KR20140125912A - 새송이 버섯 변이균주 검출용 프라이머 및 이를 이용한 검출 방법 - Google Patents

새송이 버섯 변이균주 검출용 프라이머 및 이를 이용한 검출 방법 Download PDF

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KR20140125912A
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Abstract

본 발명은 새송이 버섯 균주의 변이균주의 조기 검출을 위하여, 1) 서열번호 6의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 159, 서열번호 7의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 111, 서열번호 8의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 001, 서열번호 9의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 028, 서열번호 10의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 005, 서열번호 11의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 185, 또는 서열번호 12의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 120으로부터 선택되는 10개 이상의 연속적인 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제1프라이머; 및 2) 서열번호 13의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 185 또는 서열번호 14의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯 게놈 DNA 스캐폴드 120으로부터 선택되는 10개 이상의 연속적인 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제2프라이머를 포함하는, 새송이 버섯 섹토링 변이균주 판별용 키트를 제공한다.

Description

새송이 버섯 변이균주 검출용 프라이머 및 이를 이용한 검출 방법{Primer set for detecting Pleurotus eryngii sectoring and method for detecting using the same}
본 발명은 새송이 버섯 변이균주의 검출 방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 새송이 버섯 변이균주 검출용 프라이머 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다.
상업적으로 새송이 버섯은 폴리프로필렌(polypropylene)병에 톱밥, 미강, 옥수수대(콘코브, corncob)등을 주성분으로 하는 배지를 담아 살균 후, 액체종균을 접종하여 재배하는 병 재배 방식을 통하여 생산되고 있다. 버섯재배에 있어서 병재배 방식의 도입은 좁은 면적 내에서 자동화시스템을 통한 공장식 대량생산이 가능하게 하여, 버섯산업을 노동집약적 산업에서 자본집약적 산업으로 이행하게 만든 계기가 되었다. 이러한 버섯의 자본집약적 대량생산체제는 영세한 버섯재배농가의 몰락을 가져온 반면, 생산성을 크게 향상시킴으로서, 버섯의 대중화와 버섯시장의 확장에 기여하고 있다. 재배 기술적 측면에서도 공장식 대량생산체제는 배지의 표준화와 온도, 습도 등 재배환경과 미생물에 의한 질병을 관리할 수 있게 하였다. 그러나 새송이 버섯의 경우 이러한 대량생산체제의 도입에도 불구하고 생산시스템의 표준화가 진행되지 못하고 있으며, 특히 세균 및 곰팡이 질병의 발병에 대한 대처법이 마련되지 않아서 많은 농가들이 막대한 손실을 입고 있다.
새송이 버섯 질병의 원인미생물로는 Staphylococcus epidermis, S. hominis, Bacillus cereus 등 그람양성세균들(Lim et al., Mycobiology, 36, 13-18, 2008)과 Pesudomonas tolaasii(Gonzalez et al., Plant Disease, 93, 667, 2009), Pantoea agglomerans(Ro HS, unpublished data) 등 그람음성세균들, Trichderma, Mucor, Aspergillus, Penicillium, Phomopsis(Ro HS, unpublished data)등 속의 다수의 곰팡이균들이 있으며, 이들은 주로 작업자나 습도 조절을 위하여 공급되는 물, 배지의 불완전 살균을 통하여 유입되는 것으로 알려져 있다. 이러한 세균 및 곰팡이 질병과 더불어 품종의 변이현상 또한 버섯생산성을 저해하는 주요요인이 되고 있다. 변이균의 발생원인은 확실하게 밝혀진 바 없으나, 일단 발생하면 곰팡이감염과 마찬가지로 균사생장단계에서는 정상균과 구분이 거의 불가능하고 생장이 완료되는 자실체 단계에서나 확인 가능하므로 막대한 자본과 노력을 투입된 후에나 조치가 가능하다. 일선 버섯농가에서는 이러한 균주의 변이현상을 섹토링(sectoring) 현상이라 부르며, 미생물 감염에 의한 것으로 인식해왔다.
새송이 버섯균주의 변이여부는 균사생장단계에서는 정상균과 거의 차이가 없어 판별이 불가능하며, 생장이 완료되는 자실체 단계에서나 확인 가능하므로 막대한 자본과 노력을 투입된 후에나 조치가 가능하였다. 더욱이, 종래에는 새송이 버섯의 균종을 판별하기 위한 기술이 주로 연구되고 있었으며, 변이 또는 섹토링(sectoring) 현상을 조기 검출할 수 있는 방법에 대해서는 연구된 바가 없었다.
본 발명은 새송이 버섯 섹토링 변이균주의 검출방법을 최초로 규명한 것으로, 변이균주 특이적으로 조기에 검출을 가능하게 함으로써, 비용, 시간 및 노동력을 효율적으로 활용할 수 있게 하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 1) 서열번호 6의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 159, 서열번호 7의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 111, 서열번호 8의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 001, 서열번호 9의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 028, 서열번호 10의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 005, 서열번호 11의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 185, 또는 서열번호 12의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 120으로부터 선택되는 10개 이상의 연속적인 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제1프라이머; 및 2) 서열번호 13의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 185 또는 서열번호 14의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯 게놈 DNA 스캐폴드 120으로부터 선택되는 10개 이상의 연속적인 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제2프라이머를 포함하는, 새송이 버섯 섹토링 변이균주 판별용 키트가 제공된다.
