KR20140128257A - 표적 단백질 스크리닝을 위한 수용성 수용체 라이브러리 및 이를 이용한 표적 단백질 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 시그널펩타이드 서열, IgG Fc 도메인 서열 및 자연형 수용체의 세포외 영역 서열을 포함하여 이루어지는 표적 단백질 동정을 위한 수용성 수용체 라이브러리에 관한 것이다. 본 발명에 따른 수용성 수용체 라이브러리는 표적 단백질과 높은 결합력으로 결합이 이루어져 표적 단백질을 스크리닝 할 수 있는바, 암 및 면역과 같은 난치성질환에서 중요한 단백질-단백질 결합을 통해 이루어지는 세포외 시그널을 규명할 수 있을 뿐만 아니라, 이를 통해 항체 및 융합단백질의 치료용 타겟 및 그 질환의 바이오마커를 개발할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 어떤 단백질의 기능은 그 단백질이 결합하는 단백질의 기능에 따라 결정이 될 수 있기 때문에 새로운 기능을 발견하는데도 매우 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

표적 단백질 스크리닝을 위한 수용성 수용체 라이브러리 및 이를 이용한 표적 단백질 스크리닝 방법{SOLUBLE RECEPTOR LIBRARY FOR SCREENING TARGET PROTEIN AND SECREENING METHOD BY USING THEM}

본 발명은 표적 단백질 스크리닝을 위한 수용성 수용체 라이브러리 및 이를 이용한 표적 단백질 스크리닝 방법에 관한 것이다.

21세기에 들어서며 인간을 포함한 다수의 생물에 대한 게놈해독이 완료됨에 따라 축적된 방대한 양의 DNA 배열정보를 인류의 건강과 생활수준 향상을 위해 어떻게 결부시키느냐가 주요과제로 대두되었다. 특히, 단백질의 기능을 밝히는 단백질 유전 정보학 연구가 중요하게 인식되고 있으며, 이로 인해 단백체 연구의 한 부분으로 수용체 연구에 대한 관심이 점차 증대되고 있다.

모든 세포의 표면에 발현되어 있는 수용체는 특이적인 기능을 가지고 있으며, 이 수용체의 기능은 세포의 특이적 기능과 높은 상관관계를 가지고 있다. 하지만 수용체의 기능은 일부분만 알려져 있다. 이러한 세포 표면에 존재하는 수용체는 외부로부터 오는 신호를 감지하는 역할을 하는 동시에 받아들인 이들 신호들을 2차 전달자 형태로 증폭시켜, 대사, 분비, 방출 및 세포 성장과 같은 세포의 활동을 가능하게 해주는 역할을 한다. 수용체는 세포외 부분에 특정 리간드가 결합하면 리간드와의 상호작용으로 세포 내 부분에서 변형이 유도되고, 신호전달의 개시로 다양한 세포의 기능을 수행하게 된다.

최근에는 전 세계적으로 경쟁이 심화되고 있는 신약개발과 함께 신약개발의 실패에 따른 막대한 손실을 줄이기 위해 신약표적에 관한 고품질의 정보를 얻을 수 있는 새로운 도구의 필요성이 증대되었다. 미국의 경우 전문기술 기반의 바이오테크 기업을 중심으로 신약 표적단백질 탐색이 활발히 진행되어 방대한 정보축적과 요소기술이 발전하고 있고, 바이오테크 기업의 가치 증가에 따라 대형 제약사와의 제휴도 급증하고 있는 추세이다. 그 중 다양한 신약표적 및 신약개발 기술 중 단백질-단백질 결합을 기반으로 한 단백질 상호작용 분석은 표적 단백질 발굴을 위한 유전자 기능분석 방법 중 가장 효용성이 높은 방법으로 기대되고 있다. 생체 내에서 단백질은 다른 단백질과의 결합을 통해 기능을 나타내고, 유전자 및 단백질 발현의 변화, 세포내 위치의 변화, 번역 후 수식을 통한 구조의 변화는 단백질 결합의 변화를 유도하므로 궁극적으로 세포 내에서 일어나는 대사 및 신호전달과정의 활성, 제어의 변화를 초래하고, 유전자 변이에 의한 단백질 상호작용의 이상은 질병과 직결되어 있다. 그러므로 단백질 상호작용에 대한 규명 및 이를 기반으로 신호전달 경로에 대한 총괄적 지도는 질병과 관련된 표적단백질 발굴 및 신약개발을 가속화시킬 잠재력을 가지고 있다.

상기에서 기재한 바와 같이, 단백질 중에서 세포외에 존재하는 단백질들은 직접 또는 간접적으로 세포 표면의 수용체를 통해서 신호전달이 이루어지기 때문에, 이들 단백질의 정확한 역할규명을 위해서는 각 단백질의 수용체의 동정이 필수적임에도 불구하고, 해당 연구가 아직 미비한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명자들은 자연형 수용성 막 단백질의 새로운 세포 조절 유전자를 발굴하기 위하여 세포 수용체에 대해 연구하던 중, 다양한 세포 수용체의 세포외 영역(extracellular domain)을 포함하는 혼성화 단백질을 준비하였으며, 상기 혼성화 단백질은 N-말단에 자연형 세포 수용체의 세포외 영역 서열 및 C-말단에 인간 IgG의 Fc 영역을 포함하는 단백질로, 각각의 영역을 암호화하는 핵산 서열을 단일 프로모터 하단에 클로닝하여 완성된 것으로, 이를 수용성 수용체라고 명명하였다. 상기 수용성 수용체 라이브러리로부터 기존에 알려진 VEGF 또는 myostatin 등의 단백질이 수용성 수용체 라이브러리에 결합하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 시그널펩타이드 서열, IgG Fc 도메인 서열 및 자연형 수용체의 세포외 영역 서열을 포함하여 이루어지는 표적 단백질 동정을 위한 수용성 수용체 라이브러리를 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 수용성 수용체 라이브러리의 서열 구조는 제한효소 인식 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 제한효소 인식 서열은 Sfi I 제한효소 인식 서열인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 시그널펩타이드 서열은 MGWSYIILFLVATATDVHS인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 IgG Fc 도메인 서열은 PKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은,

