KR20140117991A

KR20140117991A - 킬레이트화제를 유효성분으로 포함하는 메탄생성 억제용 조성물 및 이를 이용한 메탄 생성 억제 방법

Info

Publication number: KR20140117991A
Application number: KR1020130033051A
Authority: KR
Inventors: 김필주; 프라마닉 프라밭; 김상윤
Original assignee: 경상대학교산학협력단
Priority date: 2013-03-27
Filing date: 2013-03-27
Publication date: 2014-10-08

Abstract

본 발명은 경제적이며 효과적으로 메탄가스 생성을 억제하는 방법을 제공하기 위하여, 킬레이트화제를 유효성분으로 함유하는 메탄가스 생성 억제용 조성물을 제공한다.

Description

킬레이트화제를 유효성분으로 포함하는 메탄생성 억제용 조성물 및 이를 이용한 메탄 생성 억제 방법{Composition for reducing methane gas comprising chelating agent and method using the same}

본 발명은 메탄 생성 억제 방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 킬레이트화제를 유효성분으로 포함하는 메탄생성 억제용 조성물 및 이를 이용한 메탄 생성 억제 방법에 관한 것이다.

논에서 벼는 담수상태로 재배되기 때문에 벼 재배과정 중 유기물이 분해되면서 상당량의 메탄이 발생되고 있다. 우리나라 농경지의 약 60%가 논이고, 담수상태의 논에서 상당량 발생되는 메탄은 이산화탄소(CO₂)에 비해 한 분자가 갖는 지구 온난화 유발 잠재성(global warming potential)이 약 24배 정도 높은 것으로 알려져 있다. 지구의 온난화 문제가 심각해지고 기후협약 등을 통해 온난화가스 발생량 저감에 대한 국제적 압력이 커지고 있는 시점에 벼논에서 메탄발생량저감을 위한 대책수립이 절실히 필요한 실정이다.

우리나라 논에서 1년간 발생되는 온실가스량은 탄산가스(CO₂)의 온난화지수로 계산할 때 메탄이 760만9000t CO₂, 아산화질소는 81만5000t CO₂인 것으로 알려져 있으며, 이상기후의 원인으로 지목되는 지구온난화가 금세기 최대의 관심사항으로 등장한 가운데, 논토양과 같은 혐기성 토양에서 온실가스의 발생량을 획기적으로 줄일 수 있는 기술 개발이 요구되고 있다.

니켈과 같은 중금속에 의한 오염토양 복원기술 중 식물 이용기술(Phytoremediation)에서 대상 식물의 중금속 흡수도를 향상시키기 위해 EDTA와 같은 킬레이트화제(chelating agent)를 널리 이용하고 있다. 이때 킬레이트화제는 토양 내 고정태의 중금속의 용해도를 향상시키고 토양과 다시 흡착하는 것을 방해함으로써 식물의 중금속 흡수율을 높여주는 특징을 가지고 있다. 그러나 현재까지 토양 내에서 킬레이트화제 사용이 메탄 발생량 저감에 미치는 영향에 대해서 연구된바 없다.

본 발명은 킬레이트화제의 메탄가스 생성 억제효과를 최초로 입증하여, 이를 유효성분으로 함유하는 메탄생성 억제용 조성물 및 이를 이용한 메탄 생성 억제 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 킬레이트화제를 유효성분으로 포함하는, 메탄가스 생성 억제용 조성물이 제공된다.

상기 조성물에 있어서, 상기 킬레이트화제는 유기계일 수 있다. 예를 들어, EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid), NTA(Nitrilotriacetic acid), HEDTA((2-Hydroxyethyl)ethylenediaminetriacetic acid), GEDTA(glycoletherdiaminotetraacetic acid), TTHA(triethylene tetraminehexaacetic acid), HIDA(iminodiacetic acid), DHEG(dihydroxyethylglycine), 부식산(humic acid), 및 풀부산(Fulvic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상일 수 있다. 상기 킬레이트화제는 본 발명자에 의하여 토양 내 메탄 생성균의 메탄생성효소(methyl-CoM reductase)의 보조인자(cofactor)인 니켈(Ni)과 착화합물을 형성 메탄 생성균 체내 니켈 흡수를 방해하여 메탄 생성을 억제시키는 효과를 최초로 입증하였다. 따라서 효과적이며 경제적으로 메탄가스 생성 억제에 본 발명의 일 실시 예에 따른 킬레이트화제를 적용할 수 있다.