상기 제1프라이머는 서열번호 6의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 159, 서열번호 7의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 111, 서열번호 8의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 001, 서열번호 9의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 028, 서열번호 10의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 005, 서열번호 11의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 185, 또는 서열번호 12의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 120으로부터 선택되는 연속적인 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 바람직하게는 10개 이상의 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 12개 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는 15개 이상의 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
상기 제2프라이머는 서열번호 13의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 185 또는 서열번호 14의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯 게놈 DNA 스캐폴드 120으로부터 선택되는 연속적인 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 바람직하게는 10개 이상의 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 12개 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는 15개 이상의 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 1) 서열번호 6의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 159, 서열번호 7의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 111, 서열번호 8의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 001, 서열번호 9의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 028, 서열번호 10의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 005로부터 선택되는 10개 이상의 연속적인 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제1프라이머; 및
2) 서열번호 11의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 185, 또는 서열번호 12의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 120, 서열번호 13의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 185 또는 서열번호 14의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯 게놈 DNA 스캐폴드 120으로부터 선택되는 10개 이상의 연속적인 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제2프라이머를 포함하는, 새송이 버섯 섹토링 변이균주 판별용 키트가 제공된다.
상기 제1프라이머는 서열번호 6의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 159, 서열번호 7의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 111, 서열번호 8의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 001, 서열번호 9의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 028, 서열번호 10의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 005, 서열번호 11의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 185, 또는 서열번호 12의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 120으로부터 선택되는 연속적인 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 바람직하게는 10개 이상의 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 12개 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는 15개 이상의 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
상기 제1프라이머는 서열번호 19의 핵산서열을 갖는 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
상기 제2프라이머는 서열번호 13의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 185 또는 서열번호 14의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯 게놈 DNA 스캐폴드 120으로부터 선택되는 연속적인 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 바람직하게는 10개 이상의 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 12개 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는 15개 이상의 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
상기 제2프라이머는 서열번호 20 또는 21의 핵산서열을 갖는 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
상기 키트에 포함된 프라이머는 본 발명자에 의하여 최초로 규명된 것이며, 새송이 버섯의 섹토링 변이가 염색체 변이에 의한 것임을 밝혔다는 데에 큰 의의가 있다. 또한, 상기 프라이머 쌍은 하기 실험예를 통하여 새송이 버섯 변이균주 특이적으로 반응함을 입증하였으므로, 균주의 조기검출에 유용하게 적용할 수 있으며, 이 외에도 Seq2(서열번호 5)에 포함된 새송이 버섯 균주 DNA 상의 스캐폴드 159, 스캐폴드 111, 스캐폴드 001, 스캐폴드 028, 스캐폴드 005, 스캐폴드 185, 스캐폴드 120, 또는 스캐폴드 192로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 적용할 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 새송이 버섯 균주로부터 게놈 DNA를 준비하는 단계; 상기 게놈 DNA를 상술한 키트에 포함된 프라이머를 이용하여 증폭하는 PCR 단계; 및 상기 PCR에 의해 DNA 단편이 증폭된 새송이 버섯 균주를 섹토링 변이균주로 선별하는 단계를 포함하는, 새송이 버섯 섹토링 변이균주 검출방법이 제공된다.
상기 키트는 서열번호 19의 핵산서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 제1프라이머로 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 상기 키트는 서열번호 20 또는 21의 핵산서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 제2프라이머로 포함할 수 있다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 새송이 버섯 섹토링 변이균주를 조기 검출할 수 있는 검출용 프라이머 및 이를 이용한 검출방법을 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 새송이 버섯 배양시 나타나는 섹토링(sectoring) 현상을 관찰한 사진으로, 35일 동안 25℃에서 톱밥을 포합하는 배지에서 배양한 정상 균주(도 1a 및 1b) 및 변이된 새송이 버섯 섹토링 변이균주(도 1c 및 1d)를 촬영한 사진이다.
도 2는 새송이 버섯 야생형 재배균주와 변이균주의 PDA 배지상에서의 성장을 관찰한 사진으로, 도 2a는 KNR2312 (WT) 균주의 배지상의 성장을 나타낸 사진이며, 도 2b는 KNR-2312-M1 또는 -M2 (sectoring) 섹토링 변이균주의 배지상의 성장을 나타낸 사진이며, 도 2c는 25℃에서 상기 3종의 균주를 배양하며 균사체의 직경을 배양함으로써 측정한 성장수준을 나타낸 그래프이다.
도 3은 새송이 버섯 야생형 재배균주로부터 분리한 게놈 DNA를 3개의 다른 프라이머(OPS1, OPS10 및 OPL13)을 이용하여 RAPD 분석을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.
도 4는 RAPD 분석으로 수득된 DNA 서열을 분석한 결과로, Seq1은 정상균(KNR2312) 및 변이균(KNR2312-M1 또는 -M2)에서 관찰된 단편을 나타내며, Seq2는 변이균(KNR2312-M1 또는-M2)에서만 관찰된 DNA 단편을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 쌍의 새송이 버섯 섹토링 변이 균주 특이적인 검출을 확인한 결과로, 도 5a는 새송이 버섯 재배균주 및 섹토링 변이균주에 대한 PCR 결과이며, 도 5b는 새송이 버섯, 느타리 버섯 및 그 외의 버섯 균주에 대한 PCR 수행 결과이다.
본 문서에서 사용되는 용어를 정의하면 하기와 같다.