(a) 상기 수용성 수용체 라이브러리를 표적 단백질에 처리하는 단계; 및

(b) 상기 수용성 수용체 라이브러리 중 상기 표적 단백질에 대한 결합력이 높은 수용성 수용체를 선별하는 단계를 포함하는 표적 단백질의 스크리닝 방법을 제공한다.

더욱이, 본 발명은 상기 방법에 의해 스크리닝된 표적 단백질에 높은 결합력을 갖는 수용성 수용체를 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 수용성 수용체는 VEGF에 높은 결합력을 갖는 FLT1(서열번호 1) 또는 KDR(서열번호 2)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 수용성 수용체는 마이오스타틴(myostatin)에 높은 결합력을 갖는 ACVR2B(서열번호 3)인 것을 특징으로 한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 수용성 수용체에 대응하는 자연형 수용체에 결합된 리간드를 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 리간드는 항체 또는 약제인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 수용성 수용체 라이브러리는 표적 단백질과 높은 결합력으로 결합이 이루어져 표적 단백질을 스크리닝 할 수 있는바, 암 및 면역과 같은 난치성질환에서 중요한 단백질-단백질 결합을 통해 이루어지는 세포외 시그널을 규명할 수 있을 뿐만 아니라, 이를 통해 항체 및 융합단백질의 치료용 타겟 및 그 질환의 바이오마커를 개발할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 어떤 단백질의 기능은 그 단백질이 결합하는 단백질의 기능에 따라 결정이 될 수 있기 때문에 새로운 기능을 발견하는데도 매우 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명에 따른 수용성 수용체 발현을 위해 사용된 발현벡터(pYK602-Fc)를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 수용성 수용체의 발현 정도를 확인하기 위한 웨스턴 블롯팅 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 수용성 수용체의 purity를 보기 위해 SDS-PAGE에 loading하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명에 따른 수용성 수용체와 VEGF의 결합력을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명에 따른 수용성 수용체와 마이오스타틴(myostatin)의 결합력을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 시그널펩타이드 서열, IgG Fc 도메인 서열 및 자연형 수용체의 세포외 영역 서열을 포함하여 이루어지는 표적 단백질 동정을 위한 수용성 수용체 라이브러리를 제공한다. 상기 수용성 수용체 라이브러리의 서열 구조는 제한효소 인식 서열을 추가적으로 포함할 수 있으며, 이러한 제한효소 인식 서열로는 Sfi I 제한효소 인식 서열을 포함하는 것이 바람직하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 수용성 수용체 라이브러리에 사용된 시그널펩타이드 서열은 MGWSYIILFLVATATDVHS이며, IgG Fc 도메인 서열은 PKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK이다.

또한, 본 발명은,

(a) 상기 수용성 수용체 라이브러리를 표적 단백질에 처리하는 단계; 및

(b) 상기 수용성 수용체 라이브러리 중 상기 표적 단백질에 대한 결합력이 높은 수용성 수용체를 선별하는 단계를 포함하는 표적 단백질의 스크리닝 방법을 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 방법에 의해 스크리닝된 표적 단백질에 높은 결합력을 갖는 수용성 수용체를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 따르면, pYK602-Fc 발현벡터를 이용하여 수용성 수용체를 제조하고(실시예 1), 이를 세포에 감염시켜 회수한 세포 배양액을 웨스턴 블롯팅 분석을 하여 상기 수용성 수용체가 분명하게 발현됨을 확인하였다(실시예 2 참조).

또한, 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명의 수용성 수용체와 표적 단백질과의 결합력을 확인하여, VEGF는 FLT1(서열번호 1), KDR(서열번호 2)과 결합력이 높고, myostatin은 ACVR2B(서열번호 3)와 결합력이 높다는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).

본 발명에 따른 수용성 수용체 라이브러리는 표적 단백질과 높은 결합력으로 결합이 이루어져 표적 단백질을 스크리닝 할 수 있는바, 암 및 면역과 같은 난치성질환에서 중요한 단백질-단백질 결합을 통해 이루어지는 세포외 시그널을 규명할 수 있을 뿐만 아니라, 이를 통해 항체 및 융합단백질의 치료용 타겟 및 그 질환의 바이오마커를 개발할 수 있다.

이에, 본 발명은 상기 수용성 수용체에 대응하는 자연형 수용체에 결합된 리간드를 제공하며, 상기 리간드는 항체 또는 약제를 포함하나, 이에 한정되지 않고 자연형 수용체와 상호작용하는 물질이면 모두 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 수용성 수용체 라이브러리의 제조

수용성 수용체에 의한 세포 신호전달의 교란 및 이에 의한 세포 표현형질의 변화 유도를 통하여 자연형 세포막 수용체의 기능을 발굴하기에 유용한 도구로 사용하기 위하여, 수용성 수용체의 라이브러리를 제조하였다. 보다 구체적으로, cDNA library mix (kidney, placenta, pancrease, liver)를 주형으로 하여 여러 유전자들의 extracellular domain을 확보하기 위해 적절한 primer를 디자인하여 폴리머라아제 연쇄 중합반응을 통해 증폭된 산물을 얻은 후, 우리가 보유한 mammalian 발현 벡터인 pYK602-Fc vector에 삽입하기위해, 제한효소 SfiI 으로 자르고, agarose gel에 loading을 한 후, gel purification kit를 이용하여 벡터에 삽입할 insert를 확보하였다. 그리고 나서, T4 DNA ligase를 이용하여 ligation을 수행하였고 ligates를 E. coli cell에 형질전환을 시켰다. Sequencing을 통해 pYK602-Fc발현 vector에 올바르게 삽입된 clone을 확보하여, midi prep을 수행하여 해당 발현벡터 (플라스미드)를 추출하였고, 상기 수용성 수용체 발현을 위해 사용된 발현벡터 (pYK602-Fc)의 모식도는 도 1에 나타내었다.

