 Ser Pro Ile His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn Ala Lys Leu Ser 645 650 655 Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Phe Glu Lys Thr Gln Val Arg Arg 660 665 670 Lys His Gln Gly Ser Gln Glu Gly Glu Leu Asn Lys Gly Ser Ser Gln 675 680 685 Val Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Met Val Pro Met Tyr Gln 690 695 700 Ser Phe Gln Val Ile Trp His Tyr Leu His Gly Thr Leu Leu Gln Arg 705 710 715 720 Tyr Ala Glu Glu Arg Asn Gly Ile Asn Val Val Ser Gly Pro Val Phe 725 730 735 Asp Ser Asp Tyr Asp Gly Arg Tyr Asp Ser Leu Glu Thr Leu Lys Gln 740 745 750 Asn Ser Arg Thr Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro Thr His Phe 755 760 765 Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asn Thr Ser Gln Ile Pro Ser Gln 770 775 780 Cys Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His Arg Thr Asp 785 790 795 800 Asn Ser Glu Ser Cys Ala His Gly Lys His Glu Ser Ser Trp Val Glu 805 810 815 Glu Leu Leu Arg Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val Glu His Ile 820 825 830 Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Glu Arg Lys Glu Pro Ile Ser Asp Ile 835 840 845 Leu Lys Leu Lys Thr Gln Leu Pro Pro Phe Asn Gln Glu Asp 850 855 860

Claims (8)

1. 항원 단백질 ENPP1(Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1)에 대하여 반응하고, 무균미니돼지 대식세포에 특이적으로 반응하는 단일클론항체.
2. 제1항에 있어서, 상기 항원 단백질 ENPP1은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 단일클론항체.
3. 제1항에 있어서, 상기 항원 단백질은 130kDa의 다이머 분자인 것을 특징으로 하는 단일클론항체.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는 대식세포 검출용 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 대식세포는 무균미니돼지 대식세포인 것을 특징으로 하는 대식세포 검출용 조성물.
6. a)돼지 조직으로부터 세포를 분리하는 단계;및
   b) 상기 세포에 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단일클론 항체를 처리하는 단계를 포함하는 돼지 조직 유래 세포로부터 대식세포를 검출하는 방법.
7. a)돼지 기관지폐포세척액으로부터 폐포 대식세포(PAM)을 제조하는 단계;
   b)상기 폐포대식세포로 마우스를 면역화하는 단계;
   c) 상기 면역화된 마우스로부터 얻은 지라 세포들을 쥐 골수(murine myeloma) 세포와 융합하고, 항 대식세포 항체를 생산하는 하이브리도마를 PAM에 대한 반응성에 대해서 에세이하여 얻는 단계;및
   d)상기 항 대식세포 항체들을 생성하는 하이브리도마를 클론화하여 그 선택된 클론들을 증식하는 단계를 포함하는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단일클론 항체를 생산하는 방법.
8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단일클론 항체를 골수세포 계통 분화의 개체발생에 사용하는 방법.

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