본 문서에서 사용되는 “섹토링 변이균주”는 균사가 배지전체를 거쳐 발달하지 못하거나, 배지 표면에 두꺼운 균피를 형성하고, 갈색의 점액질 물질을 분비하며, 자실체형성이 안 되는 등 이상 성장증상을 보이며 성장하는 변이된 균주를 의미하며, 곰팡이감염과 마찬가지로 균사생장단계에서는 정상균과 구분이 거의 불가능하고 생장이 완료되는 자실체 단계에서나 확인 가능하며, 변이균의 발생원인은 확실하게 밝혀진 바 없으며, 미생물 감염에 의한 것으로 인식해왔다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 새송이 버섯 균주 배양
새송이 버섯 재배품종(품종명: 큰느타리2호, 균주번호: KNR2312)과 KNR2312에서 유래한 섹토링 변이균주 KNR2312-M1, KNR2312-M2는 그린피스버섯연구소에서 입수하였다. 느타리버섯(P. ostreatus)과 여름느타리(P. sajor-caju) 품종은 모두 생산농가에서 수집하였다. IUM번호가 부여된 기타버섯들은 야생버섯균주은행(인천대학교)에서 분양받아 사용하였다(표 1 참조).
각 버섯균주들은 PDA(potato-dextrose agar)배지에 배양 후 보존하였다. 자실체생산을 위한 병배양은 소나무톱밥(23 중량%), 콘코브(29 중량%), 미강(18 중량%), 비트펄프(4 중량%), 밀기울(14 중량%), 면실피(4 중량%), 폐화석(4 중량%), 대두박(14 중량%)를 포함하는 배지에 액체종균을 접종하여 25℃에서 35일 이상 배양하였다.
Species No. Strain name Species No. Strain name
P. eryngii
1 KNR2312 P. ostreatus 15 Sinnong
2 KNR2312-M1 16 Chunchu
3 KNR2312-M2 17 Chunchu2
4 KNR2510 P. sajor-caju 18 Yeureum
5 KNR2512 Lentinula edodes 19 IUM1508
6 KNR2514 Microporus vernicipes 20 IUM3147
7 KNR2517 Flammulina velutipes 21 IUM1324
8 KNR2519 Trametes suaveolens 22 IUM1732
9 KNR2520 Coriolus versicolor 23 IUM0072
10 KNR2523 Stereum ostrea 24 IUM1296
11 KNR2524 Fomes fomentarius 25 IUM0204
12 KNR2525 Pycnoporus cinnabarinus 26 IUM4209
13 KNR2577 Naematoloma fasciculare 27 IUM4075
P. ostreatus 14 Suhan Ganoderma lucidum 28 IUM1727
실험예 1: 변이균주의 생리적 특징
새송이 버섯농가에서 자실체 생육조건에서 자실체 발생이 안 되는 변이균주 KNR2312-M1, -M2 균주를 수집하였다. 이 균주들은 톱밥배지에서 배양 중 균사가 배지전체를 거쳐 발달하지 못하여, 배양병을 전체적으로 관찰하면 균사가 배지의 일부분에만 성장하는 “섹토링 현상”을 나타냈다(도 1d 참조). 또한, 배양병의 표면에 두꺼운 균피를 형성하고, 갈색의 점액질 물질을 분비하는 등 이상 성장증상을 보였다(도 1c 참조). 이러한 섹토링 변이균들은 궁극적으로는 자실체 발생조건에서 자실체가 발생하지 않는 생리적 특징을 보였다.
이어, 변이균주의 성장특성을 관찰하기 위하여 PDA 배지 상에서 배양하며 성장속도를 균사의 직경으로 측정하였다(도 2 참조). 그 결과 15일간 배양시 섹토링 변이균주의 균사 성장속도가 야생형 재배균주 KNR2312에 비하여 현저히 느려지는 것을 확인하였다(도 2c 참조).
실험예 2: 변이균주의 유전체 RAPD 분석
이러한 섹토링 변이균주의 출현이 염색체 돌연변이에 의한 것인지를 확인하기 위하여 야생형 재배균주와 섹토링 변이균주의 염색체를 추출하여 RAPD 분석을 실시하였다. RAPD 분석은 짧은 랜덤 프라이머로 비교대상염색체를 PCR하여 증폭된 DNA band 패턴의 다형성(polymorphism)을 분석함으로써, 염색체간의 차이를 알아낼 수 있는 분자유전학적 기술이다.
야생형 재배균주로 KNR2312 균주를 이용하였으며, 변이균주로 KNR2312-M1, KNR2312-M2 균주를 이용하고, 상기 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 RAPD 분석을 실시하였다. 랜덤 프라이머로 OPS1(5’-CTACTGCGCT-3’, 서열번호 1), OPS10(5’-ACCGTTCCAG-3’, 서열번호 2), OPL13(5’- ACCGCCTGCT-3’, 서열번호 3)를 사용하였다. PCR 반응은 게놈 DNA 1 μl, primer 10 pM, PCR premix(Dyemix, Promega)의 조건으로 20 μl 부피로 반응시켰다. PCR 증폭은 95℃ 에서 5분간 변성 후, 95℃에서 30초간 변성, 40℃에서 30초간 어닐링(annealing), 72℃에서 2분간 연장(extension)의 조건으로 25 사이클(cycle)의 중합반응을 실시하고, 72℃에서 10분간 추가반응을 실시하였다. PCR 산물은 1.5% 아가로즈 겔(agarose gel)을 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, KNR2312-M1, KNR2312-M2 변이균주 특이적으로 1.9 Kbps(도 3의 화살표 1), 1.7 Kbps(도 3의 화살표 2) 크기의 DNA 단편이 관찰되었다. 이러한 RAPD의 결과는 이들 변이균주가 염색체의 돌연변이에 의하여 발생하는 것임을 알려주는 것이다.