본 실험에서 사용된 프라이머들은 표 1에 나타내었고, 상기 방법으로 제조된 수용성 수용체는 약 300여 종이며, pYK602-Fc발현 vector에서 클론된 수용성 수용체의 종류를 하기 표 2 내지 표 4에 나타내었다.

NAME	Forward (5'--> 3')	Reverse (5'--> 3')
FGFR1	AGGCCGTCCCCGACCTTGCC	CCTCTCTTCCAGGGCTTCCA
FGFR2	CGGCCCTCCTTCAGTTTAGT	CTCCTTTTCTCTTCCAGGCG
FGFR4	TCTGAGGAAGTGGAGCTTGA	TGTGGGGTCCTCCTCTGGCA
FLT3	AATCAAGATCTGCCTGTGAT	AAATCCCTTTCCTACGATGG
CSF1R	ATCCCAGTGATAGAGCCCAG	TCGAAGGGTGAGCTCAAACG
PDGFRA	CAGCTTTCATTACCCTCTAT	AGTTGAGCCATGGTGATCAT
PDGFRB	CTGGTCGTCACACCCCCGGG	ACTGTCAGGGTGGCTCTCAC
FLT1	GAGGGAGTCCACAGAAAACC	GTGTCTGGGGTTACCGGTTT
FLT4	GCCCAAGAGGTGCAGCAGTC	GTCAGGGAGGGCAGAGGCTG
AXL	AGCCAGTTCCGGGTGTCGCC	ATCACAGGCGAAGTCCAGCC
MERTK	CTCCAGCAGACCCCTGCATA	GGGGCTACAAAGTGGGCCCT
TYRO3	AACAAGATTTTGGTGAAGCA	CTTAGAAGGTCCGGGAAATA
NTRK1	CAGCTACTATTTAATAAAAC	AACAACACGATATTTTAGCT
NTRK2	AAGCTCACTATTGAATCCAT	TGGGGCATTTTCTTGGTATA
NTRK3	GCCAGATCGGAGGACCGGTA	ATCCTTCAGCGTGTTCCTCT
EPHA2	ACGCCGGAGGTGAAGGTGGC	CTCCGCTCTGTATTTCTTAA
EPHA3	CAGAAGGTGACCAGCCTAAC	TTTGTCTCTGAGCACTGTGA
EPHA7	AAAGCAATGCACGTGGCCCA	GTCAGAATCTGGGCACGGTT
EPHA8	CAGCCGGTGCTGCATCAGCC	AGGGACACGTGTCCTGGCTG
EPHB1	GGCCTGCTGCGCCCAACAGC	TGAACATTCTGCAGGGGCCA
EPHB3	GAAATCAATGGTTCTGCCAA	CTTCAGCTGGCAACAAAGTT
EPHB4	ACTCTCTCTGTCACACAACC	TTCCTTGCTGAGCAGCTTAA
ERBB2	GCAACTAAATTAACTGAGGA	CCTGATGATATCTGTCACAT
ERBB3	CACAACACCACAGTGTTCCA	GGAAGTGGGTGGGAAGGGGA
ERBB4	AATGCAGACGGGCTCAAGGA	ATGCTCCCAGTAGAGGACGA
IGF1R	AGTGAACATGCCTTCCAGGG	GGAGGTGGGGTTTCTCCAGT
DDR1	AATGCAGACGCATCCCAGGA	CATGGAAGAGTGGTGTCCCC
DDR2	GTCCCGCAAAGGCTTTTCCC	GGTGTAGCTCCCACCCCAGT
MET	AAAGAGATTACGAATGCCTT	GTCCAGACCTTTCTCTGGAC
ROR1	CCAAATTTCTGGCTGCAAGT	TCTGGTCTCTTGTTTCCCTG
PTK7	GTTATCCACGTGACCAAGGA	ATCAGGAAAATGCTCTTGCT
ROBO1	GCTCCTCTGAAGATTCAAGC	CTCTATAGAGAAAGGTGAAG
ROBO2	GCAAGCTACGGAACAGGTGG	TTCTGAGGGGTCTGTCCTGC
ROBO3	CAAGTGCAAGTGGTGACCCA	TTTGTTGACGGTTTGCTTAA
ROBO4	ATCTCTGTGGAAACTCCGCA	TCTGACGGCCACCGTGATGT
AGER	CAGCTCACTATTGAAGCTGT	TCCTTGTACTAAAGCATCAG
DLK1	AAGCTCACTATTGAATCCAC	CGTGACTGTGGTCCTATTGA
DLK2	CCAGGCGTCCACTCCCAGGT	TTCTGTGATATTGACCTCCA
DLL3	GATGTGCGAGTTCAAGTGCT	GGTTTCTCGGACAAAGATGA
DLL4	TGGCCACCCCCAGGAACCGG	TCCCTCTTTGACCTGGACGG
ACVR1	GAGGAGGAGCTGCAGGTGAT	GACCTTCAGGTCATGGCTTT
BMPR1A	AAGAGTAACCGGAAGGATTA	GGAGAGGTTCAGGGAAACGT
BMPR1B	AAGAAAGTGGTGCTGGGCAA	TTCCAGCAGGACCTGTCCCG
TGFBR1	CAGCTCACTACTGAATCCAT	AGCATTATAGTTTACGTTCA