상기 토양은 혐기성 토양일 수 있으며, 예를 들어 논토양일 수 있다.

본 발명의 다른 관점에 따르면, 상기 킬레이트화제를 유효성분으로 포함하는 메탄가스 생성 억제용 조성물을 토양에 살포하는 단계를 포함하는 토양 내 메탄 생성 억제 방법이 제공된다.

상기 조성물에 있어서, 상기 킬레이트화제는 유기계일 수 있다. 예를 들어, EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid), NTA(Nitrilotriacetic acid), HEDTA((2-Hydroxyethyl)ethylenediaminetriacetic acid), GEDTA(glycoletherdiaminotetraacetic acid), TTHA(triethylene tetraminehexaacetic acid), HIDA(iminodiacetic acid), DHEG(dihydroxyethylglycine), 부식산(humic acid) 및 풀부산(Fulvic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상일 수 있다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 경제적이며 효과적으로 토양에서 방출되는 메탄가스를 억제하는, 메탄생성 억제용 조성물을 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1은 니켈(Ni²⁺), EDTA, 또는 니켈(Ni²⁺)+EDTA가 첨가된 배지에서 논토양 내에 존재하는 메탄 생성균을 배양시 배출되는 메탄가스 생성량(ppm) (a), 및 단위토양 무게당 생성되는 메탄가스의 양(μg·d^-1)(b)을 나타낸 그래프이다.
도 2는 킬레이트화제인 EDTA 처리량 및 처리기간에 따른 메탄가스 생성량(μg·g^-1soil·day^-1)(a) 및 토양 내 니켈의 함량(μg·g^-1soil·day^-1)(b)을 나타낸 그래프이다.
도 3은 킬레이트화제인 EDTA 처리량에 따른 메탄 생성균의 mcr A 유전자 카피수(a) 및 Co-M 함량(b)을 나타낸 그래프이다.

본 문서에서 사용되는 용어를 정의하면 하기와 같다.

본 문서에서 사용되는 “메탄 생성균(methanogenic archaea)”은 공통적으로 mcrA gene을 가지고 있다. 이때 메탄 생성균은 세포내 효소인 Methyl coenzyme M 환원효소에 의해 Coenzyme M(CH₃-S-CoM)과 coenzyme B(CoB-SH, 혹은 HTP-SH)로부터 메탄(CH₄)을 생산하게 된다. 이상의 생화학적 반응에서 주효소(apoenzyme)인 Methyl coenzyme M 환원효소는 보조인자(cofactor)로 니켈(Ni)과 결합하여 완전효소(holoenzyme)로 될 수 있다. 논토양과 같은 혐기 토양에서 메탄 발생량은 메탄 생성균 체내에서 Methyl coenzyme M reductase 활성을 결정하는 보조인자, 즉 니켈(Ni)의 흡수량에 의존하게 된다. 본 발명자는 이러한 작용에 근거하여 킬레이트화제를 이용하여 토양 내 Ni의 생물학적 가용성을 억제함으로써, 토양 내 메탄 생성균으로부터 생산되는 메탄가스의 배출량을 감소시킬 수 있음을 최초로 입증하였다. 이러한 효과는 EDTA와 같은 킬레이트화제와 킬레이트화된 니켈의 분자 크기가 Bulky 해져 메탄 생성균 세포내로 흡수가 불가능하게 되기 때문에, 세포내 효소인 Methyl coenzyme M 환원효소의 활성 억제에 의한 것으로 판단되었다.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실험예 1: 보조인자 Ni과 착화합물 EDTA 처리에 따른 메탄 생성균 활성 변화

본 발명자는 토양 내 메탄 생성균의 메탄생성효소 보조인자 Ni과 착화합물 EDTA 처리에 따른 메탄 생성균의 활성, 즉 메탄 발생에 미치는 영향을 확인하였다.