실험예 3: DNA 단편의 염기서열분석
상기 실험예 2에서 관찰된 변이균주 특이적인 DNA 단편을 아가로즈 겔에서 추출한 후, pGEM Teasy vector(Promega)와 라이게이션(ligation) 후 염기서열을 결정하였다. KNR2312-M1에서 관찰된 DNA 단편을 클로닝 한 결과 1.949 bp를 나타냈으며(Seq1), KNR2312-M2에서 관찰된 DNA 단편을 클로닝한 결과 1,758 bp를 나타냈으며(Seq2), 이하 이를 각각 Seq1(서열번호 4) 및 Seq1(서열번호 5)로 약칭하여 기술하였다.
상기 염기서열은 현재 Genebank(submission number KC461497, KC461498)에 제출되어 심사가 진행되고 있다.
상기 2개의 염기서열을 새송이 버섯 KNR2312 유전체 데이터 베이스(경남농업기술원 비공개DB)에서 BLAST 분석을 통하여 비교하였다. 그 결과 Seq1은 야생형 재배균주인 KNR2312의 Scaffold055의 염기서열(119137-117190)과 99% 일치하였다(도 4a 참조).
반면 Seq2의 경우 염색체상 여러 scaffold(scaffold 192, 120, 159, 111 등)에 산재해 있었으며, Seq2의 1-482 사이의 서열은 scaffold 159와 111의 24724-25205, 18426-17949 서열과 각각 일치하였으며, 838-1758은 scaffold 192의 13767-14685 서열과, 899-1758은 scaffold 120의 74627-75484 서열과 일치하였다(도 4b 참조). Seq2 전체 연기서열을 가진 단일 scaffold는 발견되지 않았다.
이러한 분석 결과는 Seq2가 KNR2312 염색체상 서로 다른 위치에 있던 DNA 조각이 합쳐져서 만들어진 서열임을 의미하는 것으로, 변이균주의 경우 염색체상 염기서열의 전좌현상(translocation)이 일어났음을 알 수 있다. 또한 Seq2의 3‘말단부위에는 에너지대사에 관련되는 thiol: disulfide interchange protein 유전자의 부분이 발견되어 이유전자의 변이가 섹토링 현상과 연관이 있을 것으로 추정되었다.
scaffold # scaffold 크기 scaffold상 위치 서열번호
Seq1 Scaffold 055 241 kb 119236-117192 -
Seq2 Scaffold 159 73.4 kb 24724-25205 6
Scaffold 111 127 kb 18426-17949 7
Scaffold 001 3.2 Mb 2932625-2932151 8
Scaffold 028 370 kb 168400-168873 9
Scaffp;d 005 776 kb 511642-511173 10
Scaffold 185 57 kb 43059-43374 11
Scaffold 120 117 kb 73118-73392 12
Scaffold 192 50 kb 13767-14685 13
Scaffold 120 117 kb 74627-75484 14
실험예 4: 변이균주 검출용 PCR 프라이머 개발
변이균주의 검출을 위하여 앞서 얻어진 Seq1, Seq2 두 개의 염기서열을 바탕으로 각각 4개의 프라이머를 제작하고 이들의 조합을 통하여 각 서열의 전체, 서열의 5’부터 중간, 중간부터 3’끝까지를 증폭할 수 있게 각 3세트씩, 총 6세트의 프라이머를 디자인하였다(표 2 참조). 이렇게 제작된 프라이머 세트를 이용하여 야생형 재배균주인 KNR2312(WT)와 변이균주 KNR2312-M1(M1), KNR2312-M2(M2)의 염색체를 대상으로 PCR 반응을 수행하였다(도 5a 참조).
그 결과 프라이머 세트 P1-1, P1-2, P1-3 및 P2-3은 WT, M1, M2에 대하여 전부 PCR 산물이 관찰되었으나, P2-1, P2-2 세트에서는 M1, M2 균주에서만 PCR 산물이 관찰되었다. 이러한 결과는 도 4의 결과와 일치하는 것으로 KNR2312-M1에서 관찰된 DNA 단편의 염기서열의 경우, 변이균주에서도 전체 염기서열이 동일 scaffold에 존재하기 때문에 야생형 재배균주(WT)과 동일한 PCR 결과를 나타냈다.
반면, Seq1의 경우, 프라이머 세트 2-3은 야생형 재배균주의 scaffold 192, 120에도 들어 있기 때문에 재배종, 변이종 모두에서 PCR 산물을 만들어 낼 수 있었지만, 프라이머 세트 2-1, 2-2의 경우 정방향 프라이머 서열이 재배균주의 scaffold 159, 111에 결합하지만, 역방향 프라이머(P2-2R)가 결합할 수 있는 자리가 없기 때문에 PCR 반응이 일어나지 않았다.