ACVR1C	CAAGTCACGATTGAAGCCGA	GGATTTGGAGCTTTCCTTGC
ACVR2A	GAGAAGCCAGTGTACGAGCT	TCCTGTCCCGAGGTTCGATC
ACVR2B	GTGGTGTGGGCCCAGGAGGG	CACTGCTGCTCCAAGAAGCC
BMPR2	TTGAGTATCACTACTCCTGA	GTTTAGACGCAACAGGCACT
TGFBR2	CACGTGGGTGGTCAGGACAA	ATGCAGGTGTCTGGCGATAC
EFNA1	GAGGGAGTCCACAGAAAACC	GTGTCTGGGGTTACCGGTTT
EFNA3	CATGAGGGAGTCCACAGAAA	TCTGGGGTTACCGGTTTTGG
EFNA4	CTGGAGGCTGATAAATGCAA	CTTCTGGAAATTAGTGACTG
EFNA5	TTCACCCTTCAGCCTGCGGC	TAGTGTCTGAAAACTCAGGG
EFNB1	GAAAATGAGGCTTTAATTGT	TGGATTTTTCCTACTTAGTC
EFNB2	GATGGATGCAAGGACATTTT	TCGAAAATCCGGAGCTGGGA
GFRA3	GAATCTTGTACTTCACGTCC	ATCAGCCATGTCTGCTTTTC
NRP1	AGGCCGTCCCCGACCTTGCC	CCTCTCTTCCAGGGCTTCCA
NRP2	CGGCCCTCCTTCAGTTTAGT	CTCCTTTTCTCTTCCAGGCG
FGFRL1	GAGTCCTTGGGGACGGAGCA	CTCCACCAGCTCCTCCTCGG
PDGFRL	TCTGAGGAAGTGGAGCTTGA	TGTGGGGTCCTCCTCTGGCA
KDR	CCCGAGGAACCTCTAGTGGT	CCAGTGCCATAGTACTGGCC
TIE1	CCCAAGCCCACCCTCTGGGC	TGAGACCACGAGCTCCAGGG
TEK	CAGGAGTTCCTTTTGCGGGT	GTTCCTGTGCAAGAACTCGC
RET	CAGACATCTGTGTCCCCCTC	CCGGGTCTGGTTCTTGTGTA
GFRA1	GGCTCTTCTCAACCATCTGT	TTCTGGTTTTGTATTCACAT
GFRA2	AATCAAGATCTGCCTGTGAT	AAATCCCTTTCCTACGATGG
AMHR2	ATCCCAGTGATAGAGCCCAG	TCGAAGGGTGAGCTCAAACG
OSMR	CAGCTTTCATTACCCTCTAT	AGTTGAGCCATGGTGATCAT
IL1R1	CTGGTCGTCACACCCCCGGG	ACTGTCAGGGTGGCTCTCAC
IL1R2	CAAGAAAACTCTTTCACAAT	TTCTGTTATGTTGACCACGA
IL1RL2	AGAGAAGTAACAGTTCAGAA	CTTTCTCTGAAGCACCTGCC
IL18RAP	TTTAAAATCGAGACCACCCC	GAGCTCCACCTGGATTCCCT
IL2RG	TCAAAATTAAAAGATCCTGA	GATGAATGCTTTATCATATA
IL21R	GCCTCTGTGGGTTTGCCTAG	TTTTTCATGGACCCTGACAA
PRLR	TACTCCATGACCCCCCCGAC	ATTTTCATGCACAATGACCT
CSF2RA	GAAGAAAGTCCCTTCGTGGG	CCAGGCCTCCAGGGGTACTG
IFNGR2	GCAAGGGAAGAAGCCAAGCC	TGATGGGGCTCCTTCAGTCG
IL20RB	GCAGGTCTGAAGCTCATGGG	TGCACGGTCATGAGAAGAGA
IL22R2	GAGATGGGCACCGCGGATCT	ACCTTTTATACTGCTATTGA
IL28RA	CAGGACTCCCCGCCCCAGAT	AAGGAGGCAGACAGGTCTAC
IL17RA	CGTCAGGAAGATTTTCCACC	AATCACATCTGTAACTTCCA
IL17RB	TGCCCTGCAAATTGTGTCTG	AAAGGGCTCCTTGAGGAAGT
TNFRSF1B	GCGCCCCCGCCTAACCTCCC	GGGGTCCAGGTCGCTAGGCG
CD27	GCGGTGAATGGCACTTCCCA	GGTGTCCTTCCCAAGGGCTG
TNFRSF11A	CTGAACACGACAATTCTGAC	ATTCTCTTTTGAAGTATTGC
TNFRSF19L	ATGAAGGTCTTGCAGGAGCC	CCTGTAGGAGTTGTGCCACT
IFNGR1	GAAAGTGGCTATGCTCAAAA	CTCTGGAGTTCTGAAGTAAT
IFNGR2	TCTGTCACAGGGGAAGGACA	TCTCTGGGGAGCCTGGAAGC
IL10RA	TTTTCTGGAAGTGAGGCCAC	GTAGAAATCTTCTTCACATG
IL10RB	ATTTCATATGATTCGCCTGA	TTTGGCAGATTCTGCTGATT
CD40	CAGTTACCTCCTGGAAAACC	ATCATTCATGGTGAAGTCAC