경남 진주 가좌동 경상대학교 농장에 위치한 벼 농작지로부터 토양을 채취하여, 실험에 이용하였다. 1.0 g의 논토양을 100 ml의 증류수에 현탁시킨 후, 상기 현탁액 1 ml을 다시 100 ml 증류수에 희석시켜 10,000 배 희석시킨 토양 희석액을 제조하였다. 그 후, 상기 토양 희석액 300 ml을 메탄 생성균 배양용 배지[HCOONa 5 g, CH₃COONa 5 g, CH₃OH 5 ml, H₂/CO₂ (80/20 (v/v)); NH₄Cl 1 g, MgCl₂ 0.1 g, K₂HPO₄ 4 g, KH₂PO₄ 4 g, 시스테인(cysteine) 0.5 g, 레자주린(resazurin) 0.002 g; 미량원소 용액 10 ml; 증류수 685 ml]에서 30℃에서 10일 동안 배양하였다(Yue et al., Untrient Cycling in Agroecosystems 73: 293-301, 2005). 상기와 같은 배지로 배양한 군을 대조군으로 하였으며, 상기 배지에 Ni을 50 mg L^-1로 첨가하거나, Ni(50 mg L^-1)과 EDTA (50 mg L^-1)으로 첨가하여 배양한 군을 실험군으로 이용하였다. 12일이 경과하였을 때 대조군 배지에서 메탄 생성균이 성장하는 것이 관찰되었으며, 이 시기에 배양용기 헤드 스페이스(head space)에서 메탄 생성 농도를 측정하였다. 헤드 스페이스(head space)의 공기를 질소로 교환한 후, 30 ± 0.5℃에서 반응시켰다. 상기 헤드 스페이스의 메탄가스 농도는 1주일 간격으로 Porapak NQ 컬럼(Q 80.100 mesh) 및 FID(flame ionization detector)를 이용한 가스 크로마토그래피(Shimadzu, GC-2010, Japan)로 측정하였다. 상기 컬럼의 온도는 100℃로, 주입기(injector) 및 검출기(detector)의 온도는 200℃로 설정하였다. 헬륨 및 수소는 각각 이동 및 연소 가스로 이용하였다. 결과는 Gomez 및 Gomez의 문헌에 기재된 방법에 따라 표준 통계학적 방법을 이용하여 분석하였다(Gomez, K.A., et al., Statistical Procedures for Agricultural Research, second ed. John Wiley and Sons, New York, 1984.).

그 결과, 도 1a에 나타난 바와 같이, Ni²⁺이 첨가된 배지를 이용하였을 때, 메탄 생성이 현저하게 증가하는 것이 관찰되었다. 반면 EDTA가 첨가된 배지에서는 메탄 생성에 영향을 미치지 못하였으며, Ni과 EDTA가 함께 첨가된 배지에서는 Ni 첨가 배지에 비하여 메탄가스 생성을 오히려 감소시키는 효과를 나타냈다(도 1a 참조). EDTA가 첨가된 배지에서 메탄 생성균의 성장이 감소하는 것은 Ni-EDTA 복합체 형성으로 인하여 메탄 생성균의 이용할 수 있는 Ni²⁺ 이온이 감소한 것이 그 원인으로 생각된다.

이어, 본 발명자는 도 1a의 결과를 용기의 헤드 스페이스(head space) 내 메탄의 농도를 기준으로 계산하였으며, 그 결과를 도 1b에 일(d^-1) 메탄 생성량으로 나타냈다(도 1b 참조). 이러한 결과는 메탄 생성균의 성장에 있어서, 토양 내 보조인자 Ni과 착화합물 EDTA가 메탄 생성에 있어 중요한 역할을 수행한다는 것을 의미한다.