Primer set Primer name Sequence (5 to 3) Expected size (bps) 서열
번호
P1-1 P1-1F CTACTGCGCTCTCATT 1949 15
P1-1R TCTACTGCGCTCATGG 16
P1-2 P1-1F CTACTGCGCTCTCATT 954 15
P1-2R CGCCGTCCCATTCTAC 17
P1-3 P1-2F GTAGAATGGGACGGCG 1007 18
P1-1R TCTACTGCGCTCATGG 16
P2-1 P2-1F ACCGCCTGCTACCAGC 1758 19
P2-1R TACCGCCTGCTAAGCA 20
P2-2 P2-1F ACCGCCTGCTACCAGC 966 19
P2-2R CCAAGGATGATGCTCC 21
P2-3 P2-2F GGAGCATCATCCTTGG 808 22
P2-1R TACCGCCTGCTAAGCA 20
이어, 본 발명자는 상기 변이균주 특이적 프라이머 세트 2-1, 2-2가 다른 버섯류에 대하여 간섭(cross-talk)이 없는지를 알아보기 위하여, 상기 표 1의 변이균들이 포함된 새송이 버섯 13종, 느타리버섯(P. ostreatus) 4종, 표고버섯(Lentinula edodes), 팽이버섯(Flammulina velutipes)등이 포함된 11종의 버섯을 대상으로 PCR을 수행하였다(표 1 참조).
그 결과, 도 5b에 나타난 바와 같이, 프라이머 세트 2-1, 2-2 모두 새송이 버섯 변이균주 M1, M2에만 특이적으로 PCR 반응 산물을 산출하였다(도 5b 참조). 이러한 결과는 1) 새송이 버섯의 게놈 DNA 상의 스캐폴드 151, 스캐폴드 111, 스캐폴드 001, 스캐폴드 028, 또는 스캐폴드 005로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머와 스캐폴드 185, 스캐폴드 192, 또는 스캐폴드 120으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머의 조합, 또는 2) 새송이 버섯의 게놈 DNA 상의 스캐폴드 151, 스캐폴드 111, 스캐폴드 001, 스캐폴드 028, 스캐폴드 005, 스캐폴드 185 또는 스캐폴드 120으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머와 스캐폴드 192, 또는 스캐폴드 120으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머의 조합을 이용하여, 섹토링의 원인이 되는 염색제 전좌(transloaction) 발생 여부를 확인할 수 있고, 이로부터 새송이 버섯 균주의 섹토링 변이균주 여부를 특이적으로 확인하는데 활용될 수 있음을 시사하는 것이다.
본 발명은 도면에 도시된 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> Primer set for detecting Pleurotus eryngii sectoring and method for detecting using the same <130> PD13-0646 <160> 22 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPS1 primer <400> 1 ctactgcgct 10 <210> 2 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPS10 primer <400> 2 accgttccag 10 <210> 3 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPL13 primer <400> 3 accgcctgct 10 <210> 4 <211> 1949 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq1(KNR2312-M1) <400> 4 ctactgcgct ctcattacgg ccaggatgct acgtccgacg aggacgattg ggacgaagaa 60 ttcgaatcat ccgcctggtc ctcttctctg gcacacgtct cctcgttgca cctcacacgt 120 atcctagcgc tcttggccac gcacactccc atcgggaaca agtccatgca gaatcgtatc 180 aaccctgtgg gctgggaaat ggtaatcaat gccctaggtg cttatgggag tgatttcgtc 240 gacgaaacgt ctgtattata atctcgaatg tcaatatatc ttccatctct taatctgttc 300 aatttgaaat ttacagagct ctagctcgcg tgaagcagag gttagaagca atttatggca 360 cttctagttc aattggtcgg accttgctct ttccactctc accaagtcta atcttactca 420 gatgcagccc cgagtcgcgt ctcaatcagt gaacgtacgc gagcggtact gaacgagtcc 480 ataaattcaa atcgcatgag ctttttggac cttgttcctc agccccccgc ttctgctgtt 540 gttgaagcaa cgaaaagtat gttcgaacct ttgctatgca ctgggactcc aagctcattg 600 atgccctagc cgttgagcgg gtacgcagag agactcgcgc actcaagaag agaaaggtgg 660 acgaccagac cgcttcgcag tgatattcaa ccgttctctc ctcgccatat ttctgtccgc 720 tctaaaacgc aacgtataag ctccatcctg gagcataatc cacactaccg atcattggaa 780 tcgtgatatc cattgtaacg atgccagcta aaatacatgg gctatgtgat gtaaacaaga 840 agaaacagag atataacaga tagtttacat caatgatcca tactccagag agaaagagaa 900 agaaatgcat aacgcagaac gcattcgccg ggcgaagacg aagtagaatg ggacggcggg 960 aagaggaata atgatacata agtttaaacg agtggtgtct ccgatgccaa tcacaacaca 1020 caatcaactc agcatcatcg cttgctgaat atcttttgag caggttcaag actttcggta 1080 cgttcagttg aacgtactca ggtcgagaag cggcttgttg tctttttgct acgagaaagc 1140 cagaacgatc aaccaggaac ggcagaagat cgaggctgaa acgcaccttt tctagtaaat 1200 cgtcgagttt gagatcgagt tcaaggattg gtttttctct ccctttgtaa tgcagggcaa 1260 taatgaatgt acttggagat ggagaagaaa tgttgaagta aatgtttgga cgtcttccga 1320 aatgtggtta gcctcagtaa acgagaacag agcggagtgc aggcttacct gtgctctggc 1380 accttgctat caacaatgat cccctcttgc atcagctgtg agtgtgtaaa cctatacggg 1440 cccaggaacg tctgcttcac tggcttcgct ttgttccctc ctacggtgac cactcccact 1500 ccgctccccg ccgccttctc gctggacgcc gtcaatctga cattctgcag atacgctttg 1560 taatgctcca actgacttct cagatagtca ttgtggtcac tgatcgtccg atagacggcc 1620 tgtaacgatg tcgtctccgc taacaccttc tccttcaggt tccccagatg gatgagttca 1680 gcagcgactt cctcctgcat gagcttgtag ctatccgagg agtcgatgac atgctgttct 