TNFRSF9	TCCCAGCTGCCCGCTCCTCA	TTGCTGAAGCTCAGTGGAGG
EPHB4	CATGGGACAGAGCTGCCCAG	CCTGGTGAGGGAGATGCACT
IGF1R	ATGGTACCACCTCCCGAAAA	TTCGTCATGGGTTGTTTGCT
ROBO1	GAGAAATCGGATCTGCGAAC	CCCGTCGTCAGAACCAAATT
NRP2	ACGAAGGAAGATCCAAACCC	CCGCCAGGCACGTGTGTTTG
ACVRL1	GACTTACTTCCTGATGAAAA	CTTGTGTTCATCATTTCCCA
IL1RL1	GGCGCCGCGCCTACGGAAAC	GCGCTTCTTACCTATACTCA
IL7R	GACACCGAGATAAAAGTTAA	TTTCTTCGATAGGTCTTCAC
IFNAR2	CTGGCCCCAAGGCGCTGCCC	ATCTTGCACTGGGAGGCTTG
IL3RA	TCCTCCCCCTGCCCCCAGGC	CCTTTGGTATGGTCCCAGTG
IL13RA1	CAGAGACACAGTCCACAGGA	GCCCAGCTCCCCAGGGTCAC
IL13RA2	GGAATTACAAATATAAACTG	GTCATGTTGGAATGCTTTTG
CSF3R	CAAGATGTCTCCTTGCTGGC	CTCGGTGGCGGTCTCCACCC
IL2RA	AAAAATCTAAAATCTCCTCA	TTTAGAGGTATTTCCTGGTT
IL18R1	GGGCCACTGCAGTGCTACGG	TGCTAATTCCTCCCTGAACC
IL1RAPL2	AGAACCAGTGAGTGCTGTTT	TTCGATGCTGAAGCGCTGGG
IL17RD	GAGTGCGGGCACATCAGTGT	TGTGTCCAGTCTGACAGTGG
SIGIRR	GAACTTCTAGATCCATGTGG	TCTATCTTCATAGGTGATCC
CD95	GCAAAAATAGATGCGTGCAA	CTCTTCTTCTGGTGTTTGTG
TNFRSF14	GTGGACCTGACGCTGCTGGC	CTTGAAGCGCCGGCTGTCTT
NGFR	GCCATGGACTTGATCTTGAT	AAGAACTTTAACAGAAATGT
TNFRSF11B	CAGAAAAAGGGGGCTCCTCA	AACTTTTTCAGTTATATTAA
TNFRSF4	TTTAACTTGTCATATCCAAT	ATCAATCACATATAATTCAG
TNFRSF12A	AAGGAAGTTACTCTGATGGA	ACCTGTGCATGCCACCTGGG
TNFRSF13B	AAGGAAGTGGTACTGCTGGA	TCGTGTGCAAGGCATCGACG
TNFRSF17	GAACTGATTCCGCAGCCTTC	TCGGGTACAAGCCATGGATG
TNFRSF18	GTCACAGGTTCCAGGGTATA	ACGGGTGCAGGGCATAGAGG
TNFRSF21	CGGACCCTCCTGGCCAGCCC	TCTTGTGCATGCCATTGTGG
TNFRSF6B	CAGGCTGCGAAGGAAGTACT	CCTTGTGCATGCAACGTATG
TNFRSF10A	GAAGTGAATTTGCTGGACAC	CCGGGTGCAGGCTGAGGACG
TNFRSF10B	ATGGAAGAAACGTTAATGGA	GACGCTAGTGCATGCCACTT
CSF2RB	GTGGAAGAAACGCTAATGGA	GATGGTTGTGCAGGGCATGT
TNFRSF10D	GGCTGCCGGGCGCTGGAAGA	CACGGTGGTACAGGCACTGT
TNFRSF3	AACACAAAATTGGAAACTGC	GGTGGTGCAGGGTGCACCCC
EDAR	GAAGAGGTATTGCTGGACAC	ACCAGTGCAGGGGGCCTCTG
IL27RA	TGGGACGAGGTGAGTGTTCT	GGAGAGTCTTTCCGGAAGCT
IL1RAPL1	CTGGAGGAAAAGAAAGTTTG	TTTGAAGTGTTTAATATTCG
VASN	ACCCAAGTGTGCACCGGCAC	AGCAAACTCCTGGATATTGG
SLITRK1	TCCGAGGTGGGCAACTCTCA	CACAAATCCATCAATGTTGC
SLITRK4	TGCCACGTGCTCAAGAAGAA	CATACTCCCTGCTCCCTGTG
LRRC25	TCGGAGGTGCCCGGGGCTGC	GTCTGTCCAGCCCCACGATT
LRRC19	GACCCTCCCCAGGAGAAGGT	GGGGTTGCCAAAGAGGTTGA
RTN4R	AGCAGGGCAGCAGACACTAT	GGGCTTGGTGGTGAAGGCGG
BGN	AAGAGGCGTCCTGCCAAGGC	CACCTGTGGGAGTGCCCCAG
DCN	CTGAGCCCCCAGCCCGGAGC	GGGGGACAGGTTGTTCTGAA
LUM	AAACCCGGAGACCAAATCCT	TTTCTTCTCAGCTGCACTGT