실험예 2: 킬레이트화제에 의한 토양 내 메탄 생성균의 메탄가스 방출량 변화 분석

경남 진주시 가좌동 경상대학교 농장에 위치한 벼 농작지로부터 채취한 25 g의 토양과 40 ml의 증류수를 목이 가는 유리병에 넣고, 0, 30, 60 및 150 ppm (토양 중량 기준)이 되도록 EDTA를 첨가하고, 고무마개로 밀봉하였다. 상기 기질을 균질화하고, 헤드 스페이스(head space)의 공기를 질소로 교환한 후, 30 ± 0.5℃에서 반응시켰다. 상기 헤드 스페이스의 메탄가스 농도는 1주일 간격으로 Porapak NQ 컬럼(Q 80.100 mesh) 및 FID(flame ionization detector)를 이용한 가스 크로마토그래피(Shimadzu, GC-2010, Japan)로 측정하고, 4주 동안 실험을 수행하였다. 이때, 상기 컬럼의 온도는 100℃로, 주입기(injector) 및 검출기(detector)의 온도는 200℃로 설정하였다. 헬륨 및 수소는 각각 이동 및 연소 가스로 이용하였다. 토양으로부터 메탄가스의 방출량은 μg CH₄ g^-1 soil day^-1 로 나타냈다.

그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이, EDTA 처리에 의하여 토양으로부터 방출되는 메탄가스가 유의하게 감소하였다(P ≤ 0.05). EDTA 처리량에 따라 억제율에 차이가 나타났으며, 처리량 의존적으로 억제율이 증가하는 경향을 보였다. 그러나 1주 및 2주의 반응 이후, 메탄가스 방출량은 처리시간에 따른 군 사이에서는 통계학적으로 유의한 차이가 보이지 않았다. 즉, 킬레이트화제인 EDTA가 처리된 토양으로부터 방출된 메탄가스는 대조군에 비하여 현저하게 감소하였으며, 이러한 차이는 EDTA 처리 농도 군 사이에서는 보다 낮은 수준으로 나타났다(P ≤ 0.05).

이어, 본 발명자들은 토양 내 니켈의 함량을 분석하였다. 실시예 1에서 4주 동안 반응시킨 토양 샘플을 여과시킨 후, 여과된 토양 5 g에 옥살산 암모늄(ammonium oxalate) 용액 25 ml을 첨가하여 Ni 농도를 측정하였다(Benitez and Dubois, 1999). 토양 내 Ni 농도 측정을 위해서 5배 희석된 희석액 용액을 이용하였다.

그 결과, 도 2b에 나타난 바와 같이, 토양 내 니켈 농도는 EDTA 처리에 의해서 감소하는 것이 관찰되었다. 4주 동안 반응시킨 토양을 이용하여 Ni 농도를 측정한 결과, 대조군에서는 33.62 ± 1.49 mg kg^-1 토양이 존재하는 것으로 분석된 반면, 30 ppm, 60 ppm 및 150 ppm EDTA 가 처리된 토양에서는 각각 28.71 ± 1.08, 19.29 ± 0.96 and 18.76 ± 0.83 mg kg^-1 토양이 존재하는 것으로 분석되었다. 토양 내의 Ni 농도는 EDTA 처리농도에 비례하여 감소하였다. 비록 150 ppm 농도의 EDTA를 처리한 군에서 Ni 의 농도가 가장 낮게 관찰되었으나, EDTA를 처리한 모든 군은 대조군에 비하여 통계학적으로 유의한 수치를 나타냈다.

실험예 3: 킬레이트화제에 의한 토양 내 메탄 생성균의 변화

킬레이트화제에 의한 토양 내 메탄 생성균의 변화를 mcr 유전자와 Coenzyme M 효소를 지표로 이용하여 분석하였다. 상기 실험예 1에서 4주 동안 반응시킨 토양을 물과 분리시킨 후, Pilot Lyophilizer (PVTFD50A, Ilsin, Korea)를 이용하여 동결 건조시킨 후 분석을 수행하였다. 상기 토양으로부터 추출한 DNA를 BioRad CFX96 realtime thermocycler(BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 이용하여 mcrA 유전자를 정량화 하였으며, 하기 프라이머를 이용하였다:

mcrA forward: 5’-GGTGGTGTMGGATTCACACARTAYGCWACAGC- 3’(서열번호 1), 및

mcrA reverse: 5’-TTCATTGC RTAGTTWGGRTAGTT-3’(서열번호 2).