1740 tcgagctcgc ggagcatttc acggaccttg attcctttac gtaccaggga ggcgtctttg 1800 gtggtagcag cgcgctcggc gattgcgatg aggttgtacg gacgcttgtc gactgcacgg 1860 gggatggaac ggatgagctg cactagaata gacttcgctt ccatataaag catgtcactg 1920 gatgacacag tgtccatgag cgcagtaga 1949 <210> 5 <211> 1758 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seq2(KNR2312-M2) <400> 5 accgcctgct accagctcac tgtaggtgcc atggccaagt ggaacaggct caccattcca 60 tgggatgggg atcctgttga ggaggctctc cttcattcga tttttatcaa gaggacgaac 120 ttcggcaact atagaggcct cttcaaacgc ggtctcaagt ttcccctgct catggacacg 180 ttgcagaatt ccgactacaa atttgtgtca gaagcttata cgaaagtctg gggtggtcgt 240 gaagttggca ggactactct ggggaaggtt ctggatgagt tggaggcaga ggcagcagca 300 gaggaggcaa gagtggaggc tgagaaagcc aagaaggcta aggaggcaaa gaagaaggct 360 gctaagaagg ttaccaagta ggtagctatt ctttgtatta gtgtaaatgc aacagtcctt 420 tcacttgttc tttttcgtct gaacttcaat gaatttcaac aaatactgac ttgcctagtt 480 tcatcctcgt cgcatgtgtg cttgtacgta ggcttggctg gggagtagtg agcctctgga 540 ttttgggtag acacatgata ccttgcgcgt ttggctgggc gttcgaacat ctcatcatca 600 ttgcctgcca gacgttcacc agcagaatgg tcacagcaac aatgagaaga gggagagcaa 660 taatgacagg gggaagggga gtgatgatgg taaataggca aggcagagcc atggcagtga 720 ggagaaggag agcgaggacg atggtgagaa gaagaacaac aatgatggga aggagggggt 780 ggaaggatag tctctccgca ttgtgttgat gtatcatcgt ggaaactggt gttgtcatta 840 gcgtcgtcgc tgtcaaatag gctatcaacc gcaggaacca cagacacaac cacgtgatct 900 gaagtcgcct agcacagata tggtctgcca agtcaccatc atactccaat ggagcatcat 960 ccttggaagt ggcattggga tcatgtctga ctatgggacg aggcttgact cactggggaa 1020 cgggaagctg caactatggt ggaattattg ggaccaacag cagtgttgtc gctggaatcg 1080 tcaggatctg caagaggtgt atctgtagca gcattggcta ggaggttggc attaatagga 1140 ggcagtgtgg cttcagggga atgtggcttg gaaattggtg gatggggcag ggtgtcggtg 1200 gcctgaggtg aatttggctg gaaaattggt ggatgaggag gatcgccagt gggatctgca 1260 ctgtgctgtg cttccagtct atcatttggt tcatcgacca tttgagcacc tttgtcaatc 1320 catacatccg ttccaggagc accacttttg ctatctctag cattatttgc aattgatgta 1380 gctggctcat gaggtataac accatcgaca aggctggcga tggatgttcc atccaatacc 1440 tgtttgcctg aagcatgtaa tttgttaggt ttctgaggaa gttagctaca aatgaataat 1500 gagagtcgtg gagatgtact tcggcattgt gacacttttt ggggtttgct tccaaaggct 1560 tctctttctg gctctgttgc gcacgagcag agtctgcatc ctaataatca acggtaagtt 1620 gatacattta atgtataaag caacttacct tgatgggccc agccgccttt ctggagcgag 1680 ttgtccttgc tggttccttg tcaacattgc tgcctacatg tgatcgagta gtgtgtcgag 1740 gttgcttagc aggcggta 1758 <210> 6 <211> 474 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scaffold159 (24724-25205) <400> 6 ctaccagctt gctgtaggtg ccatggccaa gtggaacagg ctcaccactc catgggatgg 60 ggatcctgtt gaggaggctc tccttcattc gatttttatc aagaggacga acttcggcaa 120 ctacagaggc ctcttcaaac actgtctcaa gtttcccatg ctcatggaca tgttgcagaa 180 ttccgactac aactttgtgt cagaagctca tacaaaagtc tggggtggtc gtgaagttgg 240 caggactact ctggggaagg ttctggatga gttggaggca gaggcagcag cagaggaggc 300 aagagtggag gctgagaaag ccaagaaggc taaggaggca aagaagaagg ctgctaagaa 360 ggttaccaag taggtagcta ttctttgtat tagtgtaaat gcaacagtca tttcacttgt 420 tctttttcgt ctgaacttca atgaatttca acaaatactg acttgcctag tttc 474 <210> 7 <211> 480 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scaffold111 (18426-17949) <400> 7 cgcccgctac cagctcgctg taggtgccat ggccaagtgg aacaggctca ccactccatg 60 ggatggggat tctgttgagg aggctctcct ttgttcgatt tttatcaaga ggacgaactt 120 cagcaactgc ggaggcctct tcaaacactg tctcaagttt cccatgctca tggacatgtt 180 gcagaattct gactacaact ttgtatcaga agctcatatg aaagtctgga gtggtcatga 240 agttggcagg actactctgg ggaaggttct ggatgagttg gaggcagagg cggcagcaga 300 ggaggcaaga gtggaggctg agaaagccaa gaaggctagg gaggcaaaga agaaggctgc 360 taagaaggtt accaagtagg tagctattct ttgtattagt gtaaatgcaa cagtcatttc 420 acttgttctt tttcgtctga acttcaatga atttcaacaa atactgactt gcctagtttc 480 480 <210> 8 <211> 475 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scaffold001 (2932625-2932151) <400> 8 gctaccagct cgctgtaggt gccatggcca agtggaacag gctcaccact ccatgggatg 60 gggatcctgt