OMD	GATGAGGCTTCTGGGATAGG	CTTATAGTTTCCGAGTTGAA
CHAD	GAGAAGACTGGCGTGTGCCC	GAAATTGGGAGTGACACAGG
CD14	GGGAAAGCCTGGCCCACACA	GGAGCACATGATAGTAGCAT
LINGO2	AGACAAACTCCCACACAGCA	TAGTAAGAAGGCTCCAAAGA
FLRT1	CAGTTTTCTGTGCTTGGACC	GGGGTCTGCGATGGATATGC
FLRT2	CTTCAAGTGACAATTTCACT	ATCAAGGTACATGCTCTTTT
FLRT3	GAAAGCTGGGAGCCCTGCGT	AGCAGATTTGTCAAACTTTT
LRFN5	TCCACCACCAAGTGCACTGT	CCGTTTCAAATTCAGGTACC
LRRN3	AATGAATTTGCAGTAGACAA	GAGATATTCCACAGGTTTGG
CD290	GCTAGATGGTTTCCTAAAAC	CGCATCAAAAGCATTTACAG
GPR124	CTGGGTACCTTGCCTGCCTT	GTGGCTGAAGGTATCGGGAT
GPR125	GATGCTCCAGAGCTGCCAGA	GTCAAATGAATTGTGGTCAA
CD93	TACACCACAATGGCTGAGCA	ATTAGTTCGGATGTCATACA
IGFBP7	GGCAAGGGGGTAGCTATCCG	GAGCTGGAGCTTAACACTGA
SFRP1	TACAGAGCAAAGGTGGAAAA	CACATGCATCATGATTTCTT
CD70	TACACGGACAAGATTGACAG	GTTCTCCTGAAGCCACACCT
TNFSF15	GTTTTCAAAGACTGGATCAA	ATTGTCCTGCAACCACTTCT
IL1RN	AGACATGAGATTAAGAACAG	TTCTGACTCTATAATGGTCA
PRNP	CGTCATGAGATCAAGGACAC	CATGTTAGTCTCCATGAAAC
SPN	AAATCTAAGTCTGATCGCAT	ATTTTTTGCCAAGAAGTCTT
ULBP2	TACATGGACAAGGTGAACGA	GTGCTTATTGTCATCGAACC
CD28	CCGCTGCAAGACAGCCTGGA	GTTCGCGCGCAGCCACCGCC
CTLA-4	GGCGTTTGGACATATGAACA	CCTCAGCACCTGCAGTTGTT
CD80	TGCGCTTGTTTAGCCCTGAA	TCTCAAAACCTCTCCAGCAT
TREM1	CTGTTCCAGGACTGGGTGAG	GTTCCGCGGGAGCCAGCTTT
SLAMF1	ACCTTCCGGAACCAGACCAT	CGCCATGATGGTGTAGTTGT
CD244	GTCTTCAAGGACTGGATTCG	GTTGTCCTGCAGCCACTTCT
SLAMF6	GCCTTCATCTTCAGGGAAAA	TCCGGCCAAGTAGACGTAGG
SLAMF7	ACAGCAGCAACACAACGAGA	GTGTCGGTTCATTGGACCAG
CD7	CCTGGGAGTCTGGATGAGGC	GTCCTGCAAGTGCTCCAGCA
CD8A	GCCTACTACCAGCAGCTGAA	GACCCTCAGGTGCTCCTGGA
CD79B	GAACAGAAGCTGAATGAGTA	ATTGGAATGAAACCACAGTC
CD83	CGGGCCCAGCTGGAGCGAAG	GTTGTTGTGCAGCCACTTCT
CD90	GGCAAGCTGAAGCAGGAGAT	CAGGTTCTCCTGCAGCCACG
GPA33	TTTGTCAACAAGGACCAGAT	CCCGGAGAAGAGGTCATCGA
BSG	TCCCACAAGGATGAGGTGAT	GATGTGGAATTTATTGTCGA
CD200	AGAGATAAGGTGATGTCAGA	CACATTTTTCCTCAGCCAGC
VCAM1	TGCTCATGTCTGGCTATTAA	TTTCAGGGCTTCGTCTGAAT
IL12RB2	GCTCTCTTAAAAGGTCCTCT	TAGACCTAAAAATACTGAGA
CEACAM3	AAGACAATTAAAAAGCAAGT	CTTCAGATTCTTTAATACTT
CEACAM7	CGCATCGACCCCAGTAGCCT	AGGCTCAATCTTCCCAGTTT
CEACAM8	GCCGCTGCTGCCGGCCTGCG	ACGCGTAGAAGTGGTTGGAG
CD22	GCGGGCGCCCCGAGGGCGGG	GGGGCCAGCGGGCGCGTCGT
CD2	GATCGCCACACCGTCTTCTG	GTGACCGATGCTATGTAGAA
CD58	CGCGCCGAGGACGCCGCCCG	GCTGGTGAAGATGGGCTCAG
CD19	CAAGGGCCCGGAGGGGCGCT	GCTGATGCTCTTCTCAAGCT
TNFRSF11A	CTCCGCCACGTAGTCTACTG	CTCTCCAGGGCTCCCAACAG