정량적 실시간 PCR 분석은 1.0 μl DNA 주형을 하기 문헌에 기재된 바에 따라 실험을 수행하여 분석하였으며(Luton, P.E., et al., Microbiology 148, 3521-3530, 2002), 표준 DNA 샘플로는 Methanosarcina mazei로부터 분리한 mcrA 플라스미드를 이용하였다.

그 결과, 도 3a에 나타난 바와 같이, 토양 내 mcrA 유전자의 카피 수는 EDTA 처리에 의하여 현저하게 감소하였으며(P ≤ 0.05), mcr A 유저자의 카피 수의 감소 정도는 EDTA 처리량 증가에 의존적이었다.

이어, 본 발명자는 토양 내 Co-M 함량을 HPLC를 이용하여 분석하였다. 상기 실험예 1에서 4주 동안 반응시킨 토양 1 g을 15 ml 팔콘(falcon) 튜브에 넣고, 2 ml 용해버퍼[100 mM Tris-HCl 용액(pH 8.0), 100 mM EDTA(ethylene diamine tetra acetic acid) 용액(pH 8.0) 및 1.5 M NaCl 용액]를 첨가하였다(Pramanik and Kim, 2012). 그 후, 상기 기질을 2분 동안 초음파분쇄하고, 10분 동안 4,000 rpm에서 원심분리하고 수득한 상층액에 18% 에탄올 수용액이 되도록 에탄올을 첨가하고, 4℃에서 2시간 동안 방치하였다. 그 후, 침전물을 증류수에 녹이고, 적절한 희석액을 HPLC 분석하였다. 농축된 표준 용액은 순수한 Co-M 화합물(Sigma: M1511; CAS: 19767-45-4)을 물과 메탄올 혼합물(95:5, v/v)에 용해시켜 제조하였다. 순차 희석된 표준 용액 10 μl을 HPLC(Agilent DE/1200, 5 μm) 컬럼에 주입하고, UV 검출기를 이용하여 270 nm 파장에서 데이터를 분석하였다(Pramanik, P., et al., Soil Biology and Biochemistry, 55: 140-145, 2012). Co-M 정량화를 위해서, 아세토니트릴(acetonitrile) 및 0,05 M 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid, TCA) 혼합 용액(30:70, v/v)을 이동상으로 이용하였으며, 0.5 ml 분^-1의 유속으로 주입하였다. 용해 버퍼는 100 mM Tris-HCl 용액(pH 8.0), 100 mM EDTA(ethylene diamine tetra acetic acid) 용액 (pH 8.0) 및 1.5 M NaCl 용액을 혼합하여 제조하였다.

그 결과, 도 3b에 나타난 바와 같이, 토양 내 Coenzyme M은 대조군 토양에서는 523.79 ± 72.50 μmol g^-1 로 존재하였으며, 토양 내 Co-M 수치는 EDTA 처리량에 의존적으로 감소하는 것이 관찰되었다(도 2 참조).

본 발명은 도면에 도시된 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> Composition for reducing methane gas comprising chelating agent and method using the same <130> PD13-0661 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mcrA forward primer <400> 1 ggtggtgtmg gattcacaca rtaygcwaca gc 32 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mcrA reverse primer <400> 2 ttcattgcrt agttwggrta gtt 23

Claims

킬레이트화제를 유효성분으로 포함하는, 메탄가스 생성 억제용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 킬레이트화제는 유기계인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 킬레이트화제는 EDTA(Ethylene diamine tetra acetic acid), NTA(Nitrilo tri acetic acid), HEDTA((2-Hydroxyethyl)ethylenediaminetriacetic acid), GEDTA(glycoletherdiaminotetraacetic acid), TTHA(triethylene tetraminehexaacetic acid), HIDA(iminodiacetic acid), DHEG(dihydroxyethylglycine), 부식산(humic acid) 및 풀부산(Fulvic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 토양에 살포하는 단계를 포함하는, 토양 내 메탄 생성 억제 방법.
제4항에 있어서,
상기 토양은 혐기성 토양인, 방법.