tgaggaggct ctccttcgtt tgatttttat caagaggacg aacttcagca 120 actacggagg ccttttcaaa cactgtctca agtttcccat gctcatggac atgttgcaga 180 attccaacta caactttgtg tcagaagctc atacgaaagt ctggggtggt catgaagttg 240 gcaggactac tctggggaag gttctggatg agttggaggc agaggcagca gcagaggagg 300 caagagtgga ggctgagaaa gccaagaagg ctaaggaggc aaagaagaag gctgctaaga 360 aggttaccaa gtaggtagct attctttgta ttagtgtaaa tgcaacagtc atttcacttg 420 ttctttttca tctgaacttc aatgaatttc aacaaatact gacttgccta gtttc 475 <210> 9 <211> 474 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scaffold028 (168400-168873) <400> 9 ctaccagctc actgtaggtg ccatggccaa gtggaacagg cttaccactc catgggatgg 60 ggatcctgtt gaggaggctc tcctttgttc aatttttatc aagaggatga actttggcaa 120 ctatggaggc ctcttcaaac actgtctcaa gtttcccatg ctcatggaca tgttgcagaa 180 ttccaactac aactttgtgt cagaagctca tacgaaagtc tggggtggtt gtgaagttga 240 caggactact ctggggaagg ttctggatga gttggaggca gaggcagcag cagaggaggc 300 aagagtgggg gctgagaaag ccaagaaggc taaggaggca aagaagaagg ctgctaagaa 360 gcttaccaag taggtagcta ttctttgtat tagtgtaaat gcaacagtca tttcacttgt 420 tctttttcat ctgaacttcg atgaatttca acaaatactg acttgcctag tttc 474 <210> 10 <211> 470 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scaffold005 (511642-511173) <400> 10 cagctcactg taggtgccat ggccaagtgg aacaggctca ccactccatg ggatggggat 60 tctgttgagg aggctctcct tcattcaatt tttatcaaga ggacaaactt cagcaactat 120 ggaggcctct tcaagcactg tctcaagttt cccatgccca tggacatgtt gcagaattcc 180 gactacaact ttgtgtcaga agctcatatg aaagtctggg gtggttgtga agttggcagg 240 actactctgg ggaaggttct ggatgagttg gaggcagagg cagcagcaga ggaggcaaga 300 gtggaggctg agaaagccaa gaaggctaag gaggcaaaga agaaagctgc taagaaggtt 360 accaagtagg tagctattct ttgtattagt gtaaatgcaa cagttatttc acttgttatt 420 tttcatctga acttcaatga atttcaacaa atactaactt gcctagtttc 470 <210> 11 <211> 316 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scaffold185 (43059-43374) <400> 11 ttcatcctcg ttgcatgtgc gcttgcacgc aggcttggct gggaagtagt gagcctctgg 60 attttgggta gacacatgat accttgcatg tttggctggg cattcgaaca tctcatcatc 120 attgcctgcc agacattcac cagcagaatg gtcacagcga caatgagaag agggagagcg 180 ataacgatgg ggggaagggg agtggtgatg gtgaataggc aaggcagagc catggcagtg 240 agaagaagga gagtgaggat aatggtgaga aggagaacga cgatgacggg aaggaggggg 300 tggaaggata gtctct 316 <210> 12 <211> 275 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scaffold120 (73118-73392) <400> 12 gggagtagtg agcctctgga ttttgggtag atgcatgata ccttgcgtgt ttggctgggc 60 attcgaacat ctcatcatca ttgcctgcca gacgttcacc agcagaatgg tcacagcaac 120 aatgagaaga gggagagcga taacgatggg gggaagggga gtggtgatgg tgaataggca 180 aggcagagcc atggcagtga ggagaaggag agcaaggaca atggcaagaa ggagaacgac 240 aatgacagaa aggagggggt ggaaggatag tctct 275 <210> 13 <211> 919 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scaffold192 (13767-14685) <400> 13 ttagcgtcgt cgttgtcaaa caggctatca accgcgggaa ccacagacac aaccgcgcga 60 tcctgaagtc gcctagcacg gatacggtcc gccaagtcac cgtcatactc caatggagca 120 tcatccttgg aagtggcatc gggatcatgt ctgactatgg gacgaggctt gactcgctgg 180 ggaacgggag gagctgcaac cacggtggaa ttattgggac cgacagcagt gttgtcgctg 240 gaatcgtcag gatctgcaag aggtgtatct gtagcagcat tggccaggag gttggcgtca 300 ataggaggcg gtgtggcttc aggggaatgt ggcttggaaa ttggtggatg gggtggggtg 360 tcggtggcct gaggtgaatt tggccggaaa attggtggat gaggagggtc gctggtgaga 420 tctgcactgc gctgcgcttc cagtctatca tttggttcat cgaccatttg agcgcctttg 480 tcgacacata catccgttcc aggagcacca cttttgctat ctctagcatt attcgcaatt 540 gatgtagccg gctcgtgagg tatagcacca tcgacaaggc tggcgatgga tgttccatcc 600 aatacctgtt cgccagagca tgtaattcgt taggtttctg aggaagttag ctacaaacga 660 ataatgagag tcgtggagac gtacttcggc attgcgacgc ttcttggggt ttgcttccga 720 aggcttctct ttctggctcc gttgcgcatg agcagagtct gcatcctaat aaatccacgg 780 taagttgata catttaatgt ataaagcaac ttaccttgat gggcccagct gtctttctgg 840 agcgagttgt cctcgctggt tccttgtcaa cattgctgcc tacatgtgat cgagtagcgc 900 gtcgaggttg cttagcagg 919 <210> 14 <211> 858 