실시예 2. 수용성 수용체의 발현 정도 확인

실시예 1에서 제조한 수용성 수용체의 발현 정도를 확인하기 위하여, 하기와 같이 실험을 수행하였다.

즉, 세포막 수용체 (FGFR1)의 특정부위를 암호화하는 염기서열을 포함한 발현벡터를 HEK293 세포에 PEI(polyetherimide)를 이용하여 일시적으로 감염시켰다. 유전자 도입 후 약 2일 간격으로 세포 배양액을 회수하고 새 배양액으로 교환하였다. 이때, 유전자 도입의 효율은 약 70%이었다. 회수된 세포 배양액으로 분비되는 수용성 수용체의 발현 정도를 배양시간 별로 웨스턴 블롯팅 시험을 통해 확인하였다. 웨스턴 블롯 결과에 나타난 숫자는 감염 후 배양액을 회수한 날짜 (2일, 4일, 6일)를 나타낸다. 회수된 수용성 수용체의 발현이 확인된 조건 배양액들을 회수한 후,실험에 사용하기 전까지 -20℃에서 냉동 보관하였다.

본 발명의 수용성 수용체의 발현 정도를 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이, 수용성 수용체(FGFR1)가 회수된 배양액으로 분비 되어 명백하게 발현됨을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 수용성 수용체의 정제

실시예 1에서 제조된 수용성 수용체의 정제를 하기의 과정을 통해 실시하였다.

즉, 100 mm dish 20장에 cell confluence는 대략 80%이상 일 때 100 mm dish 1장당 13μg DNA : 26μg PEI ratio로 transient transfection을 수행하였다. Transfection 24 시간 후 serum free media로 갈아주고 2일, 5일, 7일째 되는 media를 얻은 후 0.22 μm top-filter를 사용하여 필터링한 후, 5 ml 컬럼에 패킹 되어 있는 500 μl의 protein A bead 에 결합시켰다다. Peri-start pump를 사용하여 0.9 ml/min 으로 4℃에서 오버나잇(overnight)으로 결합시킨 후, 100 ml 이상의 PBS (pH 7.4)로 컬럼을 wash하고, glycine elution buffer를 이용하여 6개 분획으로 나누어 용출하였다. 이후 수용성 수용체를 정량하고 발현이 있는 분획 2~3개를 모아 amicon ultra를 사용하여 농축한 후 PBS (pH 7.4)로 4번 정도 버퍼를 교환하였다. 수용성 수용체의 purity를 보기 위해 SDS-PAGE에 loading하여 확인한 결과는 도 3에 나타내었다.

실시예 4. 표면 수용성 수용체와 표적 단백질과의 결합력 확인

실시예 1에서 제조된 수용성 수용체가 표적 단백질과 결합하는지를 확인하기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.

4-1. VEGF ( Vascular endothelial growth factor )와의 결합력 확인

실시예 1에서 제조된 수용성 수용체와 VEGF의 결합력을 보기위해 ELISA를 진행하였다. 즉, 96 well immuno-plate에 VEGF를 well 당 100 ng 씩 4℃에서 16시간 정도 coating한 후, skim milk로 well을 blocking 하였다. well을 PBS/T (0.05%)로 washing 후, 수용성 수용체 라이브러리를 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. PBS/T로 3번 washing 후, 이차 항체인 anti-HuFc-HRP를 1:2000으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응하였다. PBS/T로 3번 washing 후 OPD tablet을 PC buffer에 넣어 기질 용액을 만들어 well당 100 μl씩 넣어 10분 동안 발색 시킨 다음 흡광도 490 nm에서 분광광도계(spectrophotometer)로 측정하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, VEGF는 FLT1, KDR과 결합력이 높은 것을 확인할 수 있었다.