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scaffold120 (74627-75484) <400> 14 ctgaagttgc ctagcacaga tacagtctgc caagtcactg tcatactcca atggagcatc 60 atccttggga gtggcattgg gatcatgtct gactatgaga caaggcttga cttgctgggg 120 aacaggagga gctgcaacca cagtggaatt attgggaccg acagcagtgt tgttgctgga 180 atcgtcagga tctgcaagag gtgtatctgt agcagcattg gccaggaggt tggcatcaat 240 aggaggcagt gtggcttcag ggggatgtgg cttggaaatt ggtggatggg gcggggtgtc 300 agtggcctga ggtgaatttg gccagaaaat tggtggatga ggagggttgc cggtgggatc 360 tgcactgcac tgcgcttcca gtccatcatt tggttcatcg accatttgag cacctttgtc 420 aacacataca tctgttctgg gagcactact tttgctatct ctagcattat tcgcaattga 480 tgtagctggc tcatgaggta tagcaccatt gacaaggctg gtgacagatg ttccatccaa 540 tacctgttca cccaaagcat gtaatttgtt aggtttctga ggaagttagc tacaaatgaa 600 taatgagagt tgtggagacg tactttggca ttgtgacact tcttggggtt tgcttctgaa 660 ggcttctctt tctggctcca ttgcacacga gcagagtctg catcctaata aatcaacggt 720 aagttgatac atttaatgta taaagcaact taccttgatg ggcccagttg cctttctgga 780 gcgagttgtc cttgctggtt ccttgtcaac attgctgcct acatgtgatc aagtagcatg 840 tcgaggttgc ttagcagg 858 <210> 15 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P1-1F primer <400> 15 ctactgcgct ctcatt 16 <210> 16 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P1-1R primer <400> 16 tctactgcgc tcatgg 16 <210> 17 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P1-2R primer <400> 17 cgccgtccca ttctac 16 <210> 18 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P1-2F primer <400> 18 gtagaatggg 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Claims (7)

1) 서열번호 6의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 159, 서열번호 7의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 111, 서열번호 8의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 001, 서열번호 9의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 028, 서열번호 10의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 005, 서열번호 11의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 185, 또는 서열번호 12의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 120으로부터 선택되는 10개 이상의 연속적인 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제1프라이머; 및
2) 서열번호 13의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 185 또는 서열번호 14의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯 게놈 DNA 스캐폴드 120으로부터 선택되는 10개 이상의 연속적인 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제2프라이머를 포함하는, 새송이 버섯 섹토링 변이균주 판별용 키트.
1) 서열번호 6의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 159, 서열번호 7의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 111, 서열번호 8의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 001, 서열번호 9의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 028, 서열번호 10의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 005로부터 선택되는 10개 이상의 연속적인 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제1프라이머; 및
2) 서열번호 11의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 185, 또는 서열번호 12의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 120, 서열번호 13의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯의 게놈 DNA 스캐폴드 185 또는 서열번호 14의 핵산서열을 갖는 새송이 버섯 게놈 DNA 스캐폴드 120으로부터 선택되는 10개 이상의 연속적인 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제2프라이머를 포함하는, 새송이 버섯 섹토링 변이균주 판별용 키트.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 제1프라이머는 서열번호 19의 핵산서열을 갖는 올리고뉴클레오티드인, 키트.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 제2프라이머는 서열번호 20 또는 21의 핵산서열을 갖는 올리고뉴클레오티드인, 키트.
새송이 버섯 균주로부터 게놈 DNA를 준비하는 단계;
상기 게놈 DNA를 제1항 또는 제2항의 키트에 포함된 프라이머를 이용하여 증폭하는 PCR 단계; 및
상기 PCR에 의해 DNA 단편이 증폭된 새송이 버섯 균주를 섹토링 변이균주로 선별하는 단계를 포함하는, 새송이 버섯 섹토링 변이균주 검출방법.
제5항에 있어서,
상기 키트는 서열번호 19의 핵산서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 제1프라이머로 포함하는, 새송이 버섯 섹토링 변이균주 검출방법.
제5항에 있어서,
상기 키트는 서열번호 20 또는 21의 핵산서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 제2프라이머로 포함하는, 새송이 버섯 섹토링 변이균주 검출방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR102032502B1 (ko) * 2018-12-19 2019-10-18 대한민국 팽이버섯의 색깔 판별용 snp 마커 및 이의 용도

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