4-2. 마이오스타틴 ( myostatin ) 단백질과의 결합력 확인

실시예 4-1과 동일한 방법으로 사용하여 실시예 1에서 제조된 수용성 수용체와 마이오스타틴(myostatin)과의 결합력을 확인하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 마이오스타틴(myostatin)은 ACVR2B와 결합력이 높은 것을 확인할 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> ANTIBODY AND RECEPTOR THERAPEUTICS CO.,LTD. PAICHAI UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC <120> SOLUBLE RECEPTOR LIBRARY FOR SCREENING TARGET PROTEIN AND SECREENING METHOD BY USING TEHM <130> PB14-12014 <150> 10-2013-0046860 <151> 2013-04-26 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 293 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Soluble Receptor binding to VEGF : FLT1 <400> 1 Gly Thr Gln His Ile Met Gln Ala Gly Gln Thr Leu His Leu Gln Cys 1 5 10 15 Arg Gly Glu Ala Ala His Lys Trp Ser Leu Pro Glu Met Val Ser Lys 20 25 30 Glu Ser Glu Arg Leu Ser Ile Thr Lys Ser Ala Cys Gly Arg Asn Gly 35 40 45 Lys Gln Phe Cys Ser Thr Leu Thr Leu Asn Thr Ala Gln Ala Asn His 50 55 60 Thr Gly Phe Tyr Ser Cys Lys Tyr Leu Ala Val Pro Thr Ser Lys Lys 65 70 75 80 Lys Glu Thr Glu Ser Ala Ile Tyr Ile Phe Ile Ser Asp Thr Gly Arg 85 90 95 Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr 100 105 110 Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile 115 120 125 Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly 130 135 140 Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala 145 150 155 160 Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly 165 170 175 His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile 180 185 190 Ile Asp Val Gln Ile Ser Thr Pro Arg Pro Val Lys Leu Leu Arg Gly 195 200 205 His Thr Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr Pro Leu Asn Thr Arg 210 215 220 Val Gln Met Thr Trp Ser Tyr Pro Asp Glu Lys Asn Lys Arg Ala Ser 225 230 235 240 Val Arg Arg Arg Ile Asp Gln Ser Asn Ser His Ala Asn Ile Phe Tyr 245 250 255 Ser Val Leu Thr Ile Asp Lys Met Gln Asn Lys Asp Lys Gly Leu Tyr 260 265 270 Thr Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys Ser Val Asn Thr Ser 275 280 285 Val His Ile Tyr Asp 290 <210> 2 <211> 720 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Soluble Receptor binding to VEGF : KDR <400> 2 Leu Pro Arg Leu Ser Ile Gln Lys Asp Ile Leu Thr Ile Lys Ala Asn 1 5 10 15 Thr Thr Leu Gln Ile Thr Cys Arg Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu 20 25 30 Trp Pro Asn Asn Gln Ser Gly Ser Glu Gln Arg Val Glu Val Thr Glu 35 40 45 Cys Ser Asp Gly Leu Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ile Pro Lys Val Ile 50 55 60 Gly Asn Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp Leu 65 70 75 80 Ala Ser Val Ile Tyr Val Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile 85 90 95 Ala Ser Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys 100 105 110 Asn Lys Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn 115 120 125 Val Ser Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly 130 135 140 Asn Arg Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr 145 150 155 160 Met Ile Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp 165 170 175 Glu Ser Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg 180 185 190 Ile Tyr Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val 195 200 205 Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val 210 215 220 Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys 225 230 235 240 Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys 245 250 255 Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln 260 265 270 Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn 275 280 285 Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser 290 295 300 Gly Met Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile 305 310 315 320 Pro Ala Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys 325 330 335 Asn Gly Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val 340 345 350 Leu Thr Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val 355 360 365 Ile Leu Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser 370 375 380 Leu Val Val Tyr Val Pro Pro Gln Ile Gly Glu Lys Ser Leu Ile Ser 385 390 395 400 Pro Val Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Thr Thr Gln Thr Leu Thr Cys Thr 405 410 415 Val Tyr Ala Ile Pro Pro Pro His His Ile His Trp Tyr Trp Gln Leu 420 425 430 Glu Glu Glu Cys Ala Asn Glu Pro Ser Gln Ala Val Ser Val Thr Asn 435 440 445 Pro Tyr Pro Cys Glu Glu Trp Arg Ser Val Glu Asp Phe Gln Gly Gly 450 455 460 Asn Lys Ile Glu Val Asn Lys Asn Gln Phe Ala Leu Ile Glu Gly Lys 465 470 475 480 Asn Lys Thr Val Ser Thr Leu Val Ile Gln Ala Ala Asn Val Ser Ala 485 490 495 Leu Tyr Lys Cys Glu Ala Val Asn Lys Val Gly Arg Gly Glu Arg Val 500 505 510 Ile Ser Phe His Val Thr Arg Gly Pro Glu Ile Thr Leu Gln Pro Asp 515 520 525 Met Gln Pro Thr Glu Gln Glu Ser Val Ser Leu Trp Cys Thr Ala Asp 530 535 540 Arg Ser Thr Phe Glu Asn Leu Thr Trp Tyr Lys Leu Gly Pro Gln Pro 545 550 555 560 Leu Pro Ile His Val Gly Glu Leu Pro Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu 565 570 575 Asp Thr Leu Trp Lys Leu Asn Ala Thr Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn 580 585 590 Asp Ile Leu Ile Met Glu Leu Lys Asn Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly 595 600 605 Asp Tyr Val Cys Leu Ala Gln Asp Arg Lys Thr Lys Lys Arg His Cys 610 615 620 Val Val Arg Gln Leu Thr Val Leu Glu Arg Val Ala Pro Thr Ile Thr 625 630 635 640 Gly Asn Leu Glu Asn Gln Thr Thr Ser Ile Gly Glu Ser Ile Glu Val 645 650 655 Ser Cys Thr Ala Ser Gly Asn Pro Pro Pro Gln Ile Met Trp Phe Lys 660 665 670 Asp Asn Glu Thr Leu Val Glu Asp Ser Gly Ile Val Leu Lys Asp Gly 675 680 685 Asn Arg Asn Leu Thr Ile Arg Arg Val Arg Lys Glu Asp Glu Gly Leu 690 695 700 Tyr Thr Cys Gln Ala Cys Ser Val Leu Gly Cys Ala Lys Val Glu Ala 705 710 715 720 <210> 3 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Soluble Receptor binding to myostatin : ACVR2B <400> 3 Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala 1 5 10 15 Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu 20 25 30 Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser 35 40 45 Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe 50 55 60 Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln 65 70 75 80 Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr 85 90 95 His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro 100 105 110 Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr 115

Claims (11)

1. 시그널펩타이드 서열, IgG Fc 도메인 서열 및 자연형 수용체의 세포외 영역 서열을 포함하여 이루어지는, 표적 단백질 동정을 위한 수용성 수용체 라이브러리.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 수용성 수용체 라이브러리의 서열 구조는 제한효소 인식 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 수용성 수용체 라이브러리.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 제한효소 인식 서열은 Sfi I 제한효소 인식 서열인 것을 특징으로 하는, 수용성 수용체 라이브러리.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 시그널펩타이드 서열은 MGWSYIILFLVATATDVHS인 것을 특징으로 하는, 수용성 수용체 라이브러리.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 IgG Fc 도메인 서열은 PKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK인 것을 특징으로 하는, 수용성 수용체 라이브러리.
   
6. (a) 제1항의 수용성 수용체 라이브러리를 표적 단백질에 처리하는 단계; 및
   (b) 상기 수용성 수용체 라이브러리 중 상기 표적 단백질에 대한 결합력이 높은 수용성 수용체를 선별하는 단계를 포함하는, 표적 단백질의 스크리닝 방법.
   
7. 제6항의 방법에 의해 스크리닝된 표적 단백질에 높은 결합력을 갖는 수용성 수용체.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 수용성 수용체는 VEGF에 높은 결합력을 갖는 FLT1(서열번호 1) 또는 KDR(서열번호 2)인 것을 특징으로 하는, 수용성 수용체.
   
9. 제7항에 있어서, 상기 수용성 수용체는 마이오스타틴(myostatin)에 높은 결합력을 갖는 ACVR2B(서열번호 3)인 것을 특징으로 하는, 수용성 수용체.
   
10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 수용성 수용체에 대응하는 자연형 수용체에 결합된 리간드.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 리간드는 항체 또는 약제인 것을 특징으로 하는, 리간드.
    

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